CN113999840B - 一种核酸样本保存液及其使用方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种核酸样本保存液及其使用方法和应用。所述核酸样本保存液按质量分数计包括：阳离子表面活性剂0.1‑5％、螯合剂0.025‑0.2％、稳定剂1‑5％、还原剂0.6‑3％、抑菌剂1‑15％、蛋白变性剂1‑30％和缓冲剂0.2‑4％；所述稳定剂包括N,N‑二甲基丙烯酰胺。所述核酸样本保存液能够实现法医样本的核酸在环境稳定下的运输和长时间保存，抑制各种病毒或细菌生长，实现对可疑传染性样本的安全运输和保存。同时，核酸样本保存液对样本中的核酸进行提取纯化时，可以保证样本中的DNA能够充分释放，获得高分子量、高质量和高通量的DNA，满足后续的基因检测及分析实验的要求。

Description

一种核酸样本保存液及其使用方法和应用

技术领域

本发明属于核酸样本保存技术领域，具体涉及一种核酸样本保存液及其使用方法和应用。

背景技术

在法医分子诊断分析领域，不管样本是取自室内办公室、公共场合还是野外，保持生物样本特别是人类样本中核酸稳定，通常决定该核酸能否被成功分析。生物样本中的核酸在室温下会迅速降解或变性，一般必须储存在低温下以保持稳定。当法医采集痕量物证中的样本时，无法立刻送实验室进行分析，且缺乏冷却器进行低温保存和运输，会造成核酸下游分析的结果不准确。另外，生物样本中是否有传染性的病原体或生物制剂，存在向环境的潜在接种、释放或传播的风险也是操作时需要关注的重点。目前，一般针对可能有传染性或引起健康、安全风险的样本采用生物安全箱，并送往实验室的生物安全柜进行操作。因此，为了降低法医样本的核酸检测的时间和经济成本，找到一种核酸样本的采集和保存装置成为研究的重点与热点。

CN107760593A公开了一种真空血液采集管，由原管、胶塞和保护帽构成，原管被抽成真空，胶塞密封于原管上，原管内设有复合添加剂，复合添加剂由螯合剂、酶抑制剂、渗透压剂、抗氧剂、细胞凋亡抑制剂、细胞膜稳定剂、缓冲液混合而成。所述采集管能够保持全血初始状态7-14天不腐坏，还可保证全血血浆或血清中的核酸不降解。但该采集管对只能对血液样本进行采集与保存，且保存时间较短。

CN113621682A公开了一种生物样本处理方法、采集容器和试剂盒，生物样本处理方法包括：(1)利用固定化试剂，对生物样本进行固定化处理，固定化试剂适于灭活生物样本中的病原体，并且固定化试剂适于与生物样本中的蛋白质或者核酸分子形成交联产物；(2)利用解交联试剂对步骤(1)中获得的固定化处理的产物进行解交联处理，使交联产物质发生解交联，以便获得适于检测的核酸分子或者蛋白质。所述处理方法能够有效固定样本，使得样本中的病原体不再具备感染性和毒性，操作安全。但该方法不能实现对样本的长期保存。

基于以上研究，可以看到采用特定采集装置和方法能够对样本进行保存与固定，但仍存在着保存时间短和可处理样本种类少的问题。然而，真实的法医检验中取样是非常复杂的，如床单上的细胞可疑物、杯子上的指纹、口水、牙刷、鼠标甚至土壤中的血滴等。因此，找到一种在环境温度下长时间保存复杂法医样本核酸的保存液，同时灭活病原体，对进行法医留样存档，方便未来的二次法庭追溯以及再次检验具有重大的现实意义。

发明内容

针对现有技术的不足和现实实际的需求，本发明的目的在于提供一种核酸样本保存液及其使用方法和应用。所述核酸样本保存液可实现法医样本的核酸在环境稳定下运输和保存。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种核酸样本保存液，所述核酸样本保存液按质量分数计包括：阳离子表面活性剂0.1-5％、螯合剂0.025-0.2％、稳定剂1-5％、还原剂0.6-3％、抑菌剂1-15％、蛋白变性剂1-30％和缓冲剂0.2-4％；所述稳定剂包括N,N-二甲基丙烯酰胺。

本发明中所涉及的核酸样本保存液，通过添加阳离子表面活性剂、螯合剂、还原剂、稳定剂、抑菌剂、蛋白变性剂和缓冲剂，能够快速进行细胞裂解灭活核酸酶保存核酸稳定，从而实现法医样本的核酸在环境稳定下的运输和长时间保存，确保法医样本中核酸在保存过程中的完整性，且能够抑制各种病毒或细菌生长，实现对可疑传染性样本的安全运输和保存。同时，对核酸样本保存液对样本中的核酸进行提取纯化时，可以保证样本中的细胞和DNA能够充分释放，获得高分子量、高质量和高通量的DNA，满足后续的PCR扩增、荧光定量PCR检测等基因检测及分析实验的要求。

所述0.1-5％，可以是0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％等。

所述0.025-0.2％，可以是0.025％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.15％、0.18％或0.2％等。

所述0.6-3％，可以是0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、2.8％或3％等。

所述1-5％，可以是1％、1.2％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％等。

所述1-15％，可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、13％或15％等。

所述1-30％，可以是1％、3％、5％、7％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％等。

所述0.2-4％，可以是0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％等。

上述数值范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述核酸样本保存液按质量分数计包括：阳离子表面活性剂1-4％、螯合剂0.03-0.1％、还原剂1-2.5％、稳定剂1-5％、抑菌剂5-15％、蛋白变性剂1-30％和缓冲剂1-4％。

优选地，所述核酸样本保存液的pH为7.5-10.5，优选为8.0-9.5。

所述7.5-10.5，可以是7.5、7.7、7.9、8、8.2、8.5、8.8、9、9.2、9.5、10或10.5等。

上述数值范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。

本发明所涉及的阳离子表面活性剂包括双十四烷基二甲基溴化铵、十四烷基-二甲基吡啶溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、高分子阳离子烷基多糖苷、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵或辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合可以是双十四烷基二甲基溴化铵与十四烷基-二甲基吡啶溴化铵的组合或十四烷基三甲基氯化铵与十六烷基三甲基溴化铵的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为双十四烷基二甲基溴化铵。

本发明优选双十四烷基二甲基溴化铵作为阳离子活性剂，能够促进采集到的细胞和核酸从采集器(拭子、棉签或胶带等)表面释放至样本保存液中。

本发明所涉及的螯合剂包括乙二胺四乙酸、次氮基三乙酸、三草酸、二乙基三胺五乙酸、1,10-菲咯啉、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、柠檬酸铵、酒石酸或酒石酸钠中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合可以是乙二胺四乙酸与次氮基三乙酸的组合或次氮基三乙酸与三草酸的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为柠檬酸钠、二乙基三胺五乙酸或酒石酸钠中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为二乙基三胺五乙酸。

本发明优选二乙基三胺五乙酸作为螯合剂，其具有更强的与金属离子络合的能力，从而能够提高核酸的化学稳定性。

本发明所涉及的还原剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEPhydrochloride，TCEP-HCl)、尿酸、巯基乙醇、半胱氨酸、维生素C、连二亚硫酸盐或巯基乙酸中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合可以是二硫苏糖醇与TCEP-HCl的组合或尿酸与巯基乙醇的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为TCEP-HCl和/或维生素C。

本发明优选TCEP-HCl和/或维生素C作为还原剂，能够变性核酸酶，维持核酸物质在保存期间的长期稳定。

本发明所涉及的抑菌剂包括醇。

所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇2000或甘油中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合可以是甲醇与乙醇的组合或乙醇与异丙醇的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为乙醇、异丙醇或聚乙二醇200中的任意一种或至少两种的组合。

本发明优选乙醇、异丙醇或聚乙二醇200中的任意一种或至少两种的组合作为抑菌剂，原因在于其不仅可以抑制细菌、真菌等微生物的生长，而且还能够促进N,N-二甲基丙烯酰胺在溶液中的稳定性。

本发明所涉及的蛋白变性剂包括异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、硫酸铵或尿素中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合可以是异硫氰酸胍与硫氰酸钠的组合或碘化钠与碘化钾的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为异硫氰酸胍和/或碘化钠。

本发明优选异硫氰酸胍和/或碘化钠作为蛋白变性剂，能够快速裂解细胞、并且变性核酸酶，稳定核酸分子。

本发明所涉及的缓冲剂包括三羟甲基氨基甲烷、乙磺酸钠、乙酸钠、柠檬酸、硼酸、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、乙酸铵、N,N-二羟乙基甘氨酸、酒石酸钠或酒石酸中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合可以是三羟甲基氨基甲烷与乙磺酸钠的组合或乙磺酸钠与乙酸钠的组合等，其余任意组合的方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为酒石酸钠、柠檬酸钠或乙酸铵中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为乙酸铵。

本发明优选乙酸铵作为缓冲剂，能够维持核酸在最适合的pH值下保存，使得pH值长期稳定，保证核酸不被化学降解。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸样本保存液的使用方法，所述核酸样本保存液的使用方法包括如下步骤：

用植绒拭子擦拭样本表面或用胶带粘取样本表面，随后将植绒拭子或胶带放入如第一方面所述的核酸样本保存液，浸没，摇晃，静置。

优选地，所述核酸样本保存液的体积为0.2-5mL，例如可以是0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.8mL、1mL、2mL、3mL、4mL或5mL等，优选为0.4-2mL。

所述核酸样本保存液的体积不能过高或过低，否则均会影响核酸样本的保存效果。

上述数值范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸样本保存液在法医核酸样本采集和运输中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的核酸样本保存液可以实现法医样本的核酸在环境稳定下的运输和长时间保存，确保法医样本中核酸在保存过程中的完整性，且能够抑制各种病毒或细菌生长，实现对可疑传染性样本的安全运输和保存。同时，核酸样本保存液对样本中的核酸进行提取纯化时，可以保证样本中的细胞和DNA能够充分释放，获得高分子量、高质量和高通量的DNA，满足后续的PCR扩增、荧光定量PCR检测等基因检测及分析实验的要求。

附图说明

图1为本发明实施例1涉及的核酸样本保存液保存人类基因组DNA不同时间下提取的DNA产物的Nase P基因的扩增曲线图；

其中，曲线1为保存第0天时Nase P基因的扩增曲线，曲线2为保存第30天时Nase P基因的扩增曲线，曲线3为保存第7天时Nase P基因的扩增曲线，曲线4为保存第180天时Nase P基因的扩增曲线，曲线5为保存第365天时Nase P基因的扩增曲线；

图2为本发明实施例2涉及的核酸样本保存液保存人类基因组DNA不同时间下提取的DNA产物的Nase P基因的扩增曲线图；

其中，曲线1为保存第0天时Nase P基因的扩增曲线，曲线2为保存第7天时Nase P基因的扩增曲线，曲线3为保存第30天时Nase P基因的扩增曲线，曲线4为保存第180天时Nase P基因的扩增曲线，曲线5为保存第365天时Nase P基因的扩增曲线；

图3为本发明实施例1涉及的核酸样本保存液的病毒灭活能力测试结果图；

图4为本发明实施例2涉及的核酸样本保存液的病毒灭活能力测试结果图；

图5为PBS缓冲溶液的病毒灭活能力测试结果图；

图6为生理盐水保存液的病毒灭活能力测试结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中相应材料和原料的购买来源如下：

其中，试剂盒购自苏州白垩纪生物科技有限公司，型号为Cat#CNA01690S；慢病毒原液取自山东维真生物科技有限公司；UTM核酸样本保存液，购自深圳市华晨阳科技有限公司。其余材料和原料无特殊说明，均可从其他商业途径获得。

实施例1

本实施例提供一种核酸样本保存液，按质量分数计包括：异硫氰酸胍20％、双十四烷基二甲基溴化铵2.5％、乙酸铵2.5％、二乙基三胺五乙酸0.05％、TCEP-HCl1％、异丙醇5％，N,N-二甲基丙烯酰胺4％。其制备方法如下：

按配方量在1L烧杯中加入异硫氰酸胍和500g去离子水，搅拌，溶解；随后加入配方量的双十四烷基二甲基溴化铵和乙酸铵，30min后；依次加入配方量的二乙基三胺五乙酸、TCEP-HCl和异丙醇，搅拌，溶解；加入配方量的N,N-二甲基丙烯酰胺，搅拌1h；用氢氧化钠调节pH至9.2，用去离子水定容至1L，得到核酸样本保存液。

实施例2

本实施例提供一种核酸样本保存液，按质量分数计包括：碘化钠5％、双十四烷基二甲基溴化铵4％、乙酸铵4％、二乙基三胺五乙酸0.03％、维生素C 2.5％、乙醇15％，N,N-二甲基丙烯酰胺2.5％。其制备方法如下：

按配方量在1L烧杯中加入碘化钠和500g去离子水，搅拌，溶解；随后加入配方量的双十四烷基二甲基溴化铵和乙酸铵，30min后；依次加入配方量的二乙基三胺五乙酸、维生素C和乙醇，搅拌，溶解；加入配方量的N,N-二甲基丙烯酰胺，搅拌1h；用氢氧化钠调节pH至8.5，用去离子水定容至1L，得到核酸样本保存液。

实施例3

本实施例提供一种核酸样本保存液，按质量分数计包括：异硫氰酸胍20％、十六烷基三甲基溴化铵2.5％、三羟甲基氨基甲烷1％、乙二胺四乙酸0.1％、巯基乙醇2.5％、甲醇5％，N,N-二甲基丙烯酰胺4％。其制备方法如下：

按配方量在1L烧杯中加入异硫氰酸胍和500g去离子水，搅拌，溶解；随后加入配方量的十六烷基三甲基溴化铵和三羟甲基氨基甲烷，30min后；依次加入配方量的乙二胺四乙酸、巯基乙醇和甲醇，搅拌，溶解；加入配方量的N,N-二甲基丙烯酰胺，搅拌1h；用氢氧化钠调节pH至9.0，用去离子水定容至1L，得到核酸样本保存液。

实施例4

本实施例提供一种核酸样本保存液，按质量分数计包括：异硫氰酸胍20％、十四烷基三甲基氯化铵2.5％、柠檬酸钠2％、次氮基三乙酸0.05％、巯基乙酸2％、聚乙二醇4005％，N,N-二甲基丙烯酰胺4％。其制备方法如下：

按配方量在1L烧杯中加入异硫氰酸胍和500g去离子水，搅拌，溶解；随后加入配方量的十四烷基三甲基氯化铵和柠檬酸钠，30min后；依次加入配方量的次氮基三乙酸、巯基乙酸和聚乙二醇400，搅拌，溶解；加入配方量的N,N-二甲基丙烯酰胺，搅拌1h；用氢氧化钠调节pH至8.5，用去离子水定容至1L，得到核酸样本保存液。

实施例5

本实施例提供一种核酸样本保存液，按质量分数计包括：异硫氰酸胍20％、高分子阳离子烷基多糖苷2.5％、柠檬酸钠4％、柠檬酸铵0.1％、二硫苏糖醇2％、聚乙二醇2005％，N,N-二甲基丙烯酰胺4％。其制备方法如下：

按配方量在1L烧杯中加入异硫氰酸胍和500g去离子水，搅拌，溶解；随后加入配方量的高分子阳离子烷基多糖苷和柠檬酸钠，30min后；依次加入配方量的柠檬酸铵、二硫苏糖醇和聚乙二醇200，搅拌，溶解；加入配方量的N,N-二甲基丙烯酰胺，搅拌1h；用氢氧化钠调节pH至9.5，用去离子水定容至1L，得到核酸样本保存液。

对比例1

本对比例提供一种核酸样本保存液，与实施例1的区别仅在于，不包括异丙醇，其余参数与实施例1保持一致，制备方法参考实施例1。

对比例2

本对比例提供一种核酸样本保存液，与实施例1的区别仅在于，不包括N,N-二甲基丙烯酰胺，其余参数与实施例1保持一致，制备方法参考实施例1。

对比例3

本对比例提供一种核酸样本保存液，与实施例1的区别仅在于，不包括双十四烷基二甲基溴化铵，其余参数与实施例1保持一致，制备方法参考实施例1。

对比例4

本对比例提供一种核酸样本保存液，与实施例1的区别仅在于，不包括TCEP-HCl，其余参数与实施例1保持一致，制备方法参考实施例1。

对比例5

本对比例提供一种核酸样本保存液，与实施例1的区别仅在于，不包括二乙基三胺五乙酸，其余参数与实施例1保持一致，制备方法参考实施例1。

对比例6

本对比例提供一种UTM核酸样本保存液，来源于深圳市华晨阳科技有限公司。

对比例7

本对比例提供一种核酸样本保存液，与实施例1的区别仅在于，不包括N,N-二甲基丙烯酰胺，其余参数与实施例1保持一致，制备方法参考实施例1。

测试例1

本测试例检测实施例1-5、对比例1-7得到的核酸样本保存液对于法医核酸样本的保存能力。检测方法如下：

首先让提供口腔拭子样本的受拭者使用凉水冲洗口腔3次，30min后用拭子刮取口腔细胞，置于2mL生理盐水中，充分涡旋，形成约2000个细胞/10μL的重悬液，取100μL重悬液加入至2mL的样本保存液中，混合均匀后，放置于20℃的烘箱中，保存，并在第0天、第30天、第120天和第365天分别取出200μL样本混合物，使用试剂盒进行提取，50μL洗脱液进行洗脱，使用Quibt 4.0核酸荧光定量计进行核酸定量，检测洗脱液中的核酸浓度(ng/μL)，并使用荧光定量PCR检测人类基因组DNA的管家基因Nase P基因来验证保存性能。

不同核酸样本保存液中的核酸浓度结果统计如下表1所示：

表1

由表1的数据可知，与对比例6常规的UTM核酸样本保存液和对比例7的核酸样本保存液相比，实施例1-5得到的核酸样本保存液，对于痕量细胞中的人类基因组DNA长时间保存效果是更好的；其次，对比例3得到的核酸样本保存液也能实现对人类基因组DNA的长时间保存；对比例1得到的核酸样本保存液不含有异丙醇，可以在短时间内(30天)保存基因组DNA，但是长时间保存的效果较差；对比例2、对比例4和对比例5得到的核酸样本保存液在短时间内也无法保存基因组DNA，更不适合用于基因组DNA存档，表明稳定剂、还原剂和螯合剂的添加会对核酸样本保存液的保存效果造成影响。

不同核酸样本保存液中的Nase P基因的Ct值结果统计如下表2所示：

表2

由表2的数据可知，与与对比例6常规的UTM核酸样本保存液和对比例7的核酸样本保存液在保存人类基因组DNA 30天后，Nase P基因的Ct值出现明显延迟相比，实施例1-5得到的核酸样本保存液中不同保存时间的人类基因组DNA中Nase P基因的Ct值变化小于0.5个，表明其可以实现对人类基因组DNA的长时间保存，其次，对比例3得到的核酸样本保存液中不同保存时间的人类基因组DNA中Nase P基因的Ct值变化小于0.9个，对比例1得到的核酸样本保存液不含有异丙醇，短时间内(30天)人类基因组DNA中Nase P基因的Ct值变化较小，但是长时间Ct值变化较大，不利于长期保存。对比例2、对比例4和对比例5得到的核酸样本保存液在短时间内人类基因组DNA中Nase P基因的Ct值变化就比较大，表明稳定剂、还原剂和螯合剂的添加会对核酸样本保存液的保存效果造成影响。

测试例2

本测试例检测实施例1-5、对比例3、对比例6和对比例7得到的核酸样本保存液对于法医核酸样本中DNA的释放能力。检测方法如下：

首先让提供口腔拭子样本的受拭者使用凉水冲洗口腔3次，30min后用拭子刮取口腔细胞，置于2mL生理盐水中，充分涡旋，形成约2000个细胞/10μL的重悬液，取25μL滴加于一个干净皮革的表面，形成一个约含有5000个细胞的斑点圆圈取样区，等待3天进行自然晾干。随后采用植绒拭子擦拭或者胶带进行粘取，后放置于400μL样本保存液中，静置1天。随后取出200μL样本混合物，使用试剂盒进行提取，50μL洗脱液进行洗脱，使用Quibt 4.0核酸荧光定量计进行核酸定量，检测洗脱液中的核酸浓度(ng/μL)。

不同核酸样本保存液中的核酸浓度结果统计如下表3所示：

表3

组别	植绒拭子	胶带
			实施例1	0.32	0.28
实施例2	0.31	0.24
			实施例3	0.30	0.25
实施例4	0.32	0.27
			实施例5	0.30	0.23
对比例3	0.19	0.12
			对比例6	0.12	0.07
对比例7	0.30	0.24

由上表数据可知，与对比例3和对比例6得到的核酸样本保存液相比，实施例1-5得到的核酸样本保存液对于痕量细胞中的人类基因组DNA的释放能力更强，且与胶带粘取样本表面相比，采用植绒拭子擦拭样本表面能够获得含有更多DNA的样本。由对比例7的结果可知，N,N-二甲基丙烯酰胺的添加并不影响核酸样本保存液对于人类基因组DNA的释放能力。

测试例3

本测试例验证实施例1和实施例2得到的核酸样本保存液对于人类基因组DNA的加速热稳定性保存能力。验证方法如下：

首先让提供口腔拭子样本的受拭者使用凉水冲洗口腔3次，30min后用拭子刮取口腔细胞，置于2mL生理盐水中，充分涡旋，形成约2000个细胞/10μL的重悬液，取100μL重悬液加入至2mL的核酸样本保存液中，混合均匀后，放置于55℃的烘箱中，保存，并在第0天、第7天、第30天、第180天和第365天分别取出200μL样本混合物，使用试剂盒进行提取，50μL洗脱液进行洗脱，使用荧光定量PCR检测人类基因组DNA的管家基因Nase P基因来验证长时间加热下核酸样本保存液的保存性能。

结果如图1和图2所示，其中，图1和图2分别为实施例1和实施例2得到的核酸样本保存液对于人类基因组DNA保存的加速热稳定性实验(其中，纵坐标△Rn表示每点测量的荧光强度与荧光基线强度的差值)，分别包括加速第0天、第7天、第30天、第180和第365天后提取得到的DNA产物检测的Nase P基因的扩增曲线，可以看出，两种核酸样本保存液在55℃下加速365天后，人类基因组DNA中Nase P基因的Ct值没有明显变化。以ASTM F1980-07标准中可知，55℃下加速365天，在Aging factor(Q10)为2.0情况下，相当于在20℃下保存10年左右，表明本发明提供的核酸样本保存液可以用于法医痕量物质中核酸的长期保存和存档使用。

测试例4

本测试例检测实施例1和实施例2得到的核酸样本保存液、PBS缓冲溶液以及生理盐水保存液灭活病毒的能力。检测方法如下：

将慢病毒原液(10⁸/mL)分别与实施例1和实施例2得到的核酸样本保存液，以及PBS、生理盐水保存液以1:3的体积比混合，5min后取上述5μL混合液加入至500μL细胞培养液中，立刻进行细胞感染实验，36h后再以绿色荧光蛋白报告基因(Green fluorescentprotein，GFP)的表达来衡量病毒保存液的灭活能力。

结果如图3-6所示，图3为本发明涉及的实施例1得到的核酸样本保存液的病毒灭活能力测试结果图，图4为本发明涉及的实施例2得到的核酸样本保存液的病毒灭活能力测试结果图，图5为PBS缓冲溶液的病毒灭活能力测试结果图，图6为生理盐水保存液的病毒灭活能力测试结果图。图3和图4中无绿色荧光信号，图5和图6中有绿色荧光信号，表明本发明提供的核酸样本保存液可以快速高效灭活病毒。

综上所述，本发明提供的核酸样本保存液可以实现法医样本的核酸在环境稳定下的运输和长时间保存，确保法医样本中核酸在保存过程中的完整性，且能够抑制各种病毒或细菌生长，实现对可疑传染性样本的安全运输和保存。同时，核酸样本保存液对样本中的核酸进行提取纯化时，可以保证样本中的细胞和DNA能够充分释放，获得高分子量、高质量和高通量的DNA，满足后续的PCR扩增、荧光定量PCR检测等基因检测及分析实验的要求。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (21)

1.一种核酸样本保存液，其特征在于，所述核酸样本保存液按质量分数计包括：阳离子表面活性剂0.1-5％、螯合剂0.025-0.2％、稳定剂1-5％、还原剂0.6-3％、抑菌剂1-15％、蛋白变性剂1-30％和缓冲剂0.2-4％；

所述稳定剂包括N,N-二甲基丙烯酰胺；

所述核酸样本保存液的pH为8.0-8.8。

2.根据权利要求1所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述核酸样本保存液按质量分数计包括：阳离子表面活性剂1-4％、螯合剂0.03-0.1％、稳定剂1-5％、还原剂1-2.5％、抑菌剂5-15％、蛋白变性剂1-30％和缓冲剂1-4％。

3.根据权利要求1或2所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述阳离子表面活性剂包括双十四烷基二甲基溴化铵、十四烷基-二甲基吡啶溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、高分子阳离子烷基多糖苷、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵或辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵中的任意一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求3所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述阳离子表面活性剂为双十四烷基二甲基溴化铵。

5.根据权利要求1所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述螯合剂包括乙二胺四乙酸、次氮基三乙酸、三草酸、二乙基三胺五乙酸、1,10-菲咯啉、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、柠檬酸铵、酒石酸或酒石酸钠中的任意一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求5所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述螯合剂为柠檬酸钠、二乙基三胺五乙酸或酒石酸钠中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求6所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述螯合剂为二乙基三胺五乙酸。

8.根据权利要求1所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述还原剂包括二硫苏糖醇、TCEP-HCl、尿酸、巯基乙醇、半胱氨酸、维生素C、连二亚硫酸盐或巯基乙酸中的任意一种或至少两种的组合。

9.根据权利要求8所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述还原剂为TCEP-HCl和/或维生素C。

10.根据权利要求1所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述抑菌剂包括醇。

11.根据权利要求10所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇2000或甘油中的任意一种或至少两种的组合。

12.根据权利要求11所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述醇为乙醇、异丙醇或聚乙二醇200中的任意一种或至少两种的组合。

13.根据权利要求1所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述蛋白变性剂包括异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、硫酸铵或尿素中的任意一种或至少两种的组合。

14.根据权利要求13所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述蛋白变性剂为异硫氰酸胍和/或碘化钠。

15.根据权利要求1所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述缓冲剂包括三羟甲基氨基甲烷、乙磺酸钠、乙酸钠、柠檬酸、硼酸、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、乙酸铵、N,N-二羟乙基甘氨酸、酒石酸钠或酒石酸中的任意一种或至少两种的组合。

16.根据权利要求15所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述缓冲剂为酒石酸钠、柠檬酸钠或乙酸铵中的任意一种或至少两种的组合。

17.根据权利要求16所述的核酸样本保存液，其特征在于，所述缓冲剂为乙酸铵。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的核酸样本保存液的使用方法，其特征在于，所述核酸样本保存液的使用方法包括如下步骤：

用植绒拭子擦拭样本表面或用胶带粘取样本表面，随后将植绒拭子或胶带放入如权利要求1-17中任一项所述的核酸样本保存液，浸没，摇晃，静置。

19.根据权利要求18所述的核酸样本保存液的使用方法，其特征在于，所述核酸样本保存液的体积为0.2-5mL。

20.根据权利要求19所述的核酸样本保存液的使用方法，其特征在于，所述核酸样本保存液的体积为0.4-2mL。

21.根据权利要求1-17中任一项所述的核酸样本保存液在法医核酸样本采集和运输中的应用。

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