CN115786258A - 一种细胞培养基添加物制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种细胞培养基添加物制备方法，该制备方法通过收集培养上清液并经过离心、超滤、除菌过滤以及真空冻干工艺后可制备出安全性高、质量稳定的细胞培养基添加物并可添加至基础培养基中，为细胞培养提供营养，促进细胞生长繁殖。在现有技术的基础上，可提高细胞培养的安全性，并有效降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种细胞培养基添加物制备方法。
背景技术
细胞的培养基大致划分为天然培养基、合成培养基和无血清培养三种类型，其中，合成培养基阶段在天然培养基阶段的基础上发展较为迅速，可以通过添加某些成分支持细胞增殖。合成培养基是根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。
绝大多数细胞的体外培养，需要在合成培养基中补充一定量的成分不明确的生物性液体或组织提取液才能支持细胞的生长增殖，其中血清因来源丰富且易于保存而成为被最广泛采用的培养基添加物，最常用的为胎牛血清(Foetal Bovine Serum,简称FBS)，胎牛血清是一种由很多大小不同生物分子组成的、极为复杂的混合物，它不是一种简单的液体，它含有各种血浆蛋白质、脂肪、碳水化合物、无机物质等，成分较为复杂。FBS已被证实可以用来为人骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外生长提供营养，使用浓度在为5%～20%，以10%为居多，但由于血清中所含的成分复杂，就蛋白质而言，血清中所含的蛋白成分不少于150种，给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等下游培养产物的分离纯化带来很大的困难。同时，有研究者认为FBS会给BMSCs培养带来异种蛋白或微生物的输入风险，建议使用同源性血清提取物作为营养来源，也有商用无血清培养基在人源BMSCs体外培养中显示出良好性能。虽然FBS中含有很多支持细胞生长的活性物质，但同时也给细胞培养造成了诸多的不利。此外，由于不同批次FBS间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差，且其安全性尚待进一步验证。
由于血清的应用存在诸多问题，促使人们对无血清培养基的研究和应用日益重视，基于人血清或其衍生物的人源化培养基以及无血清培养基的研发和应用为这些问题的解决提供了新的途径和方案。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种细胞培养基添加物制备方法，所述细胞培养基添加物制备方法可提高细胞培养的安全性，并有效降低细胞培养成本。
为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种细胞培养基添加物制备方法，所述细胞培养基添加物为人间充质干细胞外泌体并来源于人间充质干细胞培养上清液，且所述细胞培养基添加物通过以下方法进行制备：
S1：培养人间充质干细胞以获取上清液；
S2：采用截留分子量为10kd的超滤膜包对上清液进行超滤，收集回流端液体；
S3：对回流端液体进行除菌过滤，以获得原液；
S4：对上述原液进行稀释后获得稀释液，对上述稀释液进行分装并真空冻干，即获得所述细胞培养基添加物；
其中，真空冻干程序如下：
（1）预冻：将稀释液分装后于-45℃下预冻4h，无需抽真空；
（2）抽真空至真空度达到5.0Pa；
（3）第一阶段干燥：在20 min内将冷冻温度由-45℃调节至-30℃，然后在-30℃下保持6～7 h，此过程维持真空度为15Pa；
（4）第二阶段干燥：在15 min内将冷冻温度由-30℃调节至-20℃，然后在-20℃下保持10～12h，此过程维持真空度为15Pa；
（5）第三阶段干燥：在1h内将冷冻温度由-20℃调节至28℃，然后在28℃下维持6～8h，此过程维持真空度为5Pa；
（6）升压：在2min内将真空度调节至3.0Pa，此过程保持温度处于28℃；
（7）放气，收集稀释液冻干产品，并于28℃下存储。
进一步地，所述细胞培养基添加物包括细胞因子，所述细胞因子至少包括VEGF、PDGF以及bFGF中的至少一种。
进一步地，所述细胞因子包括VEGF、PDGF以及bFGF，且VEGF、PDGF、bFGF的浓度之比为29～30： 73～76 ：60～62。
进一步地，所述S1具体为：将人间充质干细胞在体外培养至单层，在洁净级别为B+A的条件下，收获细胞培养上清至无菌容器中，并进行离心，以获得上清液。
进一步地，所述离心条件为：转速3000rpm/min，温度为0～4℃，离心时间为2～5min。
进一步地，所述原液中蛋白质浓度为9～11 mg/ml，pH值为7.2～7.4，渗透压为200～230 Osml/kg。
第二方面，本发明还提供一种采用上述第一方面提供的细胞培养基添加物制备方法制备得到的细胞培养基添加物在制备细胞培养基方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明涉及的一种细胞培养基添加物来源于人间充质干细胞培养上清液，经过处理后可添加至基础培养基中，为间充质干细胞的培养提供营养，促进细胞生长繁殖。该种方式，不仅可以解决现在培养基添加物要么存在动物源病毒污染的风险、要么价格昂贵等问题，还可以降低血清的使用量，提高安全性，并有效降低成本。
同时，本发明提供的一种细胞培养基添加物制备方法，可以有效地利用人间充质干细胞自分泌外泌体的特点，通过收集培养上清液并经过离心、超滤、除菌过滤以及真空冻干工艺，可将上述外泌体成分添加回含有少量血清甚至不含有血清成分的基础培养基中，成为支持细胞培养的一种新的营养物质，使其能够作为一种细胞培养基添加物而被有效利用，且安全性更高。
附图说明
图1为本发明的实施例1提供的细胞培养基添加物冻干粉照片；
图2为本发明的实施例2提供的细胞生长状态照片，其中,2A为对照组1，2B为实验组，2C为对照组2；
图3为本发明的实施例2提供的细胞生长状态照片，其中,3A为对照组1，3B为实验组，3C为对照组2。
图4为本发明的实施例2提供的对照组1的人脐带间充质干细胞的表面标记物检测结果；
图5为本发明的实施例2提供的实验组的人脐带间充质干细胞的表面标记物检测结果；
图6为本发明的实施例3提供的各组培养基中的人牙髓间充质干细胞的生长情况对比；
图7为本发明的实施例3提供的完全培养基组的人牙髓间充质干细胞的表面标记物检测结果；
图8为本发明的实施例3提供的细胞培养基添加物冻干粉添加组的人牙髓间充质干细胞的表面标记物检测结果；
图9为本发明的实施例4提供的第一天各组培养基中的人表皮成纤维细胞的生长情况对比；
图10为本发明的实施例4提供的第五天各组培养基中的人表皮成纤维细胞的生长情况对比；
图11为本发明的实施例4提供的完全培养基组的人牙髓间充质干细胞的表面标记物检测结果；
图12为本发明的实施例4提供的细胞培养基添加物冻干粉添加组的人牙髓间充质干细胞的表面标记物检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料，且实施例中未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1
本实施例为本发明的第一制备实施例，本实施例通过以下方法制备细胞培养基添加物，具体步骤如下：
S1：培养人间充质干细胞以获取上清液；
将冻存的人间充质干细胞复苏后，用完全培养基重悬细胞，按对应密度将细胞悬液接种至15cm培养皿中，培养基采用25ml完全培养基（αMEM+5% UltraGRO），接种密度为5000～8000个/cm²，摇晃培养皿，使完全培养基平均铺于瓶底后于37℃、5%二氧化碳条件下进行培养，将人间充质干细胞在体外培养至单层，在洁净级别为B+A的条件下，收获4代以内人间充质干细胞培养上清至无菌容器中，在转速3000rpm/min、温度为4℃下离心3min，以收取上清液；
S2：采用截留分子量为10kd的超滤膜包对上清液进行超滤，收集回流端液体，超滤流速控制为500～600rpm、压力为0.1Mba、浓缩倍数为5倍。
S3：采用孔径为0.22μm的滤膜回流端液体进行除菌过滤，以获得原液，测定原液的蛋白质含量、PH、渗透压、细胞因子含量等指标，原液的蛋白质含量在10.2 mg/ml、PH值为7.2～7.4、渗透压为245 Osml/kg，三种细胞因子的相对含量分别为VEGF147.95pg/ml、PDGF369 pg/ml、bFGF305.8 pg/ml。
S4：用DPBS缓冲液稀释上述原液，使稀释后蛋白质的终浓度达到0.8mg/ml，再在无菌条件下分装至5ml西林瓶，每瓶2ml稀释液，最后按照以下方法进行真空冻干：
（1）预冻：将稀释液分装后于-45℃下预冻4h，无需抽真空；
（2）抽真空至真空度达到5.0Pa；
（3）第一阶段干燥：在20 min内将冷冻温度由-45℃调节至-30℃，然后在-30℃下保持6 h，此过程维持真空度为15Pa；
（4）第二阶段干燥：在15 min内将冷冻温度由-30℃调节至-20℃，然后在-20℃下保持10 h，此过程维持真空度为15Pa；
（5）第三阶段干燥：在1 h内将冷冻温度由-20℃调节至28℃，然后在28℃下维持6h，此过程维持真空度为5Pa；
（6）升压：在2min内将真空度调节至3.0Pa，此过程保持温度处于28℃；
（7）放气，收集稀释液冻干产品，并于28℃下存储，即获得细胞培养基添加物冻干粉，该细胞培养基添加物冻干粉照片如图1所示。
实施例2
本实施例为本发明的第一应用实施例，目的在于观察上述细胞培养基添加物冻干粉对人脐带间充质干细胞培养的影响。
通过将上述实施例1获得的细胞培养基添加物冻干粉添加至人脐带间充质干细胞培养基中，实际使用的浓度为每100ml培养基，加入5瓶上述实施例1制备得到的细胞培养基添加物冻干粉，以上设置为实验组。该实验同时设置对照组1和对照组2，其中，该对照组1采用完全培养基（αMEM + 5% UltraGRO、生产商：HyClone/HELIOS、批号：HyClone/HELIOS）对人脐带间充质干细胞进行培养，该对照组2采用无血清培养基（αMEM培养基、厂家：HyClon、批号：AH29847327）对人脐带间充质干细胞进行培养，上述三组培养基接种密度相同且均在37℃、5%二氧化碳条件下培养。
在细胞培养开始后的第1天和第5天分别在显微镜下对各组细胞进行拍照观察，实验结果分别如图2和图3所示。
以上实验结果表明，实验组和对照组1的细胞生长的动力学曲线基本相同，均在培养后第4-5天达到90%汇合度。无血清培养基在细胞贴壁后第3天，细胞生长停滞，且对照组1和实验组培养基在第5天收获细胞的总数分别为9.2×106个（对照组1）、8.8×106个（实验组），活率分别为95.3%（对照组1）、93%（实验组）。
在细胞培养开始后的第5d，对对照组1和实验组培养基中的细胞结团率和细胞直径进行对比，实验结果如表1所示，同时，对对照组1和实验组培养基中的人脐带间充质干细胞的表面标记物进行检测，实验结果分别如图4（对照组1）和图5（实验组）所示：
实施例3
本实施例为本发明的第二应用实施例，目的在于观察上述细胞培养基添加物冻干粉对人牙髓间充质干细胞培养的影响。
将上述细胞培养基添加物冻干粉用基础培养基αMEM 2ml/瓶进行溶解后作为培养基添加物添加到人牙髓间充质干细胞培养液中，实际使用的浓度为每100ml培养基，加入5瓶冻干粉，设置为细胞培养基添加物冻干粉添加组，同时，以完全培养基（αMEM + 5%UltraGRO、厂家：HyClone/HELIOS、批号：20221108）、无血清培养基（αMEM培养基、厂家：HyClone、批号：AH29847327）作为对照，观察各组细胞的增殖情况。
在细胞培养开始后的第5天分别在显微镜下对各组细胞进行拍照观察，实验结果如图6所示。
该实验结果表明，细胞培养基添加物冻干粉添加组细胞生长的动力学曲线与完全培养基组基本一致，均在培养后第4-5天达到90%汇合度，无血清培养基在细胞贴壁后第3天，细胞生长停滞。在第5天收获细胞的总数分别为：8.5×106个（完全培养基组）、8.3×106个（细胞培养基添加物冻干粉添加组），活率分别为96.75%（完全培养基组）、92.5%（细胞培养基添加物冻干粉添加组）。
在细胞培养开始后的第5d，对完全培养基组和细胞培养基添加物冻干粉添加组中的细胞结团率和细胞直径进行对比，实验结果如表2所示，同时，对完全培养基组和细胞培养基添加物冻干粉添加组中的人牙髓间充质干细胞的表面标记物进行检测，实验结果分别如图7（完全培养基组）和图8（细胞培养基添加物冻干粉添加组）所示：
实施例4
本实施例为本发明的第三应用实施例，目的在于观察上述细胞培养基添加物冻干粉对人表皮成纤维细胞培养的影响。
将上述细胞培养基添加物冻干粉用基础培养基αMEM 2ml/瓶进行溶解后作为培养基添加物添加到人表皮成纤维细胞培养液中，实际使用的浓度为每100ml培养基，加入5瓶冻干粉，和完全培养基、无血清培养基比较，观察各组细胞的增殖情况。
在细胞培养开始后的第1天和第5天分别在显微镜下对各组细胞进行拍照观察，实验结果分别如图9和图10所示。
结果发现，细胞培养基添加物冻干粉添加组细胞生长的动力学曲线与完全培养基组基本一致，均在培养后第4-5天达到90%汇合度，无血清培养基在细胞贴壁后第3天，细胞生长停滞。在第5天收获细胞的总数分别为：9.1×106个（完全培养基组）、8.3×106个（细胞培养基添加物冻干粉添加组），活率分别为90.3%（完全培养基组）、91.0%（细胞培养基添加物冻干粉添加组）。
同时，在细胞培养开始后的第5d，对完全培养基组和细胞培养基添加物冻干粉添加组的细胞结团率和细胞直径进行对比，实验结果如表3所示：
此外，对完全培养基组和细胞培养基添加物冻干粉添加组中的人表皮成纤维细胞的表面标记物进行检测，实验结果分别如图11（完全培养基组）和图12（细胞培养基添加物冻干粉添加组）所示。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (7)
1.一种细胞培养基添加物制备方法，其特征在于，所述细胞培养基添加物通过以下方法进行制备：
S1：培养人间充质干细胞以获取上清液；
S2：采用截留分子量为10kd的超滤膜包对上清液进行超滤，收集回流端液体；
S3：对回流端液体进行除菌过滤，以获得原液；
S4：对上述原液进行稀释后获得稀释液，对上述稀释液进行分装并真空冻干，即获得所述细胞培养基添加物；
其中，真空冻干程序如下：
（1）预冻：将稀释液分装后于-45℃下预冻4h，无需抽真空；
（2）抽真空至真空度达到5.0Pa；
（3）第一阶段干燥：在20 min内将冷冻温度由-45℃调节至-30℃，然后在-30℃下保持6～7 h，此过程维持真空度为15Pa；
（4）第二阶段干燥：在15 min内将冷冻温度由-30℃调节至-20℃，然后在-20℃下保持10～12h，此过程维持真空度为15Pa；
（5）第三阶段干燥：在1h内将冷冻温度由-20℃调节至28℃，然后在28℃下维持6～8h，此过程维持真空度为5Pa；
（6）升压：在2min内将真空度调节至3.0Pa，此过程保持温度处于28℃；
（7）放气，收集稀释液冻干产品，并于28℃下存储。
2.如权利要求1所述的一种细胞培养基添加物制备方法，其特征在于：所述细胞培养基添加物包括细胞因子，所述细胞因子至少包括VEGF、PDGF以及bFGF中的至少一种。
3.如权利要求1所述的一种细胞培养基添加物制备方法，其特征在于：所述细胞因子包括VEGF、PDGF以及bFGF，且VEGF、PDGF、bFGF的浓度之比为29～30： 73～76 ：60～62。
4.如权利要求1所述一种细胞培养基添加物制备方法，其特征在于：所述S1具体为：将人间充质干细胞在体外培养至单层，在洁净级别为B+A的条件下，收获细胞培养上清至无菌容器中，并进行离心，以获得上清液。
5.如权利要求4所述一种细胞培养基添加物制备方法，其特征在于：所述离心条件为：转速3000rpm/min，温度为0～4℃，离心时间为2～5min。
6.如权利要求1所述一种细胞培养基添加物制备方法，其特征在于：所述原液中蛋白质浓度为9～11 mg/ml，pH值为7.2～7.4，渗透压为200～230Osml/kg。
7.采用权利要求1～6任意一项所述的细胞培养基添加物制备方法制备得到的细胞培养基添加物在制备细胞培养基方面的应用。
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