CN104622709B - 人干细胞因子皮肤修复液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人干细胞因子皮肤修复液，由下述含量的成分构成：表皮生长因子50～75μg/L、酸性成纤维细胞生长因子15～20μg/L、碱性成纤维细胞生长因子15～20μg/L、血管内皮生长因子4～6μg/L；及其制备方法；本发明针对生发细胞快速增殖的一系列细胞因子组合，按照合理的符合人体细胞生长并且加速生长的环境，可以达到快速修复受损皮肤，恢复皮肤质量。

Description

人干细胞因子皮肤修复液及其制备方法

技术领域

本发明涉及损伤皮肤修复技术领域，尤其是一种人干细胞因子皮肤修复液，及其制备方法。

背景技术

人类的皮肤细胞长期处于外界环境的刺激和影响下，随着年龄的增加，皮肤细胞呈现出老化趋势。皮肤基底层的生发细胞，也就是具有增殖和扩增潜力的细胞，是维持皮肤保持色泽、光滑度、纹理、弹性的重要细胞。但遇到一些大的损伤或者持续存在的损伤时，生发细胞的增殖力就不足以维持原有的皮肤质量，则出现了皮肤老化和退化的现象。

现在市面上存在一些细胞因子的药物和化妆品，大多是单一细胞因子，比如表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)等，虽然也能起到一定的作用，但因为过于单一且用量和浓度也与人体内环境有差别，所以效果不明显。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出一种人干细胞因子皮肤修复液，搭配合理，效果好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种人干细胞因子皮肤修复液，由下述含量的成分构成：

优选的，血管内皮生长因子的含量为5μg/L。

优选的，表皮生长因子由53个氨基酸组成，分子量为6.201KD。

优选的，酸性成纤维细胞生长因子由147个氨基酸组成，分子量为15.3KD。

优选的，碱性成纤维细胞生长因子由155个氨基酸组成，分子量为16～ 18.5KD。

优选的，血管内皮生长因子由121个、165个、189个和206个氨基酸混合组成，分子量为32～45KD。

本发明还提供了上述人干细胞因子皮肤修复液的制备方法，其技术方案为：包括以下步骤：

(1)、无菌采集初生儿脐带，采用组织块直接培养法进行培养；

(2)、弃组织块后，更换新鲜无血清培养基继续培养；

(3)、细胞融合90％后，收取上清液，再加入胰酶消化，离心，获得细胞；

(4)、将细胞接种于培养器中进行培养，加入无血清培养基继续传代；

(5)、收取的细胞培养液，离心，0.2μm孔径滤器过滤；

(6)、将上清液以分子量为指标进行筛选，获得由分子量为6.201KD的表皮生长因子、分子量为15.3KD的酸性成纤维细胞生长因子、分子量为16～ 18.5KD的碱性成纤维细胞生长因子和分子量为32～45KD的血管内皮生长因子构成的混合物。

优选的，还包括向步骤(6)的混合物中添加表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子，使得各成分的含量分别为50～75μg/L、15～20μg/L、15～20μg/L和4～6μg/L，混匀保存。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：针对生发细胞快速增殖的一系列细胞因子组合，按照合理的符合人体细胞生长并且加速生长的环境，可以达到快速修复受损皮肤，恢复皮肤质量。

本发明可应用于美容皮肤养护领域，还可以广泛应用于医学整形、烧伤创伤修复、伤口愈合等方面，具有很大的经济和社会效益，对于改善生活质量，提高人民皮肤健康指数也起到重要作用。

本发明所涉及的制备方法，工艺流程不复杂，具备大规模制备的条件。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

一种人干细胞因子皮肤修复液，由下述含量的成分构成：

上述人干细胞因子皮肤修复液的制备方法，包括以下步骤：

(1)无菌采集合格初生儿脐带，采用组织块直接培养法进行培养；

(2)弃组织块后，更换新鲜无血清培养基继续培养；

(3)细胞融合90％后，收取上清液，再加入胰酶消化，离心，获得细胞；

(4)将细胞接种于培养皿/瓶中进行培养，加入无血清培养基继续传代；

(5)收取的细胞培养液，离心，0.2μm孔径滤器过滤；

(6)将上清液以分子量和直径为指标进行筛选。

(7)添加细胞因子配方，混匀保存。

本制备方法在前六步所制得的产品，经滤膜过滤后将大于22-25KD的其他因子滤除，(血管内皮生长因子保留氨基酸数量少的两个)因大分子或多氨基酸有可能发生过敏反应，并且对于皮肤修复无直接或明显效果。

按照目前过滤条件，经滤过后，组织液中各因子成分的数值：

表皮生长因子：100-120μG/L

酸性成纤维细胞生长因子：38-59μG/L

碱性成纤维细胞生长因子：47-64μG/L

血管内皮生长因子：5-13μG/L。

与血清中含量对比，各因子在细胞修复液当中的浓度明显增多，但比值关系无明显改变。因此根据目前的过滤条件，还需要根据滤过后液体四种因子成分的损失量添加该四种因子。若在过滤条件合适的情况下，该过滤所得的四种因子含量应该与血清中含量相同，也就是说无需再添加。

本发明人干细胞因子皮肤修复液，是根据细胞培养过程中，细胞培养所处的液体环境有利于细胞生长这个理论而延伸的。众所周知，干细胞是一类具有自我复制，自我更新的原始细胞，具有向多种组织细胞分化的能力。而且干细胞相对于正常成体成熟细胞而言更加脆弱，在培养过程中，如果外界条件不适合细胞的生长复制，干细胞就会凋亡。本发明配制的修复因子液，就是针对适合细胞存活和增殖的细胞液外环境进行处理，将大分子蛋白和对皮肤生长修复无效的因子剔除，按照一定比例添加促进皮肤修复的一些因子，配制出对皮肤修复具有良好效果的一种液体，适合人类皮肤细胞等正常成熟细胞在内复制存活，且复制速度加快，细胞损伤修复加快。

实施例1

一种人干细胞因子皮肤修复液，由下述含量的成分构成：

制备方法具体操作如下：

一、脐带采集操作规程

1脐带采集前，采集人员要严格核对产妇的姓名、年龄、身份证信息，产妇是否有乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒感染疾病，符合保存标准者，方可进行脐带的采集。

2脐带采集瓶必须是经批准用于人组织采集的无菌容器，以减少细胞丢失和微生物污染的危险。

3检查采集瓶是否完整、密闭、保持无菌，外包装是否有破损，如有破损，不可以使用。

4所有采集脐带用的试剂和材料必须无菌。

5新生儿娩出后10秒钟内，在距新生儿脐部5-8厘米处用两把止血钳夹住，从两钳间剪断脐带后结扎。

6待胎盘娩出1分钟内，在靠近胎盘处结扎后剪断脐带，保证采集的脐带总长度不小于15厘米。

7脐带保持完整，无针眼及破损，尽量避免脐带与其他物品接触。

8用普通无菌管采集5mL脐血，用作病原学检测。

9将结扎的脐带用浸有0.9％生理盐水的无菌医用纱布擦试两遍，清除血液及胎粪等污物。

10将脐带放入一次性无菌采集瓶，拧紧瓶盖。

11将脐带采集瓶、抗凝管、采集登记表统一标识，并装入外包装袋。

12脐带采集后应暂时保存于4℃保温箱内，迅速运至实验室。

脐带接收规程

1脐带接收人员在接到脐带样品时应认真做好与运送人员的交接工作。

2样品接收人员应严格检查样品的外观、密闭性，包装是否合格，核对样品标签内容与运送来的样品是否相符。

3样品在运送过程中是否发生破损或变质，温度是否符合要求。

4样品接收人员接收样品后对样品进行初检，合格后将样品暂时保存于 4℃冰箱中并做收样记录。

二、实验室每日常规准备工作

1.每日臭氧消毒，自动定时设定在早上5点-6点。

2.每天8:00am，实验室值班人员开启实验室及超净工作台内紫外灯(不要开启风机及日光灯)，超净台及实验室紫外线消毒30分钟(开启紫外灯人员应按要求提前更衣、洗手、戴帽子、口罩，并二次换鞋后方能进入GMP实验室)。

3.每天8:30am，开启超净台及实验室风机及空调系统，关闭紫外线， 30分钟后方可进入层流实验室工作；

4.实验人员先换刷手服，注意先上后下，准备实验相关的无菌物品(烧杯、无菌高压用水等)；

5.实验人员洗手、二次换鞋，戴无菌口罩、帽子(不要把头发露在帽子外面)、穿无菌手术衣、戴无菌手套，方能进入GMP实验室；

6.每天下班前10分钟检查所有水电，二氧化碳气瓶等仪器设备正常后方可离开。

7.每日下午4点，计划第二天实验需要物品，报给仓库管理员，提前将实验所需耗材置于传递窗中，以便第二日早晨紫外灯照射消毒。

三、脐带间充质干细胞上清液制备流程

3.1、核对脐带基本信息

1实验人员应仔细检查样品的外包装是否合格、有无破损，脐带瓶是否密闭，有无液体外溢，采血管中的血样是否达到检测标准，核对样品标签内容样品是否相符。

2仔细核对脐带基本信息，包括：产妇姓名、婴儿性别、分娩方式、采集时间(年、月、日、时、分)、采集医院、脐带编号、非抗凝血采集情况，并记好实验记录。

3.2、脐带分离所需实验器材、试剂的准备

1 高压灭菌手术盒(包含单剪、镊子、组织剪、纱布)

2 高压灭菌玻璃吸管

3 消毒塑料管

4 真空泵

5 φ10cm无菌培养皿

6 一次性无菌吸管

7 50mL离心管

8 PBS、培养基、完全培养基(所有试剂应预先放入超净台中，恢复至室温方可使用)

3.3、原代培养操作规程

1接受脐带后，开据病毒检测化验单(乙肝五项、巨细胞病毒、丙肝、梅毒、艾滋病)备用；核对无误后，将化验单递交质控组。化验单的开据，要求字迹工整清楚。

2连接抽虑装置，塑料软管一端连接真空泵，另一端连接消毒乳胶管， 75％酒精喷拭一端并放入超净工作台，备用。

3在超净台内点燃酒精灯，打开无菌手术盒，取出灭菌纱布，将无菌器械摆放在纱布上，玻璃吸管与乳胶管连接，放于纱布上备用。

4仔细检查脐带采集瓶外包装有无破损及渗漏，用75％酒精消毒脐带采集瓶外表面，置于超净工作台内。

5在超净台内打开瓶盖，仔细观察脐带的透亮度及颜色，培养基是否浑浊、异味，如培养基浑浊、异味或疑似污染，应留样检菌并采集照片备档，同时汇报给实验室负责人，做好不合格样品登记。

6弃脐带运输液，用含PBS轻轻冲洗脐带样本2-3次。

7弃尽PBS，用不锈钢镊子将脐带样本从脐带瓶中取出，置于φ10cm 无菌培养皿中，加入PBS，以没过脐带为宜，仔细检查脐带样本长短、是否结扎、有无破损、有无水肿等情况，并详细登记；假如遇到脐带破损、过短等异常情况，请做好记录。

8将脐带的两端结扎处剪去，选取光亮度好、无破损、无水肿区域的脐带，剪成1-2cm左右若干小段。

9用PBS仔细反复清洗脐带外表面的杂质及污染物等，洗净残留在血管中的血液。

10从冰箱取出冰块，75％酒精喷拭后，放入超净台，向φ10cm培养皿中加入6-8mL培养基，将皿置于冰块上，用脐带组织专用剪尽快(30min之内)将脐带剪切至1mm³小块，以剪成泡沫肉糜状为宜。

11将组织块收集入50mL离心管中，补充LG-DMEM至40mL离心，4℃， 850g/min，10min。

12弃上清，将组织块沉淀用适量完全培养基悬起，将大吸管剪至适当长度，轻轻将组织块(每φ10cm培养皿约3.5mL组织块)接种于直径φ10cm 的培养皿中，均匀铺设到皿底，同时标记产妇姓名及接种日期，置于37℃、 5％CO₂培养箱培养(24h内，尽量不要晃动培养皿)。

13次日，显微镜下仔细观察组织块，是否存在污染迹象，无异常则补液。每一个φ10cm培养皿轻轻加入4-5mL新鲜完全培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。

14第四天，显微镜下仔细观察培养的组织块是否存在污染迹象及细胞生长增殖情况，无污染则半量换液，每个φ10cm培养皿中用小习吸管轻轻吸取2-3mL上清液弃去，以剩余培养基刚没过培养皿底部为宜，再轻轻补加 4-5mL完全培养基。以后，每隔3天，显微镜先仔细观察细胞的生长、增殖情况，是否存在污染迹象，如无污染，则半量换液，按弃三加四步骤，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，注意要轻拿轻放。

15第十天，60％-70％原代培养的脐带组织块，可见到明显的细胞克隆形成(细胞克隆达70％，且≥3处)，弃去组织块(轻轻晃动培养皿，将组织块从培养皿底部晃动起来，把组织块连同培养基完全培养基全部弃掉)，用 LG-DMEM冲洗两遍，每皿加入8mL完全培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；如细胞克隆形成较小，或者有些皿观察不到细胞克隆，则继续半量换液，放置于37℃、5％CO₂培养箱培养，以后每天观察细胞生长、增殖情况，当观察到明显细胞克隆形成(细胞克隆达70％，且≥3处)，按步骤15方法弃去组织块。

16弃组织块后，细胞继续培养3-4天，显微镜下观察细胞生长、增殖情况，若细胞增殖缓慢，半量换液，当细胞克隆数量增多，克隆内细胞融合达80％-90％，可以选择细胞传代或者冻存。

3.4、细胞上清液收获操作规程

实验所需器材：酒精灯、小吸管、大吸管、50mL离心管、15mL离心管、φ35mm培养皿、φ10cm培养皿、φ15cm培养皿、175cm²培养瓶、记号笔、镊子、酒精棉球、50mL试管架、废液缸、纱布、需O₂培养瓶、上清液专用保存瓶。

实验所需试剂：胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS 1X)、0.4％台盼蓝、完全培养基

1.打开酒精灯，备好所有实验用品。

2.细胞处理前收取所有细胞培养皿/瓶中上清液吸取至上清液专用保存器皿中，从中取少量上清液用于各项检测，包括(内毒素检测、细菌检测、支原体检测)然后转至-80度冰箱保存。

3.剩余细胞继续传代，PBS冲洗2遍，胰蛋白酶消化后，加入新鲜完全培养基吹打细胞，收取至50mL离心管中离心。

4.离心后弃除上清，重悬适量完全培养基，显微镜下细胞计数、活力，接种至培养皿/瓶中，再加入一定量完全培养基，放置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

5.后续传代收取上清液步骤如上。

3.5、上清液处理

1.每次传代前收取细胞上清液，离心。

2.用naLgene 500mL pes膜0.2μm孔径过滤器过滤后，收集至 naLgene无菌500mL专用瓶中。

3.添加细胞因子配方、混匀、封口。

4.转-80度冰箱保存。

上述制备操作过程中，所需实验主要仪器、耗材、试剂，分别简介如下：

1研究级倒置显微镜(TX51，奥林巴斯(中国)有限公司)

2临床级正置显微镜(CX22，奥林巴斯(中国)有限公司)

3二氧化碳培养箱(311，赛默飞世尔科技公司)

4干燥箱(GZX-9140MBE，上海博讯干燥箱公司)

5电热恒温水槽(DKB-600B，上海培因实验仪器有限公司)

6超纯水机(cascada IX，美国PALL公司)

7灭菌锅(YXQ-LS-75SII，上海博讯干燥箱公司)

8 φ10cm无菌培养皿(153066，丹麦NUNC公司)

9 10mL一次性注射器(301945，碧迪医疗器械(上海)有限公司)

10 50m锥形离心管(339652，丹麦NUNC公司)

11低速大容量冷冻离心机(美国thermo公司st16r型号)

12无血清培养基(04-448Q，瑞士龙沙集团)

13 0.4％台盼蓝溶液(RS0003，友康基业生物科技(北京)有限公司)

14 PBS(SH30256.01B，美国HYcLone公司)

16电动移液枪(美国THERMO公司，S1型号)

16胰酶(25200-056 Gibco 0.25％trypsin-EDTA(1X)PhenoL Red胰酶)

实施例2

一种人干细胞因子皮肤修复液，由下述含量的成分构成：

制备方法具体操作如实施例1。

实施例3

一种人干细胞因子皮肤修复液，由下述含量的成分构成：

制备方法具体操作如实施例1。

临床效果验证：

自2012年3月-2014年3月，共应用上述人干细胞因子皮肤修复液治疗 200例产后陈旧性妊娠纹，致病原因多为妊娠期受荷尔蒙影响，腹部的膨隆使皮肤的弹力纤维与胶原纤维因外力牵拉而受到不同程度的损伤或断裂，早期常常为暗红色或紫红色，稳定以后妊娠纹便呈现出一种白色或浅白色的皮肤损害。

试验例：女性200例，年龄26岁至40岁，平均年龄31岁。

治疗方法：定量取修复因子液，分别均匀涂于需修复部位，并按摩3-5min，一日两次为宜，开启后应放置冰箱冷藏，尽量于十日内用完。

结果：

(1)半数患者在接受因子实施例1人干细胞因子皮肤修复液治疗后获成功，自治疗后妊娠纹几近消失。

第1-6天，快速渗透，深层滋养期，多种活性因子迅速被吸收，促进细胞再生，加快清理枯死细胞使妊娠纹颜色变淡。

第15天，补充胶原，纹路减少期，妊娠纹颜色变淡变浅，皮肤白皙紧致，妊娠纹缩小40％以上。

第30天，紧致平滑，色素变浅期，促进细胞胶原质合成，妊娠纹减少 80％，只剩下浅浅痕迹。

第45天，愈合纹理，弹性紧致期。一周期后，皮肤几乎恢复如前，腹部皮肤变得平滑紧致有弹性，妊娠纹消失。

(2)四分之一患者在接受实施例2人干细胞因子皮肤修复液治疗后，效果显著，妊娠纹消失。

肌肤粗糙，妊娠纹呈深红色；使用2周后，腹部肌肤开始收紧，妊娠纹、瘢痕组织颜色变浅，纹痕开始变小、变细；使用4周后，妊娠纹慢慢淡化，大部分纹痕消失不见，腹部肌肤紧滑；使用6周后，妊娠纹基本消失，瘢痕组织明显变小，皮肤变得光滑、弹性。

(3)四分之一患者在接受实施例3人干细胞因子皮肤修复液治疗后，效果明显，妊娠纹几不可见。

妊娠纹多为白色纹路，肌肤弹性差；使用3周后，肌肤状态明显改善，纹路变细；使用6周后，妊娠纹淡化明显，腹围变小；使用9周后，妊娠纹缩小70％以上，腹部肌肤紧滑，有弹性。

结论：应用本发明人干细胞因子皮肤修复液治疗妊娠纹是一种使用方便，安全，操作简单，患者痛苦少的治疗方法，值得推广应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种人干细胞因子皮肤修复液，其特征在于：由下述含量的成分构成：

表皮生长因子由53个氨基酸组成，分子量为6.201KD；

酸性成纤维细胞生长因子由147个氨基酸组成，分子量为15.3KD；

碱性成纤维细胞生长因子由155个氨基酸组成，分子量为16～18.5KD；

血管内皮生长因子由121个、165个、189个和206个氨基酸混合组成，分子量为32～45KD。

2.如权利要求1所述人干细胞因子皮肤修复液，其特征在于：血管内皮生长因子的含量为5μg/L。

3.一种如权利要求1所述人干细胞因子皮肤修复液的制备方法，包括以下步骤：

(1)、无菌采集初生儿脐带，采用组织块直接培养法进行培养；

(2)、弃组织块后，更换新鲜无血清培养基继续培养；

(3)、细胞融合90％后，收取上清液，再加入胰酶消化，离心，获得细胞；

(4)、将细胞接种于培养器中进行培养，加入无血清培养基继续传代；

(5)、收取的细胞培养液，离心，0.2μm孔径滤器过滤；

(6)、将上清液以分子量为指标进行筛选，获得由分子量为6.201KD的表皮生长因子、分子量为15.3KD的酸性成纤维细胞生长因子、分子量为16～18.5KD的碱性成纤维细胞生长因子和分子量为32～45KD的血管内皮生长因子构成的混合物。

4.如权利要求3所述制备方法，其特征在于：还包括向步骤(6)的混合物中添加表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子，使得各成分的含量分别为50～75μg/L、15～20μg/L、15～20μg/L和4～6μg/L，混匀保存。