CZ304780B6

CZ304780B6 - Způsob archivace DNA z histopatologického materiálu

Info

Publication number: CZ304780B6
Application number: CZ2012-748A
Authority: CZ
Inventors: Marie Korabečná
Original assignee: Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Plzni
Priority date: 2012-11-02
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2014-10-15
Also published as: CZ2012748A3

Abstract

Řešení popisuje způsob archivace DNA z histopatologického materiálu, při němž se histopatologický materiál nanese na podložní mikroskopické sklíčko určené pro analýzu jednotlivých buněk, následně se k nanesenému histopatologickému materiálu přidá lyzační pufr L, připravený smícháním pufru T, obsahujícího 30mM Tris-HCl a majícího pH=8, a roztoku K, obsahujícího proteinázu K v koncentraci 20 mg/ml v pufru o složení 20mM Tris-HCl, 1mM CaCl.sub.2.n., 50% glycerol, a majícího pH=7,3, v poměru 2T:1K až 5T:1K tak, aby se na ploše histopatologického materiálu určené k izolaci DNA vytvořila kapka, takto vytvořená kapka se následně kompletně překryje minerálním olejem a podrobí se inkubaci po dobu v rozmezí 1 až 12 hodin při teplotě v rozmezí 50 až 60 .degree.C a následné inkubaci o délce 5 až 15 min při teplotě v rozmezí 75 až 95 .degree.C, poté se odpipetuje poloviční množství přidaného minerálního oleje a vysuší se zbylý vzorek na sklíčku při teplotě v rozmezí 40 až 70 .degree.C. Řešení popisuje i vhodný způsob odběru archivované DNA.

Description

Způsob archivace DNA z histopatologického materiálu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu archivace DNA z histopatologických preparátů, užívaných pro rutinní vyšetření v patologii a soudním lékařství.

Dosavadní stav techniky

S rozvojem analýzy DNA a masovým nástupem genomických přístupů nabývá na významu spolehlivá extrakce DNA a zejména její následná archivace. Analýza DNA z archivovaných vzorků získává na důležitosti nejen v medicínských oborech, ale také v široké oblasti přírodních věd zejména s ohledem na biobanking a barcoding živých organismů (Knebelsberger T, Stóger I. DNA extraction, preservation, and amplification. Methods in Molecular Biology 2012; 858:31138). Jedním z nej běžnějších způsobů dlouhodobého uchovávání izolované DNA je archivace v zamraženém stavu v plastových zkumavkách, vzhledem k širokému spektru možných typů vzorků však neexistuje obecně aplikovatelná univerzální DNA archivační metoda. Jsou testovány různé způsoby uchovávání nejrůznějších biologických vzorků vhodné pro pozdější extrakci (např. Mychaleckyj JCet al.: Bufy coat specimens remain viable as a DNA source for highly multiplexed genome-wide genetic tests after long term storage. Journal of Translation Medicine_2011 ;9:91, Hollegaard MVet al.: Genotyping whole-genome-amplified DNA from 3- to 25year-old neonatal dried blood spot samples with reference to fresh genomic DNA. Electrophoresis, 2009; 30: 2532-5, Graham EA et al.: Room temperature DNA preservation of soft tissue for rapid DNA extraction: an addition to the disaster victim Identification investigators toolkit? Forensic Science International: Genetics. 2008; 2: 29-34, Moore JEet al.: A simple and economic preservation method for genomic bacterial DNA from clinically significant pathogens. Journal of Microbiological Methods. 2005;60:131-3).

Existuje způsob dlouhodobého uchovávání DNA v suchém stavu na FTA kartách obsahujících chemikálie zajišťující lýzi buněk, denaturaci proteinů a ochranu nukleových kyselin proti nukleázám, oxidaci a UV záření (FTA Cards, Whatman, Patenty US 5 496 562, US 5 756 126, US 5 807 527, US 5 972 386, US 5 985 327).

Tento způsob je však pro aplikace v molekulární patologii, kde jde o vyšetření mikrodisekovaných částí histopatologických tkáňových řezů nevhodný, protože vyžaduje přenos materiálu (například již izolovanou DNA) na kartu, při následujícím vyšetření takto uchované DNA je potřeba vyseknout terčík z této karty a ten podrobit dalším krokům. Při práci s malým množstvím materiálu tak hrozí nejen jeho ztráta, ale i kontaminace DNA ve vzorku původně nepřítomnou. V určitých případech nevyžadujících mikroskopickou kontrolu přenášeného materiálu lze otisknout na FTA kartu přímo operativně získanou tumorovou tkáň (Petras ML et al. KRAS detection in colonic tumors by DNA extraction from FTA páper: the molecular touchr-prep. Diagnostic Molecular Pathology. 2011 ;20:189-93).

Mikroskopická skla jako potenciální nosič DNA molekul byla zkoumána pouze s ohledem na vývoj čipových technologií. V této souvislosti bylo zjištěno, že neupravená mikroskopická skla se nehodí pro ireverzibilní ukotvení DNA molekul - lososí DNA, která na ně byla ve velké množství experimentálně aplikována, byla postupně odmývána, přičemž v experimentálních podmínkách dané studie byla popsána kinetika tohoto odmýváni (Nanassy OZ et al., Capture of genomic DNA on glass microscope slides. Analytical Chemistry 2007; 365: 240-245).

AmpliGrid technologie (Beckman Coulter Biomedical, Advalytix Products, Munich/Germany) byla vyvinuta s cílem umožnit analýzu jednotlivých buněk v nízkoobjemovém PCR přímo na sklíčku. V současnosti se používá zejména ve spojení s vyšetřováním transkripčních (např. May

- 1 CZ 304780 B6

A et al., Multiplex RT-PCR Expression Analysis of Developmentally Important Cenes in Individual Mouše Preimplantation, Embryos and Blastomeres. Biology and Reproduction 2009; 80, 194-202) a nověji i methylačních profilů (Kantlehner M et al.: A high-throughput DNA methylation analysis of a single cell. Nucleic Acids Research 2011; 39: e44) jednotlivých živých buněk získaných pomocí fluorescenční flow cytometrie (fluorescence-activated cell sorter FACS) nebo jako nosič pro amplifikaci vzorků o malé koncentraci a objemu nejen v medicínské diagnostice (např. Mayer V et al.: Single Cell Analysis of Mutations in the APC Gene. Fetal Diagnosis and Therapy 2009; 26:148-156), ale také v archeologii (např. Woide D et al.: Technical notě: PCR analysis of minimum target amount of ancient DNA. American Journal of Physical Anthropology 2010; 142: 321-327) a kriminalistice (např. Brůck S et al.: Single cells for forensic DNA analysis-from evidence materiál to test tube. Journal of Forensic Sciences 2011; 56: 176-80).

Využití tkání archivovaných ve formě parafínových bločků, při jejichž přípravě se v rutinní praxi nejčastěji používá pro fixaci tkáně formaldehyd, je rovněž často zdrojem obtíží ve vztahu ke kvalitě DNA získatelné z takto fixovaného materiálu, byly testovány různé přístupy vedoucí k rozrušení kovalentních vazeb mezi DNA a proteiny vzniklých v důsledku fixace (Gilbert MT et al.: The isolation of nucleic acids from flxed, paraffin-embedded tissues-which methos are useful when? PLoS One 2007;2:e537).

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je archivace DNA z histopatologického materiálu, například mikrodisekovaného histopatologického materiálu, v dostatečné kvalitě pro další (downstream) aplikace na snadno dostupném nosiči vhodném pro opakovaný odběr vzorků i mezilaboratomí výměnu, tj. například zasílání celého nosiče s panelem archivovaných DNA z mikrodisekovaných vzorků, s možností mikroskopické kontroly výchozího materiálu.

Tohoto cíle je dosaženo způsobem archivace DNA z histopatologického materiálu, jehož provedení umožní archivaci DNA k pozdějšímu odběru a analýze. Archivovatelnost DNA je v řádu měsíců.

Po nanesení histopatologického materiálu (tkáně), například mikrodisekcí, na podložní mikroskopické sklíčko určené pro analýzu jednotlivých buněk následně šetrná DNA izolace pro archivaci přímo na sklíčku následujícím způsobem: k histopatologickému materiálu se přidá lyzační pufr L, připravený smícháním pufru T (30mM Tris-HCl, pH=8) a roztoku K (proteináza K v koncentraci 20 mg/ml v pufru o složení 20mM Tris-HCl, lmM CaCl₂, 50% glycerol, pH = 7,3) v poměru 2T:1K až 5T:1K tak, aby se na ploše histopatologického materiálu určené k izolaci DNA vytvořila kapka. Takto vytvořená kapka se následně kompletně překryje minerálním olejem v kvalitě pro molekulární biologii. Následuje inkubace po dobu v rozmezí 1 až 12 hodin při teplotě v rozmezí 50 až 60 °C a následovaná inkubací o délce 5 až 15 min při teplotě v rozmezí 75 až 95 °C. Poté se odpipetuje poloviční množství přidaného minerálního oleje a následuje vysušení zbylého vzorku na sklíčku při 40 až 70 °C.

Tris-HCl je 2-amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propandiol hydrochlorid.

Vhodným podložním mikroskopickým sklíčkem určeným pro analýzu jednotlivých buněk je například sklíčko AmpliGrid dodavatele Beckman Coulter. Sklíčko AmpliGrid má 48 pozic a umožní procesovat 48 vzorků.

Příkladem vhodného množství přidaného lyzačního pufru L pro vytvoření kapky je přidání 2 mikrolitrů lyzačního pufru L ke vzorku tkáně do vyryté kruhové pozice o průměru 2 mm ohraničující na sklíčku prostor s analyzovanou tkání (tj. ohraničující 1 pozici na sklíčku).

-2 CZ 304780 B6

Lyzační pufr L je s výhodou připraven až těsně před použitím smícháním pufru T a roztoku K. Pufr T a roztok K. by měly být uchovávány v -20 °C. Roztok K je komerčně dostupný jako Proteinase K solution od dodavatele Qiagen.

Ve výhodném provedení je poměr pufru T a roztoku K v lyzačním pufru L 3T:1K.

S výhodou se inkubace provádí 1 hodinu při 56 °C a 10 min při 95 °C.

Ve výhodném provedení se vysušení zbylého vzorku provede při teplotě v rozmezí 55 až 65 °C.

Takto je nosič připraven k archivaci izolované DNA a pozdějším odběrům. Vzhledem k tomu, že postup byl velmi šetrný, je možné mikroskopicky kontrolovat stav tkáně (např. mikrodisekátu), která zůstává stále ve vyznačené pozici na sklíčku, a přítomnost zbylého minerálního oleje navíc zajišťuje projasnění mikroskopického obrazu, což je jedním z velkých přínosů předkládaného vynálezu.

Odběr DNA lze pak provádět nanesením 3 až 5 μΐ pufru T (30mM Tris-HCl, pH=8) do příslušné pozice na sklíčku, a po 30 až 60sekundové inkubaci při laboratorní teplotě je vzorek připraven k odsátí kapalné složky a jejímu využití v některé z dalších aplikací založených na PCR. Po odsátí pufru s DNA příslušná pozice na sklíčku vyschne během 5 minut při pokojové teplotě bez speciálních zásahů. Po takto provedeném odběru je možné vzorek dále archivovat, dlouhodobě při teplotě v rozmezí 4 až 8 °C, krátkodobě při pokojové teplotě, což umožňuje výměnu nosičů se vzorky poštou či kurýrní službou. Opakované odběry se provádějí stejným způsobem.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje integritu DNA ve vzorcích archivovaných způsobem podle vynálezu a znovu odebraných, podle příkladu 1:

A- Integrita 8 vzorků izolovaných v souladu s vynálezem bezprostředně po izolaci na sklíčku AmpliGrid (L=velikostní standard, PK=pozitivní kontrola - 600bp fragment nahoře, NK=negativní kontrola)

B- Integrita vzorku odebraného opakovaně z téže pozice v první dráze ve srovnání s integritou vzorků odebraných z dotyčných pozic poprvé po čtvrt roku trvající archivaci (druhá a třetí dráha).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Integrita izolované a archivované DNA

Byla provedena izolace DNA z řezů renálního papilámího karcinomu uchovaného ve formě formaldehydem fixované tkáně ve formě parafínového bločku. Řezy o tloušťce 4 pm byly aplikovány na Frame Slides (PET membrane, l,4pm, Leica), obarveny klasicky hematoxylínem a eosinem a poté podrobeny mikrodisekci (Laser Capture Microdissection, LMD 6500, Leica). Mikrodiskované kousky tkáně o velikosti 0,2 mm² byly v průběhu mikrodisekčního procesu lokalizovány jednotlivě do 48 vyznačených pozic na sklíčku AmpliGrid. Pozice byly kruhové, o průměru 2 mm.

Následovala izolace DNA a archivace sklíčka:

-3CZ 304780 B6

Do každé z 48 pozic s mikrodisekovanou tkání byly přidány 2 mikrolitry Iyzačního pufru L (připravený těsně před použitím smícháním pufru T (30mM Tris -HC1, pH=8) a roztoku K (Proteinase K solution od Quiagen: proteináza K v koncentraci 20 mg/ml v pufru o složení 20mM

Tris-HCl, lmM CaCl₂, 50% glycerol, pH = 7,3) v poměru 3T:1K tak, aby se na ploše tkáně určené k izolaci DNA vytvořila kapka. Pufr T a roztok K byly uchovávány v -20 °C. Kapky byly kompletně překryty minerálním olejem v kvalitě pro molekulární biologii. Následovala inkubace 1 hodinu při 56 °C a 5 min při 95 °C. Poté bylo odpipetováno poloviění množství přidaného minerálního oleje ze všech pozic na sklíčku a následovalo vysušení vodné složky při 56 °C.

V čtrnáctidenních intervalech byly pak odebírány z archivovaného sklíčka vzorky DNA vždy ze 4 až 10 pozic v jednom experimentu v souladu s popisem vynálezu:

Pro odběr izolované DNA ze sklíčka bylo použito 5 μΐ pufru T (30mM Tris-HCl, pH=8) napipe15 tovaného do příslušné pozice na sklíčku a po 30 s inkubaci při laboratorní teplotě byla vodná složka odsáta a přemístěna do tenkostěnné zkumavky vhodné pro PCR.

V takto získaných vzorcích byla zkoumána integrita DNA metodou dle publikace: van Dongen JJ et al.: Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immu20 noglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003; 17: 2257-2317. Jedná se o amplifikaci DNA metodou multiplex PCR tak, aby vznikaly amplikony o délce 100 až 600 bp (base pairs). Přítomnost delších amplikonů je důkazem, že integrita izolované DNA je dostačující pro aplikace v molekulární patologii - prokazuje, že ve vzorku jsou zachovány dostatečně dlouhé molekuly DNA.

Primery použité v této metodě jsou uvedeny v tabulce 1. PCR reakce o objemu 25 μΐ byly připraveny dle rozpisu uvedeného v tabulce 2 a podrobeny amplifikaci dle programu popsaného v tabulce 3 na přístroji 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems). Jako pozitivní kontrola byla použita DNA izolovaná z čerstvé krve dobrovolného dárce na přístroji QIAsymphony (Qiagen) kitem DNA Mini Kit (Qiagen), jako negativní kontrola voda pro injekce. Specifita produktů byla kontrolována na 2% agarózovém gelu. Obrázek 1 ukazuje dostatečnou integritu DNA vzorků i po tříměsíční archivaci a opakovaném odběru DNA z téže pozice.

Tabulka 1: Použité primery pro zkoumání integrity DNA dle van Dongena JJ et al. (2003)

Gen	Forward primer	Reverse primer	Délka (bp)
Tbxasl	GCCCGACATTCTGCAAGTCC	GGTGTTGCCGGGAAGGGTT	100
Ragl	TGTTGACTCGATCCACCCCA	TGAGCTGCAAGTTTGGCTGAA	200
Phf	TGCGATGTGGTCATCATGGTG	CGTGTCATTGTCGTCTGAGGC	300
AF4 exon 11	CCGCAGCAAGCAACGAACC	GCTTTCCTCTGGCGGCTCC	400
AF4 exon 3	GGAGCAGCATTCCATCCAGC	CATCCATGGGCCGGACATAA	600

-4CZ 304780 B6

Tabulka 2: Složení reakční směsi pro zkoumání integrity DNA

Reagencie	Množství na jednu reakci (μΐ)
Fast Start Master Mix (Roche)	10
25mM roztok Mg²⁺	0,4
Primer mix (10 pmol každého primeru)	0,48
h₂o	9,12
DNA	5

Tabulka 3: Program cycleru pro PCR zaměřené na zkoumání integrity

Program	Počet cyklů	Teplota (°C)	v Cas (min.)
Aktivace	1	95	14:00
Denaturace	35	95	01:00
Annealing	60	01:00
Extenze	72	01:30
Finální extenze	1	72	07:00
Hold	1	04	OO

Příklad 2

Forenzní identifikace izolované a archivované DNA

Vzorky izolované a archivované na sklíčku AmpliGrid, jak je popsáno v příkladu 1, byly odebrány po tříměsíčním uchovávání. Na každou pozici bylo naneseno 5 mikrolitrů pufru T a po 30 s inkubaci při laboratorní teplotě odpipetováno do tenkostěnné zkumavky vhodné pro PCR. Takto získané vzorky byly použity pro standardní individuální identifikaci - byly podrobeny amplifikaci a fragmentační analýze za pomoci systému PowerPlex ESI 17 (Promega) v souladu s pokyny výrobce. Jedná se o metodu celosvětově využívanou laboratořemi forenzní genetiky k individuální identifikaci osob.

Vzorky odebrané z pozic na sklíčku Ampli Grid po čtvrt roku trvajícím skladování při 4 až 8 °C (běžná chladnička) poskytly profily dostačující k individuální identifikaci - došlo k amplifikaci na všech 17 do multiplexu zahrnutých lokusech. Při vyhodnocování výsledků byl k dispozici profil osoby, provádějí vlastní mikrodisekci, izolaci i odběr DNA z pozice na skle, ale i profily laboratorního personálu laboratoře provádějící vlastní identifikační reakce tak, aby bylo možné odlišit kontaminaci prostřednictvím DNA nepocházející z mikrodisekované tkáně. Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 4 - mikrodisekované vzorky poskytly unikátní profil, jehož frekvence výskytu byla na základě práce Šimková H et al.: Allele frequency data for 17 short tandem repeats in aCzech population sample. Forensic Science International: Genetics 2009; 4: el5-el7 a frekvencí alel příslušných polymorfismů na www.promega.com vypočítána jako 5 z 10²⁴.

Tento příklad aplikace vynálezu tedy jasně dokládá jeho využitelnost v oblasti forenzní genetiky.

- 5 CZ 304780 B6

Tabulka 4: Forenzní identifikace původce mikrodisekované tkáně

Lokus	Amelo genin	D3S1358	D19S433	D2S1338	D22S104 5	D16SS39	D18S51	D1S1656	D10SU24 8
Genotyp	XX (žena)	15-17	14-15	23-26	12	11-12	14-15	15-17.3	13- 13
Lokus		D2S441	THO1	vWA	D21S11	D12S391	D8S1179	FGA	SE33
Genotyp		11.3	6-8	15-17	28 - 30.2	18-18.3	11 - 13	20-23	15-26.2

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob archivace DNA z histopatologického materiálu, vyznačený tím, že histopatologický materiál se nanese na podložní mikroskopické sklíčko určené pro analýzu jednotlivých buněk, následně se k nanesenému histopatologickému materiálu přidá lyzační pufr L, připravený smícháním pufru T, obsahujícího 30mM Tris-HCl a majícího pH=8, a roztoku K, obsahujícího proteinázu K v koncentraci 20 mg/ml v pufru o složení 20mM Tris-HCl, lmM CaCl₂, 50% glycerol, a majícího pH =7,3, v poměru 2T:1K až 5T:1K tak, aby se na ploše histopatologického materiálu určené k izolaci DNA vytvořila kapka, takto vytvořená kapka se následně kompletně překryje minerálním olejem a podrobí se inkubaci po dobu v rozmezí 1 až 12 hodin při teplotě v rozmezí 50 až 60 °C a následné inkubaci o délce 5 až 15 min při teplotě v rozmezí 75 až 95 °C, poté se odpipetuje poloviční množství přidaného minerálního oleje a vysuší se zbylý vzorek na sklíčku při teplotě v rozmezí 40 až 70 °C.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že poměr pufru T a roztoku K v lyzačním pufru L je 3T:1K.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se inkubace provádí 1 hodinu při 56 °C a pak 10 min při 95 °C.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že vysušení zbylého vzorku se provede při teplotě v rozmezí 55 až 65 °C.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se dále provede odběr archivované DNA tak, že se nanese 3 až 5 μΐ pufru T, obsahujícího 30mM Tris-HCl a majícího pH=8, do pozice na sklíčku obsahující vzorek izolovaný způsobem podle nároku 1, a po 30- až 60sekundové inkubaci při laboratorní teplotě se odsaje kapalná složka.