CN104622771A - 一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体脂肪中培养获取脂肪干细胞，并从自体外周血中得到富含血小板的血浆；取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待温度降至40度左右加入富含血小板的血浆，混匀后加入自体脂肪干细胞从而制备成生物美容面膜，同时还可以添加营养因子制备成个性化的生物美容面膜产品，可用于皮肤祛皱、粉刺瘢痕与疤痕修复、除斑和抗氧化等作用。

Description

一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的制备方法及其产品

技术领域

本发明涉及一种制备含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的方法以及通过所述方法获得的含自体脂肪干细胞的生物美容面膜产品。特别地，本发明涉及采用自体脂肪来源的脂肪干细胞和自体外周血来源的富含血小板的血浆，加入到琼脂糖中形成半凝胶状面膜，同时还可以添加营养因子，以及通过所述方法获得的个性化生物美容面膜产品。本发明的生物美容面膜可用于医学美容，对皮肤具有祛皱、粉刺瘢痕与疤痕修复、除斑以及抗氧化等作用。

背景技术

目前，各种面膜产品已经在市场上得到普遍的使用，其中绝大多数面膜通过由无纺布、水晶布和生物纤维等，添加一些植物提取精华素或者其他深海营养物质制备成的美容面膜产品。市场上也有通过化学试剂制备成的水凝胶面膜，同时也添加一些植物提取精华素或者其他深海营养物质，对皮肤起到保湿、美白和控油等作用。但尽管这些面膜含有一些营养物质，但因其保存方式和时间等问题，在皮肤修复、祛皱和除斑等方面还远远不足。

近年来，应用活细胞进行美容成为市场上追捧的热点，特别是干细胞的使用，通过在皱纹、瘢痕和疤痕上直接注射，使得活细胞能在皮肤中分化生长，对皮肤起着填充和修复功能。这些应用活细胞多数来源同源异体的，进入机体内自身免疫系统将对其产生免疫排斥作用，产生的美容效果是较低。脂肪干细胞是近年研究发现的一种新的成体干细胞，该细胞增殖能力强，体外培养能保持稳定的生长增殖活性，且具有多项分化潜能，也已被应用到美容治疗中。但单纯用脂肪干细胞注射液用于美容，脂肪干细胞定向分化为脂肪细胞和成纤维细胞的效率较低，见效较慢。脂肪干细胞在体外扩增后，被注射入真皮层或肌肉层。细胞生长的微环境改变，脂肪干细胞需要一定的时间来适应生长环境，这样脂肪干细胞在体内的增殖和分化为脂肪细胞和成纤维细胞速度较慢，其刺激成纤维细胞产生胶原纤维和胶原蛋白的生成也出现较晚。另外，通过注射器真皮层或肌肉层注射活细胞，这种痛楚非常痛苦，一般人难以接受。即使注射时使用局部麻醉，但是过后疼痛还是难以忍受。

本发明采用获取自体脂肪组织来源的脂肪干细胞联合自体外周血来源的富含血小板的血浆制备成生物面容面膜，利用富含血小板的血浆中丰富的细胞因子和营养物质，保证脂肪干细胞在皮肤内增殖和分化能力，并有助于其分化为脂肪细胞和成纤维细胞，产生良好的皮肤修复的作用。同时还可以添加一些营养因子，进一步保证了脂肪干细胞皮肤内成活效率。利用体内温度和皮肤毛孔，生物面容面膜中脂肪干细胞趋热性作用进入皮肤内，减去了真皮层或肌肉层注射带来的痛苦，可得到普遍的接受。

综上所述，现在市场上生物美容面膜对皮肤美容的作用是非常有限，仅限于保湿、美白和控油等作用。而为了对皮肤产生更好地祛皱、粉刺瘢痕与疤痕修复、除斑和抗氧化等作用，本发明利用自体来源脂肪干细胞和富含血小板的血浆的生物学作用，并添加了一些营养因子，在生物学有效期内更好储存及时使用，将对皮肤产生最佳的修复、再生、填充、祛斑和抗氧化等美容作用。

发明内容

为了对皮肤的皱纹、粉刺瘢痕、疤痕以及斑痕等产生更好地修复、再生、填充和抗氧化等美容作用，本发明利用自体脂肪干细胞和自体富含血小板的生物学作用，产生高效的皮肤美容作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本发明通过采集自体脂肪组织来源单细胞培养获得脂肪干细胞，高表达脂肪干细胞标志物。利用脂肪干细胞能产生各种的细胞因子，如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、类胰岛素生长因子、血小板衍生因子和转化生长因子等，分泌细胞因子作为脂肪干细胞一个基本功能，将能活化成纤维细胞，促进成纤维细胞扩增，能调节成纤维细胞产生的胶原酶；脂肪干细胞产生的各种生长因子还有抗氧化作用，保护成纤维细胞免于承受被氧化的压力。成纤维细胞可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质；同时细胞生长因子还有促使皮肤愈合的功能。

自体富含血小板的血浆含有丰富的生长因子，即血小板衍生生长因子、转化生长因子-β1与β2、类胰岛素生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、上皮细胞生长因子等。自体富含血小板的血浆联合了脂肪干细胞，在真皮浅层中将保护脂肪干细胞活性、增殖和分化，分化为脂肪细胞和成纤维细胞，可刺激大量胶原蛋白、弹性纤维、胶质等的产生，将促使组织再生，对凹陷性疤痕、组织缺失有特殊功效，达到强力祛皱抗衰目的。

同时将添加营养因子，如表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角蛋白18和海藻酸钠等，将更好地保证了脂肪干细胞在皮肤内存活，并有效地增殖分化为脂肪细胞和成纤维细胞，对皱纹、瘢痕、疤痕和斑痕等起到更佳的修复、再生、填充、祛斑和抗氧化等美容效果。

本发明提供了一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体脂肪中培养获取脂肪干细胞，并从自体外周血中得到富含血小板的血浆；取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待温度降至40度左右加入富含血小板的血浆，混匀后加入自体脂肪干细胞从而制备成生物美容面膜，同时还可以添加营养因子。

本发明提供了的自体脂肪干细胞从腹部抽脂获得脂肪组织液，分离纯化得到的有核细胞悬液经过体外原代培养和传代培养后获得脂肪干细胞，放置冰箱4℃存放，也可用40％脂肪干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。

本发明制备得到的自体脂肪干细胞经流式细胞仪检测，高表达CD29+≥90％、CD44+≥90％和CD105+≥90％，低表达CD34+≤10％、CD45+≤10％和CD14+≤10％；更优选，自体脂肪干细胞高表达CD29+为99.85％、CD44+为99.59％和CD105+为98.56％，低表达CD34+为0.00％、CD45+为0.04％和CD14+为0.21％。

本发明提供了的自体富含血小板的血浆由采集人自体抗凝外周血中，经离心去除红细胞和部分白细胞后获得的富含血小板血浆，将用于制备含自体脂肪干细胞的生物美容面膜。

优选地，自体外周血使用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)和肝素作为抗凝剂。

本发明提供了的一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜，其中，所述制备方法包括通过先将自体富含血小板的血浆加入到溶解的琼脂糖溶液中，混匀后加入含自体脂肪干细胞的生理盐水，制备成半凝胶状的生物美容面膜。

优选地，使用的琼脂糖为低熔点琼脂糖，溶解温度为65℃以下。

本发明还提供了一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜，其还添加了营养因子，即为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角蛋白18和海藻酸钠等。

本发明还提供了一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的产品，其中，该产品主要由如下成分组成：

1)1ml 1-40×10⁶自体脂肪干细胞；

2)4-10ml自体富含血小板的血浆；

3)1ml 2％(质量体积比)琼脂糖；

4)任选的1-500ng/ml营养因子；

半凝胶状生物美容面膜装入10ml无菌的塑料针管中，可用盖子密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为48小时。

优选地含自体脂肪干细胞的生物美容面膜产品添加了营养因子，即为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角蛋白18和海藻酸胺，含有一种或一种以上。

通过本发明的方法，通过获取的自体脂肪干细胞和自体富含血小板的血浆并含有一种或多种营养因子，在琼脂糖中制备成的含自体脂肪干细胞的生物美容面膜。由本发明提供的方法得到含有自体脂肪干细胞和自体富含血小板的血浆或营养因子的琼脂糖半凝胶面膜，能够对皮肤具有祛皱、粉刺瘢痕与疤痕修复、除斑以及抗氧化等美容作用。特别当联合物理美容疗法使用时，将产生更佳的美容疗效，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为营养因子和细胞进入皮肤的通道。

附图说明

图1表示由实施例1所制备的脂肪干细胞倒置显微镜下观察图。

图2表示由实施例1制备的脂肪干细胞表型检测的细胞流式图。

图3表示1名57岁男性经由实施例5所制备含自体脂肪干细胞的生物美容面膜1个疗程美容前后脸部抬头纹改善的图片。

具体实施方式

本发明提供了一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的制备方法，其中，所述制备方法包括通过从自体脂肪组织中分离培养后获得脂肪干细胞，从自体抗凝外周血中离心分离得到富含血小板的血浆，添加到琼脂糖液中，制备成自体的半凝胶状的生物美容面膜。

所述自体脂肪干细胞由腹部抽脂获得脂肪组织液体外分离培养得到。具体实施步骤如下：脂肪组织液用1×PBS(pH值为7.4)冲洗5次，去除吸脂手术中所用药物、油及血细胞。用0.1％(质量体积比)I型胶原酶37℃消化60分钟，间隔10分钟用1ml移液枪反复吹打几次。消化后1000转每分钟离心10分钟，吸弃上层脂肪后，加入1×PBS(pH值为7.4)混匀，用200目细胞筛过滤；所获得的细胞悬液1000转每分钟离心10分钟，细胞沉淀用1×PBS(pH值为7.4)洗涤1次，加入含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×10⁶细胞/ml加入到25cm²的细胞培养瓶中，于37℃，5％CO₂培养箱中生长48小时。

培养48小时后对脂肪干细胞换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液，25cm²培养瓶继续放置37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次。

脂肪干细胞在25cm²培养瓶中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，取5ml1×PBS(pH值为7.4)洗涤一次培养瓶底，加入0.5ml0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01％EDTA)到培养瓶中，放置37℃，5％CO₂培养箱中消化2-3分钟。消化后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用5ml的生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集脂肪干细胞。离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5ml移液管加入10ml新鲜的含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液，加入到1瓶75cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。待脂肪干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集脂肪干细胞，连续传代3代培养，获得4×10⁷以上的脂肪干细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得脂肪干细胞，放置冰箱4℃存放备用。

取苔盼兰染色计数后的3×106脂肪干细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD29单抗、20μL PE标记鼠抗人CD44单抗和20μLPercp标记鼠抗人CD34单抗；第二组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD45单抗、20μL PE标记鼠抗人CD105单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD14单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测。自体脂肪干细胞高表达CD29+≥90％、CD44+≥90％和CD105+≥90％，低表达CD34+≤10％、CD45+≤10％和CD14+≤10％。

部分脂肪干细胞可用40％脂肪干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。脂肪干细胞复苏后，仍高表达CD29、CD44和CD105，低表达CD34、CD45和CD14，具有显著的脂肪干细胞表型特征。

所述自体富含血小板的血浆通过两步离心法获得，即由抽取人50-100mlEDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的10-80ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得10-80ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。

作为本发明制造方法中使用的外周血抗凝剂，包括乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)、肝素、枸橼酸钠和草酸盐等，均可用于本发明，优选乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)和肝素。

所述含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的制备方法如下：取0.1-1克琼脂糖粉到50ml无菌离心管中，加入0.9％生理盐水5-50ml，微波炉中加热充分溶解，待温度降到40℃左右，取1ml琼脂糖溶液加入到制备好的4ml自体富含血小板的血浆，混匀后加入制备好的1ml 1-40×10⁶脂肪干细胞液，制备成半凝胶状的生物美容面膜，放置冰箱4℃中备用。

本发明制造方法中使用的琼脂糖，包括低熔点琼脂糖、琼脂糖和琼脂等均可用于本发明，优选低熔点琼脂糖，溶解温度为低于65℃。

同时优选地，含自体脂肪干细胞的生物美容面膜中还可以添加营养因子，所述营养因子位表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角蛋白18和海藻酸钠一种或多种，具有保护脂肪干细胞活性或生物学功能的作用，也使得含自体脂肪干细胞的生物美容面膜保质期增长。

本发明还提供了一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的产品，其中，该产品主要由如下成分组成：

1)1ml 1-40×10⁶自体脂肪干细胞；

2)4-10ml自体富含血小板的血浆；

3)1ml 2％(质量体积比)琼脂糖；

4)任选的1-500ng/ml营养因子；

半凝胶状生物美容面膜装入10ml无菌的塑料针管中，可用盖子密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为48小时。

根据本发明所述的含自体脂肪干细胞的生物美容面膜产品，其特征在于，所述含自体脂肪干细胞的生物美容面膜产品，优选地添加了营养因子，即为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角蛋白18和海藻酸胺，含有一种或一种以上。

本发明提供了含有自体脂肪干细胞和自体富含血小板的血浆或营养因子的半凝胶状面膜，能够对皮肤具有祛皱、粉刺瘢痕与疤痕修复、除斑以及抗氧化等美容作用。本发明还提供了联合物理美容疗法使用，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为营养因子和细胞进入皮肤的通道，将产生更佳的美容疗效。与高温深蓝射频美容疗法联合具体方法如下：

医学美容者躺卧在手术台上，使用洁面乳进行面部清洁，清水擦洗干净；先用高温深蓝射频仪对面部进行处理，包括眼皮、鼻梁和上嘴唇等部位，可对面部进行2-3次处理，射频热能在皮下以特定每秒40.68MHz的电波，直接进入肌肤的真皮层中，使皮肤及皮下组织中的水分子产生高速旋转振动，藉由高频率的震动使皮肤的分子产生约45度的热能，迅速打开皮肤毛孔。高温深蓝射频美容完之后，将本发明的6ml半凝胶生物美容面膜涂抹在脸部，不断慢慢涂抹，包括眼皮、鼻梁和上嘴唇等部位；涂抹完半凝胶面膜后，脸部再覆上一片保湿面膜，保持60分钟，撤下保湿面膜。

美容者本发明生物美容面膜使用之后当天不使用其他化妆品和洗脸，一般需间隔7天后连续使用4-8次，可达到更佳的医学美容效果，对皮肤可以出去微小皱纹、粉刺瘢痕与疤痕减少、除斑以及抗氧化的作用。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1人自体脂肪干细胞的制备

美容志愿者腹部抽脂获得100ml脂肪组织液(与其签署知情同意书)，将其用1×PBS(pH值为7.4)反复冲洗5次，尽量去除吸脂手术中所用药物、油及血细胞。用0.1％(质量体积比)I型胶原酶(美国Sigma公司)37℃消化60分钟，间隔10分钟用1ml移液枪反复吹打几次。消化后1000转每分钟离心10分钟，吸弃上层脂肪后，加入1×PBS(pH值为7.4)混匀，用200目细胞筛(美国BD公司)过滤；所获得的细胞悬液1000转每分钟离心10分钟，细胞沉淀用1×PBS(pH值为7.4)洗涤1次，加入含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液(美国Invitrogen公司)重悬，苔盘兰染色计数后有核细胞为1.1×10⁸，用10％胎牛血清的α-MEM培养液调整有核细胞浓度为5×10⁶细胞/ml，加入到25cm²细胞培养瓶中5ml，共4瓶，于37℃，5％CO₂培养箱中生长48小时。

培养48小时后对脂肪干细胞进行换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液，25cm²培养瓶继续放置37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次。

脂肪干细胞在25cm²培养瓶中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，取5ml1×PBS(pH值为7.4)洗涤一次培养瓶底，加入0.5ml 0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01％EDTA)到培养瓶中，放置37℃，5％CO₂培养箱中消化2-3分钟。消化后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用5ml的生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集脂肪干细胞。离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5ml移液管加入10ml新鲜的含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液，加入到1瓶75cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，共4瓶，每隔2天换一次新鲜培养液。待脂肪干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集脂肪干细胞，连续传代3代培养，共16瓶，收集到的脂肪干细胞用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得9.4×10⁷的脂肪干细胞，放置冰箱4℃存放备用。图1为所制备的脂肪干细胞倒置显微镜下观察图，成上皮样生长，图1A中为原代培养的脂肪干细胞生长图片，图1B为传代培养3代后的脂肪干细胞生长图片。

实施例2自体脂肪干细胞流式检测

取实施例1中制备的3×10⁶脂肪干细胞，分三组，第一组分别添加到有20μLFITC标记鼠抗人CD29单抗、20μL PE标记鼠抗人CD44单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第二组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD45单抗、20μL PE标记鼠抗人CD105单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD14单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×PBS(pH值为7.4)洗涤3次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测。图2中结果表明自体脂肪干细胞高表达CD29+为99.85％、CD44+为99.59％和CD105+为98.56％，低表达CD34+为0.00％、CD45+为0.04％和CD14+为0.21％，表明符合脂肪干细胞表型标志。

制备例3人自体血浆的制备

用10ml EDTA抗凝采血管(美国BD公司)，抽取人100ml抗凝经脉血，10只10ml抗凝管经1000转每分钟速度离心10分钟，得到的65ml血浆；再次3000转每分钟离心10分钟，获得10-80ml富含血小板血浆，放置冰箱4℃存放备用。

实施例4含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的制备

取0.1克低熔点琼脂糖(法国Biowest公司)加入到50ml无菌离心管中，加入0.9％生理盐水5ml，微波炉中加热充分溶解，制备成2％的低熔点琼脂糖溶液，待温度降到40℃左右，取1ml低熔点琼脂糖溶液加入到实施例2中制备好的4ml自体富含血小板的血浆，混匀后加入实施例1中制备好的1ml 6×10⁶脂肪干细胞液，制备成半凝胶状的生物美容面膜，放置冰箱4℃中备用。

实施例5含自体脂肪干细胞的生物美容面膜产品组成

该产品主要由如下成分组成：

1)1ml 6×10⁶自体脂肪干细胞；

2)4ml自体富含血小板的血浆；

3)1ml 2％(质量体积比)琼脂糖；

4)100ng/ml营养因子，即为表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角蛋白18和海藻酸胺中一种或一种以上，优选所述因子为碱性成纤维生长因子和角蛋白18；

半凝胶状生物美容面膜装入10ml无菌动脉血气针管中，贴上标签(包括美容者姓名、性别、年龄、细胞名称、数量和生产时间等信息)，放置冰箱4℃冷藏中存放，保质期为48小时。

实施例6含自体脂肪干细胞的生物美容面膜应用

医学美容者躺卧在手术台上，使用洁面乳进行面部清洁，清水擦洗干净；用高温深蓝射频仪对面部进行处理，包括眼皮、鼻梁和上嘴唇等部位，可对面部进行2-3次处理，射频热能产生高速旋转振动产生约45度的热能，迅速打开皮肤毛孔。

高温深蓝射频仪处理完之后，实施例5制备的6ml半凝胶生物美容面膜涂抹在脸部，不断慢慢涂抹，包括眼皮、鼻梁和上嘴唇等部位；涂抹完半凝胶面膜后，脸部再覆上一片保湿面膜，保持60分钟，撤下保湿面膜。美容者本发明生物面膜处理之后当天不使用其他化妆品和洗脸，间隔15天后连续使用6次，作为一个疗程。

图3中是将本发明的含自体脂肪干细胞生物美容面膜在57岁男性脸部抬头纹美容图片。使用缩聚型硅橡胶(德国德万可公司)印模方法检测皱纹修复情况，即将初次印模材料两勺，加入2.5cm催化剂膏体，混合均匀，混合时间大约30秒，用压舌板或其他工具将混合的材料抹光滑。二次印模材料与催化剂膏体1∶2混合均匀，涂于受试者额头，硅橡胶硬化后印迹了皮肤纹络。A图为美容前抬头纹印模图片，B图为1个疗程后抬头纹得到明显减少，变浅，皮肤变得细腻有光泽；表明本发明的本发明制备生物美容面膜具有良好的祛皱、皮肤修复和抗氧化等作用。

Claims (10)

1.一种含自体脂肪干细胞的自体生物美容面膜的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体脂肪中培养获取自体脂肪干细胞，并从自体外周血中得到富含血小板的血浆；取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待温度降至40℃加入富含血小板的血浆，混匀后加入自体脂肪干细胞从而制备成生物美容面膜；

其中，所述自体脂肪干细胞经流式细胞仪检测，高表达CD29+≥90％、CD44+≥90％和CD105+≥90％，低表达CD34+≤10％、CD45+≤10％和CD14+≤10％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述面膜中还添加营养因子。

3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述自体脂肪干细胞由腹部抽脂获得脂肪组织液，用1×PBS冲洗5次，去除吸脂手术中所用药物、油及血细胞；用质量体积比0.1％I型胶原酶37℃消化60分钟，间隔10分钟用1ml移液枪反复吹打；消化后1000转每分钟离心10分钟，吸弃上层脂肪后，加入1×PBS混匀，用200目细胞筛过滤；所获得的细胞悬液1000转每分钟离心10分钟，细胞沉淀用1×PBS洗涤1次，加入含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×10⁶细胞/ml加入到25cm²的细胞培养瓶中，于37℃，5％CO₂培养箱中生长48小时；

培养48小时后对脂肪干细胞换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液，25cm²培养瓶继续放置37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次；

脂肪干细胞在25cm²培养瓶中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，取5ml1×PBS洗涤一次培养瓶底，加入0.5ml、质量体积比为0.25％胰酶到培养瓶中，放置37℃，5％CO₂培养箱中消化2-3分钟；消化后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用5ml的生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集脂肪干细胞；离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5ml移液管加入10ml新鲜的含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液，加入到1瓶75cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；待脂肪干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集脂肪干细胞，连续传代3代培养，获得4×10⁷以上的脂肪干细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得脂肪干细胞，放置冰箱4℃存放备用；

部分脂肪干细胞用40％脂肪干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用；

取苔盼兰染色计数后的3×10⁶脂肪干细胞，分三组，第一组分别添加到有20μE FITC标记鼠抗人CD29单抗、20μL PE标记鼠抗人CD44单抗和20μLPercp标记鼠抗人CD34单抗；第二组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD45单抗、20μL PE标记鼠抗人CD105单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD14单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测；自体脂肪干细胞高表达CD29+≥90％、CD44+≥90％和CD105+≥90％，低表达CD34+≤10％、CD45+≤10％和CD14+≤10％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胰酶含质量体积比为0.01％的EDTA；所述PBS的pH值为7.4。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，自体血浆由抽取人50-100ml EDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的10-80ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得10-80ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，含自体脂肪干细胞的生物美容面膜的制备方法如下：

取0.1-1克琼脂糖粉到50ml无菌离心管中，加入0.9％生理盐水5-50ml，微波炉中加热充分溶解，待温度降到40℃，取1ml琼脂糖溶液加入到制备好的4ml自体富含血小板的血浆，混匀后加入制备好的1ml 1-40×10⁶脂肪干细胞液，制备成半凝胶状的生物美容面膜，放置冰箱4℃中备用。

7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，含自体脂肪干细胞的生物美容面膜中还添加以下营养因子的一种或多种：表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角蛋白18和海藻酸钠。

8.一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：

1)1ml 1-40×10⁶权利要求1-7任一项所述的自体脂肪干细胞；

2)4-10ml自体富含血小板的血浆；

3)1ml、质量体积比为2％的琼脂糖；

4)任选的1-500ng/ml营养因子；

半凝胶状生物美容面膜装入10ml无菌的塑料针管中，用盖子密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为48小时。

9.根据权利要求8所述的生物美容面膜，其特征在于，其优选添加了以下营养因子中一种或一种以上：表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角蛋白18和海藻酸胺。

10.一种权利要求1-9中任一项所述的生物面膜的应用。