CN112322697A - 一种dna样本保存液及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA样本保存液及其制备方法与应用。所述DNA样本保存液包括如下组分：弱碱1‑10g/L、EDTA盐0.1‑5g/L、抗氧化剂0.1‑1g/L、烷基硫酸盐0.1‑10w/v％、防腐剂0.1‑5v/v％、硫醇类还原剂5‑50mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.1‑2v/v％，其余部分包括水。本发明制备的DNA样本保存液组分简单、含量少、制造成本低、容易批量生产和采样，不会抑制后续的检测分析；保存生物样品的时间长，可长达1年之久；同时DNA样本保存液独有的配方通过有效的配比与之间的协同作用，保证样品可以直扩，不会抑制下游的PCR反应。

Description

一种DNA样本保存液及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种DNA样本保存液及其制备方法与应用。
背景技术
现有技术中，口腔DNA样本的采集主要采用棉签拭子获取口腔黏膜上皮细胞的方式来进行。口腔拭子采集的样本中，除脱落的上皮细胞外，还含有大量细菌、DNA酶、RNA酶、粘蛋白、球蛋白、消化酶和白蛋白等各类消化相关物质。若拭子样本直接常温下放置较长一段时间，黏附的多种有机物的存在容易滋生大量微生物，细菌在25℃及以上的温度环境中，繁殖迅速，且在DNA酶的分解下，DNA迅速降解。这个过程增加样本污染和DNA降解的风险，从而影响后续检测和分析。
通过把采集的口腔拭子置于相应的拭子保存液中可以大大增加样本保存过程中的稳定性，延缓样本DNA的降解。已有口腔拭子保存液专利中，其保护剂成分大多较为复杂：专利CN102440234A和CN105368812A中分别含有强蛋白质变性剂异硫氰酸胍和尿素，虽然可以将口腔中的消化酶、核酸酶等有机物质进行变性处理，抑制核酸酶的活性，但同时也会对裂解细胞，使得DNA处于游离状态，不利于DNA的完整性保存；专利CN102919218A中含有氯化镁，镁离子是核酸酶激活剂，容易引起DNA的降解，不利于DNA的稳定性和完整性的保存；专利CN102676501A和CN105039306A中含有微生物生长所需的糖成分，虽然可以很好地保持该保存液中细胞的渗透压，但更容易引起细菌等微生物的滋生；专利CN111139235A中含有氯化钠和蛋白酶K，采集的样本需要提取过硅胶吸附柱、磁珠吸附等，操作较繁琐；专利CN109691432A中含有氯化钠维持细胞的渗透压，主要便于细胞的保存和运输，可以保护基因组在数周内不被破坏，保存样本的时间较短；专利公布号CN111183973A中含有尿素、褐藻酸钠和左旋肉碱，成分较复杂，同时采集的样本也需要提取，操作较繁琐。以此，开发一种简单、有效的保存DNA样本的保存液是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种DNA样本保存液及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种DNA样本保存液，其包括如下组分：弱碱1-10g/L、EDTA盐0.1-5g/L、抗氧化剂0.1-1g/L、烷基硫酸盐0.1-10w/v％、防腐剂0.1-5v/v％、硫醇类还原剂5-50mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.1-2v/v％，其余部分包括水；其中，所述弱碱包括有机弱碱和/或无机弱碱；所述有机弱碱包括三羟甲基氨基甲烷、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸、有机酸碱金属盐中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此；所述无机弱碱包括碱金属的碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硼酸盐中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此；所述抗氧剂包括尿酸、尿酸盐、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此，优选为尿酸和/或尿酸盐；所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
本发明实施例还提供了前述的DNA样本保存液的制备方法，其包括：
将弱碱、EDTA盐、抗氧化剂、烷基硫酸盐、防腐剂与水混合形成溶液，之后向所获溶液中加入硫醇类还原剂、聚乙二醇辛基苯基醚、水混合均匀，形成所述DNA样本保存液。
本发明实施例还提供了前述的DNA样本保存液于保存DNA样本中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的DNA样本保存液的制备方法简单，成本低廉，稳定性好，操作容易实现，便于样本DNA的保存和运输，无需调节pH值、无需过滤除菌等复杂的操作步骤，无毒副作用，可在2-35℃的温度范围内(室温)长期有效的保护基因组DNA在一年内不被破坏，便于样本的保存和运输，适应大规模采样使用，应用前景广阔，具有较好的社会价值；
(2)本发明制备的DNA样本保存液组分简单、含量少、制造成本低、容易批量生产和采样，不会抑制后续的检测分析；保存生物样品的时间长，可长达1年之久，远远超过市面上保存数周的保存液；保存的生物样品免提取和免处理，操作比较简单，对操作人员的要求较少；同时DNA样本保存液独有的配方通过有效的配比与之间的协同作用，保证了样品可以直扩，不抑制下游的PCR反应，无需额外的提取步骤，使操作者非常方便；
(3)本发明制备的DNA样本保存液具有常温长期保存、普通邮件邮寄、液体取样检测、重复多次复检、样品取样均匀、PCR直扩效果、取样无需干燥、保存无需控制、抗细菌抗病毒和防止霉菌滋生等特点；
(4)本发明制备的DNA样本保存液是专为稳定存储口腔细胞或全血样品而设计的功能溶液，样品无需热孵育，提取或纯化，可直接进行PCR扩增，反应数量为1-2μL/反应，可做500-1000个反应；同时本发明制备的DNA样本保存液可用于采集和保存口腔细胞或全血样品，样品DNA可用于荧光定量PCR、多重PCR直扩、PCR扩增后的测序、STR分析、SNP分析、全基因组扩增、药物基因组学、动物识别、犯罪现场采样、遗传鉴定、DNA数据库建设、食品和农业研究。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一个方面提供了一种DNA样本保存液，其包括如下组分：弱碱1-10g/L、EDTA盐0.1-5g/L、抗氧化剂0.1-1g/L、烷基硫酸盐0.1-10w/v％、防腐剂0.1-5v/v％、硫醇类还原剂5-50mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.1-2v/v％，其余部分包括水。
进一步的，所述弱碱包括有机弱碱和/或无机弱碱，所述有机弱碱包括三羟甲基氨基甲烷、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸、有机酸碱金属盐中的任意一种，且不限于此。
进一步的，所述无机弱碱包括碱金属的碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硼酸盐中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述抗氧剂包括尿酸、尿酸盐、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述抗氧剂包括尿酸或尿酸盐，且不限于此。
进一步的，所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦(TCEP)，且不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述DNA样本保存液包括如下组分：
三羟甲基氨基甲烷(Tris)1-10g/L、EDTA盐0.1-5g/L、尿酸和/或尿酸盐(UricAcid)0.1-1g/L、烷基硫酸盐0.1-10w/v％、防腐剂0.1-5v/v％、三(2-羧乙基)膦(TCEP)5-50mmol/L以及聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)0.1-2v/v％，其余部分包括水。
在一些较为具体的实施方案中，所述EDTA盐包括EDTA钠盐或EDTA钾盐，且不限于此。
进一步的，所述烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠(SDS)、辛基硫酸钠、十二烷基硫酸铵、十二烷基磺酸钠(SLS)中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
更进一步的，所述烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基磺酸钠(SLS)，且不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述防腐剂包括Proclin系列防腐剂、叠氮钠、二唑烷基脲、咪唑烷基脲、羟甲基甘氨酸中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述Proclin系列防腐剂包括Proclin150、Proclin200、Proclin300、Proclin950中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述水为无菌水，且不限于此。
进一步的，所述有机酸碱金属盐包括柠檬酸钠，且不限于此。
进一步的，所述无机弱碱中的碱金属包括钠、锂、钾中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的DNA样本保存液的制备方法，其包括：
将弱碱、EDTA盐、抗氧化剂、烷基硫酸盐、防腐剂与水混合形成溶液，之后向所获溶液中加入硫醇类还原剂、聚乙二醇辛基苯基醚、水混合均匀，形成所述DNA样本保存液。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的DNA样本保存液于保存DNA样本中的用途。
进一步的，所述DNA样本为可提供液态核酸类遗传物质的生物样品。
进一步的，所述DNA样本包括唾液样本和/或口腔拭子样本。
在一些较为具体的实施方案中，所述生物样品包括人或动物的生理和/或病理体液、人或动物的细胞悬液、人或动物机体组织的提取液和/或匀浆、DNA合成过程的中间体、化学和/或生化合成DNA的混合物、植物的生理和/或病理体液、植物的细胞悬液、细菌的提取液和/或悬液、真菌的提取液和/或悬液、质粒的提取液和/或悬液、病毒的提取液和/或悬液、寄生虫的提取液和/或悬液中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述人或动物的生理和/或病理体液包括人或动物的分泌物和/或渗出液，且不限于此。
进一步的，所述人或动物的细胞悬液包括血液、淋巴液、滑膜液、精液、唾液中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
在一些更为具体的实施方案中，所述DNA样本保存液包括如下组分：Tris 1-10g/L，EDTA盐0.1-5g/L、尿酸(Uric Acid)0.1-1g/L，烷基硫酸盐0.1-10％(w/v)，防腐剂0.1-5％(v/v)，TCEP 5-50mM和Triton X-100 0.1-2％(v/v)。
本发明提供的技术方案为一种DNA样本保存液，DNA样本保存液的同时包含成分为抗菌剂、核酸释放剂、络合剂、弱碱、还原剂、表面活性剂和抗氧化剂，具有核酸类遗传物质释放能力、抗氧化能力、抑菌能力和防霉能力，可室温长期稳定保存生物样品中的遗传物质。DNA样本保存液含有独特的化学物质，同时包含化学成分为抗菌剂、核酸释放剂、络合剂、弱碱和抗氧化剂，其作用原理或机理如下：
在采集生物样品时，弱碱可发挥以下作用：①因核酸是属于碱稳定性的物质，弱碱可保护核酸使其不发生降解；②弱碱可以与抗氧化剂之间的协同作用，提供一个缓冲液系统，维持体系稳定；③弱碱可以与络合剂之间的协同作用，保证与二价金属离子结合；④防止一些非金属离子依赖性的核酸酶发生反应导致核酸破坏。弱碱可以是pH在7-10之间的Lewis碱，pH在8.0-9.5之间最好，可以选择有机弱碱(比如Tris、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸或者有机酸的碱盐如柠檬酸三钠等)，也可以选择无机弱碱(比如无机碱金属钠、锂、钾的碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或者硼酸盐)，保存液各组分通过有效的配比与之间的协同作用形成缓冲体系，不需要调节pH值，也不需要单独补加额外的酸碱来调节pH值，三羟甲基氨基甲烷(Tris)常用作生物缓冲液，有利于稳定样本中细胞，本发明采用Tris来说明实施例。
络合剂主要作用：①可以与弱碱之间的协同作用，与样品中二价活性金属离子Mg2 +、Ca2+等结合；Mg2+、Ca2+离子可以协同核酸酶催化作用从而促进核酸的降解；②与转运金属离子，尤其是Fe离子结合。Fe离子非常容易发生氧化以及还原反应，它产生出的自由基可以破坏核酸，Fe离子所产生自由基直接降解核酸。③强络合剂：具有与EDTA相当的或者更强的络合能力，可以和多价的金属离子结合，推荐使用EDTA。EDTA还可以和抑菌剂作为协同作用，来达到杀菌和抑菌的效果。EDTA盐组分作为螯合剂可以螯合镁离子、钙离子等核酸酶的激活剂，从而抑制核酸酶类对核酸分子的降解作用，达到保护核酸的作用；本发明采用EDTA盐为EDTA钠盐或EDTA钾盐中的至少一种来说明实施例。
抗菌剂主要作用：①细菌主要由细胞膜、细胞器、细胞质和核体等基本结构组成；②当血液、唾液和口腔拭子等样品转移至样本保存液时，细胞膜和细胞器被裂解，使样品中除核酸以外的一些物质(如蛋白质)变性，使病原微生物(真菌、细菌、病毒)外壳蛋白、内部蛋白以及膜蛋白的二级结构发生非特异性的破坏使其失活，从而使操作者免受感染；③与络合剂之间的协同作用，并可长期抑制细菌、霉菌和其它微生物等生长。阴离子表面活性剂或洗涤剂：能够与蛋白质结合从而使其变性的阴离子洗涤剂或表面活性剂均可使用，最好是强阴离子洗涤剂，结构中含有一个脂肪族或者芳香族的烃链部分以及一个或多个阴离子基团。烷基硫酸盐组分可以作为变性剂，可以将样本中的相关消化蛋白酶等有机物质进行变性处理，在降低液体样本粘性的同时，可以与蛋白质形成复合物而增强蛋白质的可溶性，利于后续样本处理；所述烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠、辛基硫酸钠、十二烷基硫酸铵中的至少一种。SDS或SLS是比较好的选择。
核酸释放剂主要作用：本发明中抗菌剂同时也是核酸释放剂，当生物样品转移至样本保存液时，细胞膜和细胞器被裂解，蛋白质变性，释放出的核酸被捕获在样本保存液中进行长期保存。
抗氧化剂主要作用：①抗氧化剂通过捕获中和自由基达到抗氧化的目的，自由基可以破坏DNA中的碱基鸟嘌呤，从而破坏DNA的完整性；②抗氧化剂同时呈弱酸性，可与弱碱之间的协同作用，共同作为缓冲系统中的一个组分维持体系的稳定；③抗氧化剂使遗传物质更易稳定保存在样本保存液中，利于后续DNA相关检测分析；④抗氧化剂可保护核酸免受核酸酶、氧化剂和紫外线损伤，对于DNA的长期保存起着至关重要的作用。本发明选用尿酸或者尿酸盐：对于DNA的长期保存起着至关重要的作用。主要作用：①尿酸或者尿酸盐可通过转化成尿囊素来捕获自由基。变性血清蛋白中的含硫物质会自发的发生氧化反应，从而产生自由基，血液中所含有的大量Fe离子也可以产生自由基，而自由基可以破坏DNA中的碱基鸟嘌呤；②与弱碱之间的协同作用，共同维持体系的稳定；③使GM更易稳定保存在样本保存液中，利于后续DNA相关检测分析。本发明也可以选用BHA、BHT、PG没食子酸丙酯作为抗氧化剂。
防腐剂可以减少微生物滋生，增加样本保存稳定性；所述的防腐剂应无毒无害，不影响后续的检测和分析。所述防腐剂包括Proclin系列、叠氮钠、二唑烷基脲、咪唑烷基脲、羟甲基甘氨酸中的至少一种。
众所周知，三烷基膦类化合物具有还原二硫键的性质，类化合物在水溶液中稳定性好，可以选择性还原二硫键，并且基本不和蛋白质中常规的其他活性官能团反应。但是由于这类水溶性较差，气味难闻，因而在应用中受到限制，但是TCEP的出现解决了这些问题。本发明使用TCEP作为还原剂，TCEP在很宽的PH值范围内都可以选择性定量地还原哪怕水溶性很差的烷基类二硫化合物。通常室温下反应不到5分钟就可以完成。TCEP没有难闻的气味，而且在空气中不怕氧化。TCEP是一种非常有效的硫醇类还原剂，广泛用作蛋白质化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量还原剂。该试剂在水溶液中的稳定性和溶解性都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原剂如DTT相比，TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉。因而在蛋白质化学及蛋白质组学研究常常优先选择TCEP。三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP hydrochloride，TCEP·HCl)是一种不含硫醇基且无臭的化合物，广泛应用于生物化学和分子生物学中，用作多肽或蛋白质的二硫键还原剂。
与其他类似的还原剂如二硫苏糖醇(DTT)，β-巯基乙醇(β-ME)相比，TCEP·HCl具有多种优点：
(1)无异味-实验台上使用即可，勿需通风橱；
(2)稳定性高-化合物本身结构的稳定性使得在操作、使用以及保存的过程中不需要做任何预防措施来避免氧化发生，不会挥发，室温反应即可，室温稳定，抗空气氧化。水溶性缓冲液，酸液以及碱液中稳定，不会与蛋白中的其他功能基反应；
(3)pH工作范围广-几乎溶于任何pH值的水溶性缓冲液，pH有效工作范围为1.5-9.0，直接溶于水后的pH值约为2.5；
(4)还原性强-对于大部分实验，5-50mM/L的TCEP·HCl即可提供足够的摩尔力，于室温条件作用几分钟来充分还原二硫键；
(5)兼容性广-不含有硫醇基，进行下游的巯基修饰实验如马来酰亚胺偶联不需要提前去除此还原剂。
去垢剂(又称表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多。中性去垢剂，又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类；多元醇类表面活性剂，如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚；聚氧乙烯烷基苯酚醚，乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)。Triton X-100是一种非离子型去垢剂，TritonX-100是一种比较温和的去垢剂(表面活性剂或称界面活性剂)，常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。因此本发明选用Triton X-100作为去垢剂。
Triton X-100相关性质：
(1)TritonX-100对细菌等微生物没有杀伤作用；
(2)Triton X-100在紫外波段下有光吸收(Lambdamax＝275nmand283nminmethanol)，因此，当缓冲液中存在TritonX-100时不能通过测定280nm光吸收来进行蛋白定量；
(3)TritonX-100常与CHAPS等去垢剂一起使用来纯化膜蛋白，使膜蛋白保持其天然构象；
(4)TritonX-100可以提高真核细胞细胞膜的通透性；
(5)TritonX-100非常稳定，密封避光，2～8℃条件下可以长期保存；
(6)TritonX-100是透明，略显粘稠，稍微发黄的液体；
(7)TritonX-100的密度为1.07g/ml，pH值为6.0-8.0(5％的溶液)；
(8)TritonX-100可以高压灭菌；
(9)用TritonX-100来裂解细胞时，0.1％TritonX-100就足够了，达到0.5％时也没问题；
(10)蛋白酶K在含1％TritonX-100的溶液中依然保持活性；
(11)可以使用AmberlitehydrophobicXADresinsandRezorianA161cartridges来去除TritonX-100。
Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)。中文名为：曲拉通X-100。分子量为646.86(C34H62O11)。它能溶解脂质，以增加细胞膜对抗体的通透性。通常是先配制成30％的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。生命科学领域，该产品经常被用于水中帮助分解蛋白酶；但是，必须使用尽可能低的浓度否则会污染样品，污染还会影响MS分析。
综上，本发明的样本保存液含有独特的化学物质，当样品保存在样本保存液时，细胞膜和细胞器被裂解，蛋白质变性，释放出的核酸保存在保存液中，可免受蛋白酶、核酸酶、氧化剂和紫外线损伤。样本保存液可以快速地使有机体(包括样品中的各种病原体)失活，并抑制细菌和其它微生物生长，可在室温下长期储存运输。
本发明通过大量实验的筛选，从而最终确定样本保存液的有效组分，并且通过测试不同组分的比例之间协同作用，来确定最终的最佳的比例范围。在这个过程中，我们还发现在Tris，EDTA盐，Uric Acid，烷基硫酸盐，防腐剂，TCEP和Triton X-100之间协同作用下，起到了1+1＞2的明显效果，样本保存液不但可以实现常温稳定的保存样本1年之久，还能在提取样本时，影响控制生物样本中的电荷分布情况，使核酸物质(DNA和RNA)成直线形排列，这样不容易被吸附柱所吸附，所以显著提高了DNA的提取量，这个是没有预期的，完全是在实验过程中发现的结果。
综上所述本发明的样本保存液，制备方法简单，成本低廉，稳定性好，操作容易实现，便于样本DNA的保存和运输，适应大规模采样使用。
本发明提供的DNA样本保存液，制备方法简单，无需调节pH值、无需过滤除菌等复杂的操作步骤，无毒副作用，可在2-35℃的温度范围内(室温)长期有效的保护基因组DNA在一年内不被破坏，便于样本的保存和运输，适应大规模采样使用，应用前景广阔，具有较好的社会价值；
本发明制备的DNA样本保存液独有的配方通过有效的配比与之间的协同作用，保证样品可以直扩，不抑制下游的PCR反应，无需额外的提取步骤，使操作者非常方便；
本发明制备的DNA样本保存液常温即可保存样品，不降解样品中的DNA，同时能保证样品不长细菌和霉菌；
本发明制备的DNA样本保存液组分简单、含量少、制造成本低、容易批量生产和采样，不会抑制后续的检测分析；保存生物样品的时间长，可长达1年之久，远远超过市面上保存数周的保存液；保存的生物样品免提取和免处理，操作比较简单，对操作人员的要求较少；
本发明制备的DNA样本保存液是专为稳定存储口腔细胞或全血样品而设计的功能溶液，样品无需热孵育，提取或纯化，可直接进行PCR扩增，反应数量为1-2ul/反应，可做500-1000个反应；
本发明制备的DNA样本保存液可用于采集和保存口腔细胞或全血样品。样品DNA可用于荧光定量PCR、多重PCR直扩、PCR扩增后的测序、STR分析、SNP分析、全基因组扩增、药物基因组学、动物识别、犯罪现场采样、遗传鉴定、DNA数据库建设、食品和农业研究；
本发明制备的DNA样本保存液具有以下特性：常温长期保存、普通邮件邮寄、液体取样检测、重复多次复检、样品取样均匀、PCR直扩效果、取样无需干燥、保存无需控制、抗细菌抗病毒和防止霉菌滋生等特点；
本发明提供了一种简单、有效的DNA样本保存液，可在常温下保持临床样本中病毒和细胞内的核酸在1年内完整、不降解，为获得下游实验所需要的高质量核酸提供了可靠保障。
本发明制备的DNA样本保存液储存的样本可免提取，直接使用指定的商业化试剂盒完成各种基因检测及分析实验，如PCR、qPCR等，也可使用商业化的试剂盒进行核酸提取后用于基因检测及分析等临床实验。
下面结合若干优选实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1:DNA样本保存液的配制方法
本实施例的DNA样本保存液包括如下组分和含量：Tris 1-10g/L，EDTA盐0.1-5g/L，Uric Acid 0.1-1g/L，烷基硫酸盐0.1-10％(w/v)，防腐剂0.1-5％(v/v)、TCEP 5-50mM和Triton X-100 0.1-2％(v/v)。
本实施例的样本保存液制备方法如下：
(1)使用电子天平称取所需固体试剂，加入到试剂瓶中；
(2)在配制容器中加入总量95％体积的工艺用水，开启磁力搅拌器，搅拌至溶解；
(3)使用移液管或者移液器量取所需液体试剂，加入到试剂瓶中；
(4)将溶液转移至合适容量的量筒中，将工艺用水加入溶液中，定容至刻度线；
(5)将定容后的溶液转移至原试剂瓶中，磁力搅拌5分钟，形成DNA样本保存液；
(6)在容器上标明：名称、浓度、批号、配制人、配制日期、有效期至；
(7)常温储存样品保存液。
将瓶装样本保存液分装为管装形式，管子规格为2mL联盖螺帽管，样本保存液分装规格为1mL/管，即可用于后续采集口腔拭子的保存。
以此配方所配制的DNA样本保存液，保存采集的口腔拭子样品，可以做到在60℃保存3.7周后，所提取的DNA依旧比较完整，可以很好地满足后续的DNA检测工作。
实施例2：口腔拭子采集样本的方法
(1)漱口：被采集者在采集样品前30-60min内，禁止进食。如有进食，建议清水涑口；先用清水漱口两次，去除口腔异物；
(2)防护：采集者应戴手套，避免接触一次性基因采样拭子；
(3)取样：打开一次性口腔拭子采集器或者一次性基因采样拭子的外包装，手持采样柄末端，避免接触口腔拭子采样头；手持白色采样柄末端，使采样头对准口腔内侧，在两侧口腔反复擦拭3-40次；大概30s，在另一口腔内侧重复同样操作；注意避免采样棉片掉落；
(4)留样：采集完毕，将采样头插入样品保存液的离心管中，按压采白色样柄，使采样棉片留在离心管中，拧紧保存液管盖，完成一次采样；
(5)保存：将采样好的保存液，放入回寄信封中保存。
实施例3：DNA样本的采集和分析
本实施例的DNA样本保存液包括如下组分和含量：Tris 1g/L，EDTA-2Na0.1g/L，Uric Acid0.1g/L，SDS0.1％(w/v)，Proclin9500.1％(v/v)、TCEP 5mM和Triton X-1000.1％(v/v)。
采用上述DNA样本保存液，随机采集20个被采人员口腔拭子样本，并进行定量分析，具体数据如表1所示：
表1不同被采人员口腔拭子DNA定量结果
Figure BDA0002767373190000101
Figure BDA0002767373190000111
结果如表1所示，采集的20个样本DNA浓度均可以满足后续的检测分析。
实施例4：DNA样本保存液的性能检测的验证
本实施例的DNA样本保存液包括如下组分和含量：Tris 10g/L，EDTA-2Na 5g/L，Uric Acid 1g/L，SDS10％(w/v)，Proclin 950 5％(v/v)、TCEP 50mM和Triton X-100 2％(v/v)。
(1)使用上述DNA样本保存液稀释离心的T淋巴细胞1，约1mL；
(2)将上述T淋巴细胞加入到900μL上述的DNA样本保存液中，共6支；
(3)将上述样本置于金属浴加热保温，60℃保温24h；
(4)按照提取试剂盒说明书流程，提取6管内样本DNA；
(5)使用核酸定量仪测DNA的含量，具体数据如下表2所示；
表2不同样本DNA定量结果
Figure BDA0002767373190000112
结果如表2所示，采集的6个样本DNA浓度均可以满足后续的检测分析。
实施例5：DNA样本保存液的性能检测的验证
本实施例的DNA样本保存液包括如下组分和含量：Tris 5g/L，EDTA-2Na2.5g/L，Uric Acid 0.5g/L，SDS5％(w/v)，Proclin 950 2.5％(v/v)、TCEP 25mM和Triton X-1001％(v/v)。
(1)使用上述的DNA样本保存液稀释离心的T淋巴细胞2和3，约1mL；
(2)将上述T淋巴细胞加入到900μL上述的DNA样本保存液中，共6支；
(3)将上述样本置于金属浴，60℃保温24h；
(4)按照提取试剂盒说明书流程，提取6管内样本DNA；
(5)使用核酸定量仪测DNA的含量，具体数据如下表3：
表3不同样本DNA定量结果
Figure BDA0002767373190000121
结果如表3所示，采集的6个样本DNA浓度均可以满足后续的检测分析。
实施例6：DNA样本保存液的稳定性的验证
将样本保存液室温放置1年，同时与新配置的样本保存液作为对照，(本实施例中DNA样本保存液的跟组分同实施例5一样)测试其pH和电导值，具体如下：
表4不同时间放置的样本保存液测试结果
序号 样品编号 外观 pH 电导(μs/cm)
1 新配置的样本保存液 无色透明溶液 8.39 857.00
2 室温放置1年的样本保存液1 无色透明溶液 8.25 876.00
3 室温放置1年的样本保存液2 无色透明溶液 8.30 878.00
结果如表4所示，室温放置1年的保存液和新配置的样本保存液的外观均呈现无色透明溶液，pH均满足8.0±0.5，电导均满足850±50μs/cm的要求，说明室温放置1年，样本保存液稳定性很好。
实施例7：保存的生物样本的实验性能的验证
根据以碰撞理论为基础的阿列纽斯(Arrhenius)模型建立的加速老化简化实验方案(Simplified Protocol for Accelerated Aging)，也称“10度原则”(10-degree rule)，可在中度温度范围内适用于良好表征的聚合物，试验结果可以在要求的准确度范围内。即在60℃条件下，加速老化的时间关系是24h相当于在大气环境22℃中(室温保持)14天的老化，即加速因子为14。
具体实施步骤如下：
(1)将采集自同一个体的6份口腔拭子分别放入DNA样本保存液中(本实施例中DNA样本保存液的跟组分同实施例5一样)，3份在室温放置24h，另3份在60℃放置24h；
(2)为了验证DNA样本保存液保护作用，把6份口腔拭子同时放入1xPBS缓冲液中，3份在室温放置24h，另3份在60℃放置24h；
(3)用DNA提取试剂盒对上述样本进行提取，并使用NanoDrop对DNA进行定量，从DNA提取的得率和纯度进行对比，结果如表5所示：
表5不同处理的拭子样本定量结果
Figure BDA0002767373190000131
结果如表5所示，加入DNA样本保存液的拭子样本在常温与60℃放置24h后，提取的DNA量没有显著差异，而在PBS缓冲液中拭子样本在60℃放置24h后，DNA降解很明显。说明DNA样本保存液对口腔拭子有显著的保护作用。
实施例8：保存的生物样本的实验性能的验证
根据阿列纽斯(Arrhenius)模型。即在60℃条件下，加速老化的时间关系是3.7周相当于在大气环境22℃(室温保存)1年的老化，即加速因子为14。
具体实施步骤如下(本实施例中的DNA样本保存液与实施例5中的DNA样本保存液的组成相同)：
(1)样本保存液在60℃放置3.7周后与新配置的样本保存液中分别放入采集自同一个体的各3份口腔拭子，在60℃放置24h；
(2)用DNA提取试剂盒对上述样本进行提取，从DNA提取的得率和纯度进行对比，结果如表6：
表6放置不同时间的DNA样本保存液的拭子样本加速实验DNA定量结果
Figure BDA0002767373190000141
结果如表6所示，DNA样本保存液的拭子样本在60℃放置3.7周和新配置DNA样本保存液，加入口腔拭子放置60℃24h后，提取的DNA量没有显著差异，说明样DNA样本保存液本身的稳定性很好，并且对口腔拭子保存的稳定性有明显帮助作用，所提取的DNA依旧比较完整，可以很好地满足后续的DNA检测工作。
实施例9：全组分的DNA样本保存液显著增加DNA提取量
一、三种组分的DNA样本保存液
(1)使用DNA样本保存液(包含三种组分)(本实施例的DNA样本保存液包括如下组分和含量：Tris 5g/L，EDTA-2Na2.5g/L和Triton X-100 1％(v/v))，稀释离心的T淋巴细胞4，每种约1ml；
(2)将上述T淋巴细胞加入到上述900μL样本保存液中，每种共8支；
(3)将上述所有样本置于金属浴，60℃保温24h；
(4)按照提取试剂盒说明书流程，提取24管内样本DNA；
(5)使用核酸定量仪测DNA的含量，具体数据如下表7；
表7含有三种组分的保存液DNA提取量
Figure BDA0002767373190000142
Figure BDA0002767373190000151
二、五种组分的DNA样本保存液
(1)使用DNA样本保存液(包含五种组分)(本实施例的DNA样本保存液包括如下组分和含量：Tris 5g/L，EDTA-2Na2.5g/L，SDS 5％(w/v)，Proclin 950 2.5％(v/v)和TritonX-100 1％(v/v))，稀释离心的T淋巴细胞4，每种约1mL；
(2)将上述T淋巴细胞加入到上述900μL样本保存液中，每种共8支；
(3)将上述所有样本置于金属浴，60℃保温24h；
(4)按照提取试剂盒说明书流程，提取24管内样本DNA；
(5)使用核酸定量仪测DNA的含量，具体数据如下表8；
表8含有五种组分的保存液DNA提取量
Figure BDA0002767373190000152
三、全组分的DNA样本保存液
(1)使用全组分DNA样本保存液(本实施例的DNA样本保存液包括如下组分和含量：Tris 5g/L，EDTA-2Na2.5g/L，Uric Acid 0.5g/L，SDS 5％(w/v)，Procin 950 2.5％(v/v)、TCEP 25mM和Triton X-100 1％(v/v))，稀释离心的T淋巴细胞4，每种约1mL；
(2)将上述T淋巴细胞加入到上述900μL样本保存液中，每种共8支；
(3)将上述所有样本置于金属浴，60℃保温24h；
(4)按照提取试剂盒说明书流程，提取24管内样本DNA；
(5)使用核酸定量仪测DNA的含量，具体数据如下表9：
表9全组分的保存液DNA提取量
Figure BDA0002767373190000161
从表7-9可以看出，使用本发明的全组分的DNA样本保存液可以显著提高DNA的提取量，说明本发明的全组分DNA样本保存液能够通过改变DNA分子的表面电荷排布，进而将DNA分子进行线性排列，从而大大提高了DNA的提取量，很大程度的节省了实验人员反复提取DNA的时间，大大方便了后续的检测和分析。
实施例10：DNA样本保存液储存的样本可免提取，可以长期保存核酸实验
采样方法：
1、口腔细胞样品采集：
1)被采集者在采集样品前30-60Min内，禁止进食。如有进食，建议清水涑口；
2)采集者应戴手套，避免接触一次性基因采样拭子；
3)打开一次性基因采样拭子包装，手持采样柄末端，避免接触口腔拭子采样头；
4)手持白色采样柄末端，使采样头对准口腔内侧，在口腔内侧擦拭30-40次，大概30Sec，在另一口腔内侧重复同样操作；注意避免采样棉片掉落；
5)采集完毕，将采样头插入样品保存液的离心管中，按压采白色样柄，使采样棉片留在离心管中。
注意：采集程序需专业，保证采样量大于500ng，否则结果不理想。
口腔细胞样品处理：
1)将带有采样棉片的样品保存液的离心管漩涡震荡，混合均匀，室温放置30-45Mins，效果更佳，该过程无需加热；
2)将带有采样棉片的样品保存液的离心管于室温保存，避免光照，取样检测时，保证样品混合均匀。
2、全血样品采集：
1)分别取30μL样品置于1mL样品保存液中，混合均匀。室温放置30-45min，效果更佳，该过程无需加热；将样品保存液的离心管于室温保存，避免光照。
注意：需将血样样品置于样品保存液中混合均匀，室温放置30-45min，效果更佳，保证其充分裂解。取样检测时，保证样品混合均匀。
其中，采样顺序如下：
口腔细胞和血液各2组；
口腔细胞样本：
FT13(Buccal，正常扩增) FT14(Buccal，正常扩增)
血液样本：
FB8(Blood，正常扩增) FB11(Blood，正常扩增)
3、检验方法
3.1方法：通过PCR以及毛细管电泳分析样品保存液中DNA储存稳定性；
3.2材料：2×Mix，5×Primers(引物的混合物)，10×CE Buffer，甲酰胺，内标，水，待测样品(样品保存液)；
3.3步骤：
3.3.1配制PCR反应体系
每个反应的体积10μL，分装PCR反应混合液，10μL/管，PCR体系见下表：
成分 终浓度 加入量
2×Mix 1× 5μL
5×Primers 1× 2μL
样品保存液(带有样品) 1μL
灭菌水 / 补足10μL
3.3.2 PCR扩增
使用PCR仪，
PCR条件：95度15分钟，(94度20秒，59度1分钟，72度1分钟)×29循环，60度60分钟。
3.3.3检测PCR产物
取PCR反应产物1μL，加入9μL内标/甲酰胺Mix(甲酰胺8.5μL+0.5μL 1×内标)。混匀离心。置于遗传分析仪3130上，做毛细管电泳检测。
3130操作按《3130型遗传分析仪作业指导书》。
3.4结果分析
分析19个基因座上的产物峰情况。
3.5合格要求
当19个基因座上均有产物峰时，说明保存在样品保存液中的核酸可以用于STR分析，判定稳定性合格。
3.6结果分析
经STR检测，常温保存一年后样品保存液中的核酸保存稳定，说明使用本申请的DNA样本保存液保存的生物样本(包含口腔细胞和血液)稳定性好，并且免于提取，可以直接用于短串联重复序列STR测试。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。

Claims (10)

1.一种DNA样本保存液，其特征在于包括如下组分：弱碱1-10g/L、EDTA盐0.1-5g/L、抗氧化剂0.1-1g/L、烷基硫酸盐0.1-10w/v％、防腐剂0.1-5v/v％、硫醇类还原剂5-50mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.1-2v/v％，其余部分包括水；
所述弱碱包括有机弱碱和/或无机弱碱；优选的，所述有机弱碱包括三羟甲基氨基甲烷、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸、有机酸碱金属盐中的任意一种或两种以上的组合；优选的，所述无机弱碱包括碱金属的碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硼酸盐中的任意一种或两种以上的组合；所述抗氧剂包括尿酸、尿酸盐、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯中的任意一种或两种以上的组合，优选为尿酸和/或尿酸盐；所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦。
2.根据权利要求1所述的DNA样本保存液，其特征在于包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷1-10g/L、EDTA盐0.1-5g/L、尿酸和/或尿酸盐0.1-1g/L、烷基硫酸盐0.1-10w/v％、防腐剂0.1-5v/v％、三(2-羧乙基)膦5-50mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.1-2v/v％，其余部分包括水。
3.根据权利要求1或2所述的DNA样本保存液，其特征在于：所述EDTA盐包括EDTA钠盐和/或EDTA钾盐。
4.根据权利要求1或2所述的DNA样本保存液，其特征在于：所述烷基硫酸盐包括十二烷基硫酸钠、辛基硫酸钠、十二烷基硫酸铵、十二烷基磺酸钠中的任意一种或两种以上的组合，优选为十二烷基硫酸钠和/或十二烷基磺酸钠。
5.根据权利要求1或2所述的DNA样本保存液，其特征在于：所述防腐剂包括Proclin系列防腐剂、叠氮钠、二唑烷基脲、咪唑烷基脲、羟甲基甘氨酸中的任意一种或两种以上的组合；优选的，所述Proclin系列防腐剂包括Proclin150、Proclin200、Proclin300、Proclin950中的任意一种或两种以上的组合；
和/或，所述水为无菌水。
6.根据权利要求1所述的DNA样本保存液，其特征在于：所述有机酸碱金属盐包括柠檬酸钠；
和/或，所述无机弱碱中的碱金属包括钠、锂、钾中的任意一种或两种以上的组合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的DNA样本保存液的制备方法，其特征在于包括：
将弱碱、EDTA盐、抗氧化剂、烷基硫酸盐、防腐剂与水混合形成溶液，之后向所获溶液中加入硫醇类还原剂、聚乙二醇辛基苯基醚、水混合均匀，形成所述DNA样本保存液。
8.权利要求1-6中任一项所述的DNA样本保存液于保存DNA样本中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述DNA样本为可提供液态核酸类遗传物质的生物样品；优选的，所述DNA样本包括唾液样本和/或口腔拭子样本。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述生物样品包括人或动物的生理和/或病理体液、人或动物的细胞悬液、人或动物机体组织的提取液和/或匀浆、DNA合成过程的中间体、化学和/或生化合成DNA的混合物、植物的生理和/或病理体液、植物的细胞悬液、细菌的提取液和/或悬液、真菌的提取液和/或悬液、质粒的提取液和/或悬液、病毒的提取液和/或悬液、寄生虫的提取液和/或悬液中的任意一种或两种以上的组合；
优选的，所述人或动物的生理和/或病理体液包括人或动物的分泌物和/或渗出液；
优选的，所述人或动物的细胞悬液包括血液、淋巴液、滑膜液、精液、唾液中的任意一种或两种以上的组合。
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