CN108588017A - 一种脐带间充质干细胞的扩增方法及其在关节炎上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脐带间充质干细胞的分离培养技术的改良及其在关节炎上的应用，本发明提供一种脐带来源的间充质干细胞的分离培养方法及其在关节炎上的应用，包括如下步骤：1）采用酶消化法从人脐带中获得间充质干细胞；2）用添加碱性成纤维细胞生长因子及血小板衍生生长因子的DMEM/F12培养基联合富含血小板的血浆培养间充质干细胞；3）透明质酸的改良，在透明质酸中加入甲基丙烯酸酐，形成3D生物支架，可将间充质干细胞固定于骨关节损伤部位，进行定点修复；4）将培养的间充质干细胞，联合PRP、改良的透明质酸，一起注射至志愿者的骨关节处，治疗骨关节炎。

Description

一种脐带间充质干细胞的扩增方法及其在关节炎上的应用
技术领域
本发明涉及一种脐带间充质干细胞的扩增方法，以及应用该间充质干细胞联合其他成分治疗骨关节炎。
背景技术
骨关节炎是一种渐进和痛苦的疾病，既可影响年轻人，也可影响老年人。在老龄化的社会中，患病率有可能进一步增加。据估计全国至少有1亿人受到关节炎的影响。在世界范围内，关节炎是导致残疾的第四大原因。在发达国家和发展中国家，骨关节炎是导致残疾的一个重要因素。
骨关节炎为渐进性和不可逆性软骨退行性病变。关节软骨的修复能力非常差，软骨中无血管，因此缺乏系统性的调控，可能会导致无效的愈合。有证据表明骨关节炎与基质间充质干细胞的消耗相关，表现为间充质干细胞的增殖和分化能力下降。间充质干细胞的耗竭是退行性骨关节炎的主要原因，用再生细胞疗法，帮助关节内间充质干细胞再生有望治愈骨关节炎。
目前已有大量的临床前研究证实，间充质干细胞可治疗骨关节炎取得了良好的效果，国内外文献报道脐带间充质干细胞体外传代培养染色体核型正常稳定。国家863计划资助项目有研究采用胶原酶消化法体外扩增3个代次（P3、P5、P7）的脐带间充质干细胞，通过三个不同代次细胞的生长形态、染色体核型、免疫表型和诱导分化观察体外连续传代培养脐带间充质干细胞染色体核型的稳定性。结果显示，此法在体外扩增P7代内的间充质干细胞未发生染色体结构的异常改变，保持了正常人体二倍体核型，为临床应用脐带间充质干细胞提供了遗传学的试验依据。但实际应用过程中，脐带间充质干细胞的培养存在扩增能力有限等问题。干细胞的迁移性与干细胞的分化能力和损伤修复能力密切相关，因此，需要寻找一种新的脐带间充质干细胞培养方法，以促进其增殖、提高其迁移能力。
同时目前干细胞的移植途径是在损伤病变部位原位注射移植，这种方法创伤小，简单易行，但存在一定问题，损伤病变部位的穿刺点选择并不容易，且注射的干细胞在短时期内主动迁移、聚集到损伤部位的效率低下，真正到达损伤区存活和发挥功能的细胞数目较少，功能恢复有限。细胞移植的修复效果很大程度上取决于目标区域能够发挥治疗作用的细胞数量，这无疑使得干细胞的需要量大为增加，且注射入组织后，易受到周围正常组织的影响，如被组织液稀释而游走，一定时期内若无法达到目标区域，则可能贴附于周围组织结构，呈散在分布，即使能够存活增殖，也起不到理想的治疗作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种脐带间充质干细胞的扩增方法，以解决实际应用过程中，脐带间充质干细胞的培养存在扩增能力有限等问题，并应用该间充质干细胞联合其他成分共同治疗骨关节炎，以获取更好的治疗效果。
本发明的思路，采用酶消化法，从脐带中获得的间充质干细胞。用含有bFGF、PDGF及PRP的DMEM/F12培养基培养间充质干细胞。将扩增至一定数量的间充质干细胞，与改良的透明质酸、PRP混合后，通过关节腔内注射用于治疗骨关节炎。
基于以上思路，本发明提供一种脐带来源的间充质干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
（1）采用酶消化法从脐带中获得间充质干细胞：在GMP实验室的百级超净工作台上，将脐带剪短，剥离出华通氏胶，按体积比例10:1，加入0.25%~0.5%胰蛋白酶及0.2~0.4% EDTA，37℃条件下消化一段时间后，再加入1~5mg/mL I型胶原蛋白酶消化；
（2）扩增间充质干细胞：在DMEM/F12培养基中加入细胞生长因子bFGF、PDGF及富含血小板的血浆，在35~37℃，二氧化碳浓度1~5%的培养箱中培养间充质干细胞，所述细胞生长因子的浓度为：bFGF浓度为5~100ng/mL，PDGF活力单位为100~500U/mL，所述富含血小板的血浆是指自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，浓度为5~20%。
基于以上技术方案，本发明提供的脐带来源的间充质干细胞分离培养方法，一种较优的方法，包括如下步骤：1）无菌条件下，取下脐带，在GMP实验室的百级超净工作台上，将脐带剪短，剥离出华通氏胶，按体积比例10:1加入0.5%胰蛋白酶及0.2%EDTA，37度下消化2h，再加入1mg/mL的I型胶原蛋白酶，37度下消化1h，将上述消化液过200目筛网，吹打过滤；
2）将上述细胞悬液加入含有bFGF、PDGF及PRP的DMEM/F12培养基中，在37℃，二氧化碳浓度5%培养箱中培养48h，其中bFGF浓度为50ng/mL，PDGF活力单位为100U/mL，PRP的浓度为10%。
需要说明的是，上述方案中，生长因子是存在于体内并对机体细胞的生长发育具有调节作用的一类细胞因子，在体内含量极微，但是生物活性极高。其中bFGF和PDGF能促进间充质干细胞的增殖。用DMEM/F12联合PRP的培养基可有效促进间充质干细胞的增殖，保持间充质干细胞原有细胞形态。
富血小板血浆(PRP)，是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，PRP中含有大量生长因子及蛋白质，如转化生长因子-β(TGF-β)，类胰岛素生长因子（IGF），表皮生长因子（EGF），血管内皮生长因子（VEGF）等。bFGF能特异刺激间充质细胞的新陈代谢等生理过程，包括细胞的再生、分化和迁移等。PDGF是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质，是低分子量促细胞分裂素。能刺激停滞于G0/G1期的间充质细胞等多种细胞进入分裂增殖周期。
本发明还提供一种由上述获得的脐带来源的间充质干细胞的应用，即就是在骨关节处，将获得的间充质干细胞、PRP、改良的透明质酸，一起注射至志愿者的骨关节处，用于治疗骨关节炎，其中所述间充质干细胞注射的数量为100~300万/mL，PRP的浓度为10~15%，改良的透明质酸的浓度为5~10%，注射部位为关节腔内注射，一次注射3~5ml。
上述应用中，所述改良的透明质酸的制备方法，包括如下步骤：1）将1~5%的透明质酸，分子量为1.8~2.2 MDa，置于一个圆底烧瓶中，加入过量的浓度为10~15M的甲基丙烯酸酐，用氢氧化钠溶液调节pH值至10~12；
2）24h后，将反应混合物慢慢加入到过量的乙醇中，产生沉淀。离心后收集沉淀，弃上清液。乙醇再次沉淀，去除未反应的甲基丙烯酸酐；
3）将透明质酸—甲基丙烯酸酐转移至圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空干燥除去过量的乙醇；
4）将样品转移到50ml锥形管中，在真空下冻干。
一种更优化的改良的透明质酸的制备方法，包括如下步骤：1）将1%的透明质酸，分子量为1.8MDa，置于一个圆底烧瓶中，加入过量的浓度为10M的甲基丙烯酸酐，用氢氧化钠溶液调节pH值至10.0；
2）24h后，将反应混合物慢慢加入到过量的乙醇中，产生沉淀。离心后收集沉淀，弃上清液。乙醇再次沉淀，去除未反应的甲基丙烯酸酐；
3）将透明质酸—甲基丙烯酸酐转移至圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空干燥除去过量的乙醇；
4）将样品转移到50ml锥形管中，在真空下冻干。
本发明提供的脐带间充质干细胞的扩增方法细胞扩增速度快、在规定的细胞繁殖代数内，可以得到浓度为1×106细胞/ml的脐带间充质干细胞，在透明质酸中加入甲基丙烯酸酐，使其形成新型的水凝胶结构，即3D生物支架，可将间充质干细胞固定于损伤部位，进行治疗骨关节炎，取得了良好的效果。
附图说明
图1表示，最佳bFGF浓度的筛选；
图2表示，最佳PDGF浓度的筛选；
图3表示，相同的培养条件，不同的培养基培养间充质细胞8天，经细胞生长曲线检测各组细胞的活力；
图4表示，扩增培养的脐带间充质干细胞的形态特征（100X）；
图5表示，脐带间充质干细胞经过成骨分化诱导后，茜素红染色结果，可见典型钙质沉积于分化的成骨细胞周围；
图6表示，脐带间充质干细胞经过成脂分化诱导后，油红-O染色结果，可见典型脂滴沉积于分化的脂肪细胞细胞质中。
具体实施方式
1材料和方法
1.1材料
正常孕妇生产胎儿，经本人同意后，取下脐带。脐带由西安某医院提供。
胰酶消化液，I型胶原蛋白、PDGF、bFGF购自sigma；
DMEM/F12，FBS购自Gibco；
细胞计数试剂盒购自西安赫特生物科技有限公司；
间充质干细胞的无血清培养基购自STEMCELL；
PRP为自体全血经离心后得到的血小板浓缩物。
1.2 用EXCEL统计软件分析，进行方差分析，当p＜0.05时，差异具有统计学意义。
实施例1：间充质干细胞分离培养。在手术室内，取下脐带，将其保存于无菌生理盐水中，用冷链运输至实验室。在GMP实验室的百级超净工作台上，用无菌手术器械，剥离出华通氏胶，将其加入10倍体积的胰酶消化液（0.5%胰酶+0.2%EDTA），37度下消化2h。再加入1mg/mL I型胶原蛋白继续消化1h。将上述悬液过200目筛网，吹打过滤。将上述细胞悬液与培养基混合，重悬后，加入至T25细胞培养瓶中，37度，5%二氧化碳培养箱中培养至P1代。
实施例2：将实验分为五组，A组（DMEM/F12+ 10%PRP+5ng/mL bFGF）、B组（DMEM/F12+ 10%PRP +10ng/mL BFGF）、C组（DMEM/F12+ 10%PRP + 20ng/mL bFGF）、D组（DMEM/F12+10%PRP + 50ng/mL bFGF）、E组（DMEM/F12+ 10%PRP + 100ng/mL bFGF）。
将P1代细胞，离心后，用含有10%PRP的DMEM/F12培养基重悬，调节密度至5×104个/mL，以500μL/孔接种于5块24孔板中。依据分组，在相应的孔中，加入不同浓度的bFGF，每组24个孔。随后将5块24孔板放入37度，5%二氧化碳培养箱中进行培养，并在1 d、2 d、3 d、4d、5 d、6 d、7 d、8d，共8个时间点，每个时间点取各组中3个孔的细胞进行细胞计数。
图1的实验结果显示，D组细胞增殖速度最快。表明bFGF的最佳浓度为50ng/mL。
实施例3：将实验分为五组，A组（DMEM/F12+ 10%PRP + 20U/mL PDGF）、B组（DMEM/F12+ 10%PRP + 50U/mL PDGF）、C组（DMEM/F12+ 10%PRP + 100U/mL PDGF）、D组（DMEM/F12+10%PRP + 200U/mL PDGF）、E组（DMEM/F12+ 10%PRP + 500U/mL PDGF）。
将P1代细胞，离心后，用含有10%PRP的DMEM/F12培养基重悬，调节密度至5×104个/mL，以500μL/孔接种于5块24孔板中。依据分组，在相应的孔中，加入不同浓度的PDGF，每组24个孔。随后将5块24孔板放入37度，5%二氧化碳培养箱中进行培养，并在1 d、2 d、3 d、4d、5 d、6 d、7 d、8d，共8个时间点，每个时间点取各组中3个孔的细胞进行细胞计数。
图2的实验结果显示，C组细胞增殖速度最快。表明PDGF的最佳浓度为100U/mL。
实施例4：将实验分为三组，A组（间充质干细胞的无血清培养基）、B组（DMEM/F12+10%FBS）、C组（DMEM/F12+ 10%PRP + 50ng/mL bFGF、100U/mL PDGF）。
将P1代细胞分为三份，离心后，依据分组情况，用相应的培养基重悬，调节密度至5×104个/mL，以500μL/孔接种于3块24孔板中，每组24个孔。随后将3块24孔板放入37度，5%二氧化碳培养箱中进行培养，并在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8d，共8个时间点，每个时间点取各组中3个孔的细胞进行细胞计数。
其结果显示，培养2d后，三组细胞均开始增殖并进入对数增长期。其中B组在培养3~6d间细胞增殖稍快，而A组和C组在培养3~6d间细胞增殖稍慢，但三组细胞培养7d后，无显著性差异（p＜0.01）。
图3的细胞生长曲线实验证实了，采用C组（DMEM/F12+ 10%PRP +50ng/mL bFGF、100U/mL PDGF）培养基可有效促进细胞的增殖，其增殖速度与A组（间充质干细胞的无血清培养基）、B组（DMEM/F12+10%FBS）相当。A组为STEMCELL公司研制的间充质干细胞的无血清培养基，引起造价过高，而无法大面积推广使用。B组培养基中含有胎牛血清，在给人输注的间充质细胞培养中，不建议使用异源血清。细胞生长曲线实验结果表明，在含有10%PRP的DMEM/F12培养基中加入50ng/mL bFGF、100U/mL PDGF，进行间充质干细胞培养，其效果与加入胎牛血清相似。
实施例5：将分离的P1代间充质干细胞进行扩增培养。将细胞培养于DMEM/F12、10%PRP 、50ng/mL bFGF及100U/mL PDGF中，扩增至第3代，大约3~4×106细胞。对扩增的间充质干细胞进行质控检测。分别进行形态观察、表面标记物检测以及间充质干细胞诱导分化为骨细胞及脂细胞的检测。其中图4为扩增的脐带间充质干细胞的形态特征（100X）。图5为脐带间充质干细胞经过成骨分化诱导后，茜素红染色结果。可见典型钙质沉积于分化的成骨细胞周围。图6为脐带间充质干细胞经过成脂分化诱导后，油红-O染色结果。可见典型脂滴沉积于分化的脂肪细胞细胞质中。综上所述，表面，扩增培养的间充质干细胞符合质量要求。回输前，对间充质干细胞分别进行甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等传染病检测，以及进行细菌、真菌、内毒素等微生物检测。各项指标均为阴性，符合回输标准。
实施例6：将透明质酸（分子量1.8 MDa）溶解于蒸馏水中，其终浓度为1%。将溶液置于一个圆底烧瓶中，在水浴中冷却到5°C后搅拌。在烧瓶中加入过量的10M甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride MA），用5N氢氧化钠溶液调节pH值至10.0。24h后，将反应混合物慢慢加入到过量的乙醇中，产生沉淀。离心后收集沉淀，弃上清液。乙醇再次沉淀，去除未反应的MA。将HA-MA转移至圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空干燥除去过量的乙醇。干燥后，将样品溶解于蒸馏水中，透析三天，每天更换新的蒸馏水。然后将样品转移到50ml锥形管中，在真空下冻干。
实施例7：将增殖至3×106的间充质细胞收集后，离心，调节其密度为1×106个/mL，用2.7ml生理盐水重悬，加入0.3ml PRP，0.15g改良的透明质酸，将混合物晃动溶解后。选取3~5名膝关节炎志愿者，将3ml含间充质干细胞的混合液注射至关节腔内。一个疗程为3次，每次间隔2周。6周后，对比志愿者的注射效果，症状明显，改善随访6个月，影像学（MRI）增加软骨体积，组织学评估确认玻璃样软骨再生，II型胶原的存在。此处仅以膝关节炎举例，不限于膝关节炎，可用于全身各处关节炎的治疗。
综上所述，采用酶法消化皮肤后，在含有10%PRP的DMEM/F12培养基中加入50ng/mLbFGF、100U/mL PDGF后，其间充质细胞扩增效果明显。将扩增后的间充质细胞，与PRP、改良的透明质酸混合后，注射至关节内，治疗膝关节炎，取得了明显的改善。

Claims (6)

1.一种脐带来源的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用酶消化法从脐带中获得间充质干细胞：在GMP实验室的百级超净工作台上，将脐带剪短，剥离出华通氏胶，按体积比例10:1，加入0.25%~0.5%胰蛋白酶及0.2~0.4% EDTA，37℃条件下消化一段时间后，再加入1~5mg/mL I型胶原蛋白酶消化；
扩增间充质干细胞：在DMEM/F12培养基中加入细胞生长因子bFGF、PDGF及富含血小板的血浆，在35~37℃，二氧化碳浓度1~5%的培养箱中培养间充质干细胞，所述细胞生长因子的浓度为：bFGF浓度为5~100ng/mL，PDGF活力单位为100~500U/mL，所述富含血小板的血浆是指自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，浓度为5~20%。
2.一种脐带来源的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1）无菌条件下，取下脐带，在GMP实验室的百级超净工作台上，将脐带剪短，剥离出华通氏胶，按体积比例10:1加入0.5%胰蛋白酶及0.2%EDTA，37度下消化2h，再加入1mg/mL的I型胶原蛋白酶，37度下消化1h，将上述消化液过200目筛网，吹打过滤；
2）将上述细胞悬液加入含有bFGF、PDGF及PRP的DMEM/F12培养基中，在37℃，二氧化碳浓度5%培养箱中培养48h，其中bFGF浓度为50ng/mL，PDGF活力单位为100U/mL，PRP的浓度为10%。
3.根据权利要求1～2任意一项权利要求获得的脐带来源的间充质干细胞的应用，其特征在于，在骨关节处，将获得的间充质干细胞、PRP、改良的透明质酸，一起注射至志愿者的骨关节处，用于治疗骨关节炎。
4.根据权利要求3所述的脐带来源的间充质干细胞的应用，其特征在于，所述间充质干细胞注射的数量为100~300万/mL，PRP的浓度为10~15%，改良的透明质酸的浓度为5~10%。
5.根据权利要求4所述的脐带来源的间充质干细胞的应用，其特征在于，所述改良的透明质酸的制备方法，包括如下步骤：1）将1~5%的透明质酸，分子量为1.8~2.2 MDa，置于一个圆底烧瓶中，加入过量的浓度为10~15M的甲基丙烯酸酐，用氢氧化钠溶液调节pH值至10~12；
2）24h后，将反应混合物慢慢加入到过量的乙醇中，产生沉淀，离心后收集沉淀，弃上清液，乙醇再次沉淀，去除未反应的甲基丙烯酸酐；
3）将透明质酸—甲基丙烯酸酐转移至圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空干燥除去过量的乙醇；
4）将样品转移到50ml锥形管中，在真空下冻干。
6.根据权利要求4所述的脐带来源的间充质干细胞的应用，其特征在于，所述改良的透明质酸的制备方法，包括如下步骤：1）将1%的透明质酸，分子量为1.8MDa，置于一个圆底烧瓶中，加入过量的浓度为10M的甲基丙烯酸酐，用氢氧化钠溶液调节pH值至10.0；
2）24h后，将反应混合物慢慢加入到过量的乙醇中，产生沉淀，离心后收集沉淀，弃上清液，乙醇再次沉淀，去除未反应的甲基丙烯酸酐；
3）将透明质酸—甲基丙烯酸酐转移至圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上，真空干燥除去过量的乙醇；
4）将样品转移到50ml锥形管中，在真空下冻干。
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