CN110327376B - 一种微生态转移载体、制备及在阴道微生态移植中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微生态转移载体、制备方法及其在阴道微生态转移上的应用。将织物用质量浓度0.45‑0.9%的无菌氯化钠水溶液润湿,获得所述的载体;所述织物包括蚕丝膜布、天然桑蚕丝织物、桑蚕丝无纺布或以上任一与天然棉纤维再生丝纤维的混纺布。本发明的阴道微生态转移载体不仅可用于阴道微生态移植,也具有应用于女性阴道炎性疾病治疗的益生菌缓释载体的前景,而且可应用于剖宫产孕妇的产道微生态转移。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,特别涉及一种用于微生态转移的载体、制备方法及其在阴道微生态移植中的应用。
背景技术
在自然分娩的产程中,产道壁的反复挤压有利于产道微生物定植于胎儿的口、鼻腔,并随着胎儿的吞咽成为新生儿肠道微生物的首批成员,进而影响其免疫系统的构建。然而,剖宫产手术分娩改变了人类进化史上产道微生态在后代的自然定植。产道微生态转移体,是剖宫产过程中将产道微生物及其所处介质整体转移至新生儿周身体表的特制载体,用以弥补分娩方式塑造的婴儿早期肠道微生物定植的差异,修复剖宫产分娩儿正常的菌群肠-脑轴,并影响其后续健康。目前,如何改善此载体使之最大程度实现微生态的整体转移与有效缓释,及获得受试者的高度“一体感”与材质安全信任度,是本领域研究人员一直致力解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生态转移载体、制备方法及其在阴道微生态移植上的应用,以解决目前载体受试者体验度不佳、无法去除有害菌的问题,并进一步最大程度实现微生态的整体转移与有效定植,此外该载体还能扩展用于大众女性日常的阴道微生态护理及有益菌缓释。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
本发明提供一种微生态转移载体,所述载体按如下方法制备:将织物于质量浓度0.45-0.9%的无菌氯化钠水溶液中润湿,即获得所述的载体。
所述织物包括蚕丝膜布、天然桑蚕丝织物、桑蚕丝无纺布或以上任一与天然棉纤维再生丝纤维的混纺布。
所述织物用无菌氯化钠水溶液润湿的润湿度为30-70%,所述润湿度是指织物表面润湿面积占织物表面面积的百分比。优选润湿度为50-70%,所述润湿方法为:织物呈“卷轴”状时,将织物浸入无菌氯化钠水溶液;织物呈“伞形”时,将无菌氯化钠水溶液注入织物中。
优选,所述润湿是将织物用质量浓度为0.45%氯化钠水溶液润湿,润湿度为70%。
本发明还提供一种所述微生态转移载体的制备方法,所述方法为:将织物用质量浓度0.45-0.9%的氯化钠水溶液润湿,所述润湿度为30-70%。
优选,所述织物剪裁为马鞍型,优选按照以下比例制作:马鞍型载体的中间高度为5cm,两端高度为7cm,长度为12.5-22cm。按照该比例制作的蚕丝膜布,不同润湿度下润湿前后的质量差约为3.300-4.700g。
优选预先将织物处理呈卷轴型或收伞态后再润湿,以避免润湿后再处理可能引入外源性细菌。
本发明还提供一种所述微生态转移载体在制备阴道微生态转移或移植材料中的应用。
优选,所述材料为用于剖宫产手术前的孕妇产道微生态的移植载体。
本发明还提供一种所述微生态转移载体在制备大众女性日常的阴道微生态有益菌护理材料中的应用,如将所述护理材料制成阴道益生菌转移载体或益生菌缓释载体。
进一步,所述护理材料为用于女性阴道菌群失调所致炎性疾病的益生菌缓释载体。
优选,所述护理材料为具有良好保液性的微生物负载材料。所述有益菌包括乳杆菌(Lactobacillus)、短链双歧杆菌(Bifidobacterium breve),其中乳杆菌包括加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)。
本发明采用天然蚕丝膜布,并改良其外观,以改善其应用的舒适性及高效性,基于高通量测序技术评估在不同渗透压及润湿度条件下新型微生态转移载体负载微生物的多样性及物种丰度信息,以优化制备参数,并便于临床应用。
本发明以纳入正常足月妊娠孕妇18人作为研究对象。遵循临床对照试验设计原则,收集入院时产道微生物样本作为对照组,于剖宫产手术前进行“微生态转移体”转移试验。本发明对妊娠末期女性的产道“微生态转移体”的制备进行了研究,研究结果发现以蚕丝膜布为制作材料,在低渗与等渗盐溶液中分别浸湿低、中、高三水平参数下,转移载体吸附微生物的物种构成及多样性分析显示,在0.45%Nacl低渗盐溶液中润湿度为70%条件组较对照组(入院时自身提取的样本)最相似,且在微生物物种丰度水平上,蚕丝膜布经此参数制备后在孕妇产道内吸附的微生物,以乳杆菌为代表的益生菌丰度与对照组无差异,而在加德纳菌(Gardnerella)、阿波脱菌(Atopobium)等与阴道炎性疾病有关的有害菌的丰度水平明显降低,且差异有统计学意义。由此,以此作为益生菌给药载体或阴道微生物移植载体具有显著的临床意义。
具体的,试验组随机分6组,匹配不同的参数条件进行本发明“产道微生态转移体”的吸附试验。样本经DNA提取、扩增16S rDNAV3-V4区,应用Illumina Hiseq2500进行测序。利用Mothur、Lefse和Metastats等软件进行菌群多样性分析,采用Welch’s t检验及Anosim非参数检验等方法进行差异性分析。结果显示,以0.45%Nacl低渗盐溶液、70%润湿条件下转移体负载微生物的物种构成、α多样性指数及β多样性的Unifrac距离皆与对照组最为接近,且组间差异无统计学意义(P>0.05)。另外,此两组物种差异性分析显示,以乳杆菌为代表的有益菌的丰度与对照组的差异无统计学意义(P>0.05),以加德纳菌、阿托波氏菌为代表的有害菌的丰度明显低于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。可见,本发明新型“阴道微生态转移载体”可高效吸附转移阴道微生态,且在有益菌的吸附上表现出优先选择性。
与现有技术相比,本发明有益效果主要体现在:
本发明的阴道微生态转移载体不仅可应用于剖宫产孕妇的产道微生态转移体,也具有用于女性生殖道炎性疾病治疗的益生菌缓释载体的前景,及应用于女性阴道微生态的移植。所述载体吸附的微生物,以乳杆菌为代表的益生菌丰度与对照组无差异,而在加德纳菌、阿波脱菌等与阴道炎性疾病有关的有害菌的丰度水平明显降低。本发明所述阴道微生态转移载体可高效吸附转移阴道微生态,且在有益菌的吸附上表现出优先选择性。
附图说明
图1为微生态转移载体的模型示意图;A为平面马鞍型及卷轴型;B为伞型;
图2为M组与NC组物种分布堆叠图,A为门(Phylum)水平、B为科(Family)水平、C为属(Genus)水平;
图3为M组与NC组样本稀释曲线(sobs指数);
图4为M组与NC组Weighted-Unifrac指数热图。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案,但本发明的保护范围不限于此:
实施例1
1、研究对象选取
本发明所做实验选取自2018年4月至10月于郑州市某医院产科满足入选标准的足月待产孕妇为研究对象,并签署相关知情同意书。所入选孕妇均满足纳入标准且不在排除标准内(见表1);个人基本信息及临床资料均完整。
表1 研究对象的入选标准及排除标准
2方法
2.1研究方法
遵循临床对照试验设计原则,收集18名研究对象入院时产道微生物样本作为对照组,随机分成6个亚组(M1-M6),匹配不同的参数条件(表2),应用本发明微生态转移载体(以下简称“BMT”)完成“产道微生态转移”试验,每组重复3例。试验组所用“BMT”选取江浙出产的“桑蚕丝膜布”(规格22.5cm×8cm、厚度0.26mm,产品执行标准:QB/T 2872)作为制作材料(即非织造蚕丝面膜基布),并依照女性阴道的解剖形态设计,将制作材料剪裁为图1所示载体模型,其平面展开呈马鞍状,中间高5cm,两端高7cm,长12.5cm,经辐射灭菌后密封待用。
表2 产道微生态转移体制备参数编组
2.2样本采集
采集过程严格按照无菌操作要求。对照组(NC组)样本取自研究对象入院检查时,采集方法依照“人类微生物组计划”(CONSORTIUM.H M P.Structure,function anddiversity of the healthy human microbiome[J].Nature Communications,2012,486(14):207-14)的阴道微生物采集方法进行样本收集:用扩阴器扩张阴道,用灭菌棉拭子边旋转边沿孕妇阴道壁由阴道后穹窿到中间点,最后至入口处,从内而外螺旋施压擦拭阴道壁5圈,拭子头轻缓放入样本采集管中(勿触壁)密封,每名孕妇平行取样3支。
试验组(M组)操作流程:以无菌钳夹住“BMT”一侧边缘顺时针卷成疏松的“卷轴”状,将其依照表2中各组参数条件浸润打湿后,于剖宫产手术开始前置入孕妇阴道内,轻缓地沿逆时针方向展开膜布,撤出手术钳,使其自然贴合于阴道壁。保留一小时后取出密封于宽口径无菌冻存管内,每例样本均完善标记后冻存于-80℃冰箱。
2.3试剂与仪器
CTAB试剂、β-巯基乙醇、氯仿、异丙醇、无水乙醇、异戊醇、酚:氯仿(25:24)(均为广州化学试剂厂生产),RNase-Free Water,PCR相关试剂(日本TOYOBO公司),AMPure XP磁珠(美国贝克曼库尔特公司)。4℃离心机(型号Eppendorf5427R,德国Eppendorf股份公司生产),振荡器(型号米欧mix-28+,广州围古润仪器有限公司),移液器(型号Eppendorf,德国Eppendorf股份公司生产),超纯水仪器(型号明澈TM-D,RephiLe Bioscience Ltd.公司生产),NanoDrop(型号NanoDrop 2000,美国赛默飞世尔科技公司),电泳仪(型号DYY-6C型,北京六一仪器厂),PCR仪(型号ETC811,北京东胜兴业科学仪器有限公司),Hiseq2500(美国Illumina)。
2.4 DNA提取与测序
参照“人类微生物组计划”,从样本中提取基因组DNA,用带有barcode的特异引物341F与806R扩增16S rDNA的V3-V4区;随后PCR扩增产物切胶回收,用QuantiFluorTM荧光计进行定量;将纯化的扩增产物进行等量混合,连接测序接头,构建测序文库;于IlluminaHiseq 2500 PE250上机测序。
3数据分析
使用QIIME(version 1.8.0)工具包依次进行物种注释,Mothur软件、Lefse软件进行α多样性分析、β多样性分析。应用Metastats软件检验两组样本间微生物群落丰度的差异,结合SPSS统计学软件21.0,采用Welch’s t-test、Anosim非参数检验等对M各组与NC组样本微生物的α多样性、β多样性进行差异性分析及检验。
4结果
4.1测序结果
本研究NC组收集样本18例,M组18例,共计36例样本。样本提取的DNA经质检均合格,无一脱落。测序所得有效序列的总tag在62198-115972读长之间;OTU分析显示,各组样本微生物在科、属水平均以乳杆菌为优势菌群(见图2),而且,在目、科及属水平,皆以M3(M45-70)组的物种构成与对照组最相似。
4.2α多样性分析
本研究分析了几种常用的α多样性指数:Shannon-Wiener、Simpson、Chao、ace、Sobs指数,基于样本稀释曲线图(见图3)可看出,各组样本的测序深度足够,能覆盖微生物群97%的菌种,后续分析有意义。各组多样性指数中,以M3组与对照组的数值最接近(参见表3);其中,Shannon-Wiener指数与simpson指数综合反应物种的多样性和分布的均匀度,以M3组的Shannon-Wiener指数数值最高,simpson指数较其他组更接近于1(参见表3);进一步就上述两种多样性指数对M3组与对照组进行Welch’s t-test,组间差异无统计学意义(P>0.05,见表4)。
表3 产道微生物16S rDNA多样性指数
注:Sobs、Shannon、Simpson、Chao、Ace为α多样性指数,Bray-Curtis为β多样性距离指数;Md为中位数,QR为四分位数间距。
表4 M3与NC组微生物多样性的差异性比较
4.3β多样性分析
基于样本之间距离的Unifrac指数是根据系统发生树进行比较,从整体上判断样本之间菌群构成的相似程度,而Bray-Curtis指数则基于OTU信息考虑物种有无和相对丰度水平。从Unifrac指数热图来看,加权处理下的热图中M45组样本的浅色部分较多,代表与对照组相似程度较高(见图4)。进一步就每一亚组与对照组样本之间的Bray-Curtis距离进行比较发现,M3组样本的中位数与NC组的样本最为接近(见表3)。另外,从Wilcoxon检验结果来看,经加权处理后M3组与对照组Unifrac指数的差异无统计学意义(P=0.43>0.05);同时Anosim检验结果显示,M3组与NC组的组间差异与组内差异无统计学意义(P>0.05,且R值<0.2),再次说明此两组样本的物种OTU信息相似(见表4)。
4.4物种差异性分析
根据样本OTU丰度信息进行物种差异性分析,M3与NC组微生物OTU相对丰度达0.1以上的菌群中,在属水平,Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella、Peptoniphilus、Corynebacterium菌与NC组的丰度差异无统计学意义(P>0.05),而Gardnerella菌的丰度与对照组相比明显降低,且差异有统计学意义(P=0.033<0.05,见表5);在种水平,基于16SrDNA测序技术在种水平的局限性,测出的已分类菌群中,Bifidobacterium-breve、Lactobacillus-gasseri、Lactobacillus-murinus、Prevotella-bivia、Campylobacter_hominis几种共生菌的物种丰度与对照组的差异均无统计学意义(P>0.05),而Atopobium_vaginae菌的丰度较对照组明显下降,且差异有统计学意义(P=0.0088<0.05,见表6)。
表5 M3 vs NC样本微生物的物种差异性分析(属水平)
表6 M3 vs NC样本微生物的物种差异性分析(种水平)
受雌孕激素的影响,妊娠末期孕妇的阴道壁相对松弛,在实际操作时医用棉纱布不能有效实现充分贴附于产道壁的效果,且异物感明显。为改善“BMT”应用的舒适性,并确保最大程度实现产道微生态的整体转移,本研究选取桑蚕丝膜布作为制作材料,并结合女性阴道“前短后长”的解剖结构特点在外观设计上进行改良,根据图1的模型进行设计。蚕丝纤维富含的18种氨基酸、活性蛋白,与产道微生态所处粘膜环境极其接近,其丝胶蛋白链的亲水侧基增加了蚕丝膜布的亲水性,而丝素蛋白独特的分子构象更增加其生物相容性;同时,纤维多孔结构令其保湿性、贴附性更佳。在试验中,70%润湿度的蚕丝“BMT”在盐溶液中浸湿的瞬间即可达到溶液全覆盖,与30%润湿度的带液效果显著不同;且70%润湿度的“BMT”在产道中保留1小时的贴附效果最佳,即使轻微活动下亦无明显脱落迹象。另外,受试者的体验度反馈很好,无异物感。可以说,蚕丝膜布在实现产道微生态的整体转移上颇具优势。
在制备参数设置上,考虑共生菌转移的适宜环境,本研究设置了渗透压与润湿度两因素,分高、中、低三水平。基于高渗透压条件可诱发粘膜细胞出现急性细胞毒性反应,亦可引起微生物活性降低,为控制混杂,亦为避免增加受试者不良妊娠结局的风险,研究实施时剔除高渗透压水平,选取0.45%盐溶液与0.9%生理盐水。试验结果显示,于0.45%的低渗盐溶液中浸湿70%的蚕丝“BMT”在产道中所吸附微生物的物种丰度、分布的均匀度及多样性,皆与分娩前产道微生物最相似,且差异无统计学意义,表明低渗透压相较于等渗透压条件对产道微生态的吸附转移更具有保护性效应,这可能与低渗透压环境下刺激微生物活性的膨胀压有关。
女性生殖道微生态由诸如乳杆菌属、加德纳菌属、雷德沃氏菌、棒状杆菌属、假丝酵母属及一些专性厌氧菌形成。健康女性阴道中,以卷曲乳杆菌为代表的厌氧菌占优势,而惰性乳杆菌、阴道加德纳菌等与细菌性阴道病(BV)等相关。乳酸杆菌主导的阴道菌群通常pH<4.5,以抑制其他细菌生存。因此,乳杆菌特征可用来评估阴道微生态健康状态:乳酸菌多者,阴道pH值较低(pH 4-5),菌相相对稳定,不易演变成细菌性阴道病的失衡病态;乳酸菌少或无者,阴道pH值偏高(pH>5),为兼性厌氧菌大量生长的菌群失衡态(即BV态),极易发生STD感染。在妊娠末期,正常女性阴道微生态的菌群多样性较非孕期有所下降,并以乳酸菌为稳定优势菌。本发明试验结果显示,正常妊娠末期产道微生物以乳酸菌(lactobacillus)70%的构成比居主导地位,试验组M3条件下蚕丝膜布转移体吸附的菌群中,以Lactobacillus、Bifidobacterium breve、Lactobacillus gasseri、Lactobacillusmurinus等产道有益菌的丰度与对照组的差异无统计学意义,且乳酸杆菌属的主导优势更加明显,而与细菌性阴道病强相关的Gardnerella菌、与宫颈癌变致病因子HPV病毒有协同作用的Atopobium菌之类的有害菌的OTU丰度水平较对照组显著下降,由此推断在低渗盐溶液中高湿润度下的蚕丝膜布对产道优势菌的吸附转移有优先选择性,这可能与在离子溶液中蚕丝纤维的丝胶蛋白及丝素蛋白的等电点pH值与乳杆菌维护的酸性微生态存在协同效应有关。因此,采用蚕丝膜布制作阴道益生菌缓释载体有其独特优势。
Claims (6)
1.一种微生态转移载体在制备阴道微生态移植材料中的应用,其特征在于所述载体按如下方法制备:将织物用质量浓度0.45%的无菌氯化钠水溶液润湿,获得所述的载体;所述织物为蚕丝膜布;织物的润湿度为70%,所述润湿度为织物表面润湿面积占织物表面面积的百分比。
2.如权利要求1所述微生态转移载体在制备阴道微生态移植材料中的应用,其特征在于润湿的方法为:织物呈卷轴状时,将织物浸入无菌氯化钠水溶液;织物呈伞形时,将无菌氯化钠水溶液注入织物中。
3.如权利要求1所述微生态转移载体在制备阴道微生态移植材料中的应用,其特征在于所述织物剪裁为平面呈马鞍型,参照如下比例:中间高5cm,两端高7cm,长12.5-22cm。
4.如权利要求1所述微生态转移载体在制备阴道微生态移植材料中的应用,其特征在于所述材料为在剖宫产手术前制备的孕妇产道微生态的移植材料。
5.如权利要求1所述微生态转移载体在制备阴道微生态移植材料中的应用,其特征在于所述材料为大众女性日常的阴道微生态护理材料。
6.如权利要求5所述微生态转移载体在制备阴道微生态移植材料中的应用,其特征在于所述护理材料为阴道益生菌转移材料。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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