CN103861088A - 一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂及其制备方法，本发明制剂中含有间充质干细胞（60~100）×10⁶个／m1，添加HGF20ng／m1和FGF-410ng／m1，溶剂为自体富血小板血浆裂解液。制备方法：（1）采集脐带，原代培养，获得细胞。（2）流式细胞仪检测，此种细胞表达CD29、CD73、CD90和CD105。（3）收集细胞，取人脐带间充质干细胞（60~100）×10⁶个，溶解在1毫升自体富血小板血浆裂解液中，添加HGF20ng和FGF-410ng，配制成1毫升的干细胞制剂。本发明来源丰富，易于获得，脐带间充质干细胞免疫原性弱，富血小板血浆取自患者自身，不存在免疫原性。

Description

一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗原发性肝癌的细胞制剂及其制备方法。这种细胞制剂中的细胞来自脐带中的间充质干细胞，添加肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因-4，细胞悬浮在1毫升自体富血小板血浆裂解液中，用于治疗原发性肝癌造成的肝细胞损伤。

背景技术

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)居恶性肿瘤发病率的第五位, 全球每年死亡人数约100万。目前，大部分原发性肝癌患者缺乏有效的治疗手段,总的生存率仅为3%~5%。原发性肝癌的发生是多因素、多途径、多步骤长期作用的结果，包括外环境致癌因素和自身遗传因素。具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、侵袭性强、易转移、预后差等特点。肝移植虽已成为治疗原发性肝癌的重要手段，但供体短缺、手术损伤、免疫排斥以及费用高昂等问题构成了肝脏器官移植技术发展的主要障碍。因此，开展具有疗效高、侵入性小、并发症少等特点的干细胞移植具有重要的临床意义。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来自于中胚层，并且可以向三个胚层分化的一类干细胞，在组织工程等方面有广泛的用途，是国内外广泛关注的一类细胞。目前间充质干细胞主要来自骨髓和脂肪，但骨髓和脂肪中的间充质干细胞数量有限，因其易被病毒感染以及较强的免疫原性等因素限制了其在临床的应用。

本发明采用的间充质干细胞来源于脐带中留存下来的未分化的原始细胞，具有长期自我更新和多向分化的潜能。脐带的结构从外到内依次为脐带上皮、羊膜下基质、裂隙、血管间基质（华通胶）、血管周围基质、血管（两动脉一静脉）。目前从脐带的不同的组织部位都获得了间充质干细胞，而其主要来源是血管间的华通胶基质。

国内外均已证明在特定条件下，间充质干细胞在体内、体外特定诱导条件下均可转化为肝细胞样细胞，并能行使肝细胞的功能。与骨髓间充质干细胞相比人脐带间充质干细胞以其易得、原始、增殖力强、免疫原性低、不涉及法律伦理等优势而越来越受到人们的重视。有研究证实间充质干细胞在肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因-4的作用下可形成肝细胞样细胞，参与肝脏损伤的修复。间充质干细胞可产生多种分子，如趋化因子、细胞因子和生长因子等，它们以旁分泌的形式调节和增强人体的免疫系统功能，从而增强机体的抗癌作用。

脐带组织包含丰富的间充质干细胞，脐带间充质干细胞具有以下特点：（1）增殖能力强：体外培养第七代后可扩增300倍，且无明显衰老迹象，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，能分化成肝细胞样细胞，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。（2）免疫原性低：脐带间充质干细胞可剂量依赖性的抑制激活T淋巴细胞增殖，同时可维持和促进调节性T淋巴细胞扩增。脐带间充质干细胞抑制免疫细胞的增殖，不会引起同种异源或异种免疫细胞的增殖，具有免疫调节作用和较低的免疫原性。（3）致肿瘤风险低：脐带间充质干细胞具有稳定的端粒酶活性，培养多代也不会丧失锚定依赖性和血清依赖性，在维持其增殖性的同时不具有致肿瘤性。（4）来源方便，易于分离培养、扩增和纯化。

富血小板血浆（PRP）裂解液是自体全血经离心分离得到的，是血小板含量高于普通全血4～8倍的浓缩血浆。PRP中富含大量自体源性生长因子，这些生长因子相互协同作用，有促进组织再生、创面愈合、新生血管形成、减少瘢痕等作用，能诱导间充质干细胞的增殖分化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂及其制备方法。本发明所要解决的技术是弥补缺血心肌病目前常规治疗方法的不足。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂，它是由人脐带间充质干细胞按体重配制，并添加肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4，细胞悬浮在富血小板血浆裂解液中制备而成。

进一步的，所述的人脐带间充质干细胞按（0.5~5）×10⁶个细胞每千克体重配制。

进一步的，所述的肝细胞生长因子添加量为 20 ng／m1 ，成纤维细胞生长因子-4添加量为10 ng／m1。

进一步的，所述的富血小板血浆裂解液来自患者外周血。

进一步的，所述的富血小板血浆裂解液每次用量为1ml。

一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂的制备方法，由下述步骤组成：

（1）采集脐带，原代培养，获得细胞；

（2）流式细胞仪检测，此种细胞表达基质细胞标记和黏附分子CD29、CD73、CD90、CD105，不表达CD14和CD34；

（3）制备自体富血小板血浆裂解液；

（4）收集细胞，取人脐带间充质干细胞（60~100）×10⁶个悬浮在自体富血小板血浆裂解液中，并加入HGF 20 ng／m1 和FGF-4 10 ng／m1，配制成1毫升的制剂。

进一步的，所述的步骤（1）包括：将检测合格的脐带经过机械切割后，经过II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，将细胞悬液接种在含胎牛血清和双抗(青霉素，链霉素)的DMEM／F12培养基的培养瓶中，待成纤维状细胞达到70-80%融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集第3~5代细胞冻存、复苏备用。

    本发明的优点在于：

（1）将人脐带间充质干细胞混合肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4，能明显提高病人的生存能力，调理受损的肝脏组织微环境、促进肝细胞再生和功能的恢复，因为肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4可对脐带间充质干细胞进行诱导分化，能使其定向分化为表达白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白18和储存糖原、低密度脂蛋白的肝细胞样细胞。。

（2）利用人脐带间充质干细胞制剂通过肝动脉移植或静脉输注方式移植给原发性肝癌病人，明显改善病人的生存率，改善全身状态和肝功能状态，开辟原发性肝癌治疗的新途径。因此，我们选择人脐带间充质干细胞治疗原发性肝癌，开发用于治疗肝细胞损伤的干细胞制剂及其制备方法具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。

（3）本发明利用的人脐带间充质干细胞活力高、增殖能力强、制备简便、连续培养及冻存复苏后仍有多向分化潜能，细胞同质性高，具有正常的核型和端粒酶活性。

（4）本发明利用人脐带间充质干细胞制备的制剂也可以利用静脉输注，技术方案简便、易操作。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1A为实施例1中用胶原酶消化法分离得到的单个细胞，原代培养24小时内开始贴壁，5天内大部分细胞贴壁，细胞多呈现为菱形。

图1B为实施例1中传代后的细胞，纯度高，形态均一，可呈涡旋状生长。

图2为实施例1中经过流式细胞仪检测的结果，脐带间充质干细胞表达基质细胞标记和黏附分子CD29、CD73、CD90和CD105，不表达造血干细胞标志CD34以及CD14。

图3为实施例3 中HGF+FGF-4 诱导14天的间充质干细胞形态。

图4 为实施例3中 RT-PCR 检测的结果，3A:诱导14天检测AFP；3B：诱导21天检测AFP；3C：诱导14天检测ALB；3D：诱导21天检测ALB。（ M:Marker； 1：未诱导组；2：HGF诱导组；3：FGF-4诱导组；4：HGF+FGF-4诱导组；5：L-02肝细胞）

图5、图6为实施例4中高、中分化的肝细胞癌；细胞排列结构紊乱, 染色质明显增粗, 细胞大小、形状各异, 可见瘤巨细胞和病理性核分裂。

图7为实施例4中逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR ) 检测的结果, 成癌的C57BL/6J 小鼠肝癌组织中可检测到高水平的AFP mRNA 的表达, 而肿瘤远端的肝组织无AFP基因表达。

图8 A、B为实施例4中用HE染色的结果，可见肝窦周围有大量的肝细胞聚集，并且增生活跃。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

实施例1：人脐带间充质干细胞制剂的制备

将检测合格的脐带用D-hank’s平衡盐溶液充分洗涤，冲去脐静脉和脐动脉内的残留血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，将其剪碎至约1 立方毫米的组织块，移入质量分数0.1％的II型胶原酶中，37℃消化20 小时，过100目筛网，收集含细胞的滤液，室温下以1200 转每分钟离心10 分钟，弃去上清，保留沉淀；将细胞接种在含10% 胎牛血清和含100u／mL双抗(青霉素，链霉素)的DMEM／F12培养液的培养瓶中培养，培养瓶置于37℃，体积分数为5％二氧化碳的饱和湿度环境下培养，待成纤维状细胞达到70-80%融合时，用质量分数0.25％胰酶进行消化，按1：2的比例传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的。用胶原酶消化法分离得到的单个细胞，原代培养24小时内开始贴壁，5天内大部分细胞贴壁，细胞多呈现为菱形，如图1A所示，传代后细胞纯度高，形态均一，可呈涡旋状生长，如图1B所示。

D-hank’s平衡盐溶液：溶剂为水，含有如下溶质：0.8%的NaCl、0.04%的KCl、0.006%的NaHPO₄﹒H₂O和0.006%的KH₂PO₄；%均为质量百分含量。

收集单细胞悬液供移植用，收集第3~5代细胞严格按照低温保存步骤冻存备用。收集方法为：

1、将培养瓶内的人脐带间充质干细胞用10毫升的D-hank’s平衡盐溶液清洗两次；

2、用质量分数0.25％胰酶37°C条件下消化3分钟，消化过程中在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保人脐带间充质干细胞完全消化；

3、2ml 含10% 胎牛血清和含100u／mL双抗(青霉素，链霉素)的DMEM／F12培养液终止消化，然后在培养瓶中加入10ml D-hank’s平衡盐溶液，反复吹打使细胞悬浮，得到细胞悬液。之后，1500转每分钟离心5分钟，弃去上清液，将细胞用D-hank’s平衡盐溶液重悬细胞，再1500转每分钟离心5分钟，弃去上清液，D-hank’s平衡盐溶液重悬细胞至（60~100）×10⁶个细胞每毫升，得到人脐带间充质干细胞；

4、将细胞悬液进行活细胞计数，方法如下：将细胞悬液和0.4%台盼兰溶液等体积混合，轻轻混匀；1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数；活细胞排斥台盼兰，染成蓝色的细胞是死细胞；

5、将细胞悬浮液1500转每分钟离心5分钟，弃去上清液，细胞沉淀溶解在1毫升自体富血小板血浆裂解液中，数量（60~100）×10⁶个，并加入HGF 20 ng和FGF-4 10 ng；

其中，所述的DMEM／F12培养基选自GIBCO公司的CAT NO.12400-024产品。

所述的人脐带间充质干细胞呈成纤维样贴壁生长，流式细胞仪检测，此种细胞表达基质细胞标记和黏附分子CD29、CD73、CD90和CD105，不表达CD14和CD34，如图2所示。说明这种细胞具有干细胞的特征。体外在合适的诱导条件下可以向成骨、肝细胞样细胞、心肌细胞分化。本发明中所述的细胞群表达是指阳性率大于等于98%，不表达或低表达是指阳性率小于等于2%。

实施例2：PRP裂解液的制备

PRP裂解液的制作全过程严格无菌，取患者静脉血10ml，200g离心20min，收集上层清液，即为富血小板血浆。富血小板血浆经过-80⁰C冰箱和37⁰C水浴锅快速冷冻--解冻，离心后的上清液即是富血小板血浆裂解液。

实施例3：检测肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4促使脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞方向分化

1、细胞培养：在含10% 胎牛血清和100u／mL双抗(青霉素，链霉素)的DMEM／F12培养液的培养皿中接种脐带间充质干细胞，隔天换液，待细胞融合度达到50%时进行实；

2、实验分组：A组(阴性对照组)：未加诱导因素；B组：HGF(20 ng／ml)；C组：FGF-4(10 ng／m1)；D组：HGF(20 ng／m1)+FGF-4(10 ng／m1)；E组(阳性对照组)：L-02人肝细胞株；

3、RT-PCR检测：各组在诱导第l4、21天进行AFP、ALb mRNA 的RT-PCR检测，A、E组分别为阴、阳性对照组。AFP的表达：AFP Sense 5＇-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3＇；Anti：5＇-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3＇ 产物 3l7 bp。Alb的表达：Alb Sense 5＇-TGCTrGAATGTGCTGATGATGACAGGG-3＇；Anti：5＇-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3＇ 产物162 bp。GAPDH(内参照物)的表达：Sense 5＇-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3＇：Anti：5＇-CAAAGTFGTCATGGATGGACC-3＇ 产物500 bp。反应条件为：变性94℃ 45 s，退火58℃ 1 min，延伸72℃ 45 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物于2％ 的琼脂糖凝胶、0.5×TBE缓冲液中电泳检测，电泳条件为60 V恒压。（AFP:甲胎蛋白，Alb：白蛋白，RNA:核糖核酸，mRNA：信使RNA，RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应）；

所述人L-02肝细胞株购自上海细胞生物研究所。AFP、Alb反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。

实验结果发现，HGF和FGF-4作为诱导因子，可使梭形或成纤维细胞样的脐带间充质干细胞随着诱导时间的延长，变成纺锤形、不规则圆形或多角形细胞，数量逐渐变多，与L-02肝细胞形态相似，如图3所示。RT-PCR结果发现B、C、D以及E组细胞第l4、21天AFP、Alb mRNA均为阳性表达，而A组细胞AFP、Alb mRNA均为阴性表达，如图4所示。HGF和FGF-4具有诱导脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的能力。

实施例4：动物试验—对C57BL/6J 小鼠移植人脐带间充质干细胞

小鼠肝癌模型的建立及细胞移植：将C57BL/6J 小鼠首先用二甲基亚硝胺1次腹腔注射100mg / kg (生理盐水配制)；3天后开始以四氯化碳和橄榄油(配制体积比20：80) 灌胃, 0.05 mL/10 g,2 次/周；第3周再次腹腔灌注二甲基亚硝胺1次( 50mg/kg)，同时开始给予含有9%乙醇的饮用水。第4周开始加大四氯化碳剂量至0.08mL/10 g。实验期间喂以小鼠颗粒饲料。取实验组和对照组的小鼠肝脏标本。

肝癌模型动物经尾静脉移植0.1mL细胞悬液约（6~10）×10⁶个人脐带间充质干细胞，正常对照组经尾静脉注射0.1ml 生理盐水，每周一、三、五各注射1次。于第二周、第四周取细胞移植组肝脏标本。

肝脏标本的收集与处理：取肝癌模型实验组肝癌组织及对照组正常肝组织, 用3 %中性多聚甲醛固定,常规石蜡包埋, 制成5μm 厚的连续切片；苏木素-伊红( HE ) 染色, 光镜观察。另留取小块新鲜肝肿块组织和正常肝组织快速冷冻, 用于检测小鼠甲胎蛋白(AFP) 分子的表达。

镜下显示实验组小鼠均为中、高分化肝细胞癌( HCC )，细胞排列结构紊乱, 染色质明显增粗, 细胞大小、形状各异, 可见瘤巨细胞和病理性核分裂，如图5、图6所示。

AFP 基因表达的检测：从肿块远端正常肝组织(距离癌肿20毫米以上) 和小鼠肝癌组织中分别抽提总RNA , 操作按Trizol 试剂说明进行。AFP 扩增引物为: 上游引物5′-CTGGCGATGGGTGTTTAG-3′；下游引物5 ′-TGGTTGTTGCCTGGAGGT-3 ′(由北京赛百盛生物工程公司合成)，预计目的片段474 bp。扩增条件: 94℃ 4 min , 94 ℃ 30 s ,56℃ 45 s ，72℃ 2 min；30 个循环后72 ℃延伸5min，1%琼脂糖凝胶电泳观察并照相。逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR ) 检测发现, 成癌的C57BL/6J 小鼠肝癌组织中可检测到高水平的AFP mRNA 的表达,如图7所示，而肿瘤远端的肝组织无AFP基因表达。说明诱导肝癌实验成功。

细胞移植组肝脏标本的收集与处理：用HE染色，可见肝窦周围有大量的肝细胞聚集，并且增生活跃，如图8A、8B所示。观察小鼠肝脏血管新生程度发现，细胞移植组第四周血管密度较对照组明显增加。

肝脏标本的免疫荧光染色：冰冻切片复温，D-hank’s平衡盐溶液浸泡，兔抗人VEGF、CD31和Flk-1多克隆抗体（1:100，Santa Cruz biotechnology）作一抗，FITC(异硫氰酸荧光素)链接羊抗兔二抗孵育，激光共聚焦荧光显微镜观察，绿色为抗体染色阳性，红色为Dil（细胞膜红色荧光探针）标记的脐带间充质干细胞，黄色为脐带间充质干细胞阳性细胞。

细胞移植后的小鼠肝脏组织免疫学分析显示：移植上述细胞制剂的小鼠肝组织表达人的肝细胞特异性抗原AFP。同时也表达人的内皮细胞特异性标志CD31。肝脏冰冻组织切片在荧光显微镜下观察，发现血管周围有散布的能激发红色（代表CM-Dil）和绿色（代表FITC-CD31、FITC-VEGF或FITC-FLT-1）双荧光的细胞。RT-PCR表明了人肝细胞特异性蛋白Alb和AFP转录，同时也表明了人内皮细胞特异性标志蛋白CD31、FLT-1、VEGF的转录(VEGF:血管内皮生长因子)。这些结果说明移植的脐带间充质干细胞能整合到损伤的肝组织中去。

肝功能恢复情况：细胞移植组血浆谷丙转氨酶（ALT）（对照组：205.00±60.00 U/L，细胞移植组：138.50±34.16 U/L,P<0.05），血浆谷草转氨酶（AST）（对照组：AST 271.50±51.64 U/L、细胞移植组：193.00±37.8 U/L，P<0.01）,血浆总胆红素（Tbil）(对照组：14.00±2.67 umol/l,细胞移植组：9.1±2.83 umol/l,P<0.01)较对照组明显降低。表明人脐带间充质干细胞移植到肝癌模型的C57BL/6J 小鼠后肝功能测定结果较对照组有所好转。

上述动物试验证明：体内移植间充质干细胞可以到达损伤的肝脏，应用RT-PCR技术表明损伤的肝组织有人特异性肝细胞标志AFP、Alb和肝细胞生长因子mRNA和人特异性内皮细胞标志CD31、Flt-1、IGF和VEGF mRNA的表达。免疫组织化学和免疫荧光方法分析表明移植的细胞在损伤的肝组织不仅分化为肝细胞样细胞而且可以分化为内皮细胞样细胞，修复肝脏微血管，参与肝细胞增生，改善肝功能。

因此，我们选择人脐带间充质干细胞治疗原发性肝癌，开发用于治疗肝组织损伤的干细胞制剂及其制备方法具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂，其特征在于：它是由人脐带间充质干细胞按体重配制，并添加肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4，细胞悬浮在富血小板血浆裂解液中制备而成。

2.根据权利要求1所述的一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂，其特征在于：所述的人脐带间充质干细胞按（0.5~5）×10⁶个细胞每千克体重配制。

3.根据权利要求1所述的一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂，其特征在于：所述的肝细胞生长因子添加量为 20 ng／m1 ，成纤维细胞生长因子-4添加量为10 ng／m1。

4.根据权利要求1所述的一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂，其特征在于：所述的富血小板血浆裂解液来自患者外周血。

5.根据权利要求1所述的一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂，其特征在于：所述的富血小板血浆裂解液每次用量为1ml。

6.权利要求1所述的一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂的制备方法，其特征在于：由下述步骤组成：

（1）采集脐带，原代培养，获得细胞；

（2）流式细胞仪检测，此种细胞表达基质细胞标记和黏附分子CD29、CD73、CD90、CD105，不表达CD14和CD34；

（3）制备自体富血小板血浆裂解液；

（4）收集细胞，取人脐带间充质干细胞（60~100）×10⁶个悬浮在自体富血小板血浆裂解液中，并加入HGF 20 ng／m1 和FGF-4 10 ng／m1，配制成1毫升的制剂。

7.根据权利要求6所述的一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）包括：将检测合格的脐带经过机械切割后，经过II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，将细胞悬液接种在含胎牛血清和双抗(青霉素，链霉素)的DMEM／F12培养基的培养瓶中，待成纤维状细胞达到70-80%融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集第3~5代细胞冻存、复苏备用。

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