JPH08501228A

JPH08501228A - 非液体細胞試料の採取方法

Info

Publication number: JPH08501228A
Application number: JP6505572A
Authority: JP
Inventors: クリンガー，キャサリーン・ダブリュ; リチャーズ，ブレンダ・エル
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-05
Publication date: 1996-02-13
Also published as: WO1994003111A1; EP0653920A1; CA2137282A1

Abstract

(57)【要約】ブラシを使用して遺伝分析のための非液体細胞試料を採取するための簡単な非観血的方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】非液体細胞試料の採取方法発明の背景組換えＤＮＡ技術の進歩によって、分子分析およびいくつかの遺伝病の予測が可能になった。現在、遺伝分析は、主として、全血から得られる (例えば、遠心による) 白血球を使用して行われる。次に、全血は、観血的技術 (例えば、静脈穿剌) を使用して医師または瀉血医によって臨床学的に採取しなければならない。うがい薬を使用して遺伝物質を採取するための非観血的な方法は、開示されている [レンチ,エヌ (Lench,N.) ら、ザ・ランセット (The Lancet) １：１３５６−８ (１９８８年６月１８日) ]。この方法では、個人が自分の口を食塩水で洗浄し、次いで、口から容器中に放出する。該容器は、遠心され、遠心後にペレット化された細胞が回収される。試料を容易に得ることができることは、この方法の主要な魅力である。しかしながら、このようにして得られた試料は、液体フォーマットの形態であり、したがって、取り扱い、プロセッシングおよび汚染についての問題が存在する。遺伝分析のためのＤＮＡは、膣頚管細胞からも採取された [バーク，アール・ディ (Burk,Ｒ.Ｄ.) およびシー・スピッツァー (Ｃ．Spitzer)、アメリカン・ジャーナル・オブ・オブステットリクス・アンド・ガイニコロジー (Ａm.Ｊ.Obs tet.Gynecol.)、１６２：６５２−４ (１９９０) ]。種々の方法によって得られた細胞物質の定量収量を比較する研究において、膣頚管洗浄は、膣頚管細胞を採取するための切屑、スワブまたはブラシ法より優れていることが判明した[ゴールドバーグ，ジーエル (Goldberg，ＧＬ) ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・オブステットリクス・アンド・ガイニコロジー、１６１：１１６９−７２(１９８９)；バームンド，エスエイチ (Ｖermund,ＳＨ) ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・オブステットリクス・アンド・ガイニコロジー、１６０：３０４−８ ( １９８９) ]。しかしながら、洗浄によって得られる膣頚管細胞は、液体フォーマットであり、したがって、うがい技術によって得られた試料と同様の、取り扱い、プロセッシングおよび汚染についての問題が存在する。問題の目的のために、ＤＮＡは、上皮細胞、尿からのスパン (spun) [ガスパリニン，ピー (Ｇasparinin,Ｐ.) ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン (Ｎ.Ｅng.Ｊ.Ｍed.)、３２０：８０９ (１９８９) ]、および引き抜いた毛髪から得られた根および周囲の有鞘細胞 [ヒグチ，アール (Ｈiguchi ,Ｒ.)ら、ネイチャー (Ｎature)、３３２：５４３−６ (１９８８)] から得られた。しかしながら、このようにして得られた試料は、しばしば、遺伝分析のために充分なＤＮＡを含有していない。したがって、毛髪および尿試料は、臨床分析のためには最適ではない。臨床分析のために適切な量の遺伝物質を有する非液体細胞試料を得るための簡単な非観血技術は有用である。発明の概要本発明は、遺伝分析のために動物由来の非液体細胞試料を得るため簡単な非観血方法に関する。該方法は、動物の口腔中に適当な大きさに作ったブラシを挿入し、該ブラシを口膜と接触させ、該膜に対してブラシを振り動かし、その結果、ブラシの刷毛 (bristle) 中に細胞が捕獲され、次いで、捕獲した細胞を含有するブラシを取り出し、遺伝分析で使用するためにブラシの刷毛から該細胞を単離することを含む。好ましい具体例では、該ブラシは、渦巻き状のものであり、その結果、口膜に対してブラシを回転させることによって、細胞を得ることができる。次に、このようにして得られた細胞を、多くの公知遺伝技術のいずれかを使用して分析することができる。例えば、前記方法に従って得られた細胞を溶解させることができ、細胞のＤＮＡを好適な標識プローブと接触させることができる。さらに、このようにして得られたＤＮＡを、まず、増幅させて、分析のために利用可能な遺伝物質の量を増加させることができる。本明細書に記載の遺伝試験用細胞の採取方法を使用することの主要な利点は、このようにして得られた非液体試料が液体試料よりも取り扱い安く処理し易いことである。さらに、非液体試料は、あまり汚染(例えば、細菌による)の傾向がなく、より安定である。発明の詳細な説明一般に、本発明は、遺伝分析のために動物(例えば、ヒトまたは家畜)から非液体細胞試料を採取する方法に関する。該方法は、ブラシを用いて、動物の口腔内から細胞を採取する。動物の口腔から得ることができる細胞の例としては、内頬または舌の上皮細胞が挙げられる。本発明の方法によると、ブラシを動物の口腔内に挿入し、口膜と接触させ、充分な時間、該膜に対して振り動かし(例えば、回転またはブラッシングし)、その結果、ブラシの刷毛中に細胞が捕獲される。次いで、捕獲した細胞を含有するブラシを動物の口から取り出し、遺伝分析で使用するためにブラシの刷毛から細胞を単離する。本発明で使用するのに好適であるためには、ブラシは、動物の口腔中への挿入を可能にさせるのに好適なサイズのものであるべきである。さらに、ブラシの刷毛は、潜在的に汚染する物質を含まないべきである。例えば、哺乳動物の毛からなるブラシは、毛内に存在する遺伝物質が試料を汚染し、それによって、遺伝分析を妨害するので、本発明方法において使用すべきではない。本発明で使用するための好ましいブラシは、合成(例えば、ナイロンまたはダクロン)刷毛を有する。本発明で使用するための特に好ましいブラシは、現在、パパニコラウスミアおよびクラミジア試験のために使用されているナイロン刷毛細胞学ブラシ [サイトソフト (Ｃytosoft^TM)、メディカル・パッケージング・コーポレイション(Ｍedi cal Packaging Corporation)、カリフォルニア州キャマリロ] である。口から取り出した後、捕獲した口細胞を含有するブラシを直接分析するか、または、次の遺伝分析のために輸送および／または貯蔵することができる。この時点で、捕獲した細胞をブラシから追い出させるのを回避することを目的とした手段を取るべきである。例えば、ブラシは、輸送および／または貯蔵の間に容器( 例えば、包装材料) 中に置くことができる。細胞は、捕獲した細胞の損失を回避する方法によってブラシから得てもよい。ブラシから細胞を得る好ましい方法は、溶液と細胞との接触による。例えば、ＤＮＡが増幅のための細胞から単離されるべきである場合、細胞は、細胞を溶解させる溶液 (例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム) を使用してブラシから採取することができる。このようにして得られた口細胞由来遺伝物質を、制限エンドヌクレアーゼによる消化、臭化エチジウム染色アガロースゲルの紫外光可視化、ＤＮＡ配列決定、または検出可能な核酸配列(例えば、標識プローブ)とのハイブリダイゼーションなどの多くの公知の遺伝技術を使用して遺伝的に分析することができる。さらに、記載された方法に従って得られる細胞由来遺伝物質を、Ｑ−ベータ−レプリカーゼ、およびポリメラーゼ連鎖反応 (ＰＣＲ)[サイキ，アール・ケイ (Ｓaiki, Ｒ.Ｋ.) ら、サイエンス (Ｓcience) ２３９：４８７−４９１ (１９８８)；ウォン,シー (Ｗong,Ｃ.) ら、ネイチャー (Ｎature) ３３０、３８４−３８６ ( １９８７) およびムリス (Ｍillis) らに対する米国特許第４，６８３，２０２号]などの公知の増幅技術を使用して増幅させ、さらに、遺伝分析のために利用可能な量に遺伝物質を増加させることができる。本発明を以下の実施例で説明するが、如何なる場合も限定を意図するものではない。実施例１：ブラシまたは木製スパチュラのいずれかを使用して口腔から細胞を採取すること５人のヒト患者の口腔を木製スパチュラで約３０秒間掻爬し、５人のヒト患者において、サイトソフト (Ｃytosoft^TM) ナイロン刷毛細胞学ブラシ (cytologyb rush)[メディカル・パッケージング・コーポレイション (Ｍedical Ｐackaging Ｃorporation)；カリフォルニア州キャマリロ] を、約３０秒間、頬の内側に対して回転させた。該スパチュラまたはブラシを、５０mＭＮａＯＨを含有する試験管中に約１時間浸し、その後、１０倍容量の１Ｍトリス (ＴＲＩＳ) (ｐＨ８) を該試験管に添加して中和させた。スパチュラまたはブラシを使用して得られた頬細胞溶解物をポリメラーゼ連鎖反応 (ＰＣＲ) において直接使用して、膵嚢胞性繊維症膜内外調節遺伝子の以下のエキソン：エキソン４、１０、１１、２０および２１のうちの１つ以上を増幅させた。ＰＣＲのために適切なプライマーを、リオーダン，ジェイ・アール(Ｒi ordan,Ｊ.Ｒ.) ら、サイエンス (Ｓcience) ２４５：１０６６−１０７３(１９８９) に開示されている核酸配列に基づいて発生させた。 AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡサーマルサイクラー [パーキン・エルマー (Ｐerkin Ｅlmer)] を使用して、ＰＣＲ増殖反応を行った。頬溶解物を、９４℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、および７４℃で３０秒間の２８サイクルについて増幅させ、最後に、７４℃で１０分間浸漬した。使用した反応バッファーは、従前に開示されていた [サイキ,アール・ケイ (Ｓaiki,Ｒ.Ｋ.) ら、サイエンス (Ｓcience) ２３９：４８７−４９１ (１９８８) ]。次いで、増幅した物質をナイロン膜 [バイオトランス・プラス (Ｂiotrans Ｐ lus)、ＩＣＮ・バイオメディカル (ＩＣＮＢiomedical)] 上にブロットし、ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上で分析した。木製スパチュラを使用して細胞を得た５つの試料のいずれについてもＰＣＲ生成物は検出されなかった。反対に、ブラシを使用して得られた５つの試料全てについてＰＣＲ生成物は検出された。これらのＰＣＲ生成物を、配列特異的プローブにハイブリダイズさせて、公知の突然変異 [ケレム，ビー (Ｋerem,Ｂ.) ら、サイエンス (Ｓcience) ２４５：１０７３−１０８０ (１９８９)；レンナ (Ｌemna) ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン (Ｎ.Ｅng.Ｊ.Ｍed.) ３２２：２９１−２９６ (１９９０)；ケレム (Ｋerem) ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci., ＵＳＡ) ８７：８４４７−８４５１ (１９９０)] を同定した。同等の物当業者は、常法のみを使用して、本明細書に詳述した本発明の特定の具体例に対する多くの等価物を認識するか、または、確かめることができる。かかる同等の物は、以下の請求の範囲の範囲中に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/48 Ｓ 8310−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）刷毛を有しており、動物の口腔中に挿入することができるブラシを挿入し；ｂ）該ブラシの刷毛を細胞からなる口膜と接触させ；ｃ）該膜に対してブラシを振り動かし、その結果、膜からの細胞が該ブラシの刷毛中に捕獲され；ｄ）この捕獲された細胞を含有するブラシを口腔から取り出し、これによって、非液体細胞試料を得ることを特徴とする非液体動物細胞試料の採取方法。２．ブラシが渦巻き状である請求項１記載の採取方法。３．動物がヒトである請求項１記載の採取方法。４．請求項１記載の採取方法に従って採取された非液体細胞試料。５．ａ）刷毛を有しており、動物の口腔中に挿入することができるブラシを挿入し；ｂ）該ブラシの刷毛を細胞からなる口膜と接触させ；ｃ）該膜に対してブラシを振り動かし、その結果、膜からの細胞が該ブラシの刷毛中に捕獲され；ｄ）この捕獲された細胞を含有するブラシを口腔から取り出し；次いで、ｅ）工程ｄ）で得られた細胞を溶解させ、これによって、遺伝物質を得；ｆ）該遺伝物質について遺伝分析を行うことを特徴とする動物の遺伝分析方法。６．動物がヒトである請求項５記載の分析方法。７．請求項５記載の分析方法に従って採取された遺伝物質。８．ａ）刷毛を有しており、動物の口腔中に挿入することができるブラシを挿入し；ｂ）該ブラシの刷毛を細胞からなる口膜と接触させ；ｃ）該膜に対してブラシを振り動かし、その結果、膜からの細胞が該ブラシの刷毛中に捕獲され；ｄ）この捕獲された細胞を含有するブラシを口腔から取り出し；ｅ）工程ｄ）で得られた細胞を溶解させ、これによって、遺伝物質を得；ｇ）該遺伝物質を関心のある核酸配列に対して相補的な検出可能な核酸配列と接触させ；ｈ）遺伝子配列および検出可能な核酸配列をハイブリダイズさせ；次いで、ｉ）関心のある核酸配列の存在の指標としてハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする、動物から得た細胞中に含有される遺伝物質における関心のある特定の核酸配列の存在の検出方法。９．動物がヒトである請求項８記載の検出方法。