CN112852948B

CN112852948B - 一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法及试剂盒

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Publication number: CN112852948B
Application number: CN202110184640.2A
Authority: CN
Inventors: 何震宇; 刘妍柳; 陈晓琪; 杨泽民; 戴碧璇; 徐嘉琪; 梁爽
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112852948A

Abstract

本发明属于基因分子检测的技术领域，具体涉及一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法及试剂盒。所述试剂盒包括巢式PCR反应体系和酶切体系；所述酶切体系包括限制性核酸内切酶BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I。所述方法包括：1）收集被检细胞；2）目的片段的巢式PCR扩增；3）PCR产物酶切：采用包括酶切用酶‑限制性核酸内切酶BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I进行酶切反应；4）酶切产物电泳分型。本发明采用种限制性核酸内切酶BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I针对同一PCR产物可以一次性鉴定出2个多态位点，效率高、成本低，并且能够通过电泳图谱判断基因型，快速且直观，检测效率高、检测精准。

Description

一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于基因分子检测的技术领域，具体涉及一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法及试剂盒。

背景技术

耳聋是最常见的疾病之一，据统计，全国残疾人群由8296万，其中听力残疾人群由2789万，居各类残疾之首，其发病率高、听力损失不可逆、治疗方法稀少且困难、人工耳蜗植入价格昂贵、由聋致哑，这些问题严重困扰着人们的日常生活。

其中50％以上的耳聋是由遗传因素引起的，耳聋基因在正常人群中有较高的携带率，正常听力夫妇携带至少一种突变已知耳聋基因的几率为大约6.3％，正常育龄夫妇应接受常见耳聋基因筛查及产前筛查。

有关数据表明，我国每年新增6万听力障碍儿童中由30～40％的耳聋患者是由耳毒性药物致聋的，药物性耳聋也是最有可能避免的一种听力残疾，为了预防药物性耳聋的发生，国家颁布了《常用耳毒性药物使用规范》，用药前明确地知道个体是否携带药物性耳聋基因，严格避免接触耳毒性药物成分为了预防药物性耳聋至关重要的环节。

线粒体12S rRNA基因又称“药物耳聋易感”基因、“一针致聋”基因。即携带突变的个体在使用常规剂量甚至少量的氨基糖苷类抗生素就会引起听力损失，导致临床上常见的“一针致聋”的现象。

线粒体DNA 1494C＞T和1555A＞G突变是工人的药物性耳聋相关的致病性突变，研究表明，线粒体DNA 1555A＞G突变使得线粒体12S rRNA高度保守编码区域的机构发生改变，使得它与氨基糖苷类抗生素结合能力增强，进而使得线粒体蛋白合成减少，最终导致耳聋的发生。

当发生1494C＞T突变时，线粒体DNA 12S rRNA的A区能形成新的1494U-A1555配对，导致12S rRNA与氨基糖苷类药物结合部位的空间增大，从而促进了氨基糖苷类抗生素与之结合，影响了线粒体核糖体蛋白质的合成和氧化磷酸化过程，最终因ATP合成受阻使得Na⁺、K^-、Ca²⁺等离子泵失能而导致毛细胞死亡，引起永久性耳聋。

目前，氨基糖苷类药物是临床运用广泛的抗生素，常用于治疗各种敏感菌感染导致的泌尿系统感染、胃肠道感染等情况，主要通过抑制细菌蛋白质的合成来发挥抗菌作用，其常见包括有链霉菌产生的链霉素，小单孢菌产生的庆大霉素，以及阿米卡星灯半合成氨基糖苷类等。如今，临床对抗生素运用广泛甚至可能存在滥用现象，而药源性耳聋目前尚无理想的治疗方法，由此可见在临床上开展早期筛查和预防具有重大意义。通过致聋基因诊断技术的检测，对这两个突变的携带者进行产前诊断、遗传咨询、个体化合理用药指导，从而达到对药物性耳聋的防控目的。

目前，通过检测线粒体12S rRNA的1494C>T和1555A>G位点基因型的方法来判断受试者是否携带药物性耳聋基因，从而进行致聋和生育风险评估，现阶段常用的检测方法有直接测序法、荧光定量PCR、基因芯片、PCR-RFLP法等。直接测序法的优点是准确性高，但检测周期较长，且需要专业的测序仪和结果判读人员，不适合临床推广应用；基因芯片法具有高通量的优点，但存在检测成本高、操作繁琐、易出现假阳性、假阴性等缺点；荧光定量PCR探针昂贵，成本较高；PCR-RFLP法操作简单，对仪器设备要求低，便于应用，但是，对1494C>T和1555A>G两个位点需要分别以提纯的线粒体DNA或基因组DNA为模板进行PCR，再各自用不同的内切酶进行酶切分型，即HphI检测1494C>T位点，Alw26I检测1555A>G位点，这两种酶属于稀有酶，价格较贵。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法及试剂盒，采用限制性核酸内切酶BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I实现对药物性耳聋相关基因位点的同时分型，操作简便，效率高、成本低。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种检测药物性耳聋相关基因位点的试剂盒，所述试剂盒包括巢式PCR反应体系和酶切体系；

所述PCR反应体系包括引物对、PCR用酶、被检细胞(人口腔上皮细胞)以及PCR使用试剂；

所述引物对包括外引物对MIT430WF、MIT430WR，以及内引物对MIT152NF、MIT152NR，所述MIT430WF、MIT430WR、MIT152NF和MIT152NR的核酸序列如序列表SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.4所示；

所述酶切体系包括限制性核酸内切酶BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I，以及buffer；

本发明还提供了一种限制性核酸内切酶BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I对检测药物性耳聋相关基因位点的应用。

本发明提供了一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法，所述方法包括：

1)收集被检细胞；

2)目的片段的巢式PCR扩增；

3)PCR产物酶切：采用限制性核酸内切酶BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I进行酶切反应；

4)酶切产物电泳分型。

步骤2)所述巢式PCR扩增包括第1轮反应和第2轮反应，第1轮反应的PCR反应体系包括dd H₂O、

PCR Super Mix(+dye)、被检细胞、引物对MIT430WF、MIT430WR；

第2轮反应的PCR反应体系包括dd H₂O、

PCR Super Mix、第1轮反应的PCR产物、引物对MIT152NF、MIT152NR；

步骤3)所述PCR产物酶切的酶切体系还包括PCR产物、10×FastDigest GreenBuffer和dd H₂O。

本发明的有益效果如下：

本发明的检测药物性耳聋相关基因位点的试剂盒，不需要昂贵设备或者试剂，操作简单，采用一种限制性核酸内切酶即BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I针对同一PCR产物可以一次性鉴定出2个多态位点，效率高、成本低，并且能够通过电泳图谱判断基因型，快速且直观，结果易保存；

本发明的检测药物性耳聋相关基因位点的方法，采用人口腔上皮细胞作为被检细胞即可，取样无创、方便，相比现有技术需要提取线粒体DNA或者人类基因组DNA的繁琐操作，本发明能够节省时间和经济成本，并且检测效率高、检测精准。

附图说明

图1为线粒体12S rRNA的部分基因序列；

图2为实施例2的PCR产物的电泳结果图；

图3为实施例2的酶切产物的电泳结果图；

图4为实施例2的PCR产物测序结果图；

图5为实施例3的PCR产物电泳结果图；

图6为实施例3的酶切产物电泳结果图；

图7为实施例3B组样品的PCR产物测序结果图；

图8为实施例3C组样品的PCR产物测序结果图；

图9为本发明对耳聋相关基因位点的检测方法流程图；

图10为现有技术对耳聋相关基因位点的检测方法流程图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例1

一种检测药物性耳聋相关基因位点的试剂盒

1)巢式PCR反应体系

第1轮反应的PCR反应体系的成分如表1所示：

表1第1轮PCR反应

第2轮反应的PCR反应体系的成分如表2所示：

表2第2轮PCR反应

2)酶切体系

10×FastDigest Green Buffer、第2轮PCR产物、FastDigest BshNI以及ddH₂O以及用量如下表所示：

表3酶切体系

所述FastDigest BshNI限制性核酸内切酶为Thermo Scientific^TM的快速限制性核酸内切酶BshNI，其它同裂酶BanI、AccB1I或BspT107I的使用以及效果相同，在此不作重复赘述。

所述限制性核酸内切酶BshNI进行基因位点识别的作用机理如下：

如图1所示为对于线粒体12S rRNA的一段基因序列，其中，第一个框中的Y为线粒体12S rRNA基因1494C＞T多态位点，框中序列在PCR产物中变成GGCACY，当Y＝C，即为野生型碱基时，GGCACC能被限制性核酸内切酶BshNI识别，当Y＝T，即为突变型碱基时，GGCACT不能被限制性核酸内切酶BshNI识别，故可用BshNI甄别该位点；

第二个框中的R为线粒体12s rRNA基因1555A>G多态位点，框中序列在PCR产物中变成GRCACC，当R＝A，即为野生型碱基时，GACACC不能被限制性核酸内切酶BshNI识别，当R＝G，即为突变型碱基时，GGCACC能被限制性核酸内切酶BshNI识别，故可用BshNI甄别该位点。

实施例2

一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法：

1)口腔上皮细胞样品采集及处理

准备消毒的医用棉签，受检者先用清水漱口，然后手持棉签，伸进口腔，在口腔内侧不断变换棉签头的位置、角度反复擦拭40下。用1000μL TE浸泡棉签头，捏住棉签杆不断涮洗以使细胞悬浮，4000r/min离心5分钟，弃去上清，残留的液体倒扣在纸巾上控干，得到细胞沉淀，用50μL TE重悬细胞；

2)目的片段的巢式PCR扩增

第1轮PCR反应体系(总体积：5μL)：

表4第1轮PCR反应体系

第2轮PCR反应体系(总体积：25μL)：

表5第2轮PCR反应体系

PCR产物电泳检测结果如图2所示，泳道1-7为7个不同样本的PCR产物，理论大小为152bp，目标条带符合预期。

3)PCR产物酶切

表6酶切体系(20μL)

酶切在37℃水浴1h。

4)酶切产物电泳分型

上述酶切产物使用3％的琼脂糖凝胶电泳进行基因分型。PCR产物大小为152bp，当用BshNI酶切PCR产物后，各种基因型的判断依据(条带)如下：

1494C/1555A＝95、57bp；

1494T/1555A＝152bp；

1494C/1555G＝65、57、30bp；

1494T/1555G＝122、30bp。

如图3所示，为7个不同样本的酶切产物电泳图，电泳图谱表明它们带型一致，为同一种基因型即野生型1494C/1555A，随机选择1个样品进行PCR产物测序，测序结果与PCR-RFLP法吻合，由图4可见，左边箭头所指为1494C，右边箭头所指为1555A。

实施例3

一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法：

人为构造1494T、1555G突变体进行分型

1)随机选择2个野生型样本即1494C/1555A基因型样本，以其口腔上皮细胞为模板；

2)目的片段的巢式PCR扩增

第1轮PCR反应体系(总体积：5μL)

表7第1轮PCR反应体系

以第1轮PCR产物为模板，使用3对不同的引物分别进行第2轮PCR扩增，如下。

第2轮PCR反应体系(总体积：25μL)

表8第2轮A组PCR反应体系

表9第2轮B组PCR反应体系

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表10第2轮C组PCR反应体系

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A组中引物对为实施例1中第2轮PCR使用的引物对MIT152NF、MIT152NR；

B组中引物对为设计的1494T突变的上游引物MITBS配合MIT152NR使用，所述引物MITBS的核酸序列如SEQ ID NO.5所示；

C组中引物对为设计的1555G突变的下游引物MITBX配合MIT152NF使用，所述引物MITBX的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

上述3组引物对扩增的PCR产物大小预期分别为152bp、150bp、152bp，由图5可见，琼脂糖凝胶电泳结果显示其与预期大小相符。

3)PCR产物酶切

表11酶切体系(20μL)

酶切在37℃水浴1h，接着通过电泳来判断基因型。

4)酶切产物电泳分型

当用BshNI酶完全酶切PCR产物后：

A组样品(野生型1494C/1555A)的预期条带为：95、57bp；

B组样品(模拟1494T/1555A)的预期条带为：150bp；

C组样品(模拟1494C/1555G)的预期条带为：65、57、30bp；

引物对MITBS、MIT152NR扩增野生型样本，获得的靶片段为150bp，用BshNI酶切时不会发生切割，相当于模拟1494T/1555A样本，即作为1494T的阳性对照。

引物对MIT152NF、MITBX扩增野生型样本，获得的靶片段为152bp，用BshNI酶切时将产生65、57、30bp的片段，相当于模拟1494C/1555G样本，即作为1555G的阳性对照。

如图6电泳图谱显示，结果完全符合预期。

由图7、图8可见，测序结果显示人工引入突变非常成功，同时也证明了本方法的准确性。

其中图7显示的B组样品(模拟1494T/1555A)的测序图，左边箭头所指是1494T，右边箭头所指是1555A。

图8显示的C组样品(模拟1494C/1555G)的测序图，左边箭头所指是1494C，右边箭头所指是1555G。

由上可见，本发明的检测药物性耳聋相关基因位点的方法流程如图9所示，通过采用一种限制性核酸内切酶BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I即可实现同一PCR产物可以一次性鉴定出2个多态位点，相比现有技术(如图10所示)，本发明的检测方法效率高、成本低，并且能够通过电泳图谱判断基因型，快速且直观。

序列表

<110> 广东药科大学

<120> 一种检测药物性耳聋相关基因位点的方法及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agaaatgggc tacattttct agcg 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

actatatcta ttgcgccagg tgt 23

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aacgatcaat taaaaaatat ctctaagacc caattaactt tgtacacacc gcccggcac 59

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cgacggccta cacttaccat gttacgaggt g 31

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cgatcaatta aaaaatatct ctaagaccca attaactttg tacacaccgc ccggcactc 59

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cgacggccta cacttaccat gttacgaggt gcc 33

Claims

1.一种检测药物性耳聋相关基因位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括巢式PCR反应体系和酶切体系；

所述酶切体系包括限制性核酸内切酶，所述限制性核酸内切酶为BshNI、BanI、AccB1I或BspT107I；

所述巢式PCR反应体系包括引物对；

所述引物对由外引物对MIT430WF、MIT430WR，以及内引物对MIT152NF、MIT152NR组成，MIT430WF、MIT430WR、MIT152NF和MIT152NR的核酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.4所示。