CN109646459A - 一种水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂及其应用，所述脐带间充质干细胞制剂为由脐带间充质干细胞和生理盐水组成的干细胞悬液，其中：脐带间充质干细胞和生理盐水的总体积为5毫升，干细胞悬液中脐带间充质干细胞的细胞总数为1×106～107个。本发明使用9针型水光注射仪，结合真空负压技术，使之使用相同的剂量对每个单位面积(1cm2)进行平均覆盖，是从传统的点状充填到面状充填的新突破，通过水光注射仪将脐带间充质干细胞产品注射至皮肤真皮层，定点、定量、定层注射，具有无痕、无疼、均匀注射，快捷方便，治疗仅需10分钟，达到光滑皮肤、去除皱纹、抗皮肤衰老等美肤功效。

Description

一种水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂及其应用
技术领域
本发明属于美容技术领域，涉及一种水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂及其在皮肤年轻化治疗上的应用。
背景技术
皮肤的衰老与机体的衰老是同步进行的，目前关于皮肤衰老的机理比较具有代表性的有皮肤衰老的基因调控学说、自由基学说、代谢失调学说、光老化作用等。尽管关于皮肤衰老确切机制不清楚，但是越来越多的研究认为活性氧是导致衰老的一个关键因素。Sohal等在传统自由基衰老学说的基础上提出了“氧化应激(oxidative stress)衰老学说”，认为过量活性氧能破坏组织中活性氧的产生和清除之间的平衡，可破坏组织细胞的结构和功能，造成程序性的和不可逆转的损伤。
面部衰老是机体和面、颈部的软、硬组织共同变化的结果，面部老化与体质、遗传因素、生活环境、心理情绪、工作性质、营养状况、疾病、局部皮肤护理等因素有着密切的关联。一般人到25岁以后，便开始出现衰老征象，面部皮肤皱纹的形成是一个重要特征和指标。皮肤表皮细胞的自我更新、再生修复以及衰老退变是由来自毛囊或表皮基底层的成体干细胞——表皮干细胞的增殖分化所决定的。随着年纪的增加，表皮干细胞的数量逐渐减少、功能逐渐降低。
随着生活水平的提高，人们对外形的要求越来越高，在追求美的同时对安全性、有效性也有了更高的要求，水光注射仪的注射技术，微创、无痛，恢复快、效果好，受到了爱美人士的青睐。
早在2000年前我国《黄帝内经》中已记载梅花针将药物导入皮肤治疗皮肤疾病，后来临床上通过注射器将透明质酸等药物进行皮肤局部注射，取得了很好的效果。水光注射仪注射技术则是在微电脑的控制下，通过负压系统将皮肤吸起，使接受注射的皮肤远离皮下的血管组织，然后通过9针型针头(针头直径仅32G，远远小于常规注射器针头直径)将药物注射至真皮层，注射过程中可以减少大量出血和血肿的风险；是一种使用负压把制剂精确、均匀导入到相应的真皮层的一种治疗方法。水光注射仪利用9针型针头，结合真空负压技术，使之使用相同的剂量，对每个单位面积(1cm2)进行平均覆盖，是从传统的点状充填到面状充填的新突破。相比5针型针头，9针型针头在相同的皮肤接触面积上，针孔更小，单位面积注射的药液更多更均匀，皮肤微创针孔恢复更快。相比通过皮下注射的方法将美容产品注射至皮肤软组织的方法，水光注射仪能更广泛地覆盖治疗面积，通过术前外敷麻醉剂，达到无痛微创美容的功效；并且微电脑控制施药，避免注射器人工注射剂量不易精确控制；使用快捷方便，治疗仅需十几分钟，术后恢复快，效果明显。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，是人体各器官、组织的储备细胞，可以长时间自我复制而维持其干细胞性，在体外经连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能；在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等，可以作为组织工程研究的细胞来源，修复受损的组织和细胞，促进组织愈合；另外，间充质干细胞也可以分泌多种生物活性分子(旁分泌作用)，包括生长因子、细胞因子和趋化因子，例如肝细胞生长因子、基质源性因子-1和单核细胞趋化蛋白-1、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、金属蛋白、基质金属蛋白酶-2、白细胞介素-8、脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子，可抑制组织细胞的凋亡，调节免疫功能，促进组织本身内源性干细胞的增殖和分化，加速组织损伤恢复；并且这种旁分泌作用可能在组织修复中的作用更重要，因为从静脉注射移植的MSC绝大部分发布在肝、脾、肺和其他组织内的毛细血管中，能归巢到需要修复组织的MSC极少。除此以外，MSC还可通过紧密连接，缝隙连接等与需要修复的细胞发生相互作用，影响其增殖、分化、迁徙能力。
人脐带间充质干细胞(Human Umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。hUC-MSCs形态、免疫表型以及多向分化潜能等多种生物学特性与骨髓MSCs极为相似，并且hUC-MSCs表达SSEA4、Oct-4、Nanog和Sox-2等胚胎干细胞标志物，可能是一群更为原始的干细胞。此外，hUC-MSCs还有取材方便、安全无病毒感染风险；脐带内含量高，细胞增殖能力稳定，可在短时间内大量扩增，易于工业化制备；不表达/低表达HLA-I类分子、不表达HLA-II类分子及共刺激分子，因此免疫原性极低，不易引起免疫排斥反应；回输体内后在组织局部微环境中能定向分化成多种组织细胞，安全性高和成瘤性低、不受伦理和法律限制等优势，使其较其他类型MSCs成为更为理想的种子细胞，是目前研究最多的间充质干细胞，具有广阔的临床应用前景。
hUC-MSCs在体外条件下可分化为上皮细胞，形成3-4层类上皮细胞，具有向皮肤表皮和真皮分化的能力，并可形成微血管，是面部组织工程和再生医学领域的研究热点。除了作为种子细胞直接修复、替代衰老损伤的表皮细胞外，hUC-MSCs可通过旁分泌作用，调节衰老的皮肤干细胞的微环境，促进皮肤固有的表皮干细胞的增殖，并且hUC-MSCs可分化为表皮细胞和成纤维细胞，使得皮肤厚度增加，真皮中的胶原含量也显著性增加。
目前，药物美容和外科整形美容都是一种治标不治本的临时措施，存在高风险、并发症、并伴有疼痛和淤青并且可能发生后遗症。而微创美容凭借高效、安全、易于操作及恢复快等优势日趋流行。其中微针美容被大多数求美者青睐。皮肤特别是角质层对药物透皮吸收具有屏障作用，阻碍药物的吸收，微针能够刺穿皮肤的角质层屏障，产生微通道来增加药物的渗入，药物(干细胞)通过微针孔隙渗入皮肤真皮层的毛细血管网的间隙中，通过微循环提供的氧气和营养物质干细胞可在局部定植、存活，可作为种子工程细胞补充皮肤局部随着年龄增加逐渐减少的表皮干细胞，并在局部通过旁分泌作用修复局部衰老受损的细胞或者促进皮肤固有的表皮干细胞的增殖、活化另外干细胞的多向分化潜能使局部定植的干细胞在表皮局部微环境的作用下定向分化为表皮细胞、成纤维细胞等，促进表皮增厚、胶原合成等，从而增加皮肤的弹性和厚度，可有效缓解皮肤皱纹的产生。相比注射玻尿酸、肉毒杆菌素等方法，注射干细胞到皮肤局部能明显提高皮肤的功能，结合水光注射仪的使用，能够达到足量、快速的给药目的，大大减少了药物的剂量和提高了药物的疗效。由于水光注射仪一般穿刺深度仅在角质层及真皮浅层，未接触到大的神经和血管，同时结合负压技术吸起皮肤，使接受注射的皮肤远离皮下的血管组织，结合直径为32G针头的使用，进一步减少大量出血和血肿的风险，减少了对机体组织的损伤程度和机体的疼痛感，同时可刺激真皮层的成纤维细胞增生、合成胶原纤维从而使皮肤增厚、皱纹减轻甚至消失。已有研究已经证实了微针的安全性和无刺激性。因此，微针透皮导入药物方式是安全、高效和无痛给药的最佳方式。
发明内容
本发明综合利用干细胞移植技术和微针给药技术，提供了一种水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂及其应用。本发明利用微针透皮技术可以增加干细胞输送效率，直接到达皮肤需要治疗的部位，可以定点、定层、定量的将有效成分直接输送到所需的皮肤组织，治疗面积广泛，可全面覆盖整个治疗区域，连续使用可明显减少眼角周围、颈部的皱纹，皮肤恢复光滑、弹性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂，其为由脐带间充质干细胞和生理盐水组成的干细胞悬液，其中：脐带间充质干细胞为第四代脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞和生理盐水的总体积为5毫升，干细胞悬液中脐带间充质干细胞的细胞总数为1×106～107个。
上述水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂可用于治疗皮肤衰老相关症状，具体方法如下：
在微电脑的控制下，使用9针型水光注注射仪通过负压系统将治疗区域皮肤吸起，使用负压把脐带间充质干细胞制剂定点、定量、定层注射至皮肤真皮层，水光注射仪的参数如下：注射次数为100～300次，注射深度为0.5～2mm，负压强度为2档，注射位置为面部和/或颈部真皮层，颈部使用时注意避开大血管、甲状腺的部位。
本发明中，所述脐带间充质干细胞的制备步骤如下：
步骤一、干细胞种子库的建立
(1)无菌条件下获取经检测合格的脐带组织(产妇检查乙丙梅艾、TORCH、HTLV病毒、EB病毒、地贫基因分型、肝肾功能等无异常)，同时取10ml脐带血送检(乙丙梅艾、TORCH、HTLV病毒、EB病毒、无菌性检测)，脐带组织保存至4℃无菌生理盐水中、密封，4h内冷链运输至GMP车间；
(2)生物安全柜中，将脐带转至10cm培养皿中，浸于75～80％乙醇中消毒2～5min，氯化钠注射液清洗3～5次，去除血渍；无菌剪刀剪去脐带两端手术结扎线，然后将制备用脐带剪至2～3cm数段，按血管螺旋走向剔除2条脐动脉和1条脐静脉；用有齿镊将位于羊膜与血管间的白色组织Wharton胶质剥离下来，氯化钠注射液洗涤胶体3～5次；
(3)将获得的胶体转移至50ml离心管，加入20～30ml氯化钠注射液，离心5～10min，弃上清液，称重记录，加入1～2ml培养基，用无菌组织剪将胶体剪至1～4mm3组织匀浆块；加入培养基使组织匀浆块浓度定为0.5～1.0g/ml，电动移液器吹打均匀后，每个T175培养瓶中接种2.33ml组织匀浆，即1.17g Wharton胶质，补加25ml培养基；
(4)原代培养5～6天后进行培养基全量换液，9～10天后吸掉半量培养基，补足等量新鲜培养基进行半量换液；根据细胞生长状态，培养至12～13天再进行一次半量换液，培养至第14～17天，待细胞克隆团面积百分比达80～85％时，用胰酶消化后收获细胞(P0代)；
(5)将细胞按5～10×103/cm2的密度接种至2层细胞工厂(NEST，Cat No.771101)中进行干细胞扩增培养，其中：每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一T175培养瓶内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；培养3～5天后当细胞融合至90～95％，将干细胞(P1代)消化，继续按5～10×103/cm2的密度接种至10层细胞工厂(NEST，Cat No.771302)中进行干细胞扩增培养，其中：每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；培养3～5天后当细胞融合至90～95％，将干细胞(P2代)消化，每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、做质控检测，然后用无血清细胞冻存液(ZENOAQ,CatNo:Cellbanker2)重悬、按5～10×106cells/ml/管的密度分装于细胞冻存管中，在-80℃放置至少24小时后置于液氮罐中深低温保存，建立干细胞种子库(P2代)，并按中国药典(2015版)进行种子库的检定；
(6)复苏干细胞，离心去除冻存液后，氯化钠注射液洗涤细胞沉淀1次后，按5～10×103/cm2的密度将干细胞接种于2层细胞工厂中进行干细胞扩增培养，其中：每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一细胞冻存管内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；培养3～5天后当细胞融合至90～95％时，将干细胞消化(P3代)、吹打混匀后，将单细胞悬液按5～10×103/cm2的密度接种于10层细胞工厂中进行干细胞扩增培养，其中：每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；待细胞融合度达到90～95％，将干细胞消化，回收干细胞(P4代)，每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、做质控检测，然后用无血清细胞冻存液(ZENOAQ，Cat No:Cellbanker2)重悬、按5～10×106cells/ml/管分装，冻存，建立干细胞工作库(P4代)，并按中国药典(2015版)进行干细胞工作库的检定；
步骤二、脐带间充质干细胞的制备
(1)在干细胞种子库中取1支装5～10×106cells/ml/管的P2代脐带间充质干细胞，将其复苏后按5～10×103cells/cm2的密度接种到1个2层细胞工厂(NEST，CatNo.771101)中进行干细胞扩增培养，其中：每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一支细胞冻存管内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；
(2)待细胞融合度达90～95％时，将2层细胞工厂的干细胞消化下来，按5～10×103cells/cm2的密度接种到1个10层细胞工厂中进行干细胞扩增培养，其中：每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；
(3)待10层细胞工厂中细胞融合度达到90～95％时，将干细胞消化下来，得到大量的干细胞；
(4)将步骤(3)中每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、送有资质的第三方做质控检测后，使用无血清细胞冻存液(ZENOAQ，Cat No:Cellbanker2)重悬，然后按5～10×106cells/ml/管用细胞冻存管进行分装，使用程序降温盒在-80℃放置至少24小时后置液氮罐中储存。使用时将干细胞复苏后冻存液离心去除，氯化钠注射液洗涤干细胞三次、取样质控检测后4℃冷链运输、使用。
本发明中，所述步骤二的(2)和(3)中的干细胞在2层细胞工厂和10层细胞工厂培养时，接种密度控制在30％，使干细胞3～5天达到90～95％融合度，中间无需换液。
本发明，所述细胞冻存管是经过软件编辑、生成二维码后打印粘贴于冻存管上，每管细胞有独特的ID，复苏时经扫码核对后发放。
本发明中，所述培养基为添加了2％血清替代物的无血清间充质干细胞培养基，即：UltraCULTURE SF Medium(Lonza,Cat No:12-725F)+2％Ultroser G血清替代物(Pall,Cat No:15950-017)。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
1、本发明采用水光注射仪注射脐带间充质干细胞于面部/颈部，用于面部/颈部皮肤抗皱并改善皮肤质地和肤色。脐带间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的共性，即自我更新和多向分化能力。脐带间充质干细胞在表皮局部定植、增殖并分泌大量的活性因子修复局部受损的表皮细胞，并促进局部受损、数量减少的表皮干细胞的修复和增殖，还能在局部定向分化形成表皮细胞和成纤维细胞，促进胶原蛋白、弹力纤维和透明质酸合成，提高皮肤的含水量，增加皮肤厚度和弹性以及减少细纹，具有恢复皮肤生理功能的作用。相比注射玻尿酸补水、肉毒杆菌素祛皱等传统治疗方法，细胞生物治疗能从根部上改善皮肤的病理状态，效果更显著持久。
2、本发明使用9针型水光注射仪，结合真空负压技术，使之使用相同的剂量对每个单位面积(1cm2)进行平均覆盖，是从传统的点状充填到面状充填的新突破，通过水光注射仪注射的方法将脐带间充质干细胞产品定点、定量、定层注射至真皮层，术前外敷麻醉剂，，具有微痕、无痛、均匀注射，快捷方便，治疗仅需10分钟，达到光滑皮肤、去除皱纹、抗皮肤衰老等治疗功效，同时操作简单，可在医院皮肤科广泛使用。
附图说明
图1为细胞工厂培养的P4代UC-MSCs形态图；
图2为RT-PCR检测10层细胞工厂培养的P4代脐带间充质干细胞的Nanog(N)、OCT-4(O)、SOX-2(S)基因表达；
图3为P4代脐带间充质干细胞的细胞表面标记物检测，图3a：hUS-MSCs CD73、CD90、CD105空白对照；图3b：hUS-MSCs样品CD73、CD90、CD105检测；图3c：hUS-MSCs CD19/CD34/CD14空白对照；图3d：hUS-MSCs样品CD19/CD34/CD14检测；图3e：hUS-MSCs CD45/HLA-DR空白对照；图3f：hUS-MSCs样品CD45/HLA-DR检测；
图4为hUC-MSCs成骨细胞分化、成软骨细胞分化、成脂肪细胞分化能力，图4a：MSC分化前后形态对比，A:未分化hUC-MSC(Day0)、成骨分化6天(Day6)、9天(Day9)的brightfield形态图；B:未分化hUC-MSC(Day 0)、成脂分化6天(Day6)、9天(Day9)的bright field形态图；C:未分化hUC-MSC(Day 0)、成软骨分化6天(Day6)、9天(Day9)的bright field形态图；图4b：hUC-MSC成骨细胞诱导分化鉴定，A:未分化hUC-MSC bright field形态图；B:hUC-MSC未分化时，茜素红S染色；C:hUC-MSC诱导分化后茜素红S染色；图4c：hUC-MSC成软骨细胞诱导分化鉴定，A:未分化hUC-MSC bright field形态图；B:未分化hUC-MSC阿辛蓝(Alcianblue)染色阴性对照；C:诱导分化14天阿辛蓝(Alcian blue)染色结果(400倍)；D：诱导分化12天阿辛蓝(Alcian blue)染色结果(200倍)；图4d：hUC-MSC成脂肪细胞诱导分化鉴定，A-G:hUC-MSC成脂分化14天后，油红O染色(100倍，400倍)；H:hUC-MSC成脂分化14天后，可见明显脂滴形成(100倍，400倍)；
图5为颈部水光注射仪注射hUC-MSC前后对比图，图5a：注射前；图5b：注射后。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：
本实施例提供了一种建立安全有效、数量足够的细胞库的方法，细胞库中的细胞通过专业的第三方鉴定合格，并且细胞量能够满足临床治疗的不断供给。
新生儿出生后获得脐带组织，其中捐献者必须经过严格体检，包括各项病毒检测、传染病检测，签署知情同意书和捐赠协议。在无菌手术室，从人体新鲜分离后的脐带迅速转移至4℃无菌氯化钠注射液中、密封，4h内通过冷链运送到专业的细胞制备中心。
本实施例中，细胞库的具体建立步骤如下：
(1)将脐带组织转移至药品级别GMP车间，经严格处理，75％乙醇消毒，转移至事先已照紫外线30分钟的生物安全柜中。
(2)生物安全柜中，将脐带转至10cm培养皿中，浸于75％乙醇中消毒2min，氯化钠注射液清洗3次，去除血渍。无菌剪刀剪去脐带两端手术结扎线，然后将制备用脐带剪至2～3cm数段，按血管螺旋走式剔除2条脐动脉和1条脐静脉。用有齿镊将位于羊膜与血管间的白色组织Wharton胶质剥离下来，氯化钠注射液洗涤胶体3次。
(3)获得的胶体转移至50ml离心管，加入20～30ml氯化钠注射液，840g离心5min，弃上清液，称重记录，加入1～2ml培养基，用无菌组织剪将胶体剪至1～4mm3组织匀浆块。加入适量培养基将组织匀浆块浓度定为约0.5g/ml，电动移液器吹打均匀后，每个T175培养瓶中接种2.33ml组织匀浆，即1.17g Wharton胶质，补加25ml培养基。
(4)原代培养5～6天后进行培养基全量换液，9～10天后吸掉半量培养基，补足等量新鲜培养基进行半量换液。根据细胞生长状态，培养至12～13天再进行一次半量换液，培养至第14～17天，待细胞克隆团面积百分比达80％左右时，用0.125％胰酶消化后收获细胞(P0代)。
(5)将细胞按5～10×103/cm2的密度接种至2层细胞工厂(NEST，Cat No.771101)中进行干细胞扩增培养，其中：每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一T175培养瓶内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；培养3～5天后当细胞融合至90％左右时，将干细胞(P1代)消化，继续按5～10×103/cm2的密度接种至10层细胞工厂(NEST，Cat No.771302)中进行干细胞扩增培养，其中：每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；培养3～5天后当细胞融合至90％左右时，将干细胞(P2代)消化，每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、做质控检测，然后用无血清细胞冻存液(ZENOAQ，Cat No:Cellbanker2)重悬、按5～10×106cells/ml/管的密度分装于细胞冻存管中，置于程序降温盒中在-80℃冻存至少24小时后置于液氮罐中深低温保存，建立干细胞种子库(P2代)，并按中国药典(2015版)进行种子库的检定。
(6)复苏干细胞，离心去除冻存液后，氯化钠注射液洗涤细胞沉淀1次后，按5～10×103/cm2的密度将干细胞接种于2层细胞工厂中进行干细胞扩增培养，其中：每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一细胞冻存管内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；培养3～5天后当细胞融合至90％左右时，将干细胞消化(P3代)、吹打混匀后，将单细胞悬液按5～10×103/cm2的密度接种于10层细胞工厂中进行干细胞扩增培养，其中：每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；待细胞融合度达到90％左右时，胰酶消化，用真空负压管路吸引回收干细胞(P4代)，每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、做质控检测，然后用无血清细胞冻存液(ZENOAQ，Cat No:Cellbanker2)重悬、分装，冻存，建立干细胞工作库(P4代)，并按中国药典(2015版)进行干细胞工作库的检定。
本实施例中，所述干细胞是脐带间充质干细胞；使用的培养基为UltraCULTURE SFMedium+2％Ultroser G血清替代物。干细胞专用培养基+血清替代物可最大程度保持干细胞的未分化状态，避免加入胎牛血清造成的动物源性病原体污染和及人体针对动物源性蛋白的免疫反应，为临床应用做准备。
本实施例中，使用的细胞冻存管是经过软件编辑、生成二维码后打印粘贴于冻存管上，每管细胞有独特的ID，复苏时经扫码核对后发放。
本实施例中，每次干细胞的接种密度控制在30％，3～5天可达到90～95％融合度，中途无需换液。
实施例2：
本实施例提供了一种利用细胞工厂制备临床级脐带间充质干细胞的方法，具体步骤如下：
(1)在干细胞种子库中取1支装5～10×106cells/ml/管的P2代脐带间充质干细胞，将其复苏后按5～10×103/cm2的密度接种到1个2层细胞工厂(NEST，Cat No.771101)中进行干细胞扩增培养，使干细胞在扩增至一定数量(P3代)，其中：每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一支细胞冻存管内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；
(2)待细胞融合度达90％左右时，将2层细胞工厂的干细胞消化下来，按5～10×103/cm2的密度接种到1个10层细胞工厂中进行干细胞扩增培养，其中：每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；
(3)待10层细胞工厂中细胞融合度达到90％左右时，胰酶消化，用真空负压管路吸引回收干细胞(P4代)，得到大量的干细胞；
(4)将步骤(3)中每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、送有资质的第三方做质控检测后，使用无血清细胞冻存液(ZENOAQ，Cat No:Cellbanker2)重悬，然后按5～10×106cells/ml/管用细胞冻存管进行分装，使用程序降温盒在-80℃放置至少24小时后置液氮罐中储存。使用时将干细胞复苏后冻存液离心去除，氯化钠注射液洗涤干细胞三次、取样质控检测后4℃冷链运输、使用。
本实施例中，培养过程中使用的培养基为UltraCULTURE SF Medium+2％UltroserG血清替代物。培养过程中全程使用间充质干细胞培养基并添加血清替代物，避免临床应用中动物源性血清中成分的潜在不安全性(如病毒、真菌污染、动物源性蛋白等)。
实施例3：
本实施例提供了一种实施例2制备的脐带间充质干细胞的鉴定方法，具体如下：
2006年，国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)确定了间充质干细胞的鉴定标准为：
(1)在塑料培养皿内贴壁生长，在含血清的培养基内高度增殖；
(2)表达细胞表面标志CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19；
(3)在体外可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
本实施例依据此最低标准进行干细胞的表型鉴定。
10层细胞工厂中干细胞增殖融合至90％后，使用多层细胞培养器观察台观察细胞形态，如图1所示，干细胞呈贴壁生长，梭形，为正常干细胞形态，细胞工厂生产的干细胞符合间充质干细胞的最低鉴定标准的形态学标准。
图2结果显示，细胞工厂生产的P4代干细胞强表达Oct-4、Nanog和Sox-2等胚胎干细胞标志物，显示经过细胞工厂的培养，干细胞仍然保持其良好的未分化状态，为其临床应用提供了可靠依据。
脐带间充质干细胞的细胞表型特征的鉴定：取P4代脐带间充质干细胞，采用生理盐水稀释得到密度为1×106个细胞/mL的干细胞悬液，分别吸取抗CD105、CD73、CD90、CD19、CD34、CD14、CD45、HLA-DR的单克隆抗体各5μL，加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立同型对照组；1500prm离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，再用500μLPBS重悬后上机检测。
表型特征鉴定结果见图3，由图3可知，CD14-、CD19-、CD34-、CD45-、HLA-DR-≤2.0％，符合干细胞鉴定标准的表面标志物的鉴定要求。
hUC-MSCs成骨细胞分化、成软骨细胞分化、成脂肪细胞分化能力见图4。由图4可知，经过定向诱导分化，脐带间充质干细胞分化成典型的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，符合干细胞鉴定标准的三系分化要求。
干细胞生产、使用过程的各项质控检测按GMP要求进行，在此不予赘述。
实施例4：
本实施例提供了一种水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂及其应用，所述脐带间充质干细胞制剂为由脐带间充质干细胞和生理盐水组成的干细胞悬液，其中：脐带间充质干细胞和生理盐水的总体积为5毫升，干细胞悬液中脐带间充质干细胞的细胞总数为1×106～1×107个。该制剂可用于治疗面部衰老相关症状，例如皱纹。具体方法如下：
1、实验前30min打开生物安全柜紫外进行消毒，同时打开水浴锅至水温恒定至37℃，将10毫升添加了2％血清替代物的无血清间充质干细胞培养基放在水浴锅中预热；
2、将预热的干细胞培养基擦干水迹，从实施例2的液氮罐中取1支P4代脐带间充质干细胞，37℃水浴锅中晃动1～2分钟速融，擦干水迹，75％酒精棉球对冻存管口外表面擦拭消毒后放入生物安全柜；
3、用镊子辅助轻轻旋开冻存管瓶盖，使用移液器将细胞悬液吸出，缓缓滴加到预热的10毫升干细胞培养基中，1000rpm/min，离心5min；
4、弃去上清，轻弹离心管底的细胞沉淀后，加入10ml氯化钠注射液轻轻吹打混匀，1000r/min，离心5min；
5、重复上述洗涤步骤一次；
6、弃去上清，轻弹离心管底的细胞沉淀后，加入5毫升氯化钠注射液轻轻吹打混匀。
7、将干细胞悬液转移至9针型水光注射仪(以BellaVitaTM Injector,VER.1.1为例)的注射器中，设置水光注射仪的参数如下：注射次数为200次，注射深度为2mm，负压强度为2档，注射到面部及/颈部。
实施例5：
本实施例提供了实施例4中水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂的面部治疗过程，具体步骤及评价效果如下：
手术过程：术区涂布复方利多卡因乳膏，保鲜膜覆盖，40min后取平卧位，常规消毒脱碘，铺巾，暴露术野，将干细胞悬液混匀后放入9针型水光注射仪的注射器中，按照实施例4的第7步调整注射参数，按手术涉及区域垂直注射到相应部位。
术后创面淤血轻微，出血少，无需特殊处理，如有必要，可冰敷20分钟，术后24小时内避免接触自来水及护肤品、化妆品、紫外线即可。
按照上述方法将脐带间充质干细胞制剂通过9针型水光注射仪注射至颈部的真皮层，4周以后评价治疗效果。如有必要，术后1个月重复1～2个疗程。由图5可知，该患者经过2个疗程的治疗，注射前颈纹明显，注射后颈纹明显淡化，因此水光注射仪用脐带间充质干细胞制剂具有良好的治疗效果。

Claims (10)

1.一种水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂，其特征在于所述制剂为由脐带间充质干细胞和生理盐水组成的干细胞悬液，其中：脐带间充质干细胞和生理盐水的总体积为5毫升，干细胞悬液中脐带间充质干细胞的细胞总数为1×106～1×107个。
2.根据权利要求1所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂，其特征在于所述脐带间充质干细胞为第四代脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂，其特征在于所述脐带间充质干细胞的制备方法如下：
步骤一、干细胞种子库的建立
(1)无菌条件下获取经检测合格的脐带组织，保存至4℃无菌生理盐水中、密封，4h内冷链运输至GMP车间；
(2)生物安全柜中，将脐带转至10cm培养皿中，浸于75～80％乙醇中消毒2～5min，氯化钠注射液清洗3～5次，去除血渍；无菌剪刀剪去脐带两端手术结扎线，然后将制备用脐带剪至2～3cm数段，按血管螺旋走向剔除2条脐动脉和1条脐静脉；用有齿镊将位于羊膜与血管间的白色组织Wharton胶质剥离下来，氯化钠注射液洗涤胶体3～5次；
(3)将获得的胶体转移至50ml离心管，加入20～30ml氯化钠注射液，离心5～10min，弃上清液，称重记录，加入1～2ml培养基，用无菌组织剪将胶体剪至1～4mm3组织匀浆块；加入培养基使将组织匀浆块浓度定为0.5～1.0g/ml，电动移液器吹打均匀后，每个T175培养瓶中接种2.33ml组织匀浆，补加25ml培养基；
(4)原代培养5～6天后进行培养基全量换液，9～10天后吸掉半量培养基，补足等量新鲜培养基进行半量换液；根据细胞生长状态，培养至12～13天再进行一次半量换液，培养至第14～17天，待细胞克隆团面积百分比达80～85％时，用胰酶消化后收获细胞；
(5)将细胞按5～10×103/cm2的密度接种至2层细胞工厂中进行干细胞扩增培养；培养3～5天后当细胞融合至90～95％，将干细胞消化，继续按5～10×103/cm2的密度接种至10层细胞工厂中进行干细胞扩增培养；培养3～5天后当细胞融合至90～95％，将干细胞消化，每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、做质控检测，然后用无血清细胞冻存液重悬、按5～10×106cells/ml/管的密度分装于细胞冻存管中，在-80℃放置至少24小时后置于液氮罐中深低温保存，建立干细胞种子库，并进行种子库的检定；
(6)复苏干细胞，离心去除冻存液后，氯化钠注射液洗涤细胞沉淀1次后，按5～10×103/cm2的密度将干细胞接种于2层细胞工厂中进行干细胞扩增培养；培养3～5天后当细胞融合至90～95％时，将干细胞消化、吹打混匀后，将单细胞悬液按5～10×103/cm2的密度接种于10层细胞工厂中进行干细胞扩增培养；待细胞融合度达到90～95％，将干细胞消化，回收干细胞，每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、做质控检测，然后用无血清细胞冻存液重悬、按5～10×106cells/ml/管分装，冻存，建立干细胞工作库，并进行干细胞工作库的检定；
步骤二、脐带间充质干细胞的制备
(1)在干细胞种子库中取1支装5～10×106cells/ml/管的P2代脐带间充质干细胞，将其复苏后按5～10×103cells/cm2的密度接种到1个2层细胞工厂中进行干细胞扩增培养；
(2)待细胞融合度达90～95％时，将2层细胞工厂的干细胞消化下来，按5～10×103cells/cm2的密度接种到1个10层细胞工厂中进行干细胞扩增培养；
(3)待10层细胞工厂中细胞融合度达到90～95％时，将干细胞消化下来，得到大量的干细胞；
(4)将步骤(3)中每个10层细胞工厂生产的干细胞取样、送有资质的第三方做质控检测后，使用无血清细胞冻存液重悬，然后按5～10×106cells/ml/管用细胞冻存管进行分装，使用程序降温盒在-80℃放置至少24小时后置液氮罐中储存。
4.根据权利要求3所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂，其特征在于所述干细胞种子库的建立步骤中，步骤(5)中，每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一T175培养瓶内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：35～40℃、5～10％CO2培养箱中贴壁培养3～5天；所述步骤(6)中，每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一细胞冻存管内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天；每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天。
5.根据权利要求3所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂，其特征在于所述脐带间充质干细胞的制备步骤中，步骤二(1)中，每个2层细胞工厂接种的干细胞来源于同一支细胞冻存管内的细胞，每个2层细胞工厂接种细胞总数为6.395×106个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：35～40℃、5～10％CO2培养箱中贴壁培养3～5天；所述步骤二(2)中，每个10层细胞工厂接种的干细胞来源于同一2层细胞工厂培养的干细胞，每个10层细胞工厂接种的细胞总数为3.17×107个，每层加入的细胞悬液体积为150～200ml，培养条件为：在37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中贴壁培养3～5天。
6.根据权利要求3或4所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂，其特征在于所述细胞冻存管是经过软件编辑、生成二维码后打印粘贴于冻存管上，每管细胞有独特的ID，复苏时经扫码核对后发放。
7.根据权利要求3所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂，其特征在于所述培养基为添加了2％血清替代物的无血清间充质干细胞培养基。
8.一种权利要求1-7任一权利所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂在治疗皮肤衰老相关症状中的应用。
9.根据权利要求8所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂在治疗皮肤衰老相关症状中的应用，其特征在于所述治疗方法如下：
在微电脑的控制下，使用9针型水光注注射仪通过负压系统将治疗区域皮肤吸起，使用负压把脐带间充质干细胞制剂定点、定量、定层注射至皮肤真皮层。
10.根据权利要求9所述的水光注射仪注射脐带间充质干细胞制剂在治疗皮肤衰老相关症状中的应用，其特征在于所述水光注射仪的参数如下：注射次数为100～300次，注射深度为0.5～2mm，负压强度为2档，注射位置为面部和/或颈部真皮层。
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