CN103290114B - 检测耳聋相关的线粒体t12201c突变试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种检测耳聋相关的线粒体DNAT12201C突变的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T12201C片段的PCR混合液、针对T12201C设计的一对外引物、针对T12201C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照和盒体组成。本发明运用蛋白酶K消化裂解法，从少量标本中快速提取基因组DNA，既解决传统上从耳聋患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦，又解决了跨地区传递样本的问题；既提高了酶切的特异性，又确保结果的特异性和稳定性；既降低检测成本，操作又简便快速。可在检测与耳聋相关的线粒体基因ND1 T12201C突变中的应用。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及用于检测与耳聋相关的线粒体DNA T12201C突变的试剂盒，还涉及一种与耳聋相关的线粒体基因突变的检测方法，特别涉及检测线粒体tRNAHisT12201C突变的方法，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与耳聋相关的线粒体DNA T12201C突变中的应用。
背景技术
耳聋是导致言语交流障碍的常见致残疾病，是人类最大的苦难之一。据WHO 2005年估计全球听力残疾人达2.78亿，占世界总人口4.6%；80%的听力残疾人生活在中、低收入国家。耳聋已成为我国严重的健康安全问题，给国家和社会带来巨大负担。 耳聋是一类复杂性疾病，由遗传因素、环境因素或两者相互作用所致。部分耳聋疾病呈母系遗传特征，提示mtDNA异常可能是这些耳聋疾病发病的分子基础之一。线粒体DNA(Mitochondria DNA, mtDNA)突变是引起感音神经性耳聋的重10 要原因之一，这些突变主要位于线粒体12S rRNA和tRNA基因上。位于12S rRNA基因的同质性A1555G和C1494T突变与氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside Antibiotics, AmAn)导致的非综合征型耳聋相关。近两年来，我们课题研究组发现耳聋与线粒体DNA(Mitochondria DNA, mtDNA)突变存在相关性。在世界上发现了由母系遗传的线粒体基因功能缺陷造成耳聋的致病机理。这些基因缺陷包括12S rRNA A1555G、12S rRNA C1494T、tRNASer(UCN) T7505C、 tRNASer(UCN) G7444A、tRNASer(UCN) T7511C、tRNAHisT12201C、tRNAThr G15927A等突变，诠释了母系遗传性耳聋的发病机制，为耳聋的早期诊断、干预和防治提供了新的理论依据。
自发现与mtDNA突变相关的疾病以来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。近年来，国内相继报道了检测线粒体突变相关的技术，以满足对线粒体突变进行广泛筛查的需要，如戴朴等人研发的《母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法及其试剂盒》（公开号：CN1490415），《用于检测母系遗传线粒体耳聋基因A1555G突变的探针及其用途》（公开号：CN1987462），《用于检测母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变的Taqman MGB探针及其用途》（公开号：CN1987463）。这些检测方法虽然在一定程度上降低了成本，但操作步骤还不够简便，不能同时检测出mtDNA A1555G和C1494T突变；从某种程度上来说，检测费用还是偏高，这对许多家庭济困难的人来说仍是一笔不小的开支。博奥生物自主创新研发的晶芯?遗传性耳聋基因诊断芯片试剂盒能快速、高通量筛查已知遗传性耳聋基因突变位点而25 专门设计的，采用了基因芯片的原理，同时检测4个耳聋相关基因（GJB2, GJB3, SLC26A4和12S rRNA）的9个突变热点。但基因芯片检测涉及特殊仪器及大批数据处理分析对实验室设备、环境和操作人员要求较高，且费用昂贵，难以在一般医院或实验室推广使用。传统上，获得耳聋患者基因组DNA的方法是从血液中提取，每人大约需要3～5ml。这种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时存在一定的风险和麻烦。因此，迫切需要一种对人体无伤害、无痛苦的获取耳聋患者基因组DNA的方法以及一种快速、简便、准确、经济的药物性耳聋相关基因突变检测方法，以满足对mtDNA突变进行广泛筛查的需要。
发明内容
本发明的目的是针对目前检测tRNAHisT12201C突变的方法所存在的缺点，提供一种快速、简便、准确、经济的检测耳聋相关的线粒体DNA T12201C突变的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T12201C片段的PCR混合液、针对T12201C设计的一对外引物、针对T12201C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照和盒体组成。其中，DNA提取混合液主要由细胞裂解液、细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T12201C片段的PCR混合液试剂包括dNTP(脱氧单核苷酸)、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，针对T12201C设计的外引物包括外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO:2)；针对T12201C设计的内引物包括内前向引物F: AATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACGACCCAATA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: ATAGTAGTGTGCATGGTTATTAC (SEQ ID NO:4)；限制性内切酶包括限制性内切酶SspⅠ；阳性对照是不含有线粒体序列第12201位点发生T>C突变的酶切样本；阴性对照是含有线粒体序列第12201位点发生T>C突变的酶切样本。
在上述试剂盒中，在扩增T12201C的PCR混合液中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜（0.1-0.2μl为宜）。
本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测与耳聋相关的线粒体基因ND1T12201C突变中的应用。通过以下步骤实现：
（1）基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA；
（2）特异性PCR扩增：使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件根据SEQ ID NO:5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F外/R外、F内/R内是能扩增出包含上述耳聋的线粒体突变位点的片段，F外/R外扩增出为线粒体DNA的核苷酸11929-12793，其序列为序列表中的SEQ ID NO:1、2；F内/R内扩增出为线粒体DNA的核苷酸12141-12356，其序列为序列表中的SEQ ID NO:3、4
（3）酶切鉴定：将上述PCR产物用限制性内切酶SspⅠ对T12201C突变位点处进行酶切；
（4）突变检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T12201C突变。
在上述检测mtDNA T12201C突变的方法中，可从血标本（如一滴血）、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA，根据取样方式或被测样本形式不同，对不同样本进行相应的预处理，处理方法如下：
（1）血标本（如一滴血）：取20～200μl少量血标本（如一滴血）或1cm2的血滤纸片放入1.5ml EP管（离心管），加入900μl红细胞裂解缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，pH 7.6）(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)室温静置10min，充分裂解红细胞，12000rpm离心1min，收集白细胞沉淀；
（2）带毛囊的毛发：用70%乙醇洗带毛囊的毛发1 次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1.5ml EP管中分别放入2～4 根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分；
（3）口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必须让被收集者漱口。以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质。半小时内不要喝水、进食、吸烟，然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液，可视条件选择如下方法收集唾液样本：①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0.1ml唾液直接吐进EP管内；②生理盐水漱口，吐进EP管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次；③用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入EP管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约1cm2碎纸片置于EP管中。
然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，利用盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水溶解后于-20℃保存备用。
在本发明的实施方案中，引物设计的指导思想是，针对mtDNA T12201C位点存在的位置相邻近，扩增在一条片段上，故应设计3'末端与12201位点野生型T和12201位点突变型C相对应的上游引物；针对 12201位点设计3'末端分别与12201位点野生型T和12201位点突变型C相对应的下游引物（参照图2）。
本发明人针对特异性PCR扩增后(图3)，mtDNA T12201C位点形成了酶切位点的消失。酶切位点是由mtDNA T12201C突变导致消失的，其中的限制性内切酶为SspⅠ，其位点处为序列表中的SEQ ID NO:3、4。
用以上设计的引物，以相应的被检测样本的DNA为模板，通过PCR扩增后分别获得明亮清晰的大小约216bp的恒定扩增带，12201突变位点对应于扩增片段的第60位。
在上述检测线粒体基因耳聋突变的方法中，结合特异性PCR技术和酶切技术，每份DNA样本分别用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行普通PCR扩增，然后进行突变位点处的酶切，通过一次PCR便可在几小时内检出耳聋相关的mtDNA T12201C突变。
理论上，基因组DNA样本经一次PCR反应，即体系中仅加入针对突变型位点T12201C引物F/R后，加入针对突变位点新形成的限制性内切酶SspⅠ进行酶切，就可进行检测。也就是说，同一基因组DNA样本经一次PCR-酶切，从而使检测结果更为准确、可信。
本发明人还根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成（委托生物公司）获得引物，并将引物按一定的比例混合，与提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书组合起来，制成了用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因mtDNA T12201C突变的试剂盒，使得样本DNA提取、特异性PCR扩增和酶切可以在试剂盒提供的试剂基础上顺利完成。其中，提取样本DNA的试剂主要由细胞裂解液和溶液Ⅰ（主要成分是蛋白酶K）组成；PCR扩增反应试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，限制性内切酶包括限制性内切酶SspⅠ。
用本发明的方法及其制备的体外检测耳聋相关的线粒体基因mtDNA T12201C突变试剂盒具有以下特点：
1. 传统上获得耳聋患者基因组DNA的方法是从血液中提取，每人大约需要3～5ml。这种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时存在一定的风险和麻烦。本发明运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本（如一滴血）、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等样本中快速提取基因组DNA。该方法不仅解决了传统上从耳聋患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦；而且还解决了跨地区传递样本的问题，血滤纸片、毛发以及口腔粘膜刮片（棉拭子）或唾液斑滤纸片等可以很容易的放在信封内，并可通过邮寄的方式跨地区传递。
2. 目前国内外有几种线粒体相关的母系遗传性疾病基因诊断方法，如直接测序法荧光定量PCR检测方法、基因芯片检测方法等，由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较， PCR-酶切技术则结合了特异性PCR技术及酶切技术两者的优点，每份DNA样本用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行特异性PCR扩增，通过一次PCR-酶切便可在几小时内同时检出mtDNA T12201C突变。另外值得一提的是，本方法所用的引物均经过仔细设计。首先，正常和突变等位基因间不同的碱基在酶切过程中对特异性限制性内切酶形成的位点不同，因而大大提高了酶切的特异性；另外由正常对照和空白对照的产物可作为整个PCR反应的分子内控指标，从而避免假阴性结果的出现，提高检测结果的稳定性。通过调整不同引物的浓度和比例以及对PCR反应条件进行优化，以确保结果的特异性和稳定性。
3. 应用本发明提供的试剂盒进行mtDNA T12201C突变检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；对实验设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行耳聋相关的mtDNA T12201C突变的大规模筛查和预防性检查。
附图说明
图1是本发明一种试剂盒的结构示意图。
图2是本发明的特异性巢式PCR引物示意图。
图3是本发明的特异性巢式PCR扩增方案示意图。
图4是携带T12201C突变耳聋家系系谱图。
图5是基因特异性巢式PCR扩增鉴定mtDNA T12201C的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
符号说明：
图2和3中：F外为特异性巢式PCR第一次扩增的正向引物；R外为特异性巢式PCR第一次扩增的反向引物，与F外配对使用；F内为特异性巢式PCR第二次扩增的正向引物，R内为特异性巢式PCR第二次扩增的反向引物，与F内配对使用；T12201C表示为线粒体DNA第12201位，野生型为T，发生基因突变后为C。
图4中：□ 为正常男性个体；○为正常女性个体；■为发病男性个体；●为发病女性个体；◥为先证者；/ 为已死亡的个体；Ⅰ为该家系的第一代成员；Ⅱ为该家系的第二代成员；Ⅲ为该家系的第三代成员；Ⅳ为该家系的第四代成员；Ⅴ为该家系的第五代成员。
图5中： D1是先证者未酶切的PCR产物；D2是阳性对照者；D3是先证者的大女儿（Ⅳ-29）；D4是先证者的小女儿（Ⅳ-31）；D5表示先证者携带T12201C突变位点检测的PCR扩增产物酶切鉴定的电泳图；D6为携带T12201C突变的先证者的弟弟（Ⅲ-13）；D7为先证者的姐姐（Ⅲ-6）；D8是mark对照条带。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1 本发明一种试剂盒
参见图1，本发明提供的试剂盒，由DNA提取混合液1、扩增T12201C片段的PCR混合液2、针对T12201C设计的一对外引物3、针对T12201C设计的内引物4、限制性内切酶5、阳性对照6、阴性对照7和盒体8组成，其中，DNA提取混合液1主要由细胞裂解液、蛋白酶K溶液、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T12201C片段的PCR混合液2包括dNTP(脱氧单核苷酸)、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，针对T12201C设计的外引物3有外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO:2)；针对T12201C设计的内引物4包括内前向引物F: AATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACGACCCAATA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: ATAGTAGTGTGCATGGTTATTAC (SEQ ID NO:4)；限制性内切酶5包括限制性内切酶SspⅠ；阳性对照6是不含有线粒体序列第12201位点发生T>C突变的酶切样本；阴性对照7是含有线粒体序列第12201位点发生T>C突变的酶切样本。
在上述试剂盒中，在扩增T12201C的PCR混合液2中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜（0.1-0.2μl为宜）。
实施例2 携带线粒体tRNAAlaT12201C突变的耳聋家系的检测
1. 检测样本
选择1个携带T12201C突变的耳聋家系。其家系图见图4。这个家系呈现典型的母系遗传，发病者均以耳聋为唯一的临床症状，但是家系中每个发病成员的血压升高程度不等。这个家系总人数为88人，其中母系成员数为35人，患耳聋者有17人。
2. 基因组DNA的提取
分别获取5名受检者的样本（包括采集Ⅲ-6、Ⅲ-9的毛细血管一滴静脉血滤纸片；Ⅲ-13为口腔粘膜刮片或唾液；Ⅳ-29、Ⅳ-31为带毛囊的头发），将血滤纸片用干净的剪刀剪成大小约1cm2的碎纸片放入1.5ml EP管（Eppendorf管），加入900μl红细胞裂解缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，pH 7.6）室温静置10min，充分裂解红细胞，12000rpm离心1min，收集白细胞沉淀；收集唾液样本：①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0.1ml唾液直接吐进EP管内；②生理盐水漱口，吐进EP管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次；③用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入EP管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约1cm2碎纸片置于EP管中；带毛囊的头发样本用70%乙醇洗带毛囊的毛发1 次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1.5ml EP管中分别放入2～4 根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分。然后加入600μl细胞裂解液，混匀后再加入溶液Ⅰ，使得蛋白酶K的工作浓度为20μg/ml。充分混匀后55℃消化裂解，接着以盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于-20℃保存备用。
3. 引物设计
使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件协助设计改良引物，根据已公开的人类线粒体基因剑桥参考序列（SEQ ID NO:5）进行设计，引物的设计方案（见图2）如下：
针对mtDNA 12201位点，保证引物设计的特异性，我们设计巢式PCR两对引物F外/R外，F内/R内；它们长度、退火温度相近便于实验条件稳定，以增强特异性。由此设计出的4263位点的巢式PCR引物包括外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO:2)；针对T12201C设计的内引物包括内前向引物F: AATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAG GCTTACGACCCAATA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: ATAGTAGTGTGCATGGTTATTAC (SEQ ID NO:4)
4.基因特异性巢式PCR扩增
根据上述设计的4条引物序列，通过人工合成（委托生物公司）获得2对引物，以上述提取的被检样本基因组DNA为模板，进行基因特异性巢式PCR扩增和7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳酶切鉴定（见图3）。
巢式PCR循环参数使用外引物为94℃预变性5min，接着94℃变性30s，58℃退火30s，72 ℃延伸30s，重复循环30次后，然后使用内引物94℃变性30s，55℃退火 30s，72 ℃延伸30s，重复循环30次后，最后于72 ℃再延伸5 min。PCR产物5～10 μl在7%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，经EB染色后在凝胶成像仪上观察并照相记录结果。
5. 结果
参见图5，当先证者和正常对照样本的基因组DNA分别经2对引物F外/R外，F内/R内巢式PCR酶切鉴定后，只产生一条216bp恒定扩增带，经限制性内切酶SspⅠ酶切鉴定后，产生的恒定扩增带被限制性内切酶切成两段（参见图5泳道B2），证明先证者样品未携带mtDNA T12201C突变；而经限制性内切酶酶切鉴定后，产生的恒定扩增带没有被限制性内切酶切成两段（参见图5泳道D5），证明该样品携带mtDNA T12201C突变。家系先证者（Ⅲ-14）的基因组DNA经2对引物F外/R外，F内/R内进行巢式PCR后，出现了1条216bp的恒定扩增带（参见图5泳道D1）；而经限制性内切酶酶切后，该条带没有酶切开，证明了该样品携带mtDNA T12201C突变。D3是先证者的大女儿（Ⅳ-29）；D4是先证者的小女儿（Ⅳ-31）；D5表示先证者携带T12201C突变位点检测的PCR扩增产物酶切鉴定的电泳图；D6为携带T12201C突变的先证者的弟弟（Ⅲ-13）；D7为先证者的姐姐（Ⅲ-6）；D8是mark对照条带。
6.基因特异性巢式PCR扩增检测方法可靠性的检验
经基因特异性巢式PCR扩增酶切鉴定后，我们在家系母系成员中检测出携带T12201C突变阳性个体。进一步将这些标本的PCR扩增产物进行测序分析，测序结果与基因特异性巢式PCR扩增结果相吻合，说明使用本发明方法检测线粒体基因T12201C突变的可靠性和稳定性。
基因特异性巢式PCR技术与荧光定量PCR技术、测序及基因芯片技术相比具有如下优点（见表2）。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。
<110> 浙江大学
<120> 检测耳聋相关的线粒体T12201C突变试剂盒及应用
<160> 5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 2
AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 3
AATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAG GCTTACGACCCAATA
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 4
ATAGTAGTGTGCATGGTTATTAC
<210> 5
<211> 16569
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<221> misc_feature
<222> (3107)..(3107)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt 60
cgtctggggg gtatgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc 120
gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatc ctattattta tcgcacctac gttcaatatt 180
acaggcgaac atacttacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata 240
acaattgaat gtctgcacag ccactttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca 300
aaccccccct cccccgcttc tggccacagc acttaaacac atctctgcca aaccccaaaa 360
acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac 420
ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat 480
ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata 540
ccccgaacca accaaacccc aaagacaccc cccacagttt atgtagctta cctcctcaaa 600
gcaatacact gaaaatgttt agacgggctc acatcacccc ataaacaaat aggtttggtc 660
ctagcctttc tattagctct tagtaagatt acacatgcaa gcatccccgt tccagtgagt 720
tcaccctcta aatcaccacg atcaaaagga acaagcatca agcacgcagc aatgcagctc 780
aaaacgctta gcctagccac acccccacgg gaaacagcag tgattaacct ttagcaataa 840
acgaaagttt aactaagcta tactaacccc agggttggtc aatttcgtgc cagccaccgc 900
ggtcacacga ttaacccaag tcaatagaag ccggcgtaaa gagtgtttta gatcaccccc 960
tccccaataa agctaaaact cacctgagtt gtaaaaaact ccagttgaca caaaatagac 1020
tacgaaagtg gctttaacat atctgaacac acaatagcta agacccaaac tgggattaga 1080
taccccacta tgcttagccc taaacctcaa cagttaaatc aacaaaactg ctcgccagaa 1140
cactacgagc cacagcttaa aactcaaagg acctggcggt gcttcatatc cctctagagg 1200
agcctgttct gtaatcgata aaccccgatc aacctcacca cctcttgctc agcctatata 1260
ccgccatctt cagcaaaccc tgatgaaggc tacaaagtaa gcgcaagtac ccacgtaaag 1320
acgttaggtc aaggtgtagc ccatgaggtg gcaagaaatg ggctacattt tctaccccag 1380
aaaactacga tagcccttat gaaacttaag ggtcgaaggt ggatttagca gtaaactaag 1440
agtagagtgc ttagttgaac agggccctga agcgcgtaca caccgcccgt caccctcctc 1500
aagtatactt caaaggacat ttaactaaaa cccctacgca tttatataga ggagacaagt 1560
cgtaacatgg taagtgtact ggaaagtgca cttggacgaa ccagagtgta gcttaacaca 1620
aagcacccaa cttacactta ggagatttca acttaacttg accgctctga gctaaaccta 1680
gccccaaacc cactccacct tactaccaga caaccttagc caaaccattt acccaaataa 1740
agtataggcg atagaaattg aaacctggcg caatagatat agtaccgcaa gggaaagatg 1800
aaaaattata accaagcata atatagcaag gactaacccc tataccttct gcataatgaa 1860
ttaactagaa ataactttgc aaggagagcc aaagctaaga cccccgaaac cagacgagct 1920
acctaagaac agctaaaaga gcacacccgt ctatgtagca aaatagtggg aagatttata 1980
ggtagaggcg acaaacctac cgagcctggt gatagctggt tgtccaagat agaatcttag 2040
ttcaacttta aatttgccca cagaaccctc taaatcccct tgtaaattta actgttagtc 2100
caaagaggaa cagctctttg gacactagga aaaaaccttg tagagagagt aaaaaattta 2160
acacccatag taggcctaaa agcagccacc aattaagaaa gcgttcaagc tcaacaccca 2220
ctacctaaaa aatcccaaac atataactga actcctcaca cccaattgga ccaatctatc 2280
accctataga agaactaatg ttagtataag taacatgaaa acattctcct ccgcataagc 2340
ctgcgtcaga ttaaaacact gaactgacaa ttaacagccc aatatctaca atcaaccaac 2400
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aaagtaaaag gaactcggca aatcttaccc cgcctgttta ccaaaaacat cacctctagc 2520
atcaccagta ttagaggcac cgcctgccca gtgacacatg tttaacggcc gcggtaccct 2580
aaccgtgcaa aggtagcata atcacttgtt ccttaaatag ggacctgtat gaatggctcc 2640
acgagggttc agctgtctct tacttttaac cagtgaaatt gacctgcccg tgaagaggcg 2700
ggcataacac agcaagacga gaagacccta tggagcttta atttattaat gcaaacagta 2760
cctaacaaac ccacaggtcc taaactacca aacctgcatt aaaaatttcg gttggggcga 2820
cctcggagca gaacccaacc tccgagcagt acatgctaag acttcaccag tcaaagcgaa2880
ctactatact caattgatcc aataacttga ccaacggaac aagttaccct agggataaca 2940
gcgcaatcct attctagagt ccatatcaac aatagggttt acgacctcga tgttggatca 3000
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ctcaccatcg ctcttctact atgaaccccc ctccccatac ccaaccccct ggtcaacctc 3600
aacctaggcc tcctatttat tctagccacc tctagcctag ccgtttactc aatcctctga 3660
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cccttcgccc tattcttcat agccgaatac acaaacatta ttataataaa caccctcacc 4020
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cgattccgct acgaccaact catacacctc ctatgaaaaa acttcctacc actcacccta 4200
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taagccttct cctcactctc tcaatcttat ccatcatagc aggcagttga ggtggattaa 4980
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aagacattgg aacactatac ctattattcg gcgcatgagc tggagtccta ggcacagctc 6000
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cgtttccccg cataaacaac ataagcttct gactcttacc tccctctctc ctactcctgc 6240
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tgactggcat tgtattagca aactcatcac tagacatcgt actacacgac acgtactacg 7020
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gagaagcctt cgcttcgaag cgaaaagtcc taatagtaga agaaccctcc ataaacctgg 7380
agtgactata tggatgcccc ccaccctacc acacattcga agaacccgta tacataaaat 7440
ctagacaaaa aaggaaggaa tcgaaccccc caaagctggt ttcaagccaa ccccatggcc 7500
tccatgactt tttcaaaaag gtattagaaa aaccatttca taactttgtc aaagttaaat 7560
tataggctaa atcctatata tcttaatggc acatgcagcg caagtaggtc tacaagacgc 7620
tacttcccct atcatagaag agcttatcac ctttcatgat cacgccctca taatcatttt 7680
ccttatctgc ttcctagtcc tgtatgccct tttcctaaca ctcacaacaa aactaactaa 7740
tactaacatc tcagacgctc aggaaataga aaccgtctga actatcctgc ccgccatcat 7800
cctagtcctc atcgccctcc catccctacg catcctttac ataacagacg aggtcaacga 7860
tccctccctt accatcaaat caattggcca ccaatggtac tgaacctacg agtacaccga 7920
ctacggcgga ctaatcttca actcctacat acttccccca ttattcctag aaccaggcga 7980
cctgcgactc cttgacgttg acaatcgagt agtactcccg attgaagccc ccattcgtat 8040
aataattaca tcacaagacg tcttgcactc atgagctgtc cccacattag gcttaaaaac 8100
agatgcaatt cccggacgtc taaaccaaac cactttcacc gctacacgac cgggggtata 8160
ctacggtcaa tgctctgaaa tctgtggagc aaaccacagt ttcatgccca tcgtcctaga 8220
attaattccc ctaaaaatct ttgaaatagg gcccgtattt accctatagc accccctcta 8280
ccccctctag agcccactgt aaagctaact tagcattaac cttttaagtt aaagattaag 8340
agaaccaaca cctctttaca gtgaaatgcc ccaactaaat actaccgtat ggcccaccat 8400
aattaccccc atactcctta cactattcct catcacccaa ctaaaaatat taaacacaaa 8460
ctaccaccta cctccctcac caaagcccat aaaaataaaa aattataaca aaccctgaga 8520
accaaaatga acgaaaatct gttcgcttca ttcattgccc ccacaatcct aggcctaccc 8580
gccgcagtac tgatcattct atttccccct ctattgatcc ccacctccaa atatctcatc 8640
aacaaccgac taatcaccac ccaacaatga ctaatcaaac taacctcaaa acaaatgata 8700
accatacaca acactaaagg acgaacctga tctcttatac tagtatcctt aatcattttt 8760
attgccacaa ctaacctcct cggactcctg cctcactcat ttacaccaac cacccaacta 8820
tctataaacc tagccatggc catcccctta tgagcgggca cagtgattat aggctttcgc 8880
tctaagatta aaaatgccct agcccacttc ttaccacaag gcacacctac accccttatc 8940
cccatactag ttattatcga aaccatcagc ctactcattc aaccaatagc cctggccgta 9000
cgcctaaccg ctaacattac tgcaggccac ctactcatgc acctaattgg aagcgccacc 9060
ctagcaatat caaccattaa ccttccctct acacttatca tcttcacaat tctaattcta 9120
ctgactatcc tagaaatcgc tgtcgcctta atccaagcct acgttttcac acttctagta 9180
agcctctacc tgcacgacaa cacataatga cccaccaatc acatgcctat catatagtaa 9240
aacccagccc atgaccccta acaggggccc tctcagccct cctaatgacc tccggcctag9300
ccatgtgatt tcacttccac tccataacgc tcctcatact aggcctacta accaacacac 9360
taaccatata ccaatgatgg cgcgatgtaa cacgagaaag cacataccaa ggccaccaca 9420
caccacctgt ccaaaaaggc cttcgatacg ggataatcct atttattacc tcagaagttt 9480
ttttcttcgc aggatttttc tgagcctttt accactccag cctagcccct accccccaat 9540
taggagggca ctggccccca acaggcatca ccccgctaaa tcccctagaa gtcccactcc 9600
taaacacatc cgtattactc gcatcaggag tatcaatcac ctgagctcac catagtctaa 9660
tagaaaacaa ccgaaaccaa ataattcaag cactgcttat tacaatttta ctgggtctct 9720
attttaccct cctacaagcc tcagagtact tcgagtctcc cttcaccatt tccgacggca 9780
tctacggctc aacatttttt gtagccacag gcttccacgg acttcacgtc attattggct 9840
caactttcct cactatctgc ttcatccgcc aactaatatt tcactttaca tccaaacatc 9900
actttggctt cgaagccgcc gcctgatact ggcattttgt agatgtggtt tgactatttc 9960
tgtatgtctc catctattga tgagggtctt actcttttag tataaatagt accgttaact 10020
tccaattaac tagttttgac aacattcaaa aaagagtaat aaacttcgcc ttaattttaa 10080
taatcaacac cctcctagcc ttactactaa taattattac attttgacta ccacaactca 10140
acggctacat agaaaaatcc accccttacg agtgcggctt cgaccctata tcccccgccc10200
gcgtcccttt ctccataaaa ttcttcttag tagctattac cttcttatta tttgatctag 10260
aaattgccct ccttttaccc ctaccatgag ccctacaaac aactaacctg ccactaatag 10320
ttatgtcatc cctcttatta atcatcatcc tagccctaag tctggcctat gagtgactac 10380
aaaaaggatt agactgaacc gaattggtat atagtttaaa caaaacgaat gatttcgact 10440
cattaaatta tgataatcat atttaccaaa tgcccctcat ttacataaat attatactag 10500
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tatgcctaga aggaataata ctatcgctgt tcattatagc tactctcata accctcaaca 10620
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cagcggtggg cctagcccta ctagtctcaa tctccaacac atatggccta gactacgtac 10740
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gacatgactt tccaaaaaac acataatttg aatcaacaca accacccaca gcctaattat10860
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aaccttttcc tccgaccccc taacaacccc cctcctaata ctaactacct gactcctacc 10980
cctcacaatc atggcaagcc aacgccactt atccagtgaa ccactatcac gaaaaaaact11040
ctacctctct atactaatct ccctacaaat ctccttaatt ataacattca cagccacaga 11100
actaatcata ttttatatct tcttcgaaac cacacttatc cccaccttgg ctatcatcac 11160
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atgactccct aaagcccatg tcgaagcccc catcgctggg tcaatagtac ttgccgcagt 11460
actcttaaaa ctaggcggct atggtataat acgcctcaca ctcattctca accccctgac 11520
aaaacacata gcctacccct tccttgtact atccctatga ggcataatta taacaagctc 11580
catctgccta cgacaaacag acctaaaatc gctcattgca tactcttcaa tcagccacat 11640
agccctcgta gtaacagcca ttctcatcca aaccccctga agcttcaccg gcgcagtcat 11700
tctcataatc gcccacgggc ttacatcctc attactattc tgcctagcaa actcaaacta 11760
cgaacgcact cacagtcgca tcataatcct ctctcaagga cttcaaactc tactcccact 11820
aatagctttt tgatgacttc tagcaagcct cgctaacctc gccttacccc ccactattaa 11880
cctactggga gaactctctg tgctagtaac cacgttctcc tgatcaaata tcactctcct 11940
acttacagga ctcaacatac tagtcacagc cctatactcc ctctacatat ttaccacaac 12000
acaatggggc tcactcaccc accacattaa caacataaaa ccctcattca cacgagaaaa 12060
caccctcatg ttcatacacc tatcccccat tctcctccta tccctcaacc ccgacatcat 12120
taccgggttt tcctcttgta aatatagttt aaccaaaaca tcagattgtg aatctgacaa 12180
cagaggctta cgacccctta tttaccgaga aagctcacaa gaactgctaa ctcatgcccc 12240
catgtctaac aacatggctt tctcaacttt taaaggataa cagctatcca ttggtcttag 12300
gccccaaaaa ttttggtgca actccaaata aaagtaataa ccatgcacac tactataacc 12360
accctaaccc tgacttccct aattcccccc atccttacca ccctcgttaa ccctaacaaa 12420
aaaaactcat acccccatta tgtaaaatcc attgtcgcat ccacctttat tatcagtctc 12480
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gccacaaccc aaacaaccca gctctcccta agcttcaaac tagactactt ctccataata 12600
ttcatccctg tagcattgtt cgttacatgg tccatcatag aattctcact gtgatatata 12660
aactcagacc caaacattaa tcagttcttc aaatatctac tcatcttcct aattaccata 12720
ctaatcttag ttaccgctaa caacctattc caactgttca tcggctgaga gggcgtagga 12780
attatatcct tcttgctcat cagttgatga tacgcccgag cagatgccaa cacagcagcc 12840
attcaagcaa tcctatacaa ccgtatcggc gatatcggtt tcatcctcgc cttagcatga 12900
tttatcctac actccaactc atgagaccca caacaaatag cccttctaaa cgctaatcca 12960
agcctcaccc cactactagg cctcctccta gcagcagcag gcaaatcagc ccaattaggt 13020
ctccacccct gactcccctc agccatagaa ggccccaccc cagtctcagc cctactccac 13080
tcaagcacta tagttgtagc aggaatcttc ttactcatcc gcttccaccc cctagcagaa 13140
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gcagtctgcg cccttacaca aaatgacatc aaaaaaatcg tagccttctc cacttcaagt 13260
caactaggac tcataatagt tacaatcggc atcaaccaac cacacctagc attcctgcac 13320
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aaccttaaca atgaacaaga tattcgaaaa ataggaggac tactcaaaac catacctctc 13440
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ttctactcca aagaccacat catcgaaacc gcaaacatat catacacaaa cgcctgagcc 13560
ctatctatta ctctcatcgc tacctccctg acaagcgcct atagcactcg aataattctt 13620
ctcaccctaa caggtcaacc tcgcttcccc acccttacta acattaacga aaataacccc 13680
accctactaa accccattaa acgcctggca gccggaagcc tattcgcagg atttctcatt 13740
actaacaaca tttcccccgc atcccccttc caaacaacaa tccccctcta cctaaaactc 13800
acagccctcg ctgtcacttt cctaggactt ctaacagccc tagacctcaa ctacctaacc 13860
aacaaactta aaataaaatc cccactatgc acattttatt tctccaacat actcggattc 13920
taccctagca tcacacaccg cacaatcccc tatctaggcc ttcttacgag ccaaaacctg 13980
cccctactcc tcctagacct aacctgacta gaaaagctat tacctaaaac aatttcacag 14040
caccaaatct ccacctccat catcacctca acccaaaaag gcataattaa actttacttc 14100
ctctctttct tcttcccact catcctaacc ctactcctaa tcacataacc tattcccccg 14160
agcaatctca attacaatat atacaccaac aaacaatgtt caaccagtaa ctactactaa 14220
tcaacgccca taatcataca aagcccccgc accaatagga tcctcccgaa tcaaccctga 14280
cccctctcct tcataaatta ttcagcttcc tacactatta aagtttacca caaccaccac 14340
cccatcatac tctttcaccc acagcaccaa tcctacctcc atcgctaacc ccactaaaac 14400
actcaccaag acctcaaccc ctgaccccca tgcctcagga tactcctcaa tagccatcgc 14460
tgtagtatat ccaaagacaa ccatcattcc ccctaaataa attaaaaaaa ctattaaacc 14520
catataacct cccccaaaat tcagaataat aacacacccg accacaccgc taacaatcaa 14580
tactaaaccc ccataaatag gagaaggctt agaagaaaac cccacaaacc ccattactaa 14640
acccacactc aacagaaaca aagcatacat cattattctc gcacggacta caaccacgac 14700
caatgatatg aaaaaccatc gttgtatttc aactacaaga acaccaatga ccccaatacg 14760
caaaactaac cccctaataa aattaattaa ccactcattc atcgacctcc ccaccccatc 14820
caacatctcc gcatgatgaa acttcggctc actccttggc gcctgcctga tcctccaaat 14880
caccacagga ctattcctag ccatgcacta ctcaccagac gcctcaaccg ccttttcatc 14940
aatcgcccac atcactcgag acgtaaatta tggctgaatc atccgctacc ttcacgccaa 15000
tggcgcctca atattcttta tctgcctctt cctacacatc gggcgaggcc tatattacgg 15060
atcatttctc tactcagaaa cctgaaacat cggcattatc ctcctgcttg caactatagc 15120
aacagccttc ataggctatg tcctcccgtg aggccaaata tcattctgag gggccacagt 15180
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tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct 16440
actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat 16500
ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac 16560
atcacgatg 16569
Claims (2)
1.一种检测耳聋相关的线粒体DNA T12201C突变的试剂盒，由DNA提取混合液（1）、扩增T12201C片段的PCR混合液（2）、针对T12201C设计的一对外引物（3）、针对T12201C设计的内引物（4）、限制性内切酶（5）、阳性对照（6）、阴性对照（7）和盒体（8）组成，其中，DNA提取混合液（1）由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T12201C片段的PCR混合液（2）包括dNTP(脱氧单核苷酸)、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，其特征在于，针对T12201C设计的外引物（3）有外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO:2)；针对T12201C设计的内引物（4）包括内前向引物F: AATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACGACCCAATA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: ATAGTAGTGTGCATGGTTATTAC (SEQ ID NO:4)；限制性内切酶（5）包括限制性内切酶SspⅠ；阳性对照（6）是不含有线粒体序列第12201位点发生T>C突变的酶切样本；阴性对照（7）是含有线粒体序列第12201位点发生T>C突变的酶切样本。
2.根据权利要求1所述的一种检测耳聋相关的线粒体DNA T12201C突变的试剂盒，其特征在于，在扩增T12201C片段的PCR混合液（2）中添加0.1-0.2μl二甲基亚砜。
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