CN105524916A - 一种dna类样本保存稀释液及其制备 - Google Patents

一种dna类样本保存稀释液及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种DNA类样本保存稀释液及其制备方法，属于聚合酶链式反应(PCR)技术领域核糖核酸(DNA)类样本的稀释和保存范畴。本发明的制备步骤包括：在去离子纯化水中加入一定量的DNA防腐剂和化学试剂；调pH值至7.8-8.2后定容；密封后高压灭菌，室温备用。本发明为一种白色透明溶液，具有稳定、易保存、便捷等优点，适用于血清、血浆、组织、尿液、分泌物等DNA类样本的保存和稀释。浸入DNA类样本稀释保存液后，新鲜组织细胞中DNA可以完好的在37℃下保存1周，在25℃下保存1个月，4℃下保存6个月，在-20℃或-80℃下长期保存。

Description

一种DNA类样本保存稀释液及其制备
所属领域
本发明属于生物制品技术领域，属于聚合酶链式反应(PCR)技术领域核糖核酸(DNA)类样本的稀释和保存范畴，涉及DNA类样本稀释液的制备方法及其应用。
发明背景
聚合酶链式反应(PCR)技术是重要的分子生物学技术，对现代分子生物学的发展起到非常重要的作用。PCR技术特点是高灵敏度、高特异性、省时快速，直接检测目的基因的样本分为DNA类样本或RNA类样本，但是对样本的稀释和保存要求甚高。核糖核酸(缩写为RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。DNA的质量好坏和浓度高低直接影响着检测结果，DNA酶是DNA降解的主要原因，DNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内DNA酶外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人类皮肤的汗液、唾液中均存在DNA酶，且DNA酶耐热、耐酸碱，蛋白变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。所以在DNA提取过程中必须避免外源性DNA酶的污染和抑制内源性DNA酶的活性。DNA易受外界物理因素：温度、湿度；化学因素：pH值、水解反应、氧化反应；生物因素：酶解及微生物侵染等作用等因素而降解
在现有的DNA类样本稀释保存方法中，主要方法有：1)稀释液用DEPC水、DNAsin等；2)保存主要用液氮或低温保存。其缺点是：1)不同类型的DNA类样本(血清、血浆、组织、尿液、分泌物、培养液等)无法用同一种缓冲液或稀释液；2)各种缓冲液或稀释液保存的效果质量差，DNA容易降解；3)保存后的样本要快速进入液氮或低温保存，室温保存时间过短。因此，开发一种高效防止DNA降解且能适用不同DNA类样本的稀释保存液，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA类样本稀释保存液的制备方法。可作为临床不同类型的DNA类样本(血清、血浆、组织、尿液、分泌物、培养液等)的样本稀释或/和保存。
本发明的DNA类样本稀释保存液制备方法如下：
1、量取若干毫升去离子纯化水；
2、分别加入二甲基亚砜(1％～3％[v/v])、山梨醇(0.5mol/L～1mol/L)、Tris-HCl(0.01mol/L～0.05mol/L)，乙二胺四乙酸(0.01mol/L～0.05mol/L)，Triton-100(0.1％～0.5％[v/v])，NP-40(0.1％～0.5％[v/v])、Chelex-100(1％～5％[w/v])、叠氮钠(0.08％～0.1％[w/v])，链霉素(400U/ml～800U/ml)；
3、调pH值至7.8～8.2后定容；
4、密封后高压灭菌，室温备用。
本发明为一种可直接使用的样品保存液，其原理是抑制DNase活性，可有效保护新鲜样本里的DNA免受降解。具有稳定、易保存、便捷等优点。适用于血清、血浆、组织、尿液、分泌物等DNA类样本的保存和稀释。浸入DNA类样本稀释保存液后，新鲜组织细胞中DNA可以完好的在37℃下保存1周，在25℃下保存1个月，4℃下保存6个月，在-20℃或-80℃下长期保存。
附图说明
图1显示对照组PCR扩增检测图
图2显示实验组PCR扩增检测图
图3显示37℃环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图4显示37℃环境中普通稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图5显示37℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图6显示37℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图7显示室温环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图8显示室温环境中普通稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图9显示室温环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图10显示室温环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图11显示2-8℃环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图12显示2-8℃环境中普通稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图13显示2-8℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图14显示2-8℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图15显示-20℃环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图16显示-20℃环境中普通稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图17显示-20℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图18显示-20℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明。实施例中所用的技术手段若为特殊指明，均为常规方法。实施例中涉及到的试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径获取。以下实施例中的DNA类样本稀释保存液测试实验。
实施例1：RNA稀释保存液的制备(100ml)
1)量取30ml去离子纯化水，加入灭菌烧杯中；
2)吸取1ml的二甲基亚砜加入烧杯中，并搅拌均匀；
3)称取18.2g的山梨醇加入烧杯中，并搅拌溶解；
4)称取0.12g的Tris-HCl加入烧杯中，并搅拌溶解；
5)吸取10mlENDA(0.5mol/L)加入烧杯中，并搅拌均匀；
6)吸取0.5mlTriton-100加入烧杯中，并搅拌均匀；
7)吸取10mlNP-40(1％)加入烧杯中，并搅拌均匀；
8)称取1g的Chelex-100加入烧杯中，并搅拌均匀；
9)称取0.1g的叠氮钠加入烧杯中，并搅拌溶解；
10)吸取0.4ml的链霉素(200U/ul)加入烧杯中，并搅拌均匀；
11)用氢氧化钠调pH值至7.8～8.2；
12)把已经调好pH的溶液转移到100ml的容量瓶中，用去离子纯化水定容到100ml；
13)把配制好的溶液置于试剂瓶中，密封后高压灭菌，室温备用。
实施例2：分泌物样本稀释测试
1)仪器、试剂和样本
主要仪器：ABI7500PCR检测仪、TGL-18R高速冷冻离心机、TDL-5-A台式离心机、K10CD干式恒温金属浴、BSC-1500IIA2-X生物安全柜、移液器等。
主要试剂：中山大学达安基因股份有限公司的人乳头瘤病毒(HPV)16、18型核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒。
样本：新鲜的HPV16DNA临床阳性样本(分泌物，5.0E+07IU/ml)。
2)实验方案
用普通稀释液和DNA类样本稀释保存液分别将HPV16DNA阳性样本稀释5倍、50倍、500倍、5000倍。设计对照组和实验组两组稀释液，用中山大学达安基因股份有限公司的人乳头瘤病毒(HPV)16、18型核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒对两组不同稀释液稀释的样本进行提取。
对照组：普通稀释液和HPV16DNA阳性样本。
实验组：DNA类样本稀释保存液和HPV16DNA阳性样本。
3)实验结果
PCR扩增检测图见图1、图2
表1HPV16DNA阳性样本的检测结果
4)实验结论
实验结果表明，用DNA类样本稀释保存液稀释的HPV16DNA阳性样本，扩增曲线呈典型的S型曲线，稀释的浓度梯度间隔较好，适用于临床血浆样本的稀释。
实施例3：UU培养物保存测试
1)仪器、试剂和样本
主要仪器：ABI7500PCR检测仪、TGL-18R高速冷冻离心机、TDL-5-A台式离心机、K10CD干式恒温金属浴、BSC-1500IIA2-X生物安全柜、移液器等。
主要试剂：中山大学达安基因股份有限公司的解脲脲原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。
样本：UU培养物(5.0E+07IU/ml)。
2)实验方案
用DNA类样本稀释保存液将UUDNA培养物稀释10倍、1000倍，作为高、低浓度测试样本分别标记为P1、P2。分别于-20±5℃环境中、2-8℃环境中、室温(20～25℃)环境中和37℃下放置，本实验的设计如下：把稀释后的样本，做好标记，分别放入指定环境中，按指定周期进行检验，具体如下：①-20±5℃环境中，半年或一年检测一次；②2-8℃环境中，每半个月检测一次，检测3个月；③室温(20～25℃)环境中，每8天检测一次，检测35天；④37℃环境中，每2天检测一次，检测8天。用中山大学达安基因股份有限公司的解脲脲原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对样本进行提取。
对照组：放置-80℃环境中普通稀释液稀释的样本，放置-80℃环境中DNA类样本稀释保存液稀释的样本。
实验组：普通稀释液稀释的样本和DNA类样本稀释保存液稀释的样本分别放置-20℃环境中、2-8℃环境中、室温(20～25℃)环境中和37℃环境中的样本。
3)实验结果
表237℃环境中普通稀释液稀释的样本的检测结果(见图3、图4)
表337℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本检测结果(见图5、图6)
表4室温环境中普通稀释液稀释的样本检测结果(见图7、图8)
表5室温环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本检测结果(见图9、图10)
表62-8℃环境中普通稀释液稀释的样本检测结果(见图11、图12)
表72-8℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本检测结果(见图13、图14)
表8-20℃环境中普通稀释液稀释的样本检测结果(见图15、图16)
表9-20℃环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本检测结果(见图17、图18)
四、实验结论
实验结果表明，用DNA类样本稀释保存液保存的UUDNA阳性样本比普通稀释液的稳定性要好，适用于培养物样本的保存。

Claims (4)

1.一种DNA类样本保存稀释液，其成分主要由二甲基亚砜、山梨醇、Tris-HCl、乙二胺四乙酸、Triton-100、NP-40、Chelex-100、叠氮钠、链霉素和去离子纯化水组成。
2.根据权利要求1所述的保存稀释液，其特征在于其主要组分的含量分别为：二甲基亚砜1％～3％[v/v]、山梨醇0.5mol/L～1mol/L、Tris-HCl0.01mol/L～0.05mol/)、乙二胺四乙酸0.01mol/L～0.05mol/L、Triton-1000.1％～0.5％[v/v]、NP-400.1％～0.5％[v/v]、Chelex-1001％～5％[w/v]、叠氮钠0.08％～0.1％[w/v]、链霉素400U/ml～800U/ml。
3.根据权利要求1所述的保存稀释液，其特征还在于其制备方法如下：
(1)量取若干毫升的去离子纯化水；
(2)分别加入二甲基亚砜、山梨醇、Tris-HCl、乙二胺四乙酸、Triton-100、NP-40、氢氧化钠、Chelex-100、叠氮钠、链霉素，搅拌混匀；
(3)调pH值至7.8～8.2后定容；
(4)密封后高压灭菌，室温备用。
4.根据权利要求1所述的保存稀释液，其特征还在于可用作液态和固态DNA样本的保存和/或稀释。
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