JPH05271289A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、ヒトＴＮＦ又はその変換体と同様
の抗腫瘍作用を有し、一方それらで認められた癌転移の
亢進作用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体を提供す
る。 【構成】 配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅｒ
から１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列
を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換体にお
いて、配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓｐ
までのアミノ酸配列或はそれに対応する前記変換体のア
ミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を
少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個のアミノ酸を
含むアミノ酸配列により置換されているポリペプチド、
その変換ポリペプチド、プラスミド、形質転換体、製造
方法、医薬組成物、又はＤＮＡに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトＴＮＦ転換体として
新規なポリペプチドを提供することに係り、ポリペプチ
ド自身、それを含む医薬組成物、その製造方法、その遺
伝子組換えＤＮＡ及びプラスミド、形質転換微生物細胞
などに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）は、１９７５年
にＣａｒｓｗｅｌｌらにより予めＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃ
ａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）に感染されエ
ンドトキシンで処理したマウスの血清中に存在すること
が見出された生理活性物質であり〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２ ３６６６（１９
７５）〕、１９８４年にＰｅｎｎｉｃａらによりヒトＴ
ＮＦのｃＤＮＡがクローニングされヒトＴＮＦ蛋白質の
全一次構造（アミノ酸配列）が明らかにされた〔Ｎａｔ
ｕｒｅ３１２，７２４（１９８４）〕。ＴＮＦは腫瘍細
胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対する出血性壊
死、増殖の抑制など特異的な抗腫瘍作用を有するが、最
近では高脂血症、血圧低下、発熱などの副作用も生じう
ることが報告されており、薬効、副作用などでより優れ
たものを見出すべく研究、開発がなされている。例えば
特開昭６１−４０２２１、同６３−１１９６９２、特開
平１−２７７４８８各号公報では遺伝子操作技術により
ヒトＴＮＦ蛋白質中の特定のアミノ酸を欠失したり、他
のアミノ酸に置換したりあるいは付加したりしてヒトＴ
ＮＦ変換体を提供している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、十分満
足な薬理作用を有するヒトＴＮＦ変換体は、いまだ得ら
れていない。本発明の目的は、ヒトＴＮＦ又はその変換
体と同様の抗腫瘍作用を有し、一方それらで認められた
癌転移の亢進作用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体、
それらに関連するポリペプチドとそれらの製造方法、プ
ラスミド、微生物細胞など、及び用途を提供することに
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は、配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅｒか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列を
有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換体におい
て、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓ
ｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する前記変換
体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸
配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個のアミ
ノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているポリペプ
チドに係る。また本発明は、当該ポリペプチドをコード
するＤＮＡを含む組換えプラスミド、この組換えプラス
ミドにより形質転換された微生物細胞、この微生物細胞
によるポリペプチドの製造方法、医薬組成物、前記アミ
ノ酸配列のＮ末端にメチオニンの結合したポリペプチド
並びに配列表の配列番号１０で示した１番目のＴから４
６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を有する腫瘍壊
死因子ポリペプチドのＤＮＡ又はその変異導入ＤＮＡに
おいて、前記配列番号１０の１〜３番目のＴＣＡから２
２〜２４番目のＧＡＣまでの塩基配列あるいはそれらに
対応する前記変異導入ＤＮＡの塩基配列がＡｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ
３個〜１６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードす
る塩基配列により置換されているＤＮＡに関する。

【０００５】本発明者らは、ヒトＴＮＦ又はその変換体
が有するアミノ酸配列の一定のアミノ酸配列領域におい
て、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を存在せし
めたところ、ヒトＴＮＦ又はその変換体に比し抗腫瘍活
性がほぼ同程度であり、一方ヒトＴＮＦ又はその変換体
が癌の転移を亢進するのに対しほとんど亢進しない新規
ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドが得られることを見出
し、その知見に基いて発明を完成した。

【０００６】配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅ
ｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配
列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチドとはヒトＴＮＦを
意味する。

【０００７】本発明におけるヒトＴＮＦの変換体とは、
配列表の配列番号１で示したアミノ酸配列において１個
又は２個以上のアミノ酸を適宜付加、欠失、置換の改変
を単独又は複合処理したものであって、ヒトＴＮＦと同
様の抗腫瘍作用を有するものである。したがって、本発
明において、配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目の
Ａｓｐまでのアミノ酸配列に対応する前記変換体のアミ
ノ酸配列とは、変換体において前述のアミノ酸配列が改
変されていれば改変後のアミノ酸配列がそれに該当す
る。この改変にはアミノ酸の欠失も含まれるので前述の
１番目のＳｅｒから８番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列
が部分的あるいは全部欠失したものも含まれる。

【０００８】ヒトＴＮＦ変換体としては具体的には例え
ば下記のものが挙げられるが、本発明においてはこれら
以外のものを決して排除するものではない。

【０００９】（１）特開昭６３−１４１９９９号公報に
記載：Ｎ末端に、Ｖａｌ−Ａｒｇを付加し、更に^２９Ａ
ｒｇ−^３０Ａｒｇを^２９Ａｓｎ−^３０Ｔｈｒに変換した
もの。 （２）特開昭６３−１１９６９２号公報に記載： （Ａ）^３２Ａｓｎを^３２Ｔｙｒ、^３２Ｈｉｓ、^３２Ａｓ
ｐ又は^３２Ｓｅｒにそれぞれ変換したもの。 （Ｂ）^１１５Ｐｒｏを^１１５Ｌｅｕ、^１１５Ｓｅｒ、
^１１５Ａｓｐ又は^１１５Ｇｌｙにそれぞれ変換したも
の。 （Ｃ）^１１７Ｔｙｒを^１１７Ｈｉｓに変換したもの。 （３）特開平１−２７７４８８号公報に記載：^１Ｓｅｒ
〜^８Ａｓｐを欠失し、^９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加したもの。 （４）特開平２−１６３０９４号公報に記載：^１Ｓｅｒ
〜^８Ａｓｐを欠失し、^９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加し更に^１５４Ａｌａを^１５４Ｐｈｅに
変換したもの。 （５）特開平２−１４２４９３号公報に記載：^１Ｓｅｒ
〜^８Ａｓｐを欠失し、^９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加し更に^１５４Ａｌａを^１５４Ｔｒｐに
変換したもの。 （６）特開昭６３−２７０６９７号公報に記載：^１００
Ｇｌｎ〜^１０７Ａｌａを欠失したもの。^１Ｓｅｒから２
個〜８個のアミノ酸残基を欠失したもの。 （７）特願平２−１９３９３５号明細書に記載：^６８Ｐ
ｒｏを^６８Ａｓｐ、^６８Ｍｅｔ又は^６８Ｔｙｒにそれぞ
れ変換したもの。 （８）特願平２−３１１１２９号明細書に記載：^１０６
Ｇｌｙを欠失するかあるいは他のアミノ酸により置換し
たもの。 （９）特願平２−３１１１３０号明細書に記載：^２９Ａ
ｒｇを他のアミノ酸により置換したもの。

【００１０】本明細書全般を通じてアミノ酸、ポリペプ
チド、塩基、それらの配列を表わすとき下記のリストの
ものを用いる。

【００１１】

【００１２】また本明細書で使用した略号は次のとおり
意味する。 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 （Ｄｅｏｘｙ
ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 （Ｄｅｏｘｙ
ｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 （Ｄｅｏｘｙ
ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＴＴＰ：チミジン三リン酸 （Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔ
ｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＡＴＰ：アデノシン三リン酸 （Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナ卜リウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏ
ｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ） ＢＰＢ：ブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎ
ｏｌ Ｂｌｕｅ） ＤＴＴ：ジチオスレイ卜ール （Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ） ＢＳＡ：牛血清アルブミン （Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕ
ｍ ａｌｂｕｍｉｎ） ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニル フルオライド
（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕ
ｏｒｉｄｅ） ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ） ＣＰＧ樹脂：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐｏｒｅ Ｇｌａ
ｓｓ樹脂

【００１３】本発明のポリペプチド転換体において、一
定の位置に前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列
を少なくとも１個含み、かつ３個〜１６個のアミノ酸を
含むアミノ酸配列は、抗腫瘍活性、癌の転移程度、副作
用、遺伝子組換え技術の適用性などを考慮して適宜決め
られる。前述の３個〜１６個のアミノ酸を含むアミノ酸
配列は、そこに望ましくは３個〜１１個のアミノ酸を含
むアミノ酸配列においてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミ
ノ酸配列を１個又は２個以上有するものであり、具体的
にはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ又は配列表の配列番号２〜
９で示したアミノ酸配列が挙げられるが、なかでもＡｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐあるいは配列番号２、３、５又は６
が望ましい。

【００１４】本発明におけるポリペプチド転換体のＡｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を少なくとも１個含
み、かつ３個〜１６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列以
外のアミノ酸配列すなわち配列番号１の９番目のＬｙｓ
から１５５番目のＬｅｕまでのヒトＴＮＦのアミノ酸配
列に対応するアミノ酸配列に関しては、０〜１５個のア
ミノ酸が付加、欠失又は置換あるいはそれらの組合せに
より改変されうるが、なかでも配列番号１の９番目のＬ
ｙｓから１５５番目のＬｅｕまでのヒトＴＮＦのアミノ
酸配列あるいはその１９番目のＧｌｎ、２９番目のＡｒ
ｇ、６８番目のＰｒｏ、９７番目のＳｅｒ、１０６番目
のＧｌｙ又は１２６番目のＬｙｓが欠失するかあるいは
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、もしくは１０
６番目のＧｌｙを中心に前後多くともアミノ酸８個づつ
が、必要に応じ他の位置のアミノ酸の改変を伴なって改
変されたアミノ酸配列が望ましい。また１０６番目のＧ
ｌｙを中心に改変されたアミノ酸配列に関しては１０４
番目のＰｒｏ〜１０８番目のＧｌｕのアミノ酸配列にお
いて、アミノ酸が単に他のアミノ酸に置換されたもの、
又は多くともアミノ酸８個が付加されたものあるいはこ
れら置換と付加とが組合されたものが望ましい。

【００１５】一方、２９番目のＡｒｇが置換される場
合、例えばＭｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ又はＳｅｒなどの中性アミノ酸
で、望ましくはＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ又はＳ
ｅｒで、より望ましくはＶａｌ、Ｌｅｕ又はＧｌｎでそ
れぞれ置換されたものが挙げられ、またＬｙｓ又はＨｉ
ｓなどの塩基性アミノ酸で、望ましくはＬｙｓで置換さ
れたものが挙げられ、更にＡｓｐ又はＧｌｕなどの酸性
アミノ酸で、望ましくはＡｓｐで置換されたものが挙げ
られる。

【００１６】また６８番目のＰｒｏが置換される場合、
例えば前述の２９番目のＡｒｇの場合と同様の中性アミ
ノ酸又は酸性アミノ酸で置換されたものが挙げられる
が、望ましくはＭｅｔ、Ｔｙｒ又はＡｓｐで置換された
もの、より望ましくはＭｅｔ又はＡｓｐで置換されたも
のが挙げられる。

【００１７】更に１０６番目のＧｌｙが改変される場
合、例えば欠失するかあるいは前述の２９番目のＡｒｇ
の場合と同様の中性アミノ酸、塩基性アミノ酸又は酸性
アミノ酸でそれぞれ置換されたものが挙げられるが、望
ましくは欠失するかあるいはＴｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、
Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕで置換されたもの、
より望ましくは欠失するかあるいはＴｒｐ、Ｐｒｏ、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ又はＡｓｐで置換されたものが挙げられ
る。

【００１８】かくして本発明のポリペプチドは１３５個
〜１７８個のアミノ酸により構成される。

【００１９】配列表の配列番号１０で示した１番目のＴ
から４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を有する
腫瘍壊死因子ポリペプチドのＤＮＡとは、ヒトＴＮＦの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡの１形態である。

【００２０】ヒトＴＮＦのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの変異導入ＤＮＡとは、配列表の配列番号１０で示
した塩基配列において１組又は２組以上のコドンを適宜
付加、欠失、置換の改変を単独又は複合処理したもので
あって、前述のヒトＴＮＦ変換体のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡである。したがって、その改変は、配列番
号１０で示した１番目のＴから４６５番目のＧまでで表
わされる塩基配列の全域に及ぶので、１番目のＴから２
４番目のＣまでの塩基配列だけでなく、２５番目のＡか
ら４６５番目のＧまでの塩基配列にも及ぶ。

【００２１】次に本発明についてその実施態様を詳しく
記載するが、本発明に係る遺伝子操作技術については多
くの文献により記載されている方法や手段を適宜調整し
ながら適用する。その文献を参考までに以下に列挙す
る。

【００２２】Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，（１
９８２）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（以下、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ と略記する）Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ，（１９８３）：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １００及び１０１、
Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ，（１９８７）：Ｍｅｔｈｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，１５４及び１５
５

【００２３】本発明のポリペプチドは種々の方法、手
段、機械を用いて製造することができるが、代表的な製
造方法を下記する。

【００２４】（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得 ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述の
とおり、Ｐｅｎｎｉｃａらにより明らかにされており、
その塩基配列を適宜変更してヒトＴＮＦ遺伝子配列を配
列番号１０のようにデザインする。その際、宿主細胞
（大腸菌など）に適したコドンを選択するのが望まし
く、また後述のＤＮＡ断片の連結によるクローン化並び
に変換体作製のための遺伝子改変が容易に実施できるよ
うに適当な位置に適当な制限酵素切断部位を配置するの
が望ましい。もちろんヒトＴＮＦ遺伝子の上流には翻訳
開始コドン（ＡＴＧ）を、下流には翻訳終止コドン（Ｔ
ＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）をそれぞれ読み取り枠に合致
させるように設置する必要があり、また翻訳開始コドン
の上流並びに翻訳終止コドンの下流にそれぞれ適当な制
限酵素切断部位を設置してベクターへの適用性、クロー
ン化の簡便性を図るのが好ましい。

【００２５】ヒトＴＮＦ遺伝子は上鎖・下鎖それぞれに
ついて幾つかのオリゴヌクレオチドに分けて化学合成
し、ブロックごとに順次適切に連結する方法により作製
できる。例えば配列表の配列番号１０においては、ヒト
ＴＮＦ遺伝子のコーディング鎖及び相補する配列を有す
る鎖の各鎖を約５０塩基程度ずつ１０本のオリゴヌクレ
オチドに分け、合計２０本化学合成する。

【００２６】その合成方法としてはジエステル法〔Ｈ．
Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，”ＳｏｍｅＲｅｃｅｎｔ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９６１）〕、トリエステル法〔Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉ
ｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，８９，４８０１（１９６７）〕及びホスファイト
法〔Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，２１，７１９（１９８
０）〕が挙げられるが、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホ
スファイト法が操作性などから好んで用いられる。

【００２７】合成されたオリゴヌクレオチドは例えば逆
相クロマトカラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動などの通
常の精製方法により精製される。その後、オリゴヌクレ
オチドは例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
リン酸化し、アニール化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結する。ここではオリゴヌクレオチドを幾つか
のブロックに分け、所望のヒトＴＮＦ遺伝子配列が得ら
れるように順次連結し、制限酵素で切断又はＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼによる平滑化後、電気泳動等により精製す
る。得られたＤＮＡ断片について例えばｐＵＣ８、同
９、同１８、同１９〔Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇｅｔ ａｌ，
Ｇｅｎｅ，１９，２５９（１９８２）〕のようなプラス
ミドベクターに組込み、常法によりコンピテントセルを
形質転換してクローン化する。得られたクローンより公
知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ベク
ターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列が目的の遺伝子
配列を達成したか否かを点検する。達成できたヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の各部分について、それぞれを含むプラスミド
ベクターより制限酵素を用いて切り出し、再度前記ベク
ターに連結後組込むことにより目的の完全長のヒトＴＮ
Ｆ遺伝子を有するプラスミドベクターを得る。かくして
得られたプラスミドベクターを制限酵素で切断後、ゲル
電気泳動法によって分離精製することにより所望のヒト
ＴＮＦ遺伝子を得ることができる。

【００２８】一方、前述の方法に対してはＴＮＦを発現
しているヒト細胞由来のｍＲＮＡよりヒトＴＮＦをコー
ドするｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡを使用する方法
を適宜組合せてもよい。

【００２９】（２）ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築 前記（１）で得られたヒトＴＮＦ遣伝子を適切に発現ベ
クターに挿入して、ヒトＴＮＦ発現ベクターを構築す
る。発現ベクターは翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流に
転写プロモーター領域並びに翻訳シグナルであるＳＤ
（シャイン・ダルガーノ）配列を有し、翻訳終止コドン
（ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）の下流に転写ターミネー
ター領域を有する必要がある。また転写プロモーターと
しては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔ
ａｃプロモーター、Ｐ_Ｌプロモーター、β−ラクタマー
ゼ・プロモーター、α−アミラーゼ・プロモーター、Ｐ
Ｈ０５プロモーター、ＡＤＣｌプロモーターなどが使用
でき、転写ターミネーターとしてはｔｒｐターミネータ
ー、ｒｒｎＢターミネーター、ＡＤＣＩターミネーター
などが使用できる。このような発現ベクターは例えば、
ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア）、ｐＰ_Ｌ−ｌａｍｂ
ｄａ（同左）、ｐＤＲ７２０（同左）などの市販品の中
から容易に入手できるが、これらを改良して発現性ある
いは取扱性をより高度化したものを使用してもよい。

【００３０】（３）ヒトＴＮＦ変換体又は同転換体発現
ベクターの構築 ヒトＴＮＦ変換体又は同転換体ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの作製方法としては例えば次の方法が挙げられ
る。

【００３１】（Ａ）前記（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得
で記載した方法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレ
オチドを適切に連結することにより作製する。この方法
によればアミノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加、欠
失又はそれらの組合せの改変は自在である。

【００３２】（Ｂ）前記（１）で作製したヒトＴＮＦ遺
伝子を適当な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を
除去した後、変異を導入した塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチド（例：上下鎖をアニール化して連結した
二本鎖ＤＮＡ断片）又は適当な他の遺伝子を組込む。こ
の方法によっても前記（Ａ）の場合と同様、改変を自在
に行うことができる。

【００３３】（Ｃ）変異を導入した塩基配列を有する合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＤＮＡ鎖
を延長することにより、変異導入を行う〔部異特異的変
異法 （Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７
（１９８７））〕。この方法は１０塩基対を越える比較
的長いＤＮＡ鎖の付加及び挿入には適用し難いが、その
他の改変は前記（Ａ）の場合と同様、自在に行うことが
できる。特に任意のアミノ酸を置換することに適してい
る。

【００３４】本発明では一般に（Ｃ）の部位特異的変異
法及び制限酵素切断部位を利用する（Ｂ）の方法を適宜
組合せて使用するが、以下にその方法について説明す
る。

【００３５】 部位特異的変異法により変換体又は転
換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを作製した後、発
現ベクター内に適切に挿入する。

【００３６】まず部位特異的変異法を行うに当り、鋳型
ＤＮＡを作製する。前記（１）で得られたヒトＴＮＦ遺
伝子を、Ｍｅｓｓｉｎｇら〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３（１９８７）〕によっ
て開発された一本鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミド
ベクター（ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９など）に連結
し、大腸菌株に導入する。得られた形質転換体の中より
目的のプラスミドを有するクローンを選択する。

【００３７】このプラスミドをｄｕｔ⁻及びｕｎｇ⁻変
異大腸菌株（ＣＪ２３６株など）に導入し、遺伝子内に
ウラシルを取り込ませ、大腸菌株にＭ１３Ｋ０７などの
変異型ヘルパーファージを感染させて目的の一本鎖プラ
スミドＤＮＡを取得する。

【００３８】一方、本発明に係る変異導入部位及びその
前後の塩基配列を有する約１５〜５０塩基のオリゴヌク
レオチド・プライマーを化学合成する。このプライマー
と前述の工程で得られるウラシル導入一本鎖プラスミド
ＤＮＡとをアニール化した後、例えばＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、二本鎖化す
る。鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖を不活性化し変
異導入頻度を高めるため、二本鎖となったプラスミドを
ｕｎｇ^＋の大腸菌株に導入する。

【００３９】前述のプライマーをプローブとして用いコ
ロニー・ハイブリダイゼーションを行い、目的の変換体
又は転換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラ
スミドを有するクローンを、得られた形質転換体中より
選択する。

【００４０】前述で得られるプラスミドから制限酵素切
断処理によりヒトＴＮＦ変換体又は同転換体ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片を切り出し、前記（２）の場
合と同様に、発現ベクターに挿入して、目的のヒトＴＮ
Ｆ変換体又は同転換体発現ベクターを構築することがで
きる。

【００４１】 適当な制限酵素切断により変異を導入
したい部分を切り出し、変換デザインに従って化学合成
等により作製したＤＮＡ断片で置換することにより変換
体又は転換体ポリペプチドの発現ベクターを構築する。

【００４２】ヒトＴＮＦのＮ末端近傍のアミノ酸配列を
修飾するには、Ｎ末端近傍に適当な制限酵素切断部位が
存在するのが好ましい。そこで、まず部位特異的変異法
によりヒトＴＮＦのＮ末端近傍に適当な制限酵素切断部
位を導入する。この制限酵素切断部位とその上流に位置
する翻訳開始コドンの前後に設置された制限酵素切断部
位の２種類の切断部位の使用は更に好ましい。

【００４３】一方、本発明に係る変換デザインに従って
前記（１）の場合と同様にして、上鎖及び下鎖に対応す
るオリゴヌクレオチドを化学合成する。もちろん、その
両末端には発現ベクターへの組込みを考慮して上記の制
限酵素切断部位を設置しておく必要がある。このオリゴ
ヌクレオチド（上鎖及び下鎖）を例えばＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化後アニール化すること
により二本鎖ＤＮＡ断片とする。上記の２種類の制限酵
素で切断したヒトＴＮＦの大部分を含む（Ｎ末部分を欠
失）発現用プラスミドベクター内にこの二本鎖ＤＮＡ断
片を例えばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結して、
目的とするＮ末端近傍のアミノ酸配列を修飾したヒトＴ
ＮＦ転換体の発現ベクターを構築することができる。

【００４４】また、変換体又は転換体ポリペプチドをコ
ードする遺伝子内の適当な制限酵素切断部位を利用して
それぞれの発現ベクター間で組換えを行うことにより、
更に新規な変換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクタ
ーを構築することができる。

【００４５】発現ベクターを大腸菌株のような宿主細胞
へ導入することについては、例えば塩化カルシウム法に
より作製した大腸菌株のコンピテントセルを用いる公知
の方法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，（１９８２）〕に従って
行う。宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母などの微
生物細胞が使用できるが、なかでも大腸菌としてはＪＭ
８３、ＪＭ１０３、ＨＢ１０１などのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２株の変異種が挙げられる。

【００４６】（４）ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドの取
得 本発明においては前記（３）で記載の形質転換された微
生物細胞を培養し、目的のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチ
ドを培養物中に産生、蓄積させて、抽出、分離する。微
生物細胞、特に大腸菌の培養方法としては従来から知ら
れている方法、例えば大腸菌が要求する栄養素を含んだ
培養液に大腸菌を接種し、通常３２〜３７℃で約１２〜
２４時間振とう又はかくはんすることにより短時間に大
量に培養する方法が使用できる。培地は例えばＬ培地、
Ｍ９培地、Ｍ９ＣＡ培地など〔前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕が使用でき、必要に応じてアン
ピシリンなどの抗生物質を添加したり、転写プロモータ
ーの効率を高めるために培養開始時あるいは培養中にｌ
ａｃプロモーター及びｔａｃプロモーター使用の際はイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等の薬剤
を、ｔｒｐプロモーター使用の際は３−β−インドール
アクリル酸等の薬剤を添加することもできる。

【００４７】本発明のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドは
培養後、通常、微生物細胞の集合体をトリスバッファー
に懸濁させた状態で超音波処理することにより破砕処理
を施し、遠心分離操作を行い菌体残渣を除去することに
より得られる。更に、かくして得られたものは核酸・エ
ンドトキシン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、その他従来からの蛋白質
の分離精製方法を組合せることにより、一層精製するこ
とができる。

【００４８】本発明のヒトＴＮＦ転換体遺伝子は前述の
方法を適宜適用することにより、直接製造したり、一旦
ヒトＴＮＦ遺伝子を作製後製造したり、あるいはヒトＴ
ＮＦ遺伝子次いでその変換体変異遺伝子を作製後製造し
たりすることができる。

【００４９】本発明のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチド
は、ヒトＴＮＦ又はその変換体の持つ抗腫瘍作用と同様
の作用を有し、しかもヒトＴＮＦ又はその変換体に比し
同程度の抗腫瘍活性を示し、一方それらで認められた癌
の転移冗進作用をほとんど示さないことより抗腫瘍剤、
医薬の活性成分として有効である。本発明のヒトＴＮＦ
転換体ポリペプチドとしては、具体的には例えば後述す
るＦ４１６８、Ｆ４４１５、Ｆ４４１６、Ｆ４４１７、
Ｆ４４１８、Ｆ４４２０、Ｆ４４２１、Ｆ４１１３、Ｆ
４１３７、Ｆ４６０１、Ｆ４６０２、Ｆ４６０７、Ｆ４
６０８、Ｆ４６２６、Ｆ４６２７、Ｆ４６３４、Ｆ４６
３５、Ｆ４６０９、Ｆ４６１０、Ｆ４６２８、Ｆ４６２
９、Ｆ４６３８、Ｆ４６３９、Ｆ４６１１、Ｆ４６１
２、Ｆ４６１３、Ｆ４６１４、Ｆ４６１５、Ｆ４６４
２、Ｆ４６４３、Ｆ４６４４、Ｆ４６４５、Ｆ４６４
６、Ｆ４６５２、Ｆ４６５４、Ｆ４６０６、Ｆ４６５６
などが挙げられ、なかでもＦ４１６８、Ｆ４４１５、Ｆ
４４１７、Ｆ４４１８、Ｆ４４２０、Ｆ４６０１、Ｆ４
６０９、Ｆ４６３９、Ｆ４６１１、Ｆ４６１２、Ｆ４６
４２、Ｆ４６４５、Ｆ４６５２、Ｆ４６５４、Ｆ４６０
６が望ましく、Ｆ４１６８及びＦ４４１８がより望まし
い。その医薬組成物の製剤に当っては薬理上許容される
担体又は希釈剤とともに医薬組成物に製剤化することが
できる。本発明の医薬組成物の剤型としては、外用剤、
経口投与剤、注射剤などが挙げられ、それぞれの剤型に
あった投与方法で投与される。

【００５０】投与方法としては、注射による投与が好ま
しい。注射による投与には全身投与と局所投与がある。
全身投与としては静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、皮
内注射などが挙げられ、局所投与としては腫瘍内注射な
どが挙げられる。本発明の医薬組成物は、いずれの方法
にも用いることができるが、各種癌種への適用性を考慮
して全身投与が好ましく、また、薬剤の性質から静脈内
注射が特に好ましい。癌種としては、大腸癌、肺癌、胃
癌、膵臓癌、悪性黒色腫などの固形癌並びに血液性の癌
が挙げられる。本発明の医薬組成物は、いずれの癌種に
も用いることができるが、特に固形癌への適用が望まし
い。

【００５１】

【実施例】

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子のデザイン） 既に報告されている〔Ｐｅｎｎｉｃａら、前出〕ヒトＴ
ＮＦ構造遺伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトＴＮＦ遺伝
子の塩基配列について遺伝子構築及び変換体作製の便宜
上、配列表の配列番号１０のＤＮＡ塩基配列をデザイン
した。ここでは適当な間隔で制限酵素切断部位を組み込
み、また、その５′末端に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及
びその３′末端に翻訳終止コドン（ＴＡＡ及びＴＧＡ）
を設け、更にプラスミドベクターと容易に連結できるよ
うにＡＴＧの上流に制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位
を、翻訳終止コドン（ＴＡＡ及びＴＧＡ）の下流には制
限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる切断部位をそれぞれ設け
た。

【００５２】実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合
成） 前記実施例１でデザインされたＤＮＡは、自動ＤＮＡ合
成機（アプライド・バイオシステムズ，モデル３８１
Ａ）を用いて、ホスファイト法にて化学合成した。合成
は後述する塩基配列を有するＵ−１〜１０及びＬ−１〜
１０の２０本のオリゴヌクレオチドに分割して行い、合
成されたオリゴヌクレオチドのＣＰＧ樹脂（フナコシ社
販売）からの切り出し及び保護基脱離は、アプライド・
バイオシステムズ社のマニュアルに従った。各オリゴヌ
クレオチドの分離精製は逆相クロマトカラムを用いたＨ
ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）又は７Ｍウレア
を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０
〜２０％）により行った。

【００５３】Ｕ−１〜１０及びＬ−１〜１０の各塩基配
列は以下に示すものである。 Ｕ−１：２７塩基からなり、配列番号１０の１番目のＴ
から１９番目のＡまでの配列を有し、しかも、１番目の
Ｔに対し上流方向に５′−ＡＴＧ−３′更にその上流に
５′−ＡＡＴＴＣ−３′を接続した配列を有する。 Ｕ−２：５０塩基からなり、配列番号１０の２０番目の
Ｇから６９番目のＧまでの配列を有する。 Ｕ−３：４９塩基からなり、配列番号１０の７０番目の
Ｃから１１８番目のＧまでの配列を有する。 Ｕ−４：５０塩基からなり、配列番号１０の１１９番目
のＡから１６８番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−５：５０塩基からなり、配列番号１０の１６９番目
のＴから２１８番目のＴまでの配列を有する。 Ｕ−６：５２塩基からなり、配列番号１０の２１９番目
のＣから２７０番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−７：４８塩基からなり、配列番号１０の２７１番目
のＣから３１８番目のＣまでの配列を有する Ｕ−８：４９塩基からなり、配列番号１０の３１９番目
のＧから３６７番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−９：５１塩基からなり、配列番号１０の３６８番目
のＡから４１８番目のＣまでの配列を有する。 Ｕ−１０：５３塩基からなり、配列番号１０の４１９番
目のＴから４６５番目のＧまでの配列を有し、更に下流
方向に５′−ＴＡＡＴＧＡ−３′を有する。

【００５４】Ｌ−１〜１０は、配列番号１０のＤＮＡ鎖
に対応した下鎖（コンプリメンタリー配列鎖）である。 Ｌ−１：２９塩基からなり、配列番号１０の２５番目の
Ａから１番目のＴまでの配列に相補した配列を有し、し
かも１番目のＴに相補するＡの下流方向に５′−ＣＡＴ
Ｇ−３′を接続した配列を有する。 Ｌ−２：５２塩基からなり、配列番号１０の７７番目の
Ｇから２６番目のＡまでの配列に相補した配列を有す
る。 Ｌ−３：５０塩基からなり、配列番号１０の１２７番目
のＧから７８番目のＧまでの配列に相補した配列を有す
る。 Ｌ−４：５０塩基からなり、配列番号１０の１７７番目
のＧから１２８番目のＡまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−５：４９塩基からなり、配列番号１０の２２６番目
のＣから１７８番目のＧまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−６：４９塩基からなり、配列番号１０の２７５番目
のＴから２２７番目のＡまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−７：５１塩基からなり、配列番号１０の３２６番目
のＣから２７６番目のＣまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−８：４９塩基からなり、配列番号１０の３７５番目
のＧから３２７番目のＣまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−９：５１塩基からなり、配列番号１０の４２６番目
のＴから３７６番目のＡまでの配列に相補した配列を有
する。 Ｌ−１０：４９塩基からなり、配列番号１０の４６５番
目のＧから４２７番目のＧまでの配列に相補した配列を
有し、しかも４６５番目のＧに相補するＣの上流方向に
５′−ＴＣＡＴＴＡ−３′更にその上流方向に５′−Ａ
ＧＣＴ−３′を接続した配列を有する。

【００５５】ＨＰＬＣ法については、ヌクレオジル５Ｃ
１８カラム（φ４．６×１５０ｍｍ：ケムコ社販売）を
用いた逆相クロマトグラフィーによって、アセトニトリ
ルを含むトリエチルアミノ酢酸（１００ｍＭ）バッファ
ー（ｐＨ７．０）で溶出することにより分離精製した。
上記溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配を５〜３５
％（３０分）とし、約１５分のピークを回収した。

【００５６】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に関し
ては、各合成オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により
分離し、紫外線シャドウイング法による泳動パターンの
観察結果より目的の大きさのバンド部分を切り出し、そ
のポリアクリルアミドゲル断片を約１〜２ｍｍ^３の大き
さに切り刻み、約２ｍｌの溶出バッファー（０．５ＭＮ
Ｈ_４ＯＡｃ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、３７℃で一
晩振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッフ
ァーを回収し、フェノール抽出（５０％フェノール／５
０％クロロホルム溶液使用）、イソブタノール抽出を行
い、エタノール沈殿操作により各オリゴヌクレオチドの
精製試料とした。

【００５７】合成・精製したオリゴヌクレオチドの一部
について、マキサム・ギルバード法〔Ａ．Ｍ．ＭａＸａ
ｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，６５４９９（１９８０）〕により、目的の塩
基配列を有していることを確認した。

【００５８】以下（実施例３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３及び１４）の遺伝子組換え
に係わる操作において、制限酵素及び他の関連酵素の反
応条件等は、主にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
（前出）記載の方法に準じた。なお、上記酵素等は主に
宝酒造より入手しており、宝酒造のマニュアルも参考に
した。

【００５９】実施例３（合成オリゴヌクレオチドの連結
によるヒトＴＮＦ遺伝子の構築） （１）まず図１に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構築を試み
た。前記実施例２で得られた合成オリゴヌクレオチドを
３つのグループ（Ｕ及びＬ−１〜４、Ｕ及びＬ−５〜７
並びにＵ及びＬ−８〜１０）に分けてクローニングを行
った。すなわち、Ｕ−２、３、４、６、７、９及び１０
並びにＬ−１、２、３、５、６、８及び９の各オリゴヌ
クレオチド（１〜２μｇ）の５′末端を２〜５ユニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いて、
それぞれ別々にリン酸化した。リン酸化反応は１０μｌ
の水溶液中（５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．６、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＡＴＰ）、
３７℃で１時間行い、反応終了後、７０℃で１０分間処
理することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活
させた。新たに、１〜２μｇのＵ−１、５及び８並びに
Ｌ−４、７及び１０の各オリゴヌクレオチドをそれぞれ
別々に含む上記と同組成の水溶液１０μｌを用意し、そ
れぞれＵ及びＬの同じ番号同士で各オリゴヌクレオチド
（Ｕ−１〜１０及びＬ−１〜１０）水溶液を混合し（２
０μｌ）、１００℃で５分間煮沸後徐冷することにより
アニール化した。次に、得られた１０本のアニーリング
体（二本鎖ＤＮＡ断片）を、各グループごとに連結反応
のための水溶液（６６ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．６、
６．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭＡ
ＴＰ及び１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に添加し（総液量
１２０〜１６０μｌ）、４０℃に加温後徐冷によるアニ
ール化の後、７００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加えて、１６℃で１５時間連結反応を行った。

【００６０】反応終了後、各反応液をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）により分離し、エチジ
ウムブロマイド染色法による泳動パターンの観察結果よ
り目的の大きさ（１７６ｂｐ、１５０ｂｐ及び１５３ｂ
ｐ）のバンド部分を切り出し、エレクトロ・エリューシ
ョン法により目的とする３本のＤＮＡ断片を回収した。
更に、回収した各試料に対してフェノール抽出（５０％
フェノール／５０％クロロホルム溶液使用）、イソブタ
ノール抽出を行い、エタノール沈殿操作により目的のＤ
ＮＡを精製した。上記方法に準じて、精製した３本の二
本鎖ＤＮＡ断片をそれぞれ別々にその５′末端をＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、連結反応
のための水溶液中にて混合の後、４０℃の加温によりア
ニール化を行い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加えて連結し
た。エタノール沈殿操作によりこの連結ＤＮＡを回収
し、１ｍＭ ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌＢＳＡを含む
５０μｌのハイ・ソルトバッファー（５０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ_２）に溶解させ、１５ユニットの制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ Ｉ（宝酒造）及び１５ユニットの制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で２時間切断反
応を行った。反応終了後、上記方法に準じて、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度４％）により目的と
するＤＮＡ断片（約４８０ｂｐ）を分離精製した。

【００６１】一方、プラスミドベクターｐＵＣ９（九州
大学遺伝情報実験施設より分与）の５μｇを、前記の方
法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ
で切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）に
より約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。先に
精製した約４８０ｂｐのＤＮＡ断片（ヒトＴＮＦ遺伝子
を含む）とこのｐＵＣ９断片を、前記の方法に準じて、
２０μｌの連結反応液中にて混合し、３５０ユニットの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で３時間連結反応
を行った。塩化カルシウム法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ参照〕により作製したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−
１２ＪＭ８３株（九州大学遺伝情報実験施設により分
与）のコンピテント セルを、上記連結反応液により常
法に従って形質転換した〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ参照〕。

【００６２】得られたアンピシリン耐性クローンより、
公知の方法を用いてプラスミドを調製し、前記の方法に
準じて、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ）
処理後、アガロースゲル電気泳動によりその泳動パター
ンを解析することにより、ヒトＴＮＦ遺伝子のｐＵＣ９
ベクターへの挿入を調べた。その結果、約２５０ｂｐの
遣伝子の挿入が確認でき、そのクローンについて挿入さ
れた遣伝子の塩基配列をジデオキシ法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１）〕
により調べたところ、ＥｃｏＲＩ部位から下流に約１３
０ｂｐとＨｉｎｄ ＩＩＩ部位から上流に約９０ｂｐの
目的とするヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を有する遺伝子
断片であることが確認された。このクローン及びプラス
ミドをそれぞれｐＵＡ４１／ＪＭ８３及びｐＵＡ４１と
命名した。

【００６３】（２）引き続き、図２に従ってヒトＴＮＦ
遺伝子の構築を試みた。前記（１）工程でのクローニン
グでヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列において未達成な領域
周辺を２つのグループ（Ｕ及びＬ−３〜６並びにＵ及び
Ｌ−６〜９）に分け、前記（１）工程と同様にして、各
オリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニール化した後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。前記方法に準じ
て、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）
により分離精製し、得られた２本のＤＮＡ断片（２０１
ｂｐ及び２００ｂｐ）をそれぞれ別々に１００μｌの６
７ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ_２、１６．６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、６．７μ
Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ及び各３３０μＭデオキシリボヌクレオチド三リン酸
（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＴＴＰ）水溶液に
て溶解し、２〜５ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造）を添加し、３７℃で３０分間反応することに
よりＤＮＡ断片の両末端を平滑化した。反応終了後、６
８℃で１０分間処理することによりＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを失活させ、エタノール沈殿により目的の２本のＤ
ＮＡ断片を回収した。

【００６４】一方、５μｇのｐＵＣ９ベクターを１ｍＭ
ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む５０μｌ
のミディアム・ソルトバッファー（１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２）に溶解させ、１５ユニットの制限酵素Ｈｉ
ｎｃｌｌ（宝酒造）を添加し、３７℃で２時間の反応
後、エタノール沈殿により回収した。得られた切断・開
環したｐＵＣ９ベクターに、先に平滑化後回収した２本
のＤＮＡ断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じて、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて組込み、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−
１２ ＪＭ８３株を形質転換した。得られたそれぞれの
クローンについて、前記（１）工程と同様にして、挿入
されたＤＮＡの塩基配列を調べ、目的の塩基配列である
ことを確認した。これらのクローンをそれぞれｐＵＡ４
２／ＪＭ８３及びｐＵＡ４３／ＪＭ８３と命名し、プラ
スミドをｐＵＡ４２及びｐＵＡ４３と命名した。

【００６５】上記（１）工程で得られたｐＵＡ４１を制
限酵素ＥｃｏＲＩ（ハイ・ソルトバッファー）及びＳａ
ｃＩ（宝酒造：ロウ・ソルトバッファー）、制限酵素Ｈ
ａｅＩＩ（宝酒造）及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（ミディアム
・ソルトバッファー）で、上記（２）工程で得られたｐ
ＵＡ４２を制限酵素ＳａｃＩ（ロウ・ソルトバッファ
ー）及びＨｐａＩ（宝酒造：ＫＣｌバッファー）で並び
にｐＵＡ４３を制限酵素ＨｐａＩ及びＨａｅ ＩＩ（Ｋ
Ｃｌバッファー）で、前記方法に準じて、それぞれ切断
した。ロウ・ソルトバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）とハイ・ソ
ルトバッファー又はＫＣｌバッファー（２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ ｐＨ８．５、１００ｍＭ ＫＣｌ及び１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２）の組合せについては、切断反応を２回
に分け、反応の間にエタノール沈殿操作を行うことによ
り対応した。ｐＵＡ４１からのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ
ＤＮＡ断片（１２７ｂｐ）及びＨａｅ ＩＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ ＤＮＡ断片（８０ｂｐ）、ｐＵＡ４２からの
ＳａｃＩ−ＨｐａＩ ＤＮＡ断片（１４７ｂｐ）並びに
ｐＵＡ４３からのＨｐａＩ−Ｈａｅ ＩＩ ＤＮＡ断片
（１２６ｂｐ）を、前記方法に準じて、それぞれポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）により分離
精製した。

【００６６】一方、５μｇのｐＵＣ１９プラスミドベク
ター（九州大学遺伝情報実験施設より分与）を、前記の
方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで切断し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製した。先
に精製した４本のＤＮＡ断片を図示（図２）したように
順次添加し、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結して行き、最後に上記の精製ｐＵＣ１９ベク
ター（約２．７Ｋｂｐ断片）に組込み、ＪＭ８３株を形
質転換した。この形質転換体に含まれるプラスミドにつ
いて、前記方法に準じて、挿入された遺伝子の塩基配列
を調べたところ、目的とする完全長（約４８０ｂｐ）の
ヒトＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドベクター（約３．２
Ｋｂｐ）を有するクローンであることが確認できた。こ
のクローンをｐＵＡ４４／ＪＭ８３と命名し、プラスミ
ドをｐＵＡ４４と命名した。

【００６７】実施例４（ヒトＴＮＦ発現ベクターの構
築） （１）大腸菌ｔａｃプロモーターを有する発現ベクター
ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社より入手）をより扱
いやすくする目的で以下の改良を試みた。 （Ａ）発現ベクターを低分子量化する。 （Ｂ）制限酵素ＢａｍＨ Ｉの切断部位を唯一とする。 （Ｃ）ｔａｃプロモーターの方向をアンピシリン耐性遺
伝子の方向と逆向きにする。

【００６８】図３にその方法を図示した。プラスミドベ
クターｐＢＲ３２２（九州大学遺伝情報実験施設より分
与）の５μｇを、実施例３の方法に準じて、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断後、その両末端を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。実施例３
の方法に準じて、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１
％）により約４．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製し、
その開環部位に１００ｎｇのノンフォスフォリレーテッ
ド リンカーズのＢｇｌ ＩＩリンカー（制限酵素Ｂｇ
ｌ ＩＩ切断部位を含む１０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片：
カタログＮｏ．４７２１Ａタカラ・バイオテクノロジー
・カタログ１９９１ Ｖｏｌ．１、宝酒造より入手）を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結した。前記実施例
３の方法に準じて得た形質転換体の中より、そのプラス
ミドについて制限酵素による切断の可否を調べることに
より、目的の制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ
切断部位を欠き、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ切断部位を新生
したプラスミドｐＢＲ９３３３（約４．４Ｋｂｐ）を有
するクローンを得た。

【００６９】上記で得たプラスミドｐＢＲ９３３３の５
μｇを、実施例３の方法に準じて、ハイ・ソルトバッフ
ァーに溶解し、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ（宝酒造）及びＰ
ｖｕＩＩ（宝酒造）で切断し、複製起点を含む約２．３
ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃
度１％）により分離精製した。一方、発現ベクターｐＫ
Ｋ２２３−３（約４．６Ｋｂｐ）の５μｇを上記の場合
と同様、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（宝酒造）及びＳｃａＩ（宝酒造）で切断し
た。制限酵素ＢａｍＨＩによる切断反応は、添加酵素量
を通常の約１／２とし、反応時間を５〜３０分間とする
部分切断により行った。切断処理後、ｔａｃプロモータ
ー及びｒｒｎＢＴ_１Ｔ_２ターミネーター等を含む約１．
１ＫｂｐのＤＮＡ断片を上記の場合と同様、アガロース
ゲル電気泳動により分離精製した。先に精製した複製起
点を含む約２．３ＫｂｐのＤＮＡ断片に上記の約１．１
ＫｂｐのＤＮＡ断片を前記に準じてＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて挿入連結し、実施例３の方法に準じて、塩化カ
ルシウム法により作製したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ
１０３株（九州大学遣伝情報実験施設）のコンピテント
セルに導入した。得られた形質転換体の中より、目的と
するｔａｃ プロモーター等を含む発現ベクター（約
３．４Ｋｂｐ）を有するクローンを選択し、この発現ベ
クターをｐＫＫ１０１と命名した。

【００７０】（２）図４に従って、次の工程を説明す
る。前記（１）工程で得た発現ベクターｐＫＫ１０１の
５μｇを、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調節領域
等を含む約３．４ＫｂＰのＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製した。また、
前記実施例３で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を含むプラス
ミドｐＵＡ４４（約３．２Ｋｂｐ）を、同様にして、制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ヒト
ＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂｐのＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離精製した。このヒトＴ
ＮＦ遺伝子全域を含むＤＮＡ断片を、先に発現ベクター
ｐＫＫ１０１より精製した約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片
に、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿
入連結し、前記の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２
ＪＭ１０３株に導入した。得られた形質転換体の中より
目的のヒトＴＮＦ発現ベクター（約３．９Ｋｂｐ）を有
するクローンを選択し、この発現ベクターをｐＫＦ４１
０２と命名した。

【００７１】実施例５（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４１６８の構築） （１）図５に従って説明する。前記実施例３で得られた
プラスミドｐＵＡ４４を、前記方法に準じ、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ヒトＴＮＦ遺
伝子（全域を含む約４８０ｂｐ）のＤＮＡ断片をアガロ
ースゲル電気泳動により分離精製した。一方、Ｍｅｓｓ
ｉｎｇら〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，１５３，３（１９８７）〕によって開発された一本
鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクターｐＵＣ１
１９（宝酒造より入手）を、同様にして、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ＩＧ領域を含む
約３．２ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動
により分離精製した。このＩＧ領域（Ｍ１３ファージＤ
ＮＡのｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）の存在に
より、プラスミドｐＵＣ１１９は、ヘルパーファージＭ
１３Ｋ０７感染後優先的に一本鎖ＤＮＡとなりファージ
粒子に包み込まれ菌体外に放出される。上記で精製した
ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂｐのＤＮＡ断片
とＩＧ領域を含む約３．２ＫｂｐのｐＵＣ１１９断片を
前記に準じてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、前
記実施例３の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ
８３株に導入した。得られた形質転換体の中より、目的
のプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選
択し、このクローンをｐＵＣ１１９−ｈＴＮＦ／ＪＭ８
３と命名し、プラスミドをｐＵＣ１１９−ｈＴＮＦと命
名した。

【００７２】上記で得たプラスミドｐＵＣ１１９−ｈＴ
ＮＦを、そのＤＮＡ内にウラシルを取り込ませ保持する
ために、前記実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム
法により作製した大腸菌ＣＪ２３６株（ｄｕｔ⁻，ｕｎ
ｇ⁻）のコンピテント セルに導入した。ＣＪ２３６株
はデオキシウリジン三リン酸分解酵素遺伝子に欠失変異
（ｄｕｔ⁻）を持つため競合反応が生じ、チミンの替わ
りに一部ウラシルを取り込んだＤＮＡを作ることがで
き、更にｕｎｇ⁻変異によりウラシルＮ−グリコシラー
ゼが欠損しており、そのウラシルをＤＮＡ中に保持して
おくことができる。このＣＪ２３６株はバイオ・ラドよ
り入手した。上記導入により得られたクローン（ｐＵＣ
１１９−ｈＴＮＦ／ＣＪ２３６）をヘルパーファージＭ
１３Ｋ０７（宝酒造より入手）の感染後、１００μｇ／
ｍｌアンピシリン、７０μｇ／ｍｌカナマイシン及び３
０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２×ＹＴブロ
ース（１．６％トリプトン、１％酵母エキス及び０．５
％ＮａＣｌ ｐＨ７．６）にて培養することにより、目
的のウラシルを導入した一本鎖プラスミドＤＮＡ（約
３．７Ｋｂａｓｅｓ）をファージ粒子に包み込んだ形で
菌体外に放出させた。放出させたファージ粒子を培養上
清より回収し、一本鎖ファージＤＮＡの調製方法に準じ
て、目的の一本鎖プラスミドＤＮＡを調製した。

【００７３】（２）次に図６に従って説明する。コーデ
ィング鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子に対し変異導入を行うために、プライマー４１６８を
デザインした。プライマー４１６８、配列番号１０で示
した１０番目のＣから２１番目のＴまでの塩基配列のう
ち１３〜１５番目の５′−ＡＣＣ−３′が５′−ＧＧＣ
−３′に置換され１６〜１８番目の５′−ＣＣＧ−３′
が５′−ＧＡＴ−３′に置換された１２塩基からなるオ
リゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの化
学合成及び精製は、前記実施例２の方法に準じて行っ
た。

【００７４】ヒトＴＮＦ遺伝子への部位特異的変異導入
は、バイオ・ラドのシステム（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ^ＴＭ
ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）
に準じて行った。すなわち、上記で作製した約０．５μ
ｇのプライマーの５′末端を前記方法に準じてＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した一部と、先に
調製したウラシル導入一本鎖プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ
１１９−ｈＴＮＦ）の約２００ｎｇとの間で、１０μ
ｌのアニーリング・バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．４，２ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）中にてアニーリング（約７０℃に加温後徐冷）
を行った。アニーリング終了後、１０倍シンセシス・バ
ッファー〔５ｍＭ各デオキシリボヌクレオチド三リン酸
など（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＴＴＰ）、１
０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ
７．４、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び２０ｍＭ ＤＴＴ〕
を１／１０容量加え、１ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ及び２〜４ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て二本鎖化反応（３７℃、９０分間）を行った。ＴＥバ
ッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５及び
１ｍＭ ＥＤＴＡ）を約８容量加え、凍結することによ
り反応を停止した。前記実施例３の方法に準じて、塩化
カルシウム法により作製したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２
ＴＧ１株（ｕｎｇ^＋：アマシャム社）のコンピテントセ
ルに、上記反応液を処理し二本鎖ＤＮＡを導入した。

【００７５】ｕｎｇ^＋株にヘテロ二本鎖ＤＮＡを導入す
ることにより、鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖は不
活性化され複製の対象とならない。（そのため変異の導
入頻度は５０％を上回る高効率なものとなる。）得られ
た形質転換体の中より、変異導入のために使用したプラ
イマーをプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、目的の転換体ＤＮＡを含むプラスミド
（約３．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。選択
されたクローンについて、そのプラスミドの変異導入部
位周辺の塩基配列をジデオキシ法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ：
前出〕により調べ、デザイン通りの転換体ＤＮＡに変異
していることを確認した。このプラスミドをｐＵＣ１１
９−Ｆ４１６８と命名した。

【００７６】（３）変異導入により得られた目的のヒト
ＴＮＦ転換体遣伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベク
ターの構築方法に準じて、ｔａｃ プロモーターを有す
る発現ベクターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ転換体
発現ベクターを構築した。ヒトＴＮＦ転換体遣伝子（約
４８０ｂｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラ
スミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１６８より、前記方法に準じ
て、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切
断後分離精製した。目的とするヒトＴＮＦ転換体発現ベ
クター（ｐＫＦ４１６８）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター
（ｐＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株を用いて取得した。上記転換体
発現ベクターは、発現誘導により、以下に示す変換を有
する新規生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。

【００７７】ベクターｐＫＦ４１６８：配列番号１で示
したアミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸
配列が配列番号２で示したアミノ酸配列で置換されたポ
リペプチドＦ４１６８をコードする。

【００７８】実施例６（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４４１５、ｐＫＦ４４１６、ｐＫＦ４４１７及び
ｐＫＦ４４１８の構築） （１）前記実施例５（２）において、プライマー４１６
８の替りにそれぞれプライマー４４１５、同４４１６、
同４４１７又は同４４１８を用いて目的の変異導入ＤＮ
Ａを含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を取得した。ジ
デオキシ法によりデザイン通りの変換体ＤＮＡに変異し
ていることを確認し、これらのプラスミドをそれぞれｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４４１５、ｐＵＣ１１９Ｆ４４１６、ｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４４１７又はｐＵＣ１１９−Ｆ４４１８
と命名した

【００７９】ここで用いたプライマー４４１５、同４４
１６、同４４１７及び同４４１８は以下のオリゴヌクレ
オチドであり、その化学合成及び精製は前記実施例２の
方法に準じて行われた。

【００８０】プライマー４４１５：配列番号１０で示し
た７番目のＴから３０番目のＴまでの塩基配列のうち１
６〜１８番目の５′−ＣＣＧ−３′が５′−ＣＧＴ−
３′に置換され、１９〜２１番目の５′−ＡＧＴ−３′
が５′−ＧＧＴ−３′に置換された２４塩基からなるオ
リゴヌクレオチド プライマー４４１６：配列番号１０で示した１番目のＴ
から１８番目のＧまでの塩基配列のうち９番目のＴと１
０番目のＣとの間に５′−ＣＧＴＧＧＴＧＡＴ−３′を
挿入した２７塩基からなるオリゴヌクレオチド。 プライマー４４１７：配列番号１０で示した１０番目の
Ｃから２７番目のＧまでの塩基配列のうち１８番目のＧ
と１９番目のＡとの間に５′−ＣＧＴＧＧＴＧＡＴ−
３′を挿入した２７塩基からなるオリゴヌクレオチド。 プライマー４４１８：配列番号１０で示した１番目から
９番目まで塩基配列に対し、１番目のＴに対してその
５′側に５′−ＣＧＴＧＧＴＧＡＴ−３′を付加し、更
にその５′側に５′−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧ−３′を付加
した２７塩基からなるオリゴヌクレオチド。

【００８１】（２）変異導入により得られた目的のヒト
ＴＮＦ転換体遺伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベク
ターの構築方法に準じて、ｔａｃ プロモーターを有す
る発現ベクターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ転換体
発現ベクターを構築した。ヒトＴＮＦ転換体遺伝子（約
４８０ｂｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラ
スミドｐＵＣ１１９−Ｆ４４１５、ｐＵＣ１１９−Ｆ４
４１６、ｐＵＣ１１９−Ｆ４４１７又はｐＵＣ１１９−
Ｆ４４１８より、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断後分離精製した。目
的とするヒトＴＮＦ転換体発現ベクターｐＫＦ４４１
５、ｐＫＦ４４１６、ｐＫＦ４４１７又はｐＫＦ４４１
８は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２）と同
様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株
を用いて取得した。

【００８２】上記転換体発現ベクターは、発現誘導によ
り、以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチド
を大腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４４１５：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号３で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ
４４１５をコードする。 ベクターｐＫＦ４４１６：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号４で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ
４４１６をコードする。 ベクターｐＫＦ４４１７：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号５で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ
４４１７をコードする。 ベクターｐＫＦ４４１８：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ
４４１８をコードする。

【００８３】実施例７（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４４２０の構築） （１）配列番号１０で示した５番目のＣから２０番目の
Ｇまでの１６塩基のうち１３番目のＡがＧに置換された
オリゴヌクレオチドをデザインし、プライマー４１０４
と命名した。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精
製は、前記実施例２の方法に準じて行った。前記実施例
５（２）においてプライマー４１６８の替りにこのプラ
イマー４１０４を用いることにより目的の変換体ＤＮＡ
を含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を取得した。変異
導入部位周辺の塩基配列をジデオキシ法により調べ、デ
ザイン通りの変換体ＤＮＡに変異していることを確認
し、このプラスミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４と命名
した。

【００８４】（２）前記実施例５（１）において、ｐＵ
Ｃ１１９−ｈＴＮＦの替りにｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４
を用いて目的の一本鎖プラスミドＤＮＡを調製した。ま
た、配列番号１０で示した４６番目のＧから６６番目の
Ｇまでの２１塩基のうち５６番目のＡがＧに置換された
オリゴヌクレオチドをデザインし、プライマー４２２６
と命名した。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精
製は前記実施例２の方法に準じて行った。

【００８５】次に、上記で調製したｐＵＣ１１９−Ｆ４
１０４の一本鎖プラスミドＤＮＡ及びプライマー４２２
６を用いてヒトＴＮＦ変換体遺伝子への部位特異的変異
導入を前記実施例５（２）の方法に準じて行い、目的の
変換体ＤＮＡを含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を取
得した。ジデオキシ法によりデザイン通りの変換体ＤＮ
Ａに変異していることを確認し、このプラスミドをｐＵ
Ｃ１１９−Ｆ４２２６と命名した。

【００８６】（３）前記実施例７（２）で得られた制限
酵素 ＸｈｏＩ 切断部位を２箇所に有するプラスミド
ｐＵＣ１１９−Ｆ４２２６を用いて、その生成した制限
酵素ＸｈｏＩ 切断部位のＮ末端側に化学合成オリゴヌ
クレオチド（アニーリングにより二本鎖化したもの）を
連結することにより、Ｎ末置換型転換体ポリペプチド
（Ｆ４４２０と命名）の発現ベクター（ｐＫＦ４４２０
と命名）を構築した。その構築方法を図７に従って説明
する。

【００８７】プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４２２６（約
３．７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素 Ｘｈ
ｏＩ（宝酒造）及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末部
分を欠失したＦ４２２６遺伝子を含む約４２０ｂｐのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）に
より分離精製した。また、Ｆ４２２６のＮ末部分に置換
する目的でデザインしたオリゴペプチドをコードするオ
リゴヌクレオチドの上鎖（Ｕ−４４２０）及び下鎖（Ｌ
−４４２０）を、前記実施例２の方法に準じて化学合成
し、精製した。上鎖Ｕ−４４２０は配列番号１１で示し
た塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。また下
鎖Ｌ−４４２０は上鎖Ｕ−４４２０に相補する配列を有
する鎖であるが、このものは上鎖Ｕ−４４２０の１番目
〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に相補する配列部分は
有さず、一方その下鎖の５′末端のＧに対し、その５′
側に５′−ＴＣＧＡ−３′が付加された塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドである。精製後得られた２本のオ
リゴヌクレオチド（各１μｇ）を、前記実施例３の方法
に準じて、その５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化の後、アニール化により二本鎖ＤＮ
Ａ断片（４６ｂｐ）とした。一方、前記実施例４の方法
に準じてプラスミドベクターｐＫＫ１０１を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び
転写調節領域等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分
離精製した。

【００８８】上記方法に従って得られた３本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０
３株のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的のＦ４４２０発現ベクターｐＫＦ４４
２０（約３．９Ｋｂｐ）を有するクローンを、制限酵素
ＥｃｏＲ Ｉ、 Ｘｈｏ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによ
る切断パターンの確認並びに転換体ポリペプチドのＮ末
置換部位周辺の塩基配列を調べることにより選択した。

【００８９】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４４２０：配列表の配列番号１で示した
アミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列
がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐで置換され、１９番目のＧｌ
ｎがＡｒｇに変換されたポリペプチドＦ４４２０をコー
ドする。

【００９０】実施例８（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４４２１及びｐＫＦ４１３７の構築） 前記実施
例７（１）で得られた制限酵素Ｘｈｏ Ｉ切断部位を有
するプラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４を用いて、そ
の制限酵素Ｘｈｏ Ｉ切断部位のＮ末端側に化学合成オ
リゴヌクレオチド（アニーリングにより二本鎖化したも
の）を連結することにより、Ｎ末置換型転換体ポリペプ
チド（Ｆ４４２１及びＦ４１３７と命名）の発現ベクタ
ー（ｐＫＦ４４２１及びｐＫＦ４１３７と命名）を構築
した。

【００９１】プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４（約
３．７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末部分を欠夫し
たＦ４１０４遺伝子を含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精
製した。また、Ｆ４１０４のＮ末部分に置換する目的で
デザインしたオリゴペプチドをコードするオリゴヌクレ
オチドの上鎖（Ｕ−４４２１又はＵ−４１３７）及び下
鎖（Ｌ−４４２１又はＬ−４１３７）を、前記実施例２
の方法に準じて、化学合成及び精製した。上鎖Ｕ−４４
２１は配列表の配列番号１２で示した配列を有するオリ
ゴヌクレオチドである。また下鎖Ｌ−４４２１は上鎖Ｕ
−４４２１に相補する配列を有する鎖であるが、上鎖Ｕ
−４４２１の１番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に
相補する配列部分は有さず、一方その下鎖の５′末端の
Ｇに対し、その５′側に５′−ＴＣＧＡ−３′が付加さ
れた配列を有するオリゴヌクレオチドである。また、上
鎖Ｕ−４１３７は配列表の配列番号１３で示した配列を
有するオリゴヌクレオチドである。下鎖Ｌ−４１３７は
上鎖Ｕ−４１３７に相補する配列を有する鎖であるが、
上鎖４１３７の１番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′
に相補する配列部分は有さず、一方その下鎖の５′末端
のＧに対し、その５′側に５′−ＴＣＧＡ−３′が付加
された配列を有するオリゴヌクレオチドである。精製後
得られた各上、下２本のオリゴヌクレオチド（各１μ
ｇ）を、前記実施例３の方法に準じてその５′末端をＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化の後、ア
ニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（３４ｂｐ）とした。

【００９２】一方、前記実施例４の方法に準じてプラス
ミドベクターｐＫＫ１０１を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで籾断し、複製起点及び転写調節領域
等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。

【００９３】上記方法に従って得られた各３本のＤＮＡ
断片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ１０
３株のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的のＦ４４２１発現ベクターｐＫＦ４４
２１（約３．９Ｋｂｐ）又はＦ４１３７発現ベクターｐ
ＫＦ４１３７（約３．９Ｋｂｐ）を有するクローンを、
制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉによる切断パターンの確認並びに転換体ポリペプチド
のＮ末置換部位周辺の塩基配列を調べることにより選択
した。

【００９４】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４４２１：配列表の配列番号１で示した
アミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列
が配列番号７で示したアミノ酸配列で置換されたポリペ
プチドＦ４４２１をコードする。 ベクターｐＫＦ４１３７：配列表の配列番号１で示した
アミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列
が配列番号８で示したアミノ酸配列で置換されたポポリ
ペプチドＦ４１３７をコードする。

【００９５】実施例９（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４１１３の構築） 転写プロモーターとしてｔｒｐプロモーターを有し、翻
訳開始シグナル（ＳＤ配列）をタンデムに２つ並べ、転
写ターミネーターとしてｒｒｎＢＴ_１Ｔ_２ ターミネー
ターを有するプラスミドベクター（ｐＳＫ４０７と命
名）を図９〜図１１に示した方法に従って構築した。プ
ラスミドベクターｐＧＦ１０１（約４．３Ｋｂｐ、大阪
大学薬学部より分与）の５μｇを、前記方法に準じて、
ミディアム・ソルトバッファーに溶解し、１０ユニット
の制限酵素ＣｌａＩ（宝酒造）を添加することにより切
断した。この切断されたＤＮＡ断片を、前記実施例３の
方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化
し、エタノール沈殿操作後、ＮａＣｌを添加しＮａＣｌ
濃度を１７５ｍＭとしたハイ・ソルトバッファーに溶解
し、１５ユニットの制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）を添加
することにより切断した。前記実施例３の方法に準じ
て、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により約
４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。

【００９６】一方、Ｃａｓａｄａｂａｎら〔Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．， １４３，９７１（１９８０）〕によ
って開発されプラスミドｐＭＣ１４０３（約９．９Ｋｂ
ｐ、京都大学ウィルス研究所より分与）の５μｇを、前
記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断後、上
記方法と同様に、平滑化及び制限酵素Ｓａｌ Ｉ切断を
行い、アガロースゲル電気泳動により約６．２Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を分離精製した。前記実施例３の方法に準じ
て、先に精製したＤＮＡ断片との間でＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結反応を行い、塩化カルシウム法により作
製したＥ．ｃｏｌｉＫ−１２ ＨＢ１０１株（京都大学
ウィルス研究所より分与）のコンピテントセルに導入し
た。得られた形質転換体の中より、目的のｔｒｐプロモ
ーター並びに制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ切
断部位を含む約１０．２Ｋｂｐのプラスミドベクター
（ｐＳＫ１０１と命名）を有するクローンを選択した。

【００９７】上記で得られたプラスミドベクターｐＳＫ
１０１の５μｇを２本のチューブにそれぞれ別々に、前
記方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制
限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＳａｌ Ｉ並びに制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ及びＳａｌ Ｉを添加することにより切断し、ア
ガロースゲル電気泳動により約４．０Ｋｂｐ及び約６．
２ＫｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ分離精製した。一方、
ポータブル翻訳開始部位オリゴヌクレオチド（ＳＤ−Ａ
ＴＧリンカーと略し、翻訳開始シグナルＳＤ配列及び翻
訳開始コドンＡＴＧを含む塩基数２１のオリゴヌクレオ
チド：カタログＮｏ．２７−４８７８−０１及び２７−
４８９８−０１ファルマシア・モレキュラー・バイオロ
ジカルズ１９８５Ｍａｙ、ファルマシア社より入手）の
上下鎖（各１００ｎｇ）を、前記実施例３の方法に準じ
て、その５′末端のリン酸化及びアニール化に供し、二
本鎖ＤＮＡ断片（２１ｂｐ）とした。上記で得られた３
本のＤＮＡ断片を、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＨＢ１０
１株のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的とするＳＤ−ＡＴＧリンカーがｔｒｐ
プロモーターの下流かつ制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位の
直前に挿入された約１０．２Ｋｂｐのプラスミドベクタ
ー（ｐＳＫ２１１と命名）を有するクローンを選択し
た。このプラスミドベクターは、ｔｒｐプロモーターの
下流にタンデムに並んだ２つのＳＤ配列を持つことにな
る。

【００９８】このプラスミドベクターの制限酵素Ｓａｌ
Ｉ切断部位を消失し、その近傍に制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位を新生する目的で以下の操作を行った。
プラスミドベクターｐＳＫ２１１の５μｇを前記方法に
準じて、制限酵素Ｓａｌ Ｉにて切断後、Ｔ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑化した。エタノール沈殿操作
により回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断
し、アガロースゲル電気泳動により約４．０ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片を分離精製した。一方、ｔａｃプロモーターを
有するプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマ
シア社）及びＳＤ−ＡＴＧリンカー等を用い、前記のｐ
ＳＫ２１１を構築した方法に準じた組換えにより構築し
たプラスミドベクターｐＧＦＫ５０３−１（約５．７Ｋ
ｂｐ）の５μｇを、前記方法に準じて制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩにて切断後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用い
て平滑化した。エタノール沈殿操作により回収したＤＮ
Ａ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル
電気泳動により約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製
した。上記で精製した２本のＤＮＡ断片を、前記方法に
準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０１株のコンピテントセルに導
入した。得られた形質転換体の中より、目的の制限酵素
Ｓａｌ Ｉ切断部位を欠きＨｉｎｄ ＩＩＩ切断部位を
新生したｔｒｐプロモーターを含む約５．１Ｋｂｐのプ
ラスミドベクター（ｐＳＫ３０１と命名）を有するクロ
ーンを選択した。

【００９９】このプラスミドベクターｐＳＫ３０１の５
μｇを、前記方法に準じて、ロウ・ソルトバッファーに
溶解し、５ユニットの制限酵素Ｂａｌ Ｉ（宝酒造）を
添加して切断反応を行った。反応終了後、反応液のＮａ
Ｃｌ濃度を５０ｍＭとして制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩに
よる切断を行い、約４．３ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロ
ースゲル電気泳動により分離製した。一方、プラスミド
ベクターｐＫＫ２２３−３の５μｇを、前記方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ及びＳｃａＩで切断し、約０．８ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製し
た。上記で精製した２本のＤＮＡ断片を、前記方法に準
じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２ＨＢ１０１株のコンピテントセルに導入し
た。得られた形質転換体の中より、目的とするｒｒｎＢ
Ｔ_１Ｔ_２ターミネーターがｔｒｐプロモーターの下流に
配置されたプラスミドベクターｐＳＫ４０７（約５．１
Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。

【０１００】次に、２本のオリゴヌクレオチド（Ｕ−４
１１３及びＬ−４１１３）をデザインした。Ｕ−４１１
３（配列表の配列番号１４、塩基数３２） Ｌ−４１１３（塩基数３２） Ｕ−４１１３に相補するものであるが、配列番号１４の
１番目〜４番目の５′−ＧＡＴＣ−３′に相補する塩基
配列は有さず、一方配列番号１４の３２番目のＣに相補
するＧに対しその５′側に５′−ＴＣＧＡ−３′を付加
された塩基配列を有する。

【０１０１】前記実施例２の方法に準じて化学合成し、
精製することにより作製し、得られたオリゴヌクレオチ
ド（各１μｇ）を前記実施例３の方法に準じて、その
５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化の後、アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（３２ｂ
ｐ）とした。また、ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢＴ
_１Ｔ_２ターミネーター等を有するプラスミドベクターｐ
ＳＫ４０７（約５．１Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例
３の方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し制
限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製
起点及び転写調節領域等を含む約４．０ＫｂｐのＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により
分離精製した。一方、前記実施例７（１）で得られたプ
ラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４（約３．７Ｋｂｐ）
の５μｇを、実施例８の方法と同様に、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末端部分を欠失し
たＦ４１０４遣伝子を含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断片を
分離精製した（図１２）。

【０１０２】上記方法に従って得られた３本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０
１株のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的の約４．５ＫｂｐのＦ４１１３発現ベ
クター（ｐＫＦ４１１３と命名）を有するクローンを、
制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩに
よる切断パターンの確認並びに転換体ポリペプチドのＮ
末端付加部位周辺の塩基配列を調べることにより選択し
た。

【０１０３】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４１１３：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号９で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ
４１１３をコードする。

【０１０４】実施例１０（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクタ
ーｐＫＦ４６０１及びｐＫＦ４６０２の構築） （１）プライマー４２９１及び同４２９２をデザインし
た。これらプライマーは配列番号１０の１９３番目のＣ
から２１３番目のＴまでの塩基配列を有し、２０２番目
〜２０４番目の５′−ＣＣＡ−３′が、プライマー４２
９１の場合５′−ＧＡＴ−３′により、プライマー４２
９２の場合５′−ＡＴＧ−３′によりそれぞれ置換され
た２１塩基からなるオリゴヌクレオチドである。

【０１０５】オリゴヌクレオチドの化学合成及び精製は
前記実施例２の方法に準じて行われた。これらプライマ
ー４２９１あるいは４２９２を用い、前記実施例５
（１）及び（２）の方法に準じて目的の変異導入ＤＮＡ
を含むプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を得た。ジデオキ
シ法によりデザイン通りの変換体ＤＮＡに変異している
ことを確認し、このプラスミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４２
９１あるいはｐＵＣ１１９−Ｆ４２９２と命名した。変
異導入により得られた目的のヒトＴＮＦ変換体遣伝子を
実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方法に準じ
て、ｔａｃ プロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ
１０１に組込みヒトＴＮＦ変換体発現ベクターを構築し
た。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子（約４８０ｂｐ）は、上記
で得られた約３．７ＫｂｐのプラスミドｐＵＣ１１９−
Ｆ４２９１あるいはｐＵＣ１１９−Ｆ４２９２より、前
記の方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩによる切断後分離精製した。目的とするヒトＴＮ
Ｆ変換体発現ベクターｐＫＦ４２９１あるいはｐＫＦ４
２９２（約３．９Ｋｂｐ）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター
（ｐＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株を用いて取得した。

【０１０６】（２）図８に従って説明する。前記実施例
５で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベクターｐＫＦ４１
６８（約３．９Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３の方
法に準じて、ミディアム・ソルトバッファーに溶解し、
制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製
起点及び転写調節頭域等を含む約３．５ＫｂｐのＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により
分離精製した。一方、前記（１）で得られたヒトＴＮＦ
変換体発現ベクターｐＫＦ４２９１又はｐＫＦ４２９２
の５μｇを、前記と同様にして、制限酵素ＳａｃＩ及び
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末部分を欠失したヒトＴ
ＮＦ変換体遺伝子を含む約３６０ｂｐのＤＮＡ断片を分
離精製した。

【０１０７】上記得られた２本のＤＮＡ断片を、前記実
施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３ 株のコン
ピテント セルに導入した。得られた形質転換体の中よ
り、目的のＦ４６０１ 又はＦ４６０２発現ベクターｐ
ＫＦ４６０１又はｐＫＦ４６０２（約３．９Ｋｂｐ）を
有するクローンを、制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩによる切断パターンの確認並びに変換体ポリペプチ
ド由来の変換部位周辺の塩基配列を調べることにより選
択した。

【０１０８】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４６０１：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、６８番目のＰｒ
ｏ がＡｓｐ に変換されたポリペプチドＦ４６０１を
コードする。 ベクターｐＫＦ４６０２：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、６８番目のＰｒ
ｏ がＭｅｔ に変換されたポリペプチドＦ４６０２
をコードする。

【０１０９】上記発現ベクターを有する各宿主大腸菌
が、抗腫瘍活性を示すポリペプチドを発現生産すること
を、超音波破砕処理した大腸菌懸濁液の遠心上清（遠心
分離操作後の上清画分）について、後記実施例１６の方
法に準じて試験することにより確認した。

【０１１０】実施例１１（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクタ
ーｐＫＦ４６０７、ｐＫＦ４６０８、ｐＫＦ４６２６、
ｐＫＦ４６２７、ｐＫＦ４６３４、ｐＫＦ４６３５、ｐ
ＫＦ４６０９、ｐＫＦ４６１０、ｐＫＦ４６２８、ｐＫ
Ｆ４６２９、ｐＫＦ４６３８及びｐＫＦ４６３９の構
築） （１）プライマー４２６８、同４１５０、同４２２２、
同４２６７、同４１２３及び同４２２３をデザインし
た。プライマー４２６８は配列番号１０の３０１番目の
Ａから３３３番目のＣまでの塩基配列を有し、３１６番
目〜３１８番目の５′−ＧＧＣ−３′が欠失された３０
塩基からなるオリゴヌクレオチドである。一方、他のプ
ライマーは配列番号１０の３０７番目のＡから３２７番
目のＣまでの塩基配列を有し、３１６番目〜３１８番目
の５′−ＧＧＣ−３′が、プライマー４１５０の場合
５′−ＴＧＧ−３′により、プライマー４２２２の場合
５′−ＣＣＣ−３′により、プライマー４２６７の場合
５′−ＧＣＴ−３′により、プライマー４１２３の場合
５′−ＧＡＣ−３′により、プライマー４２２３の場合
５′−ＣＧＣ−３′によりそれぞれ置換された２１塩基
からなるオリゴヌクレオチドである。

【０１１１】オリゴヌクレオチドの化学合成及び精製は
前記実施例２の方法に準じて行った。これらのプライマ
ーを用い、前記実施例５（１）及び（２）の方法に準じ
て目的の変異導入ＤＮＡを含むプラスミド（約３．７Ｋ
ｂｐ）を得た。ジデオキシ法によりデザイン通りの変換
体ＤＮＡに変異していることを確認し、このプラスミド
をｐＵＣ１１９−Ｆ４２６８、ｐＵＣ１１９−Ｆ４１５
０、ｐＵＣ１１９−Ｆ４２２２、ｐＵＣ１１９−Ｆ４２
６７、ｐＵＣ１１９−Ｆ４１２３あるいはｐＵＣ１１９
−Ｆ４２２３と命名した。変異導入により得られた目的
のヒトＴＮＦ変換体遺伝子を実施例４のヒトＴＮＦ発現
ベクターの構築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有
する発現ベクターｐＫＫ１０１に組込み、ヒトＴＮＦ変
換体発現ベクターを構築した。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子
（約４８０ｂｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐの
プラスミドより、前記の方法に準じて、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断後分離精製した。
目的とするヒトＴＮＦ変換体発現ベクターｐＫＦ４２６
８、ｐＫＦ４１５０、ｐＫＦ４２２２、ｐＫＦ４２６
７、ｐＫＦ４１２３あるいはｐＫＦ４２２３（約３．９
Ｋｂｐ）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０
２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ
１０３株を用いて取得した。

【０１１２】（２）前記実施例１０（２）の方法に準じ
て、前記実施例５で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベク
ターｐＫＦ４１６８（約３．９Ｋｂｐ）の５μｇを、制
限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製
起点及び転写調節領域等を含む約３．５ＫｂｐのＤＮＡ
断片を分離精製した。一方、前記（１）で得られたヒト
ＴＮＦ変換体発現ベクターｐＫＦ４２６８、ｐＫＦ４１
５０、ｐＫＦ４２２２、ｐＫＦ４２６７、ｐＫＦ４１２
３又はｐＫＦ４２２３の５μｇを、前記と同様にして、
制限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ
末部分を欠失したヒトＴＮＦ変換体遺伝子を含む約３６
０ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。

【０１１３】上記で得られた２本のＤＮＡ断片を、前記
実施例３の方法に準じてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株のコンピ
テントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、
目的のＦ４６０７、Ｆ４６０８、Ｆ４６２６、Ｆ４６２
７、Ｆ４６３４又はＦ４６３５の各発現ベクターｐＫＦ
４６０７、ｐＫＦ４６０８、ｐＫＦ４６２６、ｐＫＦ４
６２７、ｐＫＦ４６３４又はｐＫＦ４６３５（約３．９
Ｋｂｐ）を有するクローンを、制限酵素ＳａｃＩ及びＨ
ｉｎｄ ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに変換体
ポリペプチド由来の変換部位周辺の塩基配列を調べるこ
とにより選択した。上記方法に従って構築した転換体発
現ベクターは、発現誘導により、以下に示す変換を有す
る新規生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。

【０１１４】ベクターｐＫＦ４６０７：配列番号１で示
したアミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸
配列が配列番号２で示したアミノ酸配列で置換され、１
０６番目のＧｌｙが欠失されたポリペプチドＦ４６０７
をコードする。 ベクターｐＫＦ４６０８：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番のアミノ酸配列が配列番号
２で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧｌ
ｙがＴｒｐに変換されたポリペプチドＦ４６０８をコー
ドする。 ベクターｐＫＦ４６２６：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＰｒｏに変換されたポリペプチドＦ４６２６をコ
ードする。 ベクターｐＫＦ４６２７：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＡｌａに変換されたポリペプチドＦ４６２７をコ
ードする。 ベクターｐＫＦ４６３４：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＡｓｐに変換されたポリペプチドＦ４６３４をコ
ードする。 ベクターｐＫＦ４６３５：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＡｒｇに変換されたポリペプチドＦ４６３５をコ
ードする。 上記発現ベクターを有する各宿主大腸菌が、抗腫瘍活性
を示すポリペプチドを発現生産することを、超音波破砕
処理した大腸菌懸濁液の遠心上清（遠心分離操作後の上
清画分）について、後記実施例１６の方法に準じて試験
することにより確認した。

【０１１５】（３）前記実施例６で得られたヒトＴＮＦ
転換体発現ベクターｐＫＦ４４１８（約３．９Ｋｂｐ）
の５μｇを、前記実施例３の方法に準じて、ミディアム
・ソルトバッファーに溶解し制限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＨ
ｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調節領域等
を含む約３．５ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製した。一方、前
記（１）で得られたヒトＴＮＦ変換体発現ベクターｐＫ
Ｆ４２６８、ｐＫＦ４１５０、ｐＫＦ４２２２、ｐＫＦ
４２６７、ｐＫＦ４１２３又はｐＫＦ４２２３の５μｇ
を、前記と同様にして、制限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＨｉｎ
ｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末部分を欠失したヒトＴＮＦ変
換体遺伝子を含む約３６０ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製
した。

【０１１６】上記で得られた２本のＤＮＡ断片を、前記
実施例３の方法に準じてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株のコンピ
テントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、
目的のＦ４６０９、Ｆ４６１０、Ｆ４６２８、Ｆ４６２
９、Ｆ４６３８又はＦ４６３９の各発現ベクターｐＫＦ
４６０９、ｐＫＦ４６１０、ｐＫＦ４６２８、ｐＫＦ４
６２９、ｐＫＦ４６３８又はｐＫＦ４６３９（約３．９
Ｋｂｐ）を有するクローンを、制限酵素ＳａｃＩ及びＨ
ｉｎｄ ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに変換体
ポリペプチド由来の変換部位周辺の塩基配列を調べるこ
とにより選択した。上記方法に従って構築した転換体発
現ベクターは、発現誘導により、以下に示す変換を有す
る新規生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。

【０１１７】ベクターｐＫＦ４６０９：配列番号１で示
したアミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸
配列が配列番号６で示したアミノ酸配列で置換され、１
０６番目のＧｌｙが欠失されたポリペプチドＦ４６０９
をコードする。 ベクターｐＫＦ４６１０：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＴｒｐに変換されたポリペプチドＦ４６１０をコ
ードする。 ベクターｐＫＦ４６２８：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＰｒｏに変換されたポリペプチドＦ４６２８をコ
ードする。 ベクターｐＫＦ４６２９：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＡｌａに変換されたポリペプチドＦ４６２９をコ
ードする。 ベクターｐＫＦ４６３８：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＡｓｐに変換されたポリペプチドＦ４６３８をコ
ードする。 ベクターｐＫＦ４６３９：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、１０６番目のＧ
ｌｙがＡｒｇに変換されたポリペプチドＦ４６３９をコ
ードする。 上記発現ベクターを有する各宿主大腸菌が、抗腫瘍活性
を示すポリペプチドを発現生産することを、超音波破砕
処理した大腸菌懸濁液の遠心上清（遠心分離操作後の上
清画分）について、後記実施例１６の方法に準じて試験
することにより確認した。

【０１１８】実施例１２（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクタ
ーｐＫＦ４６１１、ｐＫＦ４６１２、ｐＫＦ４６１３、
ｐＫＦ４６１４、ｐＫＦ４６１５、ｐＫＦ４６４２、ｐ
ＫＦ４６４３、ｐＫＦ４６４４、ｐＫＦ４６４５及びｐ
ＫＦ４６４６の構築） （１）プライマー４１３４、同４３９１、同４３９２、
同４４０９及び同４４１０をデザインした。これらのプ
ライマーは配列番号１０の７６番目のＴから９６番目の
Ｔまでの塩基配列を有し、８５番目〜８７番目の５′−
ＣＧＣ−３′が、プライマー４１３４の場合５′−ＣＡ
Ａ−３′により、プライマー４３９１の場合５′−ＡＡ
Ｇ−３′により、プライマー４３９２の場合５′−ＧＡ
Ｃ−３′により、プライマー４４０９の場合５′−ＧＴ
Ｃ−３′により、プライマー４４１０の場合５′−ＣＴ
Ｃ−３′によりそれぞれ置換された２１塩基からなるオ
リゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの化学合
成及び精製は前記実施例２の方法に準じて行った。

【０１１９】（２）前記実施例５（１）において、ｐＵ
Ｃ１１９−ｈＴＮＦの替りに実施例５で得られたｐＵＣ
１１９−Ｆ４１６８を用いて目的の一本鎖プラスミドＤ
ＮＡを調製した。次に、このｐＵＣ１１９−Ｆ４１６８
のウラシルを含む一本鎖プラスミドＤＮＡ及び前記
（１）で精製したプライマー４１３４、同４３９１、同
４３９２、同４４０９又は同４４１０を用いて、前記実
施例５（２）の方法に準じて、部位特異的変異導入を行
い、目的の変異が導入されたＤＮＡを含むプラスミド
（約３．７Ｋｂｐ）を取得した。ジデオキシ法によりデ
ザイン通りの変異が導入されていることを確認し、これ
らのプラスミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４６１１、ｐＵＣ１
１９−Ｆ４６１２、ｐＵＣ１１９−Ｆ４６１３、ｐＵＣ
１１９−Ｆ４６１４又はｐＵＣ１１９−Ｆ４６１５と命
名した。

【０１２０】変異導入により得られた目的のヒトＴＮＦ
転換体遺伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの
構築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有する発現ベ
クターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ転換体発現ベク
ターを構築した。ヒトＴＮＦ転換体遺伝子（約４８０ｂ
ｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラスミドｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４６１１、ｐＵＣ１１９−Ｆ４６１２、
ｐＵＣ１１９−Ｆ４６１３、ｐＵＣ１１９−Ｆ４６１４
又はｐＵＣ１１９−Ｆ４６１５より、前記方法に準じ
て、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切
断後分離精製した。目的とするヒトＴＮＦ転換体発現ベ
クターｐＫＦ４６１１、ｐＫＦ４６１２、ｐＫＦ４６１
３、ｐＫＦ４６１４又はｐＫＦ４６１５（約３．９Ｋｂ
ｐ）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２）と
同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３
株を用いて取得した。上記転換体発現ベクターは、発現
誘導により、以下に示す変換を有する新規生理活性ポリ
ペプチドを大腸閑内に生産する。

【０１２１】ベクターｐＫＦ４６１１：配列番号１で示
したアミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸
配列が配列番号２で示したアミノ酸配列で置換され、２
９番目のＡｌｇがＧｌｎに変換されたポリペプチドＦ４
６１１をコードする。 ベクターｐＫＦ４６１２：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、２９番目のＡｒ
ｇがＬｙｓに変換されたポリペプチドＦ４６１２をコー
ドする。 ベクターｐＫＦ４６１３：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、２９番目のＡｒ
ｇがＡｓｐに変換されたポリペプチドＦ４６１３をコー
ドする。 ベクターｐＫＦ４６１４：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、２９番目のＡｒ
ｇがＶａｌに変換されたポリペプチドＦ４６１４をコー
ドする。 ベクターｐＫＦ４６１５：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、２９番目のＡｒ
ｇがＬｅｕに変換されたポリペプチドＦ４６１５をコー
ドする。 上記発現ベクターを有する各宿主大腸菌が、抗腫瘍活性
を示すポリペプチドを発現生産することを、超音波破砕
処理した大腸菌懸濁液の遠心上清（遠心分離操作後の上
清画分）について、後記実施例１６の方法に準じて試験
することにより確認した。

【０１２２】（３）前記（２）において、ｐＵＣ１１９
−Ｆ４１６８の替りに実施例６で得られたｐＵＣ１１９
−Ｆ４４１８を用いてウラシルを含む一本鎖プラスミド
ＤＮＡを調製し、前記（２）と同様にして、部位特異的
変異導入を行い、目的の変異が導入されたＤＮＡを含む
プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４６４２、ｐＵＣ１１９−
Ｆ４６４３、ｐＵＣ１１９−Ｆ４６４４、ｐＵＣ１１９
−Ｆ４６４５又はｐＵＣ１１９−Ｆ４６４６（約３．７
Ｋｂｐ）を取得した。上記で得られた目的のヒトＴＮＦ
転換体遺伝子（約４８０ｂｐ）を含むプラスミドを用い
て、前記（２）と同様にして、目的とするヒトＴＮＦ転
換体発現ベクターｐＫＦ４６４２、ｐＫＦ４６４３、ｐ
ＫＦ４６４４、ｐＫＦ４６４５又はｐＫＦ６４６（約
３．９Ｋｂｐ）を構築した。その際、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ＪＭ１０３株を宿主として用いた。上記転換体発
現ベクターは、発現誘導により、以下に示す変換を有す
る新規生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。

【０１２３】ベクターｐＫＦ４６４２：配列番号１で示
したアミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸
配列が配列番号６で示したアミノ酸配列で置換され、２
９番目のＡｒｇがＧｌｎに変換されたポリペプチドＦ４
６４２をコードする。 ベクターｐＫＦ４６４３：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、２９番目のＡｒ
ｇがＬｙｓに変換されたポリペプチドＦ４６４３をコー
ドする。 ベクターｐＫＦ４６４４：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、２９番目のＡｒ
ｇがＡｓｐに変換されたポリペプチドＦ４６４４をコー
ドする。 ベクターｐＫＦ４６４５：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、２９番目のＡｒ
ｇがＶａｌに変換されたポリペプチドＦ４６４５をコー
ドする。 ベクターｐＫＦ４６４６：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号６で示したアミノ酸配列で置換され、２９番目のＡｒ
ｇがＬｅｕに変換されたポリペプチドＦ４６４６をコー
ドする。 上記発現ベクターを有する各宿主大腸菌が、抗腫瘍活性
を示すポリペプチドを発現生産することを、超音波破砕
処理した大腸菌懸濁液の遠心上清（遠心分離操作後の上
清画分）について、後記実施例１６の方法に準じて試験
することにより確認した。

【０１２４】実施例１３（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクタ
ーｐＫＦ４６５２及びｐＫＦ４６５４の構築）（１）
プライマー４４２７及び同４４２９をデザインした。こ
れらのプライマーは配列番号１０の３０１番目のＡから
３３３番目のＣまでの塩基配列を有し、３１０番目〜３
１２番目の５′−ＣＣＣ−３′、３１３番目〜３１５番
目の５′−ＧＡＧ−３′、３１９番目〜３２１番目の
５′−ＧＣＡ−３′及び３２２番目〜３２４番目の５′
−ＧＡＧ−３′が、プライマー４４２７の場合各々５′
−ＧＧＴ−３′、５′−ＡＧＡ−３′、５′−ＧＡＴ−
３′及び５′−ＡＧＣ−３′により、プライマー４４２
９の場合各々５′−ＴＡＣ−３′、５′−ＡＴＴ−
３′、５′−ＡＧＣ−３′及び５′−ＡＧＡ−３′によ
りそれぞれ置換された３３塩基からなるオリゴヌクレオ
チドである。

【０１２５】オリゴヌクレオチドの化学合成及び精製は
前記実施例２の方法に準じて行った。これらのプライマ
ーを用い、前記実施例５（１）及び（２）の方法に準じ
て目的の変異導入ＤＮＡを含むプラスミド（約３．７Ｋ
ｂｐ）を取得した。ジデオキシ法によりデザイン通りの
変換体ＤＮＡに変異していることを確認し、このプラス
ミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４４２７あるいはｐＵＣ１１９
−Ｆ４４２９と命名した。

【０１２６】変異導入により得られた目的のヒトＴＮＦ
変換体遺伝子を実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの構
築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有する発現ベク
ターｐＫＫ１０１に組込み、ヒトＴＮＦ変換体発現ベク
ターを構築した。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子（約４８０ｂ
ｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラスミドよ
り、前記の方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨ
ｉｎｄ ＩＩＩによる切断後分離精製した。目的とする
ヒトＴＮＦ変換体発現ベクターｐＫＦ４４２７又はｐＫ
Ｆ４４２９（約３．９Ｋｂｐ）は、ヒトＴＮＦ発現ベク
ター（ｐＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株を用いて取得した。

【０１２７】（２）前記実施例１０（２）の方法に準じ
て、前記実施例５で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベク
ターｐＫＦ４１６８（約３．９Ｋｂｐ）の５μｇを、制
限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製
起点及び転写調節領域等を含む約３．５ＫｂｐのＤＮＡ
断片を分離精製した。

【０１２８】一方、前記（１）で得られたヒトＴＮＦ変
換体発現ベクターｐＫＦ４４２７又はｐＫＦ４４２９の
５μｇを、前記と同様にして、制限酵素Ｓａｃ Ｉ及び
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ未部分を欠失したヒトＴ
ＮＦ変換体遺伝子を含む約３６０ｂｐのＤＮＡ断片を分
離精製した。

【０１２９】上記で得られた２本のＤＮＡ断片を、前記
実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株のコン
ピテントセルに導入した。得られた形質転換体の中よ
り、目的のＦ４６５２又はＦ４６５４の各発現ベクター
ｐＫＦ４６５２又はｐＫＦ４６５４（約３．９Ｋｂｐ）
を有するクローンを、制限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに変換体ポリペ
プチド由来の変換部位周辺の塩基配列を調べることによ
り選択した。

【０１３０】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。

【０１３１】ベクターｐＫＦ４６５２：配列番号１で示
したアミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸
配列が配列番号２で示したアミノ酸配列で置換され、１
０４番目のＰｒｏがＧｌｙに、１０５番目のＧｌｕがＡ
ｒｇに、１０７番目のＡｌａがＡｓｐに、１０８番目の
ＧｌｕがＳｅｒにそれぞれ変換されたポリペプチドＦ４
６５２をコードする。

【０１３２】ベクターｐＫＦ４６５４：配列番号１で示
したアミノ酸配列において、１番目〜８番目のアミノ酸
配列が配列番号２で示したアミノ酸配列で置換され、１
０４番目のＰｒｏがＴｙｒに、１０５番目のＧｌｕがＩ
ｌｅに、１０７番目のＡｌａがＳｅｒに、１０８番目の
ＧｌｕがＡｒｇにそれぞれ変換されたポリペプチドＦ４
６５４をコードする。

【０１３３】上記発現ベクターを有する各宿主大腸菌
が、抗腫瘍活性を示すポリペプチドを発現生産すること
を、超音波で破砕処理した大腸菌懸濁液の遠心上清（遠
心分離操作後の上清画分）について、後記実施例１６の
方法に準じて試験することにより確認した。

【０１３４】また、上記実施例１３においてプライマー
４４２７あるいはプライマー４４２９に替えてプライマ
ー４１４３を用いることにより、ｐＫＦ４６０６を取得
した。

【０１３５】プライマー４１４３は配列番号１０の３６
７番目のＣから３８７番目のＡまでの塩基配列を有し、
３７６番目〜３７８番目の５′−ＡＡＧ−３′が５′−
ＡＧＧ−３′により置換された２１塩基からなるオリゴ
ヌクレオチドである。発現ベクターｐＫＦ４６０６は発
現誘導により、以下に示す変換を有する新規生理活性ポ
リペプチドを大腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４６０６：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、１２６番目のＬ
ｙｓがＡｒｇに変換されたポリペプチドＦ４６０６をコ
ードする。

【０１３６】実施例１４（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクタ
ーｐＫＦ４６５６の構築） （１）配列番号１０で示した３０４番目のＧから３２４
番目のＧまでの塩基配列のうち、３１４番目のＡがＧに
置換された２１塩基からなるオリゴヌクレオチドをデザ
インし、プライマー４２５５と命名した。このオリゴヌ
クレオチドの化学合成及び精製は、前記実施例２の方法
に準じて行った。前記実施例５（２）においてプライマ
ー４１６８の替りにこのプライマー４２５５を用いるこ
とにより目的の変換体ＤＮＡを含むプラスミド（約３．
７Ｋｂｐ）を取得した。変異導入部位周辺の塩基配列を
ジデオキシ法により調べ、デザイン通りの変換体ＤＮＡ
に変異していることを確認し、このプラスミドをｐＵＣ
１１９−Ｆ４２５５と命名した。

【０１３７】（２）前記実施例５（１）において、ｐＵ
Ｃ１１９−ｈＴＮＦの替りに前記（１）で得られたｐＵ
Ｃ１１９−Ｆ４２５５を用いて目的の一本鎖プラスミド
ＤＮＡを調製した。また、前記実施例２の方法に準じ
て、プライマー４４２４及び同４４２５を以下のデザイ
ンに従って化学合成及び精製した。

【０１３８】プライマー４４２４：配列番号１０で示し
た２８０番目のＧから３００番目のＧまでの塩基配列の
うち、２８９番目のＡがＧに置換された２１塩基からな
るオリゴヌクレオチドである。

【０１３９】プライマー４４２５：配列番号１０で示し
た３２２番目のＧから３４２番目のＧまでの塩基配列の
うち、３３３番目のＣがＡに置換された２１塩基からな
るオリゴヌクレオチドである。

【０１４０】次に、上記で調製したｐＵＣ１１９−Ｆ４
２５５の一本鎖プラスミドＤＮＡ及びプライマー４４２
４又は同４４２５を用いてヒトＴＮＦ変換体遺伝子への
部位特異的変異導入を前記実施例５（２）の方法に準じ
て行い、目的の変換体ＤＮＡを含むプラスミド（約３．
７ｋｂｐ）を取得した。ジデオキシ法によりデザイン通
りの変換体ＤＮＡに変異していることを確認し、これら
のプラスミドをそれぞれｐＵＣ１１９−Ｆ４４２４又は
ｐＵＣ１１９−Ｆ４２５５（Ｎ）と命名した。

【０１４１】上記で得られたプラスミドｐＵＣ１１９−
Ｆ４４２４及びｐＵＣ１１９−Ｆ４２５５（Ｎ）を、前
記（１）の変異導入により生成された制限酵素Ｓｍａ
Ｉ切断部位を利用して組換えすることにより、上記で導
入された両変異を有するプラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４
４２４（Ｎ）（約３．７Ｋｂｐ）を構築した。すなわ
ち、プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４４２４及びｐＵＣ１
１９−Ｆ４２５５（Ｎ）の５μｇを、１ｍＭＤＴＴ及び
１００μｇ／ｍｌＢＳＡを含む５０μｌのＳｍａＩバッ
ファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍ
Ｍ ＫＣｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）にそれぞれ溶解
させ、１５ユニットの制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造）を添
加して、３７℃で２時間切断反応を行った。

【０１４２】反応終了後、エタノール沈殿操作によりＤ
ＮＡ断片を回収し、５０μｌのハイ・ソルトバッファー
に再度溶解した。１５ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＩ
による３７℃、２時間の切断反応の後、プラスミドｐＵ
Ｃ１１９−Ｆ４４２４の反応液からは小さなＤＮＡ断片
（約３２０ｂｐ）を、プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４２
５５（Ｎ）の反応液からは大きなＤＮＡ断片（約３．４
Ｋｂｐ）をそれぞれ分離精製した。このようにして得ら
れた２本のＤＮＡ断片を、前記実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２株のコンピテントセルに導入した。得られた
形質転換体の中より、そのプラスミドについて制限酵素
による切断パターンの確認並びに制限酵素Ｓｍａ Ｉ切
断部位周辺の塩基配列を調べることにより、目的のプラ
スミドｐＵＣ１１９−Ｆ４４２４（Ｎ）（約３．７Ｋｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。

【０１４３】（３）前記（２）で得られたプラスミドｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４４２４（Ｎ）は、配列表の配列番号１
で示した１０６番目のＧｌｙをコードする塩基配列の周
辺に制限酵素Ａｐａ Ｉ 、Ｓｍａ Ｉ 及びＮｃｏ
Ｉ 切断部位を有する。これらの制限酵素切断部位を利
用して、配列番号１で示した１０６番目のＧｌｙ周辺に
変異導入を行う目的で、オリゴヌクレオチドＵ−４４３
１及びＬ−４４３１をデザインした。

【０１４４】Ｕ−４４３１（配列表の配列番号１５、塩
基数４３） Ｌ−４４３１（塩基数４７） Ｕ−４４３１に相補するものであるが、配列番号１５の
４３番目のＣに相補するＧに対し５′方向に５′−ＣＡ
ＴＧ−３′を接続した塩基配列を有する。

【０１４５】これらのオリゴヌクレオチドを前記実施例
２の方法に準じて化学合成し、精製した。精製後得られ
た上・下２本のオリゴヌクレオチド（各１μｇ）を、前
記実施例３の方法に準じて、その５′末端をＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、アニール
化により二本鎖ＤＮＡ断片とした。

【０１４６】一方、前記（２）で得られたプラスミドｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４４２４（Ｎ）の５μｇを、前記（２）
の方法に準じて、制限酵素Ｓｍａ Ｉ で切断し、エタ
ノール沈殿操作によるＡ断片の回収後、５０μｌのミデ
ィアム・ソルトバッファーに溶解した。１５ユニットの
制限酵素Ｎｃｏ Ｉ（宝酒造）による３７℃、２時間の
切断反応の後、約３．７ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動により分離精製した。

【０１４７】上記方法に従って得られた２本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株のコンピ
テントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、
目的の変異が導入された変換体ＤＮＡを含むプラスミド
（約３．７Ｋｂｐ）を有するクローンを、そのプラスミ
ドについて変異導入部位周辺の塩基配列を調べることに
より選択した。このプラスミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４４
３１と命名した。

【０１４８】上記で得られた目的のヒトＴＮＦ変換体遺
伝子を実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの構築方法に
準じて、ｔａｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫ
Ｋ１０１に組込み、ヒトＴＮＦ変換体発現ベクターを構
築した。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子（約５００ｂｐ）は、
上記で得られた約３．７ＫｂｐのプラスミドｐＵＣ１１
９−Ｆ４４３１より、前記の方法に準じて、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断後分離精製
した。目的とするヒトＴＮＦ変換体発現ベクターｐＫＦ
４４３１（約３．９Ｋｂｐ）は、ヒトＴＮＦ発現ベクタ
ー（ｐＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株を用いて取得した。

【０１４９】（４）前記実施例１０（２）の方法に準じ
て、前記実施例５で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベク
ターｐＫＦ４１６８（約３．９Ｋｂｐ）の５μｇを、制
限酵素Ｓａｃ Ｉ 及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複
製起点及び転写調節領域等を含む約３．５ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片を分離精製した。

【０１５０】一方、前記（３）で得られたヒトＴＮＦ変
換体発現ベクターｐＫＦ４４３１の５μｇを、前記と同
様にして、制限酵素Ｓａｃ Ｉ 及びＨｉｎｄ ＩＩＩ
で切断し、Ｎ未部分を欠失したヒトＴＮＦ変換体遺伝子
を含む約３８０ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。

【０１５１】上記で得られた２本のＤＮＡ断片を、前記
実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＡリガーゼを用いて連
結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＪＭ１０３株のコンピテ
ントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、目
的のＦ４６５６の発現ベクターｐＫＦ４６５６（約３．
９Ｋｂｐ）を有するクローンを、制限酵素による切断パ
ターンの確認並びに変換体ポリペプチド由来の変換部位
周辺の塩基配列を調べることにより選択した。

【０１５２】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。 ベクターｐＫＦ４６５６：配列番号１で示したアミノ酸
配列において、１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列番
号２で示したアミノ酸配列で置換され、９７番目のＳｅ
ｒがＧｌｙに、１０５番目のＧｌｕが配列番号１６で示
したアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）に変換され
たポリペプチドＦ４６５６をコードする。

【０１５３】実施例１５（ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリ
ペプチドの大腸菌による発現及び精製） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４
１０２）、実施例５、６、７、８、１０、１１、１２及
び１３で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベクター（ｐＫ
Ｆ４１６８、ｐＫＦ４４１５、ｐＫＦ４４１６、ｐＨ４
４１７、ｐＫＦ４４１８、ｐＫＦ４４２０、ｐＫＦ４４
２１、ｐＫＦ４１３７、ｐＫＦ４６０１、ｐＫＦ４６０
９、ｐＫＦ４６３９、ｐＫＦ４６１１、ｐＫＦ４６１
２、ｐＫＦ４６４２、ｐＫＦ４６４５及びｐＫＦ４６５
２）並びに実施例１３と同様の方法で得られたヒトＴＮ
Ｆ転換体発現ベクター（ｐＫＦ４６０６）を有するＥ．
ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株を、２５〜５０μｇ
／ｍｌアンピシリン及び０．００１％ビタミンＢ１を含
むＭ９培地（０．６％Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．３％ＫＨ_２
ＰＯ_４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ_４Ｃｌ、２
ｍＭ ＭｇＳ０_４、０．２％グルコース及び０．１ｍＭ
ＣａＣｌ_２）２０ｍｌに接種し、３７℃、１８時間振
とう培養を行った。この培養液２０ｍｌを上記培地１リ
ットル中に加え、３７℃、２〜３時間振とう培養を行っ
た。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加
し、更に３７℃、１８時間振とう培養を続けた。

【０１５４】実施例９で得られたヒトＴＮＦ転換体発現
ベクター（ｐＫＦ４１１３）を有するＥ．ｃｏｌｉＫ−
１２ ＨＢ１０１株については、２５〜５０μｇ／ｍｌ
アンピシリン、０．００１％ビタミンＢ１及び５μｇ／
ｍｌトリプトファンを含むＭ９ＣＡ培地（０．６％Ｎａ
_２ＨＰＯ_４、０．３％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ＮａＣ
ｌ、０．１％ＮＨ_４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２
％グルコース、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２及び０．２％カ
ザミノ酸）２０ｍｌに接種し、３７℃、１８時間振とう
培養を行った。５μｇ／ｍｌトリプトファンを含まない
上記培地１リットル中にこの培養液２０ｍｌを加え、３
７℃、１８時間振とう培養を行った。

【０１５５】遠心分離操作による大腸菌菌体の回収後、
ＴＰバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０
及び １００μＭ ＰＭＳＦ）を用いて菌体の洗浄を行
った。洗浄後、菌体の湿重量（グラム）当たり１０容量
（ｍｌ）のＴＰバッファーに菌体を懸濁させ、超音波発
生装置（ヒート・システムズ；モデルＷ−２２５）を用
いて菌体を超音波破砕処理した。得られた懸濁液を遠心
分離することにより、菌体残渣を除去し上清画分を回収
した。この超音波破砕処理以降の精製工程は、主に低温
下（０℃〜４℃）で行った。

【０１５６】この上清を０．４５μｍフィルターにてろ
過した後、セパビーズＦＰ−ＤＡ１３（三菱化成）を用
いた陰イオン交換クロマトグラフィー（カラムサイズ：
φ２．５×１．５ｃｍ及び流速：０．５ｍｌ／分）で分
画し、後記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びＬ９２９細胞を用いた後記実施例１６の方法に準じて
活性の有無を検定することによって活性画分を得た。溶
出にはＮａＣｌを含むＴＰバッファーを用い、ＮａＣｌ
濃度を０．０５Ｍから０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍへ
と段階的に上げ、ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４６３９及び同Ｆ
４６５２は０．０５Ｍ ＮａＣｌで、ヒトＴＮＦ（１）
は０．１Ｍ ＮａＣｌで、ヒトＴＮＦ（２）、ヒトＴＮ
Ｆ（３）、ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４４１５、同Ｆ４４１
７、同Ｆ４４１８、同Ｆ４４２０、同Ｆ４６０１、同Ｆ
４６０９、同Ｆ４６１１、同Ｆ４６１２、同Ｆ４６４
２、同Ｆ４６４５及び同Ｆ４６０６は０．２Ｍ ＮａＣ
ｌで並びにヒトＴＮＦ転換体Ｆ４１６８は０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌでそれぞれ溶出した。更に大腸閑菌体由来のエン
ドトキシン等を除去するために、核酸・エンドトキシン
除去剤Ｃ−９（栗田工業製造、大日本製薬販売）処理を
添付マニュアルに準じて行った。かくして、ヒトＴＮＦ
及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試料を得た。

【０１５７】この試料を使用して、後記実施例１６、１
７及び１８の抗腫瘍活性の評価及び実験的肺転移に及ぼ
す効果の評価を行った。なお、転換体ポリペプチドＦ４
４１６、Ｆ４４２１及びＦ４１３７については使用した
宿主大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株中並
びにＦ４１１３については使用した宿主大腸菌Ｅ，ｃｏ
ｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０１株中での不安定性のため
か、活性画分を得ることができなかった。しかしながら
他の宿主を使用すれば活性画分を得られる可能性があ
る。

【０１５８】上記試料を０．２０μｍフィルターにてろ
過した後、ＦＰＬＣシステムによる制御下のモノＱ（登
録商標）（ＨＲ１０／１０及びＨＲ５／５）プレパック
カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで、ＮａＣｌ
を含むＴＰＱバッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ
８．０及び１０μＭ ＰＭＳＦ）によって溶出し、分画
を後記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＬ
９２９細胞を用いた実施例１６の方法に準じて活性の有
無を検定することによって活性画分を得た。溶出方法
は、ＦＰＬＣシステムの制御下で下記プログラムに従っ
て行った。第３ステップは、精製純度を上げるためにＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バ
ンドとなるまで数回繰り返した。

【０１５９】第１ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ
１０／１０）カラム使用 （流速：４ｍｌ／分） ０〜５分；０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配 ５〜１６分；０．２Ｍ ＮａＣｌ １６〜２０分；０．２−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾
配 ２０〜２４分；０．５ＭＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｌ濃度及
び保持時間）は、それぞれヒトＴＮＦ（１）が０．２
Ｍ、６．６分、ヒトＴＮＦ（２）が０．２Ｍ、５．６
分、ヒトＴＮＦ（３）が０．２Ｍ、５．０分、ヒトＴＮ
Ｆ転換体Ｆ４１６８が０．２Ｍ、６．４分、同Ｆ４４１
５が０．２Ｍ、７．８分、同Ｆ４４１７が０．２Ｍ、
５．４分、同Ｆ４４１８が０．２Ｍ、５．４分、同Ｆ４
４２０が０．１８Ｍ、４．１分、同Ｆ４６０１が０．２
Ｍ、７．０分、同Ｆ４６０９が０．２Ｍ、５．０分、同
Ｆ４６３９が０．０１Ｍ、３．１分、同Ｆ４６１１が
０．２Ｍ、５．８分、同Ｆ４６１２が０．２Ｍ、５．０
分、同Ｆ４６４２が０．２Ｍ、５．０分、同Ｆ４６４５
が０．２Ｍ、４．９分、同Ｆ４６５２が非吸着画分及び
同Ｆ４６０６が０．２Ｍ、５．９分であった。

【０１６０】第２ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ
５／５）カラム使用 （流速：１ｍｌ／分） ０〜２．５分；０−０．２ＭＮａＣｌ直線濃度勾配 ２．５〜８分；０．２ＭＮａＣｌ ８〜１０分；０．２−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配 １０〜１２分；０．５Ｍ ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｌ濃度及
び保持時間）は、それぞれヒトＴＮＦ（１）が０．２
Ｍ、３．７分、ヒトＴＮＦ（２）が０．２Ｍ、４．１
分、ヒトＴＮＦ（３）が０．２Ｍ、３．８分、ヒトＴＮ
Ｆ転換体Ｆ４１６８が０．２Ｍ、３．９分、同Ｆ４４１
５が０．２Ｍ、６．０分、同Ｆ４４１７が０．２Ｍ、
３．９分、同Ｆ４４１８が０．２Ｍ、３．３分、同Ｆ４
４２０が０．２Ｍ、３．２分、同Ｆ４６０１が０．２
Ｍ、４．９分、同Ｆ４６０９が０．２Ｍ、３．２分、同
Ｆ４６３９が非吸着画分、同Ｆ４６１１が０．２Ｍ、
３．８分、同Ｆ４６１２が０．２Ｍ、４．０分、同Ｆ４
６４２が０．２Ｍ、３．５分、同Ｆ４６４５が０．２
Ｍ、３．５分、同Ｆ４６５２が非吸着画分及び同Ｆ４６
０６が０．２Ｍ、３．９分であった。

【０１６１】第３ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ
５／５）カラム使用（流速：１ｍｌ／分） ０〜６分；０−０．１５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配 ６〜１１分；０．１５−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾
配 １１〜１３分；０．２−０．５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配 １３〜１５分；０．５Ｍ ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｌ 濃度
及び保持時間）は、それぞれヒトＴＮＦ（１）が０．１
６Ｍ、６．５分、ヒトＴＮＦ（２）が０．１６Ｍ、６．
５分、ヒトＴＮＦ（３）が０．１６Ｍ、６．４分、ヒト
ＴＮＦ転換体Ｆ４１６８が０．１７Ｍ、６．７分、同Ｆ
４４１５が０．１６Ｍ、６．４分、同Ｆ４４１７が０．
１６Ｍ、６．５分、同Ｆ４４１８が０．１６Ｍ、６．２
分、同Ｆ４４２０が０．１５Ｍ、５．６分、同Ｆ４６０
１が０．１９Ｍ、９．８分、同Ｆ４６０９が０．１５
Ｍ、５．７分、同Ｆ４６３９が非吸着画分、同Ｆ４６１
１が０．１６Ｍ、６．６分、同Ｆ４６１２が０．１６
Ｍ、６．８分、同Ｆ４６４２が０．１６Ｍ、６．７分、
同Ｆ４６４５が０．１６Ｍ、６．５分、同Ｆ４６５２が
非吸着画分及び同Ｆ４６０６が０．１７Ｍ、７．３分で
あった。

【０１６２】かくしてヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプ
チドの精製試料を得た。この試料を使用して後記実施例
１６、１７及び１８の抗腫瘍活性の評価及び実験的肺転
移に及ぼす効果の評価を行った。

【０１６３】上記精製の過程及び精製試料についてＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒトＴＮ
Ｆ及び同転換体ポリペプチドの発現及び精製の確認をし
た。各試料を１０ｍＭＤＴＴを含有するＬａｅｍｍｌ
ｉ’Ｓサンプル・バッファー（６２．５ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、０．０１％ＢＰＢ及び
１０％グリセロール）に加え、Ｌａｅｍｍｌｉ〔Ｎａｔ
ｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）〕の方法に準じ、
１５％の分離用ゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳
動終了後、分離用ゲル中の蛋白質をクマシー・ブリリア
ント・ブルーで染色することにより確認した。図１３、
１４、１５及び１６にその結果の一部を示した。活性画
分を得ることのできたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプ
チドのそれぞれの発現ベクターによる発現量はほぼ同程
度であり、得られた染色ゲルをクロマト・スキャナー
（島津、ＣＳ−９２０型）にかけてその発現効率を算出
したところ、大腸菌総菌体蛋白質の約２０％であった。
また、最終精製試料は、得られた染色ゲルにおいて単一
バンドであった。その泳動位置より、ヒトＴＮＦ及び同
転換体ポリペプチドの分子量を算出し表１及び表２に示
した。

【０１６４】なお、蛋白質の物性の一つとして、ヒトＴ
ＮＦ及び同転換体ポリペプチドの等電点をアンフォライ
ン（ＬＫＢ社製）を用いた等電点ゲル電気泳動法により
測定し、得られた結果を表１及び表２に示した。

【０１６５】

【表１】

【０１６６】

【表２】

【０１６７】実施例１６（ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
の評価） 実施例１５で得られたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプ
チドの一段階精製試料及び精製試料について、マウス山
来結合組織細胞Ｌ９２９（ＡＴＣＣＣＣＬｌ）に対する
細胞傷害活性をＡｇｇａｒｗａｌら〔Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６０，２３４５（１９８５）の方法に準
じて求めた。すなわち、９６ウエルの組織培養用のマイ
クロプレート（コーニング社製）に３×１０^４細胞／
０．１ｍｌ／ウエルでＬ９２９細胞を植え、５％炭酸ガ
ス存在下３７℃で一晩培養した。培地としては、１０％
のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏによって修飾さ
れたイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（ＤＭＥ
培地、シグマ社製）を用いた。翌日、最終濃度１μｇ／
ｍｌのアクチノマイシンＤを添加した上記培地に培池を
交換し、この培地にて段階希釈した試料を各ウエルに処
理した（総培地量０．１ｍｌ）。更に２０時間の培養
後、０．５％クリスタル・バイオレット溶液（０．５％
クリスタル・バイオレット／２０％メタノール）にてプ
レートに付着した生細胞を染色（室温、１５分間）し
た。１ｍＭＣａＣｌ_２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含むリ
ン酸バッファーＰＢＳ（１０ｍＭＮａ・Ｋリン酸塩ｐＨ
７．４、０．８％ＮａＣｌ及び０．０２％ＫＣｌ）で充
分洗浄した後、３０％エタノールを含む０．０１Ｎ塩酸
溶液０．１ｍｌを用いてプレートに残ったクリスタル・
バイオレットを抽出し、その吸光度（４９２ｎｍ）をＥ
ＩＡリーダー（バイオ・ラド社製、モデル２５５０）で
測定した。この吸光度は生存細胞数に比例する。そこ
で、試料無処理ウエルの吸光度の５０％の値に相当する
吸光度を示すウエルにおける試料の最終希釈率を求め、
この試料希釈率の逆数をその試料の１ｍｌ当りのユニッ
ト数〔ユニット／ｍｌ〕と定義する。

【０１６８】上記方法に準じて求めたＬ９２９細胞傷害
活性（ユニット／ｍｌ）から各試料の比活性（ユニット
／ｍｇ・蛋白）を算出するために、各試料の蛋白定量を
行った。定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，７２，２４８（１９７６）〕に準じ、標準
試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白濃度（ｍｇ
／ｍｌ）を求めた。これらの結果より、ヒトＴＮＦ及び
同転換体ポリペプチド試料について算出した比活性を表
３及び表４に示した。

【０１６９】

【表３】

【０１７０】

【表４】

【０１７１】上記表３及び表４から、本発明のヒトＴＮ
Ｆ転換体ポリペプチドは、ヒトＴＮＦと同様、マウス由
来結合組織細胞Ｌ９２９に対する細胞傷害活性作用を有
することがわかる。

【０１７２】実施例１７（ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の
評価） 実施例１５で得られたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプ
チドの一段階精製試料又は精製試料について、マウス可
移植線維芽肉腫ＭｅｔｈＡ腫瘍に対する抗腫瘍治療活性
を求めた。試験は、生理食塩水に懸濁した１×１０^６細
胞／０．２ｍｌのＭｅｔｈＡ腫瘍細胞（佐々木研究所よ
り分与）をＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、５週令、チャール
ズ・リバー）の背中部皮下に移植し、８日後腫瘍径が６
〜１０ｍｍに達したのを確認し、生理食塩水にて段階希
釈した試料（０．２ｍｌ／マウス）を尾静脈より投与す
ることにより行った。致死量を最高投与量とし、数段階
の希釈により各投与試料を作製した。

【０１７３】投与後約２週間、腫瘍増殖等の観察を続け
た。腫瘍増殖については、腫瘍容積（腫瘍塊の長径×短
径^２／２）を計測し、試料投与日（０日）の腫瘍容積に
対する腫瘍容積率を求め、この値が２又は５となる試料
投与日からの日数（Ｄ２又はＤ５）を算定する。そし
て、コントロール群（生理食塩水投与）に対する比率を
算出し、Ｄ２％コントロール値及びＤ５％コントロール
値を求めた。その値が大きい程、腫瘍増殖能が低下して
おり高い抗腫瘍活性を示すことを意味する。上記に準じ
て得られた結果を表５、表６及び表７に掲載した。

【０１７４】

【表５】

【０１７５】

【表６】

【０１７６】

【表７】

【０１７７】表５、表６及び表７から、本発明のヒトＴ
ＮＦ転換体ポリペプチドは、ヒトＴＮＦと同様、マウス
に移植のＭｅｔｈＡ腫瘍に対する抗腫瘍治療活性作用を
有することがわかる。

【０１７８】実施例１８（腫瘍の肺転移に及ぼす効果） Ｂ１６Ｆ１０マウス悪性黒色腫細胞（千葉大 医学部よ
り分与）を以下の方法でクローン化することにより、肺
に対して高転移性を示棚クローンを樹立した。すなわ
ち、イーグルのミニマム・エッセンシャル培地（ＭＥＭ
培地、日水製薬社製）に懸濁した２×１０^４細胞／０．
２ｍｌのＢ１６Ｆ１０細胞を Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ
マウス（雌、６週令、チャールズ・リバー）の尾静脈内
に注入し、１４日後に肺を摘出した。ＤＭＥ培地で洗浄
後、肺表面に形成された直径１ｍｍ程度の転移結節の１
つを２６Ｇ注射針付シリンジ（テルモ社製）を用いて吸
引し、１ｍｌのＤＭＥ培地に懸濁した後、１０％のウシ
胎児血清を含むＤＭＥ培地含有軟寒天上で、５％炭酸ガ
ス存在下３７℃で培養することによりコロニー形成を行
った。このコロニー形成法は、「組織培養の技術」（ペ
ージ３５〜３６、１９８４年、日本組織培養学会編、朝
倉書店）記載の方法に準じた。１０〜１２日後、コロニ
ーの径が１〜２ｍｍに達したところでパスツールピペッ
トを用いてコロニーを吸引し、１０％のウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地中にて培養した。培養後、増殖した細胞
を再びＭＥＭ培地を用いて２×１０^４細胞／０．２ｍｌ
の細胞濃度に調製し、上記の場合と同様、同マウスの尾
静脈内に注入した。１４日後に肺を摘出し、前回と同様
にして、転移結節の１つを単離・培養した。このような
操作を５回繰り返し、肺に高転移性を示すクローン（Ｂ
１６Ｆ１０／Ｌ５と命名）を獲得した。

【０１７９】１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地中
で直径１０ｃｍの組織培養用ディッシュ〔コーニング
（登録商標）岩城硝子社製〕を用いて培養した対数増殖
期のＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞を、ディッシュ付着状態で
リン酸バッファーＰＢＳを用いて１回洗浄し、ＭＥＭ培
地５ｍｌを加えピペッティングを行うことにより細胞懸
濁液とした。遠心分離操作により細胞を集め、２ｍｌの
ＭＥＭ培地に再懸濁した。一方、実施例１５で得られた
ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試料
又は精製試料を、所定の濃度（実施例１７の抗腫瘍治療
試験において、治療効果を示した投与量を本試験の投与
量として使用した。）になるようにＭＥＭ培地で希釈
し、その溶液中に先に調製したＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞
懸濁液を添加することにより、２×１０^４細胞／０．２
ｍｌの各一段階精製試料又は精製試料を含む細胞懸濁液
を調製した。この細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ
マウス（雌、６週令）の尾静脈より投与した（０．２ｍ
ｌ／マウス）。コントロール群はＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細
胞のみを投与した。投与１４日後に肺を摘出し、肺表面
の転移結節数を計測した。上記に準じて得られた結果を
表８、表９及び表１０に掲載した。

【０１８０】

【表８】

【０１８１】

【表９】

【０１８２】

【表１０】

【０１８３】表８、表９及び表１０から、ヒトＴＮＦ及
び同変換体ポリペプチドが実験的肺転移を冗進する作用
を有するのに対し、そのＮ末端近傍にＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ配列を導入した本発明のヒトＴＮＦ転換体ポリペ
プチドは実験的肺転移を亢進しないことがわかる。

【０１８４】

【発明の効果】本発明によれば、ヒトＴＮＦ又はその変
換体において、配列表の配列番号１の１番目のＳｅｒか
ら８番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対
応するヒトＴＮＦ変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１
６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されるこ
とにより、ヒトＴＮＦ又はその変換体と同様の抗腫瘍活
性作用を有し、一方それらで認められた癌転移の亢進作
用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体が提供される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の構築過程を示す工程図である。

【図２】合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の構築過程を示す工程図である。

【図３】発現型プラスミドベクターの構築過程を示す工
程図である。

【図４】ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。

【図５】部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ変換体又は
同転換体遣伝子の作製過程を示す工程図である。

【図６】部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ変換体又は
同転換体遺伝子の作製過程を示す工程図である。

【図７】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。

【図８】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。

【図９】発現型プラスミドベクターの構築過程を示す工
程図である。

【図１０】発現型プラスミドベクターの構築過程を示す
工程図である。

【図１１】発現型プラスミドベクターの構築過程を示す
工程図である。

【図１２】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工
程図である。

【図１３】大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ及び同転
換体ポリペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図で
ある。

【図１４】大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ転換体ポ
リペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図である。

【図１５】大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ転換体ポ
リペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図である。

【図１６】大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ転換体ポ
リペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 青山 義行 滋賀県草津市西渋川二丁目３番１号 石原 産業株式会社中央研究所内 (72)発明者 四釜 洋 滋賀県草津市西渋川二丁目３番１号 石原 産業株式会社中央研究所内

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で示した１番目のＳ
   ｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸
   配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換体
   において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目
   のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する前
   記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのア
   ミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個
   のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているこ
   とを特徴とするポリペプチド。
2. 【請求項２】 前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸
   配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個のアミ
   ノ酸を含むアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであ
   るかあるいは配列表の配列番号２、３、４、５、６、
   ７、８又は９で示したアミノ酸配列である請求項１記載
   のポリペプチド。
3. 【請求項３】 前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸
   配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個のアミ
   ノ酸を含むアミノ酸配列がＡｒｇ，Ｇｌｙ−Ａｓｐであ
   るかあるいは配列表の配列番号２、３、５又は６である
   請求項１記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその
   変換体が、配列表の配列番号１で示した９番目のＬｙｓ
   から１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列
   あるいは当該アミノ酸配列の２９番目のＡｒｇ、６８番
   目のＰｒｏ又は１０６番目のＧｌｙが欠失するかあるい
   は他のアミノ酸により置換されたアミノ酸配列を有する
   請求項１又は２記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 前記２９番目のＡｒｇがＭｅｔ、Ｔｒ
   ｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙ
   ｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕにより
   置換された請求項４記載のポリペプチド
6. 【請求項６】 前記２９番目のＡｒｇがＧｌｎ、Ｌｙ
   ｓ、Ａｓｐ、Ｖａｌ又はＬｅｕにより置換された請求項
   ４記載のポリペプチド
7. 【請求項７】 前記６８番目のＰｒｏがＭｅｔ、Ｔｒ
   ｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅ
   ｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕにより置換された請求項４記載の
   ポリペプチド
8. 【請求項８】 前記６８番目のＰｒｏがＡｓｐ又はＭｅ
   ｔにより置換された請求項４記載のポリペプチド。
9. 【請求項９】 前記１０６番目のＧｌｙが欠失するかあ
   るいはＭｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
   ｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉ
   ｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕにより置換された請求項４記載の
   ポリペプチド。
10. 【請求項１０】 前記１０６番目のＧｌｙが欠失するか
    あるいはＴｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｓｐ又はＡｒｇに
    より置換された請求項４記載のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列表の配列番号１で示した１番目の
    Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
    酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
    体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
    目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
    前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの
    アミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６
    個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
    ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とす
    る組換えプラスミド。
12. 【請求項１２】 前記組換えプラスミドがｐＫＦ４１６
    ８、ｐＫＦ４４１５、ｐＫＦ４４１６、ｐＫＦ４４１
    ７、ｐＫＦ４４１８、ｐＫＦ４４２０、ｐＫＦ４４２
    １、ｐＫＦ４１１３、ｐＫＦ４１３７、ｐＫＦ４６０
    １、ｐＫＦ４６０２、ｐＫＦ４６０７、ｐＫＦ４６０
    ８、ｐＫＦ４６２６、ｐＫＦ４６２７、ｐＫＦ４６３
    ４、ｐＫＦ４６３５、ｐＫＦ４６０９、ｐＫＦ４６１
    ０、ｐＫＦ４６２８、ｐＫＦ４６２９、ｐＫＦ４６３
    ８、ｐＫＦ４６３９、ｐＫＦ４６１１、ｐＫＦ４６１
    ２、ｐＫＦ４６１３、ｐＫＦ４６１４、ｐＫＦ４６１
    ５、ｐＫＦ４６４２、ｐＫＦ４６４３、ｐＫＦ４６４
    ４、ｐＫＦ４６４５、ｐＫＦ４６４６、ｐＫＦ４６５
    ２、ｐＫＦ４６５４、ｐＫＦ４６０６又はｐＫＦ４６５
    ６である請求項１１記載の組換えプラスミド。
13. 【請求項１３】 配列表の配列番号１で示した１番目の
    Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
    酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
    体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
    目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
    前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの
    アミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６
    個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
    ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミ
    ドにより形質転換された組換え微生物細胞。
14. 【請求項１４】 前記組換え微生物細胞が大腸菌である
    請求項１３記載の組換え微生物細胞。
15. 【請求項１５】 配列表の配列番号１で示した１番目の
    Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
    酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
    体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
    目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
    前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの
    アミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６
    個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
    ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミ
    ドにより形質転換された組換え微生物細胞を培地中で培
    養し、当該アミノ酸配列を有するポリペプチドを産生し
    分離することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
16. 【請求項１６】 配列表の配列番号１で示した１番目の
    Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
    酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
    体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
    目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
    前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの
    アミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６
    個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されている
    ポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とす
    る医薬組成物。
17. 【請求項１７】 前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ
    酸配列を少くとも１個含み、かつ、３個〜１６個のアミ
    ノ酸を含むアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであ
    るかあるいは配列表の配列番号２、３、４、５、６、
    ７、８又は９で示したアミノ酸配列であるポリペプチド
    を含有する請求項１６記載の医薬組成物。
18. 【請求項１８】 前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ
    酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６個のア
    ミノ酸を含むアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐで
    あるかあるいは配列表の配列番号２、３、５又は６で示
    したアミノ酸配列であるポリペプチドを含有する請求項
    １６記載の医薬組成物。
19. 【請求項１９】 前記腫瘍壊死因子ポリペプチド又はそ
    の変換体が、配列番号１で示した９番目のＬｙｓから１
    ５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列あるい
    は当該アミノ酸配列の２９番目のＡｒｇ、６８番目のＰ
    ｒｏ又は１０６番目のＧｌｙが欠失するかあるいは他の
    アミノ酸により置換されたアミノ酸配列を有するポリペ
    プチドを含有する請求項１６又は１７記載の医薬組成
    物。
20. 【請求項２０】 前記２９番目のＡｒｇがＭｅｔ、Ｔｒ
    ｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙ
    ｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕにより
    置換されたポリペプチドを含有する請求項１９記載の医
    薬組成物。
21. 【請求項２１】 前記２９番目のＡｒｇがＧｌｎ、Ｌｙ
    ｓ、Ａｓｐ、Ｖａｌ又はＬｅｕにより置換されたポリペ
    プチドを含有する請求項１９記載の医薬組成物。
22. 【請求項２２】 前記６８番目のＰｒｏがＭｅｔ、Ｔｒ
    ｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅ
    ｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕにより置換されたポリペプチドを
    含有する請求項１９記載の医薬組成物。
23. 【請求項２３】 前記６８番目のＰｒｏがＡｓｐ又はＭ
    ｅｔにより置換されたポリペプチドを含有する請求項１
    ９記載の医薬組成物。
24. 【請求項２４】 前記１０６番目のＧｌｙが欠失するか
    あるいはＭｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌ
    ｅｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉ
    ｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕにより置換されたポリペプチドを
    含有する請求項１９記載の医薬組成物。
25. 【請求項２５】 前記１０６番目のＧｌｙが欠失するか
    あるいはＴｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｓｐ又はＡｒｇに
    より置換されたポリペプチドを含有する請求項１９記載
    の医薬組成物。
26. 【請求項２６】 配列表の配列番号１で示した１番目の
    Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
    酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
    体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
    目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
    前記変換体のアミノ酸配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの
    アミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜１６
    個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されてお
    り、更にそのＮ末端にＭｅｔを有することを特徴とする
    ポリペプチド。
27. 【請求項２７】 配列表の配列番号１０で示した１番目
    のＴから４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を有
    する腫瘍壊死因子ポリペプチドのＤＮＡ又はその変異導
    入ＤＮＡにおいて、１〜３番目のＴＣＡから２２〜２４
    番目のＧＡＣまでの塩基配列あるいはそれらに対応する
    前記変異導入ＤＮＡの塩基配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓ
    ｐのアミノ酸配列を少なくとも１個含み、かつ、３個〜
    １６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基
    配列により置換されていることを特徴とするＤＮＡ。