JPS6356291A

JPS6356291A - リコンビナントｂｃｄｆ

Info

Publication number: JPS6356291A
Application number: JP61200433A
Authority: JP
Inventors: Chuzo Kishimoto; 忠三岸本; Toshio Hirano; 俊夫平野; Yutaka Matsui; 裕松井; Yoshiyuki Takahara; 義之高原
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1986-08-27
Filing date: 1986-08-27
Publication date: 1988-03-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は人について活性を存するＢ細胞分化因子（以
下ｒ　ＢＣＤＦ　Ｊと記す）ならびに同因子のポリペプ
チドに対応する遺伝子ならびにクローン化遺伝子を用い
る同ＢＣＤＦの製造法に関する。ヒトＢＣＤＦは本発明
により物質としての存在が初めて発明され、免疫不全に
よる疾患等に汎く治療薬として利用しうる有用な物質で
ある。

〔従来の技術〕

抗原刺激を受は活性化された成７Ｊ）　Ｂ細胞は、Ｔ細
胞の助けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産
生細胞にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以
上のＴ細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが
知られている。この物質の存在はＲｏＷ、Ｄｕｔｔｏｎ
ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｒｅｖ、　２３　６６（
１９７５）　、　Ａ、Ｓｃｈｉｍｐｌ　　とＥ、　Ｗｅ
ｃｋｅｒら、ＮａｔｕｒｅＮ、　Ｂｉｏｌ、２３７．１
５　（１９７２）　、により明らかにされた。彼らはマ
ウスのリンパ球混合物培養後の培養上清中または抗原や
マイトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球培養上
清が、マウスのＴ細胞を除去されたリンパ球細胞集団や
ヌードマウス由来のリンパ球のヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ
）に対する１次免疫応答を増幅させることを見出し、そ
のような作用を有する活性本体にＴリンパ球代替因子、
すなわちＴＲＦという呼称を与えた。それ以来ＴＲＦは
、抗原非特異的に主要組織適合遺伝子複合体（以下、Ｍ
ＨＣと略称する。）の一致を必要としない様式でＢ細胞
に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞の抗体
産生細胞への分化を誘導する液止因子であると定義され
ている。

その後、このようなり細胞分化因子の存在を示す機能上
の証拠が蓄積されており、人においてもマウス同様の分
化因子の存在が示唆されている。

現在では上述のように定義されたＢ細胞を抗体産生細胞
へ分化させる因子をＢＣＤＦと総称するようになった。

このようにＢＣＤＦは人の体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ
抗体を作り、ＢＣＤＰと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦ
のイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に用
いることが出来ると共に、自己免疫疾患において散見さ
れるＢ細胞機能異常の修復にも用いうる。第２の応用は
各種疾患の治療への応用である。

例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にともなうＢ細胞抗
体産生能低下による免疫不全症患者にＢＣＤＦ単独また
は他のリンホカインや免疫療法剤と共に投与することに
より抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。

さらにＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。

Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）　（Ｋ、　Ｙｏｓｈｉｚａ
ｋｉら、Ｊ、ｏｆＩｍｎ＋ｕｎｏ１．１３０．　１２４
１　　（１９８３））、その他のリンホカインを含むＴ
細胞因子を培地に加えることにより正常Ｂ細胞を長期培
養できることが報告されている（　Ｂ、　５ｒｅｄｎｉ
ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、。

１５４．１５００　（１９８１）参照）。これらの培養
正常Ｂ細胞あるいはＥＢウィルスで形質転換したＢ細胞
に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用させることにより
生体外で抗体を産生させることが出来る。特定の抗体、
例えば、病原細菌、病原ウィルス、病原原虫、癌細胞な
どの表面にある特定抗原を認識する抗体を産生ずるＢ細
胞をモノクローン化し、クローン化正常Ｂ細胞またはＥ
Ｂウィルスで形質転換した細胞をＢＣＤＦとその他のリ
ンホカインを組み合せて培養し、有用なモノクローナル
抗体を産生させることが出来る。これら抗体は感染症や
癌の治療および診断に利用できる。

従来ＢＣＤＦを得るには、人末梢血などより分離した正
常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激することによりＢＣＤＦを
産生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細胞
を十分骨ることが困難である点、マイトゲンを用いたた
め、ＢＣＤＦに有害なマイトゲンが混入し、これを除去
するのが困難である点、またＴ細胞培養にはウシ胎児血
清など血清成分を培地に添加する必要があり、これら添
加タンパク質とＢＣＤＦを十分分離することが出来ず、
ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得られぬ
ことが障害となっている点など問題が多く、工業的にＢ
ＣＤＦを産生ずることは出来なかった。また人Ｔ細胞を
人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を得、これにより
ＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている（　０ｋ
ａｄａ　ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　　１５７．
　５８３（１９８３））。しかし、人融合細胞は継代中
、リンホカイン産生能が低下してゆくことが多（、実用
的ＢＣＤＦ産生人融合細胞は未だない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明の目的は、ヒトＢＣＤＦおよびその製造方
法、それをコードするＤＮＡを提供することにある。ヒ
トＢＣＤＰをコードするＤＮＡはヒトＢＣＤＦを真核生
物、原核生物の細胞等により大量に生産する際に必要不
可欠で有用なものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、人Ｔ細胞白血球ウィルス（以下ｒＨＴＬ
ＶＪと記す）により形質転換された人Ｔ細胞が高い効率
でＢＣＤＦを生産することをすでに見い出し、Ｂ細胞分
化因子活性が５Ｘ１０’単位／ＩＩ＋１以上である蛋白
標品を得た。

人ＢＣｔｌＦ産生人Ｔ細胞株の作製は以下のように行な
うことが出来る。人の末梢血・扁桃・膝帯血などよりフ
ィルコールバックなどを用いた密度勾配遠心法等でリン
パ球を分離し、Ｎ、　Ｙａｍａｍｏｔｏ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２１７，７３７　（１９８２）の方法
に準じてＨＴ　Ｌ　Ｖを用いて人Ｔ細胞を形質転換（ト
ランスフォーメーシジン）する。たとえば下記の方法を
用いることができる。ウィルス産生細胞株ＭＴ−２をＸ
ｖＡ照射（１２０００〜１４０００−ｙ　Ｆ）　テ不活
化した細胞Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｑ’　／ｒａｌと、上述のよう
にして得た人リンパ球Ｉ　Ｘ　１０’　／ｍｌを２０％
ＦＣ３，１００μｇ／ｌｓｌカナマイシン、２μｇ／Ｉ
ＩＩＩＮａＨＣＯ，，２５ｍＭ　Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘ
ｙｅｔｈｙｌ　　ｐｉｐｅｒａ−ｚｉｎｅ　−Ｎ　’　
−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥ
ＰＥＳ）を含むＲＰＭ１１６４０培地を入れたプラスチ
ックシャーレ（ファルコン＃３００３）に接種し５％Ｃ
Ｏ□存在下３７℃で培養する。１週間に２回、半分の培
地を新鮮な培地と交換しつつ２〜３力月培養した後、グ
ミティングダイリューション法により株化する。株化し
た細胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定し、ＢＣＤＦ活
性を存する株を得る。

できる。ＶＴ−１を増殖させるための特別な条件はなく
、一般に用いられている培養条件を適宜採用して行なえ
ばよい。また、ＢＣＤＦの産生も一般的な方法で行なえ
ばよいが、好ましくはタンパク質を含まない培地を用い
て行なうべきである。

ＶＴ−１の細胞数を増やすのに最適な培地として、例え
ば１〜３０％、好ましくは２０％のＦＣＳを添加した培
地を用いる。ＢＣＤＦ産生のための最適な培地としては
、ＦＣＳを添加しない上述の培地でよい、ＦＣＳを添加
しない完全合成培地中で４８時間培養後もＶＴ−１の生
存率は７０％以上が保持されている。

Ｔ細胞よりＢＣＤＦを生産する場合、従来は培地にＦＣ
Ｓのようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった（Ｔ。

Ｔｅｒａｎｉｓｈｉ　　ら、Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　１２８．　１０９３（１９８２）　、　Ａ、　Ｍ
ｕｒａｇｕｃｈｉら、Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１２７．４１２　（１９８１）参照）。これに対してＶ
Ｔ−１を使用してＢＣＤＦを生産する場合、培地にＦＣ
Ｓのような血清、血液中のタンパク質成分、その他タン
パク質成分を加える必要がなく、また通常用いられてい
るＴ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲンも加える必要
がないことは特筆に値する。そのため高価なＦＣＳを用
いないで安価にＢＣＤＦを生産することが出来るばかり
でなく、人体に有害な異種タンパク質やマイトゲンを含
まない安全なりＣ叶を容易に得ることが出来る。

ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを生産する上記方法は種々の
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくは　ＶＴ−
１培養物は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜１
０％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきであ
る。また、理想的には、培地のｐ旧よ約７．０〜７．４
と僅かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。ＶＴ
−１は平底ミクロプレートなど種々のタイプの培養器に
ＬＯＯｔｔ１４に位などの種々の容量で接種される。フ
アシヨン・ラブウェア・ディヴイジョン、ベクトン・デ
ィソキンソン・エンド・コーポレーション（Ｆａｌｃｏ
ｎＬａｂｗａｒｅ、Ｄｉｖ、　Ｂｅｃｔｏｎ＋Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、）から市販されているフラ
スコＩｋ３０１３または３０２４のような組織培養フラ
スコも使用できる。別法として上記フアシヨン・ラブウ
ェアから市販されているボトルＮ１３０２７のような５
回転びんち培養容器として使用できる。

ＶＴ−１を培養して細胞数を増やすための最適条件とし
て、細胞の当初密度は培地１＃１１あたりｌＸｌ０’細
胞ないし５Ｘ１０’細胞、好ましくは２Ｘ１０’細胞で
ある。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７
日で培地ｉｎ＋４２当り５×ｌＯＳ細胞から２Ｘｂ度が増加するので、再び新しい培地を加えて培地１ｍ１
当りｌＸｌ０’　〜５ＸＩＯ’細胞にまで細胞密度を下
げ、再び培養を続ける。このようにして目的とする細胞
数になるまでＶＴ−１の培養を続けた後、細胞を遠心分
離等で分離する。細胞をタンパク質を含まぬ完全合成培
地で洗ってから新しい完全合成培地に接種する。この時
の細胞の当初密度は培地１ｍｌあたり約ｌＸｌ０’細胞
ないしＩ　Ｘ　１０’細胞であることが好ましく、理想
的には培地１ｍｊ２あたり１×１０ｈ細胞である。

ＶＴ−１を培養することによって生産されるＢＣＤＰＩ
は経時的に変化する。例えば１ｍｊ２当り１ｘｉｏｂ初
発細胞密度でＶＴ−１をＲＰ旧１６４０培地（１＋Ｊ当
りペニシリン１００単位、ストレプトマイシン１００μ
ｇ１ゲンタマイシンｌＯμｇおよびＮａＨＣＯ３１６ｍ
　Ｍを含む）で培養すると、ＢＣＯＦ活性は４８時間後
にピークレベルに達する。

さらに、次の２４時間に存在する［１ＣＤＦ活性は僅か
に減少する。このようにＲＰＭＩ　１６４０培地中のＶ
Ｔ−１でＢＣＤＦを生産する至適培養時間は約２４〜７
８時間である。

ＢＣＤＦは塩析、真空透析、限外濾過、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、クロマトフオーカシング
、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル電
気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清から濃
縮して精製できる。

次にＢＣＤＦＣＤ側定法であるが以下のような方法があ
る。

人ＢＣＤＦに反応してＩｇＭを産生ずる人Ｂ細胞株ＣＬ
４（Ｔ、旧ｒａｎｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ
、　Ｓｃｉ、。

工２．５４９０゜１９８５）を用いてＢＣＤＦ活性を測
定する。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と６Ｘ１０”個の
Ｃｌ３を２００μ！のｌＯ％ＦＣ，Ｓを含むＲＰＭＩ１
６４０培地（１＋＋＋ｊ２当りペニシリン１００単位、
ストレプトマイシン１００μｇ、ゲンタマイシン１０／
ｊｇおよびＮａＨＣＯｓ　ｌ　６　ｍ　Ｍを含む）に入
れる。

この混合物を９６穴マイクロプレート中で３日間、５％
　ＣＯ□存在下、３７℃で培養し、培養上清のＩｇＭ＠
を酵素免疫測定法により、測定する。この条件において
最大のＩｇＭ生産ｆｆｉ　（ｉ高のＣｌ３の反応）の５
０％を示すＢＣＤＦの活性をＩＵ／ｍｊ＋とした。

また人ＢＣＤＦに反応してＩｇＭを産生ずる人Ｂ細胞株
ＣＬ　４　　（０，５ＡＩＫＩ　　ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、
　Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌ　　１３＋３１　　（１９８３））
を用いたリバースＰＦＣ法でもＢＣＯＦ活性を測定しう
る。ＢＣＯＦ活性を測定する検液とｌＸｌ０’個のＣｌ
３を２００μｌの１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４
０培地（添加物は前記と同じ）に入れる。この混合物を
９６穴マイクロプレート中で３日間、５％Ｃ（ｈ存在下
、３７℃で培養する。培養細胞・補体・抗ヒトＩｇＭ抗
体プロティンＡ結合緬羊保存血をＨＡＮＫＳ液に溶解し
たアガロースに混合して、シ中−し上に拡げ固め、３７
℃。

５％ＣＯ□存在下−晩培養した後の溶血環数をもってＢ
ＣＤＦの作用にて人１ｇＭ産生細胞に分化した細胞数を
測定する。

ヒト　ＢＣＤＦをコードする遺伝子を同定・採取するた
めには、前述のＢＣＤＦＣＤ型適条件で培養されたＶＴ
−１細胞よりＲＮＡを抽出、採取し、ｃＤＮＡライブラ
リーを作成し、同ライブラリーよりＢＣＤＦをコードす
るｃＤＮＡをクローニングする。このために本発明者ら
は実施例に示すようにＶＴ−１細胞の産生ずるヒト　Ｂ
ＣＤＦを完全に精製し、そのＮ末のアミノ酸部分配列お
よび同Ｂ（：ＤＦをリシルエンドペプチダーゼを作用さ
せて限定分解し、得られるフラグメントペプチドのアミ
ノ酸配列を決定し、各々のペプチドに対応するオリゴヌ
クレオチドを合成し、本合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを用いて上述のｃＤＮ＾ライブラリーより複数の合成
プローブと相補的にハイブリダイズするクローンを採取
することによりＢＣＤＦ　ｃＤＮＡを同定した。ここで
得られたｃＤＮＡの塩基配列を常法により決定し、ＢＣ
ＤＦをコードする遺伝子の本体を物質的に確定し、本遺
伝子配列よりヒト　ＢＣＤＦが１８４個のアミノ酸より
構成されるポリペプチドであることを見出した。と同時
にここに得られたｃＤＮＡを真核生物の細胞で発現すべ
く発現ベクターに連結したのちに、同細胞に遺伝子導入
し、本細胞の培養により、上清にＢＣＤＦを生産させ、
精製操作により純化ヒトＢＣＤＦを同定・採取し、ＩＩ
ＣＤＰの遺伝子構造に対応するりコンビナンドヒトＢＣ
ＤＦを製造し、かつ零ＢＣＤＦがＶＴ−１細胞や他のヒ
ト細胞より得られるヒトＢＣＤＦと同じ理化学的、生物
学的性状を存することを明らかにした。このことより同
定された遺伝子が確かにヒトＢＣＤＦ蛋白をコードする
ものであることが最終的に立証された。

一方ヒトＢＣＤＦは原核生物においても製造できる。

すなわちヒト　ＢＣＤＦをコードする遺伝子を発現可能
なようにベクターＤＮＡに導入して得られた組み換え体
ＤＮＡを原核生物宿主に導入し、得られた形質転換微生
物を培養すればよい。

ＢＣＤＦをコードする遺伝子はアミノ酸配列（Ｉ）。

（ＩＩ）もしくはその部分構造に対応する塩基配列を少
くも有するものである。組み換え体ＤＮＡが導入される
原核生物宿主細胞はエッシェリヒア・コリ、バチルス・
ズブチリス、その他の微生物があり、現在の遺伝子工学
的生産の分野において当該業者の容易になしうるところ
のものである。

形質転換された微生物（原核生物）を培養する培地およ
び培養方法は通常の培地、方法でよい。

形質転換された微生物細胞中にヒトＤＣＤＦが蓄積され
ている場合には、ＢＣＤＦは、当該分野の業者の容易に
なしうる方法で回収、精製する。簡単に記すと以下の通
りである。培養後、遠心で菌体を集め、リゾチームを含
む溶液や他のｄｅｔｅｒｇｅｎｔを含む液に細胞を懸濁
し、反応後、凍結・融解を繰り返し、細胞抽出液を採取
し、以下前述の精製法及び／又は抗ＢＣＤＦ抗体固定化
カラムを用いるアフィニｌティクロマトグラフィーで簡便に精製する。

実施例１゛２１容プラスチツクローラー培養器（ファルコン＃３０
２７）　　（以下ローラーと称する）中の１１の２０％
ＦＣ３含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグルタミン、
５　Ｘ　１０−’Ｍ　　２ＭＥ、　１００ｊｉＬ位／　
ｍｌｌユニリン、１００μｇ／ｍｌｌストレプトマイシ
ン、２０μｇ／ｌａｌゲンタマイシン及び１６ｍＭＮａ
１ｌＣＯ，を含有）に、２×ｌＯ５／ｌｌ１１細胞数に
なるようＶＴ−１を接種し、ローラーを８　ｒｐＨ１で
回転させつつ３日間、３７℃で培養した。培養後、培養
物を遠心分離して細胞を集めＲＰＭ１１６４０培地で２
回細胞を洗った後、細胞を２１容ローラー中１２のＲＰ
Ｍ１１６４０培地に１×１０ｈ／ｌｌ１ｌ細胞濃度にな
るよう懸濁した。ローラーを８　ｒｐｍで回転させつつ
２日間、３７°Ｃで培養する。培養後培養物を遠心分離
して、培養上清を得た。

上述のようにＶＴ−１を培養して得たｎｃｏＦを含む培
養上清より、ＢＣＤＦを以下の方法で精製した。

無細胞上清１０βを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、
アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ、ＵＳ
Ａ）を装着した限外濾過装置くアミコン大量処理用セル
２０００型、アミコン・コーポレーション、マサチュー
セソツ、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４ｋｇ／ｃＪ
の圧力をかけ濾過した。

濾過膜上部に残った１００１Ｉ１１の濃縮液をさらに限
外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装着した限外濾過装
置（アミコン、スタンダードセル５２型）を用い、窒素
ガスにより４ｋｇ／ｃａ！の圧力をかけて濾過した。濾
過膜上部に残った５Ｉ１１１の濃縮液を採取した。

上述の濃縮した上清をＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、　Ｓｗｅｄｅｎ、　２．６　
Ｘ　９０　ｃｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラムは
あらかじめＰＢＳ　（ホスフェート・バフファードセイ
ライン、０、１５　Ｍ食塩を含む０．　ＯＩ　Ｍホスフ
ェート・バッファー、ｐＨ７、ｏ）で平衡化した。濃縮
上清をＰＢＳで溶出し、溶出液を５　ｍｌｌずつ分取し
、分取液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有
する百分は分子ｆｆ１３．５±０．５Ｘ１０’ダルトン
に相当するフラクションに含まれていることがわかった
。ゲル濾過カラムは以下に示すファルマシア・ファイン
ケミカルス（スウェーデン）社製の分子量マーカーで検
定した。即ち、ブルーデキストラン２０００　２×１０
６、フェリチン４．５Ｘ１０’、アルドラーゼ１．５８
Ｘ１０’、オブアルブミン４．５Ｘ１０’、キモトリプ
シノーゲン２．５Ｘ１０’及びチトクロームＣ１，１７
Ｘ１０’。また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、
限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外濾過
装置を用いて２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６
，３）に置換した。

ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフイーで分画されたＢ
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６，３）で平衡化したＭｏｎｏ　Ｐカラム（フ
ァルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）に通
した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液で
洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４０ｍｊ！の１
／１０希釈ポリバツフアー７４　（ファルマシア・ファ
インケミカルス、スウェーデン）で溶出した。カラム操
作はファースト・プロティン・リキッド・クロマトグラ
フィー、ＦＰＬＣ（ファルマシア・ファインケミカルス
、スウェーデン）を用い、流速は毎分０．５ｍ６で行な
った。溶出液を１　ｍｌずつ分取し、ＢＣＤＦ活性とｐ
Ｈを測定した。　ＢＣＤＦ活性はｐＨ４−９〜５．１の
位置に溶出された。

Ｍｏｎｏ　Ｐカラムより得たＢＣＤＦ活性画分を０．１
％ＴＦＡ　（）リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化した逆
相クロマトグラフィー用カラム５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　
ＲＰ−Ｐ　　（Ｃｔｓ）（２５０ｘ　４．１鶴、Ｓｙｎ
ｃｈｒｏｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィーにか
け、溶出液０、１％　ＴＦＡ中のアセトニトリル濃度を
０から６０％まで直線的に増加させＢＣＤＦを溶出した
。

アセトニトリル５０〜５５％で溶出される。０．Ｄ、ｚ
ａ。

のピークは他のＯ，Ｄ、ｚｓ。のピークとは完全に分離
しており、このピークに対応してＢＣＤＦ活性が検出さ
れた。このピークを凍結乾燥してＢＣＤＦ標品を得た。

この標品を逼元条件下で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（１２％ゲル）電気泳動を行なった。

分子ｆｆ１２］０００に相当するゲル区分を切り出し、
エッペンドルフチューブ中０．０５％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、１
０ｍ　ＭＮＩＩ４ＨＣＯ３で３７℃、−晩、振盪し抽出
した。

この溶出液を再び直接逆相クロマトグラフ用カラム５ｙ
ｎｃｈｒｏｐａｋ　ＲＰ−Ｐ　　（Ｃ＋５）（２５０Ｘ
　４、ｌ　ｘｍ、５ｙｎｃｈｒｏａ＋）を用いたＨＰＬ
Ｃにかけ、溶出後０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル濃
度を０から６０％まで直線的に増加させてＢＣＤＦを溶
出した。

アセトニトリル５０〜５５％で溶出される０、Ｄ、ｚｓ
。のピークは他の０．０．ｚｓ。ピークとは完全に分離
しており、このピークに対応してＢＣＤＦ活性が検出さ
れた。このピークを凍結乾燥して精製ＢＣＤＦを得た。

ＢＣＤＦ蛋白のアミノ酸配列を決定するために前述のよ
うにして得られた６μｇの精製ＢＣＤＦをプロティン・
シークエンサー（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
　Ｃｏ、。

Ｃａ１ｆ、Ｍｏｄｅｌ　４７０＾）に導入した。アミノ
酸配列の決定方法はＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　
１９３．２６５〜２７５（１９５１）に記載されている
方法により行なった。

Ｎ末端からのアミノ酸配列は以下のとおりであった。

Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　
Ｇｌｕ＾ｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｖａ
ｌ　　Ａｌａｌａ実施例２実施例１に記した方法により調製した精製ＢＣＤＦ標品
２０ｐｇを５　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｆｌｃ　Ｉｔ　、　
ｐＨ９，５のバフファーに溶解し、リシルエンドペプチ
デース（Ｌｙｓｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（
和光）（Ｌｙｓｙｌ　ｅｎｄｏｐｅｐｔ−ｉｄａｓｅ：
　　ＢＣＤＦ標品＝１：２００．モル比）を加え、３７
℃、６時間反応させ、ＢＣＤＦをフラグメント化した。

反応液を逆相クロマトグラフィー用カラムｐ　Ｂｏｎｄ
ｏ　Ｐａｃｋ　（０，２１Ｘ　３０　ａ！１）を用いた
　ＨＰＬＣにかけ、溶出液、０．０６％ＴＦＡ中のアセ
トニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させて
フラグメントを分離溶出した。この結果ＨＰＬＣの溶出
ピーク１〜９を得た。各ピーク部分の溶出液を凍結乾燥
し、プロティン・シークエンサー　　（Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏ、＋　Ｃａ１ｆ、　Ｍｏｄ
ｅｌ　４７０４）に導入した。アミノ酸配列の決定は、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、。

Ｐｕ、２６５〜２７５（１′１５１）に記載されている
方法により行なった。

アミノ酸配列を確認出来たフラグメントとアミノ酸配列
を記す。

フラグメント３Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕフラ
グメント８Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｎ−Ａｓｎ−
Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｙ−Ｍｅ　ｔフラ
グメント２Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘ
−Ｙ−Ｌｙｓフラグメント６Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘ尚、Ｘ及
びＹは同定できなかったアミノ酸フラグメント２，６は
実施例１のＮ末端配列と一敗した。

実施例３実施例１および２で得たＢＣＤＦのアミノ酸配列をコー
ドするオリゴヌクレオチドを、下記のように合成した。

オリゴヌクレオチドの合成はアプライドバイオシステム
社製ＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０Ａを用い、シ
リカゲルを固相担体とし、亜リン酸トリエステル法を用
いてヌクレオチド結合反応を行った。常法により保護基
を除去した後、Ｃｌ１ｌ逆相カラムＨＰＬＣにてアセト
ニトリルグラジェントを用いて、目的のオリゴヌクレオ
チドを精製した。

フラグメント３Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕプロ
ーブ魚ＧＧＧＣ＾ＧＧＧＣ＾ＧＧＴＣ＾ＧＴＧＣ＾＾Ａ−ＧＡＡ−ＧＣＣ−ＣＴＡ−ＧＣＧ−ＧＡ　　　
　・・・　３−５ＧＴＧＣＡＡＡ−ＧＡＡ−ＧＣＣ−ＣＴＣ−ＧＣＧ−ＧＡ　　　
　・・・　　３−６ＧＴＴＣ（各６４通りの混合物）フラグメント８Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａ　１　ａ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｎ−
Ｇ　ｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇ　１　ｎ−Ｙ−Ｍｅ　ｔ
プローブ隘（各３２通りの混合物）Ｎ末端アミノ酸配列プローブ患ＧＡＡ−ＧＡＴ−ＴＣＡ−ＡＡＡ−ＧＡＴ−ＧＴ　　　
　　　　・・・　　　Ｎ−１ＣＧＧＣＧＡ八−ＧＡＴ−ＴＣＴ−ＡＡＡ−ＧＡＴ−ＧＴ　　　
　　　　・・・　　　Ｎ−２ＣＣＧＣＧＡＡ−ＧＡＴ−ＡＧＴ−ＡＡＡ−ＧＡＴ−ＧＴ　　　
　・・・　Ｎ−３ｃｃｃｃＡＡＡ−Ｇ、１Ｔ−ＧＴＡ−ＧＣＡ−ＧＣＡ−ＣＧ　　
　　　・・・　　Ｎ−４ＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＡＡ八−ＧＡＴ−ＧＴＴ−ＧＣＴ−ＧＣＡ−ＣＧ　　　
　　　　・・・　　　Ｎ−７ＣＣＣＧ（各６４通りの混合物）実施例４（イ）　　２１容プラスチツクローラー培養器（ファル
コン＃３０２７）　　（以下ローラーと称する）中の１
１の２０％ＦＣ３含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグ
ルタミン、５ｘｌＯ−’Ｍ　　２ＭＥ、１００単位７ｍ
ｌペニシリン、１００μｇ／ｌｌ１１ストレプトマイシ
ン、２０μｇ／ｍ／ゲンタマイシン、１６ｍＭＮａＨＣ
Ｏ，を含有）に２　ｘ　１０’　／ｍ１ＩａＩ胞数にＶ
Ｔ−１を接種し、８ｒｐｌＩ＋で回転させつつ３日間、
３７℃で培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞
を集めＰＢＳで２回細胞を洗った後細胞＜１．８Ｘ１０
’細胞）をＰＢＳ溶液８００　　ｒｍｌに懸濁し、細胞
を遠心によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤
であるＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙ
ｌ　ｃｏｍｐｌｅｘ（１０ｍＭ）を含んだＲ３Ｂ溶液（
１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　
ＮａＣｌ１．　１．５ｍＭＭｇＣｊ！ｇ）８００　ｍｌ
に懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５％になるよう
に加えた後ゆるやかに攪拌後、３０００　ｒｐｍで５分
遠心して核を含む細胞ｄｅｂｒｉｓを除去し、その上清
液にＳＤＳ　（最終濃度０．５％）とＥＤＴＡ　（最終
濃度５　ｍ　Ｍ　）を加えた後、直ちにフェノールを等
量加え、細胞質ＲＮＡを抽出した。

合計３回フェノール抽出を繰り返してから、２容エタノ
ールでＲＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め、１０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃｊ！　、　ｐＨ７，５で溶解し
た。

このようにしてＶＴ−１細胞から得られたＲＮＡ量は３
０■であった。

次にこのＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ（
ｄＴ）−セルロース（Ｐ、　Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ。

Ｔｙｐｅ　７　）を用い、カラムクロマトグラフィーを
行なった。吸着は２０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−）１ｃ　１
　、　ｐＨ７，５，０，５Ｍ　Ｎａ（Ｊ！　、　　１　
ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　０．５％ＳＤＳ溶液にＲＮＡを溶
解して行ない、緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ｔｌｃＪ、
　ｐＨ７，５，０，５Ｍ　ＮａＣｆ、　　１　ｍＭＥＤ
ＴＡ　”）で洗浄後、溶出は水と１０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＩＩｃ　ｌ（ρＩ（７，５）で交互にｍＲＮＡを溶
出することにより行なった。この結果溶出されたｍＲＮ
Ａ量は５７６μｇであった。

（Ｉｌ＋）　　（（）で調製したｍＲＮＡ　５μｇを用
いて二重鎖ｃＤＮＡを作製した。ＧＵＢＬＥＲ，ＵとＨ
ＯＦＦＭ＾Ｎ＋Ｂ＋Ｊ、、（Ｇｅｎｅ互、　２６３．１
９８３）の方法に従い、ｃＤＮＡ合成キット（アマジャ
ム）を用いアマジャムのプロトコールによって二重鎖ｃ
ＤＮＡを作製した。すなわち、ｍＲＮＡより逆転写酵素
によりジングルストランドｃＤＮへを合成し、ｍＲＮＡ
とｃＤＮＡのハイブリッドを基質として、大腸菌リボヌ
クレアーゼＨを利用してＲＮＡ鎖にニックとギャプを形
成した。さらに大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによって、
ニックトランスレーションタイプの反応によりｍＲＮＡ
をＤＮＡに置き換え二重鎖ＤＮＡを作製した。この３′
末端にある小さなオーバーハングを７４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて除去し、二重鎖ｃＤＮＡを作製した。最終
的に得た二重鎖ｃＤＮＡは１．０８μｇであった。

（ハ）得られた二本鎖ｃＤＮＡ　１．０８μｇを蔗糖密
度勾配遠心法（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　、　　
１　ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ１，５を含む溶液中で蔗糖密度勾配５−２５％、４
０．０ＯＯｒｐ＋ｎ　、　　４℃下で１３時間）により
分画し、その１部をアガロースゲル電気泳動法によるオ
ートラジオダラムにより解析し、二本鎖ｃＤＮＡのサイ
ズが５００ｂｐ以上の両分を集めてエタノール沈澱法で
回収した。回収した二本鎖ｃＤＮＡは約０．６μｇであ
った。

（ニ）０．１Ｍカコジル酸カリウム（トリスＲａ５ｅで
ｐＨを７．２にしたもの）１０ｍＭ　　ＤＴＴ、２ｍＭ
ＣｏＣｌ　ｚ、　０．５　ｍ　Ｍ　”Ｐ−ｄＣＴＰ　　
（比活性１×１０ｂｃｐｍ／ｎ　ｍｏｌｅ）　＋　　０
．６μｇ二本鎖ｃＤＮ＾および５０単位のデオキシヌク
レオチジルターミナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を
混合し、２４℃、２０分間・インキュベートした後、フ
ェノール処理を行い、セファデックスＧ−５０カラムを
通してｃＤＮＡ画分を集め、エタノール沈８物として０
．２４μｇのｄＣ−テイルしたｃＤＮＡを得た。このｃ
ＤＮＡは約１３個のｄＣＭＰ残基が３′両末端に付加さ
れていた。

（ネ）一方、第１図に示したようにサル細胞（ＣＯ５細
胞）でのｃＤＮＡ発現ベクターｐＱをｐＣＨＩＬ−２（
Ｎａｔｕｒｅ　、　３０２　、３０５　、　（１９８３
））から構築した。ｐＱはｃＤＮＡを両向きのＳＶ４０
初期プロモーターにはさみごみができ、ｃＤＮＡがどち
らの方向に挿入されてもＣＯ３細胞中でｃＤＮＡにコー
ドされるペプチド蛋白を発現させることができる。また
、Ｅ、　ｃｏｌｉ中でも複製可能で、テトラサイクリン
耐性として選択することができる。

このｐＱをＰｓｔ　Ｉで切断し、先程のｄｓ−ｃＤＮＡ
の３′端の両端にｄＣｔａｉｌをつけたのと全く同じよ
うにｄＧ　ｔａｉｌを１３個前後付与した。

次にこのｄＧ−ｔａｉｌｅｄ　ｐ　Ｑ　１００　ｎｇと
ｄＣ−ｔａｉｌｅｄｄｓ−ｃＤＮＡ　２０ｎｇを５　Ｏ
ｎ＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、　ｐＨ７，５゜０、１
　Ｍ　ＮａＣ１、１ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液に混合し、ま
ず６５℃で２分間、ついで４５℃で６０分間、３７℃で
６０分間、そして室温で６０分間インキュベートした。

そしてこのアニーリングしたＤＮＡをコンピテントなＥ
、ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６１に４人した。次にＭＣ１０
６１のコンピテント細胞の作り方、導入法を以下に示す
。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＭＣ１０６１を１００＋＋ｊ！の甲培
地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｍ
ｇＳＯ４・７■ｚＯ、ｐＨ７，６）に接種し、培養液の
吸光度が５５０ｎｏ＋で０．３〜０．５付近になるまで
３７℃で振盪培養した。培養終了後、培養液を５分間、
０℃に保持し、菌体を遠心分離により集め、Ｔｆｂｌ（
３０ｗＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ　Ｒｈ（Ｊ、　　１
０ｍＭ　ＣａＣｌ１．　、　５０ｍＭ　ＭｎＣ６ｚ　＋
　　１５％グリセリン。

ｐＨ５，８）の４０ＩＩ１１に懸濁し、０℃に５分間静
置した。

再び菌体を遠心分離により集め、Ｔｆｂｎ（１０ｍＭ　
ＭＯＰＳ　ｏｒ　ＰＩＰＥＳ、　　７５ｍＭ　ＣａＣ１
ｚ　、　１０ｍＭ　ＲｂＣｊ！。

１０％グリセリン、ｐＨ６，５）の４０ｒａｌｌに懸濁
し、０℃で１５分間静置した。この懸濁液を分注して一
７０℃に保存した。

次にこのように調製したコンピテント細胞の１００．１
７Ｎを１５分間、０℃に保持し、この中に先程ｄＧ−ｔ
ａｉｌｅｄ　ｐＱ　ｖｅｃｔｏｒとｄｃ＝ｔａｉｌｅｄ
　ｃＤＮＡとをアニールした標品１０μｌ及び５０ｎ＋
）’ｌ　ＭｇＣｊｌ　ｚ　。

１０ｍＭ　ＣａＣ１ｚの溶液９０ｐＨとを混合し、０℃
で２０分間静置する。ついで３７℃で６０秒間熱−処理
後、１〜２分間、０℃に保持し、これに！培地１ｎｌを
加え、３７℃で６０分間振とう培養した。この培養液を
１５Ｎｇ／１ａｌｌのテトラサイクリンと２５μｇ／ｍ
ｌｌのストレプトマイシンを含むし培地（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１）の寒天プ
レートに塗抹し、３７℃で一晩インキユベートするとコ
ロニーが出現した。

（へ）得られた形質転喚株約ｉｓｏ、ｏｏｏクローンに
対し、プローブ８−１．および８−２を用いてＧｒｕｎ
ｓｔｅｉｎ、ＭらＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｇｙｍｏ
ｌｏｇｙ、　６８　。

３７９　（１９７９）の方法でコロニーハイブリダイゼ
ーションを行ったところ、８−１とハイブリダイズする
株がｌＯクローン認められた。さらにこれらの１０クロ
ーンに対してプローブ３−１〜３−６を用いて、同様の
方法でコロニーハイブリダイゼーションを行ったところ
プローブ３−２とハイブリダイズする株１クローンを得
た。本クローンが保持するプラスミドＤＮＡを粗抽出精
製し、制限酵素ＰｓｔＩで切断後、ｃＤＮＡインサート
をアガロース電気泳動にてｐＱベクターと分離した。

プローブ８−１．プローブ３−２．プローブＮ−２また
はプローブＮ−５を用いてサザンハイプリダイゼーショ
ン分析を行ったところいずれのプローブともハイブリダ
イズした。その他のプローブとはハイブリダイズしなが
った・このプラスミドＤＮＡをｐＢｓＦ２−３８と名づけた。

すなわち本ｐＢｓＦ　２−３８のもつｃＤＮＡインサー
トはＢＣＤＰ活性をもつ蛋白の明らか止された部分アミ
ノ酸配列に相当する遺伝子配列を有することが明らかで
あり、本ｃＤＮＡはＢＣＤＦ遺伝子であると同定した。

実施例５（イ）　ＰＢＳＦ２−３８　　プラスミドＤＮＡを大量
調製するために本ｐＢｓＦ２−３８を保持するＭＣ１０
６１を２０μｇ／ＩＩ＋１のテトラサイリンと２５μｇ
／ｍＡのスプレブトマイシンを含む！培地１００＋＋４
！に接種し、３７℃で５〜７時間振盪培養した。次に最
終濃度１７０μｇ／ｎｊ！となるようにクロラムフェニ
コールを含む新たな！培地１００ｍｊ！を加え、さらに
−晩振盪培養した。

このようにして増幅されたプラスミドＤＮＡを以下のよ
うに精製した。

培養液を遠心分離により菌体のみ集め、５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−１１ＣＩ　、　ｐＨ７，５の５　ｒｍｌ！に懸濁し
一８０℃に凍結後、融解して次にリゾチーム（最終濃度
、２■／１１）を加えて０℃で１０分間静置し、さらニ
ＥＤＴＡ　（最終濃度０．１Ｍ）を加え、Ｏ”Ｃで１０
分間静置する。その後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終
濃度０、１％）を加えて０℃で６０分間静置する。つい
で３０，０００ｒｐｍ　、　３０分間遠心分離し、その
上清液を等量の水飽和フェノールで処理する。その水層
をさらに等量のクロロホルムで処理し、その水層を抽出
し、これに最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａ
ｓｅを加え、３７℃で６０分間インキュベートした。

その後０．２容の５ＭＮａ（ｌと１７３容のポリエチレ
ングリコールを加え、０℃に６０分間静置後、１０．０
０Ｏｒｐｍ　２０分間、遠心分離によりＤＮＡ沈殿を回
収する。

次にこの沈殿を３．８ｔａｌの水に溶解し、４ｇのＣｓ
Ｃ１を加えて溶解後、１０■／ｍｆの１ＥｔＢｒの２０
０ｕＪを加えて４０．００Ｏｒｐｍ　、　１６時間、２
０℃で超遠心分画を行う。

遠心終了後、ｐｌａｓｍｉｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ画分を抽出し
、水飽和ｎ−ブタノールの１〜２容で４回抽出操作を行
ってＥｔＢｒを除く。その後ＩＩ□Ｏ中で透析を行って
ＣｓＣＩＩを除去後、３Ｍ酢酸ソーダｐＨ５，６の１７
１０容を加え、さらに２容の冷エタノールを加えて、−
２０℃で一晩静置する。このエタノール沈殿を遠心分離
で集めて８０％エタノール水溶液で洗浄後、よく乾燥し
、この沈殿物を１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１、ｐＨ
７，５の５０μｌに溶解しサル細胞トランスフェクショ
ンためのサンプルとした。

（Ｅｌ）　　サルＣＯ５−７細胞へのプラスミドの感染
法ＣＯ５−７細胞をｌＸｌ０’　　／ｍｌになる様に１
０　％牛胎児血清含有ＲＰＭＩニｉ％ｊ、濁し、コノ３
ＩＩＩ１分を５　ｃｍシャーレにて５％炭炭酸ガスイン
キュベータ円内３７で一夜培養した。培養上清を除去し
、新しい１０％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　３　ａｓ　ｌ
を加え、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で２
時間培養した。培養後、上清を除去し、ＴＢＳ（２５ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ　ｌ　、　ｐＨ７，５，１３０ｎ
＋Ｍ　ＮａＣＪ！　。

５ｍＭ　ＭＣＩ　、　０．６ｍＭ　ＮａＪＰＯ４）　２
．５　ｍｌにて１回洗浄した。

プラスミド混合物（ＴＢＳ　（＋）（ＴＢＳに０、７　
ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　−０，５ｍｌ’ｌ　ＭｇＣｌ！ｚを
加えたもの）１．９ｍ１．プラスミドＤＮＡ２μｇおよ
び１０■／ｍ　Ｉ　ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ　５０　
／Ｊ　Ｎを力■え、３７℃、５％炭酸ガスインキュベー
ター内で４時間インキュベート、上清を除去後、ＴＢＳ
２．５ｍｌで洗浄除去し、１５０μ阿クロロキン含有１
０％牛脂児血清含有ＲＰ旧２．５ｍｆを加えた。３７℃
、５％炭酸ガスインキュベーター内で５時間インキュベ
ート後上清を除去し、Ｔ［３Ｓ２．５ｍｆｆで２回洗浄
した。

１０％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　３　ｍ　ｌを加え、３
７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で一夜培養した
。

上清を除去後回ＲＰＭ１３　ｍ　ｌを加え、３７℃５％
炭酸ガスインキュベーク−内で２日培養した。そしてこ
の培養上清を遠沈後その上清をＢＣＤＦＣＤ側定用サン
プルとした。

ミドＤＮへを導入したＣＯ８は対照に比べ明らかなりＣ
ＤＦ活性を示した。

このように真核生物細胞ＣＯ５−７で生産されたりコン
ビナンドヒトＢＣＤＦは培養液を抗ＢＣＤＦ抗体固定化
カラムを通し、次いで前出の逆相ＨＰＬＣ（ジンクロン
Ｃ＋ｓ　）を用いて精製された。本ＢＣＤＦはｃＤＮＡ
構造にＮ−グリコシレージョン位置のあることより糖鎖
を含有するものであり、その理化学的性質は実施例１の
方法にてＶＴ−１培養土端により精製された純化ＢＣＤ
Ｆのそれに一致した。すなわち分子量：３．５±０．５
Ｘ１０’ダルトン（ゲル濾過法）２．２±０．２Ｘ１０
’ダルトン（ＳＯＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法）等電点：ｐＨ４，９〜５．１であった。

実施例６実施例５（イ）により調製したｐＢＳＦ２−３８より制
限酵素Ｂａｍ旧で切り出したＢＣＤＦ　ｃＤＮＡ　１ｎ
ｓｅｒｔをプローブとしてＢＣＤＦ　ｎ＋ＲＮＡサイズ
、分子種、　ＢＣＤＦｍＲＮＡ産生株の評価を行なった
。用いたｍＲＮＡは本ＢＣＤＦを産生ずるＶＴ−１細胞
をはじめ、として他にＢＣＤＦを産生ずると考えられる
Ｃ　Ｅ　Ｓ　Ｓ、　ＲＰＭＩ　１７８８とＢＣＤＦ活性
の認められないＣＬ　−４、Ｊｕｒｋａｔ、　Ｃ２Ｍ細
胞から実施例４の（イ）と同じ方法で調製したものであ
る。

各々ｄＮＡ１０μｇ　／　３．６μｌ、５ｘＭＯＰＳ緩
衝液（０，１Ｍ　ＭＯＰＳ　　（ｐＨ７，０）　７５ｍ
Ｍ　Ｎａ０Ａｃ、　５ｍＭＥＤＴＡ　）　６．０μβ、
ホルムアルデヒド５．４μｌおよびホルムアミド１５．
０μｌを６０℃１５分間インキュベートし、これに色素
液（０，０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５
％キシレンシアツール含有８０％グリセロール液）３μ
ｌを加えたものを調整サンプルとした。本サンプルを１
×Ｍ　ＯＰ　Ｓ　１１　ｄｉ　液、１．８％ホルムアル
デヒド含有１．６％アガロースゲルにて電気泳動し、そ
の後、常法によりニトロセルロースフィルターにブロッ
ティングした。そして本フィルターを８０℃３時間べ−
りした。この様に調製したフィルターを０．１％ＳＤＳ
含有３ＸＳＳＣに浸漬後、１×デンハルト溶液、５０％
ホルムアミド、５ＸＳＳＣ３２５０μｇ／ｌｌ１１ニシ
ンＤＮＡ含有５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６
，５）にて４２℃で一夜プレハイブリダイズした。そし
て、１×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、５ＸＳ
ＳＣ１２５０μｇ／ｍｉｌニシンＤＮＡ含有５０ｎ＋Ｍ
りトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）中ニ”？ｌ”　
３”　Ｐ　ラヘル化、ＢＳＦＺ−３８（７）ＢａｍＨＩ
　ｃＤＮＡインサートをプローブとして４２℃−夜ハイ
ブリダイズした。

ハイブリダイズしたフィルターを室温で０．２％ＳＤＳ
含有２ＸＳＳＣにて５分間４回、５０°Ｃで０．２％Ｓ
ＤＳ含有０．　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃにて３０分間２回洗
浄し、風乾後、オートラジオグラムを作成した。

その結果、ＶＴ−１、ＣＥＳＳ　（ＢＣＤＦ産生株）、
ＲＰ旧１７８８由来のｍＲＮＡにはｐＢＳＦ２−３８の
ｃＤＮＡプローブはハイブリダイズした。ＢＣＤＦを産
生じないと思われるＣＬ　−４、Ｊｕｒｋａｔ、　ＣＥ
ＭおよびＢＣＤＦ非産生ＣＥＳＳ由来のｍＲＮＡにはハ
イブリダイズしなかった。

またｐＢＳＦ２−３８のｃＤＮ八へローフ゛とハイブリ
ダイズす実施例７ｐＢＳＦ２−３８を保持するＭＣ１０６１より実施、例
５の（イ）に記した通りプラスミドＤＮＡを得、制限酵
素Ｂａｎ＋ＨＩで切り出ずことによりＢＣＤＦ　ｃＤＮ
Ａを調製した。そして制限酵素地図と塩基配列を決定し
た。

塩基配列はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの化学法（Ｍｅ
ｔｈ、Ｅｎｚｙｍ。

的、　４９９　（’８０）　）およびＭ１３ファージ（
Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ旦２６９（
’８２））を使ったジデオキシヌクレオチド鎖集結法Ｃ
Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１
．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、八、７４．５４６３（’
７７）の方ンＬにより決定した。決定された塩基配列お
よび制限酵素地図を第５図に示す。

ここに決定されたヒＩ−ＢＣＤＦ塩基配列は実施例１゜
２で開示されたアミノ酸部分配列構造を全て正確に含む
。

【図面の簡単な説明】

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトＢ細胞分化因子（以下ＢＣＤＦと称する）活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
（２）遺伝子が、制限エンドヌクレアーゼにより切断さ
れる箇所がコード配列の５′−末端からＭｖａ　 I 、
Ａｌｕ　 I 、Ｓａｕ３Ａ　 I 、Ｐｓｔ　 I の順序で
配列されている部分を有する特許請求の範囲第１項記載
の遺伝子
（３）遺伝子が、制限エンドヌクレアーゼにより切断さ
れる箇所がコード配列の５′−末端からＭｖａ　 I 、
Ｍｖａ　 I 、Ａｌｕ　 I 、Ｓａｕ３Ａ　 I 、Ｐｓｔ
　 I 、Ｘｂａ　 I 、Ａｌｕ　 I 、Ｐｓｔ　 I 、Ｐｓ
ｔ　 I 、Ａｌｕ　 I の順序で配列されている部分を有
する特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
（４）遺伝子が下記の塩基配列（ａ）を有するものであ
る特許請求の範囲第１項記載の遺伝子（ａ）【遺伝子配列があります】
（５）遺伝子が、前項記載の配列（ａ）における１〜３
番目のＡＴＧ配列からはじまり、該ＡＴＧ配列から少く
も６３４〜６３６番目のＡＴＧ配列までの配列スペース
を有するものである特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
（６）遺伝子が、（４）項記載の配列（ａ）における８
５〜８７番目のＣＣＡ配列からはじまり、該ＣＣＡ配列
から少くも６３４〜６３６番目のＡＴＧ配列までの配列
スペースを有するものである特許請求の範囲第１項記載
の遺伝子
（７）遺伝子が、（４）項記載の塩基配列（ａ）におけ
る８５〜８７番目のＣＣＡ配列からはじまるものである
特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
（８）遺伝子が、（４）項記載の塩基配列（ａ）におけ
る６３４〜６３６番目のＡＴＧ配列で終わるものである
特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
（９）遺伝子が、下記のアミノ酸配列（ I ）に対応す
る塩基配列を有するものである特許請求の範囲第１項記
載の遺伝子アミノ酸配列（ I ）：【アミノ酸配列があります】
（１０）遺伝子が下記のアミノ酸配列（II）に対応する
塩基配列を有するものである特許請求の範囲第１項記載
の遺伝子アミノ酸配列（II）：【アミノ酸配列があります】
（１１）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドをコー
ドした遺伝子および真核生物の細胞中で複製可能なベク
ターＤＮＡよりなることを特徴とする組み換えＤＮＡ体
（１２）遺伝子が第４項記載の塩基配列（ａ）を有する
ものである特許請求の範囲第１１項記載の組み換えＤＮ
Ａ体
（１３）遺伝子が第５項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１４）遺伝子が第６項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１５）遺伝子が第７項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１６）遺伝子が第８項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１７）遺伝子が第９項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１８）真核生物の細胞が大型Ｔ抗原を構成的に発現す
るＳＶ−４０で形質転換されたサル細胞である特許請求
の範囲第１１項記載の組み換え体
（１９）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子および真核生物の細胞中で複製可能なベク
ターＤＮＡよりなることを特徴とする組み換えＤＮＡ体
により形質転換された真核生物細胞
（２０）遺伝子が第４項記載の塩基配列（ａ）を有する
ものである特許請求の範囲第１９項記載の真核生物細胞
（２１）遺伝子が第５項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２２）遺伝子が第６項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２３）遺伝子が第７項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２４）遺伝子が第８項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２５）遺伝子が第９項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２６）真核生物の細胞が大型Ｔ抗原を構成的に発現す
るＳＶ−４０で形質転換されたサル細胞である特許請求
の範囲第１９項記載の細胞
（２７）特許請求の範囲第１９項記載の真核生物細胞を
培地中にて培養し、生産されたヒトＢＣＤＦを採取する
ことを特徴とするヒトＢＣＤＦの製造法
（２８）真核生物がサッカロミセス属に属するものであ
る特許請求の範囲第２７項記載の方法
（２９）真核生物の細胞が大型Ｔ抗原を構成的に発現す
るＳＶ−４０で形質転換されたサル細胞である特許請求
の範囲第２７項記載の方法
（３０）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチド
（３１）Ｃ−末端がメチオニンである特許請求の範囲第
３０項記載のポリペプチド
（３２）Ｎ−末端がプロリンである特許請求の範囲第３
０項記載のポリペプチド
（３３）Ｎ−末端がプロリンであり、Ｃ−末端がメチオ
ニンである特許請求の範囲第３０項記載のポリペプチド
（３４）Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
Ｌｕの配列を内部に有する特許請求の範囲第３０項記載
のポリペプチド
（３５）Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ
−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎの配列を内部に有す
る特許請求の範囲第３０項記載のポリペプチド
（３６）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏの配
列を内部に有する特許請求の範囲第３０項記載のポリペ
プチド
（３７）特許請求の範囲第３４〜３６項記載のアミノ酸
部分配列もしくはＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕのアミノ酸部分配列を少なくとも２個以上
内部に有する特許請求の範囲第３０項記載のポリペプチ
ド
（３８）アミノ酸配列（II）で示される特許請求の範囲
第３０項記載のポリペプチド
（３９）アミノ酸配列（II）に示す構造で１個もしくは
複数アミノ酸を他のアミノ酸におき換えた構造を有する
特許請求の範囲第３０項記載のポリペプチド
（４０）アミノ酸配列（II）に示す配列のうち、Ｎ−末
端部もしくはＣ−末端部より１個もしくは複数個のアミ
ノ酸が欠損し、かつ連続している複数のアミノ酸よりな
るヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチド
（４１）真核生物の細胞で生産される糖鎖を有する糖蛋
白質でポリペプチド部分が特許請求の範囲第３１〜３７
項の範囲に入るヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチド