CN104623638A - 一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，本发明的干细胞贴剂具有间充质干细胞分子标志和生物学特性、免疫原性低，不发生免疫排斥，并添加针对黑色素瘤的有效因子等，可以有效治疗和修复黑色素瘤。本发明还提供上述干细胞贴剂的制备方法，由下述步骤组成，包括：来源于骨髓的间充质干细胞的制备，生物膜的制备和预处理，间充质干细胞生物膜的构建、间充质干细胞生物膜的诱导和抗黑色素瘤的干细胞贴剂形成。该方法采用来源广泛的干细胞产品，制备过程简单、可靠、重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和再生医学领域，具体涉及一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂及其制备方法。
背景技术
恶性黑色素瘤是一种高度恶性的肿瘤，其发病率占到皮肤科肿瘤的第三位，且呈逐年上升的态势。恶性黑色素瘤的恶性程度较高，且多发生转移，预后比较严重。患者的死亡率也会随着肿瘤侵袭的深度而增加。目前除了及早发现并行手术切除外，并无其他有效治疗手段。但目前许多肿瘤在发现时已发生转移，所以单纯的手术切除很难达到根治的目的。而以放、化疗为辅助手段对恶性黑色素瘤的治疗收效甚微。所以寻求一种高效、安全的辅助治疗手段正成为人类迫切的需求。
随着近些年对间充质干细胞研究的深入，人们发现干细胞具有自我更新、不断增殖和高分化潜能，为肿瘤的治疗提供了新的思路，即利用干细胞的增殖、定向分化、选择性归巢和分泌免疫细胞、NK细胞、细胞因子和组织因子的特性对肿瘤细胞进行杀伤，并对异常细胞进行快速修复。特别是间充质干细胞具有如下特点：（1）间充质干细胞的组织来源丰富，目前人们已成功的从骨髓、废弃胚胎、脐血、羊膜、脂肪等组织中成功提取到间充质干细胞。（2）间充质干细胞易于进行体外扩增。（3）间充质干细胞体外基因转染率高，且能稳定表达转染基因。（4）间充质干细胞的免疫源性较低，异体移植不易发生排异反应。（5）间充质干细胞具有向损伤以及肿瘤组织迁移的能力。已有研究发现间充质干细胞参与肿瘤的多项病理过程，包括肿瘤的细胞增殖、凋亡和侵袭转移，但在不同的肿瘤组织类型中其作用表现出很大的差异性，如乳腺癌、肺癌、结肠癌中，间充质干细胞促进肿瘤生长和转移，而在卡波氏肉瘤、肝细胞癌、黑色素瘤中，间充质干细胞却表现出抑制肿瘤细胞的生长作用。基于以上种种优点，间充质干细胞将可能成为一种理想的治疗手段和载体，携带抗肿瘤药物或者抗癌基因到达肿瘤组织，发挥抗肿瘤的作用。
黑色素瘤早期临床表现为痣或色素斑迅速增大，隆起，破溃不愈，边缘不整或有切迹、锯齿，颜色改变、局部形成水泡、瘙痒、刺痛等。进而可出现卫星灶、局部淋巴结肿大，移行转移（原发病灶与区域引流淋巴结之间的皮下结节，通过淋巴管转移）和远处转移。利用恶性黑色素瘤由于其特殊的解剖部位，易发生在皮肤层面，与内脏和四肢肿瘤不同的特性，使我们开发出一种针对恶性黑色素瘤并可用于皮肤层的干细胞贴剂，治疗方式直接且见效快，增强肿瘤治疗的预后。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，本发明的干细胞贴剂具有间充质干细胞分子标志和生物学特性、免疫原性低，不发生免疫排斥，并添加针对黑色素瘤的有效因子等，可以有效治疗和修复黑色素瘤。
本发明的另一目的在于提供上述干细胞贴剂的制备方法，该方法采用来源广泛的的干细胞产品，制备过程简单、可靠、重现性好。
为实现上述目的，达到以上技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，由下述主要原料和基质部分制备而成，主要原料包括1×106个来源于骨髓的间充质干细胞，1000U白细胞介素Ⅱ、100mg维生素C和20μl富血小板血浆，基质部分包括生物膜和医用级粘贴层，其中所述的来源于骨髓的间充质干细胞优选来自于胚胎骨髓组织的间充质干细胞。
本发明的一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂中，至少包括1×105个来源于骨髓的间充质干细胞，包括1×106个来源于骨髓的间充质干细胞。
上述的一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂的制备方法，其特征是由下述步骤组成：来源于骨髓的间充质干细胞的制备，生物膜的制备和预处理，间充质干细胞生物膜的构建、间充质干细胞生物膜的诱导和抗黑色素瘤的干细胞贴剂形成。
所述的来源于骨髓的间充质干细胞的制备步骤具体是：分离提取来源于骨髓的间充质干细胞，混匀成单细胞悬液备用。
所述的生物膜的制备和预处理步骤具体是：制备高分子聚乙内酯多元醇-胶原复合生物膜作为基础基质，在细胞接种前进行生物膜的预处理：将生物膜置入适宜大小的培养皿中，用3M的NaOH于37℃浸泡2小时，PBS缓冲液浸泡10次，每次15分钟。
所述的间充质干细胞生物膜的构建步骤具体是：将上述步骤制备的生物膜置于培养皿底部，然后接种来源于骨髓的间充质干细胞单细胞悬液，所用的培养基为90%DMEM培养基，和10%胎牛血清替代品，连续培养48小时。
所述的抗黑色素瘤的干细胞贴剂的诱导步骤具体是：对上述步骤培养皿更换培养液，仍用90%DMEM培养基，和10%胎牛血清替代品，并添加TNF α（α肿瘤坏死因子）诱导培养4-5小时，其中TNF α的诱导浓度为50-100ng/ml，然后将制备的生物膜用PBS清洗两遍并置于37℃、5%CO2细胞培养箱30分钟后备用。
所述的抗黑色素瘤的干细胞贴剂的形成步骤具体是：将上述步骤制备的生物膜从培养箱中取出，添加1000U白细胞介素Ⅱ、100mg维生素C和20μl富血小板血浆，然后将生物膜置于由防粘层和粘贴层组成的医用级粘胶层上，即制备完成抗黑色素瘤的干细胞贴剂。
本发明的优点在于：
（1）由于恶性黑色素瘤特殊的解剖部位，本发明干细胞贴剂不仅可以将间充质干细胞及特效因子直接作用于黑色素瘤病灶处，有效促进间充质干细胞的粘附、增殖，抑制肿瘤生长，同时发挥特效因子疗效，直接作用于黑色素瘤病灶部位，增强对黑色素瘤的杀伤作用；直接作用于修复皮肤患处，也可提高治疗后修复效果。
（2）本发明的干细胞贴剂利用间充质干细胞构建，并添加了针对恶性黑色素瘤的特效因子。其中：a、骨髓源间充质干细胞不但可以增殖、定向分化、选择性归巢和分泌多种有效因子对黑色素瘤细胞进行杀伤，并对异常细胞进行快速修复，抑制黑色素瘤的生长和转移的同时，可以携带抗肿瘤药物到达肿瘤组织，发挥抗肿瘤的作用。b、白细胞介素Ⅱ是淋巴细胞产生的一种糖蛋白，具有调节T淋巴细胞生长与分化、刺激机体免疫系统中天然杀伤细胞（LAK）的增殖等作用，能使黑色素瘤患者体内的淋巴细胞集中于肿瘤结节，刺激病人产生强力的免疫反应，以达治疗肿瘤的作用。c、维生素C影响肿瘤凋亡基因表达，抑制DNA复合物合成，通过诱导分化，干扰细胞周期，来限制肿瘤细胞生长，促进凋亡；也可诱导T细胞产生，增加干扰素合成，促进免疫球蛋白形成、淋巴细胞增殖和分化，提高机体免疫力；可以参与体内的氧化还原反应、羟化反应，促进胶原蛋白合成，增加黑色素瘤创面愈合率。d、富血小板血浆是血浆成分，含丰富的血小板成分，有机体各种生长因子及细胞因子，能够促进软组织及硬组织的愈合；能有效促进干细胞的增殖，及成骨，成脂，成软骨分化能力，并且无免疫源性，不会引起机体的免疫排斥反应等；富血小板血浆含各种纯天然的生长因子，不需要病毒转染，也不像人工合成的生长因子那样单一，缺乏稳定性，其中的生长因子在很多研究中已经证明具有促进血管形成，促进成纤维细胞生长，促进骨组织形成等功能，因此，富血小板血浆结合间充质干细胞在创面尤其是难治性创面如恶性黑色素瘤创面的的修复中起到不可或缺的作用，在组织工程及再生医学领域的应用前景十分广阔。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请中的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂的制备步骤流程图；
图2为本发明具体实施例中黑色素瘤小鼠动物模型实验结果：实验小鼠瘤体体积变化对比图；
图3为本发明具体实施例中黑色素瘤小鼠动物模型实验结果：实验小鼠肿瘤瘤体抑瘤率；
图4为本发明具体实施例中黑色素瘤小鼠动物模型实验结果：实验小鼠生存率曲线图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
具体实施例1：如图1所示的本发明一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂的制备步骤流程图，所述的方法包括以下步骤：
步骤1：来源于骨髓的间充质干细胞的制备
无菌条件下取自然流产胎儿股骨骨髓(实验用人胚胎骨髓来源间充质干细胞均为自然流产胎儿，流产胎儿母亲知情并签署同意书同意流产胎儿用于干细胞实验研究)，用含20%胎牛血清的DMEM培养基（含青霉素lOOU/mL,含链霉素100μg/mL, pH7.4）的培养液冲洗股骨骨髓入平皿，用注射器适当抽吸吹打，使骨髓组织细胞基本均匀分散，然后计数，以1×104 /cm2 密度接种于培养皿。置入37℃ 5%CO2 95%饱和湿度的细胞培养箱培养。当观察到有贴壁细胞出现，当细胞生长铺满培养皿底30%左右时更换培养液，去除不贴壁的非人胚胎骨髓来源间充质干细胞和血细胞。以后每日观察，隔日换液，当细胞生长铺满培养皿底80%时传代，传代时按1∶3的比例进行传代接种培养，传代培养基采用含10%胎牛血清的DMEM培养基。
步骤2：生物膜的制备和预处理
A.配制静电纺丝溶液：称取0.50gPCL颗粒，溶解于4ml氯仿中；另称取0.025g胶原，溶解于1ml六氟异丙醇中（HFIP）中，各自用磁力搅拌子搅拌过夜（大于12h）。将溶解好的两种溶液进行混合，用磁力搅拌子搅拌12h以上，得到静电纺丝溶液；
B.静电纺丝过程：将静电纺丝溶液装入注射器中，注射器配置直径0.6mm的钝性转头，在电压10kv，收集距离即喷头与接受盘之间的距离为15cm，液流速度为0.75ml/h的条件下电纺；
C.后期处理：电纺完成后，将静电纺丝膜在通风橱中2~3小时，待残余有机溶剂完全挥发，得到单纯高分子聚乙内酯多元醇（PCL）膜-胶原复合膜即生物膜；
D.生物膜的预处理：在细胞接种前，将单纯高分子聚乙内酯多元醇（PCL）-胶原复合膜置入适宜大小的培养皿中，用3M的NaOH于37℃浸泡2h，PBS缓冲液浸泡10次，每次15分钟。
步骤3：间充质干细胞生物膜的构建
将预处理后的生物膜置于培养皿底部，然后接种来源于骨髓的P3-P6代间充质干细胞单细胞悬液，所用的培养基为90%DMEM培养基和10%胎牛血清替代品（含青霉素lOOU/mL,含链霉素100μg/mL, pH7.4），连续培养48小时，即构建完成干细胞生物膜。
步骤4：间充质干细胞生物膜的诱导
将构建间充质干细胞生物膜的培养皿更换培养液，仍用90%DMEM培养基和10%胎牛血清替代品（含青霉素lOOU/mL,含链霉素100μg/mL, pH7.4），不同的是添加TNFα（α肿瘤坏死因子）诱导培养4-5小时，其中TNFα的诱导浓度为50-100ng/ml，然后将制备的生物膜用PBS清洗两遍并置于37℃、5%CO2细胞培养箱30分钟后备用。
步骤5：抗黑色素瘤的干细胞贴剂的形成
将诱导后的间充质干细胞生物膜从培养箱中取出，添加1000U白细胞介素Ⅱ、100mg维生素C和20μl富血小板血浆，然后将生物膜置于由防粘层和粘贴层组成的医用级粘胶层上，即制备完成抗黑色素瘤的干细胞贴剂。
关于人胚胎骨髓来源间充质干细胞的伦理说明：
人胚胎骨髓来源的间充质干细胞的胚胎是自然流产的胚胎组织，属于医学上废弃的胚胎组织，是自然或自愿流产，且流产胎儿母亲完全知情同意，签署知情同意书。根据科学技术部、卫生部2003年12月颁发的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》中明确指出：用于研究的人胚胎干细胞可以通过自然或自愿选择流产的胎儿细胞获得；另外，根据卫生部办公厅、国家食品药品监督管理局于2013年3月发布的《干细胞临床试验研究管理办法（试行）》征求意见稿中指出，来源于胎儿组织的细胞已经作为临床实验研究的种子细胞，因此本方法采用胎儿股骨组织的骨髓源间充质干细胞符合当前规定。
具体实施例2：来源于骨髓的间充质干细胞的流式鉴定
分离获得的人胚胎骨髓来源间充质干细胞经流式细胞仪检测后显示:CD166阳性细胞为95%以上，CD34 阳性细胞小于3 %(CD166是BMSC 细胞膜的特征性表面标志，BMSC细胞膜不表达CD34)，台盼蓝检测细胞活性在95%以上。
实施例3 动物试验
1.黑色素瘤小鼠动物模型的制备
①制备浓度为1×107个/ml B16黑色素瘤细胞悬液；②用备皮刀将6-8周龄的C57BL/6J小鼠背部毛发去除, 去毛面积约为4cm2 ；③向40只小鼠的背部皮下注射 B16黑色素瘤细胞，每只 0.2ml；隔天观察肿瘤生长情况, 测量硬结大小, 观测小鼠生存期并记录相关数据。
2. 黑色素瘤小鼠的治疗
一周后将荷瘤小鼠随机分成2组,每组20只,实验组瘤体处敷制备成功的干细胞贴剂，对照组未敷贴剂作为空白对照，每四天更换一次贴剂，连续治疗4次。更换贴剂时用游标卡尺测量瘤体长与宽,计算瘤体体积[V=abb/2 (a为肿瘤最大径,b为肿瘤最小径)]及抑瘤率[(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%],观察并分析荷瘤鼠的存活率。
3.黑色素瘤小鼠动物模型实验结果
①测定小鼠的肿瘤体积大小, 在未经治疗前两组肿瘤体积无明显差异。治疗后, 对照组和实验组肿瘤体积大小明显差异，对照组小鼠肿瘤生长迅速, 而对照组肿瘤生长受到明显抑制（如图2所示）,抑瘤率可达90%（如图3所示）；
②对照组与实验组小鼠生存时间比较有显著差异(P<0.01)，对照组荷瘤小鼠生存时间明显延长（如图4所示）。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，其特征在于，由下述主要原料和基质部分制备而成，主要原料包括1×106个来源于骨髓的间充质干细胞，1000U白细胞介素Ⅱ、100mg维生素C和20μl富血小板血浆，基质部分包括生物膜和医用级粘贴层。
2.根据权利要求1所述的一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，其特征在于，所述的来源于骨髓的间充质干细胞优选来自于胚胎骨髓组织的间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，其特征在于，至少包括1×105个来源于骨髓的间充质干细胞，包括1×106个来源于骨髓的间充质干细胞。
4.权利要求1所述的一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂的制备方法，其特征在于，由下述步骤组成：来源于骨髓的间充质干细胞的制备，生物膜的制备和预处理，间充质干细胞生物膜的构建，间充质干细胞生物膜的诱导和抗黑色素瘤的干细胞贴剂形成；其中，
所述的来源于骨髓的间充质干细胞的制备步骤具体是：分离提取来源于骨髓的间充质干细胞，混匀成单细胞悬液备用；
所述的生物膜的制备和预处理步骤具体是：制备高分子聚乙内酯多元醇-胶原复合生物膜作为基础基质，在细胞接种前进行生物膜的预处理：将生物膜置入适宜大小的培养皿中，用3M的NaOH于37℃浸泡2h，PBS缓冲液浸泡10次，每次15分钟；
所述的间充质干细胞生物膜的构建步骤具体是：将上述步骤制备的生物膜置于培养皿底部，然后接种来源于骨髓的间充质干细胞单细胞悬液，所用的培养基为90%DMEM培养基，和10%胎牛血清替代品，连续培养48小时；
所述的抗黑色素瘤的干细胞贴剂的诱导步骤具体是：向上述步骤培养皿更换培养液，仍用90%DMEM培养基，和10%胎牛血清替代品，并添加TNF α（α肿瘤坏死因子）诱导培养4-5小时，其中TNF α的诱导浓度为50-100ng/ml，然后将制备的生物膜用PBS清洗两遍并置于37℃、5%CO2细胞培养箱30分钟后备用；
所述的抗黑色素瘤的干细胞贴剂的形成步骤具体是：将上述步骤制备的生物膜从培养箱中取出，添加1000U白细胞介素Ⅱ、100mg维生素C和20μl富血小板血浆，然后将生物膜置于由防粘层和粘贴层组成的医用级粘胶层上，即制备完成抗黑色素瘤的干细胞贴剂。
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