CN110564682A - 一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法。本发明是在无菌条件下，从临床来源脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞(Adipose‑derived Mesenchymal Stem Cells，ADSCs)进行扩大培养，用微载体灌流培养的生产工艺，在低氧环境下联合成纤维细胞(Human Fibroblast，hFB)的条件培养基刺激ADSCs增殖和分泌，从而大规模生产外泌体的方法。

Description

一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法。

背景技术

利用干细胞治疗疾病己经成为生物医药最活跃的研究领域之一。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，属于多能干细胞，常利用其多分化特性在组织损伤时起到修复作用。但干细胞储存条件苛刻，运输不便，移植至生物体内存活率较低，限制了其临床应用。近期研究表明，干细胞大多数治疗效果都是通过旁分泌作用达到的，其中最受关注的是其分泌的外泌体。这种直径在30～150nm的囊泡，包裹细胞内的活性物质如蛋白质、DNA、mRNA及microRNA等，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程。外泌体具有其分泌细胞的特性，储存相对简单，运输方便，免疫原性较干细胞低，在治疗方面的应用极为广泛，涉及的项目包括癌症早期检测、心脏保护、组织再生、帕金森、糖尿病等，应用价值极大。

利用干细胞分泌的含有多种活性成分的外泌体替代干细胞进行治疗是目前的热点研究方向之一。但是干细胞的量非常少，并且随着个体年龄的增加，干细胞的数量逐渐减少、分泌活性逐渐降低，导致外泌体的总产量进一步减少，很难满足自体修复和临床治疗的需求，这限制了它的进一步的应用。

对于干细胞外泌体的实际应用而言，通过扩增得到足够的细胞数目，并刺激单细胞分泌更多的外泌体是一方面，另一方面还需要尽可能保持干细胞分泌功能的完整性，以保证其分泌的外泌体内含成分的稳定，因此需要在生产过程中尽可能的模拟体内正常的生理环境。

目前干细胞的培养一般都是在常氧的气相环境中进行的，氧体积分数通常在21％，而正常体内组织的氧体积分数通常在3％～5％。因此，低氧培养细胞会更接近其生理环境。且体外实验已经证明，低氧处理后，细胞分泌增加。成纤维细胞为真皮层主要结构细胞，相邻的皮下组织则主要是脂肪类细胞。生理条件下，脂肪间充质干细胞和成纤维细胞便存在相互调节作用，参与对方的生长代谢。因此成纤维细胞条件培养基的加入，可以部分模拟脂肪间充质干细胞在体内的环境，促使得到的外泌体组分更加接近体内正常情况。且脂肪间充质干细胞可取材于临床抽脂后的脂肪废弃物，成纤维细胞可取材于环切术所得新生儿包皮等，来源广泛、组织损伤小，便于临床推广。

人体的实质细胞存在于细胞外基质和其他类型细胞支持的高度复杂的三维环境中，与体外二维培养的微环境存在很大的区别。而且传统的二维培养方法难以获得大量细胞，细胞有效分泌面积小，因此外泌体的产量也受到极大限制。使用微载体结合生物反应器系统进行三维灌流式培养，是一个理想的选择。微载体培养可为细胞提供较大的生长面积，且细胞生长条件均一。灌注式培养体系可为干细胞提供一个较为稳定的生长环境，细胞密度较大，有助于细胞干性的维持。为人干细胞外泌体的大规模生产开辟了一条新的途径。

本发明采用搅拌式生物反应器，在成纤维细胞条件培养基刺激及低氧环境下进行人脂肪间充质干细胞的微载体灌流培养，提高外泌体产量，进而为解决临床上所面临的干细胞分泌外泌体数量少的难题提供新的培养方法和思路。

发明内容

为解决外泌体产量低的问题，本发明的目的在于提供一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法，用于工业化生产。

本发明所述大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法，包括细胞的原代分离、扩大培养、混合培养基的准备、灌流培养、外泌体纯化收集及功能评价。具体步骤包括：

步骤一：细胞的原代分离

ADSCs的原代分离

无菌条件下，将抽脂获得的脂肪去除结缔组织，剪成1mm³左右的组织块；将剪碎的组织转移到50mL离心管中，加入等体积生理盐水进行清洗，200～300g，常温离心3～10min；去除液体部分，在脂肪颗粒中加入等体积的0.1％胶原酶溶液，恒温震荡消化30～60min，100～200g，常温离心5～10min；去除上清，取细胞沉淀，生理盐水清洗一遍，用α-MEM完全培养基重悬，接种于75cm²培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

hFB的原代分离

取临床来源新生儿包皮组织，转移到超净工作台中，75％酒精浸泡1min，用含两倍双抗的PBS清洗数次；去除皮下脂肪组织，剪成1mm³左右的小块；用无菌毛细管在25cm²培养瓶底面滴加一层胎牛血清，再将包皮组织小块用镊子转移至细胞培养瓶底部，每个培养瓶可以均匀接种30个左右的组织小块；37℃，5％CO₂条件下培养；待组织块贴壁牢固后，在培养瓶中补加α-MEM完全培养基，继续培养，3d换液。

步骤二：细胞的扩大培养

将步骤一所得原代细胞培养5～7天后，弃去培养基，用PBS清洗一次，用0.25％胰酶消化后，1:3～1:5传代培养。以后每48～72h传代一次，直至收集到足够的细胞。

步骤三：混合培养基的准备

将3～10代成纤维细胞按3×10⁴个/ml接种于细胞工厂中，培养三天后收集细胞培养上清，即条件培养基。用20％～50％的成纤维细胞条件培养基和50％～80％的新鲜培养基制备成混合培养基，用于3～10代ADSCs的灌流培养。

所述3～10代细胞的选择是由于低代数的原代细胞具有更好的细胞因子分泌功能。

步骤四：灌流培养

生物反应器需提前注入灭菌生物反应器用溶液(PBS)，121℃高压蒸汽灭菌30min，降温后，将生物反应器中的溶液更换为混合培养基，加入微载体预培养24h，微载体浓度1～8g/L，温度37℃，持续通入90％～92％N₂∶5％CO₂∶3％～5％O₂的混合气体，搅拌速度40～50r/min，pH7.2～7.4。待控制参数稳定后，将步骤二中的10代内ADSCs以0.5～3×10⁵个细胞/ml接入到生物反应器中，再培养48h，开始灌流培养。

步骤五：外泌体的纯化收集、鉴定及功能评价

收集ADSCs条件培养基，通过100000NWCO超滤膜进行超滤浓缩，去除小分子，然后将所得液体用微米过滤器过滤除菌，获得外泌体。用BCA法测定外泌体蛋白含量，浓度范围为0.03～0.3mg/mL；透射电子显微镜观察，可见外泌体均呈类圆形囊泡，膜性结构完整，直径集中分布在60～100nm；

验证本方法所得外泌体功能，涉及MTT实验和荧光定量PCR实验。MTT法用于观察外泌体干预后的细胞增殖情况，荧光定量PCR法检测外泌体干预后细胞增殖和功能相关蛋白的基因表达。

本发明所提供的大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法，其优势在于：

1.在人脂肪间充质干细胞外泌体的大规模生产过程中，从两方面模拟了干细胞在机体内的自然生理环境，首先，脂肪间充质干细胞培养过程中加入与皮下脂肪层相邻且存在相互作用的真皮层主体细胞，成纤维细胞的条件培养基；其次，整个培养过程保持3％～5％O₂的低氧环境，与体内氧含量基本一致。理论上得到的外泌体内含物组成更接近人体正常生理情况。

2、进行灌流培养产生外泌体的细胞类型包括但不限于脂肪间充质干细胞，用于模拟生理环境的细胞类型包括但不限于成纤维细胞，可以有多种组合，得到多种产物，更适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明的整体流程图；

图2为ADSCs微载体灌流培养的细胞生长曲线；

图3为ADSCs来源外泌体干预后角质形成细胞增殖情况；

图4为ADSCs来源外泌体干预后角质形成细胞增殖和功能相关基因表达。

具体实施方式：

以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。

本发明所述大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法，其中微载体灌流培养工艺能增加脂肪间充质干细胞的分泌面积和细胞密度，低氧和成纤维细胞条件培养基同时作用于脂肪间充质干细胞，能够促进其增殖和分泌，从而大幅提高外泌体产量。

过程包括细胞的原代分离、扩大培养、混合培养基的准备、灌流培养、外泌体纯化收集及功能评价。

具体步骤如下：

步骤一：细胞的原代分离

ADSCs的原代分离

无菌条件下，将抽脂获得的脂肪去除结缔组织，剪成1mm³左右的组织块；将剪碎的组织转移到50mL离心管中，加入等体积生理盐水进行清洗，200g，常温离心5min；去除液体部分，在脂肪颗粒中加入等体积的0.1％胶原酶溶液，恒温震荡消化30min，150g，常温离心5min；去除上清，取细胞沉淀，生理盐水清洗一遍，用α-MEM完全培养基重悬，接种于75cm²培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

hFB的原代分离

取临床来源新生儿包皮组织，转移到超净工作台中，75％酒精浸泡1min，用含两倍双抗的PBS清洗三次；去除皮下脂肪组织，剪成1mm³左右的小块；用无菌毛细管在25cm²培养瓶底面滴加一层胎牛血清，再将包皮组织小块用镊子转移至细胞培养瓶底部，每个培养瓶可以均匀接种30个左右的组织小块；37℃，5％CO₂条件下培养；待组织块贴壁牢固后，在培养瓶中补加α-MEM完全培养基，继续培养，3d换液。

步骤二：细胞的扩大培养

将步骤一所得原代细胞培养5天后，弃去培养基，用PBS清洗一次，用0.25％胰酶消化后，1:3传代培养。以后每48h传代一次，直至收集到足够的细胞。

步骤三：混合培养基的准备

将原代P5代成纤维细胞按3×10⁴个/ml接种于细胞工厂中，培养三天后收集培养基。用20％的成纤维细胞条件培养基和80％的完全培养基制备成混合培养基。用于脂肪间充质干细胞的灌流培养。

步骤四：灌流培养

生物反应器需提前注入无菌PBS，121℃高压蒸汽灭菌30min，降温后，用步骤三中制备的混合培养基更换生物反应器中的溶液，加入Cytodex3微载体预培养24h，Cytodex3浓度:2g/L，温度37℃，持续通入90％N₂∶5％CO₂∶5％O₂的混合气体，搅拌速度40～50r/min，pH7.2～7.4。待控制参数稳定后，将P6代ADSCs以1.5×10⁵个细胞/ml接入到生物反应器中，再培养48h，开始灌流培养。

步骤五：外泌体的纯化收集、鉴定及功能评价

收集ADSCs培养所得上清液，通过100000NWCO超滤膜进行超滤浓缩，去除小分子，然后将所得液体用0.22微米过滤器过滤除菌，获得外泌体。

用BCA法测定外泌体蛋白含量为0.05mg/mL；透射电子显微镜观察，可见膜性结构完整，直径集中分布在60～100nm的类圆形囊泡，即本方法收集的外泌体；功能验证步骤中，用MTT法观察ADSCs来源外泌体干预后角质形成细胞增殖情况；荧光定量PCR法检测ADSCs来源外泌体干预后角质形成细胞增殖和功能相关蛋白的基因表达；具体方法及实验结果如下：

MTT实验

用第4代角质形成细胞铺96孔板，第二天分别加入终浓度0，10，20，50，100mg/L外泌体。培养48h后，移去培养基，加入终浓度0.5g/L的MTT，37℃孵育4h，弃去MTT后加入150μL二甲基亚砜，水平摇床上震荡10min，并利用酶标仪测量490nm波长下的吸光度值。发现外泌体达到一定浓度后，对角质形成细胞出现明显的促增殖作用，其中50mg/L外泌体组的促细胞生长效果达到峰值，如图3所示。

荧光定量PCR

第4代角质形成细胞用50mg/L外泌体处理48h后，移去培养基，裂解细胞提取RNA，反转录得到cDNA，检测AKT、ERK1/2、VEGFA、HGF的基因表达，比较对照组与外泌体组的差异，发现以上细胞增殖和功能相关基因都有不同倍数的提高，如图4所示。

以上检测结果表明，本方法所得外泌体功效性良好。

本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明原理的前提下会有各种改进和变化，这些改进和变化也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于：该方法是在无菌条件下，从临床来源的脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞，从新生儿包皮组织中分离得到成纤维细胞，各自进行扩大培养。收集成纤维细胞条件培养基，与新鲜培养基按一定比例混合，用所得的混合培养基进行脂肪间充质干细胞的灌流培养，之后收集脂肪间充质干细胞的条件培养基，纯化得到外泌体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于脂肪间充质干细胞灌流培养的混合培养基中，成纤维细胞条件培养基的体积占比为20～50％。

3.根据权利要求1、3所述的方法，其特征在于，成纤维细胞条件培养基的添加可以在一定程度上模拟脂肪间充质干细胞在体内的生长环境，有助于脂肪间充质干细胞分泌内含物组成更接近人体正常生理情况的外泌体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将脂肪间充质干细胞接种于含有Cytodex微载体和上述混合培养基的生物反应器中，灌流培养扩增，然后收集条件培养基，纯化得到外泌体。

5.根据权利要求1、5所述的方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞接种密度为0.5～3×10⁵个/ml。

6.根据权利要求1、3、5所述的方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞灌流培养条件为：37℃，pH 7.2～7.4，Cytodex微载体浓度1～8g/L，搅拌速度40～50r/min，并持续通入90％～92％N₂∶5％CO₂∶3％～5％O₂的混合气体。

7.根据权利要求1、7所述的方法，其特征在于，在人脂肪间充质干细胞灌流培养过程中，保持3％～5％O₂的低氧环境，更接近体内氧含量。

8.根据权利要求1、5所述的方法，其特征在于，通过收集人脂肪间充质干细胞条件培养基进行纯化的方法得到大量外泌体。所述纯化的具体步骤为：收集干细胞培养所得条件培养基，通过超滤膜超滤去除小分子，采用微米过滤器过滤除菌，获得外泌体。

9.根据权利要求1、4、5、9所述的方法，其特征在于，产生外泌体的细胞类型包括但不限于脂肪间充质干细胞，用于模拟体内生理环境的细胞类型包括但不限于成纤维细胞。