JPH0276820A - 骨髄移植療法支持剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は骨髄移植療法支持剤に関する。

より詳細に記すと、本発明はヒｌ−ＢＣＤＦを有効成分
とする骨髄移植療法支持剤に関する。

〔従来の技術〕

ヒト及びマウスにおいて成ＰＢ細胞を抗体産生細胞へ分
化させる因子をＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）と総称する
。

ヒトの体内においてこのような重要な作用を有するヒト
ＢＣＤＦについて、本発明者等は研究を重ね、そのＤＮ
Ａ配列、及びアミノ酸配列を決定（特開昭６３−４２６
８８．６３−５６２９１）Ｌ、大腸菌によるヒトＢＣＤ
Ｐの生産に成功している（特開昭６３−１５７９９６）
、またヒトＢＣＤＦが感染症及しかしながら、今までこ
のヒトＢＣＤＦの白血病、再生不良性貧血等造血器疾患
に対する有効な治療法である骨髄移植療法を支持する薬
効についての報告はない。

なおヒトＢＣＤＦをＢＳＦ−２あるいはインターロイキ
ン６　（ＩＬ　６）と呼ぶことも提唱されているが、（
Ｎａｔｕｒｅ、３２４７３（１９８６）、ＥＭＢＯ，Ｊ
、、　　６．１２１９（１９８７）ここでは従来よりの
ＢＣＤＰなる名称を用いる。またここで用いるヒトＢＣ
ＯＦはインターフェロン活性を有さず、よってインター
フェロン活性を持つＩＦＮ−Ｂｇ標品（ヨーロッパ出願
公開阻０２２０５７４）とは異なる。

ここでまずヒト　ＢＣＤＦを含有する骨髄移植支持剤が
効果を呈する骨髄移植及びこれと関連して起こる合併症
について概説するとともに、現在行なわれている治療法
について簡単に説明する。

骨髄中には少数ながら多能性造血幹細胞（以下、幹細胞
）が含まれる。この細胞はリンパ球を含むすべての血球
系へ分化すると同時に、自己複製能を有する特徴がある
。一定の寿命を有しやがて死滅していく血球が生涯を通
じて旺盛な血球産生によって補われているのは、この自
己複製能によって骨髄中の幹細胞が分化しつつも一定の
数を保持していることによる。したがって、何らかの原
因により幹細胞の質的異常が生ずると、正常の血球骨髄
移植とは、このような病態に対して正常の骨髄細胞を移
植し、その中に含まれる幹細胞の生着をはかり、それよ
り派生する細胞でもって欠如する細胞を補完したり病的
細胞を置換し、疾患を根本的に治癒せんとするものであ
る。

１９５１年Ｌｏｒｅｎｚらは、骨髄細胞を投与すること
が、放射線を全身照射したマウス、モルモットを照射の
致死的効果より保護する働きを有することを報じ、骨髄
移植の臨床応用に初めての理論的基盤を与えた。（Ｊ、
Ｎ、Ｃ，ｌ　　１２巻、１９７頁（１９５１））。

近年７、骨髄移植は、白血病および重症再生不良性貧血
をはじめとする難治性の造血器疾患の治療に試みられ、
成功例が続々と報告されてきている。

しかし、その恩恵にあずかる患者は限られており、また
すべての適応患者に対して安全確実に行える治療法では
ない（代謝２１巻、８９９頁’（１９８４））。

何故なら、骨髄移植患者の中には、種々の予防対策にも
抱らず、移植そのものがもたらす重篤な合併症によって
死亡するものがなお少くないからである。この合併症の
主なものとして、移植片対宿主病反応（以下Ｇ　Ｖ　Ｈ
Ｄと略す）、重症感染症、間質性肺炎があげられる。

例えば白血病の場合、上記合併症が主原因で骨髄移植を
行ったにもかかわらず、１９７５年から８５年の１０年
間で３５６症例中２０２例が死亡している（代謝２４巻
臨時増刊号、癌・８７　２０５頁（１９８７））。それ
では何故骨髄移植が上述の合併症を併発するかについて
は以下に記載する。

白血病等で骨髄移植を受ける患者は通常、骨髄移植手術
を受ける前に放射線照射を行うことにより悪性白血球及
び正常白血球を含めた全白血球数をゼロにしておいてか
ら、骨髄細胞を移植するのである。この操作にて悪性白
血球を根絶した後、正常骨髄細胞を移植すれば移植した
骨髄細胞が十分機能し、正常な白血球を生産するのであ
る。

しかし、移植した骨髄細胞が十分機能するまでの時期、
即ち正常白血球数が少ない時期に感染症等の種々の合併
症が発生するのである。

従って、骨髄移植後の血液学的免疫学的再構築をいかに
促進するかが今後の最も基本的な課題である。さて、現
在骨髄移植時には、無菌室・無菌食・腸内殺菌・成分輸
血等の支持療法がなされるのみであるが、最近、免疫能
や造血に働く生体活性物質の臨床的利用が注目されてき
ており、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）や尿由
来コロニー刺激因子（ＣＳＦ−ＨＵ）の利用が検討され
ている（日本臨床４５巻２７６９頁（１９８７））。

しかしこれらの因子の作用は主として成熟顆粒球や単球
への分化であり、骨髄移植時に重要な血液学的免疫学的
再構築を促進する、根本的な幹細胞を複製させる骨髄移
植療法支持剤は未だない。

〔発明が解決しようとする！！ｌ！題〕そこで本発明の
目的は従来にない、幹細胞を複製させる作用を持ち、こ
れにより白血病等への骨髄移植療法時の合併症を防止す
る骨髄移植療法支持剤の提供である。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明者等は上記課題を解決する為に鋭意研究を重ねた
結果、ヒ１−ＢＣ叶を有効成分とする骨髄移植療法支持
剤が、■幹細胞を複製する事、■骨髄移植時の血液学的
再構築を促進し、少数の移植細胞でも再構築しうる事、
■骨髄移植時の生存率を高める事を見い出し本発明を完
成した。

すなわち、本発明はヒトＢＣＤＦを有効成分とする骨髄
移植療法支持剤である。

本発明に係るヒトＢＣ叶は例えば特開昭６３−４２６８
８．６３−５６２９１及び特願昭６２−２８９００７号
公報に示されるような、下記のアミノ酸配列（１）又は
（ＩＩ）を有する。

アミノ酸配列（Ｉ）： Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｐ　Ｓｃｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＶａｌＡｌａ　Ａｌａ
　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　Ｓｃｒ　５ｅｒＧｌｕ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ａｓ
ｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｉｌｃ
　Ｌｅｕ八ｓへ　　Ｇｌｙ　　ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　Ａ
ｌａ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔ
ｈｒ　　ＣｙｓＡｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｍｅ
ｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｃｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ
Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ａ１．ｌｌ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ
　　Ａ３１）　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ
ｏ　　ＬｙｓＭｅｔ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　
　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｎ　
　Ｓａｒ　　ＧｌｙＰｈｃ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　
Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　ｆｌｅ　ｌ
１ｅＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ
　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＴｙｒ　　
Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｃ　　
Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｓｃｒ　　Ｇｌｕ　　ＧｌｕＧｉ
ｎ　　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｇｉ
ｎ　　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｖａ
ｌＬｃｕ　Ｉｌｃ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　
Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＬｅｕ　Ａｓ
ｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ
　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＡｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｃｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｃｕ　Ｇｌｎ　Ａｌ
ａ　ＧｌｎＡｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　
Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　１ｌｉｓＬｃｕＩＩ
ｅＬｃｕ　Ａｒｇ　Ｓｃｒ　Ｐｈｃ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　
Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　５ｅｒＳｅｒ　Ｌｃｕ　Ａｒ
ｇＡｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ又は アミノ配列（■）： Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　
Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　
ＡｓｐＶａｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒ
ｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　５ｅｒＳｅｒ　
Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｉ
ｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　ｌ１ｅＬｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ
　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｃｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　
Ｇｌｕ　ＴｈｒＣｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｎ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ
Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｃｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａ
ｓｎ　Ｌｃｕ　Ａｓｎ　Ｌｃｕ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇ
ｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　ＧＩｎ　５ｃｒＧｌｙ　Ｐｈｃ
　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｃｕ　
Ｖａｔ　　Ｌｙｓ　　ｌ１ｅ１）ｃ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　
Ｌｃｕ　Ｌｃｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｃ　Ｖａｔ　Ｔ
ｙｒ　ＬｃｕＧｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｃｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ
　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓｃｒ　Ｓｃｒ　ＧｌｕＧ
ｌｕ　　Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ｖ
ａｔ　　Ｇｌｎ　　Ｍｅｔ　　Ｓｃｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌ
ｙｓＶａｔ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｃ　Ｇｉｎ　　Ｐｈｅ　
　Ｌｃｕ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　
　ＬｙｓＡｓｎ　Ｌｃｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　　ｌｉｅ　
Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＴｈ
ｒ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　　ＡｌａＧ
ｉｎ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｎ　　Ｔｒｐ　　Ｌｅｕ　　Ｇ
ｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｈ
ｉｓＬｃｕ　　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｃｕ　Ｇ１ｎ５ｃｒ　
Ｓｃｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇ
ｉｎ　ＭｅＬアミノ酸配列配列）は天然型ヒトＢＣＤＰ
であり、アミノ酸配列（ＩＩ）は天然型ヒトＢＣ叶のＮ
末端にＡｌａが１つ付加されたポリペプチド（以下ヒト
Ａｌａ−ＢＣ叶と記す）である。しかし、本発明で用い
るヒト　ＢＣＤＦは必ずしも上記アミノ酸配列（１）又
は（ＩＩ）で示される構造をとる必要はない。

即ち、天然型ヒトＢＣ叶のＮ末端及び／又はＣ末端より
１個もしくは複数個のアミノ酸が付加された構造を有す
るもの、天然型ヒｌ−ＢＣＤＦの構造中の１個もしくは
複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された構造を有
するものも、ヒト　ＢＣＤＦ活性を有する限り本発明の
ヒトＢＣ叶として用いることができる。好ましくは天然
型ヒトＢＣＤＦ又はヒトＡｌａ−ＢＣＤＦを用いるのが
よい。本発明に係るヒトＢＣＤＦの含量は該骨髄移植療
法支持剤中０．０００１〜１００重量％、好ましくは０
．１〜１．０重量％である。

また本発明のヒトＢＣ叶を有効成分とする骨髄移植療法
支持剤には血清アルブミン等の安定化剤、マンニトール
等の賦形剤を含有させてもよい。

更に本発明の骨髄移植療法支持剤にはヒト　ＢＣＤＦ以
外に、助剤としてヒトＢＣＤＦ以外のサイト力イン、例
えば、ヒトＩＬ、３、マウスＩＬ、３、ヒトＩＬ−１、
ヒトこのような助剤を含有させると、骨髄移植療法支持
剤としての効果は相乗的に増加する。すなわち−ｆＬ−
１，−ＩＬ−３、込伽顯勃ミヒトＩＬ−４、←ＩＬ、５
、Ｇ−ＣＳＦＸＧＭ−ＣＳＦ、　Ｍ−Ｃ３Ｆは造血機能
の九進を増強するからである。これらの助剤の添加量は
特に限定しないが、ヒトＢＣ叶をｌＯＯとした場合にそ
れぞれ０．０００１〜２０００００重量％添加すればよ
い。

くり返し述べるが、これら助剤の添加量は決して上述の
値に限定されるものでなく、症状、患者の年令等により
適宜決定すればよい。

尚、ヒトＩＬ、３、等の助剤は必ずしもヒトＢＧ叶と同
時に同じ薬剤として投与しなくともよい。即ち、ヒト　
ＢＣＤＦを有効成分とする骨髄移植療法支持剤の投与前
又は後の適当な時期にこれらの助剤を投与してもかまわ
ない。

もちろん、本発明の骨髄移植療法支持剤は他の化学療法
剤（制癌剤、抗ウィルス剤、抗生物質等）と併用しても
かまわない。本骨髄移植療法支持剤は静脈内注射で用い
てもよいし、筋肉内注射・皮下注射で用いても良い。即
ち、いずれの方法を用いて投与してもかまわない。

また骨髄移植と同時に投与しても、骨髄移植後に投与し
てもかまわない。

さらに、骨髄移植前に患者あるいは供与者からとり出し
た骨髄細胞あるいは末梢血細胞に添加しておいてもかま
、わない。

すなわち本発明の骨髄移植療法支持剤は生体外において
も幹細胞を培養し増殖させる事ができるので、生体外で
培養した後に患者に戻すことも可能である。この時、細
胞はヒト骨髄液あるいは末梢血を通常の方法で得れば良
い。細胞は例えばＢｌｏｏｄ、　６９　、　９５３　（
１９８７）に示された方法で、密度匂配法を用いて単核
球とし、さらに付着細胞を除去したものでも良く、抗体
などを使ってさらに幹細胞を精製しても良く、また培養
前に４−１）ｃ。

ＶＰ４６のような抗癌剤等の薬剤処理した細胞でも良い
。さらにこの幹細胞に人為的な変異が加えられたもので
も良い。すなわち幹細胞を含むものであればどのような
ものでもかまわない。培養時の培地はＲＰＭＩ　１６４
０．イスコツ変法ＭＥＭなどいずれを用いても良い。ま
た１０〜２０％の牛胎児血清の添加が望ましいが、ウマ
血清・ヒト血清などでも代替でき、何も添加しなくても
良い。必要により、ハイドロコーチシン、２−メルカプ
トエタノール。

抗生物質等を添加してもよい。

初発細胞密度は用いる細胞中の幹細胞比率等により適宜
決定すれば良い。培養条件は通常の細胞培養の時に用い
られる３３〜３７℃、５〜７．５％ｃｏｚ、　５〜２０
％Ｏｔの条件が好ましいが、必ずしも限定されない。

以上述べてきたことからもわかるように、骨髄移植療法
支持剤を添加する以外は通常の細胞培養の方法に従えば
良い。

移植前添加日数は何日でも良いが好ましくは１〜１）日
、より好ましくは６〜８日である。

さらに途中で新しい培地にて細胞を希釈し、骨髄移植療
法支持剤を再添加する、いわゆる継代操作を行なえば何
日でも培養でき、幹細胞数をさらに増やす事も可能であ
る。

継代間隔は何日でも良いが、通常６〜８日が望ましい。

このように本発明のヒトＢＣ叶を含有する骨髄移極めて
有用な薬剤である。

これまで生体外で幹細胞を維持する方法としてストロマ
細胞と共存培養する方法（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　　９↓、　　３３５　（１９７７
））やＩＬ−３を添加する方法（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎ
ｖｅｓｔ、、ユ６．１６１３（１９８５））が知られて
いるが、幹細胞数を複製増殖させる方法は本発明以前に
はない。

本発明を用いれば、供与者の負荷が大きい。骨髄液採取
の量を減少させ得るのみならず、多数の幹細胞を移植す
る事で、移植後の血液学再構築を早め患者の感染症によ
る死亡を防止する事ができる。

また従来ＧＶＨＤを発症しないという利点があるものの
事前採取した骨髄細胞の凍結保存、幹細胞数の不足、癌
細胞の混入等が問題点となっていた自家骨髄移植法に本
発明を適用すれば、上記問題点が解消される。

さて、本発明に用いるヒトＢＣ叶はヒトＴ細胞、Ｂ細胞
、線維芽細胞等より既知の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２．５４９０（１９８
５）により生産、精製したものでも大腸菌、酵母、サル
細胞（ＣＯＳ細胞）、ハムスター、細菌など適当な宿主
にヒトＢＣＤＦをコードする遺伝子を適当なベクターを
用いて形質転換された株を培養することにより生産、更
には精製したヒトＢＣＤＦを用いてもよい。

なお、これらの製造法の詳細については特開昭６１−１
）５０２４、特開昭６３−４２６８８、特開昭６３−５
６２９１号公報及び特開昭６３−１５７９９６を参考に
されたい。

〔効　果〕

本発明のヒトＢＣＤＦを有効成分として含有する骨髄移
植療法支持剤は根本的に免疫的・血液的再構築を促進す
る作用より、骨髄移植療法にともなう感染症等合併症の
治療予防に有効である。また正常供与者より採取する移
植細胞数を少くできるという利点もある。更に、骨髄移
植前に取り出した骨髄細胞に本発明に係る薬剤を添加し
て移植細胞中の幹細胞を複製させた後に移植することも
可能である。

〔実施例１．ヒトＢＣ叶の製剤化〕 ヒトＢＣＤＦまたはヒトＡｌａ−ＢＣ叶の）ＩＰＬｃ画
分を一２０℃にて一夜放置し、上層のアセトニトリルを
除去した。下層を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ、２５によるゲ
ル濾過または透析により、残留するアセトニトリル及び
ＴＦＡを除去し、ＰＢＳ溶液に置換した。これを希釈し
、必要に応じてヒト、場合により他の哺乳動物の血清ア
ルブミン（０，１％）又は血清（２〜１０％）を加えた
後無菌濾過しヒト　ＢＣＤＦ製剤及びヒトＡｌａ−ＢＣ
叶製剤とした。

〔実施例２．ヒト　ＢＣＤＦＣＤ外添加による造血細胞
・造血前駆細胞及び幹細胞の複製〕 ＤＢＡ／　２マウス非行着性骨髄細胞を２．５Ｘ１０Ｓ
個／Ｉｌｌ／ウェルに調整しｌＯ％牛脂児血清含有ＲＰ
ＭＩ　１６４０培地にヒトＢＣＤＰ　（１００ｎｇ／ｎ
ｌ）及び／又はマウスＩＬ−３（２００単位／ｒａｇ）
を添加し６日培養した。

６日後に培養細胞を回収し、造血細胞数を計数した。ま
たこのようにして得た生細胞ｌＸｌ０’個あたりの造血
前駆細胞数を、造血幹細胞実験法Ｐ、４０、中外医学社
（１９８６）の方法に従い、０．８％メチルセルロース
中で細胞を１０％のポ；クウィードマイトゲン刺激肺臓
細胞上清と７日間培養し、形成される細胞塊の数で測定
した。実験は３枚のシャーレで行ない、平均値と標準偏
差を求めた。

また２Ｘ１０’個あたりの幹細胞数をＴｉ１ｌらの方法
（Ｒａｄｉａｔ、Ｒｅｓ、　１４巻２１３真（１９６１
年））に従いマウス肺臓コロニー形成数を指標に測定し
た。

その結果は第１表に示した。第１表に示すように、コン
トロールに比べてヒＩ−ＢＣＤＦ又はマウスＩＬ−３存
在下で培養した骨髄細胞では有意に造血細胞数・造血前
駆細胞数及び幹細胞数は増加していた。また、ヒトＢＣ
叶とマウスＩＬ３を組み合わせて培養した場合は、相乗
的に造血細胞数・造血前駆細胞数および幹細胞数が増加
した。同様の結果は癌化学療法剤５−フルオロウラシル
１５０■ハｇ投与後１日目のマウス骨髄細胞を用いても
得られた。

また、培養日数を３〜１）日まで変えた結果、幹細胞数
等は６〜８日で最大に達した。

またヒトＢＣＤＦの濃度を１〜１）０００ｎ／ｍ　１　
、マウスヒトＢＣＤＦ　１００．ｎｇ／ｍ　１以上、マ
ウスＩｔ、３２００単位／ｍｊ！で最大の効果が得られ
た。

以上、ヒトＢＣ叶は単独又はマウスＩＬ−３とともに骨
髄細胞移植前に添加することにより、幹細胞数等を増加
させることが明らかになった。

〔実施例３．ヒト　ＢＣＤＦＣＤ外添加培養細胞の移植
による延命効果〕 ＤＢＡ／　２マウス９匹（雌性、１２週令）にＸ線９０
０　ｒａｄ（５０Ｒ／ｓ＋ｉｎ、）を全身照射した。

実施例２においてヒト　ＢＣＤＰ及びマウスＩＬ−３存
在下で培養した骨髄細胞（初発細胞数２Ｘ１０’）を洗
浄後１％マウス血清を含むＰＢＳ５００μｌに懸濁し、
全身照射後６時間以内に尾静脈注射により移植した。対
照群として常法により調整した同系マウス非付着性骨髄
細胞２Ｘ１０’個を移植した。

３０日後の生存率を第２表に示した。ヒトＢＣＤＦ及び
マウスＩＬ−３を用いて培養した骨髄細胞の移植は常法
に比し、移植後生存率を有意に上昇させた。

移植細胞　　　　　３０日生存率 〔実施例４．ヒトＢＣ叶生体内投与による造血細胞及び
幹細胞数の増加〕 ヒトＢＣＤＰ７０μｇ（１０μｇ／匹×７日間）をアル
ザ社製浸透圧ポンプに充填し、ＤＢＡ／　２マウス（雌
性８週令）５匹の皮下に埋め込み連続投与した。

７日後にマウスより末梢血を心採血し、肺臓を摘出した
。

まず、末梢血における血液細胞数、肺臓における造血細
胞数を以下の方法で測定した。すなわち血液については
造血機能の指標となる白血球数を自動血球数測定機（東
亜医用電子社）で測定した。

肺臓よりは常法に従い肺臓造血細胞を調整し、ヘモサイ
トメーターで計数した。また肺臓の重量も測定した。

次に、前記の方法で得た肺臓細胞中の幹細胞及び造血前
駆細胞の総数を実施例２で示した肺臓コロニー形成法及
びメチルセルロース法にて測定した。

第３表に示すように、浸透圧ポンプを用いたヒトＢＣ叶
の連続投与により、末梢血白血球数、肺臓における造血
細胞数は増加した。また、ヒトＢＣＤＰ非投与群に比し
、ヒトＢＣ叶投与群では幹細胞の総数が著しく増加した
。骨髄においても同様の結果が得られた。

〔実施例５．ヒトＢＣ叶生体内投与による骨髄移植マウ
スの造血ａ能の回復〕 ＤＢ八へ２マウス５匹（雌性・８週令）にＸ線７５０ｒ
ａｄ　（５０Ｒ／ｗｉｎ、）を全身照射した。移植細胞
トしては、常法により調整した同系マウス骨髄細胞を所
定の細胞密度（５Ｘ１０’、２Ｘ１０’、ｌＸ１０”個
）になるよう１％マウス血清を含むＰＢＳに懸濁し、全
身照射６時間以内に懸濁液５００μｌを尾静脈注射によ
り移植した。移植当日より９日間、所定濃度（各０．１
μｇ）匹、１．０μｇ／匹、１０８８７匹）のヒトＢＣ
叶を１％マウス血清を含むＰＳＢに懸濁し、１００１）
１ずつ皮下注射した。移植後２日目、４日目及び９日目
にマウスより末梢血を心採血した。また生体においての
造血器官である肺臓・大腿骨の摘出を行なった。

造血機能とは、幹細胞が分化して造血前駆細胞になり、
それが更に分化して造血細胞、血液細胞となる過程であ
る。

まず、末梢血における血液細胞数、肺臓及び骨髄におけ
る造血細胞数を以下の方法で測定した。

すなわち血液については造血機能の指標となる白血球数
を自動血球数測定機（東亜医用電子社）で測定した。白
血球の分類は常法により塗抹標本を作成し、ライトギム
ザ染色後顕微鏡下で計数した。肺臓・大腿骨よりは常法
に従い肺臓造血細胞・骨髄造血細胞を調整し、ヘモサイ
トメーターで計数した。また肺臓の重量も測定した。

その結果、造血機能が回復にむかう９日目において、ヒ
トＢＣ叶の投与量が１．０μｇ／匹、及び１０μｇ／匹
の時、対照群に比較して有意に白血球数の回復が促進さ
れた。代表的な１０μｇ７匹投与・９日目の血液の結果
を第４表に示した。また一般に骨髄移植後の造血細胞数
の回復は移植細胞数にも依存するが、第５表に示すよう
にヒｌ−ＢＣＤＦを投与する事により４〜５倍の細胞数
を移植するのと同等の肺臓造血細胞数・骨髄造血細胞数
の回復が得られた。

次に、前記の方法で得た肺臓細胞及び骨髄細胞中の幹細
胞及び造血前駆細胞の総数を実施例２で示した肺臓コロ
ニー形成法及びメチルセルロース法にて測定した。

ヒトＢＣ叶非投与群に比しヒトＢＣ叶投与群では幹細胞
及び造血前駆細胞の総数は著しく回復した。

例えば２Ｘ１０’個の骨髄細胞移植後９日目の大腿骨骨
髄中の幹細胞数は非投与群６０以下に対し投与群１）０
０　（正常値１５００）　、造血前駆細胞数は非投与群
１４００に対し投与群５０００　（正常値１９０００）
に回復した。同様の回復は肺臓でも認められ、幹細胞数
は非投与群６８０に対し投与群５１００　（正常値４２
００）　、造血前駆細胞数は非投与群２５０００に対し
投与群６１２００（正常値４００００）に回復した。

以上、ヒト　ＢＣＤＦを骨髄移植後に投与する事により
、移植マウスの血液学的再構築は促進される事が明らか
になった。

〔実施例６．ヒトＢＣＤＰによる骨髄移植マウスの移植
後生存率の上昇〕 実施例５の方法でＸ線照射マウス８退動８ないし１０匹
に骨髄移植し、２１日後の生存率を第６表に示した。ヒ
ｌ−ＢＣＤＦを９日間・１０μｇ１日投与する事により
生存率は上昇し、特に移植細胞数の少ない群では顕著な
効果が認められた。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＢ細胞分化因子（以下ヒトＢＣＤＦと記す）
   を有効成分とする骨髄移植療法支持剤。
2. （２）ヒトＢＣＤＦが下記のアミノ酸配列（ I ）を有
   するものである請求項（１）記載の骨髄移植療法支持剤
   。 ￥アミノ酸配列（ I ）：￥ 【アミノ酸配列があります】
3. （３）ヒトＢＣＤＦが下記のアミノ酸配列（II）を有す
   るものである請求項（１）記載の骨髄移植療法支持剤。 ￥アミノ酸配列（II）：￥ 【アミノ酸配列があります】
4. （４）骨髄移植療法支持剤がヒトＢＣＤＦ以外に助剤と
   してインターロイキン３（以下ＩＬ−３と記す）、イン
   ターロイキン１（以下ＩＬ−１と記す）、インターロイ
   キン４（以下ＩＬ−４と記す）、インターロイキン５（
   以下ＩＬ−５と記す）、顆粒球コロニー刺激因子（以下
   Ｇ−ＣＳＦと記す）、顆粒球・マクロファージコロニー
   刺激因子（以下ＧＭ−ＣＳＦと記す）及びマクロファー
   ジコロニー刺激因子（以下、Ｍ−ＣＳＦと記す）を１種
   類以上含有することを特徴とする請求項（１）記載の骨
   髄移植療法支持剤。
5. （５）請求項（１）乃至（４）記載の骨髄移植療法支持
   剤を用いて造血幹細胞を生体外で増殖させることを特徴
   とする造血幹細胞の増殖方法。