JP6559647B2 - 非溶出試料のワンステップ核酸増幅方法 - Google Patents
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Description
(i)標的核酸を含有する細胞試料と接触させた含浸化学物質を含む固体支持体を反応容器に移す工程と、
(ii)固体支持体上の核酸を、試料から核酸を溶出させるのに十分な高pH溶液とインキュベートする工程と、
(iii)核酸を増幅して、増幅核酸を生じさせる工程と、
(iv)増幅核酸を定量する工程と
を含む方法を提供する。
(i)カオトロピック塩を含む固体支持体を、核酸を含有する細胞試料と接触させる工程と、
(ii)固体支持体を反応容器に移す工程と、
(iii)固体支持体上の核酸を、核酸増幅試薬溶液とインキュベートする工程と、
(iv)核酸を増幅して、増幅核酸を生じさせる工程と、
(v)増幅核酸を定量する工程と、場合により、
(vi)ショートタンデムリピート(STR)プロファイリングを用いてSTRプロファイルを作成する工程と
を含んでいて、固体支持体存在下で、工程(i)〜(vi)が実施される、方法が提供される。
(i)溶解試薬を含む固体支持体を、核酸を含有する細胞試料と接触させる工程と、
(ii)固体支持体を反応容器に移す工程と、
(iii)固体支持体上の核酸を、核酸増幅試薬溶液とインキュベートする工程と、
(iv)核酸を増幅して、増幅核酸を生じさせる工程と、
(v)場合により、増幅核酸を定量する工程とを含み、
固体支持体存在下で、工程(i)〜(v)が実施される、方法が提供される。
(i)法医学的ワークフロー自動化
最近の実験結果は、FTA Expressと呼ばれる非洗浄最適化法によって、典型的な自動化HIDワークフローにおいて、効率的で損失がなく、減少がないプロセスが可能であることを示している。一般的に、当該産業は、Identifiler Direct又はPowerplex 18Dワークフローのいずれかにおいて、1.2mm FTAパンチを使用し、非洗浄FTAパンチに含まれる洗剤化学物質を克服するために、特殊な増幅反応混合物及び酵素を配合した。この洗剤の量でのポリメラーゼは、上のようにしなければ変性し、STR反応が非効率になる。典型的な方法は、特殊なSTR配合物を含有し、合計体積が10〜25μlの1つの管又はウェルに1つの1.2mmパンチを直接加えることに基づく。対照的に、本発明は、かなりの量のDNAが一本鎖になる高pH溶出緩衝液に1つの1.2mmパンチを加えることを提案し、溶液の体積全体に迅速に拡散する。約8〜10分の短い時間中に、所定体積の中和剤を加え、合わせて合計で100〜200μlの体積を得て、これには約0.05〜0.2ng/μlのゲノムDNAが含まれている。次いで、このDNAストック溶液を多段階STR反応に使用することができ(Powerplex 16HSを用いる例を開示する)、5〜10μlを複数回取り出し、並行反応に加えることができる。任意の分子生物学手順のための複製及びアンプリコンの適用のために、この溶液の一部をqPCR反応又は一般的なPCR反応に加えることも可能である。特に関係があるのは、本発明が、1.2mmパンチを利用せずに、おそらく2mm又は3mmのパンチを使用し、自動化ワークフローを確立することができる能力であり、化学量論比率の高pH溶出緩衝液と中和剤を再び使用し、約10分間の処理時間で、顕著に多くのDNAを生じる。この特徴は、消耗品であるプラスチックワイヤによって生じる静電放電に起因して、自動化システムへのパンチの置き違えを確実に防ぐには、1.2mmパンチの操作は困難であり、特別な注意が必要であることを認識するとき、重要になる。本明細書に記載したように、高体積溶出に基づく容易なシステムが開発されたため、特別に配合されたPCR試薬又はSTRキット又は自動化された洗浄に頼ることなく、法医学で迅速なワークフローを利用することができ、非常に小さなパンチの静電放電による置き違えに起因するパンチの損失を避けることができる。FTAパンチの表面をこするための研磨棒をさらに使用し、高pH溶出溶液への直接的な置き換えによって、洗浄又は特別に配合された増幅反応物に頼ることなく、このプロセスの小型化が改良される。
(ii)microRNA
まれに、microRNAのように圧倒的な量の関心を得る新しい研究領域がある。実際に、過去20年の間に、真核性遺伝子制御の分野は、一部にはRNAが介在する遺伝子サイレンシングの発見によって、大きく様変わりした。真核生物での大部分の遺伝子制御は、RNA分子レベルで起こる。microRNA(miRNA)と呼ばれる内因性制御RNA分子群は、全ヒト遺伝子の約30%の制御に関与していると思われる。これらの「小さなRNA」分子(sRNA)は、がん、糖尿病又は神経性障害の進行にも、何らかの役割を果たす。
(iii)多くの種類のウイルスは、ヒト及び他の種を感染させることが知られており、典型的には、血液循環中に見出され得る。これらの多くは低分子量の核酸であり、DNA又はRNAに由来していてもよく、環状又は直鎖の性質を有していてもよい。これらの大きさのため、典型的にすべての公開された方法で記載されているFTAパンチで激しく洗浄すると、かなりの数のゲノム等価体が失われ、健康の指標として決定されるべき数のウイルス複製物を得ることができないだろう。このことは、特に、効果的な薬物治療計画のためにウイルス複写物の数のモニタリングが重要である、HIV感染のような慢性疾患では重要である。FTA又は同様の乾燥した血液スポットサンプリングを使用するプロセスは、ウイルス複写物の数を保存することを確保するには、是が非でも洗浄を避けるべきである。本願発明者らの新しい方法は、この分析に適しており、他の方法と比較して、単純な手法を与えるだろう。
(iv)古い血液試料:古い血液試料をFTAに適用すると、試料中の全RNA及びDNAの分子一体性に関し、品質が悪くなることが多いことが知られている。しかし、近年の方法は、フラグメント化した核酸を探索し得る次世代の配列決定を開発した。本発明の方法は、さらに、攻撃的な洗浄工程をもたらす現行のFTA手順を用いると疑いようもなく起こる相当量の有益な核酸の損失を抑えることによって、次世代の配列決定方法で使用するための古い核酸の分子一体性を保護するのを助けることにより、これらの方法を補助するだろう。
使用する化学物質及び材料
化学物質及びその供給源のリストを以下に与える。
Indicating FTA(商標)elute cassette(WB120230);
FTA Classicカード(WB120205)
正常なヒト血液(Tissue Solutions Ltd);
ゲノムDNA(Promega product コードG152A);
Harris Uni−coreパンチ、1.2mm(Sigma、カタログ番号Z708860−25ea、ロット3110);
TaqMan Universal PCR master Mix、AmpErase UNGなし(Applied Biosystems 部品番号4324018);
TaqMan RNase P Detection Reagent(Applied Biosystems 部品番号4316831)−RNase Pプライマーを含有する;
Quantifiler qPCRキット、Applied Biosystems Part:4343895
PowerPlex 18D(Promega コードDC1802)−プライマーを含有する;
PowerPlex 16 HS(Promega コード:DC2101−プライマーを含有する;
滅菌水(Sigma Product コードW4502);
Huma子宮頸部上皮細胞(HeLa)(ATCCコードCCL−2)及び
Hi−DIホルムアミド(ABI code 4311320)。
2.5×106細胞/mlの濃度で培養したHeLa細胞を、indicating FTA elute(iFTAe)カードの上にスポットした。細胞をスポットしたFTA eluteカードから1.2mmのパンチ片を採取し、最終体積25μlで、直接的なSTRキットPowerPlex 18D反応混合物と合わせた。増幅前に、25μlの試料混合物を、96ウェルPCRプレートのそれぞれのウェルに加えた。10秒間の試料注入を用い、3130x1キャピラリー電気泳動で試料を分析した。
1×107細胞/mlの濃度で培養したHeLa細胞又は白血球を、indicating FTA eluteカードの上にスポットした。細胞をスポットしたFTA eluteカードから3mm又は1.2mmのパンチ片を採取し、iFTAe高スループット溶出プロトコルを用いて溶出させるか、又は1mlの溶出緩衝液を用いて洗浄するか、又は洗浄せずにおく。試料、FTAカード又は5μlの溶出液のいずれかを、TaqMan Rnase P検出試薬及びTaqMan Universal PCR master混合物を含むqPCR反応物に加えた。このPCR試料混合物を、増幅前に、96ウェルPCRプレートの個々のウェルに加えた。
7.54×106細胞/mlの濃度で培養したHeLa細胞又は白血球を、iFTAeカードの上にスポットした。1.2mm(HeLa及び血液試料)パンチ片をiFTAeカードから採取し、1mlの滅菌水で洗浄し、ボルテックスで回転させ、水を除去し、又は、試料を洗浄せずにおく。3mm(HeLa及び血液試料)パンチ片をiFTAeカードから採取し、iFTAe高スループット溶出プロトコルを用いて溶出させた。試料をスポットしたiFTAeカード、又は2μl又は5μlの溶出液のいずれかを、TaqMan Rnase P検出試薬及びTaqMan Universal PCR master混合物を含むqPCR反応物に加えた。このPCR試料混合物を、増幅前に、96ウェルPCRプレートの個々のウェルに加えた。
DNA溶出
4枚の1.2mmパンチ片をFTA血液スポットから採取し、別個の管に入れた。2枚のパンチ片に、前もってパンチ片を洗浄することなく、以下の方法を行った。
溶出した全体積(100又は200μl)の両方のスケールから得た2個ずつの試料の5μl及び10μlの小分け分を用い、STR PCRを行った。次いで、装置のマニュアルの標準条件を用い、試料をGeneamp 9700 Thermalサイクラーにおいた。3130×1 Genetic分析機を用いてすべてのSTR試料を分離し、Genemapper IDソフトウエアを用い、結果を分析した。
合格基準−STR対立遺伝子ピークは、ヘテロ接合体ピークについて75RFUより高いと予想され、ホモ接合体ピークについて150RFUより高いと予想される。ネガティブコントロールは、プロファイルをまったく生成しないと予想される(すなわち、50RFUを超えるピークなし)。ポジティブコントロールは、ヘテロ接合体ピークについて75RFUより高いと予想され、ホモ接合体ピークについて150RFUより高いと予想される。
すべてのqPCRを、7900HT Real time PCR機で行い、SDS 2.3ソフトウエアを用いて分析した。
100%エタノール中で2003年から保存されたMackerel(Somber Sumbrus)試料を、180μlのPBSあたり約5mm3の組織を用い、Qiagen Tissue Ruptor Probeを用い、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で均質化した。10μlずつの小分け分をピペットでFTAカードに置き、一晩乾燥させた。パンチ加工されたFTA円板からの試料DNAの高pH溶出前に、最小限の洗浄の有効性を評価するために、3つずつの円板を得て、以下のように処理した。
溶液2:0.1M TrisHCl、pH7.0
時間スキーム:高pHで10分間、5分間中和。
2.氷上で10分間インキュベートする。
miRNAに似た特定のRNA種は、天然で小さく(約22ヌクレオチド)、従って、従来の抽出及び精製の工程中に容易に失われる。当業者は、アルカリpH溶液が、DNAではなくRNAの2’−ヒドロキシルエステル交換反応を触媒することを理解すると思われるが、RNAの変性及び損失も悪化するだろう。FTA Express方法とRNA種との適合性を評価するために、FTAカードに合成miRNAをスポットし、以下のようなFTA Express方法を用い、RT−PCRによって分析した。
(1)Whatman Indicating FTA Classicカード(GE Healthcare、カタログ番号WB120206、ロット番号FT6902011)
(2)miR21−5p(5’−UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA−3’(配列番号1)、IDTによって合成された)
(3)Let7i−5p(5’−UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU−3’(配列番号2)、IDTによって合成された)
(4)溶液1(0.1M NaOH、0.3mM EDTA、pH13.0)
(5)溶液2(0.1mM Tris−HCl、pH7.0)
(6)miScript RT Kit(Qiagen、カタログ番号218161)
(7)miScript Primer Assay(Qiagen、Hs_miR21_2、カタログ番号MS00009079)ロット番号118346858)
(8)miScript Primer Assay(Qiagen、Hs_Let7i_1、カタログ番号MS00003157)ロット番号168331862)
(9)miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen、カタログ番号218073)
(10)α−シクロデキストリン(sigma、カタログ番号C4680−1G)、ヌクレアーゼを含まない水で8%(w/v)を作成。
試料の調製:
1.2mm UniCoreパンチャーを用いてFTA Classicのパンチ片を調製し、210ngの合成miRNA(miR21−5p又はLet7i−5p)をそれぞれのパンチ片の上に1μlずつスポットした。試料を室温で一晩乾燥させた。
それぞれの1.2mmパンチ片を35μLの溶液1(0.1M NaOH、0.3mM EDTA、pH 13.0)に懸濁させ、室温で5分間インキュベートし、ボルテックスで混合しつつ、65μlの溶液2(0.1mM Tris−HCl、pH7.0)で中和した。試料をさらに室温で5分間インキュベートし、ボルテックスで混合し、溶液からパンチ片を取り出し、圧縮し、RNA溶液の最大体積(約100μl)を回復した。
miScript RTキット(Qiagen、カタログ番号218161)を用い、RT反応混合物を調製した。簡単にいうと、4μlの5倍miScript HiSpec緩衝液、2μlの10倍miScript Nucleics Mix、2μlのmiScript RT Mix、4μlの8%α−シクロデキストリン(w/v)、6μlのヌクレアーゼを含まない水及び2μlのFTA Express溶出液(上で抽出した合計体積の約2%)を、0.2ml管の中で合わせた。合成miRNAを当量の入力で用い、コントロール反応を並行して調製した。反応物を37℃で1時間インキュベートし、次いで、95℃で5分間インキュベートし、酵素を不活化した。
20μlの上述のRT反応物それぞれに180μlのヌクレアーゼを含まない水を加えることによって、cDNAの1:10希釈液を調製した。ヌクレアーゼを含まない水を用い、このcDNAストックを1:100及び1:400まで順次希釈した。
miScript SYBR Green PCRキット(Qiagen、カタログ番号218073)を用い、qPCR反応物を調製した。簡単にいうと、12.5μlの2倍SYBR Green PCR Master混合物、2.5μlの10倍miScript Universalプライマー、5.5μlのヌクレアーゼを含まない水及び2.5μlの10倍miScriptプライマー(Hs_miR21_2、カタログ番号MS00009079又はHs_Let7i_1、カタログ番号MS00003157)を、マスター混合物として合わせた。希釈したcDNAテンプレート(1:100及び1:400ストック)を、96ウェルPCRプレートに2μlずつ加え、その後、23μlのマスター混合物をウェルごとに混合した。それぞれの試料及び希釈物をこの様式で3個ずつ調製し、qPCR反応を7500Fast Real−Time PCR装置で、以下のパラメータに従ってインキュベートした。95℃/15分、(95℃/15秒、55℃/30秒、70℃/30秒)×40サイクル。
(1)Whatman Indicating FTA Classicカード(GE Healthcare、カタログ番号WB120206、ロット番号FT6902011)
(2)MCF−7全RNA(Life Technologies、カタログ番号AM7846)
(3)溶液1(0.1M NaOH、0.3mM EDTA、pH13.0)
(4)溶液2(0.1mM Tris−HCl、pH7.0)
(5)miScript RT Kit(Qiagen、カタログ番号218161)
(6)miScript プライマーAssay(Qiagen、Hs_miR21_2、カタログ番号MS00009079)ロット番号118346858)
(7)miScriptプライマーAssay(Qiagen、Hs_Let7i_1、カタログ番号MS00003157) ロット番号168331862)
(8)miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen、カタログ番号218073)
(9)α−シクロデキストリン(sigma、カタログ番号C4680−1G)、ヌクレアーゼを含まない水で8%(w/v)を作成。
試料の調製:
1.2mm UniCoreパンチャーを用いてFTA Classicのパンチ片を調製し、MCF−7細胞からの1mg/mlの全RNA(1μg)をそれぞれのパンチ片の上に1μlずつスポットした。試料を室温で一晩乾燥させた。
それぞれの1.2mmパンチ片を35μLの溶液1(0.1M NaOH、0.3mM EDTA、pH 13.0)に懸濁させ、室温で5分間インキュベートし、ボルテックスで混合しつつ、65μlの溶液2(0.1mM Tris−HCl、pH7.0)で中和した。試料をさらに室温で5分間インキュベートし、ボルテックスで混合し、溶液からパンチ片を取り出し、圧縮し、RNA溶液の最大体積(約100μl)を回復した。
miScript RTキット(Qiagen、カタログ番号218161)を用い、RT反応混合物を調製した。簡単にいうと、4μlの5倍miScript HiSpec緩衝液、2μlの10倍miScript Nucleics Mix、2μlのmiScript RT Mix、4μlの8%α−シクロデキストリン(w/v)、6μlのヌクレアーゼを含まない水及び2μlのFTA Express溶出液(上で抽出した合計体積の約2%)を、0.2ml管の中で合わせた。反応物を37℃で1時間インキュベートし、次いで、95℃で5分間インキュベートし、酵素を不活化した。
20μlの上述のRT反応物それぞれに180μlのヌクレアーゼを含まない水を加えることによって、cDNAの1:10希釈液を調製した。ヌクレアーゼを含まない水を用い、このcDNAストックを1:100及び1:400まで順次希釈した。
miScript SYBR Green PCRキット(Qiagen、カタログ番号218073)を用い、qPCR反応物を調製した。簡単にいうと、12.5μlの2倍SYBR Green PCR Master混合物、2.5μlの10倍miScript Universalプライマー、5.5μlのヌクレアーゼを含まない水及び2.5μlの10倍miScriptプライマー(Hs_miR21_2、カタログ番号MS00009079又はHs_Let7i_1、カタログ番号MS00003157)を、マスター混合物として合わせた。希釈したcDNAテンプレート(1:10、1:100及び1:400ストック)を、96ウェルPCRプレートに2μlずつ加え、その後、23μlのマスター混合物をウェルごとに混合した。それぞれの試料及び希釈物をこの様式で3個ずつ調製し、qPCR反応を7500Fast Real−Time PCR装置で、以下のパラメータに従ってインキュベートした。95℃/15分、(95℃/15秒、55℃/30秒、70℃/30秒)×40サイクル。
Claims (11)
- 核酸の増幅方法であって、
(i)標的核酸を含有する細胞試料と接触させた溶解試薬を含有する含浸化学物質を含むセルロース系マトリックス固体支持体を反応容器に移す工程と、
(ii)固体支持体上の前記細胞試料を、該試料から核酸を溶出させるのに十分なpHが13の溶液とインキュベートする工程と、
(iii)核酸を増幅して、増幅核酸を生じさせる工程と、
(iv)増幅核酸を定量する工程と
を含み、
溶出方法が、増幅工程の前に、中和溶液を添加することをさらに含む、核酸の増幅方法。 - 溶出した核酸が最小限の体積で含まれており、溶出した化学物質その他の細胞成分によって後段の分析手順が阻害されない、請求項1記載の方法。
- インキュベートする前記工程(ii)を室温で行う、請求項1又は請求項2記載の方法。
- 増幅方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 溶出した核酸がDNA種又はRNA種を含む、請求項3記載の方法。
- 核酸が、RNase阻害剤及びα−シクロデキストリン存在下で増幅され、増幅が損失又は阻害を伴わずに効率的に起こる、請求項5記載の方法。
- 核酸増幅試薬溶液は、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)、反応緩衝液及び1種以上のプライマーを含む、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。
- 固体支持体の組成物は、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン、塩酸グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム、尿酸、EDTA又はTris緩衝液を含む、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。
- 工程(i)の前に固体支持体が洗浄されない、請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載の方法。
- 核酸がDNAであって、当該方法が、さらに、
(v)ショートタンデムリピート(STR)プロファイリングを用いてSTRプロファイルを作成することを含む、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。 - 核酸が、mRNA、miRNA、rRNA、piRNA又はsiRNAであり、当該方法が、さらに、遺伝子発現分析を含む、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。
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