JPH04182498A - ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
「産業上の利用分野」
本発明はヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ変換体として新規なポリペプ
チドを提供することに係り、ポリペプチド自身、それを
含む医薬組成物、その製造方法、その遺伝子組換えＤＮ
Ａ及びプラスミド、形質転換微生物細胞などに関する。 「従来の技術」 ＴＮＦ （腫瘍壊死因子）は、１９７５年にＣａｒｓｗ
ｅｌｌらにより、予めＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔ
ｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）に感染され、エンドトキ
シンで処理したマウスの血清中に存在することか見出さ
れた生理活性物質であり（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７２３６６６（１９７５
）） 、１９８４年にＰｅｎｎ１ｃａらにより、ヒトＴ
ＮＦのｃＤＮＡをクローニングしヒトＴＮＦ蛋白質の全
−次構造（アミノ酸配列）か明らかにされた（Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１２．７２４ （１９８４）） 。ＴＮＦは腫
瘍細胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対する出血性
壊死、増殖の抑制なと特異的な抗腫瘍作用を有するか、
最近では高脂血症、血圧低下、発熱などの副作用も生じ
うろことか報告されており、薬効、副作用なとでより優
れたものを見出すべく研究、開発かなされている。例え
は特開昭６１−４０２２１、同６３−１１９６９２ 、
特開平１−２７７４８８各号公報では遺伝子操作技術に
よりヒトＴＮＦ蛋白質中の特定のアミノ酸を欠失したり
、他のアミノ酸に置換したり或は付加したりしてヒトＴ
ＮＦ蛋白質を提供している。 「発明の開示」 本発明者らはヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸配列において
２９番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換したところ
、抗腫瘍活性か高く、副作用の低い文献未記載のヒトＴ
ＮＦ変換体ポリペプチドが得られることを見出し、その
知見に基いて発明を完成した。 本発明は、配列表配列番号ｌで示した１番目のＳｅｒか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列に
おいて２９番目のＡｒｇか他のアミノ酸により置換され
た配列を有するポリペプチドに係る。また当該ポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、この
組換えプラスミドにより形質転換された微生物細胞、こ
の微生物細胞によるポリペプチドの製造方法、医薬組成
物、前記アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンの結合した
ポリペプチド並びに配列表配列番号２で示した１番目の
Ｔから４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列におい
て８５〜８７番目のＡｒｇをコードするＣＧＣを他のア
ミノ酸をコードするコドンにより置換された配列を有す
るＤＮＡにも係る。 本明細書全般を通じてアミノ酸、ポリペプチド、塩基、
それらの配列を表わすとき下記のリストのものを用いる
。 アミノ酸： 塩基： また本明細書で使用した略号は次のとおり意味する。 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸（Ｄｅｏｘｙ
ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）Ｓ
Ｄ Ｓ ： Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ５ｕｌｆ
ａｔｅＢ Ｐ Ｂ ： Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌ
ｕｅ（ブロモフェノールブルー） ＤＴＴ ニジチオスレイトール（Ｄｉ ｔｈｉｏｔｈｒ
ｅｉｔｏｌ）ＰＭＳ Ｆ ： Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙ
ｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ＦｌｕｏｒｉｄｅＣＰＧ樹脂：
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ樹脂本発
明において２９番目のＡｒｇを置換する他のアミノ酸と
してはＡ＋Ａ’ａ、 Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、 Ｇｉｕ、
Ｐｈｅ。 Ｇｌｙ、 Ｈｉｓ、 （βｅ、 Ｌｙｓ、 Ｌｅｕ、
Ｍｅｔ、 Ａｓｎ、 Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、 Ｓｅｒ、 Ｔ
ｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ又はＴｙｒか挙げられるか、Ｇｌ
ｎ、 Ｓｅｔ、 Ｐｒｏ、 Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、、Ｈｉ
ｓ、 Ｖａｌ又はＬｅｕか望ましい。 次に本発明についてその実施態様を詳しく記載するか、
本発明に係る遺伝子操作技術については多くの文献によ
り記載されている方法や手段を適宜調整し乍ら適用する
。その文献を参考までに以下に列挙する。 Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、（１９８２）：
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 Ｒ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ。 （１９８３）：λ（ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、 １００及び＋０１、Ｒ，Ｗｕ ｅｔ ａ
ｌ、 （１９８７）： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ。 １５３、 １５４及び１５５ 本発明のポリペプチドは種々の方法、手段、機械を用い
て製造することかできるか、代表的な製造方法を下記す
る。 （１） ヒトＴＮＦ遺伝子の取得 ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述の
とおり、Ｐｅｎｎ１ｃａらにより明らかにされており、
その塩基配列を適宜変更してヒトＴＮＦ遺伝子を配列表
配列番号３のようにデサインする。 その際、宿主細胞（大腸菌なと）に適したコドンを選択
するのか望ましく、また後述のＤＮＡ断片の連結による
クローン化並びに変換体作製のための遺伝子改変か容易
に実施できるように適当な位置に適当な制限酵素切断部
位を配置するのか望ましい。勿論ヒトＴＮＦ遺伝子の上
流には翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、下流には翻訳終止
コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）をそれぞれ読み取
り枠に合致させるように設置する必要かあり、また翻訳
開始コドンの上流並びに翻訳終止コドンの下流にそれぞ
れ適当な制限酵素切断部位を設置してベクターへの適用
性、クローン化の簡便性を図るのか好ましい。 ヒトＴＮＦ遺伝子は玉鎖・下鏡それぞれについて幾つか
のオリゴヌクレオチドに分けて化学合成し、ブロックご
とに順次適切に連結する方法により作製できる。例えば
配列表配列番号３及び同４においては、ヒ）ＴＮＦ遺伝
子の各鎖を約５０塩基程度ずつ１０本のオリゴヌクレオ
チドに分け、合計２０本化学合成する。その合成方法と
してはジエステル法（Ｈ，Ｇ、 Ｋｈｏｒａｎａ、”Ｓ
ｏｍｅ ＲｅｃｅｎｔＤｅｖｅｌｏｐｒｎｅｎｔｓ ｉ
ｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
Ｅｓｔｅｒｓｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｎｔｅｒ
ｅｓじ、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ５ｏｎｓ。 Ｉｎｃ、、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６１））、ｌ・ジ
エステル法ｆ：Ｒ，Ｌ。 Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｔ、 Ｊ、 Ａｍ、
Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、、 ８９． ４８０１（
１，９６７））及びホスファイ１〜法〔八１． Ｄ、
Ｍａｔｔｅｕｃｃｉｅｔ ａｌ、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ、、 ２１．７１９ （１９８０））か
挙げられるか、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホスファイ
ト法か操作性などから好んで用いられる。 合成されたオリゴヌクレオチドは例えば逆相クロマトカ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリ
ルアミドゲルを用いた電気泳動なとの通常の精製方法に
より精製される。その後、オリゴヌクレオチドは例えば
Ｔ４ポリヌクレオチ１〜キナーセを用いてリン酸化し、
アニール化した後Ｔ４ＤＮＡリガーセを用いて連結する
。ここではオリゴヌクレオチドを幾つかのブロックに分
け、所望のヒトＴＮＦ遺伝子配列か得られるように順次
連結し、制限酵素て切断又はＴ４ＤＮＡポリメラーセに
よる平滑化後、電気泳動なとにより精製する。得られた
ＤＮＡ断片について例えはｐＵｃ８、同９、同１８、同
１９ （Ｊ、 Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎ
ｅ。 １９、２５９ （１９８２））のようなプラスミドベク
ターに組み込み、常法によりコンピテントセルを形質転
換してクローン化する。得られたクローンより公知の方
法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ベクターに
挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列が目的の遺伝子配列を
達成したか否かを点検する。達成できたヒトＴＮＦ遺伝
子の各部分について、それぞれを含むプラスミドベクタ
ーより制限酵素を用いて切り出し、再度前記ベクターに
連結後組み込み、クローニングすることにより目的の完
全長のヒトＴＮＦ遺伝子を有するプラスミドベクターを
得る。かくして得られたプラスミドベクターを制限酵素
で切断後、ゲル電気泳動法によって分離精製することに
より所望のヒトＴＮＦ遺伝子を得ることかできる。 一方、前述の方法に対してはＴＮＦを発現しているヒト
細胞由来のｍＲＮＡよりヒトＴＮＦをコードするｃＤＮ
Ａを作製し、そのｃＤＮＡを使用する方法を適宜組合せ
てもよい。 （２） ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築前記（１）で
得られたヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ遺伝子は適切に発現ベクター
に挿入してヒトＴＮＦ発現ベクターを構築する。発現ベ
クターは翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流に転写プロモ
ーター領域並びに翻訳シグナルであるＳＤ（シャイン・
ダルガーノ）配列を有し、翻訳終止コドン（ＴＡＡ、Ｔ
ＧＡ又はＴＡＧ）の下流に転写ターミネータ−領域を有
する必要がある。また、転写プロモーターとしては、ｔ
ｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモ
ーター、ＰＬプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、Ａ
ＤＣｌプロモーターなどが使用でき、転写ターミネータ
−としては、ｔｒｐターミネータ−１ｒｒｎＢターミネ
ータ−１ＡＤＣ［ターミネータ−などか使用できる。こ
のような発現ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア） 、ｐＰＬ−１ａｍｂｄａ （同左）など
の市販品の中から容易に入手できるがこれらを改良して
発現性或は取扱性をより高度化したものを使用してもよ
い。 （３） ヒトＴＮＦ変換体発現ベクターの構築ヒトＴ
ＮＦ変換体ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製方法
としては例えば次の方法が挙げられる。 （ｉ）前記（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得で記載した方
法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレオチドを適切
に連結することにより作製する。この方法によればアミ
ノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加又は欠失の改変は
自在である。 （ｉｉ）前記（１）で作製したヒトＴＮＦ遺伝子を適当
な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を除去した後
、変異を導入した塩基配列を有する合成オリゴヌクレオ
チド（例：上下鏡をアニール化して連結した二本鎖ＤＮ
Ａ断片）又は適当な他の遺伝子を組み込む。この方法に
よって前記（ｉ）の場合と同様、改変を自在に行なうこ
とかできる。−（ｉｉ）変異を導入した塩基配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＤＮ
Ａ鎖を延長することにより、変換体ポリペプチド遺伝子
を作製する（部具特異的変異法（Ｔ、 Ａ、 Ｋｕｎｋ
ｅｌｅｔ ａｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、 １５４．３６７ （１９８７）〕）。こ
の方法は１０塩基対を越える比較的長いＤＮＡ鎖の付加
及び挿入には適用し難いが、その他の改変は前記（ｉ）
の場合と同様に行うことができる。特に任意のアミノ酸
を置換することに適している。 本発明では（ｉｉ）の部位特異的変異法か好適であるの
で、以下これを中心に説明する。 先ず部位特異的変異法を行なうにあたり、鋳型ＤＮＡを
作成する。前記（１）で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を、
Ｍｅｓｓｉｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ。 １５３ 、３ （１９８７））によって開発された一重
鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクター（ｐｔＪ
ｃ１１８、ｐＵｃ１１９など）に連結し、大腸菌株に導
入する。得られた形質転換体の中より目的のプラスミド
を有するクローンを選択する。 このプラスミドをｄｕｔ−及びｕｎｇ−変異大腸菌株（
ＣＪ２３６株など）に導入し、遺伝子内にウラシルを取
り込ませ、大腸菌株にＭ１３ＫＯ７なとの変異型へルバ
ーファージを感染させて目的の一重鎖プラスミドＤＮＡ
を取得する。 一方、本発明に係る変換導入部位及びその前後の塩基配
列を存する約１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチド・ブ
ライマーを化学合成する。このブライマーと前述の工程
で得られるウラシル導入−重鎖ブラスミドＤＮＡとをア
ニール化した後、例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて、二本鎖化する。鋳型である
ウラシルを含むＤＮＡ鎖を不活性化し変異導入頻度を高
めるために、二本鎖となったプラスミドをυｎ ｇ ＋
の大腸菌株に導入する。前述のブライマーをプローブと
して用いコロニー・ハイブリダイゼ゛−ジョンを行ない
、目的の変換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む
プラスミドを有するクローンを、得られた形質転換体中
より選択する。 前述で得られるプラスミドから制限酵素切断処理により
ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片
を切り出し、前記（２）の場合と同様に発現ベクターに
挿入して目的のヒトＴＮＦ変換体発現ベクターを構築す
ることかできる。 発現ベクターを大腸菌株のような宿主細胞へ導入するこ
とについては例えば塩化カルシウム法により作製した大
腸菌株のコンピテントセルを用いる公知の方法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｔ、 Ｍａｎｉａｔ
ｉｓｅｔ ａｌ、 （１９８２） ）に従って行なう。 宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母なとの微生物細
胞か使用てきるか、なかでも大腸菌としてはＪλ１８３
、ＪＭ１０３などのＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の変異
種か挙げられる。 （４） ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドの取得本発明
においては前記（３）で記載の形質転換された微生物細
胞を培養し、目的のヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ変換体ポリペプチ
ドを培養物中に産生、蓄積させて分離する。微生物細胞
、特に大腸菌の培養方法としては従来から知られている
方法、例えは大腸菌か要求する栄養素を含んだ培養液に
大腸菌を接種し、普通３２〜３７°Ｃで約１２〜２４時
間振どう又は攪拌することにより短時間に大量に培養す
る方法か使用できる。培地は例えばＬ培地、Ｍ９培地な
と〔前記Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕か
使用でき、必要に応じてアンピシリンなとの抗生物質を
添加したり、培養開始時或は培養中にｌａｃプロモータ
ー、ｔａｃプロモーターなとの転写プロモーターの効率
を高めるためにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクＩ・
ピラノシドを添加することもできる。 本発明のヒ）ＴＮＦ変換体ポリペプチドは培養後、普通
、微生物細胞の集合体をトリスバッファーに懸濁させた
状態で超音波処理することにより破砕処理を施し、遠心
分離操作を行ない菌体残渣を除去することにより得られ
る。更に、かくして得られたものは核酸・エンドトキシ
ン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーその他従来からの蛋白質の分離精製方
法を組み合わせることにより、−層積製することができ
る。 本発明のヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドはヒトＴＮＦの
持つ抗腫瘍作用と同様の作用を存し、しかもヒトＴＮＦ
に比し優れた抗腫瘍活性を示し、副作用も軽減するので
抗腫瘍剤、医薬の活性成分として有効である。本発明の
ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドは、なかでも、前記アミ
ノ酸配列で第２９番目のＡｒｇがＧｊ７ｎ、 ＬｙｓＳ
Ａｓｐ、 Ｈｉｓ又はＶａｆにより置換されたものか好
ましい。その医薬組成物の製剤に当っては薬理上許容さ
れる担体又は希釈剤とともに医薬組成物に製剤すること
かできる。 本発明の医薬組成物の剤型としては、外用剤、経口投与
剤、注射剤などがあげられ、それぞれの剤型にあった投
与方法で投与される。 実施例１ （ヒトＴＮＦ遺伝子のデザイン）既に報告さ
れているＣＰｅｎｎ１ｃａら、前出〕ヒトＴＮＦ構造遺
伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配
列について遺伝子構築及び変換体作製の便宜上、配列表
配列番号３のＤＮＡ塩基配列をデザインした。ここでは
適当な間隔て制限酵素切断部位を組み込み、またプラス
ミドベクターと容易に連結できるように翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）の上流に制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位
を、翻訳終止コドン（ＴＡＡ及びＴＧＡ）の下流には制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位をそれぞれ設けた
。 実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）前記実施例
１でデザインされたＤＮＡは、自動ＤＮＡ合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ、モデル３８１Ａ）を用いて
、ホスファイト法にて化学合成した。合成は配列表配列
番号４て示した塩基配列を存するＵ−１〜ＩＯ及びＬ−
１〜ＩＯの２０本のオリゴヌクレオチドに分割して行い
、合成されたオリゴヌクレオチドのＣＰＧ樹脂（フナコ
シ社販売）からの切り出し及び保護基脱離は、アプライ
ド・バイオシステムズ社のマニュアルに従った。 各オリゴヌクレオチドの分離精製は逆相クロマ１、カラ
ムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）又
は７Ｍウレアを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル濃度ＩＯ〜２０％）により行った。 ＨＰＬＣ法については、ヌクレオジル５Ｃ１８カラム（
φ４．６Ｘ１５０ｍｍ：ケムコ社販売）を用いた逆相ク
ロマトグラフィーによって、アセトニトリルを含むトリ
エチルアミノ酢酸（１００ｍＮ０バツフアー（ｐＨ７，
０）で溶出することにより分離精製した。上記溶出は、
アセ）・二）・ジルの直線濃度勾配を５〜３５％（３０
分）とし、約１５分のピークを回収した。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に関しては、各合成
オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により分離し、紫外
線シャドウィング法による泳動パターンの観察結果より
目的の大きさのバンド部分を切り出し、そのポリアクリ
ルアミドゲル断片を約１〜２ｍｍ’の大きさに切りきざ
み、約２ｍｆｆの溶出バッファ −（０，５Ｍ ＮＨＪ
Ａｃ及びＩｍＭ ＥＤＴＡ ）を加え、３７°Ｃて一晩
振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッファ
ーを回収し、フェノール抽出（５０％フェノール１５０
％クロロホルム溶液使用）、イソブタノール抽出を行い
、エタ、７−ル沈殿操作により各オリゴヌクレオチドの
精製試料とした。 合成・精製したオリゴヌクレオチドの一部について、マ
キサム・ギルバード法（Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍ ｅｔ ａ
ｌ。 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５４
９９ （ｉ９８０） ］により、目的の塩基配列を有し
ていることを確認した。 以下（実施例３．４及び５）の遺伝子組換えに係わる操
作において、制限酵素及び他の関連酵素の反応条件等は
、おもにＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （前出
）記載の方法に準じた。なお、上記酵素等はおもに宝酒
造より入手しており、宝酒造のマニュアルも参考にした
。 実施例３（合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の構築） （１）まず第１図に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構築を試
みた。 前記実施例２で得られる合成オリゴヌクレオチドを３つ
のグループ（Ｕ及びＬ−１〜４、Ｕ及びＬ−５〜７並び
にＵ及びＬ−８〜１０）に分けてクローニングを行った
。すなわち、Ｕ−２，３，４，６，７，９及びＩＯ並び
にＬ−１，２，３，５，６，８及び９の各オリゴヌクレ
オチド（ｌ−２μ ヌクレオチドキナーセ（宝酒造）を用いて、それぞれ別
々にリン酸化する。リン酸化反応は１０μβの水溶液中
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（、ｊ７ ｐＨ ７．６、１
０ｍＭＭｇＣｆｆ２、０． １ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉ
ｎｅ， ０． １ｍＭ ＥＤＴＡ， １０ｍＭＤＴＴ及
び１ｍＭ ＡＴＰ）、３７°Ｃて１時間行い、反応終了
後、７０°Ｃて１０分間処理することによりＴ４ポリヌ
クレオチトキナーセを失活させた。新たに、ｌ−２μ 及び１０の各オリゴヌクレオチドをそれぞれ別々に含む
上記と同組成の水溶液ｌＯμβを用意し、それぞれＵ及
びＬの同じ番号同士で各オリゴヌクレオチド（Ｕ−１〜
１０及びＬ−１〜１０）水溶液を混合しく２０μｐ）、
１００°Ｃて５分間煮沸後徐冷することによりアニール
化した。次に、得られた１０本のアニーリング体（二本
６！ Ｄ Ｎ Ａ断片）を、各グループごとに連結反応
のための水溶液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣβｐＨ７．
６、６． ６ｍＭ ＭｇＣβ２、１０ｍ！，ｌ ＤＴＴ
， １ｍＭ ＡＴＰ及び１００μｇ／ｍｆｆ ＢＳＡ）
に添加しく総液量１２０〜１６０μＡ）、４０°Ｃに加
温後徐冷によるアニール化の後、７００ユニツトのＴＪ
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１６°Ｃで１５
時間連結反応を行った。反応終了後、各反応液をポリア
クジルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）により分離
し、エチジウムブロマイド染色法による泳動パターンの
観察結果より目的の大きさ（１７６ｂｐ， １５０ ｂ
ｐ及び１５３ ｂｐ）のバント部分を切り出し、エレク
トロ・エリコーション法により目的とする３本のＤＮＡ
断片を回収した。更に、回収した各試料に対してフェノ
ール抽出（５０％フェノール１５０％クロロホルム溶液
使用）、イソブタノール抽出を行い、エタノール沈殿操
作により目的のＤＮＡを精製した。上記方法に準じて、
精製した３本の二本鎖ＤＮＡ断片をそれぞれ別々にその
５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化し、連結反応のための水溶液中にて混合の後、４０
°Ｃの加温によりアニール化を行い、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを加えて連結した。エタノール沈殿操作によりこの連
結ＤＮＡを回収し、１ｍＭＤＴＴ及び１００μｇ／艷Ｂ
ＳＡを含む５０μβのハイ・ソルトバッフ７− （５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ ｐＨ７，５，１００ｍＭ
ＮａＣＡ、１０ｍＭ ｌ＋Ｉｇｃｉ’ ２）に溶解させ
、１５４ニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ （宝酒造）及び
１５ユニットの制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ （宝酒造）を添
加して、３７°Ｃで２時間切断反応を行った。反応終了
後、上記方法に準じて、ポリアクリルアミドケル電気泳
動（ゲル濃度４％）により目的とするＤＮＡ断片（約４
８０ｂｐ）を分離精製した。 一方、プラスミドベクターｐｔＪｃ９ （九州大学遺
伝情報実験施設より分与）の５μｇを、前記の方法に準
じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断
し、アガロースゲル電気泳動（ケル濃度１％）により約
２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。 先に精製した約４８０ｂｐのＤＮＡ断片（ヒトＴＮＦ遺
伝子を含む）とこのｐＵｃ９断片を、前記の方法に準じ
て、２０μｌの連結反応液中にて混合し、３５０ユニツ
トのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、１６°Ｃて３時間
連結反応を行った。塩化カルシウム法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕により作製したＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＪＭ８３株（九州大学遺伝情報実験施設に
より分与）のコンピテントセルを、上記連結反応液によ
り常法に従って形質転換した（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１
ｏｎｉｎｇ参照〕。 得られたアンピシリン耐参照口−ンより、公知の方法を
用いてプラスミドを調製し、前記の方法に準じて、制限
酵素（ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌＩ）処理後、アガロ
ースケル電気泳動によりその泳動パターンを解析するこ
とにより、ヒトＴＮＦ遺伝子のｐｌＪｃ９ベクターへの
挿入を調べた。その結果、約２５０ｂｐの遺伝子の挿入
か確認てき、そのクローンについて挿入された遺伝子の
塩基配列をダイデオキシ法ＣＦ、Ｓａｎｇｅｒ、 ５ｃ
ｉｅｎｃｅ、 ２１４．１２０５ （１９８１））によ
り調べたところ、ＥｃｏＲＩ部位から下流に約１３０ｂ
ｐとＨｉｎｄＩ［部位から上流に約９０ｂｐの目的とす
るヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を有する遺伝子断片であ
ることか確認された。このクローン及びプラスミドをそ
れぞれｐＵＡ４１／ＪＭ８３及びｐＵＡ４１と命名した
。 （２）引き続き、第２図に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構
築を試みた。 前記（１）工程でのクローニングでヒトＴＮＦ遺伝子の
塩基配列において未達成な領域周辺を２つのグループ（
Ｕ及びＬ−３〜６並びにＵ及びＬ−６〜９）に分け、前
記（１）工程と同様にして、各オリゴヌクレオチドをリ
ン酸化し、アニール化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼに
より連結した。前記方法に準じて、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度６９６）により分離精製し、得
られた２本のＤＮＡ断片（２０１ｂｐ及び２００ｂｐ）
をそれぞれ別々に１００μＡの６７ｍ１１１ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＡ’ （ｐＨ８，８）、６．７ｍλ（ＭｇＣβ２
．１６．６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，６，７μＡ（Ｅ
ＤＴＡ、 １ｍＭ ＤＴＴ、 ２００ ｕｇ／ｍｌ
ＢＳＡ及び各３３０μＭデオキシリボヌクレオチド三
リン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ及びＴＴＰ
）水溶液にて溶解し、２〜５ユニツトのＴ４ ＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造）を添加し、３７°Ｃて３０分間反
応することによりＤＮＡ断片の両末端を平滑化した。反
応終了後、６８°Ｃで１０分間処理することによりＴ４
ＤＮＡポリメラーゼを失活させ、エタノール沈殿によ
り目的の２本のＤＮＡ断片を回収した。 一方、５μｇのｐＵｃ９ベクターをｌ ｍＭ ＤＴＴ及
び１００μｇ／ｍ１ＢＳＡを含む５０μβのミデイアム
・ソルトバッフｙ −（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ，ｉ
？ ｐＨ７，５，５０＋ｎ１ｌＮａＣ（！及びｌ０ｍＭ
ＭｇＣｌ ２）に溶解させ、１５ユニツトの制限酵素
ＨｉｎｃＩＩ （宝酒造）を添加し、３７°Ｃで２時間
の反応後、エタノール沈殿により回収した。得られた切
断・開環したｐＵＣ９ベクターに、先に平滑化後回収し
た２本のＤＮＡ断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じ
て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ−１２ＪＭ８３株を形質転換した。得られたそ
れぞれのクローンについて、前記（１）工程と同様にし
て、挿入されたＤＮＡの塩基配列を調べ、目的の塩基配
列であることを確認した。これらのクローンをそれぞれ
ｐＬＩＡ４２／Ｊλ（８３及びｐＵＡ４３／Ｊ入（８３
と命名し、プラスミドをｐ［ＪＡ４２及びｐｔＪＡ４３
と命名した。 上記（１）工程で得られたｐＵＡ４１を制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ１（ハイ・ソルトバッファ−）及び５ａｃＩ（宝酒造
、ロウ・ソルトバッファー）、制限酵素Ｈａｅ ＩＩ（
宝酒造）及び旧ｎｄＩＩＩ（ミデイアム・ソルトバッフ
ァー）て、上記（２）工程で得られたｐＬＩＡ４２を制
限酵素Ｓａｃ Ｉ （ロウ・ソルトバッファー）及びＨ
ｐａ Ｉ（宝酒造二ＫＣβバッファー）で並びにｐ［Ｊ
Ａ４３を制限酵素Ｈｐａ Ｉ及びＨａｅＩＩ （Ｋ（Ｊ
７バツフアー）で、前記方法に準じて、それぞれ切断し
た。ロウ・フルトバッフｙ −（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊ？ ｐＨ７，５及び１０ｍＭ ｈｃ（！ ２）
とハイ・ソルトバッファー又はＫＣｌバッフｙ −（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ８，５，１００ｍＭ Ｋ
ＣＪ７及び１０ｍＭ ＭｇＣｊ７２）の組み合わせにつ
いては、切断反応を２回に分け、反応の間にエタノール
沈殿操作を行うことにより対応した。ｐＵＡ４１からの
ＥＣＯＲｌ−８ａｃ Ｉ ＤＮＡ断片（１２７ｂｐ）及
びＨａｅＩＩ−ＨｉｎｄＩ［ＤＮＡ断片（８０ｂｐ）、
ｐＵＡ４２からのＳａｃ Ｉ −Ｈｐａ Ｉ ＤＮＡ断
片（１４７ｂｐ）並びにｐＬＩＡ４３からのＨｐａ Ｉ
−ＨａｅＩＩ ＤＮＡ断片（１２６ｂρ）を、前記方
法に準じて、それぞれポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度６％）により分離精製した。 一方、５μｇのｐｔＪｃ１９プラスミドベクター（九州
大学遺伝情報実験施設より分与）を、前記の方法に準じ
て、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、
約２．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度１％）により分離精製した。先に精製した
４本のＤＮＡ断片を図示（第２図）したように順次添加
し、前記方法に準じて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結して行き、最後に上記の精製ｐＵｃ１９ベクター（
約２．７Ｋｈｐ断片）に絹み込み、ＪＭ８３株を形質転
換した。この形質転換体に含まれるプラスミドＤＮＡに
ついて、前記方法に準じて、挿入されたＤＮＡの塩基配
列を調へたところ、目的とする完全長（約４８０ｂｐ）
のヒ）ＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドベクター（約３．
２ Ｋｂｐ）を有するクローンであることが確認できた
。このクローンを ｐＵＡ４４／ＪＭ８３と命名し、プ
ラスミドをｐＵＡ４４と命名した。 実施例４（ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築）（１）
大腸菌ｔａＣプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ
２２３−３ （ファルマシア社より入手）をより扱い
やす（する目的で以下の改良を試みた。 ｉ）発現ベクターを低分子量化する。 １ｉ）制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位を唯一とする。 １ｉｉ）ｔａｃプロモーターの方向をアンピシリン耐性
遺伝子の方向と逆向きにする。 第３図にその方法を図示した。 プラスミドベクターｐＢＦ？３２２ （九州大学遺伝
情報実験施設より分与）の５μｇを、実施例３の方法に
準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩＩＩで切断後
、その両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーセを用いて平滑
化した。実施例３の方法に準してアガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度１％）により約４．４ ＫｂｐのＤＮＡ断
片を分離精製し、その開環部位に１１００ｎのＢｇｌＩ
Ｉリンカ−（制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位を含む１０ｂ
ｐの二重鎖ＤＮＡ断片・宝酒造より入手）をＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを用いて挿入連結した。 前記実施例３の方法に準じて得た形質転換体のなかより
、そのプラスミドについて制限酵素による切断の可否を
調へることにより、目的の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎ
ｄｌＩ［切断部位を欠き、制限酵素Ｂｇ１■切断部位を
新生したプラスミドｐＢＲ９３３３（約４．４Ｋｂｐ’
）を有するクローンを得た。 上記で得たプラスミドｐＢＲ９３３３の５μｇを、実施
例３の方法に準して、ハイ・ソルトバッフ了−に溶解し
、制限酵素ＢｇｌＩ［（宝酒造）及びＰｖｕ Ｋ（宝酒
造）で切断し、複製起点を含む約２．３ＫｈｐのＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により
分離精製した。一方、発現ベクターｐＫＫ２２３−３（
約４．６ ｋｂｐ’）の５μｇを上記同様ハイ・フルト
バッファーに溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩ （宝酒造）
及び５ｃａＩ（宝酒造）で切断した。制限酵素ＢａｍＨ
Ｉによる切断反応は、添加酵素量を通常の約１／２とし
、反応時間を５〜３０分間とする部分切断により行った
。切断処理後、ｔａｃプロモーター及びｒｒｎＢＴ＋Ｔ
２ターミネータ−等を含む約１．］、ＫｂｐのＤＮＡ断
片を上記同様アガロースゲル電気泳動により分離精製し
た。先に精製した複製起点を含む約２．３ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片に上記の約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断片を前記に準
じてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結し、実施例
３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作製したＥ
、ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ１０３株（九州大学遺伝情報
実験施設）のコンピテントセルに導入した。得られた形
質転換体の中より、目的とするｔａｃプロモーター等を
含む発現ベクター（約３．４ Ｋｂｐ）を有するクロー
ンを選択し、この発現ベクターを１）ＫＫＩＯＩ と命
名した。 （２）第４図に従って、次の工程を説明する。 前記（１）工程で得た発現ベクターｐＫＫＩ０１の５μ
ｇを、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄ■で切断し、複製起点及び転写調節領域等を含む約
３．４ ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースケル電気泳動
（ケル濃度１％）により分離精製した。また、前記実施
例３て得られたヒトＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドｐＵ
Ａ４４ （約３．２ ｋｂｐ）を、同様にして、制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［て切断し、ヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４８０ｂρのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離精製した。このヒ）ＴＮＦ遺伝
子全域を含むＤＮＡ断片を、前記方法に準じて、先に発
現ベクターｐＫＫ１０１より精製した約３．４ｋｂｐの
ＤＮＡ断片にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結し
、前記の方法に準じてＥ、 ｃｏｌｉＫ−１２ＪＭＩ０
３株に導入した。得られた形質転換の中より目的のヒト
ＴＮＦ発現ベクター（約３．９Ｋｂｐ）を有するクロー
ンを選択し、この発現ベクターをｐＫＦ４１０２と命名
した。 実施例５（ヒトＴＮＦ変換体発現ベクターの構築）（１
） 第５図に従って説明する。 前記実施例３て得られたプラスミドｐｔＪＡ４４を前記
方法に準じて制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩて
切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子（全域を含む約４８０ｂｐ’
）のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精
製した。一方Ｍｅｓｓｉｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。 １５３、３ （１９８７） ３によって開発された一重
鎖ブラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクターｐＵｃ１
１９（宝酒造より入手）を、同様にして制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ■及びＨｉｎｄＩ［で切断し、ＩＧ領領域含む約３．
２ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により
分離精製した。このＩＧ領領域Ｍ１３ファージＤＮＡの
ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）の存在により、
プラスミドｐＵＣ１１９はへルバーファージＭ１３ＫＯ
７感染後優先的に一本鎖ＤＮＡとなりファージ粒子に包
み込まれ菌体外に放出される。上記で精製したヒトＴＮ
Ｆ遺伝子全域を含む約４８０ｂｐのＤＮＡ断片とＩＧ領
領域含む約３．２ＫｂｐのｐＵｃ１１９断片を前記に準
じてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、前記実施例
３の方法に準じてＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ８３株
に導入した。 得られた形質転換体の中より、目的のプラスミド（約３
．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択し、このクローン
をｐｔＪｃ １１９−ｈＴＮＦ／ＪＭ８３と命名し、プ
ラスミドをｐＵｃ １１９−ｈＴＮＦと命名した。 上記で得たプラスミドｐＵｃ１１９−ｈＴＮＦを、その
ＤＮＡ内にウラシルを取り込ませ保持するために、前記
実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作製
した大腸菌ＣＪ２３６株（ｄａｔ−、ｕｎｇつのコンピ
テントセルに導入した。ＣＪ２３６株は、デオキシウリ
ジン三リン酸分解酵素遺伝子に欠失変異（ｄｕｔ”）を
持つため競合反応が生じ、チミンの替わりに一部ウラシ
ルを取り込んだＤＮＡを作ることかでき、更にｕｎｇ−
変異によりウラシルＮ−グルコシラーゼか欠損しており
、そのウラシルをＤＮＡ中に保持してお（ことかできる
。このＣＪ２３６株はバイオ・ラドより入手した。上記
導入により得られたクローン（ｐｔＪｃ１１９−ｈＴＮ
Ｆ／ＣＪ２３６）をヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝
酒造より入手）の感染後、１００μｇ ／ ｍｅアンピ
シリン、７０μｇ／ｍｌカナマイシン及び３０μｇ ／
ｍｌクロラムフェニコールを含む２ＸＹＴブロース（
１，６％トリプトン、１％酵母エキス及び０．５％Ｎａ
Ｃ！！ｐＨ７，６）にて培養することにより、目的のウ
ラシルを導入した一重鎖ブラスミドＤＮＡ （約３．７
Ｋｂａｓｅｓ）をファージ粒子に包み込んだ形で菌体外
に放出させた。放出させたファージ粒子を培養上清より
回収し、−重鎖ファージＤＮＡの調製方法に準じて、目
的の一重鎖ブラスミドＤＮＡを調製した。 （２）次に第６図に従って説明する。 プラス鎖オリゴヌクレオチドを用いてヒトＴＮＦ遺伝子
に対し変異導入を行うために、配列表配列番号５で示し
たプライマー４１３４、同月３５、同４２０５、同４３
９１．同４３９２、同４３９８、同４４０９及び同４４
１０をデザインした。このオリゴヌクレオチドの化学合
成及び精製は前記実施例２の方法に準じて行った。 ヒトＴＮＦ遺伝子への部位特異的変異導入はバイオ・ラ
ドのシステム（Ｍｕｔａ−ＧｅｎｅＴＭｉｎ ｖｉｔｒ
。 ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）に準じて行った。す
なわち、上記で作製した約０．５μｇのプライマーの５
′末端を前記方法に準じてＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼによりリン酸化した一部と、先に調製したウラシル導
入−重鎖ブラスミドＤＮＡ （ｐｔＪｃ １１９−ｈＴ
ＮＦ）の約２００ｎｇとの間て、１０μｌのアニーリン
グ・バッファ （２０ｍＭ Ｔｒｙｓ ＨＣｌ ｐＨ
７，４，２ｍＭＫ＋ｇＣｆｆ２及び５０ ｍｈ！ Ｎａ
Ｃｆｆ ）中にてアニーリング（約７０°Ｃに加温後徐
冷）を行った。アニーリング終了後、１０倍シンセシス
・バッファー〔５ｍＭ各デオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ及びＴＴＰ
）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＡ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７，４，５０ｍＭ ＭｇＣｊ’ ２及び２０ｍＭ
ＤＴＴ ）を１７１Ｏ容量加え、１ユニツトのＴ４
ＤＮＡポリメラーセ及び２〜４ユニツトのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて二本鎖化反応（３７°Ｃ１９０分間）
を行った。ＴＥバッフ−ｒ−（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７，５及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）を約８容量加
え、凍結することにより反応を停止した。 前記実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム法により
作製したＥ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＴＧＩ株（ｕｎｇ”
：アマシャム社）のコンピテントセルに、上記反応液
を処理し二本鎖ＤＮＡを導入した。ｕｎｇ＋株にヘテロ
二本鎖ＤＮＡを導入することにより、鋳型であるウラシ
ルを含むＤＮＡ鎖は不活性化され複製の対象とならない
。そのため変異の導入頻度は５０％を上回る高効率なも
のとなる。得られた形質転換体の中より、変異導入のた
めに使用したプライマーをプローブとしたコロニー・ハ
イブリダイゼーション法を用いて、目的の変換体ＤＮＡ
を含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を有するクローン
を選択した。選択されたクローンについて、そのプラス
ミドの変異導入部位周辺の塩基配列をダイデオキシ法Ｃ
Ｆ、 Ｓａｎｇｅｒ ：前出〕により調へ、デザイン通
りの変換体ＤＮＡに変異していることを確認した。 これらのプラスミドをそれぞれｐＵｃ１］、９−Ｆ４１
３４、ｐＵｃ１１９−Ｆ４１３５、ｐｔＪｃ１１９−Ｆ
４２０５、ｐＬＩｃ １１９−Ｆ４３９１、ｐｔＪｃ１
１９−Ｆ４３９２ 、ｐＵｃ１１９−Ｆ４３９８、ｐＵ
ｃ１１９−Ｆ４４０９及びｐ（ＪＣ１１９−Ｆ４４１０
と命名した。 変異導入により得られた目的のヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ変換体
遺伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方
法に準じて、ｔａｃプロモーターを存する発現ベクター
ｐＫＫ１０１に組み込みヒトＴＮＦ変換体発現ベクター
を構築した。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子（約４８０ｂｐ）
は、上記で得られた約３．７ＫｂｐのプラスミドｐＬｌ
ｃ１１９−Ｆ４１３４ 、ｐｔＪｃ１１９−Ｆ４１３５
．１）ＵＣ１１９−Ｆ４２０５、ｐＬｌｃ１］９−Ｆ４
３９１、ｐＵｃ１１９−Ｆ４３９２、ｐｌＪｃｌ １９
−Ｆ４３９８ 、ｐＵｃ１１９−Ｆ４４０９及びｐｏｃ
ｌ １９−Ｆ４４１０より、前記方法に準じて、それ
ぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［による切断後
分離精製した。目的とするそれぞれのヒトＴＮＦ変換体
発現ベクター（ｐＫＦ４１３４、ｐＫＦ４１３５ 、ｐ
ＫＦ４２０５ 、ｐＫＦ４３９１ 、 ｐＫＦ４３９２
、ｐＫＦ４３９８ 、ｐＫＦ４４０９及びｐＫＦ４
４１０）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２
）と同様、宿主としてＥ。 ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ１０３株を用いて取得した。 上記８種類の変換体発現ベクターは、発現誘導により、
以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチドを大
腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４１３４ ：配列表配列番号ｌて示した
２９番目のＡｒｇかＧＡｎに変換 されたポリペプチドＦ４１３４を コードする。 ベクターｐＫＦ４１３５ ：配列表配列番号１で示した
２９番目のＡｒｇかＳｅｔに変換 されたポリペプチドＦ４１３５を コードする。 ベクターｐＫＦ４２０５ ：配列表配列番号１て示した
２９番目のＡｒｇかＰｒｏに変換 されたポリペプチドＦ４２０５を コードする。 ベクターｐＫＦ４３９１ ：配列表配列番号１て示した
２９番目のＡｒｇがＬｙｓに変換 されたポリペプチドＦ４３９１を コードする。 ベクターｐＫＦ４３９２ ：配列表配列番号１で示した
２９番目のＡｒｇかＡｓｐに変換 されたポリペプチドＦ４３９２を コードする。 ベクターｐＫＦ４３９８ ：配列表配列番号１て示した
２９番目のＡｒｇかＨｉｓに変換 されたポリペプチドＦ４３９８を コードする。 ベクターｐＫＦ４４０’９ ：配列表配列番号１て示し
た２９番目のＡｒｇかＶａｆに変換 されたポリペプチドＦ４４０９を コードする。 ベクターｐＫＦ４４１０・配列表配列番号１て示した２
９番目のＡｒｇかＬｅｕに変換 されたポリペブチｌ’ Ｆ４４１０を コードする。 実施例６（ヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の大腸菌に
よる発現及び精製） 実施例４て得られたヒ１−ＴＮＦ発現ヘクター（ｐＫＦ
４］０２）及び実施例５て得られたヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ変
換体発現ベクター（ｐＫＦ４１３４、ｐＫＦ４１３５、
ｐＫＦ４２０５、ｐＫＦ４３９１、ｐＫＦ４３９２、ｐ
ＫＦ４３９８、ｐＫＦ４４０９及びｐＫＦ４４１０）を
有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１２Ｊｕ１０３株を、２５
〜５０μｇ ／ ｍｌアンピシリン及び０．００１％ビ
タミンＢ１を含むＭ９培地（０，６％Ｎａ２ＨＰＯ＜、
０．３％ＫＨ２ＰＯ４，０，０５％Ｎａ（Ｊ？ 、Ｏ
，Ｉ％ＮＨａＣｆ 、 ２ｍＭλＩｇｓ０４．０．２％
クルコース及びＯ，１ｍＭ ＣａＣｆ’ ２’） ２０
ｍｌに接種し、３７°Ｃ１１８時間振どう培養を行っ
た。この培養液２０ｍ１を上記培地ｊリッ）〜ル中に加
え、３７°Ｃ１２〜３時間振どう培養を行った。次いて
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ’）を最終濃度１ ｍＭとなるように添加し、更に
３７°Ｃ１１８時間振どう培養を続けた。 遠心分離操作による大腸菌菌体の回収後、ＴＰバッ”）
７− （１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ ｐＨ８，０
及び１００μＭ ＰＭＳＦ）を用いて菌体の洗浄を行っ
た。洗浄後、菌体グラム当たりｌＯ容量（ｍｌ ）のＴ
Ｐバッファーに菌体を懸濁させ、超音波発生装置（ヒー
ト・システムズ；モデルＷ−２２５）を用いて菌体を超
音波破砕処理した。得られた懸濁液を遠心分離すること
により、菌体残渣を除去し上溝両分を回収した。この超
音波破砕処理以降の精製工程は、おもに低温下（０°Ｃ
〜４°Ｃ）で行った。 この上清を０．４５μｍフィルターにてろ過した後、セ
パビーズＦＰ−ＤＡ］３ （三菱化成工業）を用いた陰
イオン交換クロマトグラフィー（カラムサイズ。 φ２．５ Ｘ １．５ ｃｍ及び流速：０．５ｍｆ／分
）で分画し、後記５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及びＬ９２９細胞を用いた後記実施例７の方法に準
じて活性の有無を検定することによって活性画分を得た
。溶出にはＮａＣｌを含むＴＰバッファーを用い、Ｎａ
Ｃ、ｅ濃度を０．０５ Ｍから０．１Ｍ、０．２Ｍ、０
．５Ｍへと段階的に上げ、ヒトＴＮＦ並びにヒトＴＮＦ
変換体Ｆ４１３４及び同Ｆ４１３５はＯ，ＩＭＮａＣＩ
！で、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ ４２０５は０．５ ＭＮａ
Ｃ！で、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４３９１、同Ｆ ４３９２
、Ｆ ４３９８、同Ｆ ４４０９及び同Ｆ４４１０は０
．２ Ｍ ＮａＣＡでそれぞれ溶出した。更に大腸菌菌
体由来のエンドトキシン等を除去するために、核酸・エ
ンドトキシン除去剤Ｃ−９（栗田工業製造、大日本製薬
販売）処理を添付マニュアルに準じて行った。かくして
、ヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の一段階精製試料を
得た。この試料を使用して、後記実施例７及び８の抗腫
瘍活性の評価を行った。 上記試料を０．２０μｍフィルターにてろ過した後、Ｆ
ＰＬＣシステムによる制御下のモノＱ＠ （ＨＲ１０／
１０及びＨＲ５１５）プレパックカラム（ファルマシア
ＬＫＢバイオテクノロジー社製）を用いた陰イオン交換
クロマトグラフィーで、ＮａＣβを含むＴＰＱバッフｙ
−（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２ｐＨ８，０及びｌ
ＯμＭ ＰＭＳＦ）によって溶出し、分画を後記５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＬ９２９細胞を
用いた後記実施例７の方法に準じて活性の有無を検定す
ることによって活性画分を得た。溶出方法は、ＦＰＬＣ
システムの制御下で下記プログラムに従って行った。各
試料における最終ステップは、精製純度を上げるために
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一
バンドとなるまで数回繰り返した。 第１ステップ：モノＱ■（ＨＲ５１５）カラム使用（流
速：１ｍ１１分） ０〜２分；ＯＭＮａＣＪ？ ２〜１５分； Ｏ−０，１５Ｍ ＮａＣｊ７直線濃度直
線濃度−配置５〜２０分 １５−０．５ Ｍ ＮａＣｌ
！直線濃度勾配２０〜３０分； ０．５ Ｍ ＮａＣＪ
？上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣＪ？濃
度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４１３４か０
．３５Ｍ、１８．０分及び同Ｆ４１３５か０．３ Ｍ、
１８．０分てあった。 第２ステツプ・モノＱ■（ＨＲ１０／１０）カラム使用
（流速＝４ｍρ／分） ０〜５分；０−０．２ＭＮａＣｆｆ直線濃度勾配５〜１
６分； ０．２ Ｍ Ｎａ（４２１６〜２０分； ０．
２−０．５ Ｍ ＮａＣｐ直線濃直線濃度勾配２橿〜２
４ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣＡ濃度及
び保持時間）は、ヒトＴＮＦか０．２Ｍ、５．３分、ヒ
トＴＮＦ変換体Ｆ ４２０５が０．２Ｍ、４．８分、同
Ｆ４３９１か０．２Ｍ，４．２分、同Ｆ ４３９２が０
．２Ｍ、４、５分、同Ｆ ４３９８か０．２Ｍ、４．５
分、同Ｆ ４４０９か０、２Ｍ、４．４分及び同Ｆ４４
１０が０．２Ｍ、４．５分てあった。 第３ステップ：モノＱ ＠ （ＨＲ ５１５）カラム使
用（流速：１ｍ（！／分） ０〜２．５分； Ｏ −０． ２ Ｍ ＮａＣＡ直線濃
度勾配２、５〜８分； ０． ２ Ｍ ＮａＣｆ８〜１
０分； ０． ２ −０． ５ Ｍ ＮａＣＡ直線濃度
勾配ｌＯ〜１２分；０．５ＭＮａＣβ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ ＮａＣ７濃度
及び保持時間）は、ヒトＴＮＦか０．２Ｍ、３．７分、
ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４１３４か０．２Ｍ、３．７分、同
Ｆ４１３５か０．２Ｍ，３．７分、同Ｆ ４２０５が０
．２Ｍ。 ３、１分、同Ｆ ４３９１が０．２Ｍ，３．４分、同Ｆ
４３９２か０、２Ｍ，３．２分、同Ｆ ４３９８か０
．２Ｍ，３．３分、同Ｆ ４４０９が０．２Ｍ、３．２
分及び同Ｆ ４４１０が０．２Ｍ。 ３、４分てあった。 第４ステップ：モノＱ■（ＨＲ ５１５）カラム使用（
流速：１ｍ１１分） ０〜６分； ０ −０． １ ５Ｍ ＮａＣｆ直線濃度
勾配６〜１１分； ０． １ ５ −０． ２ Ｍ Ｎ
ａＣｆ直線濃度勾配置１〜１３分； ０． ２ −０．
５ Ｍ ＮａＣＡ＋直ＰＡａ度勾配置３〜１５分；
０． ５ Ｍ ＮａＣＡ上記方法に従った活性画分の分
画結果（ ＮａＣｆ濃度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦ
が０．１６Ｍ、６．５分、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４１３５
が０．１６Ｍ、６．７分、同Ｆ ４２０５か０． １７
Ｍ， ７． １分、同Ｆ４３９１か０． １５Ｍ。 ５、４分、同Ｆ ４３９２か０．１６Ｍ， ６．７分、
同Ｆ ４３９８が０、 １６Ｍ， ５． ８分、同Ｆ
４４０９か０．１６Ｍ， ７．８分及び同Ｆ４４１０か
０．１７Ｍ， ７． ５分てあった。 かくしてヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の精製試料を
得た。この試料を使用して後記実施例７の抗腫瘍活性の
評価を行った。 上記精製の過程および精製試料について５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒトＴＮＦ及び変換
体ポリペプチドの発現および精製の確認をした。各試料
をｌ Ｏ ｍＭ ＤＴＴを含有するＬａｅｍｍｌ ｉ’
ｓサンプル・バッフｙ −（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ ｐＨ ６．８、２％ＳＯ３ 、０．０１％Ｂ
ＰＢ及び１０％グリセロール）に加え、Ｌａｅｒｎｍｌ
ｉ （Ｎａｔｕｒｅ， ２２７。 ６８０ （１９７０））の方法に準じ、１５％の分離用
ゲルを用いて泳動を行った。電気泳動終了後、分離用ゲ
ル中の蛋白質をクマシー・ブリリアント・ブルーで染色
することにより確認した。第７図にその結果の〜部を示
した。それぞれの発現ベクターによるヒトＴＮＦ及び変
換体ポリペプチドの発現量はほぼ同程度であり、得られ
た染色ゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ５−９２
０型）にかけてその発現効率を算出したところ、大腸菌
総菌体蛋白質の約２０％であった。また、最終精製試料
は、得られた染色ゲルにおいて単一バンドであった。そ
の泳動位置より、ヒｈＴＮＦ及び変換体ポリペプチドの
分子量を算出し第１表に示した。 なお、蛋白質の物性の一つとして、ヒトＴＮＦ及び変換
体ポリペプチドの等電点をアンフオライン（ＬＫＢ社製
）を用いた等電点ゲル電気泳動法により測定し、得られ
た結果を第１表に示した。 第１表 ヒ１〜ＴＮＦ及び変換体ポリペプチドの等電点
及び分子量 ヒトＴ Ｎ Ｆ ５．６ １
７．０Ｆ４１３４（２９Ａｒｇ−Ｇｌｎ） ５．３
１７．０Ｆ ４１３５（”Ａｒｇ ＋５ｅｒ）
５．３ １７．０Ｆ４２０５（”Ａｒｇ−
Ｐｒｏ） ５．２ １７．０Ｆ４３９１（”
Ａｒｇ＋Ｌｙｓ） ５．６ １７、ＯＦ ４
３９２（”Ａｒｇ４Ａｓｐ） ５．０ １７
．０Ｆ４３９８（”Ａｒｇ−Ｈｉｓ） ５．２，５．
４” １７．０Ｆ４４０９（”Ａｒｇ−”Ｖａｆ
） ５．２ １７．０Ｆ４４１０（”Ａｒｇ
−”Ｌｅｕ） ５．２ １７．０実施例７
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性の評価）実施例６で得ら
れたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドの一
段階精製試料及び精製試料について、マウス由来結合組
繊細胞Ｌ ９２９（ＡＴＣＣＣＣＬＩ）に対する細胞傷
害活性をＡｇｇａｒｗａｌら〔Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、、 ２６０．２３４５ （１９８５） ）の方法に
準じて求めた。すなわち、９６ウエルの組織培養用のマ
イクロプレート（コーニング社製）に３Ｘ１０’細胞１
０．１ｍＡ’／ウェルてＬ９２９細胞を植え、５％炭酸
ガス存在下３７°Ｃて一晩培養した。培地としては、１
０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏによって修
飾されたイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（Ｄ
ＭＥ培地、シグマ社製）を用いた。 翌日、最終濃度１μｇ／ｍｌ！のアクチノマイシンＤを
添加した上記培地に培地を交換し、この培地にて段階希
釈した試料を各ウェルに処理した（総培地量０．１ｍＪ
）。更に２０時間の培養後、０，５％クリスタル・バイ
オレット溶液（０，５％クリスタル・バイオレット／２
０％メタノール）にてプレートに付着した生細胞を染色
（室温、１５分間）した。ｌ ｒｎＭ ＣａＣＡ’
２及び１ｍＮ口１ｇｃβ２を含むリン酸バッフｙ −Ｐ
ＢＳ （１０ｍＭ Ｎａ−Ｋ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 、
０．８％ＮａＣｉ及び０．０２％ＫＣＡ’）で充分洗
浄した後、３０％エタノールを含む０．０ＩＮ塩酸溶液
０．１ｍｊ？を用いてプレートに残ったクリスタル・バ
イオレットを抽出し、その吸光度（４９２ｎｍ）をＥＩ
Ａリーダー（バイオ・ラド社製、モデル２５５０）で測
定した。 この吸光度は生存細胞数に比例する。そこで、試料無処
理ウェルの吸光度の５０％の値に相当する吸光度を示す
ウェルにおける試料の最終希釈率を求め、この試料希釈
率の逆数をその試料の１ｍＡ７当たりのユニット数（ユ
ニット／ｍＡ）と定義する。 上記方法に準じて求めたＬ９２９細胞傷害活性（ユニッ
ト／ ｍ Ｉ！ ）から各試料の比活性（ユニット／■
・ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出するために、各試料の蛋白定
量を行った。定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ７２．２４８ （１９７６））に
準じ、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白
濃度（■／ｒｎＡ）を求めた。これらの結果より、ヒト
ＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体試料について算出した比活
性を第２表に示した。 第２表 ヒトＴＮＦ及び変換体ポリペプチドのＬ９２９
細胞傷害活性 一段階精製試料 精製試料 ヒトＴＮＦ ２．７ｘ１０７８．０ｘｌＯ７
Ｆ４１３４ １．３Ｘ１０７１．０ＸＩ０７Ｆ
４１３５ ４．７Ｘ１０＠１．１Ｘ１０７Ｆ４
２０５ １．５Ｘ１０’ ３．０ＸＩＯ
３Ｆ４３９１ １．６Ｘ１０７３．４Ｘ１０７
Ｆ４３９２ ８．９Ｘ１０’ １．１Ｘ
１０７Ｆ４３９８ ６．０Ｘ１０’ ７
．７Ｘ１０６Ｆ４４０９ ２．９ｘｌＯ”
６．７ｘｌＯ’Ｆ４４１０ ］、０Ｘ１
０７９．５Ｘ１０’上記第２表からヒトＴＮＦ変換体ポ
リペプチドはヒトＴＮＦと同様のＬ９２９細胞に対する
細胞傷害活性作用を有することかわかる。ただし、ヒト
ＴＮＦ変換体Ｆ ４２０５はかなり低い細胞傷害性を示
した。 実施例８ （ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の評価）実施例
６で得られたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の一段階
精製試料について、マウス可移植線維芽肉腫ＭｅｔｈＡ
腫瘍に対する抗腫瘍治療活性を求めた。試験は、生理食
塩水に懸濁したｌＸｌ０’細胞／ ０．２ ｒｎｌのＭ
ｅｔｈＡ腫瘍細胞（佐々木研究所より分与）をＢＡＬＢ
／ｃマウス（雄、５週令、チャールズ・リバー）の背中
部皮下に移植し、８日後腫瘍径が６〜１０ｍｍに達した
のを確認し、生理食塩水にて段階希釈した試料（０，２
ｍｊ’／マウス）を尾静脈より投与することにより行な
った。致死量を最高投与量とし、数段階の希釈により各
投与試料を作製した。 投与後約２週間、腫瘍増殖等の観察を続けた。 腫瘍増殖については、腫瘍容積（腫瘍塊の長径×短径２
／２）を計測し、試料投与臼（０日）の腫瘍容積に対す
る腫瘍容積率を求め、この値か２又は５となる試料投与
臼からの日数（Ｄ２又はＤ５）を算定する。そして、コ
ントロール群（生理食塩水投与）に対する比率を算出し
、Ｄ２％コントロール値及びＤ５％コントロール値を求
めた。その値か大きい程、腫瘍増殖能か低下しており高
い抗腫瘍活性を示すことを意味する。 上記に準じて得られた結果を第３表に掲載した。 その結果、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ ４１３４、同Ｆ４３９
ＬＦ ４３９２、同Ｆ ４３９８及び同Ｆ ４４０９は
ヒトＴＮＦに比し、死亡率か０％のときの投与量で高い
腫瘍容積率を示しており、マウス移植Ｍｅｔｈ Ａ腫瘍
に対する抗腫瘍治療効果か高いことかわかる。
チドを提供することに係り、ポリペプチド自身、それを
含む医薬組成物、その製造方法、その遺伝子組換えＤＮ
Ａ及びプラスミド、形質転換微生物細胞などに関する。 「従来の技術」 ＴＮＦ （腫瘍壊死因子）は、１９７５年にＣａｒｓｗ
ｅｌｌらにより、予めＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔ
ｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）に感染され、エンドトキ
シンで処理したマウスの血清中に存在することか見出さ
れた生理活性物質であり（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７２３６６６（１９７５
）） 、１９８４年にＰｅｎｎ１ｃａらにより、ヒトＴ
ＮＦのｃＤＮＡをクローニングしヒトＴＮＦ蛋白質の全
−次構造（アミノ酸配列）か明らかにされた（Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１２．７２４ （１９８４）） 。ＴＮＦは腫
瘍細胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対する出血性
壊死、増殖の抑制なと特異的な抗腫瘍作用を有するか、
最近では高脂血症、血圧低下、発熱などの副作用も生じ
うろことか報告されており、薬効、副作用なとでより優
れたものを見出すべく研究、開発かなされている。例え
は特開昭６１−４０２２１、同６３−１１９６９２ 、
特開平１−２７７４８８各号公報では遺伝子操作技術に
よりヒトＴＮＦ蛋白質中の特定のアミノ酸を欠失したり
、他のアミノ酸に置換したり或は付加したりしてヒトＴ
ＮＦ蛋白質を提供している。 「発明の開示」 本発明者らはヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸配列において
２９番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換したところ
、抗腫瘍活性か高く、副作用の低い文献未記載のヒトＴ
ＮＦ変換体ポリペプチドが得られることを見出し、その
知見に基いて発明を完成した。 本発明は、配列表配列番号ｌで示した１番目のＳｅｒか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列に
おいて２９番目のＡｒｇか他のアミノ酸により置換され
た配列を有するポリペプチドに係る。また当該ポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、この
組換えプラスミドにより形質転換された微生物細胞、こ
の微生物細胞によるポリペプチドの製造方法、医薬組成
物、前記アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンの結合した
ポリペプチド並びに配列表配列番号２で示した１番目の
Ｔから４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列におい
て８５〜８７番目のＡｒｇをコードするＣＧＣを他のア
ミノ酸をコードするコドンにより置換された配列を有す
るＤＮＡにも係る。 本明細書全般を通じてアミノ酸、ポリペプチド、塩基、
それらの配列を表わすとき下記のリストのものを用いる
。 アミノ酸： 塩基： また本明細書で使用した略号は次のとおり意味する。 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸（Ｄｅｏｘｙ
ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）Ｓ
Ｄ Ｓ ： Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ５ｕｌｆ
ａｔｅＢ Ｐ Ｂ ： Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌ
ｕｅ（ブロモフェノールブルー） ＤＴＴ ニジチオスレイトール（Ｄｉ ｔｈｉｏｔｈｒ
ｅｉｔｏｌ）ＰＭＳ Ｆ ： Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙ
ｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ＦｌｕｏｒｉｄｅＣＰＧ樹脂：
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ樹脂本発
明において２９番目のＡｒｇを置換する他のアミノ酸と
してはＡ＋Ａ’ａ、 Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、 Ｇｉｕ、
Ｐｈｅ。 Ｇｌｙ、 Ｈｉｓ、 （βｅ、 Ｌｙｓ、 Ｌｅｕ、
Ｍｅｔ、 Ａｓｎ、 Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、 Ｓｅｒ、 Ｔ
ｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ又はＴｙｒか挙げられるか、Ｇｌ
ｎ、 Ｓｅｔ、 Ｐｒｏ、 Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、、Ｈｉ
ｓ、 Ｖａｌ又はＬｅｕか望ましい。 次に本発明についてその実施態様を詳しく記載するか、
本発明に係る遺伝子操作技術については多くの文献によ
り記載されている方法や手段を適宜調整し乍ら適用する
。その文献を参考までに以下に列挙する。 Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、（１９８２）：
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 Ｒ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ。 （１９８３）：λ（ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、 １００及び＋０１、Ｒ，Ｗｕ ｅｔ ａ
ｌ、 （１９８７）： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ。 １５３、 １５４及び１５５ 本発明のポリペプチドは種々の方法、手段、機械を用い
て製造することかできるか、代表的な製造方法を下記す
る。 （１） ヒトＴＮＦ遺伝子の取得 ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述の
とおり、Ｐｅｎｎ１ｃａらにより明らかにされており、
その塩基配列を適宜変更してヒトＴＮＦ遺伝子を配列表
配列番号３のようにデサインする。 その際、宿主細胞（大腸菌なと）に適したコドンを選択
するのか望ましく、また後述のＤＮＡ断片の連結による
クローン化並びに変換体作製のための遺伝子改変か容易
に実施できるように適当な位置に適当な制限酵素切断部
位を配置するのか望ましい。勿論ヒトＴＮＦ遺伝子の上
流には翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、下流には翻訳終止
コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）をそれぞれ読み取
り枠に合致させるように設置する必要かあり、また翻訳
開始コドンの上流並びに翻訳終止コドンの下流にそれぞ
れ適当な制限酵素切断部位を設置してベクターへの適用
性、クローン化の簡便性を図るのか好ましい。 ヒトＴＮＦ遺伝子は玉鎖・下鏡それぞれについて幾つか
のオリゴヌクレオチドに分けて化学合成し、ブロックご
とに順次適切に連結する方法により作製できる。例えば
配列表配列番号３及び同４においては、ヒ）ＴＮＦ遺伝
子の各鎖を約５０塩基程度ずつ１０本のオリゴヌクレオ
チドに分け、合計２０本化学合成する。その合成方法と
してはジエステル法（Ｈ，Ｇ、 Ｋｈｏｒａｎａ、”Ｓ
ｏｍｅ ＲｅｃｅｎｔＤｅｖｅｌｏｐｒｎｅｎｔｓ ｉ
ｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
Ｅｓｔｅｒｓｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｎｔｅｒ
ｅｓじ、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ５ｏｎｓ。 Ｉｎｃ、、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６１））、ｌ・ジ
エステル法ｆ：Ｒ，Ｌ。 Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｔ、 Ｊ、 Ａｍ、
Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、、 ８９． ４８０１（
１，９６７））及びホスファイ１〜法〔八１． Ｄ、
Ｍａｔｔｅｕｃｃｉｅｔ ａｌ、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ、、 ２１．７１９ （１９８０））か
挙げられるか、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホスファイ
ト法か操作性などから好んで用いられる。 合成されたオリゴヌクレオチドは例えば逆相クロマトカ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリ
ルアミドゲルを用いた電気泳動なとの通常の精製方法に
より精製される。その後、オリゴヌクレオチドは例えば
Ｔ４ポリヌクレオチ１〜キナーセを用いてリン酸化し、
アニール化した後Ｔ４ＤＮＡリガーセを用いて連結する
。ここではオリゴヌクレオチドを幾つかのブロックに分
け、所望のヒトＴＮＦ遺伝子配列か得られるように順次
連結し、制限酵素て切断又はＴ４ＤＮＡポリメラーセに
よる平滑化後、電気泳動なとにより精製する。得られた
ＤＮＡ断片について例えはｐＵｃ８、同９、同１８、同
１９ （Ｊ、 Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎ
ｅ。 １９、２５９ （１９８２））のようなプラスミドベク
ターに組み込み、常法によりコンピテントセルを形質転
換してクローン化する。得られたクローンより公知の方
法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ベクターに
挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列が目的の遺伝子配列を
達成したか否かを点検する。達成できたヒトＴＮＦ遺伝
子の各部分について、それぞれを含むプラスミドベクタ
ーより制限酵素を用いて切り出し、再度前記ベクターに
連結後組み込み、クローニングすることにより目的の完
全長のヒトＴＮＦ遺伝子を有するプラスミドベクターを
得る。かくして得られたプラスミドベクターを制限酵素
で切断後、ゲル電気泳動法によって分離精製することに
より所望のヒトＴＮＦ遺伝子を得ることかできる。 一方、前述の方法に対してはＴＮＦを発現しているヒト
細胞由来のｍＲＮＡよりヒトＴＮＦをコードするｃＤＮ
Ａを作製し、そのｃＤＮＡを使用する方法を適宜組合せ
てもよい。 （２） ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築前記（１）で
得られたヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ遺伝子は適切に発現ベクター
に挿入してヒトＴＮＦ発現ベクターを構築する。発現ベ
クターは翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流に転写プロモ
ーター領域並びに翻訳シグナルであるＳＤ（シャイン・
ダルガーノ）配列を有し、翻訳終止コドン（ＴＡＡ、Ｔ
ＧＡ又はＴＡＧ）の下流に転写ターミネータ−領域を有
する必要がある。また、転写プロモーターとしては、ｔ
ｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモ
ーター、ＰＬプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、Ａ
ＤＣｌプロモーターなどが使用でき、転写ターミネータ
−としては、ｔｒｐターミネータ−１ｒｒｎＢターミネ
ータ−１ＡＤＣ［ターミネータ−などか使用できる。こ
のような発現ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア） 、ｐＰＬ−１ａｍｂｄａ （同左）など
の市販品の中から容易に入手できるがこれらを改良して
発現性或は取扱性をより高度化したものを使用してもよ
い。 （３） ヒトＴＮＦ変換体発現ベクターの構築ヒトＴ
ＮＦ変換体ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製方法
としては例えば次の方法が挙げられる。 （ｉ）前記（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得で記載した方
法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレオチドを適切
に連結することにより作製する。この方法によればアミ
ノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加又は欠失の改変は
自在である。 （ｉｉ）前記（１）で作製したヒトＴＮＦ遺伝子を適当
な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を除去した後
、変異を導入した塩基配列を有する合成オリゴヌクレオ
チド（例：上下鏡をアニール化して連結した二本鎖ＤＮ
Ａ断片）又は適当な他の遺伝子を組み込む。この方法に
よって前記（ｉ）の場合と同様、改変を自在に行なうこ
とかできる。−（ｉｉ）変異を導入した塩基配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＤＮ
Ａ鎖を延長することにより、変換体ポリペプチド遺伝子
を作製する（部具特異的変異法（Ｔ、 Ａ、 Ｋｕｎｋ
ｅｌｅｔ ａｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、 １５４．３６７ （１９８７）〕）。こ
の方法は１０塩基対を越える比較的長いＤＮＡ鎖の付加
及び挿入には適用し難いが、その他の改変は前記（ｉ）
の場合と同様に行うことができる。特に任意のアミノ酸
を置換することに適している。 本発明では（ｉｉ）の部位特異的変異法か好適であるの
で、以下これを中心に説明する。 先ず部位特異的変異法を行なうにあたり、鋳型ＤＮＡを
作成する。前記（１）で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を、
Ｍｅｓｓｉｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ。 １５３ 、３ （１９８７））によって開発された一重
鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクター（ｐｔＪ
ｃ１１８、ｐＵｃ１１９など）に連結し、大腸菌株に導
入する。得られた形質転換体の中より目的のプラスミド
を有するクローンを選択する。 このプラスミドをｄｕｔ−及びｕｎｇ−変異大腸菌株（
ＣＪ２３６株など）に導入し、遺伝子内にウラシルを取
り込ませ、大腸菌株にＭ１３ＫＯ７なとの変異型へルバ
ーファージを感染させて目的の一重鎖プラスミドＤＮＡ
を取得する。 一方、本発明に係る変換導入部位及びその前後の塩基配
列を存する約１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチド・ブ
ライマーを化学合成する。このブライマーと前述の工程
で得られるウラシル導入−重鎖ブラスミドＤＮＡとをア
ニール化した後、例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて、二本鎖化する。鋳型である
ウラシルを含むＤＮＡ鎖を不活性化し変異導入頻度を高
めるために、二本鎖となったプラスミドをυｎ ｇ ＋
の大腸菌株に導入する。前述のブライマーをプローブと
して用いコロニー・ハイブリダイゼ゛−ジョンを行ない
、目的の変換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む
プラスミドを有するクローンを、得られた形質転換体中
より選択する。 前述で得られるプラスミドから制限酵素切断処理により
ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片
を切り出し、前記（２）の場合と同様に発現ベクターに
挿入して目的のヒトＴＮＦ変換体発現ベクターを構築す
ることかできる。 発現ベクターを大腸菌株のような宿主細胞へ導入するこ
とについては例えば塩化カルシウム法により作製した大
腸菌株のコンピテントセルを用いる公知の方法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｔ、 Ｍａｎｉａｔ
ｉｓｅｔ ａｌ、 （１９８２） ）に従って行なう。 宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母なとの微生物細
胞か使用てきるか、なかでも大腸菌としてはＪλ１８３
、ＪＭ１０３などのＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の変異
種か挙げられる。 （４） ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドの取得本発明
においては前記（３）で記載の形質転換された微生物細
胞を培養し、目的のヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ変換体ポリペプチ
ドを培養物中に産生、蓄積させて分離する。微生物細胞
、特に大腸菌の培養方法としては従来から知られている
方法、例えは大腸菌か要求する栄養素を含んだ培養液に
大腸菌を接種し、普通３２〜３７°Ｃで約１２〜２４時
間振どう又は攪拌することにより短時間に大量に培養す
る方法か使用できる。培地は例えばＬ培地、Ｍ９培地な
と〔前記Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕か
使用でき、必要に応じてアンピシリンなとの抗生物質を
添加したり、培養開始時或は培養中にｌａｃプロモータ
ー、ｔａｃプロモーターなとの転写プロモーターの効率
を高めるためにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクＩ・
ピラノシドを添加することもできる。 本発明のヒ）ＴＮＦ変換体ポリペプチドは培養後、普通
、微生物細胞の集合体をトリスバッファーに懸濁させた
状態で超音波処理することにより破砕処理を施し、遠心
分離操作を行ない菌体残渣を除去することにより得られ
る。更に、かくして得られたものは核酸・エンドトキシ
ン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーその他従来からの蛋白質の分離精製方
法を組み合わせることにより、−層積製することができ
る。 本発明のヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドはヒトＴＮＦの
持つ抗腫瘍作用と同様の作用を存し、しかもヒトＴＮＦ
に比し優れた抗腫瘍活性を示し、副作用も軽減するので
抗腫瘍剤、医薬の活性成分として有効である。本発明の
ヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドは、なかでも、前記アミ
ノ酸配列で第２９番目のＡｒｇがＧｊ７ｎ、 ＬｙｓＳ
Ａｓｐ、 Ｈｉｓ又はＶａｆにより置換されたものか好
ましい。その医薬組成物の製剤に当っては薬理上許容さ
れる担体又は希釈剤とともに医薬組成物に製剤すること
かできる。 本発明の医薬組成物の剤型としては、外用剤、経口投与
剤、注射剤などがあげられ、それぞれの剤型にあった投
与方法で投与される。 実施例１ （ヒトＴＮＦ遺伝子のデザイン）既に報告さ
れているＣＰｅｎｎ１ｃａら、前出〕ヒトＴＮＦ構造遺
伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配
列について遺伝子構築及び変換体作製の便宜上、配列表
配列番号３のＤＮＡ塩基配列をデザインした。ここでは
適当な間隔て制限酵素切断部位を組み込み、またプラス
ミドベクターと容易に連結できるように翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）の上流に制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位
を、翻訳終止コドン（ＴＡＡ及びＴＧＡ）の下流には制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位をそれぞれ設けた
。 実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）前記実施例
１でデザインされたＤＮＡは、自動ＤＮＡ合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ、モデル３８１Ａ）を用いて
、ホスファイト法にて化学合成した。合成は配列表配列
番号４て示した塩基配列を存するＵ−１〜ＩＯ及びＬ−
１〜ＩＯの２０本のオリゴヌクレオチドに分割して行い
、合成されたオリゴヌクレオチドのＣＰＧ樹脂（フナコ
シ社販売）からの切り出し及び保護基脱離は、アプライ
ド・バイオシステムズ社のマニュアルに従った。 各オリゴヌクレオチドの分離精製は逆相クロマ１、カラ
ムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）又
は７Ｍウレアを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル濃度ＩＯ〜２０％）により行った。 ＨＰＬＣ法については、ヌクレオジル５Ｃ１８カラム（
φ４．６Ｘ１５０ｍｍ：ケムコ社販売）を用いた逆相ク
ロマトグラフィーによって、アセトニトリルを含むトリ
エチルアミノ酢酸（１００ｍＮ０バツフアー（ｐＨ７，
０）で溶出することにより分離精製した。上記溶出は、
アセ）・二）・ジルの直線濃度勾配を５〜３５％（３０
分）とし、約１５分のピークを回収した。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に関しては、各合成
オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により分離し、紫外
線シャドウィング法による泳動パターンの観察結果より
目的の大きさのバンド部分を切り出し、そのポリアクリ
ルアミドゲル断片を約１〜２ｍｍ’の大きさに切りきざ
み、約２ｍｆｆの溶出バッファ −（０，５Ｍ ＮＨＪ
Ａｃ及びＩｍＭ ＥＤＴＡ ）を加え、３７°Ｃて一晩
振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッファ
ーを回収し、フェノール抽出（５０％フェノール１５０
％クロロホルム溶液使用）、イソブタノール抽出を行い
、エタ、７−ル沈殿操作により各オリゴヌクレオチドの
精製試料とした。 合成・精製したオリゴヌクレオチドの一部について、マ
キサム・ギルバード法（Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍ ｅｔ ａ
ｌ。 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５４
９９ （ｉ９８０） ］により、目的の塩基配列を有し
ていることを確認した。 以下（実施例３．４及び５）の遺伝子組換えに係わる操
作において、制限酵素及び他の関連酵素の反応条件等は
、おもにＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （前出
）記載の方法に準じた。なお、上記酵素等はおもに宝酒
造より入手しており、宝酒造のマニュアルも参考にした
。 実施例３（合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の構築） （１）まず第１図に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構築を試
みた。 前記実施例２で得られる合成オリゴヌクレオチドを３つ
のグループ（Ｕ及びＬ−１〜４、Ｕ及びＬ−５〜７並び
にＵ及びＬ−８〜１０）に分けてクローニングを行った
。すなわち、Ｕ−２，３，４，６，７，９及びＩＯ並び
にＬ−１，２，３，５，６，８及び９の各オリゴヌクレ
オチド（ｌ−２μ ヌクレオチドキナーセ（宝酒造）を用いて、それぞれ別
々にリン酸化する。リン酸化反応は１０μβの水溶液中
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（、ｊ７ ｐＨ ７．６、１
０ｍＭＭｇＣｆｆ２、０． １ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉ
ｎｅ， ０． １ｍＭ ＥＤＴＡ， １０ｍＭＤＴＴ及
び１ｍＭ ＡＴＰ）、３７°Ｃて１時間行い、反応終了
後、７０°Ｃて１０分間処理することによりＴ４ポリヌ
クレオチトキナーセを失活させた。新たに、ｌ−２μ 及び１０の各オリゴヌクレオチドをそれぞれ別々に含む
上記と同組成の水溶液ｌＯμβを用意し、それぞれＵ及
びＬの同じ番号同士で各オリゴヌクレオチド（Ｕ−１〜
１０及びＬ−１〜１０）水溶液を混合しく２０μｐ）、
１００°Ｃて５分間煮沸後徐冷することによりアニール
化した。次に、得られた１０本のアニーリング体（二本
６！ Ｄ Ｎ Ａ断片）を、各グループごとに連結反応
のための水溶液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣβｐＨ７．
６、６． ６ｍＭ ＭｇＣβ２、１０ｍ！，ｌ ＤＴＴ
， １ｍＭ ＡＴＰ及び１００μｇ／ｍｆｆ ＢＳＡ）
に添加しく総液量１２０〜１６０μＡ）、４０°Ｃに加
温後徐冷によるアニール化の後、７００ユニツトのＴＪ
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１６°Ｃで１５
時間連結反応を行った。反応終了後、各反応液をポリア
クジルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）により分離
し、エチジウムブロマイド染色法による泳動パターンの
観察結果より目的の大きさ（１７６ｂｐ， １５０ ｂ
ｐ及び１５３ ｂｐ）のバント部分を切り出し、エレク
トロ・エリコーション法により目的とする３本のＤＮＡ
断片を回収した。更に、回収した各試料に対してフェノ
ール抽出（５０％フェノール１５０％クロロホルム溶液
使用）、イソブタノール抽出を行い、エタノール沈殿操
作により目的のＤＮＡを精製した。上記方法に準じて、
精製した３本の二本鎖ＤＮＡ断片をそれぞれ別々にその
５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化し、連結反応のための水溶液中にて混合の後、４０
°Ｃの加温によりアニール化を行い、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを加えて連結した。エタノール沈殿操作によりこの連
結ＤＮＡを回収し、１ｍＭＤＴＴ及び１００μｇ／艷Ｂ
ＳＡを含む５０μβのハイ・ソルトバッフ７− （５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ ｐＨ７，５，１００ｍＭ
ＮａＣＡ、１０ｍＭ ｌ＋Ｉｇｃｉ’ ２）に溶解させ
、１５４ニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ （宝酒造）及び
１５ユニットの制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ （宝酒造）を添
加して、３７°Ｃで２時間切断反応を行った。反応終了
後、上記方法に準じて、ポリアクリルアミドケル電気泳
動（ゲル濃度４％）により目的とするＤＮＡ断片（約４
８０ｂｐ）を分離精製した。 一方、プラスミドベクターｐｔＪｃ９ （九州大学遺
伝情報実験施設より分与）の５μｇを、前記の方法に準
じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断
し、アガロースゲル電気泳動（ケル濃度１％）により約
２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。 先に精製した約４８０ｂｐのＤＮＡ断片（ヒトＴＮＦ遺
伝子を含む）とこのｐＵｃ９断片を、前記の方法に準じ
て、２０μｌの連結反応液中にて混合し、３５０ユニツ
トのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、１６°Ｃて３時間
連結反応を行った。塩化カルシウム法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕により作製したＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＪＭ８３株（九州大学遺伝情報実験施設に
より分与）のコンピテントセルを、上記連結反応液によ
り常法に従って形質転換した（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１
ｏｎｉｎｇ参照〕。 得られたアンピシリン耐参照口−ンより、公知の方法を
用いてプラスミドを調製し、前記の方法に準じて、制限
酵素（ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌＩ）処理後、アガロ
ースケル電気泳動によりその泳動パターンを解析するこ
とにより、ヒトＴＮＦ遺伝子のｐｌＪｃ９ベクターへの
挿入を調べた。その結果、約２５０ｂｐの遺伝子の挿入
か確認てき、そのクローンについて挿入された遺伝子の
塩基配列をダイデオキシ法ＣＦ、Ｓａｎｇｅｒ、 ５ｃ
ｉｅｎｃｅ、 ２１４．１２０５ （１９８１））によ
り調べたところ、ＥｃｏＲＩ部位から下流に約１３０ｂ
ｐとＨｉｎｄＩ［部位から上流に約９０ｂｐの目的とす
るヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を有する遺伝子断片であ
ることか確認された。このクローン及びプラスミドをそ
れぞれｐＵＡ４１／ＪＭ８３及びｐＵＡ４１と命名した
。 （２）引き続き、第２図に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構
築を試みた。 前記（１）工程でのクローニングでヒトＴＮＦ遺伝子の
塩基配列において未達成な領域周辺を２つのグループ（
Ｕ及びＬ−３〜６並びにＵ及びＬ−６〜９）に分け、前
記（１）工程と同様にして、各オリゴヌクレオチドをリ
ン酸化し、アニール化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼに
より連結した。前記方法に準じて、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度６９６）により分離精製し、得
られた２本のＤＮＡ断片（２０１ｂｐ及び２００ｂｐ）
をそれぞれ別々に１００μＡの６７ｍ１１１ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＡ’ （ｐＨ８，８）、６．７ｍλ（ＭｇＣβ２
．１６．６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，６，７μＡ（Ｅ
ＤＴＡ、 １ｍＭ ＤＴＴ、 ２００ ｕｇ／ｍｌ
ＢＳＡ及び各３３０μＭデオキシリボヌクレオチド三
リン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ及びＴＴＰ
）水溶液にて溶解し、２〜５ユニツトのＴ４ ＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造）を添加し、３７°Ｃて３０分間反
応することによりＤＮＡ断片の両末端を平滑化した。反
応終了後、６８°Ｃで１０分間処理することによりＴ４
ＤＮＡポリメラーゼを失活させ、エタノール沈殿によ
り目的の２本のＤＮＡ断片を回収した。 一方、５μｇのｐＵｃ９ベクターをｌ ｍＭ ＤＴＴ及
び１００μｇ／ｍ１ＢＳＡを含む５０μβのミデイアム
・ソルトバッフｙ −（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ，ｉ
？ ｐＨ７，５，５０＋ｎ１ｌＮａＣ（！及びｌ０ｍＭ
ＭｇＣｌ ２）に溶解させ、１５ユニツトの制限酵素
ＨｉｎｃＩＩ （宝酒造）を添加し、３７°Ｃで２時間
の反応後、エタノール沈殿により回収した。得られた切
断・開環したｐＵＣ９ベクターに、先に平滑化後回収し
た２本のＤＮＡ断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じ
て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ−１２ＪＭ８３株を形質転換した。得られたそ
れぞれのクローンについて、前記（１）工程と同様にし
て、挿入されたＤＮＡの塩基配列を調べ、目的の塩基配
列であることを確認した。これらのクローンをそれぞれ
ｐＬＩＡ４２／Ｊλ（８３及びｐＵＡ４３／Ｊ入（８３
と命名し、プラスミドをｐ［ＪＡ４２及びｐｔＪＡ４３
と命名した。 上記（１）工程で得られたｐＵＡ４１を制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ１（ハイ・ソルトバッファ−）及び５ａｃＩ（宝酒造
、ロウ・ソルトバッファー）、制限酵素Ｈａｅ ＩＩ（
宝酒造）及び旧ｎｄＩＩＩ（ミデイアム・ソルトバッフ
ァー）て、上記（２）工程で得られたｐＬＩＡ４２を制
限酵素Ｓａｃ Ｉ （ロウ・ソルトバッファー）及びＨ
ｐａ Ｉ（宝酒造二ＫＣβバッファー）で並びにｐ［Ｊ
Ａ４３を制限酵素Ｈｐａ Ｉ及びＨａｅＩＩ （Ｋ（Ｊ
７バツフアー）で、前記方法に準じて、それぞれ切断し
た。ロウ・フルトバッフｙ −（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊ？ ｐＨ７，５及び１０ｍＭ ｈｃ（！ ２）
とハイ・ソルトバッファー又はＫＣｌバッフｙ −（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ８，５，１００ｍＭ Ｋ
ＣＪ７及び１０ｍＭ ＭｇＣｊ７２）の組み合わせにつ
いては、切断反応を２回に分け、反応の間にエタノール
沈殿操作を行うことにより対応した。ｐＵＡ４１からの
ＥＣＯＲｌ−８ａｃ Ｉ ＤＮＡ断片（１２７ｂｐ）及
びＨａｅＩＩ−ＨｉｎｄＩ［ＤＮＡ断片（８０ｂｐ）、
ｐＵＡ４２からのＳａｃ Ｉ −Ｈｐａ Ｉ ＤＮＡ断
片（１４７ｂｐ）並びにｐＬＩＡ４３からのＨｐａ Ｉ
−ＨａｅＩＩ ＤＮＡ断片（１２６ｂρ）を、前記方
法に準じて、それぞれポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度６％）により分離精製した。 一方、５μｇのｐｔＪｃ１９プラスミドベクター（九州
大学遺伝情報実験施設より分与）を、前記の方法に準じ
て、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、
約２．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度１％）により分離精製した。先に精製した
４本のＤＮＡ断片を図示（第２図）したように順次添加
し、前記方法に準じて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結して行き、最後に上記の精製ｐＵｃ１９ベクター（
約２．７Ｋｈｐ断片）に絹み込み、ＪＭ８３株を形質転
換した。この形質転換体に含まれるプラスミドＤＮＡに
ついて、前記方法に準じて、挿入されたＤＮＡの塩基配
列を調へたところ、目的とする完全長（約４８０ｂｐ）
のヒ）ＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドベクター（約３．
２ Ｋｂｐ）を有するクローンであることが確認できた
。このクローンを ｐＵＡ４４／ＪＭ８３と命名し、プ
ラスミドをｐＵＡ４４と命名した。 実施例４（ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築）（１）
大腸菌ｔａＣプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ
２２３−３ （ファルマシア社より入手）をより扱い
やす（する目的で以下の改良を試みた。 ｉ）発現ベクターを低分子量化する。 １ｉ）制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位を唯一とする。 １ｉｉ）ｔａｃプロモーターの方向をアンピシリン耐性
遺伝子の方向と逆向きにする。 第３図にその方法を図示した。 プラスミドベクターｐＢＦ？３２２ （九州大学遺伝
情報実験施設より分与）の５μｇを、実施例３の方法に
準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩＩＩで切断後
、その両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーセを用いて平滑
化した。実施例３の方法に準してアガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度１％）により約４．４ ＫｂｐのＤＮＡ断
片を分離精製し、その開環部位に１１００ｎのＢｇｌＩ
Ｉリンカ−（制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位を含む１０ｂ
ｐの二重鎖ＤＮＡ断片・宝酒造より入手）をＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを用いて挿入連結した。 前記実施例３の方法に準じて得た形質転換体のなかより
、そのプラスミドについて制限酵素による切断の可否を
調へることにより、目的の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎ
ｄｌＩ［切断部位を欠き、制限酵素Ｂｇ１■切断部位を
新生したプラスミドｐＢＲ９３３３（約４．４Ｋｂｐ’
）を有するクローンを得た。 上記で得たプラスミドｐＢＲ９３３３の５μｇを、実施
例３の方法に準して、ハイ・ソルトバッフ了−に溶解し
、制限酵素ＢｇｌＩ［（宝酒造）及びＰｖｕ Ｋ（宝酒
造）で切断し、複製起点を含む約２．３ＫｈｐのＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により
分離精製した。一方、発現ベクターｐＫＫ２２３−３（
約４．６ ｋｂｐ’）の５μｇを上記同様ハイ・フルト
バッファーに溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩ （宝酒造）
及び５ｃａＩ（宝酒造）で切断した。制限酵素ＢａｍＨ
Ｉによる切断反応は、添加酵素量を通常の約１／２とし
、反応時間を５〜３０分間とする部分切断により行った
。切断処理後、ｔａｃプロモーター及びｒｒｎＢＴ＋Ｔ
２ターミネータ−等を含む約１．］、ＫｂｐのＤＮＡ断
片を上記同様アガロースゲル電気泳動により分離精製し
た。先に精製した複製起点を含む約２．３ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片に上記の約１．ＩＫｂｐのＤＮＡ断片を前記に準
じてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結し、実施例
３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作製したＥ
、ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ１０３株（九州大学遺伝情報
実験施設）のコンピテントセルに導入した。得られた形
質転換体の中より、目的とするｔａｃプロモーター等を
含む発現ベクター（約３．４ Ｋｂｐ）を有するクロー
ンを選択し、この発現ベクターを１）ＫＫＩＯＩ と命
名した。 （２）第４図に従って、次の工程を説明する。 前記（１）工程で得た発現ベクターｐＫＫＩ０１の５μ
ｇを、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄ■で切断し、複製起点及び転写調節領域等を含む約
３．４ ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースケル電気泳動
（ケル濃度１％）により分離精製した。また、前記実施
例３て得られたヒトＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドｐＵ
Ａ４４ （約３．２ ｋｂｐ）を、同様にして、制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［て切断し、ヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４８０ｂρのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離精製した。このヒ）ＴＮＦ遺伝
子全域を含むＤＮＡ断片を、前記方法に準じて、先に発
現ベクターｐＫＫ１０１より精製した約３．４ｋｂｐの
ＤＮＡ断片にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結し
、前記の方法に準じてＥ、 ｃｏｌｉＫ−１２ＪＭＩ０
３株に導入した。得られた形質転換の中より目的のヒト
ＴＮＦ発現ベクター（約３．９Ｋｂｐ）を有するクロー
ンを選択し、この発現ベクターをｐＫＦ４１０２と命名
した。 実施例５（ヒトＴＮＦ変換体発現ベクターの構築）（１
） 第５図に従って説明する。 前記実施例３て得られたプラスミドｐｔＪＡ４４を前記
方法に準じて制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩて
切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子（全域を含む約４８０ｂｐ’
）のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精
製した。一方Ｍｅｓｓｉｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。 １５３、３ （１９８７） ３によって開発された一重
鎖ブラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクターｐＵｃ１
１９（宝酒造より入手）を、同様にして制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ■及びＨｉｎｄＩ［で切断し、ＩＧ領領域含む約３．
２ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により
分離精製した。このＩＧ領領域Ｍ１３ファージＤＮＡの
ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）の存在により、
プラスミドｐＵＣ１１９はへルバーファージＭ１３ＫＯ
７感染後優先的に一本鎖ＤＮＡとなりファージ粒子に包
み込まれ菌体外に放出される。上記で精製したヒトＴＮ
Ｆ遺伝子全域を含む約４８０ｂｐのＤＮＡ断片とＩＧ領
領域含む約３．２ＫｂｐのｐＵｃ１１９断片を前記に準
じてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、前記実施例
３の方法に準じてＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ８３株
に導入した。 得られた形質転換体の中より、目的のプラスミド（約３
．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択し、このクローン
をｐｔＪｃ １１９−ｈＴＮＦ／ＪＭ８３と命名し、プ
ラスミドをｐＵｃ １１９−ｈＴＮＦと命名した。 上記で得たプラスミドｐＵｃ１１９−ｈＴＮＦを、その
ＤＮＡ内にウラシルを取り込ませ保持するために、前記
実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作製
した大腸菌ＣＪ２３６株（ｄａｔ−、ｕｎｇつのコンピ
テントセルに導入した。ＣＪ２３６株は、デオキシウリ
ジン三リン酸分解酵素遺伝子に欠失変異（ｄｕｔ”）を
持つため競合反応が生じ、チミンの替わりに一部ウラシ
ルを取り込んだＤＮＡを作ることかでき、更にｕｎｇ−
変異によりウラシルＮ−グルコシラーゼか欠損しており
、そのウラシルをＤＮＡ中に保持してお（ことかできる
。このＣＪ２３６株はバイオ・ラドより入手した。上記
導入により得られたクローン（ｐｔＪｃ１１９−ｈＴＮ
Ｆ／ＣＪ２３６）をヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝
酒造より入手）の感染後、１００μｇ ／ ｍｅアンピ
シリン、７０μｇ／ｍｌカナマイシン及び３０μｇ ／
ｍｌクロラムフェニコールを含む２ＸＹＴブロース（
１，６％トリプトン、１％酵母エキス及び０．５％Ｎａ
Ｃ！！ｐＨ７，６）にて培養することにより、目的のウ
ラシルを導入した一重鎖ブラスミドＤＮＡ （約３．７
Ｋｂａｓｅｓ）をファージ粒子に包み込んだ形で菌体外
に放出させた。放出させたファージ粒子を培養上清より
回収し、−重鎖ファージＤＮＡの調製方法に準じて、目
的の一重鎖ブラスミドＤＮＡを調製した。 （２）次に第６図に従って説明する。 プラス鎖オリゴヌクレオチドを用いてヒトＴＮＦ遺伝子
に対し変異導入を行うために、配列表配列番号５で示し
たプライマー４１３４、同月３５、同４２０５、同４３
９１．同４３９２、同４３９８、同４４０９及び同４４
１０をデザインした。このオリゴヌクレオチドの化学合
成及び精製は前記実施例２の方法に準じて行った。 ヒトＴＮＦ遺伝子への部位特異的変異導入はバイオ・ラ
ドのシステム（Ｍｕｔａ−ＧｅｎｅＴＭｉｎ ｖｉｔｒ
。 ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）に準じて行った。す
なわち、上記で作製した約０．５μｇのプライマーの５
′末端を前記方法に準じてＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼによりリン酸化した一部と、先に調製したウラシル導
入−重鎖ブラスミドＤＮＡ （ｐｔＪｃ １１９−ｈＴ
ＮＦ）の約２００ｎｇとの間て、１０μｌのアニーリン
グ・バッファ （２０ｍＭ Ｔｒｙｓ ＨＣｌ ｐＨ
７，４，２ｍＭＫ＋ｇＣｆｆ２及び５０ ｍｈ！ Ｎａ
Ｃｆｆ ）中にてアニーリング（約７０°Ｃに加温後徐
冷）を行った。アニーリング終了後、１０倍シンセシス
・バッファー〔５ｍＭ各デオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ及びＴＴＰ
）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＡ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７，４，５０ｍＭ ＭｇＣｊ’ ２及び２０ｍＭ
ＤＴＴ ）を１７１Ｏ容量加え、１ユニツトのＴ４
ＤＮＡポリメラーセ及び２〜４ユニツトのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて二本鎖化反応（３７°Ｃ１９０分間）
を行った。ＴＥバッフ−ｒ−（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７，５及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）を約８容量加
え、凍結することにより反応を停止した。 前記実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム法により
作製したＥ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＴＧＩ株（ｕｎｇ”
：アマシャム社）のコンピテントセルに、上記反応液
を処理し二本鎖ＤＮＡを導入した。ｕｎｇ＋株にヘテロ
二本鎖ＤＮＡを導入することにより、鋳型であるウラシ
ルを含むＤＮＡ鎖は不活性化され複製の対象とならない
。そのため変異の導入頻度は５０％を上回る高効率なも
のとなる。得られた形質転換体の中より、変異導入のた
めに使用したプライマーをプローブとしたコロニー・ハ
イブリダイゼーション法を用いて、目的の変換体ＤＮＡ
を含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を有するクローン
を選択した。選択されたクローンについて、そのプラス
ミドの変異導入部位周辺の塩基配列をダイデオキシ法Ｃ
Ｆ、 Ｓａｎｇｅｒ ：前出〕により調へ、デザイン通
りの変換体ＤＮＡに変異していることを確認した。 これらのプラスミドをそれぞれｐＵｃ１］、９−Ｆ４１
３４、ｐＵｃ１１９−Ｆ４１３５、ｐｔＪｃ１１９−Ｆ
４２０５、ｐＬＩｃ １１９−Ｆ４３９１、ｐｔＪｃ１
１９−Ｆ４３９２ 、ｐＵｃ１１９−Ｆ４３９８、ｐＵ
ｃ１１９−Ｆ４４０９及びｐ（ＪＣ１１９−Ｆ４４１０
と命名した。 変異導入により得られた目的のヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ変換体
遺伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方
法に準じて、ｔａｃプロモーターを存する発現ベクター
ｐＫＫ１０１に組み込みヒトＴＮＦ変換体発現ベクター
を構築した。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子（約４８０ｂｐ）
は、上記で得られた約３．７ＫｂｐのプラスミドｐＬｌ
ｃ１１９−Ｆ４１３４ 、ｐｔＪｃ１１９−Ｆ４１３５
．１）ＵＣ１１９−Ｆ４２０５、ｐＬｌｃ１］９−Ｆ４
３９１、ｐＵｃ１１９−Ｆ４３９２、ｐｌＪｃｌ １９
−Ｆ４３９８ 、ｐＵｃ１１９−Ｆ４４０９及びｐｏｃ
ｌ １９−Ｆ４４１０より、前記方法に準じて、それ
ぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［による切断後
分離精製した。目的とするそれぞれのヒトＴＮＦ変換体
発現ベクター（ｐＫＦ４１３４、ｐＫＦ４１３５ 、ｐ
ＫＦ４２０５ 、ｐＫＦ４３９１ 、 ｐＫＦ４３９２
、ｐＫＦ４３９８ 、ｐＫＦ４４０９及びｐＫＦ４
４１０）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２
）と同様、宿主としてＥ。 ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ１０３株を用いて取得した。 上記８種類の変換体発現ベクターは、発現誘導により、
以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチドを大
腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４１３４ ：配列表配列番号ｌて示した
２９番目のＡｒｇかＧＡｎに変換 されたポリペプチドＦ４１３４を コードする。 ベクターｐＫＦ４１３５ ：配列表配列番号１で示した
２９番目のＡｒｇかＳｅｔに変換 されたポリペプチドＦ４１３５を コードする。 ベクターｐＫＦ４２０５ ：配列表配列番号１て示した
２９番目のＡｒｇかＰｒｏに変換 されたポリペプチドＦ４２０５を コードする。 ベクターｐＫＦ４３９１ ：配列表配列番号１て示した
２９番目のＡｒｇがＬｙｓに変換 されたポリペプチドＦ４３９１を コードする。 ベクターｐＫＦ４３９２ ：配列表配列番号１で示した
２９番目のＡｒｇかＡｓｐに変換 されたポリペプチドＦ４３９２を コードする。 ベクターｐＫＦ４３９８ ：配列表配列番号１て示した
２９番目のＡｒｇかＨｉｓに変換 されたポリペプチドＦ４３９８を コードする。 ベクターｐＫＦ４４０’９ ：配列表配列番号１て示し
た２９番目のＡｒｇかＶａｆに変換 されたポリペプチドＦ４４０９を コードする。 ベクターｐＫＦ４４１０・配列表配列番号１て示した２
９番目のＡｒｇかＬｅｕに変換 されたポリペブチｌ’ Ｆ４４１０を コードする。 実施例６（ヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の大腸菌に
よる発現及び精製） 実施例４て得られたヒ１−ＴＮＦ発現ヘクター（ｐＫＦ
４］０２）及び実施例５て得られたヒｌ−Ｔ Ｎ Ｆ変
換体発現ベクター（ｐＫＦ４１３４、ｐＫＦ４１３５、
ｐＫＦ４２０５、ｐＫＦ４３９１、ｐＫＦ４３９２、ｐ
ＫＦ４３９８、ｐＫＦ４４０９及びｐＫＦ４４１０）を
有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１２Ｊｕ１０３株を、２５
〜５０μｇ ／ ｍｌアンピシリン及び０．００１％ビ
タミンＢ１を含むＭ９培地（０，６％Ｎａ２ＨＰＯ＜、
０．３％ＫＨ２ＰＯ４，０，０５％Ｎａ（Ｊ？ 、Ｏ
，Ｉ％ＮＨａＣｆ 、 ２ｍＭλＩｇｓ０４．０．２％
クルコース及びＯ，１ｍＭ ＣａＣｆ’ ２’） ２０
ｍｌに接種し、３７°Ｃ１１８時間振どう培養を行っ
た。この培養液２０ｍ１を上記培地ｊリッ）〜ル中に加
え、３７°Ｃ１２〜３時間振どう培養を行った。次いて
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ’）を最終濃度１ ｍＭとなるように添加し、更に
３７°Ｃ１１８時間振どう培養を続けた。 遠心分離操作による大腸菌菌体の回収後、ＴＰバッ”）
７− （１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ ｐＨ８，０
及び１００μＭ ＰＭＳＦ）を用いて菌体の洗浄を行っ
た。洗浄後、菌体グラム当たりｌＯ容量（ｍｌ ）のＴ
Ｐバッファーに菌体を懸濁させ、超音波発生装置（ヒー
ト・システムズ；モデルＷ−２２５）を用いて菌体を超
音波破砕処理した。得られた懸濁液を遠心分離すること
により、菌体残渣を除去し上溝両分を回収した。この超
音波破砕処理以降の精製工程は、おもに低温下（０°Ｃ
〜４°Ｃ）で行った。 この上清を０．４５μｍフィルターにてろ過した後、セ
パビーズＦＰ−ＤＡ］３ （三菱化成工業）を用いた陰
イオン交換クロマトグラフィー（カラムサイズ。 φ２．５ Ｘ １．５ ｃｍ及び流速：０．５ｍｆ／分
）で分画し、後記５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及びＬ９２９細胞を用いた後記実施例７の方法に準
じて活性の有無を検定することによって活性画分を得た
。溶出にはＮａＣｌを含むＴＰバッファーを用い、Ｎａ
Ｃ、ｅ濃度を０．０５ Ｍから０．１Ｍ、０．２Ｍ、０
．５Ｍへと段階的に上げ、ヒトＴＮＦ並びにヒトＴＮＦ
変換体Ｆ４１３４及び同Ｆ４１３５はＯ，ＩＭＮａＣＩ
！で、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ ４２０５は０．５ ＭＮａ
Ｃ！で、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４３９１、同Ｆ ４３９２
、Ｆ ４３９８、同Ｆ ４４０９及び同Ｆ４４１０は０
．２ Ｍ ＮａＣＡでそれぞれ溶出した。更に大腸菌菌
体由来のエンドトキシン等を除去するために、核酸・エ
ンドトキシン除去剤Ｃ−９（栗田工業製造、大日本製薬
販売）処理を添付マニュアルに準じて行った。かくして
、ヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の一段階精製試料を
得た。この試料を使用して、後記実施例７及び８の抗腫
瘍活性の評価を行った。 上記試料を０．２０μｍフィルターにてろ過した後、Ｆ
ＰＬＣシステムによる制御下のモノＱ＠ （ＨＲ１０／
１０及びＨＲ５１５）プレパックカラム（ファルマシア
ＬＫＢバイオテクノロジー社製）を用いた陰イオン交換
クロマトグラフィーで、ＮａＣβを含むＴＰＱバッフｙ
−（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２ｐＨ８，０及びｌ
ＯμＭ ＰＭＳＦ）によって溶出し、分画を後記５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＬ９２９細胞を
用いた後記実施例７の方法に準じて活性の有無を検定す
ることによって活性画分を得た。溶出方法は、ＦＰＬＣ
システムの制御下で下記プログラムに従って行った。各
試料における最終ステップは、精製純度を上げるために
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一
バンドとなるまで数回繰り返した。 第１ステップ：モノＱ■（ＨＲ５１５）カラム使用（流
速：１ｍ１１分） ０〜２分；ＯＭＮａＣＪ？ ２〜１５分； Ｏ−０，１５Ｍ ＮａＣｊ７直線濃度直
線濃度−配置５〜２０分 １５−０．５ Ｍ ＮａＣｌ
！直線濃度勾配２０〜３０分； ０．５ Ｍ ＮａＣＪ
？上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣＪ？濃
度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４１３４か０
．３５Ｍ、１８．０分及び同Ｆ４１３５か０．３ Ｍ、
１８．０分てあった。 第２ステツプ・モノＱ■（ＨＲ１０／１０）カラム使用
（流速＝４ｍρ／分） ０〜５分；０−０．２ＭＮａＣｆｆ直線濃度勾配５〜１
６分； ０．２ Ｍ Ｎａ（４２１６〜２０分； ０．
２−０．５ Ｍ ＮａＣｐ直線濃直線濃度勾配２橿〜２
４ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣＡ濃度及
び保持時間）は、ヒトＴＮＦか０．２Ｍ、５．３分、ヒ
トＴＮＦ変換体Ｆ ４２０５が０．２Ｍ、４．８分、同
Ｆ４３９１か０．２Ｍ，４．２分、同Ｆ ４３９２が０
．２Ｍ、４、５分、同Ｆ ４３９８か０．２Ｍ、４．５
分、同Ｆ ４４０９か０、２Ｍ、４．４分及び同Ｆ４４
１０が０．２Ｍ、４．５分てあった。 第３ステップ：モノＱ ＠ （ＨＲ ５１５）カラム使
用（流速：１ｍ（！／分） ０〜２．５分； Ｏ −０． ２ Ｍ ＮａＣＡ直線濃
度勾配２、５〜８分； ０． ２ Ｍ ＮａＣｆ８〜１
０分； ０． ２ −０． ５ Ｍ ＮａＣＡ直線濃度
勾配ｌＯ〜１２分；０．５ＭＮａＣβ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ ＮａＣ７濃度
及び保持時間）は、ヒトＴＮＦか０．２Ｍ、３．７分、
ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４１３４か０．２Ｍ、３．７分、同
Ｆ４１３５か０．２Ｍ，３．７分、同Ｆ ４２０５が０
．２Ｍ。 ３、１分、同Ｆ ４３９１が０．２Ｍ，３．４分、同Ｆ
４３９２か０、２Ｍ，３．２分、同Ｆ ４３９８か０
．２Ｍ，３．３分、同Ｆ ４４０９が０．２Ｍ、３．２
分及び同Ｆ ４４１０が０．２Ｍ。 ３、４分てあった。 第４ステップ：モノＱ■（ＨＲ ５１５）カラム使用（
流速：１ｍ１１分） ０〜６分； ０ −０． １ ５Ｍ ＮａＣｆ直線濃度
勾配６〜１１分； ０． １ ５ −０． ２ Ｍ Ｎ
ａＣｆ直線濃度勾配置１〜１３分； ０． ２ −０．
５ Ｍ ＮａＣＡ＋直ＰＡａ度勾配置３〜１５分；
０． ５ Ｍ ＮａＣＡ上記方法に従った活性画分の分
画結果（ ＮａＣｆ濃度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦ
が０．１６Ｍ、６．５分、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ４１３５
が０．１６Ｍ、６．７分、同Ｆ ４２０５か０． １７
Ｍ， ７． １分、同Ｆ４３９１か０． １５Ｍ。 ５、４分、同Ｆ ４３９２か０．１６Ｍ， ６．７分、
同Ｆ ４３９８が０、 １６Ｍ， ５． ８分、同Ｆ
４４０９か０．１６Ｍ， ７．８分及び同Ｆ４４１０か
０．１７Ｍ， ７． ５分てあった。 かくしてヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の精製試料を
得た。この試料を使用して後記実施例７の抗腫瘍活性の
評価を行った。 上記精製の過程および精製試料について５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒトＴＮＦ及び変換
体ポリペプチドの発現および精製の確認をした。各試料
をｌ Ｏ ｍＭ ＤＴＴを含有するＬａｅｍｍｌ ｉ’
ｓサンプル・バッフｙ −（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ ｐＨ ６．８、２％ＳＯ３ 、０．０１％Ｂ
ＰＢ及び１０％グリセロール）に加え、Ｌａｅｒｎｍｌ
ｉ （Ｎａｔｕｒｅ， ２２７。 ６８０ （１９７０））の方法に準じ、１５％の分離用
ゲルを用いて泳動を行った。電気泳動終了後、分離用ゲ
ル中の蛋白質をクマシー・ブリリアント・ブルーで染色
することにより確認した。第７図にその結果の〜部を示
した。それぞれの発現ベクターによるヒトＴＮＦ及び変
換体ポリペプチドの発現量はほぼ同程度であり、得られ
た染色ゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ５−９２
０型）にかけてその発現効率を算出したところ、大腸菌
総菌体蛋白質の約２０％であった。また、最終精製試料
は、得られた染色ゲルにおいて単一バンドであった。そ
の泳動位置より、ヒｈＴＮＦ及び変換体ポリペプチドの
分子量を算出し第１表に示した。 なお、蛋白質の物性の一つとして、ヒトＴＮＦ及び変換
体ポリペプチドの等電点をアンフオライン（ＬＫＢ社製
）を用いた等電点ゲル電気泳動法により測定し、得られ
た結果を第１表に示した。 第１表 ヒ１〜ＴＮＦ及び変換体ポリペプチドの等電点
及び分子量 ヒトＴ Ｎ Ｆ ５．６ １
７．０Ｆ４１３４（２９Ａｒｇ−Ｇｌｎ） ５．３
１７．０Ｆ ４１３５（”Ａｒｇ ＋５ｅｒ）
５．３ １７．０Ｆ４２０５（”Ａｒｇ−
Ｐｒｏ） ５．２ １７．０Ｆ４３９１（”
Ａｒｇ＋Ｌｙｓ） ５．６ １７、ＯＦ ４
３９２（”Ａｒｇ４Ａｓｐ） ５．０ １７
．０Ｆ４３９８（”Ａｒｇ−Ｈｉｓ） ５．２，５．
４” １７．０Ｆ４４０９（”Ａｒｇ−”Ｖａｆ
） ５．２ １７．０Ｆ４４１０（”Ａｒｇ
−”Ｌｅｕ） ５．２ １７．０実施例７
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性の評価）実施例６で得ら
れたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体ポリペプチドの一
段階精製試料及び精製試料について、マウス由来結合組
繊細胞Ｌ ９２９（ＡＴＣＣＣＣＬＩ）に対する細胞傷
害活性をＡｇｇａｒｗａｌら〔Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、、 ２６０．２３４５ （１９８５） ）の方法に
準じて求めた。すなわち、９６ウエルの組織培養用のマ
イクロプレート（コーニング社製）に３Ｘ１０’細胞１
０．１ｍＡ’／ウェルてＬ９２９細胞を植え、５％炭酸
ガス存在下３７°Ｃて一晩培養した。培地としては、１
０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏによって修
飾されたイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（Ｄ
ＭＥ培地、シグマ社製）を用いた。 翌日、最終濃度１μｇ／ｍｌ！のアクチノマイシンＤを
添加した上記培地に培地を交換し、この培地にて段階希
釈した試料を各ウェルに処理した（総培地量０．１ｍＪ
）。更に２０時間の培養後、０，５％クリスタル・バイ
オレット溶液（０，５％クリスタル・バイオレット／２
０％メタノール）にてプレートに付着した生細胞を染色
（室温、１５分間）した。ｌ ｒｎＭ ＣａＣＡ’
２及び１ｍＮ口１ｇｃβ２を含むリン酸バッフｙ −Ｐ
ＢＳ （１０ｍＭ Ｎａ−Ｋ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 、
０．８％ＮａＣｉ及び０．０２％ＫＣＡ’）で充分洗
浄した後、３０％エタノールを含む０．０ＩＮ塩酸溶液
０．１ｍｊ？を用いてプレートに残ったクリスタル・バ
イオレットを抽出し、その吸光度（４９２ｎｍ）をＥＩ
Ａリーダー（バイオ・ラド社製、モデル２５５０）で測
定した。 この吸光度は生存細胞数に比例する。そこで、試料無処
理ウェルの吸光度の５０％の値に相当する吸光度を示す
ウェルにおける試料の最終希釈率を求め、この試料希釈
率の逆数をその試料の１ｍＡ７当たりのユニット数（ユ
ニット／ｍＡ）と定義する。 上記方法に準じて求めたＬ９２９細胞傷害活性（ユニッ
ト／ ｍ Ｉ！ ）から各試料の比活性（ユニット／■
・ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出するために、各試料の蛋白定
量を行った。定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ７２．２４８ （１９７６））に
準じ、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白
濃度（■／ｒｎＡ）を求めた。これらの結果より、ヒト
ＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体試料について算出した比活
性を第２表に示した。 第２表 ヒトＴＮＦ及び変換体ポリペプチドのＬ９２９
細胞傷害活性 一段階精製試料 精製試料 ヒトＴＮＦ ２．７ｘ１０７８．０ｘｌＯ７
Ｆ４１３４ １．３Ｘ１０７１．０ＸＩ０７Ｆ
４１３５ ４．７Ｘ１０＠１．１Ｘ１０７Ｆ４
２０５ １．５Ｘ１０’ ３．０ＸＩＯ
３Ｆ４３９１ １．６Ｘ１０７３．４Ｘ１０７
Ｆ４３９２ ８．９Ｘ１０’ １．１Ｘ
１０７Ｆ４３９８ ６．０Ｘ１０’ ７
．７Ｘ１０６Ｆ４４０９ ２．９ｘｌＯ”
６．７ｘｌＯ’Ｆ４４１０ ］、０Ｘ１
０７９．５Ｘ１０’上記第２表からヒトＴＮＦ変換体ポ
リペプチドはヒトＴＮＦと同様のＬ９２９細胞に対する
細胞傷害活性作用を有することかわかる。ただし、ヒト
ＴＮＦ変換体Ｆ ４２０５はかなり低い細胞傷害性を示
した。 実施例８ （ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の評価）実施例
６で得られたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮＦ変換体の一段階
精製試料について、マウス可移植線維芽肉腫ＭｅｔｈＡ
腫瘍に対する抗腫瘍治療活性を求めた。試験は、生理食
塩水に懸濁したｌＸｌ０’細胞／ ０．２ ｒｎｌのＭ
ｅｔｈＡ腫瘍細胞（佐々木研究所より分与）をＢＡＬＢ
／ｃマウス（雄、５週令、チャールズ・リバー）の背中
部皮下に移植し、８日後腫瘍径が６〜１０ｍｍに達した
のを確認し、生理食塩水にて段階希釈した試料（０，２
ｍｊ’／マウス）を尾静脈より投与することにより行な
った。致死量を最高投与量とし、数段階の希釈により各
投与試料を作製した。 投与後約２週間、腫瘍増殖等の観察を続けた。 腫瘍増殖については、腫瘍容積（腫瘍塊の長径×短径２
／２）を計測し、試料投与臼（０日）の腫瘍容積に対す
る腫瘍容積率を求め、この値か２又は５となる試料投与
臼からの日数（Ｄ２又はＤ５）を算定する。そして、コ
ントロール群（生理食塩水投与）に対する比率を算出し
、Ｄ２％コントロール値及びＤ５％コントロール値を求
めた。その値か大きい程、腫瘍増殖能か低下しており高
い抗腫瘍活性を示すことを意味する。 上記に準じて得られた結果を第３表に掲載した。 その結果、ヒトＴＮＦ変換体Ｆ ４１３４、同Ｆ４３９
ＬＦ ４３９２、同Ｆ ４３９８及び同Ｆ ４４０９は
ヒトＴＮＦに比し、死亡率か０％のときの投与量で高い
腫瘍容積率を示しており、マウス移植Ｍｅｔｈ Ａ腫瘍
に対する抗腫瘍治療効果か高いことかわかる。
１！：）１１５５
翫ｆり番号 ２
配列の長さ、４６５
配列の型 核酸
鎖の数 −重鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類：他の核酸合成りＮＡ
「す
ＴＣＡＴＣＴ［’ＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧ ＴＧＡ
ＣＡＡＧＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧ ’［’ｌ”Ｇ
ＴＡＧＣＡＡＡ ＣＣＣＴＣＭＧＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡ
ＴＡ ＡＣＣＡＡＣＴＡＧＴ ＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡ
ＧＡＧＧＧＣＣＵ ＡＣＣＴＧＡＴＣＴＡ ＣＴＣＴＣ
ＡＧＧＴＣＣＴＣＴｒＣＡＡＧＧ ＧＴＣＭＧＧＣＴＧ
ＣＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ
ＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣ
Ｔ ＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴｒＡＡＣＣＴＣ
ＣＴＣＴＣＴＧ ＣＴＡＴｒＡＡＧＡＧ ＣＣＣＣＴＧ
ＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＡ
ＧＡＧＧＣＣＡＡＧ ＣＣＣＴＧＧＴＡＴＧ ＡＧＣＣ
ＣＡＴＣＴＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧ ＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧ
ＣＧＣＴＧＡＧＡ ＴＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡ
ＴＣＴＣＧＡＣＴｒＴＧＣＣＧ ＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡ
Ｇ（γ「ＣＴＡＣＴｒＴ ＧＧＧＡＴＣＡＩＴＧ Ｃ
ＣＣＴＧ配列番号 、３ 翫１りの長さ・４７４ 配列の梨 、核 酸 鎖の数 二本鎖 トポロジー、直鎮状 配列の種石：他の核酸合成りＮＡ 配列 〔注１〕番号 開始コドン（’ＡＴＣ）からの番号
〔注２〕マ又はム オリゴヌクレオチド作製のための切
断位置註３〕制限酵素、ヒトＴＮＦ遺１に子構築のため
に設けたＩｌ駅酵素切新部位 〔注４〕英小文字 ヒトＴＮＦ遺伝子のプラスミｌ’ベ
クターへの連結のために設けた制限酵素切断塩基九ノ１
１配列番号 ：４ 配列の長さｊ２７（Ｕ−１）、５０（Ｕ−２）、４９（
Ｕ−３）、５０（Ｕ−４）、５０（Ｕ−５）、５２（Ｕ
−６）、４８（Ｕ−７）、４９（ｔＪ−８）、５１（Ｕ
−９）、５３ （Ｕ−１０）、２９（Ｌ−１）、５２（
Ｌ−２）、５０（Ｌ−３）、５０（Ｌ−４）、４９（Ｌ
−５）、４９（Ｌ−６）、５１ （Ｌ−７）、４９（Ｌ
−８）、５１（Ｌ−９）、４９ （Ｌ−１０） 配列の型 ・核酸 鎖の数 ニー重鎖 トポロジー、直鎖状 配列の種類・他の核酸合成りＮＡ 翫ｊり番号 ＝５ 配列の長さ：２１ （プライマー４１３４）２＋（ブラ
イマー４］３５） ２１（プライマー４２０５） ２１（ブライマー４３９１） ２１（プライマー４３９２） ２１（プライマー４３９８） ２１ （ブライマー４４０９） ２１（ブライマー４４１０） 配列の型 ：核酸 鎖の数 ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成りＮＡ 〔注二＊変異導入塩基〕 （発明の効果） 本発明によれば、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列において２
９番目のアミノ酸を他のアミノ酸に変換することにより
、ヒトＴＮＦに比し、抗腫瘍活性が高く副作用の低い新
規なヒトＴＮＦ変換体か提供される。
ＣＡＡＧＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧ ’［’ｌ”Ｇ
ＴＡＧＣＡＡＡ ＣＣＣＴＣＭＧＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡ
ＴＡ ＡＣＣＡＡＣＴＡＧＴ ＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡ
ＧＡＧＧＧＣＣＵ ＡＣＣＴＧＡＴＣＴＡ ＣＴＣＴＣ
ＡＧＧＴＣＣＴＣＴｒＣＡＡＧＧ ＧＴＣＭＧＧＣＴＧ
ＣＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ
ＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣ
Ｔ ＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴｒＡＡＣＣＴＣ
ＣＴＣＴＣＴＧ ＣＴＡＴｒＡＡＧＡＧ ＣＣＣＣＴＧ
ＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＡ
ＧＡＧＧＣＣＡＡＧ ＣＣＣＴＧＧＴＡＴＧ ＡＧＣＣ
ＣＡＴＣＴＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧ ＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧ
ＣＧＣＴＧＡＧＡ ＴＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡ
ＴＣＴＣＧＡＣＴｒＴＧＣＣＧ ＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡ
Ｇ（γ「ＣＴＡＣＴｒＴ ＧＧＧＡＴＣＡＩＴＧ Ｃ
ＣＣＴＧ配列番号 、３ 翫１りの長さ・４７４ 配列の梨 、核 酸 鎖の数 二本鎖 トポロジー、直鎮状 配列の種石：他の核酸合成りＮＡ 配列 〔注１〕番号 開始コドン（’ＡＴＣ）からの番号
〔注２〕マ又はム オリゴヌクレオチド作製のための切
断位置註３〕制限酵素、ヒトＴＮＦ遺１に子構築のため
に設けたＩｌ駅酵素切新部位 〔注４〕英小文字 ヒトＴＮＦ遺伝子のプラスミｌ’ベ
クターへの連結のために設けた制限酵素切断塩基九ノ１
１配列番号 ：４ 配列の長さｊ２７（Ｕ−１）、５０（Ｕ−２）、４９（
Ｕ−３）、５０（Ｕ−４）、５０（Ｕ−５）、５２（Ｕ
−６）、４８（Ｕ−７）、４９（ｔＪ−８）、５１（Ｕ
−９）、５３ （Ｕ−１０）、２９（Ｌ−１）、５２（
Ｌ−２）、５０（Ｌ−３）、５０（Ｌ−４）、４９（Ｌ
−５）、４９（Ｌ−６）、５１ （Ｌ−７）、４９（Ｌ
−８）、５１（Ｌ−９）、４９ （Ｌ−１０） 配列の型 ・核酸 鎖の数 ニー重鎖 トポロジー、直鎖状 配列の種類・他の核酸合成りＮＡ 翫ｊり番号 ＝５ 配列の長さ：２１ （プライマー４１３４）２＋（ブラ
イマー４］３５） ２１（プライマー４２０５） ２１（ブライマー４３９１） ２１（プライマー４３９２） ２１（プライマー４３９８） ２１ （ブライマー４４０９） ２１（ブライマー４４１０） 配列の型 ：核酸 鎖の数 ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成りＮＡ 〔注二＊変異導入塩基〕 （発明の効果） 本発明によれば、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列において２
９番目のアミノ酸を他のアミノ酸に変換することにより
、ヒトＴＮＦに比し、抗腫瘍活性が高く副作用の低い新
規なヒトＴＮＦ変換体か提供される。
第１図及び第２図は合成オリゴヌクレオチドの連結によ
るヒトＴＮＦ遺伝子の構築方法を、第３図及び第４図は
ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方法を並びに第５図及び
第６図は部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ変換体の遺
伝子の作製方法をそれぞれ説明するための図であり、第
７図は大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮ
Ｆ変換体の精製試料の電気泳動結果を示す図である。 第 １ 図 Ｕ−Ｉ Ｕ−２Ｕ−３Ｕ−４Ｕ−５Ｕ−６Ｕ−７Ｕ
−８Ｕ−９Ｕ−１ＯＬ−Ｉ １−２ Ｌ−３Ｌ−４
Ｌ−５Ｌ−６Ｌ−７１−８１−９１−１０１連 結 、１ＥｃｏＲｌ ＆ Ｈｉｎｄｌｌｌ ｉ肖イヒｐ
Ｕｃ９に組み込む ＵＡ４１ 〔、王） Ｏ−５’末端リン酸化（−）・−
ノ／（＋） ｌリン酸化 ！リン酸化 獲得したりＤ−ン ｐＬＩｃ９に組み込む ｐｌ
Ｊｃ９に組み込む 獲得したクローンｐＵＡ４１
ｐＵＡ４２ ｐＵＡ４３
ｐＵＡ４１第４図 ｐＫＫＩｏｌ ｐＬＩＡ４４ＥｃｏＲＩ
Ｈｉｎｄｌｌｌ １゜ ｐＫＦ４１０２ 第 ５ 図 第６図 第 ７ 図 （Ａ） １、蛋白質分子量マーカー ２、超音波破砕総画体 ３、超音波破砕上清 ４、ヒトＴＮＦ／−段階精製試料 ５、ヒトＴＮＦ／精製試料 手続補正書（自発） 平成３年６月１４日 特許庁長官 深 沢 亘 殿１、事件
の表示 平成２年特許願第３１１１３０号２、発
明の名称 ポリペプチド ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 〒５５０大阪市西区江戸掘−下目３番２２号５
、補正の内容 明細書の４４頁の４行目のｒ５． ３Ｊをｒ６． ６Ｊ
に、５行目 のｒ４． ８Ｊをｒ６． ＯＪに、６行目
の「４．２」をｒ５．３Ｊに、７行目の２か所の「４゜
５」をいずれもｒ５．６Ｊに、８行目のｒ４． ４Ｊ及
び同ｒ４．５Ｊをｒ５．５Ｊ及びｒ５．６Ｊにそれぞれ
補正する。 以上
るヒトＴＮＦ遺伝子の構築方法を、第３図及び第４図は
ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方法を並びに第５図及び
第６図は部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ変換体の遺
伝子の作製方法をそれぞれ説明するための図であり、第
７図は大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ及びヒトＴＮ
Ｆ変換体の精製試料の電気泳動結果を示す図である。 第 １ 図 Ｕ−Ｉ Ｕ−２Ｕ−３Ｕ−４Ｕ−５Ｕ−６Ｕ−７Ｕ
−８Ｕ−９Ｕ−１ＯＬ−Ｉ １−２ Ｌ−３Ｌ−４
Ｌ−５Ｌ−６Ｌ−７１−８１−９１−１０１連 結 、１ＥｃｏＲｌ ＆ Ｈｉｎｄｌｌｌ ｉ肖イヒｐ
Ｕｃ９に組み込む ＵＡ４１ 〔、王） Ｏ−５’末端リン酸化（−）・−
ノ／（＋） ｌリン酸化 ！リン酸化 獲得したりＤ−ン ｐＬＩｃ９に組み込む ｐｌ
Ｊｃ９に組み込む 獲得したクローンｐＵＡ４１
ｐＵＡ４２ ｐＵＡ４３
ｐＵＡ４１第４図 ｐＫＫＩｏｌ ｐＬＩＡ４４ＥｃｏＲＩ
Ｈｉｎｄｌｌｌ １゜ ｐＫＦ４１０２ 第 ５ 図 第６図 第 ７ 図 （Ａ） １、蛋白質分子量マーカー ２、超音波破砕総画体 ３、超音波破砕上清 ４、ヒトＴＮＦ／−段階精製試料 ５、ヒトＴＮＦ／精製試料 手続補正書（自発） 平成３年６月１４日 特許庁長官 深 沢 亘 殿１、事件
の表示 平成２年特許願第３１１１３０号２、発
明の名称 ポリペプチド ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 〒５５０大阪市西区江戸掘−下目３番２２号５
、補正の内容 明細書の４４頁の４行目のｒ５． ３Ｊをｒ６． ６Ｊ
に、５行目 のｒ４． ８Ｊをｒ６． ＯＪに、６行目
の「４．２」をｒ５．３Ｊに、７行目の２か所の「４゜
５」をいずれもｒ５．６Ｊに、８行目のｒ４． ４Ｊ及
び同ｒ４．５Ｊをｒ５．５Ｊ及びｒ５．６Ｊにそれぞれ
補正する。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
、２９番目のＡｒｇが他のアミノ酸により置換された配
列を有することを特徴とするポリペプチド。 ２、２９番目に置換される他のアミノ酸がグルタミン、
セリン、プロリン、リジン、アスパラギン酸、ヒスチジ
ン、バリン又はロイシンである請求項１のポリペプチド
。 ３、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
２９番目のＡｒｇが他のアミノ酸により置換された配列
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むことを
特徴とする組換えプラスミド。 ４、前記組換えプラスミドがｐＫＦ４１３４、ｐＫＦ４
１３５、ｐＫＦ４２０５、ｐＫＦ４３９１、ｐＫＦ４３
９２、ｐＫＦ４３９８、ｐＫＦ４４０９又はｐＫＦ４４
１０である請求項３の組換えプラスミド。 ５、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
２９番目のＡｒｇが他のアミノ酸により置換された配列
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え
プラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞。 ６、前記組換え微生物細胞が大腸菌である請求項５の組
換え微生物細胞。 ７、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
２９番目のＡｒｇが他のアミノ酸により置換された配列
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え
プラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞を培
地中で培養し、当該アミノ酸配列を有するポリペプチド
を産生し分離することを特徴とするポリペプチドの製造
方法。 ８、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
２９番目のＡｒｇが他のアミノ酸により置換された配列
を有するポリペプチドを有効成分として含有することを
特徴とする医薬組成物。 ９、配列表配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において
２９番目のＡｒｇが他のアミノ酸により置換され、かつ
そのＮ末端にＭｅｔを有する配列を有することを特徴と
するポリペプチド。 １０、配列表配列番号２で示した１番目のＴから４６５
番目のＧまでで表わされる塩基配列において８５〜８７
番目のＡｇｒをコードするＣＧＣを他のアミノ酸をコー
ドするコドンにより置換された配列を有することを特徴
とするＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2311130A JPH04182498A (ja) | 1990-11-16 | 1990-11-16 | ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2311130A JPH04182498A (ja) | 1990-11-16 | 1990-11-16 | ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04182498A true JPH04182498A (ja) | 1992-06-30 |
Family
ID=18013494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2311130A Pending JPH04182498A (ja) | 1990-11-16 | 1990-11-16 | ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04182498A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7056695B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-06-06 | Xencor | TNF-α variants |
| US7101974B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-09-05 | Xencor | TNF-αvariants |
| US7244823B2 (en) | 2000-03-02 | 2007-07-17 | Xencor | TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders |
| US7446174B2 (en) | 2001-03-02 | 2008-11-04 | Xencor, Inc. | Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7662367B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7687461B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-03-30 | Xencor, Inc. | Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins |
-
1990
- 1990-11-16 JP JP2311130A patent/JPH04182498A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7056695B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-06-06 | Xencor | TNF-α variants |
| US7101974B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-09-05 | Xencor | TNF-αvariants |
| US7244823B2 (en) | 2000-03-02 | 2007-07-17 | Xencor | TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders |
| US7662367B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7687461B2 (en) | 2000-03-02 | 2010-03-30 | Xencor, Inc. | Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins |
| US7446174B2 (en) | 2001-03-02 | 2008-11-04 | Xencor, Inc. | Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders |
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