CN108103009A - 一种胎盘间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胎盘间充质干细胞的制备方法，涉及干细胞的制备技术领域。选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，将剪取的组织块在含有庆大霉素的生理盐水中清洗至鲜红色，将组织放入10cm平皿中，使组织位于高处，剪成肉泥，做好标记；将细胞培养瓶倒扣，将培养瓶正置，此时应确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；三天后观察组织块，注意动作要轻，尽量不要晃动；七天后再半量换液，此后均半量换液；进行传代培养；将培养液去除，弃去上层溶液，待细胞生长至80‑90％密度时，收获细胞，进行冻存。胎盘来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

Description

一种胎盘间充质干细胞的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种胎盘间充质干细胞的制备方法，属于干细胞的制备技术领域。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，间充质干细胞具有低免疫原性及向缺血或损伤组织归巢的特征，输入宿主体内后，可归巢于特定部位，在微环境影响下定向分化为内胚层、中胚层以及外胚层3个胚层来源组织的细胞，如骨、软骨、肌腱、脂肪、肝、肾、皮肤、肌肉、神经甚至胰腺等10余种成熟细胞，因而成为再生医学中器官修复的理想种子细胞。

间充质干细胞具有广阔的临床应用前景，可用于治疗神经系统疾病、肝肾损伤、自身免疫疾病、心脏疾病、骨疾病、软骨疾病、缺血性血管疾病、糖尿病并发症和肿瘤等疾病。它们也可用于组织工程和面部整形中。另外，它们也可与造血干细胞共同移植治疗血液疾病。

间充质干细胞有三个主要来源：骨髓、脂肪组织、婴儿出生时娩出的胎盘组织，其中，以胎盘中存量最多。婴儿出生后，留存在胎盘中的间充质干细胞可以提取出来，给孩子长期保存，以备他日不时之需，只是因为对干细胞缺乏了解，这种宝贵的健康资源很多就被丢弃了。

胎盘间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种多能干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层。在机体正常的组织损伤修复过程中，MSC是一种重要的参与组织再生的细胞库。在组织损伤引起的特殊信号作用下，MSC迁移到受损部位，在局部聚集增殖，依据不同的损伤信号沿着不同途径分化。MSC易于分离扩增，体外倍增能力旺盛，即使扩增1亿倍仍能保持其多向分化能力。因此，MSC是一种实用的组织修复种子细胞。

近年来，以胎盘作为间充质干细胞组织来源的研究越来越多。2016年，北京大学第三医院为早衰症女孩实施了干细胞治疗，通过静脉注射胎盘间充质干细胞，早衰症女孩急速衰老的机体得到了缓解，与以前相比生活得到了改善，生命也得到了延长。这则案例证明了胎盘间充质干细胞在早衰症的治疗中十分具有前景。目前胎盘间充质干细胞已被用于治疗造血干细胞移植引发的移植物抗宿主病，并且已被证实十分具有临床应用前景。瑞典科学家对数十名接受异体造血干细胞移植的患者注射了胎盘间充质干细胞，证实了胎盘间充质干细胞移植的安全性；同时，在治疗上，注射胎盘间充质干细胞可以明显提高移植物抗宿主病患者的存活率。

总体来说，胎盘间充质干细胞主要有以下几个方面的优势：

1)取材方便，原料来源充足，是生命资源的再生。

2)分化能力强可以定向诱导分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞和肝干细胞等多种干细胞。

3)数量充足，使用方便，增殖能力强，培养后数目可达10亿，可以供多人多次使用。

4)在人群中使用不需要配型，不会产生免疫排斥反应，同时，血缘关系越亲近，生物利用度会越高，使用的效果越好。

5)治疗疾病范围广，抗衰老，恢复健康体态，心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤，自身免疫性疾病，移植物抗宿主病等多种疾病。

综上所述，间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望,对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。

发明内容：

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种胎盘间充质干细胞的制备方法。

本发明的一种胎盘间充质干细胞的制备方法具体步骤为：步骤一、选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，确保无胎粪等污染，剪取胎盘底蜕膜面的组织，将底蜕膜面的细胞即靠近母体面的表层减去，减去之后挑颜色鲜红的组织剪取；

步骤二、将剪取的组织块在含有庆大霉素的生理盐水中清洗至鲜红色，所述的生理盐水的配制方法为：在500mL生理盐水加入2支庆大霉素即可；

步骤三、挑取颜色鲜亮的组织，将组织放入10cm平皿中，倾斜平皿，使组织位于高处，剪成肉泥，注意无菌操作；

步骤四、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm²细胞培养瓶中，做好标记；

步骤五、将细胞培养瓶倒扣，且细胞培养瓶为设置有通气滤膜的培养瓶，其中有组织块的血培养面位于上方，缓慢加入6mL无血清培养基，培养基位于下方，-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物，产品号分别是：10151A，10151B；两者以10：1混合；混合后加入L-gln，使其终浓度达到2mM，放入37℃培养箱中，5％CO₂，放置2h，拧紧瓶盖；

步骤六、将培养瓶正置，此时应确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；

步骤七、三天后观察组织块，注意动作要轻，尽量不要晃动；

步骤八、七天后再半量换液，此后均半量换液；

步骤九、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；

步骤十、将培养液去除，用6mL生理盐水冲洗一遍，加入2mL 0.25％Trypsin-EDTA，放入37℃培养箱中，约3-5min，待细胞变圆时，停止消化，吸取消化液到含有3ml培养基的离心管里，加入6mL-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物至培养瓶终止消化，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，吸取细胞到新的离心管中，1500rpm，离心5min；

步骤十一、弃去上层溶液，收集细胞，加入传代培养基，其中完全培养基-XF：MSCGM-CD^TM BulletKit＝3：1，按着1×10⁵个/mL细胞量进行传代培养；

步骤十二、待细胞生长至80-90％密度时，收获细胞，进行冻存。

本发明的有益效果：胎盘来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

具体实施方式：

本具体实施方式采用以下技术方案和实施例对发明进行进一步的详细说明。

本具体实施方式中一种胎盘间充质干细胞的制备方法为：步骤一、选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，确保无胎粪等污染，剪取胎盘底蜕膜面的组织，将底蜕膜面的细胞即靠近母体面的表层减去，减去之后挑颜色鲜红的组织剪取；

步骤二、将剪取的组织块在含有庆大霉素的生理盐水中清洗至鲜红色，所述的生理盐水的配制方法为：在500mL生理盐水加入2支庆大霉素即可；

步骤三、挑取颜色鲜亮的组织，将组织放入10cm平皿中，倾斜平皿，使组织位于高处，剪成肉泥，注意无菌操作；

步骤四、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm²细胞培养瓶中，做好标记；

步骤五、将细胞培养瓶倒扣，且细胞培养瓶为设置有通气滤膜的培养瓶，其中有组织块的血培养面位于上方，缓慢加入6mL无血清培养基，培养基位于下方，-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物，产品号分别是：10151A，10151B；两者以10：1混合；混合后加入L-gln，使其终浓度达到2mM，放入37℃培养箱中，5％CO₂，放置2h，拧紧瓶盖；

步骤六、将培养瓶正置，此时应确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；

步骤七、三天后观察组织块，注意动作要轻，尽量不要晃动；

步骤八、七天后再半量换液，此后均半量换液；

步骤九、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；

步骤十、将培养液去除，用6mL生理盐水冲洗一遍，加入2mL 0.25％Trypsin-EDTA，放入37℃培养箱中，约3-5min，待细胞变圆时，停止消化，吸取消化液到含有3ml培养基的离心管里，加入6mL-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物至培养瓶终止消化，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，吸取细胞到新的离心管中，1500rpm，离心5min；

步骤十一、弃去上层溶液，收集细胞，加入传代培养基，其中完全培养基-XF：MSCGM-CD^TM BulletKit＝3：1，按着1×10⁵个/mL细胞量进行传代培养；

步骤十二、待细胞生长至80-90％密度时，收获细胞，进行冻存。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.一种胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于：具体制备方法为：

步骤一、选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，确保无胎粪等污染，剪取胎盘底蜕膜面的组织，将底蜕膜面的细胞即靠近母体面的表层减去，减去之后挑颜色鲜红的组织剪取；

步骤二、将剪取的组织块在含有庆大霉素的生理盐水中清洗至鲜红色，所述的生理盐水的配制方法为：在500mL生理盐水加入2支庆大霉素即可；

步骤三、挑取颜色鲜亮的组织，将组织放入10cm平皿中，倾斜平皿，使组织位于高处，剪成肉泥，注意无菌操作；

步骤四、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm²细胞培养瓶中，做好标记；

步骤五、将细胞培养瓶倒扣，且细胞培养瓶为设置有通气滤膜的培养瓶，其中有组织块的血培养面位于上方，缓慢加入6mL无血清培养基，培养基位于下方，-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物，产品号分别是：10151A，10151B；两者以10：1混合；混合后加入L-gln，使其终浓度达到2mM，放入37℃培养箱中，5％CO₂，放置2h，拧紧瓶盖；

步骤六、将培养瓶正置，此时应确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；

步骤七、三天后观察组织块，注意动作要轻，尽量不要晃动；

步骤八、七天后再半量换液，此后均半量换液；

步骤九、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；

步骤十、将培养液去除，用6mL生理盐水冲洗一遍，加入2mL 0.25％Trypsin-EDTA，放入37℃培养箱中，约3-5min，待细胞变圆时，停止消化，吸取消化液到含有3ml培养基的离心管里，加入6mL-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物至培养瓶终止消化，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，吸取细胞到新的离心管中，1500rpm，离心5min；

步骤十一、弃去上层溶液，收集细胞，加入传代培养基，其中完全培养基-XF：MSCGM-CD^TMBulletKit＝3：1，按着1×10⁵个/mL细胞量进行传代培养；

步骤十二、待细胞生长至80-90％密度时，收获细胞，进行冻存。