CN107586774A - 一种常温下长时间口腔拭子dna保存和提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法，包含口腔拭子DNA的提取方法以及口腔拭子DNA的保存液的制备方法，本发明提供的常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法，同时考虑了提取以及保存液的制备两点，从而有利于保持DNA的完整性。在这过程中精化了各个参数值，保存的效率高于其他方法，而同时在常温下很大的时间跨度下进行保存。总的说来，本方法具有快速、简便、经济、可靠的特点，可以用于多态性的分析。

Description

一种常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及一种常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法。

背景技术

近年来，采用口腔拭子进行DNA检验有逐渐增多的趋势，由于国内没有专门用于采集口腔脱落细胞的工具，而只是使用普通的医用棉签，而不同的人采集口腔脱落细胞在擦拭次数、力度、检材剪取量及扩增用的模板量上都存在一定差异，导致了口腔拭子的DNA常温下保存效果不大稳定，影响了口腔拭子在DNA常温下保存中的应用。为规范口腔拭子DNA的采集，提高口腔拭子的DNA保存效率，亟需一种常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的一种常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法。

为达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：一种常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法，包含以下步骤：

口腔拭子DNA的提取方法以及口腔拭子DNA的保存液的制备方法；

口腔拭子DNA的提取方法包含以下步骤：

第一步，取一个2ml容量的离心管，对其进行高温消毒，选取口腔拭子，使用消毒灭菌后的镊子小心撕去其外表面，选取的过程中用分析天平称取保证所述口腔拭子的质量在0.8g与1g之间，只取所述口腔拭子头部的五分之一到四分之一之间，放入离心管中，加入质量百分比为10％的弱阳离子螯合树脂溶液，反复吹打，加入浓度为100μl 4mol/L异硫氰酸胍配成的细胞裂解液(PH＝10.0)、和100μl80U/nl的木瓜蛋白酶溶液，将两者震荡混匀后剧烈振荡后，室温下放置1分钟，再使用台式高速离心机13000rpm离心1分钟；

第二步，将pH为5.0的磷酸缓冲溶液与上清液按体积比4：1混合，加入800μL无水乙醇，室温下静置1分钟，加入核酸纯化柱中，台式高速离心机13000rpm离心1分钟；在所述纯化柱中加入500g/L无水乙醇洗涤液800μL混匀后使用台式高速离心机8000rpm离心1分钟，将离心后的纯化柱转移到另一个干净的离心管，再次加入400μL的同样的洗涤液使用相同的手法离心1分钟，将干燥待用的所述核酸纯化柱置于新离心管上，将80μL 40-50℃的去离子水升温至70℃，放置于所述核酸纯化柱的硅胶膜上，并在恒温50℃下放置1分钟，并立即离心1分钟，再取一个消毒后的离心管，并收集下层液体，得到口腔拭子DNA溶液；口腔拭子DNA的保存液的制备方法，步骤如下：

首先，取50ml 0.1modl/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与30ml 0.1mol/L盐酸在一个干净的200ml的烧杯中混匀后，加去离子水稀释至10ml，得到稀释后的三羟甲基氨基甲烷溶液，将十二烷基硫酸钠溶解于烧杯中，加入灭菌去离子水、0.85％乙醇直到达到饱和状态，并添加乙二胺四乙酸EDTA、蔗糖分别达到浓度20mol/L、28mpl/L，得到饱和溶液，然后将饱和溶液用冰乙酸调节至pH5.0配制成保存液；

将口腔拭子DNA加入保存液中进行常温保存，保存的温度在0℃到30℃之间。

本发明的有益成果为：本发明提供的常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法，同时考虑了提取以及保存液的制备两点，从而有利于保持口腔试子DNA的完整性。在这过程中精化了各个参数值，保存的效率高于其他方法，而同时在常温下很大的时间跨度下进行保存。总的说来，本方法具有快速、简便、经济、可靠的特点，可以用于多态性的分析。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：

实施例1：

近年来，基因检测技术发展颇为迅速，而在样本取材(DNA来源)上却鲜有突破性的进展。血液中的病原体有潜在的致病风险。抽血给许多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时也存在一定的麻烦。此外抽血的高成本费用成为基因检测普及的制约因素。因此，迫切需要一种简便无损的基因获取方法以满足检测乃至广泛筛查的需要。国内外科研力量也在提取DNA方面不断的尝试寻求可以取代血液的其他生物检材，如采用脱落的口腔黏膜上皮、毛囊等各种可能含有DNA的人体检材。在口腔黏膜上皮的收集方式上，文献报道过口腔细胞刷、口腔黏膜拭子、牙签、漱口等多种方式。其中漱口法的DNA产量是相对最高的。本实施例介绍一种口腔拭子的获取的获取方法：

口腔拭子的获取：取1根普通医用消毒棉签反复刮拭受检者面颊内壁黏膜6次(受检者30min内未进食)，空气中干燥后贮存于干净的信封中室温保存。

口腔拭子DNA的提取：

手工法：用消毒后的镊子将风干的口腔拭子表面的硬质棉花撕脱，置于2mL的EP管中，加入100μl质量百分比为10％的弱阳离子螯合树脂溶液，反复吹打，加入浓度为100μl4mol/L异硫氰酸胍配成的细胞裂解液(PH＝10.0)、和10μl 80U/ul的木瓜蛋白酶溶液，将两者震荡混匀后剧烈振荡后，室温下放置1分钟，再使用台式高速离心机13000rpm离心1分钟，将pH为5.0的磷酸缓冲溶液与上清液按体积比4：1混合，加入800μL无水乙醇，室温下静置1分钟，加入核酸纯化柱中，台式高速离心机13000rpm离心1分钟；在所述纯化柱中加入500g/L无水乙醇洗涤液800μL混匀后使用台式高速离心机8000rpm离心1分钟，将离心后的纯化柱转移到另一个干净的离心管，再次加入400μL的同样的洗涤液使用相同的手法离心1分钟，将干燥待用的所述核酸纯化柱置于新离心管上，将80μL 40-50℃的去离子水升温至70℃，放置于所述核酸纯化柱的硅胶膜上，并在恒温50℃下放置1分钟，并立即离心1分钟，再取一个消毒后的离心管，并收集下层液体，得到口腔拭子DNA溶液

试剂盒法：按QIAamp DNA mini Kit(50)试剂盒的说明书要求提取DNA。

静脉血DNA的提取：按TAKERA DNA EXTRAC-TION KIT试剂盒说明书提取。

口腔拭子及静脉血DNA浓度及纯度的测定：

用超微量分光光度计测定DNA溶液的A260值及A260/A280、A260/A230值来衡量DNA的浓度及纯度。

实施例2：口腔拭子法是提取当事人的颊粘膜的口腔脱落细胞进行DNA检验的方法，取材简便、无创伤、所需成本低，且不受当事人近期输血或接受异体骨髓移植的影响。国外多利用口腔拭子法提取有犯罪前科的在押人员和犯罪嫌疑人的口腔脱落细胞进行法医DNA检验并建立DNA数据库。国内近年来采用口腔拭子进行DNA检验也有增多趋势，但因不同人采集口腔脱落细胞时擦拭次数、力度不一，采集的口腔脱落细胞的多少肉眼无法观察，法医工作者单纯依靠经验进行取材、选择DNA提取方式及决定扩增的模板DNA用量的做法带有一定的盲目性。

口腔黏膜细胞是分子流行病学、遗传学和法医学研究中重要的DNA来源，其收集具有取样简便、安全、成本低、无创伤的优点。目前从人体口腔黏膜上皮细胞提取DNA的方法主要有酚-氯仿法、Chelex-100法、试剂盒法等。酚-氯仿法提取DNA的操作较为繁杂，效率不稳定，且酚和氯仿均有挥发毒性，长期使用严重危害人体健康。Chelex-100法操作比较简单，但得到的DNA纯度不高，一般认为用此法提取的DNA保存时间不宜过长，超过12个月可能会影响PCR的忠实性。试剂盒法得到的DNA质量较好，但成本较高。盐析法是全血基因组DNA提取常用的方法之一，具有快速、简便、可靠的特点。提供口腔拭子为标本，建立了盐析法提取口腔拭子DNA的方法，并用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chainreaction－restriction fragment length polymor-phism，PCR－RFLP)技术对得到的DNA的2个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点(TP53基因的rs1042522和CHRNA3基因的rs12910984进行了分析。

DNA浓度和纯度检测用PUEX紫外分光光度计检测DNA的紫外吸收值，计算DNA的量和纯度。根据计算结果将DNA稀释为10ng/μl。

DNA分子质量检测4μl DNA与2μl上样缓冲液混合，0.8％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统照相。

SNPs检测引物由Primer3软件设计，上海英骏生物技术有限公司合成。rs1042522位点上游引物：5′-CAA TGG ATG ATT TGA TGC TG-3′，下游引物：5′-TGG TAG GTT TTC TGGGAA GG-3′，扩增产物长度为196bp。rs12910984位点上游引物：5′-GCT GGT CTT GAA CTCCCA AC-3′，下游引物：5′-GGG CTA GTT CAC CAC TTT GC-3′，扩增产物长度为315bp。PCR反应体系均为20μl，包含Sino Bio 2×Taq master mix 10μl，10μmol/L上、下游引物各0.4μl，模板1μl(10ng)，dd H₂O 8.2μl。rs1045255位点PCR扩增反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；

最后72℃延伸5min。rs12910984位点PCR扩增反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；最后72℃延伸5min。取4μlPCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统照相。2个SNPs位点酶切总反应体积均为15.5μl，其中缓冲液1μl，PCR产物10μl，内切酶0.5μl(5U)，dd H₂O 4μl。37℃水浴过夜，2％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统照相。

DNA测序取2个SNRs位点酶切后判断为不同基因型的样本扩增后送北京诺赛基因组研究中心测序。

实施例结果：

DNA浓度和纯度检测结果紫外吸收值测定结果显示单支口腔拭子提取得到DNA的量在0.68～2.56μG之间，均值为1.06μG。D260/D280比值在1.77～1.94之间，均值为1.83。

DNA琼脂糖凝胶电泳结果

DNA琼脂糖凝胶电泳显示DNA的大小在23kb左右，部分样品有凋亡条带出现。

以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明的权利要求保护范围。同时以上说明，对于相关技术领域的技术人员应可以理解及实施，因此其他基于本发明所揭示内容所完成的等同改变，均应包含在本权利要求书的涵盖范围内。

本发明的有益成果为：本发明提供的常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法，同时考虑了提取以及保存液的制备两点，从而有利于保持DNA的完整性。在这过程中精化了各个参数值，保存的效率高于其他方法，而同时在常温下很大的时间跨度下进行保存。总的说来，本方法具有快速、简便、经济、可靠的特点，可以用于多态性的分析。

Claims (1)

1.一种常温下长时间口腔拭子DNA保存和提取方法，其特征在于，包含：

口腔拭子DNA的提取方法以及口腔拭子DNA的保存液的制备方法；

所述口腔拭子DNA的提取方法包含以下步骤：

第一步，取一个2ml容量的离心管，对其进行高温消毒，选取口腔拭子，使用消毒灭菌后的镊子小心撕去其外表面，选取的过程中用分析天平称取保证所述口腔拭子的质量在0.8g与1g之间，只取所述口腔拭子头部的五分之一到四分之一之间，放入离心管中，加入质量百分比为10％的弱阳离子螯合树脂溶液，反复吹打，加入浓度为100μl 4mol/L异硫氰酸胍配成的细胞裂解液(PH＝10.0)、和100μl 80U/ul的木瓜蛋白酶溶液，将两者震荡混匀后剧烈振荡后，室温下放置1分钟，再使用台式高速离心机13000rpm离心1分钟；

第二步，将pH为5.0的磷酸缓冲溶液与上清液按体积比4：1混合，加入800μL无水乙醇，室温下静置1分钟，加入核酸纯化柱中，台式高速离心机13000rpm离心1分钟；在所述核酸纯化柱中加入500g/L无水乙醇洗涤液8000μL混匀后使用台式高速离心机8000rpm离心1分钟，将离心后的所述核酸纯化柱转移到另一个干净的离心管，再次加入400μL的同样的洗涤液使用相同的手法离心1分钟，将干燥待用的所述核酸纯化柱置于新离心管上，将80μL 40-50℃的去离子水升温至70℃，放置于所述核酸纯化柱的硅胶膜上，并在恒温50℃下放置1分钟，并立即离心1分钟，再取一个消毒后的离心管，并收集下层液体，得到口腔拭子DNA溶液；

所述口腔拭子DNA的保存液的制备方法，步骤如下：

首先，取50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与30ml 0.1mol/L盐酸在一个干净的200ml的烧杯中混匀后，加去离子水稀释至100ml，得到稀释后的三羟甲基氨基甲烷溶液，将十二烷基硫酸钠也溶解于烧杯中，加入灭菌去离子水、0.85％乙醇直到达到饱和状态，并添加乙二胺四乙酸、蔗糖分别到达浓度20mol/L、28mol/L，得到饱和溶液，然后将所述饱和溶液用冰乙酸调节至pH 5.0配制成保存液；

将所述口腔拭子DNA加入所述保存液中进行常温保存，保存的温度在0℃到30℃之间。