CN111643526A - 一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂 - Google Patents

一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂，该制剂包括脐带间充质干细胞和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。该方案可解决单用脐带间充质干细胞治疗卵巢早衰等更年期症状的效果有限的问题。本方案的制剂可以应用于卵巢早衰的治疗和预防以及美容美体中，并可用于防治围绝经期痴呆和抑郁等。

Description

一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细 胞制剂
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂。
背景技术
卵巢衰老是指年龄相关女性卵巢储备/功能逐渐衰退直至衰竭的过程，受遗传、环境、社会心理、生活方式等多因素影响，以卵泡数量和卵子质量下降为基础，最终表现为绝育乃至绝经，并影响全身多个系统和器官，导致相关疾病和综合征的发生发展。目前观点认为卵巢衰老是女性机体衰老的起搏器，是多个器官衰老的始动因素。随着现代社会工作和生活节奏的不断加快，压力增大，许多女性在非更年期出现更年期症状，即出现卵巢早衰(POF)。卵巢早衰是指女性40岁之前由于多种病因出现卵巢萎缩和功能减退。卵巢早衰对女性生殖健康的两大威胁主要是雌激素水平降低及生育能力丧失，雌激素水平降低增加了女性患痴呆和骨质疏松的危险，并诱发情绪波动和抑郁。该病目前诊断标准为:40岁以前出现至少4个月以上闭经,并有2次或以上血FSH>40U/L(两次检查间隔1个月以上),雌二醇<73.2pmol/L。该病发病率在育龄女性中超过1％，且近年来呈上升和年轻化趋势。
间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族的重要成员，属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中。间充质干细胞具有以下特性：①具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力；②具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；③具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性；④面目模糊，表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。正是由于MSCs所具备的这些免疫学特性，使其具有广阔的临床应用前景。MSCs最先在骨髓中被发现，并在脐带、脂肪、脐带血、羊膜、(胎盘)绒毛膜、胎儿血和肝脏等中存在。脐带间充质干细胞(UC-MSCs)与其他来源MSCs相比，具有以下优势：①UC-MSCs细胞在脐带组织中丰度高；②由于MSCs具有年龄特性，因此脐带和羊膜来源的MSCs具有明显的优势；③UC-MSCs的免疫调节能力优于其他来源MSCs；④UC-MSCs分泌细胞生长因子的总量明显高于其他来源MSCs；⑤由于具有来源获取方便和高增殖能力等特性，UC-MSCs最适合作为MSCs细胞治疗的组织来源。
近年的研究发现UC-MSCs可以在损伤的大鼠卵巢中存活，迁移，能部分改善建模后大鼠的性激素水平，减轻对卵泡的损伤，卵巢注射组和尾静脉注射组部分大鼠能生育幼鼠，其后代生长发育良好。将UC-MSCs通过尾静脉注射到小鼠体内，可以提高卵泡的数量，改善卵巢的功能。UC-MSCs改善卵巢功能的机制主要包括：(1)释放细胞因子进行免疫调节，减少炎性因子；(2)分泌旁分泌因子，保护卵巢细胞；(3)改善卵巢组织微循环，减少自由基等有害因素，改善内分泌。UC-MSCs是目前最有可能应用于临床治疗卵巢早衰的生物制剂，为高龄妇女卵巢功能低下及卵巢抗衰老提供了新的技术手段，通过再生医学新技术帮助卵巢早衰患者迎来了健康美丽的希望之光。但是，UC-MSCs通过静脉注射进入患者体内的卵巢改善功能有限，亟需研发一种能够提高UC-MSCs卵巢修复能力的方法，以满足治疗或者缓解卵巢早衰等更年期症状的需求。
发明内容
本发明旨在提供一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂，以解决单用脐带间充质干细胞治疗卵巢早衰等更年期症状的效果有限的问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂，包括脐带间充质干细胞和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
本方案的原理及优点是：脐带间充质干细胞(UC-MSCs)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的组合物制剂可用于延缓卵巢衰老和防治围绝经期痴呆和抑郁。GM-CSF可有效提高UC-MSCs的增殖、免疫调节和细胞因子、营养因子释放谱，进而增强UC-MSCs延缓卵巢衰老的作用，可用于卵巢早衰及美容美体，并可用于防治围绝经期痴呆和抑郁。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，是由巨噬细胞，T细胞，肥大细胞，自然杀伤细胞，内皮细胞和成纤维细胞分泌的作为细胞因子起作用的单体糖蛋白。GM-CSF不仅作为骨髓造血功能调节的重要因子，同时还对免疫细胞的产生和功能很重要。其主要功能为兴奋骨髓的造血功能、刺激粒细胞、单核细胞、T细胞的增殖，并能促进单核细胞和粒细胞的成熟。GM-CSF是一种广谱效应的多肽因子，对早期的造血祖细胞具有促增殖的作用。主要作用于髓系祖细胞，通过与其高亲和力受体结合发挥生物学效应，使其迅速进入细胞周期向粒系和巨噬系分化，最后成为成熟细胞，并能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能。与特异性促进中性粒细胞增殖和成熟的粒细胞集落刺激因子不同，GM-CSF影响更多细胞类型，尤其是巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。GM-CSF是一种单体糖蛋白，具有细胞因子的功能，是一种白细胞生长因子。GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞离开循环并迁移到组织中，随后它们成熟为巨噬细胞和树突细胞。因而是免疫/炎症级联的一部分，通过该级联，少量巨噬细胞的活化可以迅速导致其数量的增加，这是对抗感染一个关键的过程。GM-CSF对免疫系统的成熟细胞也有一些影响，可抑制嗜中性粒细胞迁移并引起细胞表面上受体表达变化。GM-CSF还能够促进UC-MSCs的体外增殖，而UC-MSCs亦可以释放GM-CSF，因此二者具有明确的相互影响，合用可产生良好的协同效应。GM-CSF可有效提高UC-MSCs的增殖、免疫调节和细胞因子、营养因子释放谱，进而增强UC-MSCs延缓卵巢衰老的作用，可用于卵巢早衰及美容美体，并可用于防治围绝经期痴呆和抑郁。
进一步，所述脐带间充质干细胞为原代脐带间充质干细胞或者继代脐带间充质干细胞。
采用上述技术方案，原代脐带间充质干细胞或者继代脐带间充质干细胞均具有较高的分泌活性。
进一步，所述继代脐带间充质干细胞为第1代至第10代继代脐带间充质干细胞。
采用上述技术方案，第1代至第10代继代脐带间充质干细胞分泌出的细胞因子，具有活性高以及分泌量大的特点，适合用于进行卵巢细胞保护、改善卵巢组织微循环等。
进一步，所述脐带间充质干细胞的密度为1×107个/mL～1×108个/mL。
采用上述技术方案，上述密度的脐带间充质干细胞可以释放足够量的细胞因子，以保护卵巢细胞，改善卵巢组织微循环，减少自由基等有害因素，改善内分泌。
进一步，所述重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为100μg/mL～200μg/mL。
采用上述技术方案，上述浓度的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子可以有效刺激脐带间充质干细胞功能。
进一步，所述制剂还包括氯化钠。
采用上述技术方案，氯化钠溶液为常见渗透压平衡液，易于获取，用于维持间充质干细胞的功能和形态。
进一步，所述氯化钠的浓度为0.8％～1.0％。
采用上述技术方案，上述质量分数的氯化钠溶液可实现对脐带间充质干细胞的形态和功能的维持。
进一步，所述制剂的溶剂为无菌注射用水。
采用上述技术方案，水为常规溶剂，性质稳定。
进一步，所述制剂由下述方法制备：将重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分散于含氯化钠的无菌注射用水中，获得制剂基质；将脐带间充质干细胞混悬于所述制剂基质中，获得制剂。
采用上述技术方案，先制备基质，便于对基质进行消毒灭菌，然后在无菌的基质中接种脐带间充质干细胞，实现无菌操作。
进一步，将间充质干细胞混悬于所述制剂基质中的过程在低于25℃的温度下进行。
采用上述技术方案，温度低于25℃可减少制备过程对脐带间充质干细胞的刺激，保持其分泌功能不受温度条件的抑制。
具体实施方式
本发明涉及一种可用于延缓卵巢衰老和防治围绝经期痴呆和抑郁的脐带间充质干细胞(UC-MSCs)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的组合物制剂。GM-CSF可有效提高UC-MSCs的增殖、免疫调节和细胞因子、营养因子释放谱，进而增强UC-MSCs延缓卵巢衰老的作用，可用于卵巢早衰及美容美体，并可用于防治围绝经期痴呆和抑郁。
实施例1
一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂包括脐带间充质干细胞(UC-MSCs)、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(简称GM-CSF，同立海源，TL-302)、氯化钠和水。
UC-MSCs在制剂中的密度为1×107个/mL，GM-CSF在制剂中的浓度为100ug/mL，氯化钠的质量百分数为0.8％。UC-MSCs在本方中使用的是原代脐带间充质干细胞，其分离获取的方法为：
(1)脐带组织处理：将组织块平铺于细胞培养平皿中，使组织块风干直至组织贴在平皿上。
(2)脐带组织培养：沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没，放进CO2浓度为5％的37℃培养箱进行培养，培养至第3-7天时补加适量间充质干细胞培养基(本实施例为第5天)；在第9-11天时将平皿中的培养基移出(本实施例为第10天)，加入适量新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天时清除所有脐带组织块并继续培养(本实施例为第12天)；此后每1-3天进行一次全换液(本实施例为每2天)。当细胞培养皿内的细胞融合率达到50-70％时，消化细胞，离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮，获得原代脐带间充质干细胞。
本制剂按照如下的方法制备：
将GM-CSF加入无菌注射用水(含氯化钠0.8％)中，获得制剂的基质，对基质进行灭菌处理(可采用过滤除菌、热压灭菌等常规灭菌手段)；将预先制得的UC-MSCs混悬于该基质中(保证温度低于25℃)，分装到一次性使用的预充注射器中，即得。上述所有制备过程需要在无菌条件下进行。
实施例2
本实施例基本同实施例1，不同点在于：UC-MSCs在制剂中的密度为1×108个/mL，GM-CSF在制剂中的浓度为200ug/mL，无菌注射用水中氯化钠的质量百分数为1.0％。
实施例3
本实施例基本同实施例1，不同点在于：UC-MSCs在制剂中的密度为0.5×108个/mL，GM-CSF在制剂中的浓度为150ug/mL，无菌注射用水中氯化钠的质量百分数为0.9％。
实施例4
本实施例基本同实施例1，不同点在于：UC-MSCs在本方中使用的是第1代继代脐带间充质干细胞。第1代继代脐带间充质干细胞的获取方法如下：
(1)脐带组织处理：将组织块平铺于细胞培养平皿中，使组织块风干直至组织贴在平皿上。
(2)脐带组织培养：沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没，放进CO2浓度为5％的37℃培养箱进行培养，培养至第3-7天时补加适量间充质干细胞培养基(本实施例为第6天)；在第9-11天时将平皿中的培养基移出(本实施例为第10天)，加入适量新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天时清除所有脐带组织块并继续培养(本实施例为第12天)；此后每1-3天进行一次全换液(本实施例为每2天)。
(3)细胞传代：当细胞培养皿内的细胞融合率达到50-70％时，消化细胞，离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮，接种于T25细胞培养瓶进行传代扩增培养；每1-3天换液一次(本实施例为每2天)，直至融合率达到70-90％后，即得第1代脐带间充质干细胞。
实施例5
本实施例基本同实施例4，不同点在于：UC-MSCs在本方中使用的是第5代继代脐带间充质干细胞。第5代继代脐带间充质干细胞的获取方法如下：对第1代脐带间充质干细胞再进行4次继代培养，获得第5代脐带间充质干细胞。
实施例6
本实施例基本同实施例5，不同点在于：UC-MSCs在本方中使用的是第10代继代脐带间充质干细胞。第10代继代脐带间充质干细胞的获取方法如下：对第5代脐带间充质干细胞再进行5次继代培养，获得第10代脐带间充质干细胞。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂，其特征在于，包括脐带间充质干细胞和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述脐带间充质干细胞为原代脐带间充质干细胞或者继代脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于：所述继代脐带间充质干细胞为第1代至第10代继代脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于：所述脐带间充质干细胞的密度为1×107个/mL～1×108个/mL。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于：所述重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为100μg/mL～200μg/mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制剂，其特征在于：所述制剂还包括氯化钠。
7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于：所述氯化钠的浓度为0.8％～1.0％。
8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于：所述制剂的溶剂为无菌注射用水。
9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于：所述制剂由下述方法制备：将重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分散于含有氯化钠的无菌注射用水中，获得制剂基质；将脐带间充质干细胞混悬于所述制剂基质中，获得制剂。
10.根据权利要求9所述的制剂，其特征在于：将脐带间充质干细胞混悬于所述制剂基质中的过程在低于25℃的温度下进行。
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