CN108753708B - 一种干细胞活性因子冻干粉的制备方法 - Google Patents

一种干细胞活性因子冻干粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞技术研究领域，提供了一种人间充质干细胞分泌的干细胞活性因子冻干粉的制备方法。所提供的人脂肪干细胞原料来源充足，提取安全方便，无任何不良反应，使用安全可靠。其制备过程具体包括以下步骤：(1)外源因子检测；(2)脂肪干细胞的原代分离、培养和传代；(3)间充质干细胞的鉴定；(4)上清液的收集；(5)冻干粉的制备；(6)对上述上清液和冻干粉的干细胞活性因子进行检测；(7)溶媒的配制和灌装。本发明制备的冻干粉相较于上清液易于保存，运输，且有效的保存了因子的活性，能够应用于美容行业，细胞因子含量高，冻干粉中水分含量低从而易于保存，烫伤后采用本发明中制得的冻干粉，加入生物多糖焦胶、胶原蛋白、叶酸、无菌超纯水制成的组合物去涂抹伤口时伤口的愈合率高。

Description

一种干细胞活性因子冻干粉的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术药物领域，涉及干细胞技术研究领域，具体涉及一种人脂肪间充质干细胞分泌的干细胞活性因子的制备方法和用途。
背景技术
近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。
干细胞在美容中的应用，最早是干细胞在整形外科中的运用，它是目前研究较多的一种干细胞美容技术。而在整形外科中应用得较多的干细胞种类主要亦是人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞等。
脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。脂肪间质干细胞在组织工程和细胞治疗方面具有广泛的应用前景，吸引了越来越多研究者的关注。
脂肪来源的间充质干细胞可以分泌200多种细胞活性因子，如表皮生长因子(EGF)，角质细胞生长因子(KGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子(bFGF)，血管内皮生长因子(VFGF)等，这些细胞分泌的活性因子不仅种类繁多，且十分均衡，可以修复皮肤纤维组织的生长，促进皮下胶原蛋白的分泌与合成，还可以促进皮下血管新生成，分泌蛋白质，促进受损肌肤深层细胞组织愈合，淡化疤痕和痘印。
将细胞因子添加到美容化妆品，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，越来越受到人们的关注。但是利用培养基进行常规培养时，干细胞的活性较低，分泌的因子含量很少，产量低，保存时间短，使用一些常规方法，例如机械摩擦、紫外线照射和饥饿培养等方案，并不能显著提高干细胞上清液中因子的含量。目前，也有一些对干细胞活性因子及冻干粉的制备方法的专利公开，例如中国专利申请201710015650.7中公开了一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途，该申请制备得到的浓缩液脂肪间充质干细胞因子含量得到了一定的提高，质量稳定，与其它材料在特定配比下组合物制备得到的产品对皮肤损伤具有一定的修复能力；中国专利申请201610680823.2中公开了一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备方法及制得的冻干粉，其最大程度上保存了人间充质干细胞培养上清液中的各种具有生物活性的细胞因子混合物，为其在美容等方面的应用奠定了基础；但采用以上专利中公开的方法制得的干细胞活性因子或其冻干粉应用到细胞修复的时候，不仅存在修复效果不佳，烫伤后创面愈合率低的问题，在制备过程中还存在细胞因子大量损失，冻干粉中水分含量高从而导致冻干粉不易保存的问题。
基于上述问题，本领域技术人员致力于公开一种干细胞活性因子冻干粉，以达到其可以促进皮下血管新生成，分泌蛋白质，促进受损肌肤深层细胞组织愈合，淡化疤痕和痘印的技术效果，同时以期制得一种干细胞活性因子冻干粉来达到烫伤后采用该冻干粉涂抹伤口时伤口的愈合率高、细胞因子含量高、冻干粉中水分含量低从而易于保存的效果。
本发明由此产生。
发明内容
本发明提供一种人脂肪间充质干细胞分泌的干细胞活性因子及其冻干粉的制备方法和用途，将易于获取的脂肪间充质干细胞与冻干技术结合，目的是制备出产量高、活性好、保存时间长的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉；本发明的另一个目的在于制备出可以促进皮下血管新生成、分泌蛋白质、促进受损肌肤深层细胞组织愈合、淡化疤痕和痘印的干细胞活性因子冻干粉，同时以期制得一种干细胞活性因子冻干粉来达到烫伤后采用该冻干粉涂抹伤口时伤口的愈合率高、细胞因子含量高、冻干粉中水分含量低从而易于保存的效果。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)外源因子检测；
(2)脂肪干细胞的原代分离、培养和传代；
(3)间充质干细胞的鉴定；
(4)上清液的收集；
(5)冻干粉的制备；
(6)对上述上清液和冻干粉的干细胞活性因子进行检测；
(7)溶媒的配制和灌装。
步骤(1)中所述的外源因子检测具体过程如下：采用ELISA诊断试剂盒对吸取的脂肪组织上清液进行梅毒螺旋体、艾滋病病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、人EB病毒和T淋巴细胞白血病病毒等外源因子检测，从而确保脂肪组织中不含有以上外源因子。
步骤(2)中所述的脂肪干细胞的原代分离、培养和传代具体过程如下：首先将脂肪稀释，吹散后进行离心，小心抽取底部沉淀物，然后用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化，接着再次离心，吸取细胞放入一次性培养皿中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃，5％的CO2培养箱内进行培养，培养5天以后出现细胞集落，培养10-15天细胞密度达到80％左右时，进行传代；所述的消化液为浓度为0.1％-0.3％的胰蛋白酶或浓度为0.5％-2％的胶原酶。
传代过程中要用生理盐水清洗细胞表面两次，然后加入胰酶消化，进行离心和接种，再继续传代培养。
步骤(3)中所述的间充质干细胞的鉴定包括以下三个方面：a.标准培养条件下，在培养瓶或培养皿中能够贴壁生长；b.流式细胞仪检测结果显示细胞活率在90％以上，标志物CD90、CD105、CD73的阳性表达率在95％以上，标志物CD14、CD34、CD20、CD45的阴性表达率在5％以下，HLA-DR的表达率在2％以下；c.所述的间充质干细胞具有成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞多向分化的潜能；以上三个方面的鉴定结果显示细胞符合间充质干细胞的标准。
步骤(4)中所述的上清液的收集是对P3-P5代次细胞上清液进行收集，当细胞生长到密度为70％-80％时收集上清液，然后补充到原来的体积再进行培养，待细胞长到致密单层时再次收集上清液。
步骤(5)中所述的冻干粉的制备过程具体如下：首先将冻干粉保护剂加入到收集到的上清液中，再通过0.22μm滤膜过滤除菌，将其分装到西林瓶中，半加塞，置冻干机中，按预定的冷冻干燥程序对样品进行冷冻干燥，压塞后取出再进行压盖贴签即可；所述的冻干保护剂为甘露醇、右旋糖酐和蔗糖中的一种或几种；
所述的冻干具体流程如下：在-50℃的条件下预冷，之后抽真空，然后在-50℃保持6h，接着开始升温到-35℃保持20h，逐步升温到-20℃保持4h，0℃-10℃保持4h-6h，10℃-25℃保持4h，最后在25℃干燥6h。
步骤(6)中对所述的干细胞活性因子进行检测时，用2ml量的上清液冻干后的粉剂加4ml溶媒稀释，然后用EGF和bFGF试剂盒测定干细胞活性因子的含量。
步骤(7)中所述的溶媒是采用甘油和不同分子量的玻尿酸进行配制而成的，将其分装到西林瓶中进行压塞压盖贴签；配制溶媒的玻尿酸采用高、中、低分子量的玻尿酸进行不同比例配比。
本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的人脂肪干细胞原料来源充足，提取安全方便，无任何不良反应，使用安全可靠；在制备上采用超滤浓缩及冷冻干燥工艺，能够使冻干粉中的有效蛋白成分和细胞因子长期有效的保存，且产品方便携带和使用；含有多种干细胞分泌的活性因子，能够促进皮肤成纤维细胞分裂与增殖，并显著提高机体的代谢水平和免疫能力，延缓皮肤衰老，保持青春状态。
(2)本发明将易于获取的脂肪间充质干细胞与冻干技术结合，制备出产量高、活性好、保存时间长的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉；利用本发明提供的制备方法制得的干细胞活性因子冻干粉可以促进皮下血管新生成、分泌蛋白质、促进受损肌肤深层细胞组织愈合、淡化疤痕和痘印。
(3)利用本发明提供的干细胞活性因子冻干粉的制备方法制得的干细胞活性因子冻干粉细胞因子含量高，冻干粉中水分含量低从而易于保存，并且烫伤后采用该冻干粉涂抹伤口时伤口的愈合率高。
附图说明
图1为人脂肪来源间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化示意图；
图2为人脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化示意图；
图3为人脂肪来源间充质干细胞向脂肪细胞的诱导分化示意图；
图4为人脂肪来源间充质干细胞表型检测结果示意图。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。
实施例1一种干细胞活性因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)外源因子检测：采用ELISA诊断试剂盒对吸取的脂肪组织上清液进行梅毒螺旋体、艾滋病病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、人EB病毒和T淋巴细胞白血病病毒等外源因子检测，然后对检测结果进行判定，从而确保脂肪组织中不含有以上外源因子。
(2)脂肪干细胞的原代分离、培养和传代：首先取20ml左右脂肪组织放于50ml离心管内，稀释，吹散后进行离心，小心抽取底部沉淀物，清洗脂肪组织，然后用0.25％胰蛋白酶和1％胶原酶消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化，接着再次离心吸取细胞放入一次性培养皿中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃，5％的CO2培养箱内进行培养，培养5天以后出现细胞集落，培养10-15天细胞密度达到80％左右时，进行传代。
(3)间充质干细胞的鉴定：a.标准培养条件下，在培养瓶或培养皿中能够贴壁生长；b.流式细胞仪检测结果显示细胞活率在90％以上，标志物CD90、CD105、CD73的阳性表达率在95％以上，标志物CD14、CD34、CD20、CD45的阴性表达率在5％以下，HLA-DR的表达率在2％以下；c.所述的间充质干细胞具有成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞多向分化的潜能；以上三个方面的鉴定结果显示细胞符合间充质干细胞的标准。具体过程如下：
贴壁鉴定：标准培养条件下，看细胞是否能够在培养瓶或培养皿中贴壁生长。
诱导分化：取脂肪来源的间充质干细胞进行传代培养，分别用间充质干细胞成骨、成软骨和成脂分化培养基试剂盒进行诱导分化培养。
如图1、图2和图3所示，通过对不同批次的人脂肪间充质干细胞向成骨、成软骨和成脂细胞的诱导分化实验，证明了在体外的特定条件下，该细胞能够在培养瓶或培养皿中贴壁生长，且可分化为成骨、成软骨和成脂细胞，具有向成骨、成软骨和成脂细胞分化的潜能。
表型鉴定：1)取9个样品，每份都有2×105个细胞，分别标记为空白、PerCP、PE、APC、FITC、同型、表型、PE同型和HLA-DR。2)向PerCP，PE，APC，FITC，同型，表型等样品中加入相应试剂，混匀，在4℃黑暗环境中孵育。然后再向每个样中加生理盐水定容，洗细胞，离心，去上清。用生理盐水重悬每个样品。3)上流式细胞仪进行分析，用表型样品直接测各种表型结果。
如图4所示，流式检测结果中显示该细胞符合间充质干细胞表型检测标准。综上所述，该脂肪细胞在三种检测结果中显示细胞符合间充质干细胞标准。
(4)上清液的收集：对P3-P5代次细胞上清液进行收集，当细胞生长到密度为70％-80％时收集上清液，然后补充到原来的体积再进行培养，待细胞长到致密单层时再次收集上清液，各个批次传代细胞的无血清上清分批收集完毕后，置于-20℃保存，待处理。
(5)冻干粉的制备：首先将冻干粉保护剂甘露醇和右旋糖酐加入到收集到的上清液中，再通过0.22μm滤膜过滤除菌，将其分装到西林瓶中，半加塞，置冻干机中，按预定的冷冻干燥程序对样品进行冷冻干燥，具体为：在-50℃的条件下预冷，之后抽真空，然后在-50℃保持6h，接着开始升温到-35℃保持20h，逐步升温到-20℃保持4h，0℃-10℃保持4h-6h，10℃-25℃保持4h，最后在25℃干燥6h，压塞后取出再进行压盖贴签，即可制得人脂肪干细胞提取物冻干粉。
(6)对上述上清液和冻干粉的干细胞活性因子进行检测：用2ml量的上清液冻干后的粉剂加4ml溶媒稀释，然后用EGF和bFGF试剂盒测定干细胞活性因子的含量。对人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉进行质量标准检测，外观：肉眼观察人脂肪干细胞提取物冻干粉产品为白色、粉末状。按标示量用所配溶媒溶解后为澄清、透明的淡红色溶液；PH值的测定：采用PH测试仪检测样品的PH值，首先对PH测试仪进行校正，再对人脂肪干细胞提取物冻干粉水溶液进行检测。人脂肪干细胞提取物水溶液的产品值在6.5～7.5之间。人脂肪干细胞提取物冻干粉蛋白质含量测定：根据BCA法进行蛋白含量测定。合格产品为每支人脂肪干细胞提取物冻干粉的蛋白含量为100.0±0.5mg/支。
(7)溶媒的配制和灌装：采用甘油和不同分子量的玻尿酸进行配制而成的，将其分装到西林瓶中进行压塞压盖贴签；配制溶媒的玻尿酸采用高、中、低分子量的玻尿酸进行不同比例配比。
实施例2
与实施例1唯一的区别在于：所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法步骤(2)中用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化的步骤中，所述的消化液为：0.1％胰蛋白酶和0.5％胶原酶消化液。
实施例3
与实施例1唯一的区别在于：所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法步骤(2)中用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化的步骤中，所述的消化液为：0.3％胰蛋白酶和2％胶原酶消化液。
实施例4
与实施例1唯一的区别在于：所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法步骤(5)中所述的冻干保护剂为右旋糖酐和蔗糖。
实施例5
与实施例1唯一的区别在于：所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法步骤(5)中所述的冻干保护剂为蔗糖。
对比例1
与实施例1唯一的区别在于：所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法步骤(2)中用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化的步骤中，所述的消化液为：0.05％胰蛋白酶和0.3％胶原酶消化液。
对比例2
与实施例1唯一的区别在于：所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法步骤(2)中用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化的步骤中，所述的消化液为：0.5％胰蛋白酶和2.5％胶原酶消化液。
对比例3
与实施例1唯一的区别在于：所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法步骤(5)中所述的冻干保护剂为白蛋白。
实验结果:
(1)用2ml量的上清液冻干后的粉剂加4ml溶媒稀释，然后用EGF和bFGF试剂盒测定干细胞活性因子的含量，得到如下表1：
由上表可知，本发明实施例1-3公开的干细胞活性因子冻干粉的制备方法可以有效提高细胞因子表达水平，进而最终提高干细胞活性因子的含量。
(2)采用细胞增值法\MTT比色法测定冻干前溶液的EGF和冻干后的EGF，得出其活性保持率，如下表2：
表2
实施例 EGF活性 冻干粉所含水分
实施例1 99.8％ 0.7％
实施例2 97.5％ 0.6％
实施例3 96.6％ 0.9％
实施例4 97.5％ 0.8％
实施例5 98.4％ 0.8％
对比例1 87.7％ 2％
对比例2 86.6％ 1.3％
对比例3 85.7％ 1.5％
本发明中实施例1-5所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法制得的冻干粉可以有效保护细胞因子的EGF活性，EGF活性均达到90％以上，并且冻干粉中水分含量低，均在1％以下，使冻干粉更易于保存。
由实施例1-3和对比例1-2可知，只有当所述的消化液为本发明中公开的浓度为0.1％-0.3％的胰蛋白酶或浓度为0.5％-2％的胶原酶的消化液时，脂肪干细胞才有很好的活性，制得的冻干粉才可以有效保护细胞因子的EGF活性，并且冻干粉中水分含量低，使冻干粉更易于保存。
由实施例4-5和对比例3可知，当所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法步骤(5)中所述的冻干保护剂为甘露醇、右旋糖酐和蔗糖中的一种或几种的时候，制得的冻干粉才可以有效的保护细胞因子的EGF活性，并且冻干粉中水分含量低，使冻干粉更易于保存。
(3)取实施例1-5和对比例1-3制得的冻干粉，加入生物多糖焦胶、胶原蛋白、叶酸、无菌超纯水制成组合物。
选取体重为300g左右雄性Wistar大鼠40只，经脱毛、局麻后，用3cm沸水加热后的铁棒紧贴背部皮肤，持续7s，每只大鼠背部造成4个创面，烫伤后立即腹腔注射乳酸林格氏液5ml抗休克，创面经病理证实为深I度。
大鼠40只随机分两组，随机分为8组，每组5只，分别涂抹用实施例1-5和对比例1-3制得的冻干粉与生物多糖胶、胶原蛋白、叶酸、无菌超纯水制成的组合物，每日一次，于烫伤后10d、20d、30d测量创面愈合率，得到如下表3：各组创面愈合率比较(％，x±s，n＝6)
表3
*：与生理盐水相比，P＜0.05；#：与最佳组(实施例1)相比，P＜0.05
由上表可以看出，本发明实施例1-5制得的冻干粉与生物多糖胶、胶原蛋白、叶酸、无菌超纯水制成的组合物对创伤面的愈合效果显著优于对比例1-3，其中，实施例1制得的冻干粉组成的组合物对创伤面的愈合效果最佳。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）外源因子检测；
（2）脂肪干细胞的原代分离、培养和传代；
（3）间充质干细胞的鉴定；
（4）上清液的收集；
（5）冻干粉的制备；
（6）对上述上清液和冻干粉的干细胞活性因子进行检测；
（7）溶媒的配制和灌装；
步骤(2)中所述的脂肪干细胞的原代分离、培养和传代具体过程如下：首先将脂肪稀释，吹散后进行离心，小心抽取底部沉淀物，然后用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化，接着再次离心，吸取细胞放入一次性培养皿中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃，5%的CO2培养箱内进行培养，培养5天以后出现细胞集落，培养10-15天细胞密度达到80%左右时，进行传代；所述的消化液为浓度为0.1%-0.3%的胰蛋白酶或浓度为0.5%-2%的胶原酶。
2.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的外源因子检测具体过程如下：采用ELISA诊断试剂盒对吸取的脂肪组织上清液进行梅毒螺旋体、艾滋病病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、人EB病毒和T淋巴细胞白血病病毒等外源因子检测，从而确保脂肪组织中不含有以上外源因子。
3.根据权利要求2所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：传代过程中要用生理盐水清洗细胞表面两次，然后加入胰酶消化，进行离心和接种，再继续传代培养。
4.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的间充质干细胞的鉴定包括以下三个方面：a.标准培养条件下，在培养瓶或培养皿中能够贴壁生长；b.流式细胞仪检测结果显示细胞活率在90%以上，标志物CD90、CD105、CD73的阳性表达率在95%以上，标志物CD14、CD34、CD20、CD45的阴性表达率在5%以下，HLA-DR的表达率在2%以下；c.所述的间充质干细胞具有成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞多向分化的潜能；以上三个方面的鉴定结果显示细胞符合间充质干细胞的标准。
5.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的上清液的收集是对P3-P5代次细胞上清液进行收集，当细胞生长到密度为70%-80%时收集上清液，然后补充到原来的体积再进行培养，待细胞长到致密单层时再次收集上清液。
6.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述的冻干粉的制备过程具体如下：首先将冻干粉保护剂加入到收集到的上清液中，再通过0.22μm滤膜过滤除菌，将其分装到西林瓶中，半加塞，置冻干机中，按预定的冷冻干燥程序对样品进行冷冻干燥，压塞后取出再进行压盖贴签即可；所述的冻干保护剂为甘露醇、右旋糖酐和蔗糖中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述的冻干具体流程如下：在-50℃的条件下预冷，之后抽真空，然后在-50℃保持6h，接着开始升温到-35℃保持20h，逐步升温到-20℃保持4h，0℃-10℃保持4h-6h，10℃-25℃保持4h，最后在25℃干燥6h。
8.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（6）中对所述的干细胞活性因子进行检测时，用2ml量的上清液冻干后的粉剂加4ml溶媒稀释，然后用EGF和bFGF试剂盒测定干细胞活性因子的含量。
9.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（7）中所述的溶媒是采用甘油和不同分子量的玻尿酸进行配制而成的，将其分装到西林瓶中进行压塞压盖贴签；配制溶媒的玻尿酸采用高、中、低分子量的玻尿酸进行不同比例配比。
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