JPH0372888A - 抗酸菌分泌発現ベクター及び抗酸菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ミコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（以下ＢＣ
Ｇ菌と略記）を代表とする抗酸菌において、異種ポリペ
プチドを菌体外に分泌発現しうる分泌発現ベクターと該
ベクターで形質転換した形質転換体に関する。

〔従来の技術〕

抗酸菌の１種であるＢＣＧ菌はマクロファージ内でも増
殖可能な結核菌のうち、ウシ型結核菌を２０年以上人工
培地上で継代培養して得られた弱毒株である。このＢＣ
Ｇ菌は、細菌ワクチンの中では現在唯一の生菌ワクチン
として用いられている、毒性が極めて弱い、結核感染の
みならず一般に強い非特異的細胞性免疫増強作用（アジ
ュバント活性）がある、安価である等の特徴を有してい
る。

従って、遺伝子組み換え手法を用いてＢＣＧ菌に種々の
病原性細菌やウィルスの抗原性ポリペプチドを分泌発現
させることができれば、 ■安全性が高い ■持続性が期待される ■ＢＣＧ菌自身のアジュバント活性により高いワクチン
活性を示すと期待される ■安価 である等のメリットを有する遺伝子組み換えＢＣＧ生ワ
クチンの開発が可能となる。現在、遺伝子組み換え生ワ
クチンの研究は、ベクターとして主に、ワタシニアウイ
ルスが広く用いられているが、強毒性のりバータントが
出現する危険性や、人に接種した際に脳炎を起こすこと
があるなどの欠点があり、実用化には程遠く、安全でア
ジュバント効果が期待できるＢＣＧ菌に注目が集まって
いる。

一方、遺伝子組み換えによる抗酸菌での外来遺伝子の発
現は従来形質転換系自体が確立されていない為に全く報
告されていなかったが、最近エレクトロポレーションに
よる形質転換系が確立された事により実現可能となった
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５．６９８７（１９８８））　
、これは、ミコバクテリウム・フォルドウイータム由来
のプラスミドルＡ　Ｌ５０００　（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、、　３０．２２１（１９８５
）　）をベースとし、大腸菌のベクターｐｌＪ６６６と
融合させた大腸菌−抗酸菌のシャトルベクターをエレク
トロポレーションによってＢＣＧＩやミコバクテリウム
・スメグマティスといった抗酸菌に導入するという系で
あり、大腸菌由来のカナマイシン耐性遺伝子（カナマイ
シンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）が抗酸菌におい
て発現することが示された。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、ワクチンとしてより有効と思われる外来
ポリペプチド、例えばエイズウィルスのコア蛋白を抗酸
菌から分泌発現させる系はまだ開発されていない。

本発明の目的は抗酸菌特にＢＣＧ菌から異種ポリペプチ
ドを分泌発現させうる分泌ベクターと該ベクターにより
形質転換された形質転換体の提供に有る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明はこのような目的を遠戚するべくなされたもので
あり、プロモーター配列、シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列及び異種ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ塩基配列とが連結されたＤＮＡ塩基配列を有し、か
つ抗酸菌において複製可能ならしめる複製開始領域を含
むことを分泌発現するポリペプチド分泌発現ベクター及
びこのベクターで形質転換した形質転換体によって上記
目的を遠戚したものである。

本発明のベクターに組み込まれるプロモーター配列は、
抗酸菌のＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写開
始点から−３５及び−１０塩基対付近の配列が必須であ
る。これらの領域のコンセンサス配列は、抗酸菌につい
てはまだ決定されるには至っていないが、大腸菌のコン
センサス配列ＴＴＧＡＣＡ　（−３５領域）　、ＴＡＴ
ＡＡＴ　（−１０領域）に類似した配列は抗酸菌におい
ても種々報告されている。

しかしながら、このコンセンサス配列とは全く異なる配
列を有する抗酸菌のプロモーターも存在するので、実際
に抗酸菌において、著量発現している遺伝子の−３５及
び−１０領域の配列をそのまま使用するか、その配列を
人工的に合成した合成りＮＡを用いることが望ましい。

シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列は、蛋白
質が膜を通過して細胞の外に分泌されるために必須な２
０〜４０ア藁ノ酸残基からなるペプチドをコードする配
列である。そのシグナルペプチドの構造的特徴は、Ｎ末
端に開始コドンＡＴＧに対応するＭ　ｅ　ｔを有する、
Ｎ末端近傍に２〜３個の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、　Ａ
ｒｇ等）、そのうしろに１５〜２５個の疎水性アミノ酸
が続き、更にシグナルペプチドの切断点はＡｌａ、　Ｃ
；Ｉｙなど側鎖の短いアミノ酸残基になっている等であ
る。この構造的特徴は種々の生物種において共通ではあ
るが個々のシグナルペプチドのアミノ酸配列及び塩基配
列は微妙に異なっているので、プロモーター配列と同様
に、実際に多量に抗酸菌の菌体外に分泌されている蛋白
質の遺伝子のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
をそのまま使用するか、その配列を人工的に合成した合
成ＤＮＡを用いることが望ましい。

前記のプロモーター配列及びシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片は、本発明者らが
既にＢＣＧＣ集菌体ＤＮＡよりクローニングした分泌蛋
白質遺伝子〔α抗原（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　
１７０．３８４７　（１９８８））　、Ｍ　Ｐ　Ｂ６４
蛋白（Ｉｎｆｅｃｔ、　ＩＩＩＩｍｕｎ、、　５７．２
８３　（１９８９））　、ＭＰ　Ｂ７０蛋白（ＦＥＭＳ
　Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、　Ｌｅｔｔ、、　５８．２７３
（１９８９））又はミコバクテリウム・カンサシ染色体
ＤＮＡよりクローニングしたα抗原遺伝子より切出すこ
とができる。

その調製方法の例をミコバクテリウム・カンサシ由来α
抗原遺伝子のクローニングについて述べる。まず、ミコ
バクテリウム・カンサシの染色体ＤＮＡは鉛末らの方法
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６９．８３９（１９
８７）　）に準じて調製できる。この染色体ＤＮＡの種
々の制限酵素による切断物をアガロースゲル電気泳動で
分画後ＢＣＧ菌よりクローニングしたα抗原遺伝子又は
α抗原の部分アミノ酸配列から推定される塩基配列と相
補的な配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプローブ
としてサザンハイブリダイゼーション（Ｊ、　Ｍｏｌ、
　Ｂｉｏｌ、、　９８．５０３（１９７５）　）を行う
ことにより目的のＤＮＡ断片を検出する。次いで電気泳
動により分画したこのＤＮＡ断片をゲルから抽出し、ク
ローニングベクター（例えばプラスξドｐＵｃ１Ｂ、ｐ
ＢＲ３２２など）に導入したのち、ハナハンの方法（Ｊ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

１６６、５５７　（１９８３）　）あるいは塩化カルシ
ウム処理によるコンピテントセル法により宿主細胞（例
えば大腸菌ＪＭ１０９株、１８１０１株など）に導入し
て形質転換させＤＮＡライブラリーを調製する。

このＤＮＡライブラリーを形成するコロニーについて前
述のプローブを用いて常法に従ってコロニーハイブリダ
イゼーションを行い、目的のＤＮＡ断片のクローンを得
ることができる。かくして得られたクローン化ＤＮＡ断
片について、メッシングらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９，３０９（１９８１））または
、マクサムらの方法（Ｍｅｔｏｈｄｓ　Ｅｎｚｙｍ−ｏ
ｌ、。

６５、４９９（１９８０）　）によって塩基配列を解析
し、ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原遺伝子の
全塩基配列を決定することができる。尚、このα抗原は
ミコバクテリウム・カンサシに特異的な抗原決定基を有
することが判明しているので、抗酸菌からの分泌発現の
マーカー遺伝子として利用できる。次に、決定した塩基
配列の中からα抗原のプロモーター及びシグナルペプチ
ドと推定される領域を適当な制限酵素により切出せばよ
い。

次に分泌発現させる異種ポリペプチドであるが、具体的
には大腸菌由来のβ−ラクタマーゼやヒトインターロイ
キン２に代表される高等動物由来の種々のホルモン、リ
ンホカイン、更にはエイズウィルスのコア蛋白などがあ
げられる。

また、たとえばミコバクテリウム・ボビスＢＣＧを宿主
としてミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原を分泌
発現する場合は生産されるミコバクテリウム・カンサシ
由来のα抗原は異種ポリペプチドになる。

すなわち、宿主がミコバクテリウムという開底であって
も、別の種の微生物が分泌発現しているポリペプチドを
生産する限り、本発明の異種ポリペプチドの分泌発現に
該当する。

更に融合ポリペプチド、例えば大腸菌のβ−ラクタマー
ゼとヒトインターロイキン２の融合ポリペプチドも本発
明の異種ポリペプチドに該当する。

また宿主としてＢＣＧ菌を用いて分泌発現されるミコバ
クテリウム・カンサシ由来のα抗原とＨＩＶｉ　　ｇａ
ｇ抗原のＢ細胞エピトープの融合ポリペプチドも本発明
の異種ポリペプチドである。

これらの異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
の取得方法としては、これらの異種ポリペプチドの遺伝
子がクローン化されたプラスミドからその実質的な配列
である構造遺伝子を適当な制限酵素で切り出すか又は構
造遺伝子を人工的に台底するという方法を用いればよい
。

抗酸菌において複製可能ならしめる複製開始領域は抗酸
菌で複製可能なプラスミドであれば特に制限されない。

例えば抗酸菌より分離されたプラスごドを用いればよい
。また、ミコバクテリウム・フォルドウイータム由来の
プラスξドｐＡ、Ｌ５０００に大腸菌のベクターｐｌＪ
６６６を融合させた大腸菌−抗酸菌のシャトルベクター
を利用することもできる。そのほか、例えばミコバクテ
リウム・フォルドウイータム由来のプラスミドＩ）ＡＬ
５０００に大腸菌のベクターｐＢＲ３２２やｐＵｃ１８
などを融合させた大腸菌−抗酸菌のシャトルベクターも
利用することもできる。

これらのＤＮＡ塩基配列の連結方法及び順序は、抗酸菌
で複製可能なプラスミドの複製開始に関与していない領
域の適当な制限酵素の切断部位に５゛から、プロモータ
ー配列を含むＤＮＡ断片、シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片、異種ポリペプチド
の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の順に、ＤＮＡリガーゼ
により連結する。

このような抗酸菌分泌発現ベクターの構築には、様々な
抗酸菌種より分離され、抗酸菌において複製可能な複製
開始領域を有するプラスミドを使用することができる。

好ましくはそのプラスミドと大腸菌で複製可能な複製開
始領域を有するプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵ
ｃ１８など）とを融合し、抗酸菌及び大腸菌において発
現可能な薬剤耐性マーカー遺伝子を付与したものが良い
。例えば、カナマイシン耐性及びクロラムフ玉ニコール
耐性遺伝子を有するスナツパ−らのベクターｐＩＪ６６
６−ｐＡ　Ｌ５０００　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５゜６９８７　（１
９８Ｂ）　）があげられる。次に、上記プラス壽ドの適
当なりローニングサイトに抗酸菌において機能しうるプ
ロモーター及びシグナルペプチドをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片、望ましくは、実際にＢＣＧ菌などの抗
酸菌から著量分泌されている蛋白質（例えばα抗原、Ｍ
ＰＢ６４蛋白、ＭＰＢ７０蛋白など）のブローモーター
及びシグナルペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を導入し、さらに、そのシグナルペプチドの下流に
種々の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を必要
に応じて合成アダプターを用いて導入することにより、
異種ポリペプチドを分泌発現ベクターを構築することが
できる。

本発明のポリペプチド分泌発現ベクターを抗酸菌に導入
することによってこのポリペプチドの分泌能を付与する
ことができる。導入方法としては、例えばスナツパ−ら
の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　８５．６９８７（１９８８））
に準じて６．２５ＫＶ／ｃｍ以上の電場強度によるエレ
クトロポレーションにより宿主に導入し、形質転換体を
得ることができる。宿主の抗酸菌としては、分泌発現さ
れる異種ポリペプチドとの関係もあるがＢＣＧ菌、結核
菌、非定型抗酸菌などの遅育抗酸菌の他に、くコバクテ
リウム・スメグマティスなどの速育抗酸菌も使用できる
が、いずれの場合もニトロソグアニジンなどの変異剤処
理や紫外線照射などによりリストリクジョンマイナスと
なった変異株を用いることが望ましい。

次に、得られた形質転換体を好気性培地中で培養するこ
とにより、培養上清に異種ポリペプチドを分泌発現させ
ることができる。培養方法は宿主に用いた抗酸菌を培養
する公知の方法に従って行うことができる。培養後は必
要により産生されたポリペプチドを公知の方法に従って
分離精製すればよい。

この形質転換体をワクチンとして使用することができる
。その場合、必要により加熱、ホルマリン処理等によっ
て活性を低下させてから使用してもよい。形質転換体を
浮遊させる媒体には生理食塩水、リン酸緩衝液等を使用
すればよく、濃度は約０．０１〜０．８モル／ｉ！、程
度でよい。

〔作用］ 本発明で得られた分泌発現ベクターにおいて、プロモー
ター配列は、シグナルペプチドと異種ポリペプチドの融
合ポリペプチドのメツセンジャーＲＮＡが抗酸菌のＲＮ
Ａポリメラーゼによって台底されるために必須である。

また、シグナルペプチドをコードする配列は、融合ポリ
ペプチドとして発現したシグナルペプチドと異種ポリペ
プチドのうち、異種ポリペプチドのみを抗酸菌の細胞質
膜を通過させ、菌体外に分泌させるために必要不可欠で
ある。このような作用によって異種ポリペプチドの構造
遺伝子が、抗酸菌において発現し、分泌されるわけであ
る。さらに、複製開始領域のＤＮＡは、本ベクターが抗
酸菌が分裂・増殖すると同時に複製して娘細胞に受けつ
がれ、娘細胞においても異種ポリペプチドが分泌発現す
るために必須である。

［実施例］ 以下に本発明を実施例により更に具体的に説明する。な
お、本発明においては下記の略号を使用する。

Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、Ｇニゲアニン、Ｔ：チミ
ン、ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ｄＣＴＰ：デオキシシ
チジン三リン酸、ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸
、Ｋｂ：キロ塩基、ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム
、Ｓ　Ｓ　Ｃ７０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）緩衝液、ＴＥ：１
０ｍＭトリス−塩酸、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０
）緩衝液、ＩＰＴＧ　：イソブロビルーβ−Ｄ−チオガ
ラクトシド、Ｘ−ｇａｌ　：　５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル＝β−Ｄ−ガラクトピラノシド 実施例１　分泌発現ベクターの調製 ■ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原遺伝子を含
むＤＮＡ断片の調製 ミコバクテリウム・カンサシＡＴＣＣ１２４７８株をソ
ートン培地（組成：アスパラギン０．４％、クエン酸０
．２％、クエン酸ナトリウム０．２８％、リン酸カリウ
ム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％、クエン酸
第１鉄アンモニウムｏ、ｏｏｓ％、グリセリン６％）１
１！、中にて３７°Ｃで培養し、対数増殖期の菌体を遠
心分離により集菌した。得られた菌体を１０ｍＭ　）リ
ス−塩酸（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥＤＴＡバッファー（
以下、ＴＥと略記）５ｍｌに懸濁し、リゾチーム５■を
加えて３７°Ｃで１５分間インキュベートした。次いで
これに１０％ＳＤＳ水溶液０．５　ｄを加えたのち、フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５
：２４：１の混合液６ｍで３回抽出し、得られた水層に
エタノール１０１１！ｉ！を加え、沈澱するＤＮＡをガ
ラス棒に巻きとった。このＤＮＡをＴＥ６、６　ｄに溶
解し、塩化セシウム７ｇ、エチジウムプロ≧ド（５■／
ｄ）水溶液０．７−を加えて溶解した。該溶液を遠心チ
ューブ（米国ベックマン社製、クイックシールチューブ
）中に入れ、６０．００Ｏｒｐｍにて６時間遠心して染
色体ＤＮＡのバンドを遠心チューブの上方より採取した
。このＤＮＡ溶液をＴＥに対して透析・脱塩して精製ミ
コバクテリウム・カンサシ染色体ＤＮＡを得た。

次に、既にクローニングしたＢＣＧ菌のα抗原遺伝子の
Ｌｅｕ”＝ＧＩｎ”９に対応する０、８ＫｂＰｓｔｌ断
片をサブクローニングしたプラス・ξドＩ）Ｐ−１（Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１７０．３８４７（１９
８８））　２０ｐｇを制限酵素ＰｓｔＩとＸｈｏｌで完
全消化して１％アガロースゲル電気泳動にて分画した。

これをＤＥ−８１ペーパー法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、　１７０．３８４７（１９８８））にて４９０ｂ
ｐと３１０ｂｐのＰｓｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片を回収
し、フェノール及びクロロホルムで２回ずつ抽出し、２
．５倍容量のエタノールを加えて沈澱させた。この沈澱
を減圧乾燥後ＴＥ２０ｐｅずつに溶解し、その１２ｐｅ
にニックトランスレーションキット（宝酒造製）の１０
倍濃度バッファー４　ｐｌ、酵素溶液１　ｐＲ及び〔α
−”Ｐ）ｄＣＴＰ　（アマジャム製、３，０００Ｃｉ／
ｍ　ｍｏｌ）　１０ｐεと蒸溜水１３μｅを加えた反応
混合物を１５°Ｃで２時間反応させた。反応終了後、フ
ェノールで１回抽出したのち水層を集め、これに仔牛胸
腺ＤＮＡ溶液（１ｍｇ／Ｗｉ）　３０ｐＱ、３Ｍ酢酸ナ
トリウム１ａｐｅを加、え、さらにエタノールを加えた
。生じた沈澱を集め、ＴＥ１００μｅに溶解してｆｆ！
ｐ標識プローブ（プローブＡ　：　４９０ｂｐ断片、プ
ローブＢ：３１０ｂｐ断片）を調製した。

次に前記、染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　３　ｐｇを制限酵素Ｋｐ
ｎＩで完全消化して０．８％アガロースゲル電気泳動に
て分画した後、常法（Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、９
８．５０３（１９７５）　３によりナイロンメンブラン
フィルタ−（ＮＥＮ社製、Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐ
ｌｕｓ）にサザントランスファーＬＤＮＡ結合フィルタ
ーを調製した。

このフィルターをハイブリダイゼーション溶液〔５倍濃
度のデンハルト溶液（０，１％フィコール４００．０．
１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミ
ン）、５倍濃度の５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ溶液及び仔牛
胸腺ＤＮＡＩＱμｇ／成］中に浸し、上述した３２Ｐ標
識プローブ２０ｐ２を加え、５８°Ｃで１６時間静置し
た。２倍濃度５ＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液中、室温で１
０分間の振盪洗浄を行った後、０．１倍濃度５ＳＣ−０
，１％ＳＤＳ溶液中、６０“Ｃで２０分間の洗浄を４回
繰返し行った。洗浄後フィルターを室温で乾燥させ、オ
ートラジオグラフィーを行い、５．５ＫｂのＫｐｎＩ断
片を検出した。

この断片をクローニングするために、ミコバクテリウム
・カンサシ染色体ＤＮＡ２０μｇをＫｐｎｌで完全消化
したのち、０．８％アガロースゲル電気泳動により分画
した。次いで、５゜０〜６．３にｂの範囲の断片をＤＨ
−８１ペーパー法により回収し、フェノール・クロロホ
ルム処理、エタノール沈澱後ＴＥ２０ｐｊに溶解した。

その４　ＡとｐＵ　Ｃ１８／Ｋｐｎ　Ｉ切断物０．２　
ｐｇ（２ｕｌ）と、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造製）のＡ溶液３８μｌ、　Ｂ溶液６μｅの混合物を１
６°Ｃで３０分間反応させた。反応液２０μｅをＥ、ｃ
ｏｌｉＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造）１００μ
ｅに加えＯｏＣで４０分間次いで４２°Ｃで９０秒間次
いでＯｏＣで５分間静置したのち、し−ブロス培地（組
成：バクトトリブトン１％、酵母抽出物０．５％、塩化
ナトリウム０．５％、グルコース０．１％）５００ａ＋
！を加えて３７°Ｃで１時間静置した。この培養液の１
部を採り、アンピシリン５０ｐｇ／ｐｇ、　０．１ｍＭ
　ＩＰＴＧ、　０．００４％Ｘ−ｇａｌを含むＬ−寒天
プレー）　（Ｌ−ブロス＋１．５％寒天）に塗布し、３
７°Ｃで１６時間培養してアンピシリン耐性でかつβ−
ガラクトシダーゼ活性を保持しない白色コロニー２００
個が得られた。このコロニーに対して常法（Ｍｅｔｏｈ
ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８．３７９（１９７９）　）
に従ってプローブＡ及びＢを用いたコロニーハイブリダ
イゼーションを行って１個のポジティブクローンを得た
。このクローンからプラスミドを抽出し、ｐＫＡ５２と
した。

ｐＫＡ５２を種々の制限酵素で切断してサザンハイブリ
ダイゼーションで解析した所、ミコバクテリウム・カン
サシ由来のα抗原遺伝子は２．０ＫｂＦＩｉｎｃＩ！断
片上に存在すると推測された。そこで、この断片を単離
・精製し、ｐＵｃ１８のｔｌｉｎｃＩＩサイトにサブク
ローニング（プラスξドｐＫＡＨ２０）Ｌ、ジデオキシ
法による塩基配列決定法（Ｐｒｏ、　Ｎ、　Ａ。

Ｓ、ＵＳＡ、　７４．５４６３　（１９７７））により
塩基配列を決定し、ミコバクテリウム・カンサシの培養
液より精製したα抗原のＮ末端アミノ酸配列に対応する
塩基配列の存在を確認した。第１図に全塩基配列とそれ
より演鐸されるアミノ酸配列を示し、予測されるプロモ
ーター配列を−３５、−１０と記した。

■大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の調
製 第３図に示すようにプラスミドルＵ　Ｃ１８（１０ｐｇ
）をＡｐａＬ　Ｉで切断して生ずる１、２ＫｂのＡｐａ
Ｌ　Ｉ断片を上述したＤＢ　−８１ペーパー法及びフェ
ノール・クロロホルム処理、エタノール沈澱にて単離・
精製し、ＴＥ２０ａｆｆｉに溶解した。一方、β−ラク
タマーゼのＴｈｒ４〜ＡＩａ′７に対応し、ＡｐａＬ　
Ｉサイトと旧ｎｃＩＩサイトをつなぐアダプターを構成
するオリゴヌクレオチド： ５’　ＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴ
ＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧ３’５’　ＴＧＣ
ＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴ
ＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴ３’２種をそれぞれ自
動ＤＮＡ合或合成装置国、アプライドバイオシステムズ
社、３７０Ａ型）で台底した。

ジメトキシトリチル基以外の保護基を除去し、逆相中圧
カラムクロマトグラフィー（条件：　Ｃ−１８−シリカ
ゲルカラムを用い、移動相として１００ｍＭ　）リエチ
ルアミンアセテートバッファ−（ｐＨ７，０）　中、ア
セトニトリルからなる濃度勾配液を用いる）で精製した
。次いで、８０％酢酸でジメトキシトリチル基を除去し
た後、逆相１１ＰＬｃ（条件二ＹＭＣＰＡＣＫ　ＡＭ−
３１４００５カラムを用い、移動相として１００ｍＭ　
）リエチルアミンアセテートバッファ−（ｐＨ７，０）
中、アセトニトリルからなる濃度勾配液を用いる）で精
製し凍結乾燥した。かくして得られた２種の合成オリゴ
ヌクレオチドをそれぞれ２５０ｐｍｏｌずつ採り、キナ
ーゼ反応バッファー（５０ｍＭ　）リスー塩酸バッフｙ
　　　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１
０１ジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ）中、１５単位
のポリヌクレオチドキナーゼを用いて３７°Ｃで１時間
反応させた。それぞれの反応混合物から５０ｐｍｏｌず
つを混合し、７０°Ｃで５分間加熱した後徐冷すること
によりアニーリングさせて、塩基配列５’　−ＡＡＣＧ
ＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧ
ＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧ−３’３”−ＴＴＧＣＧＡＣＣＡ
ＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＴＣ
ＡＡＣＣＣＡＣＧＴ−５’からなるオリゴヌクレオチド
アダプターを得た。

このアニーリング混合物約４０ｐｍｏｌと上記１．２　
ＫｂＡｐａＬ　Ｉ断片溶液２　ｐｌ！　（０，５μｇ）
とｐＵｃｌＢの旧ｎｃＩＩ切断物約０．１μｇを■で述
べたと同様にしてＤＮＡライゲーションキットにて連結
し、プラスミドｐＵＣＬＡＣ−１を得た。このプラスミ
ド１０ｐｇをＨｉｎｃＩＩで切断して生ずる１、３Ｋｂ
のＨｉｎｃｌｌ断片を同様に単離・精製しフェノール・
クロロホルム処理、エタノール沈澱後、ＴＥ２０μｅに
溶解し、β−ラクタマーゼ遺伝子断片を得た（Ｔｈｒ’
より下流の構造遺伝子を含む）。

■ミコバクテリウム・カンサシ由来α抗原分泌発現ベク
ターの構築 大腸菌−抗酸菌シャトルベクターｐｌＪ６６６ｐＡ　Ｌ
５０００　（５ｐｇ）を制限酵素Ｋｐｎｌで消化し、６
５’Ｃ５分間熱処理して酵素を失活させた後、エタノー
ル沈澱を行った。沈澱を乾燥後、５０ｍＭ　）　＋Ｊス
・塩酸バッファー（ｐＨ８，５）　１９２μｅに溶解し
、アルカリホスファターゼ（Ｅ、　’ｃｏｌｔ　Ｃ−７
５）　　４　ａｅ　（２Ｕ）を加えて６５°Ｃで一時間
静置する。さらにアルカリホスファターゼ４μｅを加え
一時間静置後、フェノール、クロロホルム処理、エタノ
ール沈澱し、ＴＥ２０ａｌｌに溶解してベクター溶液と
した。一方、■で調製したプラスミドｐＫＡＨ２０由来
の２．ＯＫｂ　Ｈｉｎｃ■断片の両側にＫｐｎｌリンカ
−（宝酒造製）をライゲーションした後、Ｋｐｎｌで切
断して得られる２、ＯＫｂのＫｐｎｌ断片を調製し、そ
の０．２　＃ｇと上述のベクター溶液１ａｇ（０，１ａ
ｇ）をＤＮＡライゲージジンキットを用いて連結し、ミ
コバクテリウム・カンサシ由来のα抗原の分泌発現ベク
ターｐＩＪＫ−１を得た。このベクターの構築を第２図
に示した。

■大腸菌由来β−ラクタマーゼ分泌発現ベクターの構築 既にクローニングした、ＢＣＧ菌の分泌型抗原タンパク
質ＭＰＢ７０の遺伝子（ＦＥＭＳ旧ｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｌｅｔｔ、、　２７３−２７６（１９８９））を含む３
．６Ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ断片をＳｍａｌで切断して生ずる
０、８Ｋｂ　ＳｍａＩ断片に、プロモーター及びシグナ
ルペプチドをコードする領域が含まれるので、この断片
を上述したＤＥ−８１ペーパー法で精製し、その０．３
μｇとｐＵｃｌＢのＳｍａ■切断物０．１　ｐｇとをＤ
ＮＡライゲーションキットにより連結したＬ　Ｈ，ｃｏ
ｌｉ　ＪＭ１０９コンピテントセルに形質転換し、形質
転換体から組み換えプラス藁ドを調製することにより０
．８Ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ断片をサブクローニングしたプラ
スミドを得、ｐ　Ｓ　ｍａ８００と名付けた（第３図参
照）。このプラスミド５μｇを制限酵素ＮｏｔＩとＨｉ
ｎｃ　ＩＩで切断し、３．４にｂのＮｏｔｌ−Ｈｉｎｃ
ｌｌ断片をＤＨ−８１ペーパー法にて精製した。

この断片にはＭＰＢ７０のプロモーター及びシグナルペ
プチド３０アミノ酸のうちの、２９ア稟ノ酸をコードす
る領域が含まれ、シグナルペプチドの残り１アミノ酸残
基に対応する遺伝子を欠いていた（第３図）。

次に、■で調製したβ−ラクタマーゼの構造遺伝子のう
ち、Ｔｈｒ’より下流の配列を含んでいる１、３Ｋｂ旧
ｎｃＩＩ断片をＭＰＢ７０のシグナルペプチドの下流に
連結するため、シグナルペプチドのＣ末端のＡｌａとβ
−ラクタマーゼのＨｉｓ’＝Ｃ１ｕ３に対応する配列を
補い、Ｎｏｔ　Ｉサイトと旧ｎｃＩ［サイトを連結しう
るアダプターを調製した。即ち、オリゴヌクレオチド： ５’　−ＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡ−３′及び５
′−ＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＣ−３”の２種のオリゴヌク
レオチドを■と全く同様にして合成・精製及びキナーゼ
反応・アニーリングを行い、塩基配列 ５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡ−３’３’　−
ＣＧＴＧＴＧＧＧＴＣＴ−５’からなるアダプターを得
た。このアダプター約４０ｐｍｏｌと上記３．４Ｋｂ　
Ｎｏｔ　Ｉ　−１（ｉｎｃ　Ｕ断片０．１ｐｇと１．３
Ｋｂ　ＨｉｎｃＩ［断片０　、３　ｐｇをＤＮＡライゲ
ーションキットにより連結し、ＭＰＢ７０のシグナルペ
プチドの直後にβ−ラクタマーゼの完全な構造遺伝子が
連結されたプラスミドｐＬＡｃ７０を得た（第３図）。

ｐＬ　Ａ　Ｃ７Ｃ７０（２０ｐをＳｍａｌと旧ｎｃＩＩ
で完全消化して生ずる２、ＩＫｂ　Ｓｍａ　Ｉ　−Ｈ１
ｎｃＩＩ断片をＤＥ−８１ペーパー法で単離・精製し、
その０．３μｇを■と同様にＫｐｎｌリンカ−とをライ
ゲーションにより連結した後、ＫｐｎＩで切断して末端
をＫｐｎＩサイトとした２、　ＩＫｂの断片を■で調製
したｐ　Ｉ　Ｊ　６６６−ｐＡ　Ｌ５０００をＫｐｎＩ
で切断後、脱リン酸処理したベクター０．１μｇとＤＮ
Ａライゲーションキットを用いて連結し、大腸菌由来の
β−ラクタマーゼの分泌発現ベクターｐｌＪＬＡｃ７０
を得たく第３図）。

実施例２異種遺伝子のＢＣＧ菌からの分泌発現のミコバ
クテリウム・カンサシ由来α抗原のＢＣＧ菌からの分泌
発現 ミコバクテリウム・ボビスＢＣＧ東京株をアルブミン・
デキストロースコンプレックスと０．０５％Ｔｗｅｅｎ
８０を含むＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ　７　Ｈ９培地（以
下７Ｈ９培地と略記）　（Ｄｉｆｃｏ製）８ｄ中中子７
Ｃで振盪培養した。０Ｄｓｑ。が０．１に達した時点で
遠心分離により集菌し、エレクトロポレーションバッフ
ァー（７ｍＭリン酸ナトリウム／２７２ｍＭ　　マニト
ールｐＨ７，２，０、５％Ｔｗｅｅｎ８０）　　０．８
　ｒｄに懸濁した。このＢＣＧ菌溶液溶液施例１■で調
製したα抗原分泌発現ベクターｐＩＪＫ−１（Ｉμｇ）
を加え、エレクトロポレーションキュベツトに入れＯ′
Ｃで１０分間静置したのち、５００μ秒、電場強度７．
０ＯＯＶ／ｃｍの矩形波で、エレクト・ロボレーション
を行った（品性製作所製、電気的細胞融合装置５ＳＨ−
１型を使用）。

エレクトロポレーション後、Ｃｅ１ｌをＯ′Ｃで１０分
間静置し、７Ｈ９培地０．８蔵を加えて３７°Ｃで２時
間静置した。これを１０ｐｇ／ｄのカナマイシンを含む
７ＨＩＯ寒天（Ｄｉｆｃｏ製）プレートに塗布し、３７
°Ｃで３０日間培養したところ１００コロニー／ｐｇＤ
ＮＡの形質転換体が得られた。

形質転換体をソートン培地５Ｍ！（１０！１ｇ／ｄのカ
ナマイシンを含有）中、３７゛Ｃで２１日間静置培養し
た後、ξリボワフィルター（０，４５即）により菌体を
除去した培養上清１成を採取し、１０％トリクロロ酢酸
水溶液１成を加えてＯ″Ｃで２０分間静置した。

１２．０００回転で１０分間遠心分離し、沈澱した蛋白
を冷アセトンで洗浄したのち減圧乾燥した。この沈澱を
５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバ
ララフ　　　（６０ｍＭ　）リス、２％ＳＤＳ、５％２
−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０、１
％ブロモフェノールブルー〕２０ｐｅ中で９５°Ｃ５分
間加熱することによって溶解し、レムリの方法（Ｎａｔ
ｕｒｅ　２２７．６８０（１９７０）　）に従った、５
ＯＳ−ポリアクリルアミド平板ゲル電気泳動法と、ウェ
スタンプロット法により解析した。得られた結果を第４
図に示す。図中、レーン１はα−抗原、レーン２はｐｌ
ＪＫ−１／ＢＣＧ菌、そしてレーン３はｐｒＪ６６６−
ｐＡ　Ｌ５０００／Ｂ　ＣＧ菌の各培養上清について得
られたものである。また、図に現われている３０　Ｋ　
Ｄａ付近のバンドはごコバクテリウム・カンサシ由来の
α抗原である。α−Ｔ　（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ由来の精製α抗原）で吸収した抗α−Ｋ　（Ｍ、Ｋ
ａｎｓａｓｉｉ由来の精製α抗原）抗体を用いたウェス
タンプロット分析においてｐ　Ｉ　Ｊ　６６６−ｐＡ　
Ｌ５０００を取得するＢＣＧ菌ではポジティブバンドが
見られないのに対しく第４図、レーン３）ｐｌＪＫ−１
を取得するＢＣＧ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂ
ｏｖｉｓＢＣＧ　Ｔｏｋｙ。

（ｐｌＪＫ−１））では、精製α−に抗原とほぼ同じ分
子量の位置に軍ジティブバンドが認められ（第４図、レ
ーン２）ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原がＢ
ＣＧ菌から分泌発現していることがわかった。

■大腸菌由来β−ラクタマーゼ遺伝子のＢＣＧ菌からの
分泌発現 ■と同様に実施例１■で構築したβ−ラクタマーゼ分泌
用ベクターｐｌＪＬＡｃ７０１μｇを用いてＢＣＧ菌に
エレクトロポレーションで形質転換した。得られたカナ
マイシン耐性の形質転換体をソートン培地５０ｄ中、３
７℃で２１日間培養後、菌体をミリボワフィルター（０
，４５ｎ）で除いた。培養上清に硫酸アンモニウム２８
．０５ｇをゆっくりと撹拌しながら加えて溶解し、４°
Ｃで一晩静置した。次いで、沈澱した蛋白を遠心分離し
、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐ）１７．０
）　　５　ｄに溶解したのち、同じバッファーに透析し
て脱塩を行い、粗酵素液を調製した。

この粗酵素液の一部を用いてベンジルペニシリンの分解
反応を行い、２４０ｎｍの吸光度の減少によってβ−ラ
クタマーゼ活性を測定した所、同様にしてｐ　Ｉ　Ｊ６
６６−ｐＡ　Ｌ５０００を保持するＢＣＧ閑の培養液か
ら調製した粗酵素液では活性がほとんどないのに対して
ｐ　Ｉ　Ｊ　１ａｃ７０の方では高いβ−ラクタマーゼ
活性があることがわかった。そこで、粗酵素液１成を■
と同様にトリクロロ酢酸沈澱して蛋白を回収し、５Ｏ５
−ポリアクリルア旦ドゲル電気泳動を行った所、β−ラ
クタマーゼの理論分子量２９．０００の位置に顕著なバ
ンドが認められ、大腸菌由来β−ラクタマーゼがＢＣＧ
菌から分泌発現していることがわかった。

実施例３異種遺伝子（融合蛋白質）のＢＣＧ菌からの分
泌発現 ■ミコバクテリウム・カンサシ由来α抗原−ＨＩＶ−１
ｇａｇ抗原のＢ細胞エピトープ融合蛋白質の分泌ベクタ
ー構築 まず、旧ｖ−１（エイズの原因ウィルス）のｇａｇ抗原
のｐｌ？蛋白質のＢ細胞エピトープのうち、ケごコン社
製抗ＨＩＶ−１ｐ１７モノクローナル抗体によって認識
されるエピトープの８アミノ酸Ｇｌｕ′２−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−ＩｌｅＩ
９をコードし、かつミコバクテリウム・カンサシ由来α
抗原のＡｌａ”’〜Ａ　１ｇ２１１５の部分をコードす
る配列を含み、末端にＰｓｔＩ及び旧ｎｄＩ［Ｉサイト
と同じ粘着末端を持つＤＮＡ断片を台底した。即ち、５
’　−ＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧ
ＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＣ−ＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣ
ＣＧＣＴＧＡ−３’　（４９ｍｅｒ）及び５’　−ＡＧ
ＣＴＴＣＡＧＣＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＣＧＡ
ＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＣＣ
ＣＴＧＣＡ−３’　（５７ｍｅｒ）の２種のオリゴヌク
レオチドを実施例１−■と同様にして台底・精製及びキ
ナーゼ反応、アニーリングを行い、目的のＤＮＡ断片を
台底した（第５図参照）。

次に、ミコバクテリウム・カンサシ由来α抗原遺伝子を
含む上述のｐＫＡＴ−１２０（５ｐｇ）をＰｓｔｌとＨ
ｔｎｄＩ［Ｉで完全に消化して得られる４、　ＯＫｂの
Ｐｓｔｌ−ＨｉｎｄＩＩｌ断片をＤＢ−８１ペーパー法
で精製し、その０．１μｇと上記ＨＩＶ−１のエピトー
プに対応するＤＮＡ断片Ｑ、ｌｐｍｏｌをＤＮＡライゲ
ーションキットにより連結した。これをＥ、ｃｏｌｉ　
ＪＭ１０９コンピテントセルに形質転換し、形質転換体
から組み換えプラスミドを調製することにより、ミコバ
クテリウム・カンサシ由来α抗原のＧｌｎ”’とＡｌａ
”’の間にＨＩＶ−１ｇａｇ抗原ｐｌ？蛋白質のＢ細胞
エピトープ８アミノ酸、即ちＧｌｕ　−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ａｒｇ−Ｔｒｐ　−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ｉ　ｌｅが
挿入された融合蛋白質の遺伝子を有するプラスミドｐＫ
ＡＨ２１を得た（第５図）。

このプラスミドの旧ｎｄＩ［完全消化物０．１ｐｇと、
実施例１−■と同様に台底・精製及びキナーゼ反応、ア
ニーリングを行って調製した下記の塩基配列５’　−Ａ
ＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡ−３’３’−ＡＣＣＡＴＧＧＴ
ＴＣＧＡ−５’を有する化学合成Ｋｐｎｌリンカー０．
１ｐｍｏｌをＤＮＡライゲーションキットにより連結し
、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９コンピテントセルに形質転
換した。得られた形質転換体から調製した組み換えプラ
スミド１０μｇをＫｐｎＩで完全に切断して生じる１、
　４　ＫｂのＫｐｎｌ断片をＤＥ−８１ペーパー法にて
精製し、ＴＥ２０μｅに熔解して、融合蛋白質遺伝子断
片溶液とした。

一方、大腸菌・抗酸菌シャトルベクターｐＩＪ６６６−
ｐＡ　Ｌ５０００　（５μｇ）を制限酵素Ｋｐｎｌで完
全に消化した後、脱リン酸処理した上述のベクター溶液
０．１．ｇと上記融合蛋白質遺伝子断片溶液１μｅをＤ
ＮＡライゲーションキットを用いて反応させ、ミコバク
テリウム・カンサシ由来α抗原−ＨＩＶ−１ｇａｇ抗原
ｐ１７蛋白質のＢ細胞エピトープ融合蛋白質の分泌ベク
ターｐ　Ｉ　Ｊ　Ｋ　ＨＩＶ−１を得た（第５図参照）
。

■ξミコバクテリウムカンサシ由来α抗原−ＨＩＶ−１
　ｇａｇ抗原のＢ細胞エピトープ融合蛋白質の分泌発現 実施例２−のと全く同様にして、上記ｐｌＪＫ）ＩＩＶ
−１でＢＣＧ菌東京株を形質転換し、形質転換体ＢＣＧ
１８ＨＩＶ　（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉ
ｓ　ＢＣＧ　Ｔｏｋｙ。

（ｐＩＪＫ　ＨＩＶ−１））を得た。

この形質転換体をソートン培地１００ｄ　（１０μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有）中、３７°Ｃで２８日間静
置培養した後、遠心により菌体を除去した培養上清に硫
酸アンモニウム５６．１ｇをゆっくりと撹拌しながら加
えて溶解し、４°Ｃで一晩静置した。次いで、沈澱した
蛋白を遠心分離し、１００ｍＭリン酸カリウムバッファ
ー（ｐＨ７，０）　５　ｍｌにン容解した。その１　ｍ
ｌｌを採取し、１０％トリクロロ酢酸水溶液１−を加え
てＯ′Ｃで２０分間静置したのち、１２０００回転で１
０分間遠心分離し、沈澱した蛋白を冷アセトンで洗浄し
たのち減圧乾燥した。

この沈澱を実施例２−■と同様にして５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法とウェスタンプロット法によ
り解析した。得られた結果を第６図に示す。図中、レー
ン１，５はミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原、
レーン２．６はベクターｐ　Ｉ　Ｊ　６６６−ｐＡ　Ｌ
５０００を有するＢＣＧ菌、レーン３．７はベクターｐ
ＩＪＫ−１を有するＢＣＧ菌、レーン４．８はへ’）　
タールＩ　Ｊ　Ｋ　）ＩＩＶ−１を含有するＢＣＧ菌（
ＢＣＧ１８ＨＩＶ）の各培養上清について得られたもの
で、レーン１〜４は、抗α−に吸収抗体（抗ミコバクテ
リウム・カンサシ由来のα抗原に対する抗体の略称）を
、レーン５〜８は抗ＩＨＶ−１ｐｌ？モノクローナル抗
体（ケ稟コン社製）を−次抗体として用いたウェスタン
プロットの図である。

抗α−に吸収抗体を用いた場合、ネガティブコントロー
ルのｐ　Ｉ　Ｊ　６６６−ｐＡ　Ｌ５０００／　Ｂ　Ｃ
Ｇ菌ではポジティブバンドが見られないのに対しｐｌＪ
Ｋ、１／ＢＣＧ菌及びｐ　Ｉ　Ｊ　Ｋ　ＨＩＶ４／Ｂ　
ＣＧ菌ではポジティブなバンドが認められた（レーン３
．４）。

一方、抗開Ｖ−Ｉ　Ｐ１７モノクローナル抗体を用いた
場合、ｐ　Ｉ　Ｊ　Ｋ　ＨＩＶ−１／Ｂ　ＣＧ菌のみに
α−にとほぼ同じ分子量の位置にポジティブバンドが認
められ（レーン８）、ミコバクテリウム・カンサシ由来
α抗原とＨＩＶ−１ｇａｇ抗原ｐ１７蛋白質のＢ細胞エ
ピトープの融合蛋白質がＢＣＧ菌から分泌発現している
ことがわかった。このＢＣＧ形質転換体はＡＩＤＳワク
チンとしての使用が可能である。

〔発明の効果〕

本発明により提供される抗酸菌分泌発現ベクターは、エ
イズ、マラリア、らいなどの難病の原因となる種々のウ
ィルスや病原性細菌・原虫の抗原性ポリペプチドをマチ
ュアーな形で或いは融合蛋白としてＢＣＧ菌から分泌発
現させることによる遺伝子組み換えワクチンの開発に利
用することができる。それからまた、将来、ＢＣＧ菌由
来の抗原蛋白の中で、結核菌感染に対する主たる防御抗
原として働いている蛋白質が発見されれば、この蛋白質
遺伝子を分泌ベクターに組み込み、ＢＣＧ菌、に導入す
ることによってワクチン効果の増強されたＢＣＧワクチ
ンの開発が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ミコバクテリウム・カンサシのα抗原遺伝子
の塩基配列と推定されるアミノ酸配列を示し、線で囲っ
た部分がシグナルペプチドの領域である。第２図はミコ
バクテリウム・カンサシのα抗原の分泌発現ベクターｐ
ｌＪＫ−１の構築を示す図である。第３図は大腸菌β−
ラクタマーゼの分泌発現ベクターｐＩＪＬＡｃ７０の構
築を示す図である。第４図は、ごコバクテリウム・カン
サシ由来のα抗原の分泌を確認するウェスタンプロット
法での分析データーである。第５図は融合ポリペプチド
である旦コバクテリウム・カンサシ由来α抗原−ＨＩＶ
−１ｇａｇ抗原ｐ１７蛋白質のＢ細胞エピトープの分泌
発現ベクターｐｌ　ＪＫ　ＩＩＩＶ−１の構築を示す。 第６図は融合ポリペプチドであるミコバクテリウム・カ
ンサシ由来α抗原−ＨＩＶ−１ｇａｇ抗原ｐ１７蛋白質
のＢ細胞エピトープが分泌されていることを確認するウ
ェスタンプロット分析の結果である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロモーター配列、シグナルペプチドをコードす
   るＤＮＡ塩基配列及び異種ポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ塩基配列とが連結されたＤＮＡ塩基配列を有し、か
   つ抗酸菌において複製可能ならしめる複製開始領域を含
   むことを特徴とする抗酸菌において発現するベクター
2. （２）プロモーター配列及びシグナルペプチドが抗酸菌
   由来のものである請求項（１）記載のベクター
3. （３）請求項（１）又は（２）記載のベクターで形質転
   換した形質転換体
4. （４）宿主がミコバクテリウム・ボビスＢＣＧであるこ
   とを特徴とする請求項（３）記載の形質転換体
5. （５）ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原を分泌
   発現する請求項（４）記載の形質転換体
6. （６）大腸菌由来のβ−ラクタマーゼを分泌発現する請
   求項（４）記載の形質転換体
7. （７）ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原とヒト
   免疫不全ウィルス１型（以下ＨＩＶ−１と略する）ｇａ
   ｇ抗原ｐ１７蛋白質のＢ細胞エピトープの融合蛋白を分
   泌発現する請求項（４）記載の形質転換体
8. （８）融合蛋白がミコバクテリウム・カンサシ由来α抗
   原の２７９番目のＧｌｎと２８０番目のＡｌａの位置の
   間にＨＩＶ−１ｇａｇ抗原のｐ１７蛋白質のＢ細胞エピ
   トープに対応するアミノ酸配列であるＧｌｕ−Ｌｅｕ−
   Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅが挿
   入されている請求項（７）記載の形質転換体
9. （９）宿主がミコバクテリウム・スメグマティスである
   ことを特徴とする請求項（３）記載の形質転換体
10. （１０）ミコバクテリウム・ボビスＢＣＧ由来のα抗原
    を分泌発現する請求項（９）記載の形質転換体
11. （１１）請求項（３）記載の形質転換体を含有するワク
    チン
12. （１２）形質転換体の宿主がミコバクテリウム・ボビス
    ＢＣＧであり、分泌発現する蛋白がエイズウィルスのコ
    ア蛋白又はミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原で
    ある請求項（１１）記載のワクチン