CN110623917A - 一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶 - Google Patents

一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学美容及皮肤修复技术领域，公开了一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶，所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶由干细胞复合因子和透明质酸钠组成。本发明经过组织块培养法获得人体免疫源性最低、细胞分化潜能最强的脐带间充质干细胞，纯化、扩大培养，在细胞分裂旺盛时期(约长满培养瓶70％～80％面积)收集细胞培养上清液，经过浓缩、过滤、蛋白含量测定、质检，得到干细胞复合因子溶液。然后将干细胞复合因子溶液和透明质酸钠混合均匀，制备成包载干细胞复合因子的透明质酸钠凝胶，可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。

Description

一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶
技术领域
本发明属于医学美容及皮肤修复技术领域，尤其涉及一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶
背景技术
目前，最接近的现有技术：干细胞是一种具有多向分化潜能及无限自我更新复制能力的细胞，在一定条件下，可分化为特定的组织。干细胞在生长、增殖、分化过程中会向胞外分泌促进细胞生长及调控周围环境的生长因子、细胞因子、调节肽、胶原蛋白等复合因子活性物质。复合因子中还有含有多种细胞特异性蛋白、脂类物质及核酸物质，能够释放信号分子并将其传递给其他细胞，从而刺激皮肤组织进行修复调节。
生长因子主要有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)，角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)等。VEGF促进血管内皮细胞增殖、血管生成，增加血管通透性，改善皮肤微循环，有效清除一些代谢障碍的细胞，如胞浆中导致各种皮肤黑斑的过氧化脂质沉着，从而使细胞中各种有害代谢产物不容易积累形成暗疮、黑斑、黄褐斑等；EGF通过促进皮肤组织细胞增殖和生长，促使细胞新陈代谢，使皮肤细胞年轻化、抗衰老抗氧化，增加皮肤弹性和光泽；FGF能够改善细胞生长的微环境，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，使肌肤富有弹性，使皮肤处于滑嫩的状态；KGF可激活促分裂原蛋白激酶和纤溶酶原激活物活性，修复皮肤角质层，可防治红血丝形成并加速受损肌肤修复，增加皮肤免疫力和抵抗力，使肌肤恢复健康亮白状态；TGF可诱导、趋化成纤维细胞使其有利于组织修复过程的进行，同时，TGF可刺激血管内皮细胞增殖，加速血管形成，并促进胶原纤维连接蛋白、糖蛋白、糖胺聚糖和透明质酸等物质的合成，在修复皮肤的同时，令肌肤变得红润光滑、自然健康；TGF对基质降解酶的产生也有抑制作用，使基质和细胞的结合加强，减缓皮肤老化，持久保持弹性的肌肤状态。
细胞因子主要有白细胞介素(interleukin，IL)，肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)，巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)，粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating Factor，G-CSF)，落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)等，细胞因子的作用主要有1)参与血管生成；2)炎症、免疫调节、细胞凋亡、增殖和分化；2)调节代谢、防御反应和组织分化。胶原蛋白主要有I，II，III，IV型胶原蛋白，细胞分泌的胶原蛋白可以促进皮肤活性细胞生成，增加皮肤紧致度。同时还可以修复肌肤凹陷损伤，防止毛孔粗大和皱纹产生。
这些干细胞复合因子在液态常温中保存活性很容易丧失，冻干粉是其最佳的保存手段，但是在从培养上清液到冻干粉的制备过程不但会造成这些复合因子活性的丧失，又很难保证无菌。而且这些有活性的复合因子是水溶性的，没有一定的粘稠度，在使用过程中很容易流失从而降低求美者使用效果。所以，我们将干细胞复合因子和透明质酸钠按照比例混合制备成凝胶，然后保存方式为-20℃。即保证了细胞因子的活性，又能收到很好的补水、美白效果。
透明质酸钠广泛存在于自然界中，是一种直链大分子多糖，没有物种差异，具有良好的生物相容性非免疫原性、生物可降解性。其平均分子量可用粘度法、凝胶色谱法等方法进行测定。透明质酸钠在医药、美容领域的应用非常广泛，大分子量的透明质酸钠(相对分子量Mr≥2x106)具有较好的保湿性、粘弹性、润滑、抑制炎性反应等功能，可用于眼科手术、骨关节炎注射制剂。Mr(1～2)x106的HA具有良好的保湿性、润滑性及药物缓释作用，广泛用于化妆品、滴眼液和皮肤烧伤愈合及术后防粘连；Mr(1～8)x104的HA属低分子，口服能被肠道吸收，补充机体HA的不足，发挥保健和美容养颜的功效。HA寡聚糖(Mr<1x104)具有抗肿瘤、促进骨和血管生成作用，具有潜在的医学应用前景。
专利200910067634.8《一种用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法》中干细胞的培养方法是用α-MEM培养基，加入10％的胎牛血清。干细胞分泌因子制备中用了胎牛血清，引入了异源性成分，增加了过敏几率及风险。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法的干细胞分泌因子制备中引入胎牛血清，有异源性成分，增加了过敏几率及风险。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶。
本发明是这样实现的，一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶由干细胞复合因子溶液和透明质酸钠组成；按照质量体积比透明质酸钠的添加比例为干细胞复合因子溶液的0.1％～0.5％。
本发明的另一目的在于提供一种所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法包括以下步骤：
第一步，经过组织块培养法获得脐带间充质干细胞，纯化、扩大培养；收集细胞培养上清液，经过浓缩、过滤、蛋白含量测定、质检，得到干细胞复合因子溶液；
第二步，透明质酸钠的添加比例为0.1％～0.5％，然后将干细胞复合因子溶液和透明质酸钠混合均匀，制备成包载干细胞复合因子的透明质酸钠凝胶。
进一步，所述干细胞复合因子的制备方法包括：
步骤一，脐带间充质干细胞的原代分离与培养；
步骤二，脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定；
步骤三，细胞因子生产与检测。
进一步，所述步骤一具体包括：
1)将脐带组织放置在含脐带采集液的专用脐带无菌采集瓶中，密封保存；使用4℃恒温保温箱，送回无菌实验室；
2)在生物安全柜内，将脐带倒入150mm直径培养皿中，用生理盐水清洗3-5次；用长柄手术剪将脐带剪成长3-4cm的小段，用生理盐水重复清洗3-5次，去除血渍；
3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用带齿弯镊撕下两条动脉，用眼科镊将位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即华通氏胶取出；用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2-3次；
4)将获得的华通氏胶用眼科弯剪将胶体剪碎，剪成1mm3大小，接种于150mm直径无菌培养皿中，组织块儿间隔约2mm，组织贴好后将培养皿小心放入培养箱中30min，随后取出，加入无血清间充质干细胞培养基，加入量铺满皿底即可；
5)组织贴壁后，第2天进行补液，以后每2～3d换液1次；
6)在倒置显微镜下观察，细胞融合达到60％后，去除组织块，用0.25％的胰酶消化，按1∶2～1∶3的比例传代，继续扩增培养。
进一步，其特征在于，所述步骤二具体包括：
1)取P5代以内细胞，胰酶消化计数后，按1×105-1×106/管的密度接种至7个1.5mlEP管中，每管加入1ml PBS，混匀细胞悬液，1000rpm/min，离心5min。离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl的PBS重悬细胞，并在避光条件下分别加入以下流式抗体5μl：PE Anti-Human HLA-DR、PE anti-human CD105、FITC Anti-Human CD90、FITC anti-human CD34、FITC anti-human CD45、FITC Anti-Human 29；
2)抗体加入后用200μl微量移液器混匀，4℃避光孵育30min；
3)孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次，每次用1ml；1000rpm/min，离心5min；离心后用500μl PBS重悬细胞后上流式仪检测。
进一步，所述步骤三具体包括：
1)待细胞融合度达到80％后，收集P5代以内(包含P5代)脐带间充质干细胞的培养上清，培养皿的细胞则继续传代，直至传到P5代，细胞冻存；
2)将收集的干细胞培养上清液经过0.22μm的微孔滤膜过滤除去细胞碎片；
3)在过滤收集的培养上清中加入透明质酸钠，透明质酸钠浓度为0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％；
4)配制完成的干细胞复合因子凝胶，进行检测；
5)外观检测：合格干细胞复合因子凝胶应澄清、无浑浊；
6)pH值检测：合格干细胞复合因子凝胶的pH值应在5.0～8.5；
7)微生物检测，标准为：细菌：阴性，真菌：阴性，支原体：阴性，内毒素：≤0.5EU；
8)蛋白浓度检测，采用BCA蛋白浓度测定法对细胞因子总蛋白浓度进行测定；标准为：蛋白浓度≥1mg/ml；经过检测，培养上清蛋白浓度为1.8mg/ml。
进一步，所述细菌检测方法：将培养基复温至常温25℃，然后划线接种于培养基琼脂面上；置于培养箱，37℃恒温箱培养18h至48h后观察菌落形态；
所述真菌检测方法：将培养基复温至常温25℃，然后用无菌吸管吸取一定量后移至平皿，缓慢释放，释放的同时将吸管作“Z”字形移动接种于培养基琼脂面上；置20～25℃恒温培养箱中培养24h～48h后，观察结果；
所述支原体检测方法具体操作步骤如下：
(1)从组份1、组份2中取出所需数量培养基、药敏板复温至室温、编号；
(2)与阴性对照孔加入100μl解脲/人型支原体培养基；阴性对照孔是A1孔；
(3)接种标本：棉拭子插入培养基中充分振洗并在瓶壁挤干拭子；液态标本取150μl～200μl；已知支原体阳性培养液取50μl；
(4)将已接种的培养基按100μl/孔的接种量接入药敏板除A1孔以外的29个孔中；
(5)各检测孔滴入1滴液体石蜡油；
(6)培养基药敏板置于37℃恒温培养箱中培养24h和48h对解脲脲原体。人型支原体分别观察记录结果；
(7)填写结果报告签；
(8)结果判断。
进一步，所述内毒素检测方法包括：
(1)根据赏试剂灵敏度的标示值λ，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡棍合器上混匀15分钟；然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟；
(2)取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加人0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照；将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃士1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟；
(3)将试管从恒温器中轻轻取出，倒转180°；当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效；按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值λc；
λc＝antilg(∑X/4)，式中X为反应终点浓度的对数值lg，反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；当λc在0.5λ～2λ时，方用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度；
所述干扰试验：制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数MVD的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
本发明的另一目的在于提供一种由所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶制备的医学美容药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶制备的皮肤修复药剂。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明经过组织块培养法获得人体免疫源性最低、细胞分化潜能最强的脐带间充质干细胞，纯化、扩大培养，在细胞分裂旺盛时期(约长满培养瓶70％～80％面积)收集细胞培养上清液，经过浓缩、过滤、蛋白含量测定、质检，得到干细胞复合因子。然后将干细胞复合因子和透明质酸钠混合均匀，制备成包载干细胞复合因子的透明质酸钠凝胶，可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。
本发明没有使用胎牛血清，降低了过敏风险。现有脐带间充质干细胞的培养体系中没有胎牛血清的引入，从原代到传到培养过程中全程使用无动物源性血清替代物。本发明无异源性成分的引入，降低了过敏几率和风险。
附图说明
图1是本发明实施例提供的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的贴壁生长的人脐带间充质干细胞(40×)示意图。可见人脐带间充质干细胞呈贴壁生长，呈长梭形，成纤维细胞状。
图3是本发明实施例提供的贴壁生长的人脐带间充质干细胞(100×)示意图。可见人脐带间充质干细胞呈贴壁生长，呈长梭形，成纤维细胞状。
图4是本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞细胞表型示意图。结果显示，人脐带间充质干细胞CD90，CD29，CD105呈阳性表达，CD34，CD45呈阴性表达，不表达HLA-DR。
图5是本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞培养上清细菌检测结果示意图。普通细菌培养后，菌落形态典型。实验结果表明：显示人脐带间充质干细胞培养上清接种到血琼脂培养基上培养48h后无细菌生长。
图6是本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞培养上清真菌检测结果示意图。普通真菌培养后，菌落形态典型。检测结果显示：人脐带间充质干细胞培养上清接种到血琼脂培养基上培养48h后无真菌生长。
图7是本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞培养上清支原体检测结果示意图；检测结果显示：对照孔、鉴定孔均显示无支原体生长，为阴性。药敏部分均为：阴性。
图8是本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞培养上清内毒素检测结果示意图。检测结果显示：检测样本均无内毒素检出。
图9是本发明实施例提供的实施例1干细胞复合因子凝胶使用前效果图。
图10是本发明实施例提供的实施例1干细胞复合因子凝胶使用后一个月效果图。
图11是本发明实施例提供的实施例2干细胞复合因子凝胶使用前效果图。
图12是本发明实施例提供的实施例2干细胞复合因子凝胶使用后一个月效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶由干细胞复合因子和透明质酸钠组成。按照质量体积比透明质酸钠的添加比例为干细胞复合因子溶液的0.1％～0.5％。
本发明使用的透明质酸钠购自华熙福瑞达生物医药有限公司，批号18102611，特性粘数是2.42m3/kg。单纯的透明质酸钠水光针效果维持时间短，配合干细胞复合因子，可以达到即时效果和长时效果的结合。
如图1所示，本发明实施例提供的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法包括以下步骤：
S101：经过组织块培养法获得人体免疫源性最低、细胞分化潜能最强的脐带间充质干细胞，纯化、扩大培养，在细胞分裂旺盛时期(约长满培养瓶70％～80％面积)收集细胞培养上清液，经过浓缩、过滤、蛋白含量测定、质检，得到干细胞复合因子溶液；
S102：然后将干细胞复合因子溶液和透明质酸钠混合均匀，制备成包载干细胞复合因子的透明质酸钠凝胶。
本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞的原代分离与培养方法包括：
1)将来源清晰、检测合格(产妇各项传染性疾病检测合格)的脐带组织放置在含脐带采集液的专用脐带无菌采集瓶中，密封保存。使用4℃恒温保温箱，送回无菌实验室。
2)在生物安全柜内，将脐带倒入150mm直径培养皿中，用生理盐水清洗3-5次。然后用长柄手术剪将脐带剪成长3-4cm的小段，用生理盐水重复清洗3-5次，去除血渍。
3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用带齿弯镊撕下两条动脉，用眼科镊将位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即华通氏胶取出。用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2-3次。
4)将获得的华通氏胶用眼科弯剪将胶体剪碎，约剪成1mm3大小，接种于150mm直径无菌培养皿中，组织块儿间隔约2mm，组织贴好后将培养皿小心放入培养箱中约30min，随后取出，小心加入无血清间充质干细胞培养基，加入量铺满皿底即可，切记加液动作轻柔，勿将组织块冲起。
5)组织贴壁后，第2天进行补液，以后每2～3d换液1次。
6)在倒置显微镜下观察，细胞融合达到60％后，去除组织块，用0.25％的胰酶消化，按1∶2～1∶3的比例传代，继续扩增培养。
本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定
1)取P5代以内细胞，胰酶消化计数后，按1×105-1×106/管的密度接种至7个1.5mlEP管中，每管加入1ml PBS，混匀细胞悬液，1000rpm/min，离心5min。离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl的PBS重悬细胞，并在避光条件下分别加入以下流式抗体5μl：PE Anti-Human HLA-DR、PE anti-human CD105、FITC Anti-Human CD90、FITC anti-human CD34、FITC anti-human CD45、FITC Anti-Human 29。
2)抗体加入后用200μl微量移液器轻轻混匀，注意不要产生气泡，4℃避光孵育30min。
3)孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次，每次用1ml。1000rpm/min，离心5min。离心后用500μl PBS重悬细胞后上流式仪检测。
本发明实施例提供的细胞因子生产与检测
1)待细胞融合度达到80％后，收集P5代以内(包载P5代)脐带间充质干细胞的培养上清，培养皿的细胞则继续传代，直至传到P5代，细胞冻存；
2)将收集的干细胞培养上清液经过0.22μm的微孔滤膜过滤除去细胞碎片；
3)在过滤收集的培养上清中加入透明质酸钠，透明质酸钠浓度为0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％；
4)配制完成的干细胞复合因子凝胶，送质量部门进行检测；
5)外观检测：合格干细胞复合因子凝胶应澄清、无浑浊。
6)pH值检测：合格干细胞复合因子凝胶的pH值应在5.0～8.5之间；
7)微生物检测，依据《中华人民共和国药典》2015版第三部中的方法检测。标准为：细菌：阴性，真菌：阴性，支原体：阴性，内毒素：≤0.5EU；
细菌检测：将培养基复温至常温25℃，然后划线接种于培养基琼脂面上；置于培养箱，37℃恒温箱培养18h至48h后观察菌落形态。
真菌检测：将培养基复温至常温25℃，然后用无菌吸管吸取一定量后移至平皿，缓慢释放，释放的同时将吸管作“Z”字形移动接种于培养基琼脂面上；置20～25℃恒温培养箱中培养24h～48h后，观察结果；
支原体检测：具体操作步骤如下：
使用前应仔细核对组份1、组分2的批号，不同批号之间的各组分不可互换使用。
(1)从组份1、组份2中取出所需数量培养基、药敏板复温至室温、编号；
(2)与阴性对照孔(A1孔)加入100μl解脲/人型支原体培养基；
(3)接种标本：棉拭子插入培养基中充分振洗并在瓶壁挤干拭子；液态标本取150μl～200μl；已知支原体阳性培养液(如PCR检测阳性后进行药敏试验或支原体培养阳性后进行药敏试验用培养液)取50μl；
(4)将已接种的培养基按100μl/孔的接种量接入药敏板除A1孔以外的29个孔中；
(5)各检测孔滴入1滴液体石蜡油；
(6)培养基药敏板置于37℃恒温培养箱中培养24h和48h对解脲脲原体。人型支原体分别观察记录结果；
(7)填写结果报告签。
(8)结果判断：判断标准见表4。
表4支原体检测结果判定表
内毒素检测：
(1)根据赏试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡棍合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
(2)取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加人0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃士1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
(3)将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效.按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。
λc＝antilg(∑X/4)，式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ～2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验：按表5制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表5凝胶法干扰试验溶液的制备
注：A为供试品溶液；B为干扰试剂系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。
8)蛋白浓度检测，采用BCA蛋白浓度测定法对细胞因子总蛋白浓度进行测定。标准为：蛋白浓度≥1mg/ml；经过检测，培养上清蛋白浓度为1.8mg/ml。
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
如图7所示，支原体检测结果显示：对照孔、鉴定孔均显示无支原体生长，为阴性。药敏部分均为：阴性。如图8所示检测样本均无内毒素检出。
下面结合具体实施例对本发明的技术效果作详细的描述。
本发明的干细胞复合因子凝胶中的透明质酸钠浓度为0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％。凝胶制备完成后，按照下表中的指标进行检测：
实施例1：干细胞复合因子凝胶的试用实例
市场上选取20例有不同面部问题的人群，将干细胞复合因子凝胶涂抹在受试者面部，用滚针帮助其跟踪受试人员面部情况3个月。
试用本发明的产品的人群面部均有改善。改善效果分别表现在以下几个方面：面部细小皱纹减少、红血丝淡化、皮脂分泌减少、色斑减少、皮肤白皙清透等。
实施例2
李女士，60岁，平时进行简单的面部基础护理，随着年龄增增大，面部皱纹加深严重，皮肤干燥，松弛下垂，无光泽。干细胞复合因子凝胶试用后，皮肤透亮，斑点淡化，红润饱满，皱纹减轻。
实施例3
王女士，28岁，平时进行简单的面部基础护理，面部斑点较多，肤色无光泽。干细胞复合因子凝胶试用后，皮肤透亮细腻，斑点淡化，红润饱满。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包载在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶由干细胞复合因子和透明质酸钠组成；按照质量体积比透明质酸钠的添加比例为干细胞复合因子溶液的0.1％～0.5％。
2.一种如权利要求1所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法包括以下步骤：
第一步，经过组织块培养法获得脐带间充质干细胞，纯化、扩大培养；收集细胞培养上清液，经过浓缩、过滤、蛋白含量测定、质检，得到干细胞复合因子溶液；
第二步，然后将干细胞复合因子溶液和透明质酸钠混合均匀，制备成包载干细胞复合因子的透明质酸钠凝胶。
3.如权利要求2所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述干细胞复合因子的制备方法包括：
步骤一，脐带间充质干细胞的原代分离与培养；
步骤二，脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定；
步骤三，细胞因子生产与检测。
4.如权利要求3所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：
1)将脐带组织放置在含脐带采集液的专用脐带无菌采集瓶中，密封保存；使用4℃恒温保温箱，送回无菌实验室；
2)在生物安全柜内，将脐带倒入150mm直径培养皿中，用生理盐水清洗3-5次；用长柄手术剪将脐带剪成长3-4cm的小段，用生理盐水重复清洗3-5次，去除血渍；
3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用带齿弯镊撕下两条动脉，用眼科镊将位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即华通氏胶取出；用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2-3次；
4)将获得的华通氏胶用眼科弯剪将胶体剪碎，剪成1mm3大小，接种于150mm直径无菌培养皿中，组织块儿间隔约2mm，组织贴好后将培养皿小心放入培养箱中30min，随后取出，加入无血清间充质干细胞培养基，加入量铺满皿底即可；
5)组织贴壁后，第2天进行补液，以后每2～3d换液1次；
6)在倒置显微镜下观察，细胞融合达到60％后，去除组织块，用0.25％的胰酶消化，按1∶3～1∶4的比例传代，继续扩增培养。
5.如权利要求3所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤具体包括：
1)取P5代以内细胞，胰酶消化计数后，按1×105-1×106/管的密度接种至7个1.5ml EP管中，每管加入1ml PBS，混匀细胞悬液，1000rpm/min，离心5min；离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl的PBS重悬细胞，并在避光条件下分别加入以下流式抗体5μl：PE Anti-HumanHLA-DR、PE anti-human CD105、FITC Anti-Human CD90、FITC anti-human CD34、FITCanti-human CD45、FITC Anti-Human 29；
2)抗体加入后用200μl微量移液器混匀，4℃避光孵育30min；
3)孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次，每次用1ml；1000rpm/min，离心5min；离心后用500μl PBS重悬细胞后上流式仪检测。
6.如权利要求3所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：
1)待细胞融合度达到80％后，收集P5代以内脐带间充质干细胞的培养上清，培养皿的细胞则继续传代，直至传到P5代，细胞冻存；
2)将收集的干细胞培养上清液经过0.22μm的微孔滤膜过滤除去细胞碎片；
3)在过滤收集的培养上清中加入透明质酸钠，透明质酸钠浓度为0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％；
4)配制完成的干细胞复合因子凝胶，进行检测；
5)外观检测：合格干细胞复合因子凝胶应澄清、无浑浊；
6)pH值检测：合格干细胞复合因子凝胶的pH值应在5.0～8.5；
7)微生物检测，标准为：细菌：阴性，真菌：阴性，支原体：阴性，内毒素：≤0.5EU；
8)蛋白浓度检测，采用BCA蛋白浓度测定法对细胞因子总蛋白浓度进行测定；标准为：蛋白浓度≥1mg/ml；经过检测，培养上清蛋白浓度为1.8mg/ml。
7.如权利要求6所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述细菌检测方法：将培养基复温至常温25℃，然后划线接种于培养基琼脂面上；置于培养箱，37℃恒温箱培养18h至48h后观察菌落形态；
所述真菌检测方法：将培养基复温至常温25℃，然后用无菌吸管吸取一定量后移至平皿，缓慢释放，释放的同时将吸管作“Z”字形移动接种于培养基琼脂面上；置20～25℃恒温培养箱中培养24h～48h后，观察结果；
所述支原体检测方法具体操作步骤如下：
(1)从组份1、组份2中取出所需数量培养基、药敏板复温至室温、编号；
(2)与阴性对照孔加入100μl解脲/人型支原体培养基；阴性对照孔是A1孔；
(3)接种标本：棉拭子插入培养基中充分振洗并在瓶壁挤干拭子；液态标本取150μl～200μl；已知支原体阳性培养液取50μl；
(4)将已接种的培养基按100μl/孔的接种量接入药敏板除A1孔以外的29个孔中；
(5)各检测孔滴入1滴液体石蜡油；
(6)培养基药敏板置于37℃恒温培养箱中培养24h和48h对解脲脲原体；人型支原体分别观察记录结果；
(7)填写结果报告签；
(8)结果判断。
8.如权利要求6所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述内毒素检测方法包括：
(1)根据赏试剂灵敏度的标示值λ，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡棍合器上混匀15分钟；然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟；
(2)取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加人0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照；将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃士1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟；
(3)将试管从恒温器中轻轻取出，倒转180°；当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效；按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值λc；
λc＝antilg(∑X/4)，式中X为反应终点浓度的对数值lg，反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；当λc在0.5λ～2λ时，方用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度；
所述干扰试验：制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数MVD的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
9.一种由权利要求1所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶制备的医学美容药物。
10.一种由权利要求1所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶制备的皮肤修复药剂。
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