CN114457174B - 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒 - Google Patents

一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114457174B
CN114457174B CN202210107234.0A CN202210107234A CN114457174B CN 114457174 B CN114457174 B CN 114457174B CN 202210107234 A CN202210107234 A CN 202210107234A CN 114457174 B CN114457174 B CN 114457174B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer
probe
artificial sequence
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210107234.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114457174A (zh
Inventor
朱苗骏
符屺凡
谭若颖
王海龙
薛竞东
俞仲伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOVUE TECHNOLOGY Ltd
Original Assignee
BIOVUE TECHNOLOGY Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOVUE TECHNOLOGY Ltd filed Critical BIOVUE TECHNOLOGY Ltd
Priority to CN202210107234.0A priority Critical patent/CN114457174B/zh
Publication of CN114457174A publication Critical patent/CN114457174A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114457174B publication Critical patent/CN114457174B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种泌尿生殖道感染病原体多重检测试剂盒及其用途。具体地，本发明开发了一种用于检测12种临床常见尿道感染病菌的荧光定量PCR试剂盒。本发明提供的优化的引物和探针具有更优秀的的12组PCR引物和探针的组合具有优异的稳定性，并且在PCR反应过程中不会互相发生干扰，因此能够用于多重荧光定量PCR方法。

Description

一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域。具体地，本发明涉及一种检测尿道病原体感 染的多重荧光定量(探针法)PCR试剂盒及其应用。
背景技术
尿路感染(urinary tract infection，UTI)，简称尿感——又称泌尿系统感 染，是指病原体侵犯尿路黏膜或组织引起的尿路炎症，是常见疾病，一般人 群中患病率高达1％。多种病原体如细菌、真菌、支原体、衣原体、病毒、寄 生虫等均可引起尿感，通常伴随有菌尿和脓尿。按部位可分为上尿路感染(主 要肾盂肾炎，Pyelonephritis)和下尿路感染(主要是膀胱炎，Cystitis)。按是 否具有尿路异常分为非复杂性尿路感染和复杂性尿路感染。
在尿感的诊断中，确定病原体的种类十分重要，可以指导医生合理使用 抗生素治疗，避免无效治疗和减少抗生素的滥用。
目前，临床上常规检查法主要有镜检、培养、组织病理学诊断、影像学 检查以及血清学检查等。但是，这些方法都存在一定的缺陷和局限性：镜检 和培养是真菌常规检查的基本方法，但阳性率低，耗时长；组织病理学检查 为侵入性操作，不宜取材，病人也较痛苦，而且需要免疫组化方法来进一步 验证；影像学检查虽然较方便，但是缺乏特异性；血清学检查虽然快速简 便，但其敏感性、特异性以及假阳性在早期诊断、病情监测方面仍然有很大 缺陷，而且还无法鉴定感染病原体的种类。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应， 能够用于其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相似，但多重PCR反 应收到多个因素的影响，极易对结果造成干扰，例如反应体系不平衡，产物 扩增不平均，难以检测；引物特异性差，容易与其他非目的基因片段结合； 多组引物间最佳退火温度需要彼此接近；引物之间形成发卡结构干扰引物与 目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
用于多重泌尿道感染单体系检测多种病原体的引物组的现有技术存在下 述问题：(1)无法实现较多重反应，如一管只能检测两个目标病原体和一个 内标，只支持三重反应(CN111593144A)；(2)目标病原体的覆盖面较窄， 如仅支持检测支原体(CN110343777A)、仅支持检测生殖道相关病原体 (CN111647672A)等；(3)操作复杂，如需要配合毛细管电泳，所需步骤及 仪器较为繁杂(CN202110167340)。
因此，本领域迫切需要研究和开发一种步骤简单并能够准确、快速地定 量和定性检测尿道感染病原体的多重PCR检测试剂。
发明内容
本发明的目的就是提供步骤简单并能够准确、快速地定量和定性检测泌 尿生殖感染的病原菌多重PCR检测试剂。
本发明的另一目的是提供针对泌尿道病原体的高灵敏度、高特异性的检 测引物及探针。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测泌尿道病原体的试剂盒，所 述试剂盒包括第一容器，所述第一容器中包括：
(A1)针对奇异变形杆菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:16所示的上游 引物、如SEQ ID NO:17所示的下游引物、和SEQ ID NO:18所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的一种或多种针对病原 体的引物探针组合：
(A2)针对粪肠球菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:13所示的上游引 物、如SEQ IDNO:14所示的下游引物、和SEQ ID NO:15所示的探针，和
(A3)针对大肠埃希氏菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:19所示的上游 引物、如SEQ ID NO:20所示的下游引物、和SEQ ID NO:21所示的探针。
(A4)针对肺炎克雷伯杆菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:4所示的上 游引物、如SEQ ID NO:5所示的下游引物、和SEQ ID NO:6所示的探针，
(A5)针对铜绿假单胞菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:7所示的上游 引物、如SEQID NO:8所示的下游引物、和SEQ ID NO:9所示的探针，和
(A6)针对金黄色葡萄球菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:10所示的上 游引物、如SEQ ID NO:11所示的下游引物、和SEQ ID NO:12所示的探针；
(A7)针对鲍曼不动杆菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:22所示的上游 引物、如SEQ ID NO:23所示的下游引物、和SEQ ID NO:24所示的探针，
(A8)针对微小脲原体的引物探针组合：如SEQ ID NO:25所示的上游引 物、如SEQID NO:26所示的下游引物、和SEQ ID NO:27所示的探针，和
(A9)针对白色念珠菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:28所示的上游引 物、如SEQID NO:29所示的下游引物、和SEQ ID NO:30所示的探针；
(A10)针对生殖支原体的引物探针组合：如SEQ ID NO:31所示的上游 引物、如SEQID NO:32所示的下游引物、和SEQ ID NO:33所示的探针，
(A11)针对沙眼衣原体的引物探针组合：如SEQ ID NO:34所示的上游 引物、如SEQID NO:35所示的下游引物、和SEQ ID NO:36所示的探针，和
(A12)针对淋病奈瑟菌的引物探针组合：如SEQ ID NO:37所示的上游 引物、如SEQID NO:38所示的下游引物、和SEQ ID NO:39所示的探针。
在另一优选例中，所述的引物探针组合对样本中病原菌的检测灵敏度 为：可检出浓度≤10拷贝/μL(优选地≤1拷贝/μL)的病原菌。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自第二容器、第三容器和第四容 器中一个或多个的容器。
在另一优选例中，所述的第一容器至第四容器中分别含有所述的引物探 针组合(A1)～(A12)中的1、2或3种，且各容器之间针对病原体的引物探 针组合互不重复。
在另一优选例中，所述的第一容器中的3种引物探针组合选自下组：
(A1)、(A2)和(A3)，以及
(A1)、(A4)和(A11)；
所述的第二容器中的3种引物探针组合选自下组：
(A4)、(A5)和(A6)，以及
(A2)、(A6)和(A7)；
所述的第三容器中的3种引物探针组合选自下组：
(A7)、(A8)和(A9)，
(A3)、(A5)和(A9)，以及
(A5)、(A8)和(A9)；
所述的第四容器中的3种引物探针组合选自下组：
(A10)、(A11)和(A12)，
(A8)、(A10)和(A12)，以及
(A3)、(A10)和(A12)；
并且，各容器之间针对病原体的引物探针组合互不重复。
在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、第三容器和/或第四容器 中，还包括针对内标的引物探针组合。
在另一优选例中，所述的内标包括：人类β-actin、GAPDH、PARP2、 RNaseP。
在另一优选例中，所述针对内标的引物探针组合选自下组：
(A13)针对人类β-actin的引物探针组合：如SEQ ID NO:1所示的上游 引物、如SEQID NO:2所示的下游引物、和SEQ ID NO:3所示的探针；
(A14)针对人类GAPDH的引物探针组合：如SEQ ID NO:58所示的上 游引物、如SEQID NO:59所示的下游引物、和SEQ ID NO:60所示的探针； 和
(A15)针对人类PARP2的引物探针组合：如SEQ ID NO:61所示的上游 引物、如SEQID NO:62所示的下游引物、和SEQ ID NO:63所示的探针。
在另一优选例中，所述的各容器中针对内标的引物探针组合是相同的， 或是不同的。
在另一优选例中，所述的第一容器中的引物探针组合为：(A1)、(A2)、 (A3)和(A13)；
所述的第二容器中的引物探针组合为：(A4)、(A5)、(A6)和(A13)；
所述的第三容器中的引物探针组合为：(A7)、(A8)、(A9)和(A13)；
所述的第四容器中的引物探针组合为：(A10)、(A11)、(A12)和(A13)。
在另一优选例中，所述探针上的一端标记有荧光发生基团，另一端标记 有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，设立荧光通道F1、F2、F3、F4，荧光通道F1-F4分别 对应不同的荧光发生基团，同一容器中不同探针互不重复地具有F1、F2、F3 或F4对应的荧光发生基团。
在另一优选例中，所述的各个容器中，针对内标的探针具有相同的荧光 发生基团。
在另一优选例中，所述探针的荧光发生基团为选自下组的任意4种： FAM、VIC、TEXAS RED、CY5、JOE、NED、TET、HEX、TAMARA、 ROX、CY3、CY5.5、和CY7。
在另一优选例中，所述的荧光淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、 MGB、BHQ3或TAMARA。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有
Figure BDA0003494353820000041
酶反应液、特异性样 品处理酶、阳性对照、和阴性对照。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测泌尿道病原体的方法，所述 方法包括：
(S1)获取待测样品；
(S2)使用如本发明第一方面所述的试剂盒，对所述样品进行荧光定量 PCR反应，从而检测所述泌尿道病原体。
在另一优选例中，所述的荧光定量PCR反应为多重荧光定量PCR反应， 优选地为四重荧光定量PCR反应。
在另一优选例中，在所述步骤(S2)中，在所述试剂盒的一、二、三或四个 容器中，同时进行荧光定量PCR反应。
在另一优选例中，在所述步骤(S2)中，多重荧光定量PCR反应中，每个引 物终浓度为0.3μM，每个探针终浓度为0.2μM。
在另一优选例中，在所述步骤(S2)中，多重荧光定量PCR反应的反应程序 为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环，60℃收集荧光信 号。
在另一优选例中，在所述步骤(S2)中，通过分辨所述反应产物的荧光标 记，确定其所述的荧光通道，并进一步确定其所对应的病原体。
在另一优选例中，在所述步骤(S2)之前，还包括步骤：对待测样本进行处 理，从而提取样本中的核酸模板。
在另一优选例中，在所述步骤(S2)之前，还包括步骤：提供泌尿道病原体 标准曲线。
在另一优选例中，在所述步骤(S2)之后，还包括步骤(S3)：检测反应的荧 光值，从而判断样本中是否存在泌尿道病原体和/或判断样品中泌尿道病原体 的拷贝数。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在样品检测的同时，之前或之 后，进行阳性对照实验和阴性对照实验。
在另一优选例中，所述的病原体包括肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、 微小脲原体、白色念珠菌、生殖支原体、沙眼衣原体、和淋病奈瑟菌。
在另一优选例中，所述的方法为同时检测12种病原体：肺炎克雷伯杆 菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、大肠埃希 菌、鲍曼不动杆菌、微小脲原体、白色念珠菌、生殖支原体、沙眼衣原体、 和淋病奈瑟菌的方法。
在另一优选例中，所述的待测样品包括尿液、导尿管、输尿管支架。
在本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的试剂盒的用途， 用于检测泌尿道病原体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书 所界定的本发明范围。
图1A-M显示了单重荧光定量PCR(Taqman法)检测不同病原体的扩增 曲线，其中模板浓度分别为：10000拷贝/μl、1000拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷 贝/μl和1拷贝/μl。
图1A显示了肺炎克雷伯杆菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1B显示了铜绿假单胞菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1C显示了金黄色葡萄球菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1D显示了粪肠球菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1E显示了奇异变形杆菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1F显示了大肠埃希菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1G显示了鲍曼不动杆菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1H显示了微小脲原体和阴性对照组的扩增曲线。
图1I显示了白色念珠菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1J显示了生殖支原体和阴性对照组的扩增曲线。
图1K显示了沙眼衣原体和阴性对照组的扩增曲线。
图1L显示了淋病奈瑟菌和阴性对照组的扩增曲线。
图1M显示了内源性对照人的beta-actin和阴性对照组的扩增曲线。
图2A-D显示了多重荧光定量PCR(Taqman法)检测不同组合病原体的多 组分图谱，模板浓度为10000拷贝/μl。
图2A显示了A组多重组合的检测结果，其中包括：肺炎克雷伯杆菌(蓝 色)、铜绿假单胞菌(绿色)、金黄色葡萄球菌(肉色)和内源性对照(紫色)
图2B显示了B组多重组合的检测结果，其中包括：奇异变形杆菌(绿 色)、大肠埃希菌(肉色)、粪肠球菌(蓝色)和内源性对照(紫色)
图2C显示了C组多重组合的检测结果，其中包括：生殖支原体(蓝色)、 沙眼衣原体(绿色)、淋病奈瑟菌(肉色)和内源性对照(紫色)
图2D显示了D组多重组合的检测结果，其中包括：鲍曼不动杆菌(蓝 色)、微小脲原体(绿色)、白色念珠菌(肉色)和内源性对照(紫色)。
图3A-M显示了多重荧光定量PCR(Taqman法)检测不同病原体模板浓 度分别为：100000拷贝/μl、10000拷贝/μl、1000拷贝/μl、100拷贝/μl和10拷 贝/μl的线性Ct值。
图3A显示了肺炎克雷伯杆菌的Ct值拟合情况。
图3B显示了铜绿假单胞菌的Ct值拟合情况。
图3C显示了金黄色葡萄球菌的Ct值拟合情况。
图3D显示了粪肠球菌的Ct值拟合情况。
图3E显示了奇异变形杆菌的Ct值拟合情况。
图3F显示了大肠埃希菌的Ct值拟合情况。
图3G显示了鲍曼不动杆菌的Ct值拟合情况。
图3H显示了微小脲原体的Ct值拟合情况。
图3I显示了白色念珠菌的Ct值拟合情况。
图3J显示了生殖支原体的Ct值拟合情况。
图3K显示了沙眼衣原体的Ct值拟合情况。
图3L显示了淋病奈瑟菌的Ct值拟合情况。
图3M显示了内源性对照(人β-actin)的Ct值拟合情况。
图4A-C显示了单重荧光定量PCR(Taqman法)检测不同大肠埃希菌浓度 为10000拷贝/μl的多组分图谱。
图4A为大肠埃希菌RecA.
图4B为大肠埃希菌gadE.
图4C为大肠埃希菌uidA多组分线性图谱。
图5A-L显示了使用市售的不同Taq酶反应液进行多重荧光定量PCR (Taqman法)，检测不同病原体的结果。模板浓度分别为：100000拷贝/μl、 10000拷贝/μl、1000拷贝/μl、100拷贝/μl和10拷贝/μl的线性Ct值。
图5A显示了肺炎克雷伯杆菌的Ct值拟合情况。
图5B显示了铜绿假单胞菌的Ct值拟合情况。
图5C显示了金黄色葡萄球菌的Ct值拟合情况。
图5D显示了粪肠球菌的Ct值拟合情况。
图5E显示了奇异变形杆菌的Ct值拟合情况。
图5F显示了大肠埃希菌的Ct值拟合情况。
图5G显示了鲍曼不动杆菌的Ct值拟合情况。
图5H显示了微小脲原体的Ct值拟合情况。
图5I显示了白色念珠菌的Ct值拟合情况。
图5J显示了生殖支原体的Ct值拟合情况。
图5K显示了沙眼衣原体的Ct值拟合情况。
图5L显示了淋病奈瑟菌的Ct值拟合情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种用于检测12种临床常 见尿道感染病菌的荧光定量PCR试剂盒。具体地，本发明人经过大量研究和 筛选，意外地发现了本发明的12组PCR引物和探针的组合。本发明的引物和 探针具有优异的稳定性，并且在PCR反应过程中不会互相发生干扰，因此能 够用于多重荧光定量PCR方法。
同时，本发明人经大量实验探究，发现了能够同时对12种病原体基因进 行扩增的反应条件，可以快速(3-4小时即可得到结果)、灵敏和高特异性地 检测12种常见尿道感染病原菌。在此基础上，完成了本发明。
本发明使用了Taqman荧光定量PCR技术，通过构造多通道特异性荧光探 针(多重反应)，建立了一种检测并鉴定泌尿生殖道感染病原体种类的荧光定 量PCR诊断试剂盒。具体地，所述的试剂盒含有检测样本特异性消化酶、12 种病原体的特异性引物和探针混合液以及多重探针法荧光定量PCR酶混合 液，可用于荧光定量PCR的方法检测12种常见尿道感染病原菌。
实验证明，本发明的试剂盒和检测方法并且具有高度的灵敏性和特异 性，本检测试剂盒适合于检测病人尿液的病原菌感染，可用于临床对尿感的 辅助评价，抗菌药物的疗效观察及预后，并利于尿感菌的早期诊断和针对性 治疗。
尿路感染及泌尿道病原体
本发明所用的术语“泌尿道病原体”、“尿路感染病原体”、“病原体”、 “病原菌”均具有相同的含义，均指能够侵入尿路并导致尿路感染，诱发炎症 反应的微生物。
尿路感染95％以上是由单一细菌引起的，最常见的致病菌是肠道革兰氏阴 性菌。大肠埃希杆菌(大肠杆菌，Escherichia coli，EC)是最常见的肠道病原 菌，90％的门诊病人和50％左右的住院病人，以及初次感染或单纯性UTI多由 大肠杆菌所致，此菌血清分型可达140种，致尿感型大肠埃希杆菌与病人粪便 中分离出来的大肠埃希杆菌属同一种菌型，多见于无症状菌尿或无并发症的 尿感；其次是奇异变形杆菌(Proteus mirabilis，PM，多见于伴有尿路结石 者)、克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella peneumoniae，KP)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii，AB)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa， PA，常见于尿路器械检查后)，此类病原菌主要发生在住院期间、复杂性、反 复感染、尿路器械检查后发生的尿感(此类继发性感染的比例更是高达15％)。 另有5％-10％的尿感由革兰氏阳性细菌引起，主要是粪链球菌(Enterococcus faecalis，EF)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，常见于败血症 等血源性尿感)，其中粪链球菌见于再感染、留置导尿管、有并发症之尿路感 染者；金黄色葡萄球菌多见于皮肤创伤及吸毒者引起的菌血症和败血症。真 菌类常见白色念珠菌(Candida albicans，CA)，感染多见于糖尿病及使用糖皮 质激素和免疫抑制药的病人及肾移植后。病毒、支原体感染虽属少见，但近 年来有逐渐增多趋向。淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae，NG，亦称淋球 菌)是通过性接触传播的病菌，通常会感染男性尿道粘膜细胞或女性的子宫颈 和尿道，通常人们将NG引起的尿道炎和非淋球菌引起的非特异性泌尿生殖系 统感染(包括支原体、衣原体和其他细菌真菌等)的病原体——如沙眼衣原体 (Chlamydia trachomatis，CT)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium，MG)、 微小脲原体(Ureaplasma parvum，UP)等，进行区分，这类感染引起的男性并 发症可能导致前列腺炎或睾丸炎。女性可导致输卵管炎或卵巢炎，其中任何 一种感染都可能导致不育。
通常尿感由一种细菌所致，偶尔两种以上致病菌混合感染，多种细菌感 染见于留置导尿管、神经源性膀胱、肾移植、结石、先天性畸形和抵抗力极 差的患者。
本发明可检测的病原体涉及细菌、真菌、支原体，检测范围较宽。可用于 检测的样品包括尿液、导尿管、输尿管支架及其他类型的样品。
引物和探针
本文所用的术语“引物(对)”和“特异性引物(对)”具有本领域技术人员常 规理解的意义，即，是指这样的引物(对)，其扩增出的扩增产物具有目标病原 体的互补链序列。
本文所用的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段 单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。
本发明提供了一组可用于检测尿道病原体的引物和探针。
本发明的探针由两端分别标记有荧光发生基团和淬灭基团的单链核酸分 子组成。优选地，所述探针5’端标记有荧光发生基团，3’端标记有荧光淬灭 基团。荧光发生基团选自下组：FAM、VIC、TEXAS RED、CY5、JOE、NED、 TET、HEX、TAMARA、ROX、CY3、CY5.5、和CY7。荧光淬灭基团选自下 组：BHQ1、BHQ2、MGB、BHQ3或TAMARA。
本发明优选的引物及探针核苷酸序列如表1所示。
表1荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体与内源性对照品的引物和探针
Figure BDA0003494353820000091
Figure BDA0003494353820000101
Figure BDA0003494353820000111
本发明的引物和探针在单独应用时均具有优秀的检测灵敏度和特异性。在 应用于多重反应时，由于本发明优化后的引物探针组合之间不易发生相互反 应，其检测灵敏度和特异性相对于现有的引物探针组合也均有提高。
试剂盒
本发明提供了一种用于检测尿道病原体感染的荧光定量PCR试剂盒，针对 12种临床常见尿道感染病菌：肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、微小脲原体、 白色念珠菌、生殖支原体、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌，针对性地设计了优化的 引物和探针，能够通过4组反应体系，同步检测上述12种病原菌。本发明的 试剂盒能够快速(3-4小时即可得到结果)、高灵敏度(10拷贝/ul)和高特异 性(无交叉反应)地检测这12种尿道感染病菌。
具体地，本发明首先提供了针对12种泌尿道病原体的优化的引物和探针。 并将其分配至4个反应体系中，通过特别设计的引物探针组合，避免引物间相 互干扰。同时，通过设置荧光通道，实现对4个反应体系同时进行荧光定量PCR 反应，从而简便、快速且准确地检测病原体的存在。
本发明优选的引物探针分组方式及对应的荧光通道如表2所示，但不限于 此。
表2反应体系分组
Figure BDA0003494353820000121
优选地，所述的试剂盒含有检测样本特异性消化酶、12种病原体的特异性 引物和探针混合液以及多重探针法荧光定量PCR酶混合液，可用于荧光定量 PCR的方法检测12种常见尿道感染病原菌。
检测方法
本发明提供了一种多重荧光定量PCR法(四重)检测泌尿系统DNA病原 体感染的方法。与现有技术所公开的方法比较，本发明提供了一种优化引物 对与探针和对应的多重荧光定量PCR扩增反应液的检测试剂盒，通过优化的 引物，实现一管中检测3种不同病原体和内参的方法。
本发明的主要优点包括：
1)本发明设计了优化的针对泌尿生殖道病原体的引物对和探针，较现有 的检测体系提高了特异性和灵敏度，检测灵敏度普遍可达10拷贝/ul，对部分 病原体检测灵敏度可达1拷贝/ul。
2)本发明通过设计特殊的引物和探针组合，构造了四重反应检测体系， 每个反应体系中的引物间均不存在互相干扰抑制，可以在同一反应体系中检 测三种不同的病原菌和一种内标，降低了经济成本，提高了检测效率。
3)本发明的引物和探针组合能够适配市售常见的Taq酶反应液，应用范 围较广。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重 量份数。
实施例1单重荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体
1.1荧光定量PCR引物组的制备
从GenBank获取人内源性对照人肌动蛋白基因beta-actin的DNA核酸序列 与12种DNA病原体包括肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、 粪肠球菌、奇异变形杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、微小脲原体、白色念 珠菌、生殖支原体、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的核酸序列，进行同源性比对分 析确定各型靶标的保守序列区域，然后在保守区域内选择合适的序列，采用 Primer Primier 3.0软件设计出13对特异的预扩增引物对和13组荧光定量PCR 引物组。
荧光定量PCR检测的人内源性对照和DNA病原体的引物和探针如表1所 示。
1.2 DNA参考品制备
根据不同病原菌各型靶标的保守序列区域，对11个病原体(肺炎克雷伯 杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、鲍曼不动 杆菌、微小脲原体、白色念珠菌、生殖支原体、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌)， 以PUC57质粒为载体，选择多克隆位点EcoRV为插入点进行构建，将上述质 粒分别构建到5个质粒和1个内源性对照质粒中；大肠埃希菌则以pcDNA3.1 质粒为载体，在多克隆位点以BamHI和KpnI酶切位点为插入位点，构建所述 病原体的质粒1个。每个质粒参考品分别用TE缓冲液以10倍梯度稀释，从5 ×106拷贝/μl梯度稀释至5拷贝/μl。
1.3单重荧光定量PCR检测DNA病原体
执行单重荧光定量PCR检测12个DNA病原体和1个内源性对照，使用 表1的DNA病原体检测引物和探针。
单个病原体检测反应体系：取2μl扩增子为模板(模板终浓度依次为1× 104拷贝/μl、1×103拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×101拷贝/μl和1×100拷贝/μl)， 加入2x探针法酶反应液(Biovuetech)10μl，一种病原体引物组(引物终浓度 为0.3μM，探针终浓度为0.2uM)，并补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积 20μL。
12个DNA病原体和1个内源性对照检测需设置13个反应孔。在美国 ABI7500实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒， 60℃60秒，40个循环，60℃收集FAM、VIC、TEXAS RED和CY5荧光信号， 以ROX为参比荧光。
结果：扩增曲线如图1所示。模板浓度分别为：10000拷贝/μl、1000拷贝 /μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl和1拷贝/μl，图1A-M分别显示了肺炎克雷伯杆 菌和阴性、铜绿假单胞菌和阴性、金黄色葡萄球菌和阴性、粪肠球菌和阴性、 奇异变形杆菌和阴性、鲍曼不动杆菌和阴性、微小脲原体和阴性、白色念珠菌 和阴性、生殖支原体和阴性、沙眼衣原体和阴性、淋病奈瑟菌和阴性、大肠埃 希菌和阴性、以及内源性对照人的beta-actin和阴性对照的检测结果。
实施例2优化后多重荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体
2.1 DNA参考品制备
以每个质粒参考品5×105拷贝/μl为母液配置多重(每3个DNA病原体和 1个内参)对照质粒混合参考品，其中每个质粒浓度为5×104拷贝/μl、5×103拷贝/μl、5×102拷贝/μl、5×101拷贝/μl和5×100拷贝/μl，单个病原体检测反 应体系：取4μl扩增子为模板(模板浓度依次为1×104拷贝/μl、1×103拷贝/μl、 1×102拷贝/μl、1×101拷贝/μl和1×100拷贝/μl)。
2.2多重荧光定量PCR检测DNA病原体
按照院感获得性病原菌、肠道菌群类病原菌、生殖道感染性病原菌和其他 病原菌的分类，对12个病原菌进行分组，分别进行多重(四重)荧光定量PCR， 每组检测3个DNA病原体和1个内源性对照。分组情况如表1所示。
使用表1中的DNA病原体检测引物和探针，分别配置下列引物对组：
A组引物对：针对肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌三种 病原体和内参；
B组引物对：针对奇异变形杆菌、大肠埃希菌、粪肠球菌和内参；
C组引物对：针对生殖支原体、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和内参；
D组引物对：针对鲍曼不动杆菌、微小脲原体、白色念珠菌和内参。
反应体系中加入2×探针法酶反应液(Biovuetech)10μl以及引物组混合液， 其中每个引物浓度为0.3μM，每个探针浓度为0.2uM，并补充不含DNA酶/RNA 酶的水至总体积20μL。
12个DNA病原体和1个内源性对照分为四组(每组均进行四重荧光定量 PCR)，检测需设置8个反应孔(复孔)。在美国ABI7500实时荧光定量PCR 仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环，60 ℃收集FAM、VIC、TEXAS RED和CY5荧光信号，以ROX为参比荧光。
结果：扩增的线形图谱如图2所示，可见各组别中的病原体基因扩增结果 均良好。本实施例证，本发明构建的反应条件能够高效地同时对12种病原体 进行扩增。
实施例3优化后多重荧光定量PCR检测尿感DNA病原体灵敏性实验
为评价四重荧光定量PCR(Taqman法)的检测灵敏性，以浓度为5×105拷贝/μl的病原体质粒为母液，按照表1组合配制四组混合参考品，每组包含3 种病原体和内参，其中每个病原体质粒浓度为5×104拷贝/μl，以TE缓冲液稀 释至以下梯度浓度，作为灵敏性参考品：
5000拷贝/μl灵敏度参考品；
500拷贝/μl灵敏度参考品；
50拷贝/μl灵敏度参考品；
5拷贝/μl灵敏度参考品。
结果：检测Ct值如表3所示。
表3目标病原体灵敏度检测结果
Figure BDA0003494353820000151
由检测结果可知，本发明引物及探针可在四重Taqman反应中同时检测三 种病原体和内源性对照。其中，肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、 奇异变形杆菌、淋病奈瑟菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌的最低检测限为1拷 贝/μL；金黄色葡萄球菌、生殖支原体、沙眼衣原体、微小脲原体等病原体的最 低检测限可检测到10拷贝/μL；而大肠埃希菌的NTC检测值与最低检测限(1 拷贝/μL)接近，表明大肠埃希菌在反应体系中难以达到NTC40，因此大肠埃 希菌的检测限也为10拷贝/μL。
本实施例表明，本发明的引物对和探针检测试剂对病原体具有高度灵敏 性。
实施例4优化后多重荧光定量PCR检测临床病原体特异性实验
特异性参考品制备
为评价方法的检测特异性，将已经过验证的10种病原体培养物或者病人 样本分别抽提DNA病原体，10种DNA提取物分别为：人基因组DNA、金黄 色葡萄球菌培养提取物DNA、铜绿假单胞菌培养提取物DNA、酵母培养提取 物DNA、大肠埃希菌培养提取物DNA、奇异变形杆菌和大肠埃希菌感染病人 尿液提取物DNA、粪肠球菌感染病人尿液提取物DNA、肺炎克雷伯菌感染病 人尿液提取物DNA、白色念珠菌和曲霉菌感染病人痰液提取物DNA、沙眼衣 原体和铜绿假单胞菌感染病人样品提取物DNA。
结果：特异性检测结果如表4所示。由于条件所限，并未收取到鲍曼不动 杆菌、淋病奈瑟菌、生殖支原体和微小脲原体的临床样品，但用这四种试剂检 测这10种培养物均为阴性。
表4目标病原体特异性检测结果
Figure BDA0003494353820000161
/>
表4目标病原体特异性检测结果(续)
Figure BDA0003494353820000171
由检测结果可知，用本发明Taqman法对应靶标的引物对和探针检测试剂， 对含有人源的内源性对照人肌动蛋白基因beta-actin(人源标本或基因组DNA 均可检测出)、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、酵母、大肠埃希菌、奇异变 形杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、沙眼衣原体、白色念珠菌和曲霉菌的样本 进行检测，不仅能够特异性检出对应的靶标，并且对不含检测靶标的样本NCT 基本均为40，证明其不易产生假阳性结果。而大肠埃希菌的的检测限为10拷 贝/μL，检测真实样本的ct值时，为使结果更严谨可设置cutoff(ct＝30)，小 于该ct值才可判断为大肠埃希菌感染。
如结果所示，本发明的引物对和探针检测试剂能够特异性检测对应的病原 体标本，且对其他种类病原体不产生假阳性结果。证明本发明的引物和探针组 合具有优秀的特异性。
实施例5(对比例)优化前多重荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体
5.1 DNA参考品制备
以每个质粒参考品5x105拷贝/μl为母液配置多重(每3个DNA病原体和 1个内参)对照质粒混合参考品，其中每个质粒浓度为5x104拷贝/μl、5x103拷 贝/μl、5x102拷贝/μl、5x101拷贝/μl和5x100拷贝/μl，单个病原体检测反应体系： 取4μl扩增子为模板(模板浓度依次为1x104拷贝/μl、1x103拷贝/μl、1x102拷 贝/μl、1x101拷贝/μl和1x100拷贝/μl)。
5.2多重荧光定量PCR检测DNA病原体
参照表5的组合形式执行多重(四重)荧光定量PCR检测3个DNA病原 体和1个内源性对照，使用表6的DNA病原体检测引物和探针。
表5反应体系分组
Figure BDA0003494353820000181
表6荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体与内源性对照品的引物和探针
Figure BDA0003494353820000182
/>
Figure BDA0003494353820000191
/>
Figure BDA0003494353820000201
加入2x探针法酶反应液(Biovuetech)5μl，引物组混合液包含每个引物浓 度为0.3μM，每个探针浓度为0.2uM分别配置A1组引物对包括鲍曼不动杆菌、 粪肠球菌、金黄色葡萄球菌三种病原体和内参；B1组引物对包括肺炎克雷伯杆 菌、奇异变形杆菌、沙眼衣原体和内参；C1组引物对包括铜绿假单胞菌、微小 脲原体、白色念珠菌和内参；D1组引物对包括生殖支原体、大肠埃希氏菌、淋 病奈瑟菌和内参；以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积10μL。每反应 中Taq酶为0.35U。12个DNA病原体和1个内源性对照分为四组(每组四重)检测需设置8个反应孔(复孔)。在美国ABI7500实时荧光定量PCR仪上运 行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环，60℃收集 FAM、VIC、TEXAS RED和CY5荧光信号，以ROX为参比荧光。
结果：实验结果如表7所示，Ct值线性拟合如图3所示。
表7优化前多重荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体检测结果
Figure BDA0003494353820000202
由检测结果可知，本四重反应的Taqman法可同时检测三种病原体和内源 性对照，12种病原体和1个内标的最低检测限都为10拷贝/μL，但大肠埃希氏 菌、淋病奈瑟菌和奇异变形杆菌的NTC都不为40。
图3显示了线性拟合Ct值，大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、 微小脲原体、白色念珠菌、淋病奈瑟菌和奇异变形杆菌的线性Ct值不佳，需要 进行优化。
实施例6单重荧光定量PCR检测大肠埃希氏菌
6.1荧光定量PCR引物组的制备
从GenBank获取多个大肠埃希氏菌的核酸序列，采用Clustalw2 Alignment 软件进行同源性比对分析，确定各型靶标的保守序列区域，然后在保守区域内 选择合适的序列，采用Primer Primier 3.0软件设计出3对特异的扩增引物对和 3组荧光定量PCR引物组，荧光定量PCR检测大肠埃希氏菌的引物和探针如 表8所示。
表8荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体与内源性对照品的引物和探针
Figure BDA0003494353820000211
6.2 DNA参考品制备
根据大肠埃希菌各型靶标的保守序列区域，3段目的基因个分别构建在3 个质粒上。其中RecA基因以PUC57质粒为载体，在多克隆位点EcoRV为插 入点进行构建；gadE和uidA则以pcDNA3.1质粒为载体，在多克隆位点以 BamHI和KpnI酶切位点为插入位点，构建所述病原体的质粒2个。每个质粒 参考品分别用TE缓冲液以10倍梯度稀释，从5x106拷贝/μl梯度稀释至5拷贝 /μl。
6.3单重荧光定量PCR检测大肠埃希菌
执行单重荧光定量PCR检测3种大肠埃希氏菌，使用表8的DNA病原体 检测引物和探针。单个病原体检测反应体系：取4μl扩增子为模板(模板终浓 度为1x104拷贝/μl)，加入2x探针法酶反应液(Biovuetech)10μl，一种病原 体引物组(引物浓度为0.3μM，探针浓度为0.2uM)以及补充不含DNA酶/RNA 酶的水至总体积20μL。体系中Taq酶浓度为3.5U。3种大肠埃希菌检测需设置 3个反应孔。在美国ABI7500实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10 分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环，60℃收集VIC荧光信号，以ROX 为参比荧光。
结果：实验结果如图4所示。模板浓度为10000拷贝/μl的多组分图，图 4A-C分别显示了大肠埃希菌RecA和阴性、大肠埃希菌gadE和阴性以及大肠 埃希菌uidA和阴性的检测结果。
根据图4所示实验结果，检测大肠埃希菌uidA基因的引物探针组最优， 因此选用该组加入后续多重荧光定量PCR检测。
实施例7优化后多重荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体
7.1 DNA参考品制备
以每个质粒参考品5x105拷贝/μl为母液配置多重(每3个DNA病原体和 1个内参)对照质粒混合参考品，其中每个质粒浓度为5x104拷贝/μl、5x103拷 贝/μl、5x102拷贝/μl、5x101拷贝/μl和5x100拷贝/μl，单个病原体检测反应体系： 取4μl扩增子为模板(模板浓度依次为1x104拷贝/μl、1x103拷贝/μl、1x102拷 贝/μl、1x101拷贝/μl和1x100拷贝/μl)。
7.2多重荧光定量PCR检测DNA病原体
参照表9的组合形式执行多重(四重)荧光定量PCR检测3个DNA病原 体和1个内源性对照，使用表1的DNA病原体检测引物和探针。
表9反应体系组合
Figure BDA0003494353820000231
加入2x探针法酶反应液(Biovuetech)10μl，引物组混合液包含每个引物 浓度为0.3μM，每个探针浓度为0.2uM，以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至 总体积20μL。每反应中Taq酶为3.5U。12个DNA病原体和1个内源性对照 分为四组(每组四重)检测需设置8个反应孔(复孔)。在美国ABI7500实时 荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒， 40个循环，60℃收集FAM、VIC、TEXAS RED和CY5荧光信号，以ROX为 参比荧光。
结果：实验结果如表10所示。
表10优化后多重荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体检测结果
Figure BDA0003494353820000232
由检测结果可知，本发明试剂盒可在四重Taqman反应中同时检测三种病 原体和内源性对照，12种病原体和1个内标的最低检测限都为10拷贝/μL。对 比优化前(实施例5)数据可知，所有检测目标Ct值均有所下降，证明优化后 引物检测灵敏度提高。
本实施例中，除大肠埃希菌外所有目标NTC均为40。由于Taqman法使 用的原材料来自大肠埃希菌，因此在反应体系中大肠埃希菌的Ct值难以达到 NTC 40。
实施例8优化前后多重荧光定量PCR检测临床泌尿生殖道感染病原体
8.1样品制备
从合作医院总共收集了41例待测样品，其中20例为尿液、3例为导尿管 头、9例为输尿管支架(分为肾端和膀胱端，共18例)。
尿液样品取1ml移至1.5ml离心管中，12000g离心10分钟，弃上清液。 沉淀用600μlDPBS缓冲液充分悬浮后12000g离心10分钟，弃上清液，保留 沉淀。导尿管头和输尿管支架样品浸泡于5ml DPBS缓冲液中10分钟，期间每 隔2分钟震荡30秒。之后取1ml混合液移至1.5ml离心管中，12000g离心10min， 弃上清液，保留沉淀。
8.2样品核酸提取
在上步骤的样品沉淀中加入25μl去核酸酶水和25μl特异性样品处理酶， 充分震荡悬浮沉淀后37℃水浴10分钟。再向每份样品中加入150μl去核酸酶 水，充分混匀后使用核酸提取试剂盒(磁珠法)(硕世生物，江苏)以及配套 的全自动核酸提取仪SSNP-2000A(硕世生物，江苏)按照说明书提取核酸。
8.3多重荧光定量PCR检测DNA病原体
优化前参照表5的组合形式执行多重(四重)荧光定量PCR检测3个DNA 病原体和1个内源性对照，使用表6的DNA病原体检测引物和探针。加入2x 探针法酶反应液(Biovuetech)5μl，引物组混合液包含每个引物浓度为0.3μM， 每个探针浓度为0.2uM分别配置A2组引物对包括鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、 金黄色葡萄球菌三种病原体和内参；B2组引物对包括肺炎克雷伯杆菌、奇异变 形杆菌、沙眼衣原体和内参；C2组引物对包括铜绿假单胞菌、微小脲原体、白 色念珠菌和内参；D2组引物对包括生殖支原体、大肠埃希氏菌、淋病奈瑟菌和 内参；以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积10μL。体系中Taq酶为 0.35U。12个DNA病原体和1个内源性对照分为四组(每组四重)检测需设置8个反应孔(复孔)。在美国ABI7500实时荧光定量PCR仪上运行以下程序： 95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环，60℃收集FAM、VIC、TEXAS RED和CY5荧光信号，以ROX为参比荧光。
优化后参照表2的组合形式执行多重(四重)荧光定量PCR检测3个DNA 病原体和1个内源性对照，使用表1的DNA病原体检测引物和探针。加入2x 探针法酶反应液(Biovuetech)10μl，引物组混合液包含每个引物浓度为0.3μM， 每个探针浓度为0.2uM分别配置A2组引物对包括肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单 胞菌、金黄色葡萄球菌三种病原体和内参的；B2组引物对包括奇异变形杆菌、 大肠埃希菌、粪肠球菌和内参；C2组引物对包括生殖支原体、沙眼衣原体、淋 病奈瑟菌和内参；D2组引物对包括鲍曼不动杆菌、微小脲原体、白色念珠菌和 内参；以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积20μL。体系中Taq酶为3.5U。 12个DNA病原体和1个内源性对照分为四组(每组四重)检测需设置8个反 应孔(复孔)。在美国ABI7500实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10 分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环，60℃收集FAM、VIC、TEXAS RED 和CY5荧光信号，以ROX为参比荧光。
结果：实验结果如表11所示。
表11优化前后多重荧光定量PCR临床泌尿生殖道感染病原体检测结果
Figure BDA0003494353820000251
/>
Figure BDA0003494353820000261
1.培养结果不包含在qPCR检测的12个病原体之内，故检测结果为阴性
2.大肠埃希氏菌核酸浓度比奇异变形杆菌低100倍
3.大肠埃希氏菌核酸浓度比奇异变形杆菌低10倍
由实验结果可知，使用优化后的引物探针组及反应条件，四重qPCR检测 结果Ct值均比优化前更低，证明优化后的引物探针组灵敏度提高。
使用优化前的引物探针组，38例样品的四重qPCR结果符合培养结果，3 例样品不符合。
01号样品培养结果为豪氏变形杆菌阳性，qPCR检测结果为奇异变形杆菌 阳性。经分析，原因是优化前的奇异变形杆菌引物探针组种属特异性不够高， 样品存在近缘物种即会导致假阳性。使用优化后的引物探针组，该样品四重 qPCR检测结果为阴性，符合培养结果。证明优化后的奇异变形杆菌引物探针 特异性提高。
04号样品培养结果为奇异变形杆菌阳性，四重qPCR检测结果为奇异变形 杆菌和大肠埃希氏菌阳性，其中大肠埃希氏菌的核酸浓度比奇异变形杆菌低 100倍。基于奇异变形杆菌的浓度优势，使用传统培养法很有可能漏检样品中 占比约1％的大肠埃希氏菌。而使用优化后的引物探针组后，同属一个病人的 04号样品和05号样品四重qPCR检测结果均为奇异变形杆菌和大肠埃希氏菌 阳性，且定量结果显示大肠埃希氏菌的核酸浓度比奇异变形杆菌低10～100倍， 证明引物探针组优化后对大肠埃希氏菌的检测灵敏度更高。
同理，34号样品使用优化前引物探针组四重qPCR检测结果为阴性，而使 用优化后引物探针组四重qPCR检测结果为大肠埃希氏菌阳性，也说明引物探 针组优化后提高了对大肠埃希氏菌的检测灵敏度。35号样品培养结果为大肠埃 希氏菌阳性，优化前四重qPCR检测结果为大肠埃希氏菌和淋病奈瑟菌阳性， 优化后四重qPCR检测结果为大肠埃希氏菌阳性，说明引物探针组优化前淋病 奈瑟菌检测特异性欠缺，而优化后改进了其特异性，减少了假阳性。
综上所述，引物探针组优化后，四重qPCR检测的特异性和灵敏度均有提 升，消除了部分样品中的假阳性结果，并能够检出培养法漏检的病原体。另外， 本发明适用的样品类型不局限于尿液，也可以包括导尿管、输尿管支架及其他 类型的样品。
实施例9使用其他Taq酶反应液进行荧光定量PCR检测临床泌尿生殖道 感染病原体
9.1 DNA参考品制备
以每个质粒参考品5x105拷贝/μl为母液配置多重(每3个DNA病原体和 1个内参)对照质粒混合参考品，其中每个质粒浓度为5x104拷贝/μl、5x103拷 贝/μl、5x102拷贝/μl、5x101拷贝/μl和5x100拷贝/μl，单个病原体检测反应体系： 取4μl扩增子为模板(模板浓度依次为1x104拷贝/μl、1x103拷贝/μl、1x102拷 贝/μl、1x101拷贝/μl和1x100拷贝/μl)。
9.2多重荧光定量PCR检测DNA病原体
参照表2的组合形式执行多重(四重)荧光定量PCR检测3个DNA病原 体和1个内源性对照，使用表1的DNA病原体检测引物和探针。
加入2x探针法酶反应液(Biovuetech)或2xGUeasy化学修饰探针法qPCR MasterMix(通用生物)10μl，引物组混合液包含每个引物浓度为0.075～0.3μM， 每个探针浓度为0.05～0.2uM分别配置A2组引物对包括肺炎克雷伯杆菌、铜绿 假单胞菌、金黄色葡萄球菌三种病原体和内参的；B2组引物对包括奇异变形杆 菌、大肠埃希菌、粪肠球菌和内参；C2组引物对包括生殖支原体、沙眼衣原体、 淋病奈瑟菌和内参；D2组引物对包括鲍曼不动杆菌、微小脲原体、白色念珠菌 和内参；以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积20μL。使用2x探针法酶 反应液的每反应中Taq酶为3.5U，使用2xGUeasy化学修饰探针法qPCR Master Mix的每反应中Taq酶为4U。12个DNA病原体和1个内源性对照分为四组(每 组四重)检测需设置8个反应孔(复孔)。在美国ABI7500实时荧光定量PCR 仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环，60℃收 集FAM、VIC、TEXAS RED和CY5荧光信号，以ROX为参比荧光。
结果：实验结果如表12和图5所示。
表12不同Taq酶多重荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染病原体检测结果
Figure BDA0003494353820000281
由检测结果可知，使用本四重反应的Taqman法同时检测三种病原体和内 源性对照，可以适配市面上常见的Taq酶反应液，但检测结果不优于本发明中 包含的Taq酶反应液。使用其他Taq酶反应液大肠埃希氏菌的NTC也为33左 右。
讨论：
由于多重荧光PCR检测方法的限制，一管体系同时检测12种病原体的难 度极大。经过深入研究和反复实验，本发明人将病原体分为4组体系进行多重 荧光PCR扩增，4组反应体系均能够很好地解决多重荧光PCR体系引物间互 相干扰抑制的问题，同时优化的引物能够提高本试剂盒检测的灵敏度和特异 性。
经过实验验证，本发明提供的引物和探针将病原体检测灵敏度提升至最低 检测限1拷贝/μL水平。并且，针对大肠埃希氏菌、淋病奈瑟菌和奇异变形杆 菌的优化后引物和探针明显改善了其线性Ct值(拟合R2值可达到0.999)。通 过对培养物和临床样品的检测，证实本发明的引物和探针组合具有优秀的检测 特异性。并且能够适配市面上常见的Taq酶反应液。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容 之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海翔琼生物技术有限公司
<120> 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法PCR试剂盒
<130> P2021-2886
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaggaccct ggatgtgaca 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctgcctga gctgacct 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccccacaca ccacaggacc ccaca 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtcagggta aagcgaacg 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcttctgcg tcgttgcc 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtgcgcgaa ctgctgctca acaat 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcgtgggtg tggaagtc 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggtgaagca gagcaggttc t 21
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcagtggaa cgaca 15
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtatggacaa ggtatttcta aaga 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttccttacct tgacccattc 20
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaacttatt gatttaggtg ttgaaaacga cat 33
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaagcggctg ttccacca 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gggcgtaggt gggtatcc 18
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
actctcagga ccatatactt caataattcg gcca 34
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
actacccatc agattatgtc at 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgtttgagg aaaatgcaat tta 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
attcacaccc tacccaacat tcat 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcagtttcat caatcaccac 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctcctaccgt acctcgcatt ac 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atctgcccag tcgagcatct cttca 25
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgctgcagca tcaaatcat 19
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgggtcaacc gagaaagtta c 21
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcacctgct gacaccactc cacca 25
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acaggtgaac aggcttttga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtgctcccat caatgcttca 20
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cagttgctgc aatgctccca gaaagcgaa 29
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gggtttgctt gaaagacggt a 21
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttgaagatat acgtggtgga cgtta 25
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tagacctaag ccattgtcaa agcgatcccg 30
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccatgcctag gatgagcaat 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cactaaatgc agtcgctagt t 21
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctaaatcaag tgcaccttca gca 23
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aggtgcattg tcgttggatt 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcttttgagc attggccact a 21
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cgggccagag tcttcaggga aaaca 25
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
taccaccccc acggcgatt 19
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgaaattttg cgccatacgg a 21
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgcagtttac gvcaccatc 19
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccctgaccct ctcggtga 18
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acgttgacgc ccagctt 17
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agcacgcgct cgatcccgac tatgc 25
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gcacctaaag caacgtctaa tg 22
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgcagcactt ggtcaaattg 20
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ttcgcccaga cgcatgatag aacct 25
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgaccgatct tctcaccttt g 21
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ccgtttaaac aggctgaatt 20
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tagaagttga taccttcgcc gtagaggatc t 31
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcagttcgtt tagatattcg tcgta 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
accgtataga atttggaaaa tagct 25
<210> 51
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cggtcaagta aaagaaggcg atgaaattgt tggt 34
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
accaccaatc cagacagagt 20
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cccaggtatt gctgaacgt 19
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ttggctccat cttctatgaa agtta 25
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cgtcaggcag agtttgacat 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gtctttgccc tgaccgattt 20
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tcaacaaatc cggcgcgtgg tacagct 27
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acgtattcgg gtgtgtactc attctttgct 30
<210> 59
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
acgagttttc ttggcagggg aagagtcttc tggagccgtg ttgccattat 50
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
agcattaaat gaaagcaaaa gag 23
<210> 61
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ggcaacaata tccactttac cagagttaaa agca 34
<210> 62
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
catattctgg aggagcctcc cctcctcatg ccttcttgcc tcttgtctc 49
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tagatttggt cgtattgggc 20

Claims (4)

1.一种用于检测泌尿道病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器、第二容器、第三容器和第四容器，所述的第一容器中的引物探针组合为：（A1）、（A2）、（A3）和（A13）；
所述的第二容器中的引物探针组合为：（A4）、（A5）、（A6）和（A13）；
所述的第三容器中的引物探针组合为：（A7）、（A8）、（A9）和（A13）；
所述的第四容器中的引物探针组合为：（A10）、（A11）、（A12）和（A13）；
其中，（A1）针对奇异变形杆菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 16所示的上游引物、如SEQ ID NO: 17所示的下游引物、和SEQ ID NO: 18所示的探针，
（A2）针对粪肠球菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 13所示的上游引物、如SEQ IDNO: 14所示的下游引物、和SEQ ID NO: 15所示的探针，
（A3）针对大肠埃希氏菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 19所示的上游引物、如SEQID NO: 20所示的下游引物、和SEQ ID NO: 21所示的探针，
（A4）针对肺炎克雷伯杆菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 4所示的上游引物、如SEQID NO: 5所示的下游引物、和SEQ ID NO: 6所示的探针，
（A5）针对铜绿假单胞菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 7所示的上游引物、如SEQ IDNO: 8所示的下游引物、和SEQ ID NO: 9所示的探针，
（A6）针对金黄色葡萄球菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 10所示的上游引物、如SEQID NO: 11所示的下游引物、和SEQ ID NO: 12所示的探针；
（A7）针对鲍曼不动杆菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 22所示的上游引物、如SEQID NO: 23所示的下游引物、和SEQ ID NO: 24所示的探针，
（A8）针对微小脲原体的引物探针组合为如SEQ ID NO: 25所示的上游引物、如SEQ IDNO: 26所示的下游引物、和SEQ ID NO: 27所示的探针，
（A9）针对白色念珠菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 28所示的上游引物、如SEQ IDNO: 29所示的下游引物、和SEQ ID NO: 30所示的探针；
（A10）针对生殖支原体的引物探针组合为如SEQ ID NO: 31所示的上游引物、如SEQ IDNO: 32所示的下游引物、和SEQ ID NO: 33所示的探针，
（A11）针对沙眼衣原体的引物探针组合为如SEQ ID NO: 34所示的上游引物、如SEQ IDNO: 35所示的下游引物、和SEQ ID NO: 36所示的探针，
（A12）针对淋病奈瑟菌的引物探针组合为如SEQ ID NO: 37所示的上游引物、如SEQ IDNO: 38所示的下游引物、和SEQ ID NO: 39所示的探针，和
（A13）针对人类β-actin的引物探针组合为如SEQ ID NO: 1所示的上游引物、如SEQ IDNO: 2所示的下游引物、和SEQ ID NO: 3所示的探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针上的一端标记有荧光发生基团，另一端标记有荧光淬灭基团，同一容器中不同探针互不重复地具有对应不同的荧光发生基团。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的荧光发生基团为选自下组的任意4种：FAM、VIC、TEXAS RED、CY5、JOE、NED、TET、HEX、ROX、CY3、CY5.5、和CY7。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、MGB、BHQ3或TAMARA。
CN202210107234.0A 2022-01-28 2022-01-28 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒 Active CN114457174B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210107234.0A CN114457174B (zh) 2022-01-28 2022-01-28 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210107234.0A CN114457174B (zh) 2022-01-28 2022-01-28 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114457174A CN114457174A (zh) 2022-05-10
CN114457174B true CN114457174B (zh) 2023-07-07

Family

ID=81410589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210107234.0A Active CN114457174B (zh) 2022-01-28 2022-01-28 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114457174B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852984B (zh) * 2021-02-07 2024-03-15 华东医院 泌尿系统感染病原体的检测体系及其试剂盒和应用
CN116426658A (zh) * 2023-03-09 2023-07-14 广州凯普医药科技有限公司 泌尿生殖道病原体检测试剂盒及其引物探针组合物与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2283458A1 (en) * 1999-09-28 2001-03-28 Michel G. Bergeron Highly conserved genes and their use to generate species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes and amplification primers to rapidly detect and identify bacterial, fungal and parasitical pathogens from clinical specimens for diagnosis
CN103642910A (zh) * 2013-11-26 2014-03-19 车团结 定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用
CN107604081A (zh) * 2016-12-14 2018-01-19 深圳市埃克特生物科技有限公司 可视化lamp检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法
CN108624704A (zh) * 2018-06-22 2018-10-09 上海孚清生物科技有限公司 一种荧光定量pcr探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒
CN108660189A (zh) * 2018-05-30 2018-10-16 杭州千基生物科技有限公司 一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒
CN109825615A (zh) * 2019-01-09 2019-05-31 中生方政生物技术股份有限公司 沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN110343777A (zh) * 2019-07-17 2019-10-18 中生方政生物技术股份有限公司 四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2283458A1 (en) * 1999-09-28 2001-03-28 Michel G. Bergeron Highly conserved genes and their use to generate species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes and amplification primers to rapidly detect and identify bacterial, fungal and parasitical pathogens from clinical specimens for diagnosis
CN103642910A (zh) * 2013-11-26 2014-03-19 车团结 定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用
CN107604081A (zh) * 2016-12-14 2018-01-19 深圳市埃克特生物科技有限公司 可视化lamp检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法
CN108660189A (zh) * 2018-05-30 2018-10-16 杭州千基生物科技有限公司 一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒
CN108624704A (zh) * 2018-06-22 2018-10-09 上海孚清生物科技有限公司 一种荧光定量pcr探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒
CN109825615A (zh) * 2019-01-09 2019-05-31 中生方政生物技术股份有限公司 沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN110343777A (zh) * 2019-07-17 2019-10-18 中生方政生物技术股份有限公司 四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114457174A (zh) 2022-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114457174B (zh) 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒
WO2022042568A1 (zh) 基于crispr技术进行多重核酸检测的方法
WO2022089550A1 (en) Novel compositions and methods for coronavirus detection
CN110714090A (zh) 一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒
CN113265456B (zh) 一种检测宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化的引物和探针组合
NL2031171B1 (en) Primer, Probe and Application for Identifying Brucella Vaccine Strain A 19 and Wild Strain
CN114134219A (zh) 一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用
CN112176079B (zh) 一种基于四重液滴数字pcr检测女性阴道微生物的引物探针组合及其应用
CN113046452B (zh) 一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用
CN112680541B (zh) 一种LNA-Taqman-多重荧光PCR技术及其在念珠菌快速检测中的应用
CN118006812A (zh) 检测阴道炎相关病原体的组合物、试剂盒及用途
EP4144859A1 (en) Tumor detection reagent and kit
CN111020042B (zh) 检测a族链球菌的组合物及方法
CN113493835A (zh) 通过检测bcan基因区域的甲基化状态筛查大肠瘤的方法和试剂盒
US9593384B2 (en) Metronidazole resistance in trichomonas vaginalis and single nucleotide polymorphisms
CN116121411A (zh) 用于检测多种生殖道微生态菌群的实时荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法
CN110029179B (zh) 一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用
KR102502129B1 (ko) Pna 프로브를 이용한 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 진단방법 및 키트
CN113151570B (zh) 一种基于lna修饰的环介导等温扩增lamp技术及其在念珠菌快速检测中的应用
CN110512013B (zh) 一种应用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法
WO2023121335A1 (ko) 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법
CN116904621A (zh) 检测不同生殖道病原体的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN115786557A (zh) 一种多重实时荧光定量pcr检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组、试剂盒及检测方法
CN117286265A (zh) 一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物、试剂盒以及方法
CN114921575A (zh) 一种同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体dna的试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant