CN108079024A - 一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于剖宫产胎儿初次获得有益微生物的复合微生态制剂及其制备方法。该复合微生态制剂是由具有益生作用健康妇女阴道常见的婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌组成,这些有益菌在适宜的培养基中进行单独发酵,发酵后按照一定的比例,加入冻干保护剂,进行真空冷冻干燥制得。所得微生态冻干制剂具有乳香味,细菌活性强,能长期保存等特点。使用该种复合微生态制剂对剖宫产胎儿进行微生物浴,能弥补剖宫产分娩对新生儿细菌定植造成的不足,部分恢复胎儿未从母亲阴道获得的有益微生物菌群,从而有效抑制剖宫产胎儿出生后有害菌的定植,提高胎儿免疫力、促进胎儿肠道菌群成熟,帮助胎儿建立正常菌群等。
Description
技术领域
本发明专利属于微生物技术领域。具体涉及一种用于剖宫产新生儿微生物浴的复合微生态制剂及其制备方法。
背景技术
新生儿出生后微生物菌群的定植受到很多因素影响,包括出生前的子宫环境、出生时的分娩方式、出生后的抗生素治疗、饮食等等。这些因素引发的微生物菌群紊乱会引发免疫系统紊乱,从而引发疾病。幼儿时期是微生物菌群定植的“窗口期”。而不同的分娩方式是影响婴儿微生物菌群形成的首要因素。剖宫产婴儿和顺产婴儿的菌群的早期差异性持续存在。阴道分娩婴儿的菌群定植主要受母亲阴道和会阴区域菌群的影响,剖宫产婴儿则主要受到医院环境的影响。顺产的婴儿,他们的皮肤、肠道、口腔、鼻咽腔会富含乳酸杆菌,类似于产妇阴道微生物菌群。相反,剖腹产出生的婴儿,他们微生物组菌群中缺乏乳酸杆菌,更多的是含有普通皮肤、外界环境的微生物,例如葡萄球菌、链球菌和丙酸杆菌。以肠道菌群为例,大多数新生儿肠道微生物来源于母亲,顺产婴儿最初的肠道菌群源于母亲阴道和外阴周围的细菌,多为乳酸杆菌、普雷沃氏菌等;而剖宫产婴儿肠道菌群主要以链球菌、葡萄球菌、厌氧球菌、类杆菌、丙酸杆菌为主,并且肠道微生物的抗生素耐药基因含量更高。其中金黄色葡萄球菌是导致新生儿败血症的主要原因,这种细菌不但有可能导致婴儿耐受多种药物,而且还会减弱肠道对营养物质的吸收与合成以及肠上皮细胞的代谢能力。此外,剖腹产还会延迟婴幼儿肠道微生物菌群结构的进化,剖宫产婴儿肠道健康菌群的建立会比自然分娩婴儿晚约6个月,顺产和剖腹产出生的婴儿,在出生后的一年内,体内微生物菌群均具有显著差异性。剖腹产婴儿出生的第一年,肠道微生物的多样性减少。
与顺产的婴儿相比,剖宫产出生的婴儿患过敏性疾病,如哮喘和花粉症的概率更高。并且剖宫产出生的儿童更容易患急性胃肠炎和乳糜泻疾病。流行病学调查显示,剖宫产与儿童发病率较高的肥胖、哮喘、过敏及免疫缺陷风险相关。剖腹产与1型糖尿病和肥胖等风险增加之间存在关联。肥胖症表型可以通过肠道微生物群移植由人类转移给小鼠,母亲与新生儿之间的微生物转移被认为在遗传因素之外的肥胖代际关系中发挥作用。由于母亲肠道微生物群在怀孕期间发生变化,而且这些变化依赖于体重状况,因此母体体重可能决定了遗传给后代的微生物菌群。在动物实验中,断奶后的15个月内,经剖腹产出生的小鼠体重会比顺产小鼠平均重33%。而且,这种肥胖症状在雌性小鼠身上更为明显,剖腹产雌鼠的体重会增加70%!顺产小鼠体内的微生物结构会伴随着成长而趋向成熟,然而剖腹产小鼠的肠道菌群会很快就成熟,但是在随后的发育过程中会变得相对不稳定。同时,顺产小鼠会获得母体阴道的微生物群,这些微生物群会阻止小鼠体重增加。此外,子宫、胎盘和羊水的微生物菌群有助于胎儿出生后抵抗细菌感染,并影响胎儿先天免疫基因表达健康的新生儿微生物菌群的建立。
因此,剖宫产婴儿出生后的微生物定植对其健康具有重大意义。
关于剖宫产和顺产的优劣,医学界普遍认为,顺产应该是首选的分娩方式,并达成剖宫产率为10%至15%的共识,因为“尽管剖宫产可以拯救生命,但它的实施,常常没有医学上的必要性,会导致妇女和婴儿面临短期和长期的健康风险”。但是,调查表明,部分拉美国家的剖宫产率接近50%。而2014年11月发表于《中华妇产科杂志》的《全国剖宫产率及剖宫产指征构成比调查的多中心研究》表明:中国的平均剖宫产率达到54.47%,部分地区剖宫产率高达72%。剖宫产分娩的婴儿没有获得母体遗传的菌群,因而对婴儿的健康造成了长远的、无益的甚至有害的影响。
研究表明,用含有母亲阴道微生物的纱布拭擦新生儿可以部分恢复源自母亲产道的微生物菌群。(Dominguez-Bello等,2016)因此,通过阴道菌群移植可以弥补剖宫产对新生儿细菌定植造成的不足。因此,在产后立即用阴道有益菌擦洗婴儿身体各个部位,可以部分恢复微生物菌群。
发明内容
本发明的目的在于提供一种剖宫产新生儿微生物浴用的微生态制剂,同时提供其相应的制备方法是本发明的另一目的。
基于上述目的,本发明采取如下技术方案:一种复合的剖宫产新生儿微生物浴用的微生态制剂,每1g制剂中含婴儿双歧杆菌≥5×107CFU,两歧双歧杆菌≥5×107CFU,鼠李糖乳杆菌≥5×107CFU,罗伊氏乳杆菌≥5×107CFU,冻干保护剂0.1-0.2g。
所述冻干保护剂的质量比为:10-20%脱脂奶粉、5-10%蔗糖,5-10%低聚糖。所述低聚糖包括低聚果糖,低聚麦芽糖,低聚木糖。
一种复合的剖宫产新生儿微生物浴用的微生态制剂的制备方法,包括以下步骤:
(a)制备复合菌菌液:
分别将婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种到MRS培养基中,厌氧发酵24-72小时,发酵温度30-40℃,所得各菌含量≥5×108CFU/ml,然后进行按比例混合得混合菌液;
(b)将(a)所获得的菌液加入冻干保护剂和低聚寡糖,将准备好的菌液分装到冻干瓶中,然后进行预冷;
(c)真空冷冻干燥,得成品。
所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(a)中所用菌株为婴儿双歧杆菌CICC21716,两歧双歧杆菌CICC10395,鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2568,罗伊氏乳杆菌CICC10855;混合液中各菌占总体积比例为10-60%V/V。
所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)中,以质量百分比计,所述冻干保护剂的配方包括:10-20%脱脂奶粉、5-10%蔗糖,5-10%低聚糖。
所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)中,在-70~-80℃下预冻2-4小时。
所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(c)中,真空冷冻干燥36小时。
所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)中,低聚糖包括低聚果糖,低聚麦芽糖,低聚木糖。
本发明的优点是:将阴道有益菌进行体外单独发酵,然后按照一定的比例进行混合,配以冻干保护剂和低聚糖等益生元,然后进行真空冷冻干燥,能提高细菌在自然状态下的存活率。将无菌的湿纱布置于发酵完全的微生态制剂内,放置1个小时。在剖宫产手术开始前取出纱布,放置在无菌的烧杯,室温下保存,然后开始剖宫产手术。术后使用纱布擦拭新生儿身体各个部位,部分恢复阴道有益微生物菌群,有效抑制有害菌的定植,提高婴儿免疫力,促进婴儿健康菌群的建立,对剖宫产婴儿健康产生长远的、有益的影响。
具体实施方式
以下实施例只为进一步说明本发明,不以任何形式限制本发明,本实施例中所涉及的菌株婴儿双歧杆菌CICC21716,两歧双歧杆菌CICC10395,罗伊氏乳杆菌CICC10855购自中国工业微生物菌种保藏中心,鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2568购自中国普通微生物菌种保藏中心。
实施例1
将婴儿双歧杆菌CICC21716,两歧双歧杆菌CICC10395,鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2568,罗伊氏乳杆菌CICC10855四种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养,斜面和液体发酵培养基分别为:婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌培养基为MRS培养基,其组成为(W/V):蛋白胨1%,牛肉粉0.5%,酵母粉0.4%,葡萄糖2%,吐温80 0.1%,磷酸氢二钾0.2%,乙酸钠0.5%,柠檬酸三铵0.2%,硫酸镁0.02%,硫酸锰0.005%,固体培养基加入琼脂粉1.5-2%,pH 6.2左右。将种子液按照5%的接种量接种到发酵培养基中,婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌在37℃,厌氧培养24-72h,使得每种菌的菌含量≥109cfu/ml。
将四种菌发酵液按体积百分比25%:25%:25%:25%混合,得复合菌液,加入冻干保护剂,该冻干保护剂的配方包括:脱脂乳、蔗糖和低聚果糖,其中,在冻干保护剂中,脱脂乳为10%,蔗糖5%、低聚果糖10%,分装,接下来以-80℃进行预冻4小时,最后冷冻干燥36小时即可。
实施例2
将婴儿双歧杆菌CICC21716,两歧双歧杆菌CICC10395,鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2568,罗伊氏乳杆菌CICC10855四种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养,斜面和液体发酵培养基分别为:婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌培养基为MRS培养基,其组成为(W/V):蛋白胨1%,牛肉粉0.5%,酵母粉0.4%,葡萄糖2%,吐温80 0.1%,磷酸氢二钾0.2%,乙酸钠0.5%,柠檬酸三铵0.2%,硫酸镁0.02%,硫酸锰0.005%,固体培养基加入琼脂粉1.5-2%,pH 6.2左右。将种子液按照5%的接种量接种到发酵培养基中,婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌在37℃,厌氧培养24-72h,使得每种菌的菌含量≥109cfu/ml。
将四种菌发酵液按体积百分比30%:20%:30%:20%混合,得复合菌液,加入冻干保护剂,该冻干保护剂的配方包括:脱脂乳、蔗糖和低聚果糖,其中,在冻干保护剂中,脱脂乳为10%,蔗糖5%、低聚果糖10%,分装,接下来以-80℃进行预冻4小时,最后冷冻干燥36小时即可。
实施例3
将婴儿双歧杆菌CICC21716,两歧双歧杆菌CICC10395,鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2568,罗伊氏乳杆菌CICC10855四种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养,斜面和液体发酵培养基分别为:婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌培养基为MRS培养基,其组成为(W/V):蛋白胨1%,牛肉粉0.5%,酵母粉0.4%,葡萄糖2%,吐温80 0.1%,磷酸氢二钾0.2%,乙酸钠0.5%,柠檬酸三铵0.2%,硫酸镁0.02%,硫酸锰0.005%,固体培养基加入琼脂粉1.5-2%,pH 6.2左右。将种子液按照5%的接种量接种到发酵培养基中,婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌在37℃,厌氧培养24-72h,使得每种菌的菌含量≥109cfu/ml。
将四种菌发酵液按体积百分比20%:20%:30%:30%混合,得复合菌液,加入冻干保护剂,该冻干保护剂的配方包括:脱脂乳、蔗糖和低聚果糖,其中,在冻干保护剂中,脱脂乳为10%,蔗糖5%、低聚果糖10%,分装,接下来以-80℃进行预冻4小时,最后冷冻干燥36小时即可。
实施例4
按照实施例1制备的复合益生菌制剂与市场上所售益生菌产品保存稳定性比较。市场产品分别选三株口服液,市售高浓缩益生菌菌粉。按常规加速试验法,若将产品置37~40℃、相对湿度75%条件下放置3个月、12个月后,测定菌含量。结果显示本发明所制得的真空冷冻干燥的复合益生菌经过长期保存后,活菌含量仍然很高,结果见表1。
表1益生菌保存性实验
Claims (9)
1.一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂,其特征在于:该制剂由复合菌、和冻干保护剂组成,所述的复合菌由婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌组成;每1g制剂中含婴儿双歧杆菌≥ 5×107CFU,两歧双歧杆菌≥ 5×107CFU,鼠李糖乳杆菌≥ 5×107CFU,罗伊氏乳杆菌≥ 5×107CFU,冻干保护剂0.1-0.2g。
2.如权利要求2所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂,其特征在于,所述的复合菌中婴儿双歧杆菌为婴儿双歧杆菌CICC21716,两歧双歧杆菌为两歧双歧杆菌CICC10395,鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2568,罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌CICC10855。
3.如权利要求1所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂,其特征在于以质量百分比计,所述冻干保护剂包括:10-20 %脱脂奶粉、5-10%蔗糖,5-10%低聚糖。
4.如权利要求3所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂,其特征在于,低聚糖包括低聚果糖,低聚麦芽糖,低聚木糖。
5.一种如权利要求1所述一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a)制备复合菌菌液:
分别将婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种到MRS培养基中,厌氧发酵24-72小时,发酵温度30-40℃,所得各菌含量≥ 5×108CFU/ml,然后进行按比例混合得混合菌液;
(b)将(a)所获得的菌液加入冻干保护剂,将准备好的菌液分装到冻干瓶中,然后进行预冷;
(c)真空冷冻干燥,得成品。
6.如权利要求5所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(a)中所用婴儿双歧杆菌为婴儿双歧杆菌CICC21716,两歧双歧杆菌为两歧双歧杆菌CICC10395,鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2568,罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌CICC10855;混合液中上述各菌株占总体积的10-60%。
7.如权利要求5 所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)中,以质量百分比计,所述冻干保护剂包括:10-20 %脱脂奶粉、5-10%蔗糖,5-10%低聚糖。
8.如权利要求5所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)中,在-70 ~ -80℃下预冻2-4小时。
9.如权利要求5所述的一种剖宫产新生儿微生物浴用微生态制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(c)中,真空冷冻干燥36小时;所述步骤(b)中,低聚糖包括低聚果糖,低聚麦芽糖,低聚木糖。
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