CN112760318B - 一种用于稳定核酸分子的试剂组合物及其应用 - Google Patents
一种用于稳定核酸分子的试剂组合物及其应用 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
本发明提供了一种用于稳定化生物学样品中的核酸分子的试剂组合物，该试剂组合物包含pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂和抗微生物剂和可选的如无机盐离子、组织渗透剂、还原剂、核酸酶抑制剂等。本发明还提供了使用所述试剂组合物来运输、保存和稳定化生物学样品中的核酸分子的方法以及所述试剂组合物在运输、保存和稳定化生物学样品中的核酸分子中的应用。本发明确保用于生物样品中高分子量DNA的常温长期保持。
Description
技术领域
本发明涉及用于稳定生物学样品中的核酸分子的技术领域。更具体地说，本发明涉及用于稳定生物样品存在的核酸分子的试剂组合物及其应用。
背景技术
在诊断学领域中，核酸是重要的生物标志物。例如，包含人类基因组中的基因或其片段在分子体外诊断学中被广泛用作生物标志物，以为正常的生物和病理过程提供见解，并预测疾病结果和指导精准用药。因此，核酸分子在疾病诊断、预后和用于生物标志物发现的临床试验中是重要的。基因组学是探索基础生物学、诊断疾病、促进药物开发、为特定病理和遗传情况定制疗法以及产生与生物或治疗过程和途径相关的数据库的强有力工具。然而，已经发现生物样品中核酸如果没有得到妥善保存和稳定化将可能会损害后续分析的结果，如果在待分析的样品的保存和稳定化中不采取预防措施，样品将在运输和储存期间经历可能严重改变被靶向分子的情况。
我们应当理解，用于运输保存和稳定核酸的结构和功能完整性的方法对于广泛多种应用是重要的，所述应用包括诊断应用、治疗应用、预后应用、研究应用、法医应用、测序应用、扩增应用、分析物检测、传感应用等。各种条件如pH、温度、湿度、运输、氧化、还原、盐离子等都会导致核酸的降解。因此，需要一种用于运输、保存和稳定生物样品中核酸分子的试剂和方法。
发明内容
本发明是基于以下发现：在包含有核酸的生物样品中，有的核酸以游离的形成存在，如血浆中的游离DNA，有些在固体中如动植物组织中的基因组DNA、骨骼中基因组DNA、粪便中破碎细胞的基因组DNA，以及包含在含有细胞的生物样品中的核酸。这些含有细胞的生物样品可以是全血、培养细胞、组织、粪便、土壤、唾液、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液等。本发明人经过研究发现，某些试剂的组合能够令人吃惊地有效稳定这些生物样品中的DNA，可以使核酸分子DNA高度稳定，不会使其片段化，同时还可以允许在室温下对DNA进行运输或保存。
于是，本发明通过用这些试剂组合添加到样品中进行分散后，可以使生物样品中的核酸瞬间稳定化，从而应用于它们的运输和长时间保存，以便用于后续基于DNA的分析。本发明通过这些试剂组合可以快速抑制DNA酶活性，杀灭病原体微生物，阻止细胞活性来保护DNA的稳定性。
于是，本发明在第一方面提供了一种试剂组合物，所述试剂组合物为包含用于稳定一种或多种生物样品中的核酸分子的试剂组合物，在该试剂组合物中含有多种组分。
在一些实施例中，生物样品可以是细胞、或含有细胞的拭子样品。
在其他一些实施方式中，生物样品可以是体液样品，如血液、血清、血浆、痰、粘液、脑脊液、尿液、精液或其组合。
在另外一些实施例中，生物样品可以是固体类型样品，如粪便、土壤、动物组织和植物组织。
本发明的试剂组合可以包含pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂、抗微生物剂和水。
进一步，所述试剂组合物还可以包含无机盐离子和还原剂。
进一步，所述试剂组合物还可以包含组织渗透剂和核酸酶抑制剂。
下文将对本发明的试剂组合物的组分进行说明，如果没有特别说明，列出的这些组分的具体选择进出举例目的而非限制目的。对于没有列出具体选择的组分，可以采用本技术领域常用的已知组分。
pH稳定剂
应当理解的是，下文列举的各组分如果没有特别说明的话，都只是出于举例目的而非限制目的。
在一些更具体的实施方式中，所述pH稳定剂为选自三羟基氨基甲烷、乙酸钠、柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾、硼酸、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、醋酸钠、甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、乙酸铵、亮氨酸、乙磺酸、半胱氨酸和四硼酸钠中的一种或多种的组合。
优选的是，所述pH稳定剂包含至少两种缓冲物质，如三羟基氨基甲烷和柠檬酸组合，或碳酸钠和甘氨酸组合，或二乙醇胺和丙磺酸组合，或乙酸钠、柠檬酸钠和丙氨酸组合。另外地或进一步优选的是，所述pH稳定剂为乙酸钠、柠檬酸钠和丙氨酸的组合。
另外地或进一步优选的是，所述试剂组合物包含10-500mM乙酸钠、1-200mM柠檬酸钠和50-300mM丙氨酸作为pH稳定剂。
更为优选的是，所述试剂组合物包含100mM乙酸钠、100mM柠檬酸钠和50mM丙氨酸作为pH稳定剂。
在一些更优选的实施方式中在一些更具体的实施方式中，技术人员应认识到，选择用于本文所公开的试剂组合物和方法的缓冲剂的pH也是有关的。最终的试剂组合物溶液(例如配制成用于直接使用时的试剂组合物水溶液)的pH值一般在一般在5至12的范围内。在一些实施方案中，令人意外的发现，最终的试剂组合的pH的范围为9-10，可以稳定高分子量的DNA长时间稳定。
螯合剂
在一些更优选的实施方式中，所述螯合剂任选地选自由N-乙酰-L-半胱氨酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、水杨酸、三草酸、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、柠檬酸、邻菲咯啉、酒石酸钾钠、柠檬酸铵、酒石酸和三乙醇胺等组成的组中的一种或多种。
优选的，所述螯合剂包含EDTA、三草酸、酒石酸钾钠、酒石酸和/或柠檬酸钠。更为优选的，所述螯合剂包含EDTA、三草酸、酒石酸和/或柠檬酸钠。
进一步，所述螯合剂在所述试剂组合物中存在的浓度为约1mM至最高达约500mM、或约10mM至最高达约200mM。
蛋白变性剂
在一些更优选的实施方式中，所述蛋白变性剂选自由盐酸胍、硫氰酸钾、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾、碘化钠、高氯酸钠、尿素和去污剂组成的组中的一种或多种。
在一些更优选的实施方式中，所述去污剂为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂，其可以任选地选自由Brij 35、Brij 56、Brij58、十二烷基硫酸钠、NP40、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Span-80、Span-20、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂苄索氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、高分子阳离子烷基多糖苷、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、松香基季铵盐阳离子表面活性剂和椰油基葡萄糖苷羟丙基三甲基氯化铵组成的组中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述蛋白变性剂可以为异硫氰酸胍、尿素或去污剂。不意在限于具体的变性剂，所述蛋白变性剂可根据其生物物理性质和完全抑制生物酶(例如RNA酶或DNA酶)活性的能力分类为强蛋白变性剂(本文有时称为第一蛋白变性剂)或弱蛋白变性剂(本文有时称为第二蛋白变性剂)。其中，所述强蛋白变性剂能够快速裂解细胞使核酸从细胞中释放出来；而所述弱蛋白变性剂(例如去污剂)能够裂解细胞和破坏蛋白-蛋白相互作用而不变性核酸。
在所述蛋白变性剂由一种强蛋白变性剂与一种弱蛋白变性剂组合构成的情况下，所述强蛋白变性剂和所述弱蛋白变性剂可以为如强蛋白变性剂十二烷基硫酸钠和弱蛋白变性剂辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵的组合，或者可以是强蛋白变性剂异硫氰酸胍和弱蛋白变性剂Brij 58的组合，或者可以是强蛋白变性剂尿素和弱蛋白变性剂聚乙二醇辛基苯基醚的组合。
在一些实施方案中，当存在时弱蛋白变性剂时，所述弱蛋白变性剂在所述试剂组合物中的浓度为约0.05％(w/v)，至最高达约0.5％、或约2％至最高达约20％。在一些实施方案中，所述弱蛋白变性剂在所述试剂组合物中的浓度可以为约0.2％，或约0.25％、或约1％、或约2.5％至最高达约10％。
在一些实施方案中，若强蛋白变性剂是十二烷基硫酸钠，则优选其在所述试剂组合物中的浓度范围可以为约0.2％，至最高达约0.5％、或约0.75％至最高达约2.5％。
在一些实施方案中，若强蛋白变性剂是尿素或异硫酸氰胍，则优选其在所述试剂组合物中的浓度为约1-5M。
本文中使用的蛋白变性剂可以中断蛋白质中的非共价键，使其变性，同时有些蛋白变性剂还可以抑制DNA酶或者RNA酶的活性，通过破坏这些酶的复合结构，且弱蛋白变性剂例如去污剂同时还可以促进生物样品在本发明的试剂组合物中分散。
抗微生物剂
本发明中的“抗微生物剂”将被理解意为与其不存在情况下的生物体生长速率相比降低生物体生长速率的物质或物质群。微生物的生物体生长速率的降低可以是至少50％，更期望至少60％，还更期望至少80％，最期望99％或更多。抗微生物剂是抑菌性或者杀菌的。
进一步，所述抗微生物剂可以是青霉素、链霉素、庆大霉素、三氯生、Irgasan、IRGASAN DP 300、Proclin 950、Proclin 300、Proclin 150、叠代钠、碳酸锂，氯化锂、酰基苯胺类、咪唑类、噻唑类、异噻唑酮衍生物、醇类抗微生物剂。
所述醇类抗微生物剂为乙醇、异丙醇、甘油、聚乙二醇、甲醇等单元醇或者是多元醇。
优选的，所述抗微生物剂可以为乙醇、异丙醇、氯化锂、聚乙二醇、庆大霉素、三氯生或其组合。
更为优选的，所述试剂组合物包含浓度5-15％乙醇或浓度0.05％庆大霉素作为抗微生物剂。
无机盐离子
所述的无机盐离子主要指的是钠盐、铵盐、钾盐和/或锂盐。
优选的是，所述无机盐离子可以是氯化钠、氯化铵、硫酸钠、硫酸铵、氯化钾、碳酸钾、磷酸铵、氯化锂、乙酸钠、碳酸锂或其组合。
优选的是，所述无机盐离子为乙酸钠、氯化钠或氯化锂。
所述无机盐离子在所述试剂组合物中的浓度为0.05-1M。
另外地或进一步优选的是，所述试剂组合物包含0.1-5M氯化钠，或者包含0.1-2M乙酸钠和0.05-2M氯化锂，或其组合作为无机盐离子。
另外地或进一步优选的是，所述试剂组合物包含100mM乙酸钠或100mM氯化锂作为无机盐离子。
还原剂
在本发明中，还原剂通常能够起到抗氧化剂的作用。
在一些更优选的实施方式中，所述还原剂可以任选地选自由DTT(二硫苏糖醇)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、TCEP-HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、尿素、尿酸、巯基乙醇、半胱氨酸(dysteine)、亚硫酸钠、维生素C、连二亚硫酸盐、巯基乙酸和焦亚硫酸盐组成的组中的一种或多种。
优选的，所述还原剂为亚硫酸钠。
进一步优选的，所述还原剂为亚硫酸钠，其在所述试剂组合物中的浓度范围为约1mM-200mM。。
组织渗透剂
在一些更优选的实施方式中，所述组织渗透剂可以使试剂组合物能够浸入到各种固体样品内部，如粪便颗粒、植物或者动物组织内部，保护其中的核酸分子使其得以完整保存，所述组织渗透剂可以是甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、丙酮、甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二氧六环或其组合。
在一些实施方案中，优选所述组织渗透剂为聚乙二醇200、聚乙二醇600、二甲亚砜、二氧六环或其组合。
在一些实施方案中，优选所述组织渗透剂在所述试剂组合物中的的浓度范围为1-35％。
核酸酶抑制剂
在一些更优选的实施方式中，所述核酸酶抑制剂可以是焦磷酸二乙酯(DEPC)、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物、RNA酶的蛋白质抑制剂、花青素、木酚素或其组合。
在一些实施方案中，优选所述核酸酶抑制剂为花青素或木酚素。
更为优选的是，所述试剂组合物包含0.05％(w/v的花青素作为核酸酶抑制剂。
本发明对所述试剂组合物中所用的水没有特别限制，所述水优选是无菌的，例如可以为蒸馏水、甚至是双蒸水。在一些实施方式中，水可以构成所述试剂组合物的余量部分，即，所述试剂组合物除了所宣称的组分之外，其余都是水。也就是说，所述试剂组合物包含所宣称的组分和余量的水。
本发明在第二方面提供了包含本发明第一方面所述的试剂组合物中的相应组分的试剂盒。在一些可选的实施方式中，所述试剂盒还可以包括为方便使用所述试剂组合物包括在所述试剂盒内的一些辅助试剂或组件。所述辅助试剂例如可以为无菌水、生理盐水或缓冲剂例如PBS缓冲剂或消毒剂例酒精。所述组件例如可以取样用工具例如咽拭子等。
本发明在第三方面提供了一种在例如运输、保存过程中稳定化生物学样品中的核酸分子的方法，所述方法使用本发明第一方面所述的试剂组合物进行。
本发明在第四方面提供了本发明第一方面所述的试剂组合物在运输、保存和稳定化生物学样品中的核酸分子的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
1.不仅可实现样品的常温运输和常温保存生物样品中的核酸(DNA)，而且在常温下可以保存至1个月以上甚至数年的时间，样品中的核酸都不发生降解或不发生明显降解。在使用大多数商业化核酸提取纯化试剂进行提取后，所获得的DNA质量好、得量高，可完成PCR、qPCR、NGS等各种基因检测及分析实验；
2.确保DNA在保存过程中的完整性，即获得高分子量的DNA；
3.快速灭活病毒，杜绝二次传染，保障运输及检测人员安全；
4.能抑制各种病毒或细菌生长，杀灭各种传染因子，实现传染性样品的安全运输。
附图说明
图1是本发明实施例1中的DNA电泳图，M为DNA分子Marker；1、2、3、4、5、6分别为S1试剂组合和唾液保存在第0天，第7天，第14天，第30天，第90天和第360天提取得到的DNA产物电泳图；7、8、9、10、11、12分别为S2试剂组合物和唾液保存在第0天，第7天，第14天，第30天，第90天和第360天提取得到的DNA产物电泳图；13和14分别为常规细胞保存液与唾液保存在第14天和第30天提取得到的DNA产物电泳图。
图2是本发明实施例1中的扩增rs7412基因区段电泳图，1、2、3、4、5、6分别为S1试剂组合物和唾液保存在第0天，第7天，第14天，第30天，第90天和第360天提取DNA后扩增rs7412基因区段电泳条带，13号为常规细胞保存液与唾液保存在第14天提取得到的DNA后扩增rs7412基因区段电泳条带，C(control)为标准DNA(50ng/uL)扩增rs7412基因区段电泳条带。
图3是本发明是实施例2的DNA电泳图，M为DNA分子Marker，1-8为实施例2试剂组合pH分别为5、6、7、8、9、10、11和12时保存拭子样品室温1个月后提取的DNA产物电泳图。
图4是本发明实施例4的DNA电泳图，M为DNA分子Marker，1-6号分别为表6中提到的不同试剂组合常温下保存粪便样品14天后提取的DNA产物电泳图。
具体实施方式
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应当明白，这些实施方式只是以实例的方式提供的。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变更、变化和替换。应当理解，本文描述的本发明实施方式的许多备选方案可用于实践本发明。
在详细描述本教导之前，应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为这些可以变化。应当注意，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。
本文使用的术语“样品”或“样品”将被理解意为任何这样的样品：可能包含目标核酸物质的样品，术语“样品”或“样品”或可包括溶液，如水溶液、细胞、组织、活检、粉末、或其中一种或多种的组合。样品可以是生物学样品，如唾液、痰、口腔拭子样品、血清、血浆、血液、血沉棕黄层、咽部、鼻部/鼻咽部或鼻窦拭子或分泌物、喉部拭子或刮出物、尿液、粘液、粪便排泄物、直肠拭子、呕吐物、胃液、胃肠道液、精液、精子、尿道拭子和分泌物、脑脊液、哺乳期或经期产物、卵黄、羊水、房水、玻璃体液、宫颈分泌物、阴道液、分泌物、拭子或刮出物、骨髓样品和抽取物、胸膜液和渗出液、汗液、脓、眼泪、淋巴液、支气管或肺灌洗液或抽取物、细胞培养物和细胞悬浮液、结缔组织、上皮、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉组织、胎盘组织、活检、渗出物、器官组织、神经组织、毛发、皮肤、或指甲，其中前述的样品可得自例如脊椎动物，包括哺乳动物。
应当理解，在本公开中讨论的温度、质量、重量、体积比、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得轻微和非实质性的偏差在本文的教导的范围内。通常，术语“约”表示组合物的组分量的非实质性变化，其对组合物的效果或稳定性没有任何显著影响。而且，“包含”、“含有”、和“包括”的使用不旨在是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本教导的限制。就通过引用并入的任何材料与本公开的表述内容不一致的程度，则以表述内容为准。
除非特别指出，否则描述为“包含”各种组分的说明书中的实施方式也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；描述为“由各种组分组成”的说明书中的实施方式也被认为是“包含”或“基本上由所述组分组成”。
“核酸”是指包含两个或更多个共价键合的核苷或具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其他键连接在一起，以形成多核苷酸。核酸包括RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“骨架”可以由多种连接组成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键中的一种或多种。核酸可以包括修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加到核酸中。用于体外制备核酸的合成方法在本领域中是公知的，尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸。本文中的核酸一般指的是DNA。
在本申请中，“提取”、“分离”或“纯化”是指样品的一个或多个组分被除去或与其它样品组分分离。样品组分包含常处于通常水性溶液相中的目标核酸，其也可以包含细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质、盐离子、金属离子和其它核酸。“提取”、“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常，分离或纯化表示从样品中去除至少70％或至少80％或至少90％的除了目标核酸之外的其它样品组分。
本领域技术人员将理解，本发明的试剂组合物可以使生物样品中的DNA在室温条件下的长时间存在高分子量的DNA，这可通过琼脂糖凝胶电泳评估，琼脂糖凝胶电泳可提供对高分子量DNA的品质以及高分子量DNA的数量的定性或定量度量。
上述所述的“长时间”是指保存样品中的高分子量DNA在常温下至少7天，更期望至少1个月，还更期望至少3个月，还更期望至少1年，期望3年或更多。
本发明的试剂组合物优选能在某些压力测试下保护高分子量的DNA的长时间稳定。所述的“压力测试”可以是高温如37℃，甚至更高的45℃，甚至56℃下也能够长时间保存，“压力测试”也可以是低温，如零下4℃，甚至更低的零下20℃，甚至是最低的零下80℃。“压力测试”也可能是反复的融冻处理，如常温至零下20℃反复融冻处理3次，甚至5次，甚至更多的7次。
在一些实施方式中，所述生物样品为细胞、或含有细胞的拭子样品。在一些实施方式中，对于细胞样品或拭子样品，更为优选的是，所述试剂组合物为pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂和抗微生物剂的组合。拭子样品与保存液的比例以浸没拭子为准，如1支拭子/0.5mL至1至拭子/10mL之间，更为优选地是1支拭子/1mL至1支拭子/3mL。
在一些实施方式中，所述生物样品为体液样品，如血液、血清、血浆、痰、粘液、脑脊液、尿液、精液组成的组中的一种或多种体液样品的情况下所述试剂组合物优选为pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂、抗微生物剂、无机盐离子和还原剂的组合。
所述体液样品与试剂组合物的体积比使用可以是1:10至10:1，更优选为1:5至4:1，进一步优选为1:3至2:1。
在一些实施方式中，所述生物样品可以是固体类型的样品，如粪便、土壤、动物组织和植物组织。在这种情况下，所述试剂组合物为pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂、抗微生物剂、无机盐离子、还原剂、组织渗透剂和核酸酶抑制剂。
所述固体类型的样品与试剂组合物的使用比例可以是1g/1mL至1g/50mL，更为优选的1g/3mL至1g/10mL。
实施例
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：唾液样品DNA保存试剂组合物
该试剂组合物为pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂、抗微生物剂、无机盐离子和还原剂的组合。按照如下组分和浓度采用去离子水配制DNA保存试剂组合物(S1)：100mM乙酸钠、100mM柠檬酸钠、50mM丙氨酸、25mM酒石酸钠、2.5M尿素、0.1％辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、10％乙醇、10mM亚硫酸钠，pH9.5。
按照如下组分和浓度采用去离子水配制DNA保存试剂组合物(S2)：100mM乙酸钠、100mM柠檬酸钠、50mM丙氨酸、50mM EDTA、2％十二烷基硫酸钠、0.5％聚乙二醇辛基苯基醚、10mM亚硫酸钠、0.05％庆大霉素，pH 9.0。
受拭者使用凉水重洗口腔三次，然后等待5min至唾液分泌，然后将唾液吐至收集管中达到6mL的标记，将此6mL的唾液分装至3个无酶无菌的离心管中，每个2mL，并在每个含有唾液的离心管中分别加入等量的试剂组合物S1、S2和常规的细胞保存液(购自深圳市华晨阳科技有限公司)。
将包含试剂组合物S1和唾液的混匀样品在室温下保存0天，7天，14天，30天和90天和360天(表1中1-6)，包含试剂组合物S2和唾液的混匀样品在室温下保存0天，7天，14天，30天和90天和360天(表1中7-12)，包含常规细胞保存液与唾液的样品在室温下保存14天和第30天(表1中13和14)。上述准备好的样品使用CretBiotech公司试剂盒《磁珠法唾液&拭子基因组DNA提取试剂盒》(Cat#CNA004901)进行提取，每次使用250μL样品进行提取，100μL洗脱液进行洗脱。
从表1和图1中得知，唾液样品保存于试剂组合物S1或者S2后，在室温下存储1年依旧可以得到高分子的DNA(＞23kb)，且经过提取试剂盒提取之后，从表1可以看出，在Nanodrop和Qubit上进行的测试显示，DNA得量变化＜20％，A260/280＞1.7，A260/230＞1.5。而对照的常规细胞保存液在常温下保存14天后即在电泳上不能观察到清晰的主带。
A.DNA浓度和纯度的吸光度测定
260nm下的吸光度测量(A260nm)常被用于定量DNA。在260nm下1.0的吸光度对应于50ng/μL浓度的纯双链DNA。利用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Fisher ScientificInc)确定在各种条件下经过或不经过本发明的试剂组合处理的纯化唾液样品的DNA收率。将2μL体积的各DNA样品置于底座上并经220nm至350nm扫描，并测量在230nm、260nm和280nm下的吸光度。通过NanoDrop 2000c软件报告样品DNA浓度(ng/μL)、A260/A280比和A260/A230比。
B.DNA浓度的荧光法测定
鉴于采用A260nm可能存在如下缺点：(i)分析的不灵敏性；和(ii)非DNA组分如RNA的干扰。于是，本发明人采用荧光染料方法进行进一步的测定，该方法使用InvitrogenQubit 4.0定量纯化样品的DNA量。其中所采用的荧光双链DNA结合染料(485nm激发/535nm放射)能够灵敏地定量亚纳克数量的双链DNA。
C.储存在稳定化组合物中的样品中的DNA的完整性
将上述提取的样品的DNA产物取5μL在120伏特下通过电泳在1％琼脂糖凝胶上分离15分钟。将凝胶在室温下在蒸馏水中的1μg/mL溴化乙锭(EtBr)中染色15分钟，冲洗并在UV透射器上利用成像系统(UVP LLC)照相。当凝胶上的染色带清晰并且与DNA梯相比显示>23Kb时，可以确定DNA被稳定化并且完整，DNA Marker尺寸作为参考。
表1：唾液样品长时间保存的DNA浓度和纯度检测
D.PCR扩增操作检测
参考表2和表3进行PCR扩增操作(扩增试剂盒来自CretBiotech PCRKit)，将上述提取的样品的DNA产物1-6号，以及13号和C标准DNA(50ng/uL)，扩增rs7412基因区段，从图2中看到1-6号与C(control)都能扩增出明亮的条带，而常规细胞保存液13号则不能扩增出条带。
表2：PCR体系(引物探针由生工生物合成)
| 2×PCR Buffer(缓冲液) | 10ul |
| Primer-F | 0.5ul |
| Primer-R | 0.5ul |
| 25mM dNTP | 0.16ul |
| Tag酶 | 0.2ul |
| Templates | 2ul |
| ddH2O | To 20ul |
表3：PCR条件
| 95℃ | 5min |
| 95℃ | 30sec |
| 60℃ | 30sec |
| 72℃ | 1min |
| 72℃ | 7min |
| 12℃ | ∞ |
实施例2：拭子样品DNA保存试剂组合物
该试剂组合物为pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂、抗微生物剂的组合。
按照如下组分和浓度采用去离子水配制试剂组合物：100mM乙酸钠、100mM柠檬酸钠、50mM丙氨酸、50mM三草酸、0.5％十二烷基硫酸钠、0.2％NP40和0.05％庆大霉素。pH分别为5、6、7、8、9、10、11和12。
受拭者使用凉水重洗口腔三次，然后等待5min采用植绒拭子按照标准刮取口腔拭子，各取8个后分别加入上述保存液各1mL，室温下混匀后放置1个月。上述准备好的样品使用CretBiotech公司试剂盒《磁珠法唾液&拭子基因组DNA提取试剂盒》(Cat#CNA004901)进行提取，每次使用200μL样品进行提取，100μL洗脱液进行洗脱。
从表4和图3中得知，口腔拭子样品保存于试剂组合，在室温下存储1个月后发现上述试剂组合在pH为9-10时效果特别好，令人意外的，因为通常认为在pH7-8才得到比较好的结果。在弱碱性下，尤其是在pH 9-10时效果最佳，依旧可以得到高分子的DNA(＞23kb)，且经过提取试剂盒提取之后，从Nanodrop和Qubit上测试发现DNA的量在pH 9和10时保留高分子量DNA，A260/280＞1.8，A260/230＞1.8。pH5-8时DNA主带明显没有pH 9和10清晰明亮，而常规保存液pH为7-8，而在本发明的试剂组合中保存DNA则需要在更为碱性的环境中存在。
表4：拭子样品长时间保存的浓度和纯度检测
实施例3：血浆样品病毒DNA保存试剂组合物
该试剂组合物为pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂、抗微生物剂、无机盐离子和还原剂的组合。
按照如下组分和浓度采用去离子水配制微生物DNA保存试剂组合物：100mM乙酸钠、100mM柠檬酸钠、50mM丙氨酸、50mM三草酸、0.5％十二烷基硫酸钠、0.1％辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、0.05％庆大霉素、100mM氯化锂、10mM亚硫酸钠，pH 10，并将此配方标记为SB10。
将含病毒的阳性血浆样品用阴性血浆稀释、或用市场常规VTM(hanks溶液为主的病毒保存液)或用上述试剂组合SB10进行稀释，稀释比例为1:1，混匀后放置数天后，间隔几天依次提取其中的病毒DNA并使用qPCR进行扩增(扩增试剂盒来自江苏硕世生物科技有限公司)，从表5中可以看到，使用试剂组合物SB10保存乙肝病毒时，在室温下14天后检测与第0天检测灵敏度一致，而其他两种保存试剂都不能实现常温保存。
表5：乙肝病毒DNA常温保存测试
| 保存液 | Day 0(Ct) | Day 3(Ct) | Day 7(Ct) | Day 14(Ct) |
| 阴性血浆 | 30.1 | 30.7 | 32.3 | 36.6 |
| VTM | 30.4 | 31.3 | 33.6 | 35.3 |
| 试剂SB10 | 29.7 | 30.1 | 30.0 | 30.5 |
实施例4：粪便样品DNA保存试剂组合物
该试剂组合物为pH稳定剂、螯合剂、蛋白变性剂、抗微生物剂、无机盐离子、还原剂、组织渗透剂和核酸酶抑制剂组合。
按照如下组分和浓度采用去离子水配制微生物DNA保存试剂组合物：
100mM乙酸钠、100mM柠檬酸钠、50mM丙氨酸、50mM三草酸、0.5％十二烷基硫酸钠、0.1％辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、0.05％庆大霉素、100mM氯化锂、10mM亚硫酸钠、10％(v/v)的二甲亚砜、0.05％(w/v)的花青素，pH10，并将此配方标记为ST10。
分别取新鲜粪便固体样品1g加入不同的5mL的保存液中，使用涡旋混匀仪混匀后，在室温下保存15天后使用，每次使用200μL固液混合液，根据MP biomedicals公司磁珠法粪便DNA提取试剂盒(Cat#116570400)说明书进行操作，本发明人发现试剂组合物ST10可以稳定高分子量DNA至少15天，而其他的样品保存液则不能在室温下稳定粪便样品中的高分子量DNA。
具体粪便样品DNA提取操作如下：
1、向Lysing Matrix E中加入200μL粪便-保存液样品，加入1000μL Lysis BuferF1和20μL Lysis Bufer F2，最大速度涡旋30s使样品混匀；
2、使用FastPrep-24样品制备仪，5.0m/s，研磨60s；
3、12000rpm离心5min，保存上清液，弃去沉淀；
4、将900μL上清液转移至新的2mL离心管中，加入250μL PPS，颠倒混匀20次；
5、12000rpm离心5min，保存上清液，弃去沉淀；
6、将1000μL上清液转移至新的2mL离心管中，加入1000μL Binding Buffer F和10μL Magnetic Beads，涡旋混匀；
7、将离心管置于摇床上震荡5min，磁珠结合DNA；
8、磁性分离后，弃去上清液，加入1000μL Wash Buffer F1，震荡3min；
9、磁性分离后，弃去上清液，加入1000μL Wash Buffer F2，震荡3min；
10、磁性分离后，弃去上清液，置于55℃晾干5min；
11、向离心管中加入100μL TE Buffer，重悬磁珠，将离心管置于55℃洗脱5min；
12、将洗脱液转移至新的1.5mL离心管，即可应用于下游检测。
表6：不同保存液保存粪便样品DNA
| 序号 | 试剂组合 |
| 1 | 去离子水 |
| 2 | 生理盐水 |
| 3 | 细胞保存液 |
| 4 | 试剂组合S1 |
| 5 | 试剂组合SB10 |
| 6 | 试剂组合ST10 |
将上述提取的样品的DNA产物取5μL，在120伏特下通过电泳在1％琼脂糖凝胶上分离15分钟。将凝胶在室温下在蒸馏水中的1μg/mL溴化乙锭(EtBr)中染色15分钟，冲洗并在UV透射器上利用成像系统(UVP LLC)照相。从图4可以看出，凝胶上的染色带清晰并且与DNA梯相比显示>23Kb，由此可以确定DNA被稳定化并且完整(DNA Marker尺寸作为参考)。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (8)
1.一种用于稳定化唾液样品中的核酸分子的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物包含100mM乙酸钠、100mM柠檬酸钠、50mM丙氨酸、25mM酒石酸钠、2.5M尿素、0.05-0.1%辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、5-15%乙醇、10mM 亚硫酸钠和余量的水，pH值为9-10。
2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述pH值为9.5。
3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述乙醇的浓度为10%。
4.一种用于稳定化唾液样品中的核酸分子的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1至3中任一项所述的试剂组合物进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述唾液样品与所述试剂组合物的水溶液的体积比为1:5至4:1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述唾液样品与所述试剂组合物的水溶液的体积比为1:3至2:1。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂组合物在稳定化唾液样品中的核酸分子中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用采用权利要求4至6中任一项所述的方法进行。
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- 2020-12-30 CN CN202011599233.XA patent/CN112760318B/zh active Active
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