JPH04368397A - ポリペプチド - Google Patents
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトＴＮＦ転換体として
新規なポリペプチドを提供することに係り、ポリペプチ
ド自身、それを含む医薬組成物、その製造方法、その遺
伝子組換えＤＮＡ、プラスミド及び形質転換微生物細胞
などに関する。
新規なポリペプチドを提供することに係り、ポリペプチ
ド自身、それを含む医薬組成物、その製造方法、その遺
伝子組換えＤＮＡ、プラスミド及び形質転換微生物細胞
などに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）は、１９７５年
にＣａｒｓｗｅｌｌらにより予めＢａｃｉｌｌｕｓ
Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）に感染さ
れエンドトキシンで処理したマウスの血清中に存在する
ことが見出された生理活性物質であり〔Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２ ３６６６
（１９７５）〕、１９８４年にＰｅｎｎｉｃａらにより
ヒトＴＮＦのｃＤＮＡがクローニングされヒトＴＮＦ蛋
白質の全一次構造（アミノ酸配列）が明らかにされた〔
Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ７２４（１９８４）〕。 ＴＮＦは腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対
する出血性壊死、増殖の抑制など特異的な抗腫瘍作用を
有するが、最近では高脂血症、血圧低下、発熱などの副
作用も生じうることが報告されており、薬効、副作用な
どでより優れたものを見出すべく研究、開発がなされて
いる。例えば特開昭６１−４０２２１、同６３−１１９
６９２、特開平１−２７７４８８各号公報では遺伝子操
作技術によりヒトＴＮＦ蛋白質中の特定のアミノ酸を欠
失したり、他のアミノ酸に置換したり或は付加したりし
てヒトＴＮＦ変換体を提供している。
にＣａｒｓｗｅｌｌらにより予めＢａｃｉｌｌｕｓ
Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）に感染さ
れエンドトキシンで処理したマウスの血清中に存在する
ことが見出された生理活性物質であり〔Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２ ３６６６
（１９７５）〕、１９８４年にＰｅｎｎｉｃａらにより
ヒトＴＮＦのｃＤＮＡがクローニングされヒトＴＮＦ蛋
白質の全一次構造（アミノ酸配列）が明らかにされた〔
Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ７２４（１９８４）〕。 ＴＮＦは腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、移植腫瘍に対
する出血性壊死、増殖の抑制など特異的な抗腫瘍作用を
有するが、最近では高脂血症、血圧低下、発熱などの副
作用も生じうることが報告されており、薬効、副作用な
どでより優れたものを見出すべく研究、開発がなされて
いる。例えば特開昭６１−４０２２１、同６３−１１９
６９２、特開平１−２７７４８８各号公報では遺伝子操
作技術によりヒトＴＮＦ蛋白質中の特定のアミノ酸を欠
失したり、他のアミノ酸に置換したり或は付加したりし
てヒトＴＮＦ変換体を提供している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、十分満
足な薬理作用を有するヒトＴＮＦ変換体は、いまだ得ら
れていない。本発明の目的は、ヒトＴＮＦ又はその変換
体と同様の抗腫瘍作用を有し、一方それらで認められた
癌転移の亢進作用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体、
それらに関連するポリペプチドとそれらの製造方法、プ
ラスミド、微生物細胞など、及び用途を提供することに
ある。
足な薬理作用を有するヒトＴＮＦ変換体は、いまだ得ら
れていない。本発明の目的は、ヒトＴＮＦ又はその変換
体と同様の抗腫瘍作用を有し、一方それらで認められた
癌転移の亢進作用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体、
それらに関連するポリペプチドとそれらの製造方法、プ
ラスミド、微生物細胞など、及び用途を提供することに
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は、配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅｒか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列を
有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換体におい
て、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓ
ｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する前記変換
体のアミノ酸配列がラミニンの細胞接着性ペプチド配列
を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個のアミノ酸
を含むアミノ酸配列により置換されていることを特徴と
するポリペプチドに関する。また本発明は、当該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、こ
の組換えプラスミドにより形質転換された微生物細胞、
この微生物細胞によるポリペプチドの製造方法、医薬組
成物、前記アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンの結合し
たポリペプチドに関し、更に配列表の配列番号７で示し
た１番目のＴから４６５番目のＧまでで表わされる塩基
配列を有するＤＮＡ又はその変異導入ＤＮＡにおいて、
前記配列番号７の１〜３番目のＴＣＡから２２〜２４番
目のＧＡＣまでの塩基配列あるいはそれらに対応する前
記変異導入ＤＮＡの塩基配列がラミニンの細胞接着性ペ
プチド配列を少なくとも１個含み、かつ５個〜３０個の
アミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列によ
り置換されているＤＮＡに関する。
発明は、配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅｒか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列を
有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換体におい
て、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓ
ｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する前記変換
体のアミノ酸配列がラミニンの細胞接着性ペプチド配列
を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個のアミノ酸
を含むアミノ酸配列により置換されていることを特徴と
するポリペプチドに関する。また本発明は、当該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、こ
の組換えプラスミドにより形質転換された微生物細胞、
この微生物細胞によるポリペプチドの製造方法、医薬組
成物、前記アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンの結合し
たポリペプチドに関し、更に配列表の配列番号７で示し
た１番目のＴから４６５番目のＧまでで表わされる塩基
配列を有するＤＮＡ又はその変異導入ＤＮＡにおいて、
前記配列番号７の１〜３番目のＴＣＡから２２〜２４番
目のＧＡＣまでの塩基配列あるいはそれらに対応する前
記変異導入ＤＮＡの塩基配列がラミニンの細胞接着性ペ
プチド配列を少なくとも１個含み、かつ５個〜３０個の
アミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列によ
り置換されているＤＮＡに関する。
【０００５】本発明者らは、ヒトＴＮＦ又はその変換体
が有するアミノ酸配列の一定のアミノ酸配列領域におい
て、ラミニンの細胞接着性ペプチド配列を有するアミノ
酸配列を存在せしめたところ、ヒトＴＮＦ又はその変換
体に比し抗腫瘍活性がほぼ同程度であり、一方ヒトＴＮ
Ｆ又はその変換体が癌の転移を亢進するのに対しほとん
ど亢進しない新規ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドが得ら
れることを見出し、その知見に基づいて発明を完成した
。配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列を有する
腫瘍壊死因子ポリペプチドとは、ヒトＴＮＦを意味する
。
が有するアミノ酸配列の一定のアミノ酸配列領域におい
て、ラミニンの細胞接着性ペプチド配列を有するアミノ
酸配列を存在せしめたところ、ヒトＴＮＦ又はその変換
体に比し抗腫瘍活性がほぼ同程度であり、一方ヒトＴＮ
Ｆ又はその変換体が癌の転移を亢進するのに対しほとん
ど亢進しない新規ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドが得ら
れることを見出し、その知見に基づいて発明を完成した
。配列表の配列番号１で示した１番目のＳｅｒから１５
５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列を有する
腫瘍壊死因子ポリペプチドとは、ヒトＴＮＦを意味する
。
【０００６】また本発明においてヒトＴＮＦの変換体と
は、配列表の配列番号１で示したアミノ酸配列において
１個又は２個以上のアミノ酸を適宜付加、欠失、置換の
改変を単独又は複合処理したものであって、ヒトＴＮＦ
と同様の抗腫瘍作用を有するものである。したがって、
本発明におけるヒトＴＮＦ変換体に関してヒトＴＮＦの
配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓｐまでの
アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列とは、ヒトＴＮＦ
変換体において前述のＳｅｒからＡｓｐまでのアミノ酸
配列自身が改変されていなければそれに該当し、そのア
ミノ酸配列が改変されていれば改変後のアミノ酸配列が
それに該当する。この改変にはアミノ酸の欠失も含まれ
るので前述の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓｐまでの
アミノ酸配列が部分的あるいは全部欠失したものも含ま
れる。
は、配列表の配列番号１で示したアミノ酸配列において
１個又は２個以上のアミノ酸を適宜付加、欠失、置換の
改変を単独又は複合処理したものであって、ヒトＴＮＦ
と同様の抗腫瘍作用を有するものである。したがって、
本発明におけるヒトＴＮＦ変換体に関してヒトＴＮＦの
配列番号１の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓｐまでの
アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列とは、ヒトＴＮＦ
変換体において前述のＳｅｒからＡｓｐまでのアミノ酸
配列自身が改変されていなければそれに該当し、そのア
ミノ酸配列が改変されていれば改変後のアミノ酸配列が
それに該当する。この改変にはアミノ酸の欠失も含まれ
るので前述の１番目のＳｅｒから８番目のＡｓｐまでの
アミノ酸配列が部分的あるいは全部欠失したものも含ま
れる。
【０００７】ヒトＴＮＦ変換体としては具体的には例え
ば下記のものが挙げられるが、本発明においてはこれら
以外のものを決して排除するものではない。
ば下記のものが挙げられるが、本発明においてはこれら
以外のものを決して排除するものではない。
【０００８】（１）特開昭６３−１４１９９９号公報に
記載：Ｎ末端に、Ｖａｌ−Ａｒｇを付加し、更に２９Ａ
ｒｇ−３０Ａｒｇを２９Ａｓｎ−３０Ｔｈｒに変換した
もの。 （２）特開昭６３−１１９６９２号公報に記載：（Ａ）
３２Ａｓｎを３２Ｔｙｒ、３２Ｈｉｓ、３２Ａｓｐ又は
３２Ｓｅｒにそれぞれ変換したもの。 （Ｂ）１１５Ｐｒｏを１１５Ｌｅｕ、１１５Ｓｅｒ、１
１５Ａｓｐ又は１１５Ｃｌｙにそれぞれ変換したもの。 （Ｃ）１１７Ｔｙｒを１１７Ｈｉｓに変換したもの。 （３）特開平１−２７７４８８号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加したもの。 （４）特開平２−１６３０９４号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加し更に１５４Ａｌａを１５４Ｐｈｅに
変換したもの。 （５）特開平２−１４２４９３号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加し更に１５４Ａｌａを１５４Ｔｒｐに
変換したもの。 （６）特開昭６３−２７０６９７号公報に記載：１００
Ｇｌｎ〜１０７Ａｌａを欠失したもの。１Ｓｅｒから２
個〜８個のアミノ酸残基を欠失したもの。 （７）特願平２−１９３９３５号明細書に記載：６８Ｐ
ｒｏを６８Ａｓｐ、６８Ｍｅｔ又は６８Ｔｙｒにそれぞ
れ変換したもの。
記載：Ｎ末端に、Ｖａｌ−Ａｒｇを付加し、更に２９Ａ
ｒｇ−３０Ａｒｇを２９Ａｓｎ−３０Ｔｈｒに変換した
もの。 （２）特開昭６３−１１９６９２号公報に記載：（Ａ）
３２Ａｓｎを３２Ｔｙｒ、３２Ｈｉｓ、３２Ａｓｐ又は
３２Ｓｅｒにそれぞれ変換したもの。 （Ｂ）１１５Ｐｒｏを１１５Ｌｅｕ、１１５Ｓｅｒ、１
１５Ａｓｐ又は１１５Ｃｌｙにそれぞれ変換したもの。 （Ｃ）１１７Ｔｙｒを１１７Ｈｉｓに変換したもの。 （３）特開平１−２７７４８８号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加したもの。 （４）特開平２−１６３０９４号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加し更に１５４Ａｌａを１５４Ｐｈｅに
変換したもの。 （５）特開平２−１４２４９３号公報に記載：１Ｓｅｒ
〜８Ａｓｐを欠失し、９ＬｙｓのＮ末端にＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇを付加し更に１５４Ａｌａを１５４Ｔｒｐに
変換したもの。 （６）特開昭６３−２７０６９７号公報に記載：１００
Ｇｌｎ〜１０７Ａｌａを欠失したもの。１Ｓｅｒから２
個〜８個のアミノ酸残基を欠失したもの。 （７）特願平２−１９３９３５号明細書に記載：６８Ｐ
ｒｏを６８Ａｓｐ、６８Ｍｅｔ又は６８Ｔｙｒにそれぞ
れ変換したもの。
【０００９】本明細書全般を通じてアミノ酸、ポリペプ
チド、塩基、それらの配列を表わすとき下記のリストの
ものを用いる。
チド、塩基、それらの配列を表わすとき下記のリストの
ものを用いる。
【００１０】アミノ酸：
記号 Ａｌａ Ｃｙｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ 意味 アラニン システイン アスパラギン
酸 グルタミン酸 記号 Ｐｈｅ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙ
ｓ 意味 フェニルアラニン グリシン ヒスチ
ジン イソロイシン リジン 記号 Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ 意味 ロイシン メチオニン アスパラギン
プロリン グルタミン 記号 Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ｔｒｐ 意味 アルギニン セリン スレオニン
バリン トリプトファン 記号 Ｔｙｒ 意味 チロシン 塩基： 記号 Ａ又はａ Ｃ又はｃ Ｇ又はｇ Ｔ
又はｔ Ｕ意味 アデニン シトシン グ
アニン チミン ウラシル
Ａｓｐ Ｇｌｕ 意味 アラニン システイン アスパラギン
酸 グルタミン酸 記号 Ｐｈｅ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙ
ｓ 意味 フェニルアラニン グリシン ヒスチ
ジン イソロイシン リジン 記号 Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ 意味 ロイシン メチオニン アスパラギン
プロリン グルタミン 記号 Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ｔｒｐ 意味 アルギニン セリン スレオニン
バリン トリプトファン 記号 Ｔｙｒ 意味 チロシン 塩基： 記号 Ａ又はａ Ｃ又はｃ Ｇ又はｇ Ｔ
又はｔ Ｕ意味 アデニン シトシン グ
アニン チミン ウラシル
【００１１】また本明細書で使用した略号は次のとおり
意味する。 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸（Ｄｅｏｘｙ
ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸（Ｄｅｏｘｙ
ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸（Ｄｅｏｘｙ
ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＴＴ
Ｐ：チミジン三リン酸（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＡＴＰ：アデノシン三リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄ
ｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ） ＢＰＢ：ブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎ
ｏｌ Ｂｌｕｅ） ＤＴＴ：ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉ
ｔｏｌ） ＢＳＡ：牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕ
ｍ ａｌｂｕｍｉｎ） ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｐ
ｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏ
ｒｉｄｅ） ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ
Ａｃｉｄ） ＣＰＧ樹脂：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐｏｒｅ Ｇｌ
ａｓｓ樹脂
意味する。 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸（Ｄｅｏｘｙ
ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸（Ｄｅｏｘｙ
ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸（Ｄｅｏｘｙ
ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＴＴ
Ｐ：チミジン三リン酸（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＡＴＰ：アデノシン三リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄ
ｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ） ＢＰＢ：ブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎ
ｏｌ Ｂｌｕｅ） ＤＴＴ：ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉ
ｔｏｌ） ＢＳＡ：牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕ
ｍ ａｌｂｕｍｉｎ） ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｐ
ｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏ
ｒｉｄｅ） ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ
Ａｃｉｄ） ＣＰＧ樹脂：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐｏｒｅ Ｇｌ
ａｓｓ樹脂
【００１２】前記ラミニンの細胞接着性ペプチド配列を
有するアミノ酸配列に関しては当該細胞接着性ペプチド
配列のみから構成されてもよいが、当該細胞接着性ペプ
チド配列と１個又は２個以上のアミノ酸とから構成され
ていてもよく、またそこにおいては当該ラミニンの細胞
接着性ペプチド配列を１個又は２個以上有することがで
きる。またラミニンの細胞接着性ペプチド配列を有する
アミノ酸配列の構成アミノ酸の数は５個〜３０個である
。そして具体的には例えば配列表の配列番号２〜６でそ
れぞれ示したアミノ酸配列あるいはその他が挙げられる
が、なかでも配列番号２、３又は４で示したアミノ酸配
列が望ましい。
有するアミノ酸配列に関しては当該細胞接着性ペプチド
配列のみから構成されてもよいが、当該細胞接着性ペプ
チド配列と１個又は２個以上のアミノ酸とから構成され
ていてもよく、またそこにおいては当該ラミニンの細胞
接着性ペプチド配列を１個又は２個以上有することがで
きる。またラミニンの細胞接着性ペプチド配列を有する
アミノ酸配列の構成アミノ酸の数は５個〜３０個である
。そして具体的には例えば配列表の配列番号２〜６でそ
れぞれ示したアミノ酸配列あるいはその他が挙げられる
が、なかでも配列番号２、３又は４で示したアミノ酸配
列が望ましい。
【００１３】ラミニンの細胞接着性ペプチド配列として
は配列表の配列番号２で示したアミノ酸配列において３
番目のＴｙｒから７番目のＡｒｇまでで表わされるアミ
ノ酸配列であるものが望ましい。
は配列表の配列番号２で示したアミノ酸配列において３
番目のＴｙｒから７番目のＡｒｇまでで表わされるアミ
ノ酸配列であるものが望ましい。
【００１４】更に本発明におけるポリペプチドのラミニ
ンの細胞接着性ペプチド配列を有するアミノ酸配列のア
ミノ酸配列に関しては、配列番号１の９番目のＬｙｓか
ら１５５番目のＬｅｕまでのヒトＴＮＦのアミノ酸配列
あるいはその６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸望ましく
はＡｓｐ又はＭｅｔで置換されたアミノ酸配列が望まし
い。
ンの細胞接着性ペプチド配列を有するアミノ酸配列のア
ミノ酸配列に関しては、配列番号１の９番目のＬｙｓか
ら１５５番目のＬｅｕまでのヒトＴＮＦのアミノ酸配列
あるいはその６８番目のＰｒｏが他のアミノ酸望ましく
はＡｓｐ又はＭｅｔで置換されたアミノ酸配列が望まし
い。
【００１５】本発明のポリペプチドにおいて、一定の位
置にラミニンの細胞接着性ペプチド配列を含み、かつ、
５個〜３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列は、いわゆ
るラミニンの細胞接着性ペプチドと称されるアミノ酸配
列の種類、抗腫瘍活性、癌の転移程度、副作用、遺伝子
組換え技術の適用性などを考慮して適宜決められる。
置にラミニンの細胞接着性ペプチド配列を含み、かつ、
５個〜３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列は、いわゆ
るラミニンの細胞接着性ペプチドと称されるアミノ酸配
列の種類、抗腫瘍活性、癌の転移程度、副作用、遺伝子
組換え技術の適用性などを考慮して適宜決められる。
【００１６】配列表の配列番号７で示した１番目のＴか
ら４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を有するＤ
ＮＡとは、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａの１形態である。
ら４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を有するＤ
ＮＡとは、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａの１形態である。
【００１７】ヒトＴＮＦのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの変異導入ＤＮＡとは、配列表の配列番号７で示し
た塩基配列において１組又は２組以上のコドンを適宜付
加、欠失、置換の改変を単独又は複合処理したものであ
って、前述のヒトＴＮＦ変換体のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡである。したがって、その改変は配列番号７
で示した１番目のＴから４６５番目のＧまでで表わされ
る塩基配列の全域に及ぶので、１番目のＴから２４番目
のＣまでの塩基配列だけでなく、２５番目のＡから４６
５番目のＧまでの塩基配列にも及ぶ。
ＮＡの変異導入ＤＮＡとは、配列表の配列番号７で示し
た塩基配列において１組又は２組以上のコドンを適宜付
加、欠失、置換の改変を単独又は複合処理したものであ
って、前述のヒトＴＮＦ変換体のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡである。したがって、その改変は配列番号７
で示した１番目のＴから４６５番目のＧまでで表わされ
る塩基配列の全域に及ぶので、１番目のＴから２４番目
のＣまでの塩基配列だけでなく、２５番目のＡから４６
５番目のＧまでの塩基配列にも及ぶ。
【００１８】次に本発明についてその実施態様を詳しく
記載するが、本発明に係る遺伝子操作技術については多
くの文献により記載されている方法や手段を適宜調整し
乍ら適用する。その文献を参考までに以下に列挙する。
記載するが、本発明に係る遺伝子操作技術については多
くの文献により記載されている方法や手段を適宜調整し
乍ら適用する。その文献を参考までに以下に列挙する。
【００１９】Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，
（１９８２）：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｎｌ（以下、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇと略記する）Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８３
）：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
， １００及び１０１、Ｒ．Ｗｕ ｅｔａｌ，（１
９８７）：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，１５３，１５４及び１５５
（１９８２）：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｎｌ（以下、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇと略記する）Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８３
）：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
， １００及び１０１、Ｒ．Ｗｕ ｅｔａｌ，（１
９８７）：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，１５３，１５４及び１５５
【００２０】本発明のポリペプチドは種々の方法、手段
、機械を用いて製造することができるが、代表的な製造
方法を下記する。
、機械を用いて製造することができるが、代表的な製造
方法を下記する。
【００２１】（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得ヒトＴＮＦ
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述のとおり、Ｐ
ｅｎｎｉｃａらにより明らかにされており、その塩基配
列を適宜変更してヒトＴＮＦ遺伝子配列をデザインする
。その配列は配列番号７のＤＮＡ鎖を上鎖（コーディン
グ鎖）とし、それに対応したコンプリメンタリー配列鎖
を下鎖としたＤＮＡ二本鎖をデザインしたものである。 その際、宿主細胞（大腸菌など）に適したコドンを選択
するのが望ましく、また後述のＤＮＡ断片の連結による
クローン化並びに変換体作製のための遺伝子改変が容易
に実施できるように適当な位置に適当な制限酵素切断部
位を配置するのが望ましい。もちろんヒトＴＮＦ遺伝子
の上流には翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、下流には翻訳
終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）をそれぞれ読
み取り枠に合致させるように設置する必要があり、また
翻訳開始コドンの上流並びに翻訳終止コドンの下流にそ
れぞれ適当な制限酵素切断部位を設置してベクターへの
適用性、クローン化の簡便性を図るのが好ましい。
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は前述のとおり、Ｐ
ｅｎｎｉｃａらにより明らかにされており、その塩基配
列を適宜変更してヒトＴＮＦ遺伝子配列をデザインする
。その配列は配列番号７のＤＮＡ鎖を上鎖（コーディン
グ鎖）とし、それに対応したコンプリメンタリー配列鎖
を下鎖としたＤＮＡ二本鎖をデザインしたものである。 その際、宿主細胞（大腸菌など）に適したコドンを選択
するのが望ましく、また後述のＤＮＡ断片の連結による
クローン化並びに変換体作製のための遺伝子改変が容易
に実施できるように適当な位置に適当な制限酵素切断部
位を配置するのが望ましい。もちろんヒトＴＮＦ遺伝子
の上流には翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、下流には翻訳
終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）をそれぞれ読
み取り枠に合致させるように設置する必要があり、また
翻訳開始コドンの上流並びに翻訳終止コドンの下流にそ
れぞれ適当な制限酵素切断部位を設置してベクターへの
適用性、クローン化の簡便性を図るのが好ましい。
【００２２】ここでは前述のＤＮＡ二本鎖に基づき作成
され、その上鎖は、１番目のＴに５′−ＡＴＧ−３′を
上流方向に接続し、かつ４６５番目のＧに５′−ＴＡＡ
ＴＧＡ−３′を下流方向に接続するものであって４７４
個の塩基を含む（以下コーディング４７４Ｕ鎖）。した
がって下鎖はこのコーディング４７４Ｕ鎖に相補したも
のとして上鎖の下段に記載すれば、Ｔから始まりＴに終
了する４７４個の塩基を含む（以下コンプリメンタリー
配列鎖４７４Ｌ鎖）。
され、その上鎖は、１番目のＴに５′−ＡＴＧ−３′を
上流方向に接続し、かつ４６５番目のＧに５′−ＴＡＡ
ＴＧＡ−３′を下流方向に接続するものであって４７４
個の塩基を含む（以下コーディング４７４Ｕ鎖）。した
がって下鎖はこのコーディング４７４Ｕ鎖に相補したも
のとして上鎖の下段に記載すれば、Ｔから始まりＴに終
了する４７４個の塩基を含む（以下コンプリメンタリー
配列鎖４７４Ｌ鎖）。
【００２３】ヒトＴＮＦ遺伝子は上鎖・下鎖それぞれに
ついて幾つかのオリゴヌクレオチドに分けて化学合成し
、ブロックごとに順次適切に連結する方法により作製で
きる。例えばこのコーデング４７４Ｕ鎖及びコンプリメ
ンタリー配列鎖４７４Ｌ鎖からなるＤＮＡ二本鎖に基づ
いて調整したＤＮＡ二本鎖においては、ヒトＴＮＦ遺伝
子の各鎖を約５０塩基程度ずつ１０本のオリゴヌクレオ
チドに分け、合計２０本化学合成する。
ついて幾つかのオリゴヌクレオチドに分けて化学合成し
、ブロックごとに順次適切に連結する方法により作製で
きる。例えばこのコーデング４７４Ｕ鎖及びコンプリメ
ンタリー配列鎖４７４Ｌ鎖からなるＤＮＡ二本鎖に基づ
いて調整したＤＮＡ二本鎖においては、ヒトＴＮＦ遺伝
子の各鎖を約５０塩基程度ずつ１０本のオリゴヌクレオ
チドに分け、合計２０本化学合成する。
【００２４】その合成方法としてはジエステル法〔Ｈ．
Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，“ＳｏｍｅＲｅｃｅｎｔ Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”．Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６１）〕、トリエステル法〔
Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔａｌ，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）〕及
びホスファイト法〔Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅ
ｔ ａｌ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，２１
，７１９（１９８０）〕が挙げられるが、全自動ＤＮＡ
合成機を用いたホスファイト法が操作性などから好んで
用いられる。
Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，“ＳｏｍｅＲｅｃｅｎｔ Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”．Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６１）〕、トリエステル法〔
Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔａｌ，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）〕及
びホスファイト法〔Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅ
ｔ ａｌ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，２１
，７１９（１９８０）〕が挙げられるが、全自動ＤＮＡ
合成機を用いたホスファイト法が操作性などから好んで
用いられる。
【００２５】合成されたオリゴヌクレオチドは例えば逆
相クロマトカラムを用いた高速液体クロマトグラフイー
、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動などの通常
の精製方法により精製される。その後、オリゴヌクレオ
チドは例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化し、アニール化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結する。ここではオリゴヌクレオチドを幾つかの
ブロックに分け、所望のヒトＴＮＦ遺伝子配列が得られ
るように順次連結し、制限酵素で切断又はＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼによる平滑化後、電気泳動等により精製する
。得られたＤＮＡ断片について例えばｐＵＣ８、同９、
同１８、同１９〔Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇｅｔ ａｌ，Ｇ
ｅｎｅ，１９，２５９（１９８２）〕のようなプラスミ
ドベクターに組込み、常法によりコンピテントセルを形
質転換してクローン化する。得られたクローンより公知
の方法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ベクタ
ーに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列が目的の遺伝子配
列を達成したか否かを点検する。達成できたヒトＴＮＦ
遺伝子の各部分について、それぞれを含むプラスミドベ
クターより制限酵素を用いて切り出し、再度前記ベクタ
ーに連結後組込むことにより目的の完全長のヒトＴＮＦ
遺伝子を有するプラスミドベクターを得る。かくして得
られたプラスミドベクターを制限酵素で切断後、ゲル電
気泳動法によって分離精製することにより所望のヒトＴ
ＮＦ遺伝子を得ることができる。
相クロマトカラムを用いた高速液体クロマトグラフイー
、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動などの通常
の精製方法により精製される。その後、オリゴヌクレオ
チドは例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化し、アニール化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結する。ここではオリゴヌクレオチドを幾つかの
ブロックに分け、所望のヒトＴＮＦ遺伝子配列が得られ
るように順次連結し、制限酵素で切断又はＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼによる平滑化後、電気泳動等により精製する
。得られたＤＮＡ断片について例えばｐＵＣ８、同９、
同１８、同１９〔Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇｅｔ ａｌ，Ｇ
ｅｎｅ，１９，２５９（１９８２）〕のようなプラスミ
ドベクターに組込み、常法によりコンピテントセルを形
質転換してクローン化する。得られたクローンより公知
の方法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ベクタ
ーに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列が目的の遺伝子配
列を達成したか否かを点検する。達成できたヒトＴＮＦ
遺伝子の各部分について、それぞれを含むプラスミドベ
クターより制限酵素を用いて切り出し、再度前記ベクタ
ーに連結後組込むことにより目的の完全長のヒトＴＮＦ
遺伝子を有するプラスミドベクターを得る。かくして得
られたプラスミドベクターを制限酵素で切断後、ゲル電
気泳動法によって分離精製することにより所望のヒトＴ
ＮＦ遺伝子を得ることができる。
【００２６】一方、前述の方法に対してはＴＮＦを発現
しているヒト細胞由来のｍＲＮＡよりヒトＴＮＦをコー
ドするｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡを使用する方法
を適宜組合せてもよい。
しているヒト細胞由来のｍＲＮＡよりヒトＴＮＦをコー
ドするｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡを使用する方法
を適宜組合せてもよい。
【００２７】（２）ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築前記
（１）で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を適切に発現ベクタ
ーに挿入して、ヒトＴＮＦ発現ベクターを構築する。発
現ベクターは翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流に転写プ
ロモーター領域並びに翻訳シグナルであるＳＤ（シャイ
ン・ダルガーノ）配列を有し、翻訳終止コドン（ＴＡＡ
、ＴＧＡ又はＴＡＧ）の下流に転写ターミネーター領域
を有する必要がある。また転写プロモーターとしては、
ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロ
モーター、ＰＬプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、
ＡＤＣＩプロモーターなどが使用でき、転写ターミネー
ターとしてはｔｒｐターミネーター、ｒｒｎＢターミネ
ーター、ＡＤＣＩターミネーターなどが使用できる。こ
のような発現ベクターは例えば、ｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア）、ｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ（同左）、ｐＤＲ
７２０（同左）などの市販品の中から容易に入手できる
が、これらを改良して発現性あるいは取扱性をより高度
化したものを使用してもよい。
（１）で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を適切に発現ベクタ
ーに挿入して、ヒトＴＮＦ発現ベクターを構築する。発
現ベクターは翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流に転写プ
ロモーター領域並びに翻訳シグナルであるＳＤ（シャイ
ン・ダルガーノ）配列を有し、翻訳終止コドン（ＴＡＡ
、ＴＧＡ又はＴＡＧ）の下流に転写ターミネーター領域
を有する必要がある。また転写プロモーターとしては、
ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロ
モーター、ＰＬプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、
ＡＤＣＩプロモーターなどが使用でき、転写ターミネー
ターとしてはｔｒｐターミネーター、ｒｒｎＢターミネ
ーター、ＡＤＣＩターミネーターなどが使用できる。こ
のような発現ベクターは例えば、ｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア）、ｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ（同左）、ｐＤＲ
７２０（同左）などの市販品の中から容易に入手できる
が、これらを改良して発現性あるいは取扱性をより高度
化したものを使用してもよい。
【００２８】（３）ヒトＴＮＦ変換体又は同転換体発現
ベクターの構築 ヒトＴＮＦ変換体又は同転換体ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの作製方法としては例えば次の方法が挙げられ
る。
ベクターの構築 ヒトＴＮＦ変換体又は同転換体ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの作製方法としては例えば次の方法が挙げられ
る。
【００２９】（Ａ）前記（１）ヒトＴＮＦ遺伝子の取得
で記載した方法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレ
オチドを適切に連結することにより作製する。この方法
によればアミノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加又は
欠失の改変は自在である。
で記載した方法に準じて化学的に合成したオリゴヌクレ
オチドを適切に連結することにより作製する。この方法
によればアミノ酸、ポリペプチドなどの置換、付加又は
欠失の改変は自在である。
【００３０】（Ｂ）前記（１）で作製したヒトＴＮＦ遺
伝子を適当な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を
除去した後、変異を導入した塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチド（例：上下鎖をアニール化して連結した
二本鎖ＤＮＡ断片）又は適当な他の遺伝子を組込む。こ
の方法によっても前記（Ａ）の場合と同様、改変を自在
に行うことができる。
伝子を適当な制限酵素で切断し、遺伝子内の特定領域を
除去した後、変異を導入した塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチド（例：上下鎖をアニール化して連結した
二本鎖ＤＮＡ断片）又は適当な他の遺伝子を組込む。こ
の方法によっても前記（Ａ）の場合と同様、改変を自在
に行うことができる。
【００３１】（Ｃ）変異を導入した塩基配列を有する合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＤＮＡ鎖
を延長することにより、変異導入を行う〔部異特異的変
異法（Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，
３６７（１９８７））〕。この方法は１０塩基対を越え
る比較的長いＤＮＡ鎖の付加及び挿入には適用し難いが
、その他の改変には前記（Ａ）の場合と同様、自在に行
うことができる。特に任意のアミノ酸を置換することに
適している。
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＤＮＡ鎖
を延長することにより、変異導入を行う〔部異特異的変
異法（Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，
３６７（１９８７））〕。この方法は１０塩基対を越え
る比較的長いＤＮＡ鎖の付加及び挿入には適用し難いが
、その他の改変には前記（Ａ）の場合と同様、自在に行
うことができる。特に任意のアミノ酸を置換することに
適している。
【００３２】本発明では一般に（Ｃ）の部位特異的変異
法及び制限酵素切断部位を利用する（Ｂ）の方法を適宜
組合せて使用するが、以下にその方法について説明する
。
法及び制限酵素切断部位を利用する（Ｂ）の方法を適宜
組合せて使用するが、以下にその方法について説明する
。
【００３３】■ 部位特異的変異法により変換体又は
転換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを作製した後、
発現ベクター内に適切に挿入する。
転換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを作製した後、
発現ベクター内に適切に挿入する。
【００３４】まず部位特異的変異法を行うに当り、鋳型
ＤＮＡを作製する。前記（１）で得られたヒトＴＮＦ遺
伝子を、Ｍｅｓｓｉｎｇら〔Ｍｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３（１９８７）〕によって
開発された一本鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベ
クター（ｐＵＣ１１８、ｐｕＣ１１９など）に連結し、
大腸菌株に導入する。得られた形質転換体の中より目的
のプラスミドを有するクローンを選択する。
ＤＮＡを作製する。前記（１）で得られたヒトＴＮＦ遺
伝子を、Ｍｅｓｓｉｎｇら〔Ｍｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３（１９８７）〕によって
開発された一本鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベ
クター（ｐＵＣ１１８、ｐｕＣ１１９など）に連結し、
大腸菌株に導入する。得られた形質転換体の中より目的
のプラスミドを有するクローンを選択する。
【００３５】このプラスミドをｄｕｔ−及びｕｎｇ−変
異大腸菌株（ＣＪ２３６株など）に導入し、遺伝子内に
ウラシルを取り込ませ、大腸菌株にＭ１３Ｋ０７などの
変異型ヘルパーファージを感染させて目的の一本鎖プラ
スミドＤＮＡを取得する。
異大腸菌株（ＣＪ２３６株など）に導入し、遺伝子内に
ウラシルを取り込ませ、大腸菌株にＭ１３Ｋ０７などの
変異型ヘルパーファージを感染させて目的の一本鎖プラ
スミドＤＮＡを取得する。
【００３６】一方、本発明に係る変異導入部位及びその
前後の塩基配列を有する約１５〜５０塩基のオリゴヌク
レオチド・プライマーを化学合成する。このプライマー
と前述の工程で得られるウラシル導入一本鎖プラスミド
ＤＮＡとをアニール化した後、例えばＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、二本鎖化する
。鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖を不活性化し変異
導入頻度を高めるため、二本鎖となったプラスミドをｕ
ｎｇ＋の大腸菌株に導入する。
前後の塩基配列を有する約１５〜５０塩基のオリゴヌク
レオチド・プライマーを化学合成する。このプライマー
と前述の工程で得られるウラシル導入一本鎖プラスミド
ＤＮＡとをアニール化した後、例えばＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、二本鎖化する
。鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖を不活性化し変異
導入頻度を高めるため、二本鎖となったプラスミドをｕ
ｎｇ＋の大腸菌株に導入する。
【００３７】前述のプライマーをプローブとして用いコ
ロニー・ハイブリダイゼーションを行い、目的の変換体
又は転換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラ
スミドを有するクローンを、得られた形質転換体中より
選択する。
ロニー・ハイブリダイゼーションを行い、目的の変換体
又は転換体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラ
スミドを有するクローンを、得られた形質転換体中より
選択する。
【００３８】前述で得られるプラスミドから制限酵素切
断処理によりヒトＴＮＦ変換体又は同転換体ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片を切り出し、前記（２）の場
合と同様に、発現ベクターに挿入して、目的のヒトＴＮ
Ｆ変換体又は同転換体発現ベクターを構築することがで
きる。
断処理によりヒトＴＮＦ変換体又は同転換体ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片を切り出し、前記（２）の場
合と同様に、発現ベクターに挿入して、目的のヒトＴＮ
Ｆ変換体又は同転換体発現ベクターを構築することがで
きる。
【００３９】■ 適当な制限酵素切断により変異を導
入したい部分を切り出し、変換デザインに従って化学合
成等により作製したＤＮＡ断片で置換することにより変
換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクターを構築する
。
入したい部分を切り出し、変換デザインに従って化学合
成等により作製したＤＮＡ断片で置換することにより変
換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクターを構築する
。
【００４０】ヒトＴＮＦのＮ末端近傍のアミノ酸配列を
修飾するには、Ｎ末端近傍に適当な制限酵素切断部位が
存在するのが好ましい。そこで、まず部位特異的変異法
によりヒトＴＮＦのＮ末端近傍に適当な制限酵素切断部
位を導入する。この制限酵素切断部位とその上流に位置
する翻訳開始コドンの前後に設置された制限酵素切断部
位の２種類の切断部位の使用は更に好ましい。
修飾するには、Ｎ末端近傍に適当な制限酵素切断部位が
存在するのが好ましい。そこで、まず部位特異的変異法
によりヒトＴＮＦのＮ末端近傍に適当な制限酵素切断部
位を導入する。この制限酵素切断部位とその上流に位置
する翻訳開始コドンの前後に設置された制限酵素切断部
位の２種類の切断部位の使用は更に好ましい。
【００４１】一方、本発明に係る変換デザインに従って
前記（１）の場合と同様にして、上鎖及び下鎖に対応す
るオリゴヌクレオチドを化学合成する。もちろん、その
両末端には発現ベクターへの組込みを考慮して上記の制
限酵素切断部位を設置しておく必要がある。このオリゴ
ヌクレオチド（上鎖及び下鎖）を例えばＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化後アニール化すること
により二本鎖ＤＮＡ断片とする。上記の２種類の制限酵
素で切断したヒトＴＮＦの大部分を含む（Ｎ末部分を欠
失）発現用プラスミドベクター内にこの二本鎖ＤＮＡ断
片を例えばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結して、
目的とするＮ末端近傍のアミノ酸配列を修飾したヒトＴ
ＮＦ転換体の発現ベクターを構築することができる。
前記（１）の場合と同様にして、上鎖及び下鎖に対応す
るオリゴヌクレオチドを化学合成する。もちろん、その
両末端には発現ベクターへの組込みを考慮して上記の制
限酵素切断部位を設置しておく必要がある。このオリゴ
ヌクレオチド（上鎖及び下鎖）を例えばＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化後アニール化すること
により二本鎖ＤＮＡ断片とする。上記の２種類の制限酵
素で切断したヒトＴＮＦの大部分を含む（Ｎ末部分を欠
失）発現用プラスミドベクター内にこの二本鎖ＤＮＡ断
片を例えばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結して、
目的とするＮ末端近傍のアミノ酸配列を修飾したヒトＴ
ＮＦ転換体の発現ベクターを構築することができる。
【００４２】また、変換体又は転換体ポリペプチドをコ
ードする遺伝子内の適当な制限酵素切断部位を利用して
それぞれの発現ベクター間で組換えを行うことにより、
更に新規な変換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクタ
ーを構築することができる。
ードする遺伝子内の適当な制限酵素切断部位を利用して
それぞれの発現ベクター間で組換えを行うことにより、
更に新規な変換体又は転換体ポリペプチドの発現ベクタ
ーを構築することができる。
【００４３】発現ベクターを大腸菌株のような宿主細胞
へ導入することについては、例えば塩化カルシウム法に
より作製した大腸菌株のコンピテントセルを用いる公知
の方法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，（１９８２）〕に
従って行う。宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母な
どの微生物細胞が使用できるが、なかでも大腸菌として
はＪＭ８３、ＪＭ１０３、ＨＢ１０１などのＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２株の変異種が挙げられる。
へ導入することについては、例えば塩化カルシウム法に
より作製した大腸菌株のコンピテントセルを用いる公知
の方法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，（１９８２）〕に
従って行う。宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、酵母な
どの微生物細胞が使用できるが、なかでも大腸菌として
はＪＭ８３、ＪＭ１０３、ＨＢ１０１などのＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２株の変異種が挙げられる。
【００４４】（４）ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドの取
得 本発明においては前記（３）で記載の形質転換された微
生物細胞を培養し、目的のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチ
ドを培養物中に産生、蓄積させて分離する。微生物細胞
、特に大腸菌の培養方法としては従来から知られている
方法、例えば大腸菌が要求する栄養素を含んだ培養液に
大腸菌を接種し、通常３２〜３７℃で約１２〜２４時間
振とう又はかくはんすることにより短時間に大量に培養
する方法が使用できる。培地は例えばＬ培地、Ｍ９培地
、Ｍ９ＣＡ培地など〔前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ参照〕が使用でき、必要に応じてアンピシリ
ンなどの抗生物質を添加したり、転写プロモーターの効
率を高めるために培養開始時あるいは培養中にｌａｃプ
ロモーター及びｔａｃプロモーター使用の際はイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等の薬剤を、ｔ
ｒｐプロモーター使用の際は３−β−インドールアクリ
ル酸等の薬剤を添加することもできる。
得 本発明においては前記（３）で記載の形質転換された微
生物細胞を培養し、目的のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチ
ドを培養物中に産生、蓄積させて分離する。微生物細胞
、特に大腸菌の培養方法としては従来から知られている
方法、例えば大腸菌が要求する栄養素を含んだ培養液に
大腸菌を接種し、通常３２〜３７℃で約１２〜２４時間
振とう又はかくはんすることにより短時間に大量に培養
する方法が使用できる。培地は例えばＬ培地、Ｍ９培地
、Ｍ９ＣＡ培地など〔前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ参照〕が使用でき、必要に応じてアンピシリ
ンなどの抗生物質を添加したり、転写プロモーターの効
率を高めるために培養開始時あるいは培養中にｌａｃプ
ロモーター及びｔａｃプロモーター使用の際はイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等の薬剤を、ｔ
ｒｐプロモーター使用の際は３−β−インドールアクリ
ル酸等の薬剤を添加することもできる。
【００４５】本発明のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドは
培養後、通常、微生物細胞の集合体をトリスバッファー
に懸濁させた状態で超音波処理することにより破砕処理
を施し、遠心分離操作を行い菌体残渣を除去することに
より得られる。更に、かくして得られたものは核酸・エ
ンドトキシン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、その他従来からの蛋白質
の分離精製方法を組合せることにより、一層精製程度を
高めることができる。本発明のヒトＴＮＦ転換体遺伝子
は前述の方法を適宜適用することにより、直接製造した
り、一旦ヒトＴＮＦ遺伝子を作製後製造したり、あるい
はヒトＴＮＦ遺伝子次いでその変換体変異遺伝子を作製
後製造したりすることができる。
培養後、通常、微生物細胞の集合体をトリスバッファー
に懸濁させた状態で超音波処理することにより破砕処理
を施し、遠心分離操作を行い菌体残渣を除去することに
より得られる。更に、かくして得られたものは核酸・エ
ンドトキシン除去剤処理、フィルターによるろ過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、その他従来からの蛋白質
の分離精製方法を組合せることにより、一層精製程度を
高めることができる。本発明のヒトＴＮＦ転換体遺伝子
は前述の方法を適宜適用することにより、直接製造した
り、一旦ヒトＴＮＦ遺伝子を作製後製造したり、あるい
はヒトＴＮＦ遺伝子次いでその変換体変異遺伝子を作製
後製造したりすることができる。
【００４６】本発明のヒトＴＮＦ転換体ポリペプチドは
、ヒトＴＮＦ又はその変換体の持つ抗腫瘍作用と同様の
作用を有し、しかもヒトＴＮＦ又はその変換体に比し同
程度の抗腫瘍活性を示し、一方それらで認められた癌の
転移亢進作用をほとんど示さないことより抗腫瘍剤、医
薬の活性成分として有効である。本発明のヒトＴＮＦ転
換体ポリペプチドとしては、具体的には後述するＦ４２
３６、Ｆ４１４６、Ｆ４４１９、Ｆ４４２２、Ｆ４４２
３、Ｆ４６０３、Ｆ４６０４などが挙げられ、なかでも
Ｆ４２３６、Ｆ４１４６、Ｆ４４１９、Ｆ４６０３が望
ましく、Ｆ４２３６、Ｆ４１４６、Ｆ４４１９がより望
ましい。その医薬組成物の製剤に当っては薬理上許容さ
れる担体又は希釈剤とともに医薬組成物に製剤化するこ
とができる。本発明の医薬組成物の剤型としては、外用
剤、経口投与剤、注射剤などが挙げられ、それぞれの剤
型にあった投与方法で投与される。
、ヒトＴＮＦ又はその変換体の持つ抗腫瘍作用と同様の
作用を有し、しかもヒトＴＮＦ又はその変換体に比し同
程度の抗腫瘍活性を示し、一方それらで認められた癌の
転移亢進作用をほとんど示さないことより抗腫瘍剤、医
薬の活性成分として有効である。本発明のヒトＴＮＦ転
換体ポリペプチドとしては、具体的には後述するＦ４２
３６、Ｆ４１４６、Ｆ４４１９、Ｆ４４２２、Ｆ４４２
３、Ｆ４６０３、Ｆ４６０４などが挙げられ、なかでも
Ｆ４２３６、Ｆ４１４６、Ｆ４４１９、Ｆ４６０３が望
ましく、Ｆ４２３６、Ｆ４１４６、Ｆ４４１９がより望
ましい。その医薬組成物の製剤に当っては薬理上許容さ
れる担体又は希釈剤とともに医薬組成物に製剤化するこ
とができる。本発明の医薬組成物の剤型としては、外用
剤、経口投与剤、注射剤などが挙げられ、それぞれの剤
型にあった投与方法で投与される。
【００４７】
【実施例】実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子のデザイン）既
に報告されている〔Ｐｅｎｎｉｃａら、前出〕ヒトＴＮ
Ｆ構造遺伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトＴＮＦ遺伝子
の塩基配列について遺伝子構築及び変換体作製の便宜上
、配列表の配列番号７のＤＮＡ鎖次にコーディング４７
４Ｕ鎖及びコンプリメンタリー配列鎖４７４Ｌ鎖のＤＮ
Ａ二本鎖、更にそれを若干調整したＤＮＡ二本鎖の塩基
配列をデザインした。ここでは適当な間隔で制限酵素切
断部位を組込み、またプラスミドベクターと容易に連結
できるように翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流に制限酵
素ＥｃｏＲ Ｉによる切断部位を、翻訳終止コドン（
ＴＡＡ及びＴＧＡ）の下流には制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩによる切断部位をそれぞれ設けた。
に報告されている〔Ｐｅｎｎｉｃａら、前出〕ヒトＴＮ
Ｆ構造遺伝子のアミノ酸配列を基に、ヒトＴＮＦ遺伝子
の塩基配列について遺伝子構築及び変換体作製の便宜上
、配列表の配列番号７のＤＮＡ鎖次にコーディング４７
４Ｕ鎖及びコンプリメンタリー配列鎖４７４Ｌ鎖のＤＮ
Ａ二本鎖、更にそれを若干調整したＤＮＡ二本鎖の塩基
配列をデザインした。ここでは適当な間隔で制限酵素切
断部位を組込み、またプラスミドベクターと容易に連結
できるように翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流に制限酵
素ＥｃｏＲ Ｉによる切断部位を、翻訳終止コドン（
ＴＡＡ及びＴＧＡ）の下流には制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩによる切断部位をそれぞれ設けた。
【００４８】実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成
） 前記実施例１でデザインされたＤＮＡは、自動ＤＮＡ合
成機（アプライド・バイオシステムズ，モデル３８１Ａ
）を用いて、ホスファイト法にて化学合成した。合成は
前述した塩基配列を有するＵ−１〜１０及びＬ−１〜１
０の２０本のオリゴヌクレオチドに分割して行った。
） 前記実施例１でデザインされたＤＮＡは、自動ＤＮＡ合
成機（アプライド・バイオシステムズ，モデル３８１Ａ
）を用いて、ホスファイト法にて化学合成した。合成は
前述した塩基配列を有するＵ−１〜１０及びＬ−１〜１
０の２０本のオリゴヌクレオチドに分割して行った。
【００４９】これらオリゴヌクレオチドを、配列表の配
列番号７のＤＮＡ鎖に基づいて以下に説明する。 名 前 塩基数
内 容Ｕ−１
２７ 配列番号７の１番目のＴから１９
番目のＡまでの配列を有
し、しかも１番目のＴに対し上流方向に５
′−ＡＴＧ−３
′更に５′−ＡＡＴＴＣ−３′を接続した配列を有
する。 Ｕ−２ ５０ 配列番号７の２０番目
のＧから６９番目のＧまでの配列を
有する。 Ｕ−３ ４９ 配列番号７の７０番目
のＣから１１８番目のＧまでの配列
を有する。 Ｕ−４ ５０ 配列番号７の１１９番
目のＡから１６８番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−５ ５０ 配列番号７の１６９番
目のＴから２１８番目のＴまでの配
列を有する。 Ｕ−６ ５２ 配列番号７の２１９番
目のＣから２７０番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−７ ４８ 配列番号７の２７１番
目のＣから３１８番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−８ ４９ 配列番号７の３１９番
目のＧから３６７番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−９ ５１ 配列番号７の３６８番
目のＡから４１８番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−１０ ５３ 配列番号７の４１９番目
のＴから４６５番目のＧまでの
配列を有し、更に下流方向に５′−
ＴＡＡＴＧＡ−３′を
有する。
列番号７のＤＮＡ鎖に基づいて以下に説明する。 名 前 塩基数
内 容Ｕ−１
２７ 配列番号７の１番目のＴから１９
番目のＡまでの配列を有
し、しかも１番目のＴに対し上流方向に５
′−ＡＴＧ−３
′更に５′−ＡＡＴＴＣ−３′を接続した配列を有
する。 Ｕ−２ ５０ 配列番号７の２０番目
のＧから６９番目のＧまでの配列を
有する。 Ｕ−３ ４９ 配列番号７の７０番目
のＣから１１８番目のＧまでの配列
を有する。 Ｕ−４ ５０ 配列番号７の１１９番
目のＡから１６８番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−５ ５０ 配列番号７の１６９番
目のＴから２１８番目のＴまでの配
列を有する。 Ｕ−６ ５２ 配列番号７の２１９番
目のＣから２７０番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−７ ４８ 配列番号７の２７１番
目のＣから３１８番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−８ ４９ 配列番号７の３１９番
目のＧから３６７番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−９ ５１ 配列番号７の３６８番
目のＡから４１８番目のＣまでの配
列を有する。 Ｕ−１０ ５３ 配列番号７の４１９番目
のＴから４６５番目のＧまでの
配列を有し、更に下流方向に５′−
ＴＡＡＴＧＡ−３′を
有する。
【００５０】配列番号７のＤＮＡ鎖に対応した下鎖（コ
ンプリメンタリー配列鎖）を配列番号７に基づいて説明
するが、下鎖の流れ方向の説明、即ち上流、下流、５′
−及び３′−は上鎖のそれと全く逆になる。 名 前 塩基数
内 容Ｌ一１
２９ 配列番号７の２５番目のＡから１
番目のＴまでの配列に相
補した配列を有し、しかも１番目のＴに相
補するＡに対し
、下流方向に５′−ＣＡＴＧ−３′を接続した配列
を有す る。 Ｌ−２ ５２ 配列番号７の７７番目
のＧから２６番目のＡまでの配列に
相補した配列を有する。 Ｌ−３ ５０ 配列番号７の１２７番
目のＧから７８番目のＧまでの配列
に相補した配列を有する。 Ｌ−４ ５０ 配列番号７の１７７番
目のＧから１２８番目のＡまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−５ ４９ 配列番号７の２２６番
目のＣから１７８番目のＧまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−６ ４９ 配列番号７の２７５番
目のＴから２２７番目のＡまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−７ ５１ 配列番号７の３２６番
目のＣから２７６番目のＣまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−８ ４９ 配列番号７の３７５番
目のＧから３２７番目のＣまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−９ ５１ 配列番号７の４２６番
目のＴから３７６番目のＡまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−１０ ４９ 配列番号７の４６５
番目のＧから４２７番目のＧまでの
配列に相補した配列を有し、し
かも４６５番目のＧに相補
するＣに対し、上流方向に５′ーＴＣＡ
ＴＴＡ−３′更に
５′−ＡＧＣＴ−３′を接続した配列を有する。
ンプリメンタリー配列鎖）を配列番号７に基づいて説明
するが、下鎖の流れ方向の説明、即ち上流、下流、５′
−及び３′−は上鎖のそれと全く逆になる。 名 前 塩基数
内 容Ｌ一１
２９ 配列番号７の２５番目のＡから１
番目のＴまでの配列に相
補した配列を有し、しかも１番目のＴに相
補するＡに対し
、下流方向に５′−ＣＡＴＧ−３′を接続した配列
を有す る。 Ｌ−２ ５２ 配列番号７の７７番目
のＧから２６番目のＡまでの配列に
相補した配列を有する。 Ｌ−３ ５０ 配列番号７の１２７番
目のＧから７８番目のＧまでの配列
に相補した配列を有する。 Ｌ−４ ５０ 配列番号７の１７７番
目のＧから１２８番目のＡまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−５ ４９ 配列番号７の２２６番
目のＣから１７８番目のＧまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−６ ４９ 配列番号７の２７５番
目のＴから２２７番目のＡまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−７ ５１ 配列番号７の３２６番
目のＣから２７６番目のＣまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−８ ４９ 配列番号７の３７５番
目のＧから３２７番目のＣまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−９ ５１ 配列番号７の４２６番
目のＴから３７６番目のＡまでの配
列に相補した配列を有する。 Ｌ−１０ ４９ 配列番号７の４６５
番目のＧから４２７番目のＧまでの
配列に相補した配列を有し、し
かも４６５番目のＧに相補
するＣに対し、上流方向に５′ーＴＣＡ
ＴＴＡ−３′更に
５′−ＡＧＣＴ−３′を接続した配列を有する。
【００５１】合成されたオリゴヌクレオチドのＣＰＧ樹
脂（フナコシ社販売）からの切り出し及び保護基脱離は
、アプライド・バイオシステムズ社のマニュアルに従っ
た。各オリゴヌクレオチドの分離精製は逆相クロマトカ
ラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）
又は７Ｍウレアを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度１０〜２０％）により行った。
脂（フナコシ社販売）からの切り出し及び保護基脱離は
、アプライド・バイオシステムズ社のマニュアルに従っ
た。各オリゴヌクレオチドの分離精製は逆相クロマトカ
ラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）
又は７Ｍウレアを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度１０〜２０％）により行った。
【００５２】ＨＰＬＣ法については、ヌクレオジル５Ｃ
１８カラム（φ４．６×１５０ｍｍ：ケムコ社販売）を
用いた逆相クロマトグラフィーによって、アセトニトリ
ルを含むトリエチルアミノ酢酸（１００ｍＭ）バッファ
ー（ｐＨ７．０）で溶出することにより分離精製した。 上記溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配を５〜３５
％（３０分）とし、約１５分のピークを回収した。
１８カラム（φ４．６×１５０ｍｍ：ケムコ社販売）を
用いた逆相クロマトグラフィーによって、アセトニトリ
ルを含むトリエチルアミノ酢酸（１００ｍＭ）バッファ
ー（ｐＨ７．０）で溶出することにより分離精製した。 上記溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配を５〜３５
％（３０分）とし、約１５分のピークを回収した。
【００５３】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に関し
ては、各合成オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により
分離し、紫外線シャドウイング法による泳動パターンの
観察結果より目的の大きさのバンド部分を切り出し、そ
のポリアクリルアミドゲル断片を約１〜２ｍｍ３の大き
さに切り刻み、約２ｍｌの溶出バッファー（０．５ＭＮ
Ｈ４ＯＡｃ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、３７℃で
一晩振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッ
ファーを回収し、フェノール抽出（５０％フェノール／
５０％クロロホルム溶液使用）、イソブタノール抽出を
行い、エタノール沈殿操作により各オリゴヌクレオチド
の精製試料とした。
ては、各合成オリゴヌクレオチド試料を電気泳動により
分離し、紫外線シャドウイング法による泳動パターンの
観察結果より目的の大きさのバンド部分を切り出し、そ
のポリアクリルアミドゲル断片を約１〜２ｍｍ３の大き
さに切り刻み、約２ｍｌの溶出バッファー（０．５ＭＮ
Ｈ４ＯＡｃ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、３７℃で
一晩振とうした。各オリゴヌクレオチドを含む溶出バッ
ファーを回収し、フェノール抽出（５０％フェノール／
５０％クロロホルム溶液使用）、イソブタノール抽出を
行い、エタノール沈殿操作により各オリゴヌクレオチド
の精製試料とした。
【００５４】合成・精製したオリゴヌクレオチドの一部
について、マキサム・ギルバード法〔Ａ．Ｍ．Ｍａｘａ
ｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５ ４９９（１９８０）〕によ
り、目的の塩基配列を有していることを確認した。
について、マキサム・ギルバード法〔Ａ．Ｍ．Ｍａｘａ
ｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５ ４９９（１９８０）〕によ
り、目的の塩基配列を有していることを確認した。
【００５５】以下（実施例３、４、５、６、７、８、９
、１０及び１１）の遺伝子組換えに係わる操作において
、制限酵素及び他の関連酵素の反応条件等は、主にＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）記載の方法
に準じた。なお、上記酵素等は主に宝酒造より入手して
おり、宝酒造のマニュアルも参考にした。
、１０及び１１）の遺伝子組換えに係わる操作において
、制限酵素及び他の関連酵素の反応条件等は、主にＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）記載の方法
に準じた。なお、上記酵素等は主に宝酒造より入手して
おり、宝酒造のマニュアルも参考にした。
【００５６】実施例３（合成オリゴヌクレオチドの連結
によるヒトＴＮＦ遺伝子の構築） （１）まず図１に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構築を試み
た。前記実施例２で得られた合成オリゴヌクレオチドを
３つのグループ（Ｕ及びＬ−１〜４、Ｕ及びＬ−５〜７
並びにＵ及びＬ−８〜１０）に分けてクローニングを行
った。すなわち、Ｕ−２、３、４、６、７、９及び１０
並びにＬ−１、２、３、５、６、８及び９の各オリゴヌ
クレオチド（１〜２μｇ）の５′末端を２〜５ユニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いて、
それぞれ別々にリン酸化した。リン酸化反応は１０μｌ
の水溶液中（５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．６、１０
ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＡＴＰ）
、３７℃で１時間行い、反応終了後、７０℃で１０分間
処理することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失
活させた。新たに、１〜２μｇのＵ−１、５及び８並び
にＬ−４、７及び１０の各オリゴヌクレオチドをそれぞ
れ別々に含む上記と同組成の水溶液１０μｌを用意し、
それぞれＵ及びＬの同じ番号同士で各オリゴヌクレオチ
ド（Ｕ−１〜１０及びＬ−１〜１０）水溶液を混合し（
２０μｌ）、１００℃で５分間煮沸後徐冷することによ
りアニール化した。次に、得られた１０本のアニーリン
グ体（二本鎖ＤＮＡ断片）を、各グループごとに連結反
応のための水溶液（６６ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７
．６、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ
、１ｍＭＡＴＰ及び１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に添
加し（総液量１２０〜１６０μｌ）、４０℃に加温後徐
冷によるアニール化の後、７００ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造）を加えて、１６℃で１５時間連結反
応を行った。
によるヒトＴＮＦ遺伝子の構築） （１）まず図１に従ってヒトＴＮＦ遺伝子の構築を試み
た。前記実施例２で得られた合成オリゴヌクレオチドを
３つのグループ（Ｕ及びＬ−１〜４、Ｕ及びＬ−５〜７
並びにＵ及びＬ−８〜１０）に分けてクローニングを行
った。すなわち、Ｕ−２、３、４、６、７、９及び１０
並びにＬ−１、２、３、５、６、８及び９の各オリゴヌ
クレオチド（１〜２μｇ）の５′末端を２〜５ユニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いて、
それぞれ別々にリン酸化した。リン酸化反応は１０μｌ
の水溶液中（５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．６、１０
ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＡＴＰ）
、３７℃で１時間行い、反応終了後、７０℃で１０分間
処理することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失
活させた。新たに、１〜２μｇのＵ−１、５及び８並び
にＬ−４、７及び１０の各オリゴヌクレオチドをそれぞ
れ別々に含む上記と同組成の水溶液１０μｌを用意し、
それぞれＵ及びＬの同じ番号同士で各オリゴヌクレオチ
ド（Ｕ−１〜１０及びＬ−１〜１０）水溶液を混合し（
２０μｌ）、１００℃で５分間煮沸後徐冷することによ
りアニール化した。次に、得られた１０本のアニーリン
グ体（二本鎖ＤＮＡ断片）を、各グループごとに連結反
応のための水溶液（６６ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７
．６、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ
、１ｍＭＡＴＰ及び１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に添
加し（総液量１２０〜１６０μｌ）、４０℃に加温後徐
冷によるアニール化の後、７００ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造）を加えて、１６℃で１５時間連結反
応を行った。
【００５７】反応終了後、各反応液をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）により分離し、エチジ
ウムブロマイド染色法による泳動パターンの観察結果よ
り目的の大きさ（１７６ｂｐ、１５０ｂｐ及び１５３ｂ
ｐ）のバンド部分を切り出し、エレクトロ・エリューシ
ョン法により目的とする３本のＤＮＡ断片を回収した。 更に、回収した各試料に対してフェノール抽出（５０％
フェノール／５０％クロロホルム溶液使用）、イソブタ
ノール抽出を行い、エタノール沈殿操作により目的のＤ
ＮＡを精製した。上記方法に準じて、精製した３本の二
本鎖ＤＮＡ断片をそれぞれ別々にその５′末端をＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、連結反応
のための水溶液中にて混合の後、４０℃の加温によりア
ニール化を行い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加えて連結した
。エタノール沈殿操作によりこの連結ＤＮＡを回収し、
１ｍＭ ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌＢＳＡを含む５
０μｌのハイ・ソルトバッファー（５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２）に溶解させ、１５ユニットの制限酵
素ＥｃｏＲ Ｉ（宝酒造）及び１５ユニットの制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で
２時間切断反応を行った。反応終了後、上記方法に準じ
て、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度４％）
により目的とするＤＮＡ断片（約４８０ｂｐ）を分離精
製した。
ドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）により分離し、エチジ
ウムブロマイド染色法による泳動パターンの観察結果よ
り目的の大きさ（１７６ｂｐ、１５０ｂｐ及び１５３ｂ
ｐ）のバンド部分を切り出し、エレクトロ・エリューシ
ョン法により目的とする３本のＤＮＡ断片を回収した。 更に、回収した各試料に対してフェノール抽出（５０％
フェノール／５０％クロロホルム溶液使用）、イソブタ
ノール抽出を行い、エタノール沈殿操作により目的のＤ
ＮＡを精製した。上記方法に準じて、精製した３本の二
本鎖ＤＮＡ断片をそれぞれ別々にその５′末端をＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、連結反応
のための水溶液中にて混合の後、４０℃の加温によりア
ニール化を行い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加えて連結した
。エタノール沈殿操作によりこの連結ＤＮＡを回収し、
１ｍＭ ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌＢＳＡを含む５
０μｌのハイ・ソルトバッファー（５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２）に溶解させ、１５ユニットの制限酵
素ＥｃｏＲ Ｉ（宝酒造）及び１５ユニットの制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で
２時間切断反応を行った。反応終了後、上記方法に準じ
て、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度４％）
により目的とするＤＮＡ断片（約４８０ｂｐ）を分離精
製した。
【００５８】一方、プラスミドベクターｐＵＣ９（九州
大学遺伝情報実験施設より分与）の５μｇを、前記の方
法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）
により約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。先
に精製した約４８０ｂｐのＤＮＡ断片（ヒトＴＮＦ遺伝
子を含む）とこのｐＵＣ９断片を、前記の方法に準じて
、２０μｌの連結反応液中にて混合し、３５０ユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で３時間連結反
応を行った。塩化カルシウム法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕により作製したＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ８３株（九州大学遺伝情報実験施設
により分与）のコンピテントセルを、上記連結反応液に
より常法に従って形質転換した〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕。
大学遺伝情報実験施設より分与）の５μｇを、前記の方
法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）
により約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。先
に精製した約４８０ｂｐのＤＮＡ断片（ヒトＴＮＦ遺伝
子を含む）とこのｐＵＣ９断片を、前記の方法に準じて
、２０μｌの連結反応液中にて混合し、３５０ユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で３時間連結反
応を行った。塩化カルシウム法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕により作製したＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ８３株（九州大学遺伝情報実験施設
により分与）のコンピテントセルを、上記連結反応液に
より常法に従って形質転換した〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ参照〕。
【００５９】得られたアンピシリン耐性クローンより、
公知の方法を用いてプラスミドを調製し、前記の方法に
準じて、制限酵素（ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ）処理後、アガロースゲル電気泳動によりその泳動
パターンを解析することにより、ヒトＴＮＦ遺伝子のｐ
ＵＣ９ベクターへの挿入を調べた。その結果、約２５０
ｂｐの遺伝子の挿入が確認でき、そのクローンについて
挿入された遺伝子の塩基配列をジデオキシ法〔Ｆ．Ｓａ
ｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４， １２０５（１
９８１）〕により調べたところ、ＥｃｏＲ Ｉ部位か
ら下流に約１３０ｂｐとＨｉｎｄ ＩＩＩ部位から上
流に約９０ｂｐの目的とするヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配
列を有する遺伝子断片であることが確認された。このク
ローン及びプラスミドをそれぞれｐＵＡ４１／ＪＭ８３
及びｐＵＡ４１と命名した。
公知の方法を用いてプラスミドを調製し、前記の方法に
準じて、制限酵素（ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ）処理後、アガロースゲル電気泳動によりその泳動
パターンを解析することにより、ヒトＴＮＦ遺伝子のｐ
ＵＣ９ベクターへの挿入を調べた。その結果、約２５０
ｂｐの遺伝子の挿入が確認でき、そのクローンについて
挿入された遺伝子の塩基配列をジデオキシ法〔Ｆ．Ｓａ
ｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４， １２０５（１
９８１）〕により調べたところ、ＥｃｏＲ Ｉ部位か
ら下流に約１３０ｂｐとＨｉｎｄ ＩＩＩ部位から上
流に約９０ｂｐの目的とするヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配
列を有する遺伝子断片であることが確認された。このク
ローン及びプラスミドをそれぞれｐＵＡ４１／ＪＭ８３
及びｐＵＡ４１と命名した。
【００６０】（２）引き続き、図２に従ってヒトＴＮＦ
遺伝子の構築を試みた。前記（１）工程でのクローニン
グでヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列において未達成な領域
周辺を２つのグループ（Ｕ及びＬ−３〜６並びにＵ及び
Ｌ−６〜９）に分け、前記（１）工程と同様にして、各
オリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニール化した後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。前記方法に準じて
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）に
より分離精製し、得られた２本のＤＮＡ断片（２０１ｂ
ｐ及び２００ｂｐ）をそれぞれ別々に１００μｌの６７
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．７μ
Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ及び各３３０μＭデオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸など（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＴＴＰ）
水溶液にて溶解し、２〜５ユニットのＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ（宝酒造）を添加し、３７℃で３０分間反応する
ことによりＤＮＡ断片の両末端を平滑化した。反応終了
後、６８℃で１０分間処理することによりＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼを失活させ、エタノール沈殿により目的の２
本のＤＮＡ断片を回収した。
遺伝子の構築を試みた。前記（１）工程でのクローニン
グでヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列において未達成な領域
周辺を２つのグループ（Ｕ及びＬ−３〜６並びにＵ及び
Ｌ−６〜９）に分け、前記（１）工程と同様にして、各
オリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニール化した後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。前記方法に準じて
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）に
より分離精製し、得られた２本のＤＮＡ断片（２０１ｂ
ｐ及び２００ｂｐ）をそれぞれ別々に１００μｌの６７
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．７μ
Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ及び各３３０μＭデオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸など（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＴＴＰ）
水溶液にて溶解し、２〜５ユニットのＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ（宝酒造）を添加し、３７℃で３０分間反応する
ことによりＤＮＡ断片の両末端を平滑化した。反応終了
後、６８℃で１０分間処理することによりＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼを失活させ、エタノール沈殿により目的の２
本のＤＮＡ断片を回収した。
【００６１】一方、５μｇのｐＵＣ９ベクターを１ｍＭ
ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む５０
μｌのミディアム・ソルトバッファー（１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２）に溶解させ、１５ユニットの制限
酵素ＨｉｎｃＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で２時間
の反応後、エタノール沈殿により回収した。得られた切
断・開環したｐＵＣ９ベクターに、先に平滑化後回収し
た２本のＤＮＡ断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じ
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて組込み、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ＪＭ８３株を形質転換した。得られたそれぞれ
のクローンについて、前記（１）工程と同様にして、挿
入されたＤＮＡの塩基配列を調べ、目的の塩基配列であ
ることを確認した。これらのクローンをそれぞれｐＵＡ
４２／ＪＭ８３及びｐＵＡ４３／ＪＭ８３と命名し、プ
ラスミドをｐＵＡ４２及びｐＵＡ４３と命名した。
ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む５０
μｌのミディアム・ソルトバッファー（１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２）に溶解させ、１５ユニットの制限
酵素ＨｉｎｃＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で２時間
の反応後、エタノール沈殿により回収した。得られた切
断・開環したｐＵＣ９ベクターに、先に平滑化後回収し
た２本のＤＮＡ断片をそれぞれ別々に、前記方法に準じ
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて組込み、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ＪＭ８３株を形質転換した。得られたそれぞれ
のクローンについて、前記（１）工程と同様にして、挿
入されたＤＮＡの塩基配列を調べ、目的の塩基配列であ
ることを確認した。これらのクローンをそれぞれｐＵＡ
４２／ＪＭ８３及びｐＵＡ４３／ＪＭ８３と命名し、プ
ラスミドをｐＵＡ４２及びｐＵＡ４３と命名した。
【００６２】上記（１）工程で得られたｐＵＡ４１を制
限酵素ＥｃｏＲ Ｉ（ハイ・ソルトバッファー）及び
Ｓａｃ Ｉ（宝酒造：ロウ・ソルトバッファー）、制
限酵素Ｈａｅ ＩＩ（宝酒造）及びＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ（ミディアム・ソルトバッファー）で、上記（２）工
程で得られたｐＵＡ４２を制限酵素Ｓａｃ Ｉ（ロウ
・ソルトバッファー）及びＨｐａ Ｉ（宝酒造：ＫＣ
ｌバッファー）で並びにｐＵＡ４３を制限酵素Ｈｐａ
Ｉ及びＨａｅ ＩＩ（ＫＣｌバッファー）で、前記
方法に準じて、それぞれ切断した。ロウ・ソルトバッフ
ァー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５及び１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２）とハイ・ソルトバッファー又はＫＣｌ
バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５、
１００ｍＭ ＫＣｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）の
組合せについては、切断反応を２回に分け、反応の間に
エタノール沈殿操作を行うことにより対応した。ｐＵＡ
４１からのＥｃｏＲ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ ＤＮＡ断
片（１２７ｂｐ）及びＨａｅ ＩＩ−Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩＤＮＡ断片（８０ｂｐ）、ｐＵＡ４２からのＳａｃ
Ｉ−ＨｐａＩ ＤＮＡ断片（１４７ｂｐ）並びに
ｐＵＡ４３からのＨｐａ Ｉ−Ｈａｅ ＩＩ Ｄ
ＮＡ断片（１２６ｂｐ）を、前記方法に準じて、それぞ
れポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）に
より分離精製した。
限酵素ＥｃｏＲ Ｉ（ハイ・ソルトバッファー）及び
Ｓａｃ Ｉ（宝酒造：ロウ・ソルトバッファー）、制
限酵素Ｈａｅ ＩＩ（宝酒造）及びＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ（ミディアム・ソルトバッファー）で、上記（２）工
程で得られたｐＵＡ４２を制限酵素Ｓａｃ Ｉ（ロウ
・ソルトバッファー）及びＨｐａ Ｉ（宝酒造：ＫＣ
ｌバッファー）で並びにｐＵＡ４３を制限酵素Ｈｐａ
Ｉ及びＨａｅ ＩＩ（ＫＣｌバッファー）で、前記
方法に準じて、それぞれ切断した。ロウ・ソルトバッフ
ァー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５及び１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２）とハイ・ソルトバッファー又はＫＣｌ
バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５、
１００ｍＭ ＫＣｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）の
組合せについては、切断反応を２回に分け、反応の間に
エタノール沈殿操作を行うことにより対応した。ｐＵＡ
４１からのＥｃｏＲ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ ＤＮＡ断
片（１２７ｂｐ）及びＨａｅ ＩＩ−Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩＤＮＡ断片（８０ｂｐ）、ｐＵＡ４２からのＳａｃ
Ｉ−ＨｐａＩ ＤＮＡ断片（１４７ｂｐ）並びに
ｐＵＡ４３からのＨｐａ Ｉ−Ｈａｅ ＩＩ Ｄ
ＮＡ断片（１２６ｂｐ）を、前記方法に準じて、それぞ
れポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度６％）に
より分離精製した。
【００６３】一方、５μｇのｐＵＣ１９プラスミドベク
ター（九州大学遺伝情報実験施設より分与）を、前記の
方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製し
た。 先に精製した４本のＤＮＡ断片を図示（図２）したよう
に順次添加し、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結して行き、最後に上記の精製ｐＵＣ１９ベ
クター（約２．７Ｋｂｐ断片）に組込み、ＪＭ８３株を
形質転換した。この形質転換体に含まれるプラスミドに
ついて、前記方法に準じて、挿入された遺伝子の塩基配
列を調べたところ、目的とする完全長（約４８０ｂｐ）
のヒトＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドベクター（約３．
２Ｋｂｐ）を有するクローンであることが確認できた。 このクローンをｐＵＡ４４／ＪＭ８３と命名し、プラス
ミドをｐＵＡ４４と命名した。
ター（九州大学遺伝情報実験施設より分与）を、前記の
方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製し
た。 先に精製した４本のＤＮＡ断片を図示（図２）したよう
に順次添加し、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結して行き、最後に上記の精製ｐＵＣ１９ベ
クター（約２．７Ｋｂｐ断片）に組込み、ＪＭ８３株を
形質転換した。この形質転換体に含まれるプラスミドに
ついて、前記方法に準じて、挿入された遺伝子の塩基配
列を調べたところ、目的とする完全長（約４８０ｂｐ）
のヒトＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドベクター（約３．
２Ｋｂｐ）を有するクローンであることが確認できた。 このクローンをｐＵＡ４４／ＪＭ８３と命名し、プラス
ミドをｐＵＡ４４と命名した。
【００６４】実施例４（ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築
） （１）大腸菌ｔａｃプロモーターを有する発現ベクター
ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社より入手）をより扱
いやすくする目的で以下の改良を試みた。 ｉ）発現ベクターを低分子量化する。 ｉｉ）制限酵素ＢａｍＨ Ｉの切断部位を唯一とする
。 ｉｉｉ）ｔａｃプロモーターの方向をアンピシリン耐性
遺伝子の方向と逆向きにする。
） （１）大腸菌ｔａｃプロモーターを有する発現ベクター
ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社より入手）をより扱
いやすくする目的で以下の改良を試みた。 ｉ）発現ベクターを低分子量化する。 ｉｉ）制限酵素ＢａｍＨ Ｉの切断部位を唯一とする
。 ｉｉｉ）ｔａｃプロモーターの方向をアンピシリン耐性
遺伝子の方向と逆向きにする。
【００６５】図３にその方法を図示した。プラスミドベ
クターｐＢＲ３２２（九州大学遺伝情報実験施設より分
与）の５μｇを、実施例３の方法に準じて、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断後、その両
末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。実
施例３の方法に準じて、アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度１％）により約４．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精
製し、その開環部位に１００ｎｇのノンフォスフォリレ
ーテッドＢｇｌ ＩＩリンカー（制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩ切断部位を含む１０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片：カタ
ログＮｏ．４７２１ Ａタカラ・バイオテクノロジー
・カタログ１９９１ Ｖｏｌ．１、宝酒造より入手）
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結した。前記実施
例３の方法に準じて得た形質転換体の中より、そのプラ
スミドについて制限酵素による切断の可否を調べること
により、目的の制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位を欠き、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ切断
部位を新生したプラスミドｐＢＲ９３３３（約４．４Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを得た。
クターｐＢＲ３２２（九州大学遺伝情報実験施設より分
与）の５μｇを、実施例３の方法に準じて、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断後、その両
末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。実
施例３の方法に準じて、アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度１％）により約４．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精
製し、その開環部位に１００ｎｇのノンフォスフォリレ
ーテッドＢｇｌ ＩＩリンカー（制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩ切断部位を含む１０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片：カタ
ログＮｏ．４７２１ Ａタカラ・バイオテクノロジー
・カタログ１９９１ Ｖｏｌ．１、宝酒造より入手）
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入連結した。前記実施
例３の方法に準じて得た形質転換体の中より、そのプラ
スミドについて制限酵素による切断の可否を調べること
により、目的の制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位を欠き、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ切断
部位を新生したプラスミドｐＢＲ９３３３（約４．４Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを得た。
【００６６】上記で得たプラスミドｐＢＲ９３３３の５
μｇを、実施例３の方法に準じて、ハイ・ソルトバッフ
ァーに溶解し、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ（宝酒造）及び
ＰｖｕＩＩ（宝酒造）で切断し、複製起点を含む約２．
３ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度１％）により分離精製した。一方、発現ベクターｐ
ＫＫ２２３−３（約４．６Ｋｂｐ）の５μｇを上記の場
合と同様、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
ＢａｍＨ Ｉ（宝酒造）及びＳｃａ Ｉ（宝酒造）
で切断した。制限酵素ＢａｍＨ Ｉによる切断反応は
、添加酵素量を通常の約１／２とし、反応時間を５〜３
０分間とする部分切断により行った。切断処理後、ｔａ
ｃプロモーター及びｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター等
を含む約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を上記の場合と同様
、アガロースゲル電気泳動により分離精製した。先に精
製した複製起点を含む約２．３ＫｂｐのＤＮＡ断片に上
記の約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を前記に準じてＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて挿入連結し、実施例３の方法に準
じて、塩化カルシウム法により作製したＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株（九州大学遺伝情報実験施
設）のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的とするｔａｃプロモーター等を含む発
現ベクター（約３．４Ｋｂｐ）を有するクローンを選択
し、この発現ベクターをｐＫＫ１０１と命名した。
μｇを、実施例３の方法に準じて、ハイ・ソルトバッフ
ァーに溶解し、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ（宝酒造）及び
ＰｖｕＩＩ（宝酒造）で切断し、複製起点を含む約２．
３ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度１％）により分離精製した。一方、発現ベクターｐ
ＫＫ２２３−３（約４．６Ｋｂｐ）の５μｇを上記の場
合と同様、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
ＢａｍＨ Ｉ（宝酒造）及びＳｃａ Ｉ（宝酒造）
で切断した。制限酵素ＢａｍＨ Ｉによる切断反応は
、添加酵素量を通常の約１／２とし、反応時間を５〜３
０分間とする部分切断により行った。切断処理後、ｔａ
ｃプロモーター及びｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター等
を含む約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を上記の場合と同様
、アガロースゲル電気泳動により分離精製した。先に精
製した複製起点を含む約２．３ＫｂｐのＤＮＡ断片に上
記の約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を前記に準じてＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて挿入連結し、実施例３の方法に準
じて、塩化カルシウム法により作製したＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株（九州大学遺伝情報実験施
設）のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換
体の中より、目的とするｔａｃプロモーター等を含む発
現ベクター（約３．４Ｋｂｐ）を有するクローンを選択
し、この発現ベクターをｐＫＫ１０１と命名した。
【００６７】（２）図４に従って、次の工程を説明する
。前記（１）工程で得た発現ベクターｐＫＫ１０１の５
μｇを、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及
びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調節
領域等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製した。ま
た、前記実施例３で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＵＡ４４（約３．２Ｋｂｐ）を、同様にして
、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切
断し、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂｐのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した。 このヒトＴＮＦ遺伝子全域を含むＤＮＡ断片を、先に発
現ベクターｐＫＫ１０１より精製した約３．４Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片に、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて挿入連結し、前記の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株に導入した。得られた形
質転換体の中より目的のヒトＴＮＦ発現ベクター（約３
．９Ｋｂｐ）を有するクローンを選択し、この発現ベク
ターをｐＫＦ４１０２と命名した。
。前記（１）工程で得た発現ベクターｐＫＫ１０１の５
μｇを、前記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及
びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調節
領域等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製した。ま
た、前記実施例３で得られたヒトＴＮＦ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＵＡ４４（約３．２Ｋｂｐ）を、同様にして
、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切
断し、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂｐのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した。 このヒトＴＮＦ遺伝子全域を含むＤＮＡ断片を、先に発
現ベクターｐＫＫ１０１より精製した約３．４Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片に、前記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて挿入連結し、前記の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株に導入した。得られた形
質転換体の中より目的のヒトＴＮＦ発現ベクター（約３
．９Ｋｂｐ）を有するクローンを選択し、この発現ベク
ターをｐＫＦ４１０２と命名した。
【００６８】実施例５（プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４
１０４の構築） （１）図５に従って説明する。前記実施例３で得られた
プラスミドｐＵＡ４４を、前記方法に準じ、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子（全域を含む約４８０ｂｐ）のＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、Ｍ
ｅｓｓｉｎｇら〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，１５３，３（１９８７）〕によって開発
された一本鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクタ
ーｐＵＣ１１９（宝酒造より入手）を、同様にして、制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｉ
Ｇ領域を含む約３．２ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離精製した。このＩＧ領域（Ｍ１
３ファージＤＮＡのｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉ
ｏｎ）の存在により、プラスミドｐＵＣ１１９は、ヘル
パーファージＭ１３Ｋ０７感染後優先的に一本鎖ＤＮＡ
となりファージ粒子に包み込まれ菌体外に放出される。 上記で精製したヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂ
ｐのＤＮＡ断片とＩＧ領域を含む約３．２ＫｂｐのｐＵ
Ｃ１１９断片を前記に準じてＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結し、前記実施例３の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ８３株に導入した。得られた形質転
換体の中より、目的のプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を
有するクローンを選択し、このクローンをｐＵＣ１１９
−ｈＴＮＦ／ＪＭ８３と命名し、プラスミドをｐＵＣ１
１９−ｈＴＮＦと命名した。
１０４の構築） （１）図５に従って説明する。前記実施例３で得られた
プラスミドｐＵＡ４４を、前記方法に準じ、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子（全域を含む約４８０ｂｐ）のＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、Ｍ
ｅｓｓｉｎｇら〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，１５３，３（１９８７）〕によって開発
された一本鎖プラスミドＤＮＡ調製用プラスミドベクタ
ーｐＵＣ１１９（宝酒造より入手）を、同様にして、制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｉ
Ｇ領域を含む約３．２ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離精製した。このＩＧ領域（Ｍ１
３ファージＤＮＡのｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉ
ｏｎ）の存在により、プラスミドｐＵＣ１１９は、ヘル
パーファージＭ１３Ｋ０７感染後優先的に一本鎖ＤＮＡ
となりファージ粒子に包み込まれ菌体外に放出される。 上記で精製したヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４８０ｂ
ｐのＤＮＡ断片とＩＧ領域を含む約３．２ＫｂｐのｐＵ
Ｃ１１９断片を前記に準じてＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結し、前記実施例３の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ８３株に導入した。得られた形質転
換体の中より、目的のプラスミド（約３．７Ｋｂｐ）を
有するクローンを選択し、このクローンをｐＵＣ１１９
−ｈＴＮＦ／ＪＭ８３と命名し、プラスミドをｐＵＣ１
１９−ｈＴＮＦと命名した。
【００６９】上記で得たプラスミドｐＵＣ１１９−ｈＴ
ＮＦを、そのＤＮＡ内にウラシルを取り込ませ保持する
ために、前記実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム
法により作製した大腸菌ＣＪ２３６株（ｄｕｔ−，ｕｎ
ｇ−）のコンピテントセルに導入した。ＣＪ２３６株は
デオキシウリジン三リン酸分解酵素遺伝子に欠失変異（
ｄｕｔ−）を持つため競合反応が生じ、チミンの替わり
に一部ウラシルを取り込んだＤＮＡを作ることができ、
更に ｕｎｇ−変異によりウラシルＮ−グリコシラー
ゼが欠損しており、そのウラシルをＤＮＡ中に保持して
おくことができる。このＣＪ２３６株はバイオ・ラドよ
り入手した。上記導入により得られたクローン（ｐＵＣ
１１９−ｈＴＮＦ／ＣＪ２３６）をヘルパーファージＭ
１３Ｋ０７（宝酒造より入手）の感染後、１００μｇ／
ｍｌアンピシリン、７０μｇ／ｍｌカナマイシン及び３
０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２×ＹＴブロ
ース（１．６％トリプトン、１％酵母エキス及び０．５
％ＮａＣｌ ｐＨ７．６）にて培養することにより、
目的のウラシルを導入した一本鎖プラスミドＤＮＡ（約
３．７Ｋｂａｓｅｓ）をファージ粒子に包み込んだ形で
菌体外に放出させた。放出させたファージ粒子を培養上
清より回収し、一本鎖ファージＤＮＡの調製方法に準じ
て、目的の一本鎖プラスミドＤＮＡを調製した。
ＮＦを、そのＤＮＡ内にウラシルを取り込ませ保持する
ために、前記実施例３の方法に準じて、塩化カルシウム
法により作製した大腸菌ＣＪ２３６株（ｄｕｔ−，ｕｎ
ｇ−）のコンピテントセルに導入した。ＣＪ２３６株は
デオキシウリジン三リン酸分解酵素遺伝子に欠失変異（
ｄｕｔ−）を持つため競合反応が生じ、チミンの替わり
に一部ウラシルを取り込んだＤＮＡを作ることができ、
更に ｕｎｇ−変異によりウラシルＮ−グリコシラー
ゼが欠損しており、そのウラシルをＤＮＡ中に保持して
おくことができる。このＣＪ２３６株はバイオ・ラドよ
り入手した。上記導入により得られたクローン（ｐＵＣ
１１９−ｈＴＮＦ／ＣＪ２３６）をヘルパーファージＭ
１３Ｋ０７（宝酒造より入手）の感染後、１００μｇ／
ｍｌアンピシリン、７０μｇ／ｍｌカナマイシン及び３
０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２×ＹＴブロ
ース（１．６％トリプトン、１％酵母エキス及び０．５
％ＮａＣｌ ｐＨ７．６）にて培養することにより、
目的のウラシルを導入した一本鎖プラスミドＤＮＡ（約
３．７Ｋｂａｓｅｓ）をファージ粒子に包み込んだ形で
菌体外に放出させた。放出させたファージ粒子を培養上
清より回収し、一本鎖ファージＤＮＡの調製方法に準じ
て、目的の一本鎖プラスミドＤＮＡを調製した。
【００７０】（２）次に図６に従って説明する。コーデ
ィング鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子に対し変異導入を行うために、プライマー４１０４を
デザインした。プライマー４１０４（塩基数１６）配列
表の配列番号７の５番目のＣから２０番目のＧまでの塩
基配列を有するが、 １３番目のＡがＧに置換された
ものである。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精
製は、前記実施例２の方法に準じて行った。
ィング鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子に対し変異導入を行うために、プライマー４１０４を
デザインした。プライマー４１０４（塩基数１６）配列
表の配列番号７の５番目のＣから２０番目のＧまでの塩
基配列を有するが、 １３番目のＡがＧに置換された
ものである。このオリゴヌクレオチドの化学合成及び精
製は、前記実施例２の方法に準じて行った。
【００７１】ヒトＴＮＦ遺伝子への部位特異的変異導入
は、バイオ・ラドのシステム（Ｍｕｔａ−ＧｅｎｅＴＭ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｋｉｔ）に準じて行った。すなわち、上記で作製した
約０．５μｇのプライマーの５′末端を前記方法に準じ
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した一
部と、先に調製したウラシル導入一本鎖プラスミドＤＮ
Ａ（ｐＵＣ １１９−ｈＴＮＦ）の約２００ｎｇとの
間で、１０μｌのアニーリング・バッファー（２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４， ２ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２及び５０ｍＭ ＮａＣｌ）中にてアニーリング（
約７０℃に加温後徐冷）を行った。アニーリング終了後
、１０倍シンセシス・バッファー（５ｍＭ各デオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸など（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ及びＴＴＰ）、１０ｍＭＡＴＰ、１００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２及
び２０ｍＭ ＤＴＴ）を１／１０容量加え、１ユニッ
トのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び２〜４ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて二本鎖化反応（３７℃、９０分
間）を行った。ＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス−
ＨＣｌ ｐＨ７．５及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）を約８
容量加え、凍結することにより反応を停止した。前記実
施例３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作製し
たＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＴＧ１株（ｕｎｇ＋：
アマシャム社）のコンピテントセルに、上記反応液を処
理し二本鎖ＤＮＡを導入した。
は、バイオ・ラドのシステム（Ｍｕｔａ−ＧｅｎｅＴＭ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｋｉｔ）に準じて行った。すなわち、上記で作製した
約０．５μｇのプライマーの５′末端を前記方法に準じ
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した一
部と、先に調製したウラシル導入一本鎖プラスミドＤＮ
Ａ（ｐＵＣ １１９−ｈＴＮＦ）の約２００ｎｇとの
間で、１０μｌのアニーリング・バッファー（２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４， ２ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２及び５０ｍＭ ＮａＣｌ）中にてアニーリング（
約７０℃に加温後徐冷）を行った。アニーリング終了後
、１０倍シンセシス・バッファー（５ｍＭ各デオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸など（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ及びＴＴＰ）、１０ｍＭＡＴＰ、１００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２及
び２０ｍＭ ＤＴＴ）を１／１０容量加え、１ユニッ
トのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び２〜４ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて二本鎖化反応（３７℃、９０分
間）を行った。ＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス−
ＨＣｌ ｐＨ７．５及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）を約８
容量加え、凍結することにより反応を停止した。前記実
施例３の方法に準じて、塩化カルシウム法により作製し
たＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＴＧ１株（ｕｎｇ＋：
アマシャム社）のコンピテントセルに、上記反応液を処
理し二本鎖ＤＮＡを導入した。
【００７２】ｕｎｇ＋株にヘテロ二本鎖ＤＮＡを導入す
ることにより、鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖は不
活性化され複製の対象とならない。（そのため変異の導
入頻度は５０％を上回る高効率なものとなる。）得られ
た形質転換体の中より、変異導入のために使用したプラ
イマーをプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、目的の変換体ＤＮＡを含むプラスミド
（約３．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。選択
されたクローンについて、そのプラスミドの変異導入部
位周辺の塩基配列をジデオキシ法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ：
前出〕により調べ、デザイン通りの変換体ＤＮＡに変異
していることを確認した。このプラスミドをｐＵＣ１１
９−Ｆ４１０４と命名した。ｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４
の変異導入は配列表の配列番号７の配列における１３番
目のＡのＧへの変換であり、その結果、制限酵素 Ｘ
ｈｏ Ｉ切断部位を生成した。
ることにより、鋳型であるウラシルを含むＤＮＡ鎖は不
活性化され複製の対象とならない。（そのため変異の導
入頻度は５０％を上回る高効率なものとなる。）得られ
た形質転換体の中より、変異導入のために使用したプラ
イマーをプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、目的の変換体ＤＮＡを含むプラスミド
（約３．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。選択
されたクローンについて、そのプラスミドの変異導入部
位周辺の塩基配列をジデオキシ法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ：
前出〕により調べ、デザイン通りの変換体ＤＮＡに変異
していることを確認した。このプラスミドをｐＵＣ１１
９−Ｆ４１０４と命名した。ｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４
の変異導入は配列表の配列番号７の配列における１３番
目のＡのＧへの変換であり、その結果、制限酵素 Ｘ
ｈｏ Ｉ切断部位を生成した。
【００７３】実施例６（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４１４６の構築） 前記実施例５で得られた制限酵素 Ｘｈｏ Ｉ切断
部位を有するプラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４を用
いて、その制限酵素 Ｘｈｏ Ｉ切断部位のＮ末端
側に化学合成オリゴヌクレオチド（アニーリングにより
二本鎖化したもの）を連結することにより、Ｎ末端付加
型ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチド（Ｆ４１４６と命名）
の発現ベクター（ｐＫＦ４１４６と命名）を構築した。 その構築方法を図７に従って説明する。
ｐＫＦ４１４６の構築） 前記実施例５で得られた制限酵素 Ｘｈｏ Ｉ切断
部位を有するプラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４を用
いて、その制限酵素 Ｘｈｏ Ｉ切断部位のＮ末端
側に化学合成オリゴヌクレオチド（アニーリングにより
二本鎖化したもの）を連結することにより、Ｎ末端付加
型ヒトＴＮＦ転換体ポリペプチド（Ｆ４１４６と命名）
の発現ベクター（ｐＫＦ４１４６と命名）を構築した。 その構築方法を図７に従って説明する。
【００７４】プラスミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４（約
３．７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ （宝酒造）及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ
末部分を欠失したＦ４１０４遺伝子を含む約４６０ｂｐ
のＤＮＡ断片をアガロース電気泳動（ゲル濃度１％）に
より分離精製した。また、Ｆ４１０４のＮ末部分に付加
する目的でデザインしたオリゴペプチドをコードするオ
リゴヌクレオチドの上鎖（Ｕ−４１４６）及び下鎖（Ｌ
−４１４６）を前記実施例２の方法に準じて化学合成し
、精製した。上鎖（Ｕ−４１４６）は配列表の配列番号
８で示した配列を有する。また下鎖（Ｌ−４１４６）は
この上鎖に相補するものであるが、配列番号８の１番目
〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に相補する塩基配列は
有さず、一方配列番号８の４３番目のＣに相補するＧに
対し上流方向に５′−ＴＣＧＡ−３′を接続する塩基配
列を有する。精製後得られた２本のオリゴヌクレオチド
（各１μｇ）を、前記実施例３の方法に準じて、その５
′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化の後、アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（４３ｂｐ
）とした。一方、前記実施例４の方法に準じてプラスミ
ドベクターｐＫＫ１０１を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調節領域等
を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。
３．７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３の方法に準じ
て、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ （宝酒造）及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ
末部分を欠失したＦ４１０４遺伝子を含む約４６０ｂｐ
のＤＮＡ断片をアガロース電気泳動（ゲル濃度１％）に
より分離精製した。また、Ｆ４１０４のＮ末部分に付加
する目的でデザインしたオリゴペプチドをコードするオ
リゴヌクレオチドの上鎖（Ｕ−４１４６）及び下鎖（Ｌ
−４１４６）を前記実施例２の方法に準じて化学合成し
、精製した。上鎖（Ｕ−４１４６）は配列表の配列番号
８で示した配列を有する。また下鎖（Ｌ−４１４６）は
この上鎖に相補するものであるが、配列番号８の１番目
〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に相補する塩基配列は
有さず、一方配列番号８の４３番目のＣに相補するＧに
対し上流方向に５′−ＴＣＧＡ−３′を接続する塩基配
列を有する。精製後得られた２本のオリゴヌクレオチド
（各１μｇ）を、前記実施例３の方法に準じて、その５
′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化の後、アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（４３ｂｐ
）とした。一方、前記実施例４の方法に準じてプラスミ
ドベクターｐＫＫ１０１を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調節領域等
を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。
【００７５】上記方法に従って得られた３本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ
１０３株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的のＦ４１４６発現ベクターｐＫＦ
４１４６（約３．９Ｋｂｐ）を有するクローンを、制限
酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ及びＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩによる切断パターンの確認並びに転換体ポリペプチ
ドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列を調べることにより
選択した。
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ
１０３株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的のＦ４１４６発現ベクターｐＫＦ
４１４６（約３．９Ｋｂｐ）を有するクローンを、制限
酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ及びＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩによる切断パターンの確認並びに転換体ポリペプチ
ドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列を調べることにより
選択した。
【００７６】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４１４６：配列表の配列番号１で示した１番目な
いし８番目のアミノ酸配列が配列表の配列番号３で示し
たアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ４１４６を
コードする。
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４１４６：配列表の配列番号１で示した１番目な
いし８番目のアミノ酸配列が配列表の配列番号３で示し
たアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ４１４６を
コードする。
【００７７】実施例７（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４４２２及びｐＫＦ４４２３の構築）前記実施例
６で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベクターｐＫＦ４１
４６（約３．９Ｋｈｐ）の５μｇを、前記実施例３の方
法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵
素Ｂｇｌ ＩＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ
末部分を欠失したＦ４１４６遺伝子を含む約４７０ｂＰ
のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％
）により分離精製した。また、Ｆ４１４６のＮ末部分に
付加する目的でデザインしたオリゴペプチドをコードす
るオリゴヌクレオチドの上鎖（Ｕ−４４２２又はＵ−４
４２３）及び下鎖（Ｌ−４４２２又はＬ−４４２３）を
デザインした。
ｐＫＦ４４２２及びｐＫＦ４４２３の構築）前記実施例
６で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベクターｐＫＦ４１
４６（約３．９Ｋｈｐ）の５μｇを、前記実施例３の方
法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵
素Ｂｇｌ ＩＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ
末部分を欠失したＦ４１４６遺伝子を含む約４７０ｂＰ
のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％
）により分離精製した。また、Ｆ４１４６のＮ末部分に
付加する目的でデザインしたオリゴペプチドをコードす
るオリゴヌクレオチドの上鎖（Ｕ−４４２２又はＵ−４
４２３）及び下鎖（Ｌ−４４２２又はＬ−４４２３）を
デザインした。
【００７８】
Ｕ−４４２２（配列表の配列番号９、塩基数２１）Ｌ−
４４２２（塩基数２１） Ｕ−４４２２に相補するものであるが、配列番号９の１
番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に相補する塩基配
列は有さず、一方配列番号９の２１番目のＡに相補する
Ｔに対し上流方向に５′−ＧＡＴＣ−３′を接続する塩
基配列を有する。
４４２２（塩基数２１） Ｕ−４４２２に相補するものであるが、配列番号９の１
番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に相補する塩基配
列は有さず、一方配列番号９の２１番目のＡに相補する
Ｔに対し上流方向に５′−ＧＡＴＣ−３′を接続する塩
基配列を有する。
【００７９】
Ｕ−４４２３（配列表の配列番号１０、塩基数３６）Ｌ
−４４２３（塩基数３６） Ｕ−４４２３に相補するものであるが、配列番号１０の
１番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に相補する塩基
配列は有さず、一方配列番号１０の３６番目のＡに相補
するＴに対し上流方向に５′−ＧＡＴＣ−３′を接続す
る塩基配列を有する。
−４４２３（塩基数３６） Ｕ−４４２３に相補するものであるが、配列番号１０の
１番目〜４番目の５′−ＡＡＴＴ−３′に相補する塩基
配列は有さず、一方配列番号１０の３６番目のＡに相補
するＴに対し上流方向に５′−ＧＡＴＣ−３′を接続す
る塩基配列を有する。
【００８０】これらのオリゴヌクレオチドを前記実施例
２の方法に準じて化学合成し、精製した。精製後得られ
たそれぞれの上・下２本のオリゴヌクレオチド（各１μ
ｇ）を、前記実施例３の方法に準じて、その５′末端を
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化の後、
アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（２１ｂｐ又は３６
ｂｐ）とした。
２の方法に準じて化学合成し、精製した。精製後得られ
たそれぞれの上・下２本のオリゴヌクレオチド（各１μ
ｇ）を、前記実施例３の方法に準じて、その５′末端を
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化の後、
アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（２１ｂｐ又は３６
ｂｐ）とした。
【００８１】一方、前記実施例４の方法に準じて、プラ
スミドベクターｐＫＫ１０１を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ
及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調
節領域等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製
した。
スミドベクターｐＫＫ１０１を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ
及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、複製起点及び転写調
節領域等を含む約３．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離精製
した。
【００８２】上記方法に従って得られた３種類のＤＮＡ
断片をそれぞれ、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１
２ ＪＭ１０３株のコンピテントセルに導入した。得
られた形質転換体の中より、目的のＦ４４２２発現ベク
ターｐＫＦ４４２２（約３．９Ｋｂｐ）又はＦ４４２３
発現ベクターｐＫＦ４４２３（約３．９Ｋｂｐ）を有す
るクローンを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ
及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断パターンの確認並び
に転換体ポリペプチドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列
を調べることにより選択した。
断片をそれぞれ、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１
２ ＪＭ１０３株のコンピテントセルに導入した。得
られた形質転換体の中より、目的のＦ４４２２発現ベク
ターｐＫＦ４４２２（約３．９Ｋｂｐ）又はＦ４４２３
発現ベクターｐＫＦ４４２３（約３．９Ｋｂｐ）を有す
るクローンを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ
及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断パターンの確認並び
に転換体ポリペプチドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列
を調べることにより選択した。
【００８３】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４４２２：配列表の配列番号１で示した１番目〜
８番目のアミノ酸配列が配列表の配列番号５で示したア
ミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ４４２２をコー
ドする。ベクターｐＫＦ４４２３：配列表の配列番号１
で示した１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列表の配列
番号６で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチド
Ｆ４４２３をコードする。
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４４２２：配列表の配列番号１で示した１番目〜
８番目のアミノ酸配列が配列表の配列番号５で示したア
ミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ４４２２をコー
ドする。ベクターｐＫＦ４４２３：配列表の配列番号１
で示した１番目〜８番目のアミノ酸配列が配列表の配列
番号６で示したアミノ酸配列で置換されたポリペプチド
Ｆ４４２３をコードする。
【００８４】実施例８（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４２３６の構築） （１）ｔｒｐ プロモーターを有する発現ベクターの
構築方法を図８〜図１１に従って説明する。転写プロモ
ーターとしてｔｒｐプロモーターを有し、翻訳開始シグ
ナル（ＳＤ配列）をタンデムに２つ並べ、転写ターミネ
ーターとして ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを有
するプラスミドベクター（ｐＳＫ４０７と命名）を図８
〜図１０に示した方法に従って構築した。プラスミドベ
クターｐＧＦ１０１（約４．３Ｋｂｐ、大阪大学薬学部
より分与）の５μｇを、前記方法に準じて、ミディアム
・ソルトバッファーに溶解し、１０ユニットの制限酵素
ＣｌａＩ（宝酒造）を添加することにより切断した。こ
の切断されたＤＮＡ断片を、前記実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、エタノ
ール沈殿操作後、ＮａＣｌを添加しＮａＣｌ濃度を１７
５ｍＭとしたハイ・ソルトバッファーに溶解し、１５ユ
ニットの制限酵素Ｓａｌ Ｉ（宝酒造）を添加するこ
とにより切断した。前記実施例３の方法に準じて、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により約４．０Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。
ｐＫＦ４２３６の構築） （１）ｔｒｐ プロモーターを有する発現ベクターの
構築方法を図８〜図１１に従って説明する。転写プロモ
ーターとしてｔｒｐプロモーターを有し、翻訳開始シグ
ナル（ＳＤ配列）をタンデムに２つ並べ、転写ターミネ
ーターとして ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを有
するプラスミドベクター（ｐＳＫ４０７と命名）を図８
〜図１０に示した方法に従って構築した。プラスミドベ
クターｐＧＦ１０１（約４．３Ｋｂｐ、大阪大学薬学部
より分与）の５μｇを、前記方法に準じて、ミディアム
・ソルトバッファーに溶解し、１０ユニットの制限酵素
ＣｌａＩ（宝酒造）を添加することにより切断した。こ
の切断されたＤＮＡ断片を、前記実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、エタノ
ール沈殿操作後、ＮａＣｌを添加しＮａＣｌ濃度を１７
５ｍＭとしたハイ・ソルトバッファーに溶解し、１５ユ
ニットの制限酵素Ｓａｌ Ｉ（宝酒造）を添加するこ
とにより切断した。前記実施例３の方法に準じて、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により約４．０Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。
【００８５】一方、Ｃａｓａｄａｂａｎ ら〔Ｊ．Ｂ
ａｄｅｒｉｏｌ．，１４３，９７１（１９８０）〕によ
って開発されプラスミドｐＭＣ１４０３（約９．９Ｋｂ
ｐ、京都大学ウィルス研究所より分与）の５μｇを、前
記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉにより切断後
、上記方法と同様に、平滑化及び制限酵素Ｓａｌ Ｉ
切断を行い、アガロースゲル電気泳動により約６．２Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。前記実施例３の方法
に準じて、先に精製したＤＮＡ断片との間でＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結反応を行い、塩化カルシウム法に
より作製したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０１
株（京都大学ウィルス研究所より分与）のコンピテント
セルに導入した。得られた形質転換体の中より、目的の
ｔｒｐプロモーター並びに制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び
ＢａｍＨ Ｉ切断部位を含む約１０．２Ｋｂｐのプラ
スミドベクター（ｐＳＫ１０１と命名）を有するクロー
ンを選択した。
ａｄｅｒｉｏｌ．，１４３，９７１（１９８０）〕によ
って開発されプラスミドｐＭＣ１４０３（約９．９Ｋｂ
ｐ、京都大学ウィルス研究所より分与）の５μｇを、前
記方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉにより切断後
、上記方法と同様に、平滑化及び制限酵素Ｓａｌ Ｉ
切断を行い、アガロースゲル電気泳動により約６．２Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。前記実施例３の方法
に準じて、先に精製したＤＮＡ断片との間でＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結反応を行い、塩化カルシウム法に
より作製したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０１
株（京都大学ウィルス研究所より分与）のコンピテント
セルに導入した。得られた形質転換体の中より、目的の
ｔｒｐプロモーター並びに制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び
ＢａｍＨ Ｉ切断部位を含む約１０．２Ｋｂｐのプラ
スミドベクター（ｐＳＫ１０１と命名）を有するクロー
ンを選択した。
【００８６】上記で得られたプラスミドベクターｐＳＫ
１０１の５μｇを２本のチューブにそれぞれ別々に、前
記方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制
限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＳａｌ Ｉ並びに制限酵素
ＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉを添加することにより
切断し、アガロースゲル電気泳動により約４．０Ｋｂｐ
及び約６．２ＫｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ分離精製し
た。一方、ポータブル翻訳開始部位オリゴヌクレオチド
（ＳＤ−ＡＴＧリンカーと略し、翻訳開始シグナルＳＤ
配列及び翻訳開始コドンＡＴＧを含む塩基数２１のオリ
ゴヌクレオチド：カタログＮｏ．２７−４８７８−０１
及び２７−４８９８−０１ファルマシア・モレキュラー
・バイオロジカルズ１９８５ Ｍａｙ、ファルマシア
社より入手）の上下鎖（各１００ｎｇ）を、前記実施例
３の方法に準じて、その５′末端のリン酸化及びアニー
ル化に供し、二本鎖ＤＮＡ断片（２１ｂｐ）とした。上
記で得られた３本のＤＮＡ断片を、前記方法に準じて、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ＨＢ１０１株のコンピテントセルに導入した。 得られた形質転換体の中より、目的とするＳＤ−ＡＴＧ
リンカーがｔｒｐプロモーターの下流かつ制限酵素Ｂａ
ｍＨ Ｉ切断部位の直前に挿入された約１０．２Ｋｂ
ｐのプラスミドベクター（ｐＳＫ２１１と命名）を有す
るクローンを選択した。このプラスミドベクターは、ｔ
ｒｐプロモーターの下流にタンデムに並んだ２つのＳＤ
配列を持つことになる。
１０１の５μｇを２本のチューブにそれぞれ別々に、前
記方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制
限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＳａｌ Ｉ並びに制限酵素
ＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉを添加することにより
切断し、アガロースゲル電気泳動により約４．０Ｋｂｐ
及び約６．２ＫｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ分離精製し
た。一方、ポータブル翻訳開始部位オリゴヌクレオチド
（ＳＤ−ＡＴＧリンカーと略し、翻訳開始シグナルＳＤ
配列及び翻訳開始コドンＡＴＧを含む塩基数２１のオリ
ゴヌクレオチド：カタログＮｏ．２７−４８７８−０１
及び２７−４８９８−０１ファルマシア・モレキュラー
・バイオロジカルズ１９８５ Ｍａｙ、ファルマシア
社より入手）の上下鎖（各１００ｎｇ）を、前記実施例
３の方法に準じて、その５′末端のリン酸化及びアニー
ル化に供し、二本鎖ＤＮＡ断片（２１ｂｐ）とした。上
記で得られた３本のＤＮＡ断片を、前記方法に準じて、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ＨＢ１０１株のコンピテントセルに導入した。 得られた形質転換体の中より、目的とするＳＤ−ＡＴＧ
リンカーがｔｒｐプロモーターの下流かつ制限酵素Ｂａ
ｍＨ Ｉ切断部位の直前に挿入された約１０．２Ｋｂ
ｐのプラスミドベクター（ｐＳＫ２１１と命名）を有す
るクローンを選択した。このプラスミドベクターは、ｔ
ｒｐプロモーターの下流にタンデムに並んだ２つのＳＤ
配列を持つことになる。
【００８７】このプラスミドベクターの制限酵素Ｓａｌ
Ｉ切断部位を消失し、その近傍に制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位を新生する目的で以下の操作を行っ
た。 プラスミドベクターｐＳＫ２１１の５μｇを前記方法に
準じて、制限酵素Ｓａｌ Ｉにて切断後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑化した。エタノール沈殿操作
により回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨ Ｉで
切断し、アガロースゲル電気泳動により約４．０Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を分離精製した。一方、ｔａｃプロモータ
ーを有するプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア社）及びＳＤ−ＡＴＧリンカー等を用い、前記
のｐＳＫ２１１を構築した方法に準じた組換えにより構
築したプラスミドベクターｐＧＦＫ５０３−１（約５．
７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記方法に準じて制限酵素Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩにて切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑化した。エタノール沈殿操作により回収した
ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨ Ｉで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を
分離精製した。上記で精製した２本のＤＮＡ断片を、前
記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０１株のコンピテ
ントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、目
的の制限酵素Ｓａｌ Ｉ切断部位を欠きＨｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位を新生したｔｒｐプロモーターを含む約
５．１Ｋｂｐのプラスミドベクター（ｐＳＫ３０１と命
名）を有するクローンを選択した。
Ｉ切断部位を消失し、その近傍に制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位を新生する目的で以下の操作を行っ
た。 プラスミドベクターｐＳＫ２１１の５μｇを前記方法に
準じて、制限酵素Ｓａｌ Ｉにて切断後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑化した。エタノール沈殿操作
により回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨ Ｉで
切断し、アガロースゲル電気泳動により約４．０Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を分離精製した。一方、ｔａｃプロモータ
ーを有するプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア社）及びＳＤ−ＡＴＧリンカー等を用い、前記
のｐＳＫ２１１を構築した方法に準じた組換えにより構
築したプラスミドベクターｐＧＦＫ５０３−１（約５．
７Ｋｂｐ）の５μｇを、前記方法に準じて制限酵素Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩにて切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑化した。エタノール沈殿操作により回収した
ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨ Ｉで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により約１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片を
分離精製した。上記で精製した２本のＤＮＡ断片を、前
記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０１株のコンピテ
ントセルに導入した。得られた形質転換体の中より、目
的の制限酵素Ｓａｌ Ｉ切断部位を欠きＨｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位を新生したｔｒｐプロモーターを含む約
５．１Ｋｂｐのプラスミドベクター（ｐＳＫ３０１と命
名）を有するクローンを選択した。
【００８８】このプラスミドベクターｐＳＫ３０１の５
μｇを、前記方法に準じて、ロウ・ソルトバッファーに
溶解し、５ユニットの制限酵素Ｂａｌ Ｉ（宝酒造）
を添加して切断反応を行った。反応終了後、反応液のＮ
ａＣｌ濃度を５０ｍＭとして制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉによる切断を行い、約４．３ＫｂｐのＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、プラ
スミドベクターｐＫＫ２２３−３の５μｇを、前記方法
に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＳｃａ Ｉで切断し、約０．
８ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により
分離精製した。上記で精製した２本のＤＮＡ断片を、前
記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＨＢ１０１株のコンピテント
セルに導入した。得られた形質転換体の中より、目的と
するｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターがｔｒｐプロモー
ターの下流に配置されたプラスミドベクターｐＳＫ４０
７（約５．１Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。
μｇを、前記方法に準じて、ロウ・ソルトバッファーに
溶解し、５ユニットの制限酵素Ｂａｌ Ｉ（宝酒造）
を添加して切断反応を行った。反応終了後、反応液のＮ
ａＣｌ濃度を５０ｍＭとして制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉによる切断を行い、約４．３ＫｂｐのＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離精製した。一方、プラ
スミドベクターｐＫＫ２２３−３の５μｇを、前記方法
に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し、制限酵素
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＳｃａ Ｉで切断し、約０．
８ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により
分離精製した。上記で精製した２本のＤＮＡ断片を、前
記方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＨＢ１０１株のコンピテント
セルに導入した。得られた形質転換体の中より、目的と
するｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターがｔｒｐプロモー
ターの下流に配置されたプラスミドベクターｐＳＫ４０
７（約５．１Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。
【００８９】次に、上記方法に従って構築し得られたプ
ラスミドベクターｐＳＫ４０７の転写及び翻訳シグナル
制御下でのＴＮＦ変換体発現ベクターをデザインした。 コードされる変換体ポリペプチド（Ｆ４１１３と命名）
は、ヒトＴＮＦのＮ末端にオリゴペプチドＡｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
を付加し、５番目のＴｈｒをＡｌａに変換したポリペプ
チドである。付加するオリゴペプチドのアミノ酸配列に
従って２本のオリゴヌクレオチド（Ｕ−４１１３及びＬ
−４１１３）をデザインした。
ラスミドベクターｐＳＫ４０７の転写及び翻訳シグナル
制御下でのＴＮＦ変換体発現ベクターをデザインした。 コードされる変換体ポリペプチド（Ｆ４１１３と命名）
は、ヒトＴＮＦのＮ末端にオリゴペプチドＡｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
を付加し、５番目のＴｈｒをＡｌａに変換したポリペプ
チドである。付加するオリゴペプチドのアミノ酸配列に
従って２本のオリゴヌクレオチド（Ｕ−４１１３及びＬ
−４１１３）をデザインした。
【００９０】
Ｕ−４１１３（配列表の配列番号１１、塩基数３２）Ｌ
−４１１３（塩基数３２） Ｕ−４１１３に相補するものであるが、配列番号１１の
１番目〜４番目の５′−ＧＡＴＣ−３′に相補する塩基
配列は有さず、一方配列番号１１の３２番目のＣに相補
するＧに対し上流方向に５′−ＴＣＧＡ−３′を接続す
る塩基配列を有する。
−４１１３（塩基数３２） Ｕ−４１１３に相補するものであるが、配列番号１１の
１番目〜４番目の５′−ＧＡＴＣ−３′に相補する塩基
配列は有さず、一方配列番号１１の３２番目のＣに相補
するＧに対し上流方向に５′−ＴＣＧＡ−３′を接続す
る塩基配列を有する。
【００９１】前記実施例２の方法に準じて化学合成し、
精製することにより作製し、得られたオリゴヌクレオチ
ド（各１μｇ）を前記実施例３の方法に準じて、その５
′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化の後、アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（３２ｂｐ
）とした。また、ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢＴ１
Ｔ２ターミネーター等を有するプラスミドベクターｐＳ
Ｋ４０７（約５．１Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３
の方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し制限
酵素ＢａｍＨ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、
複製起点及び転写調節領域等を含む約４．０ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）に
より分離精製した。一方、前記実施例５で得られたプラ
スミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４（約３．７Ｋｂｐ）の
５μｇを、実施例６の方法と同様に、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末端部分を欠
失したＦ４１０４遺伝子を含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断
片を分離精製した（図１１）。
精製することにより作製し、得られたオリゴヌクレオチ
ド（各１μｇ）を前記実施例３の方法に準じて、その５
′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸
化の後、アニール化により二本鎖ＤＮＡ断片（３２ｂｐ
）とした。また、ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢＴ１
Ｔ２ターミネーター等を有するプラスミドベクターｐＳ
Ｋ４０７（約５．１Ｋｂｐ）の５μｇを、前記実施例３
の方法に準じて、ハイ・ソルトバッファーに溶解し制限
酵素ＢａｍＨ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、
複製起点及び転写調節領域等を含む約４．０ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）に
より分離精製した。一方、前記実施例５で得られたプラ
スミドｐＵＣ１１９−Ｆ４１０４（約３．７Ｋｂｐ）の
５μｇを、実施例６の方法と同様に、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末端部分を欠
失したＦ４１０４遺伝子を含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断
片を分離精製した（図１１）。
【００９２】上記方法に従って得られた３本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ
１０１株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的の約４．５ＫｂｐのＦ４１１３発
現ベクター（ｐＫＦ４１１３と命名）を有するクローン
を、制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ及びＨｉｎ
ｄ ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに変換体ポ
リペプチドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列を調べるこ
とにより選択した。
片を、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ
１０１株のコンピテントセルに導入した。得られた形質
転換体の中より、目的の約４．５ＫｂｐのＦ４１１３発
現ベクター（ｐＫＦ４１１３と命名）を有するクローン
を、制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ及びＨｉｎ
ｄ ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに変換体ポ
リペプチドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列を調べるこ
とにより選択した。
【００９３】（２）前記実施例６で得られた発現ベクタ
ーｐＫＦ４１４６の転写プロモーター（ｔａｃプロモー
ター）を前記（１）項で構築した発現ベクターｐＫＦ４
１１３に含まれるｔｒｐプロモーターに置換する。また
、この置換はＮ末端アミノ酸配列の変換も伴う。図１２
に従って、この置換方法を説明する。
ーｐＫＦ４１４６の転写プロモーター（ｔａｃプロモー
ター）を前記（１）項で構築した発現ベクターｐＫＦ４
１１３に含まれるｔｒｐプロモーターに置換する。また
、この置換はＮ末端アミノ酸配列の変換も伴う。図１２
に従って、この置換方法を説明する。
【００９４】プラスミドｐＫＦ４１４６（約３．９Ｋｂ
ｐ）の５μｇを１ｍＭ ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌ
ＢＳＡを含む５０μｌのＳｍａ Ｉバッファー（１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＫＣ
ｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に溶解させ、１５ユニ
ットの制限酵素 Ｓｍａ Ｉ（宝酒造）を添加して
、３７℃で２時間切断反応を行った。反応終了後、エタ
ノール沈殿操作によりＤＮＡ断片を回収し、５０μｌの
ミディアム・ソルトバッファーに再度溶解した。１５ユ
ニットの制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる３７℃、２
時間の切断反応の後、約４９０ｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製し
た。一方、前記（１）項の構築により得られたｔｒｐプ
ロモーターを有するプラスミドｐＫＦ４１１３（約４．
５Ｋｂｐ）の５μｇを、上記方法と同様にして、制限酵
素Ｓｍａ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩにより切断し、
ｔｒｐプロモーターを含む約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離
精製した。このようにして得られた二本のＤＮＡ断片を
、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＨＢ１０１株
のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換体の
中より、目的とするｔｒｐプロモーターによる転換体ポ
リペプチド発現ベクター（約４．５Ｋｂｐ）を有するク
ローンを、制限酵素による切断パターンの確認及び転換
体ポリペプチドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列を調べ
ることにより選択した。この選択により、再生されるは
ずの制限酵素 Ｓｍａ Ｉを、Ｐｒｏをコードする
３塩基対５′−ＣＣＣ−３′ ３′−ＧＧＧ−５′ を欠失することにより再生しないクローンを得た。この
発現ベクターをｐＫＦ４２３６と命名した。
ｐ）の５μｇを１ｍＭ ＤＴＴ及び１００μｇ／ｍｌ
ＢＳＡを含む５０μｌのＳｍａ Ｉバッファー（１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＫＣ
ｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に溶解させ、１５ユニ
ットの制限酵素 Ｓｍａ Ｉ（宝酒造）を添加して
、３７℃で２時間切断反応を行った。反応終了後、エタ
ノール沈殿操作によりＤＮＡ断片を回収し、５０μｌの
ミディアム・ソルトバッファーに再度溶解した。１５ユ
ニットの制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる３７℃、２
時間の切断反応の後、約４９０ｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離精製し
た。一方、前記（１）項の構築により得られたｔｒｐプ
ロモーターを有するプラスミドｐＫＦ４１１３（約４．
５Ｋｂｐ）の５μｇを、上記方法と同様にして、制限酵
素Ｓｍａ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩにより切断し、
ｔｒｐプロモーターを含む約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により分離
精製した。このようにして得られた二本のＤＮＡ断片を
、前記実施例３の方法に準じて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ＨＢ１０１株
のコンピテントセルに導入した。得られた形質転換体の
中より、目的とするｔｒｐプロモーターによる転換体ポ
リペプチド発現ベクター（約４．５Ｋｂｐ）を有するク
ローンを、制限酵素による切断パターンの確認及び転換
体ポリペプチドのＮ末端付加部位周辺の塩基配列を調べ
ることにより選択した。この選択により、再生されるは
ずの制限酵素 Ｓｍａ Ｉを、Ｐｒｏをコードする
３塩基対５′−ＣＣＣ−３′ ３′−ＧＧＧ−５′ を欠失することにより再生しないクローンを得た。この
発現ベクターをｐＫＦ４２３６と命名した。
【００９５】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４２３６：配列表の配列番号１で示した１番目〜
８番目のアミノ酸配列 が配列表の配列番号２で示し
たアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ４２３６
をコードする。
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産する。ベクター
ｐＫＦ４２３６：配列表の配列番号１で示した１番目〜
８番目のアミノ酸配列 が配列表の配列番号２で示し
たアミノ酸配列で置換されたポリペプチドＦ４２３６
をコードする。
【００９６】実施例９（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクター
ｐＫＦ４４１９の構築）配列表の配列番号１２で示した
プライマー４４１９を用い、前記実施例５（１）及び（
２）の方法に準じて目的の変異導入ＤＮＡを含むプラス
ミド（約３．７Ｋｂｐ）を得た。ジデオキシ法によりデ
ザイン通りの転換体ＤＮＡに変異していることを確認し
、このプラスミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４４１９と命名し
た。
ｐＫＦ４４１９の構築）配列表の配列番号１２で示した
プライマー４４１９を用い、前記実施例５（１）及び（
２）の方法に準じて目的の変異導入ＤＮＡを含むプラス
ミド（約３．７Ｋｂｐ）を得た。ジデオキシ法によりデ
ザイン通りの転換体ＤＮＡに変異していることを確認し
、このプラスミドをｐＵＣ１１９−Ｆ４４１９と命名し
た。
【００９７】変異導入により得られた目的のヒトＴＮＦ
転換体遺伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの
構築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有する発現ベ
クターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ転換体発現ベク
ターを構築した。ヒトＴＮＦ転換体遺伝子（約４８０ｂ
ｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラスミドｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４４１９より、前記方法に準じて、制限
酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断
後分離精製した。目的とするヒトＴＮＦ転換体発現ベク
ター（ｐＫＦ４４１９）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（
ｐＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株を用いて取得した。
転換体遺伝子を、実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの
構築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有する発現ベ
クターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ転換体発現ベク
ターを構築した。ヒトＴＮＦ転換体遺伝子（約４８０ｂ
ｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラスミドｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４４１９より、前記方法に準じて、制限
酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断
後分離精製した。目的とするヒトＴＮＦ転換体発現ベク
ター（ｐＫＦ４４１９）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（
ｐＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２ ＪＭ１０３株を用いて取得した。
【００９８】上記転換体発現ベクターは、発現誘導によ
り、以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチド
を大腸菌内に生産する。ベクターｐＫＦ４４１９：配列
表の配列番号１で示した１番目〜８番目のアミノ酸配列
が配列表の配列番号４で示したアミノ酸配列で置換され
たポリペプチドＦ４４１９をコードする。
り、以下に示す変換を有する新規生理活性ポリペプチド
を大腸菌内に生産する。ベクターｐＫＦ４４１９：配列
表の配列番号１で示した１番目〜８番目のアミノ酸配列
が配列表の配列番号４で示したアミノ酸配列で置換され
たポリペプチドＦ４４１９をコードする。
【００９９】実施例１０（ヒトＴＮＦ変換体発現ベクタ
ーｐＫＦ４２９１及びｐＫＦ４２９２の構築）プライマ
ー４２９１及び同４２９２をデザインした。プライマー
４２９１及び同４２９２（塩基数２１）配列表の配列番
号７の１９３番目のＣから２１３番目のＴまでの塩基配
列を有するが、２０２番目〜２０４番目の５′−ＣＣＡ
−３′が、プライマー４２９１の場合５′−ＧＡＴ−３
′により、プライマー４２９２の場合５′−ＡＴＧ−３
′によりそれぞれ置換されたものである。
ーｐＫＦ４２９１及びｐＫＦ４２９２の構築）プライマ
ー４２９１及び同４２９２をデザインした。プライマー
４２９１及び同４２９２（塩基数２１）配列表の配列番
号７の１９３番目のＣから２１３番目のＴまでの塩基配
列を有するが、２０２番目〜２０４番目の５′−ＣＣＡ
−３′が、プライマー４２９１の場合５′−ＧＡＴ−３
′により、プライマー４２９２の場合５′−ＡＴＧ−３
′によりそれぞれ置換されたものである。
【０１００】これらプライマー４２９１或は同４２９２
を用い、前記実施例５（１）及び（２）の方法に準じて
目的の変異導入ＤＮＡを含むプラスミド（約３．７Ｋｂ
ｐ）を得た。ジデオキシ法によりデザイン通りの変換体
ＤＮＡに変異していることを確認し、このプラスミドを
ｐＵＣ１１９−Ｆ４２９１或はｐＵＣ１１９−Ｆ４２９
２と命名した。変異導入により得られた目的のヒトＴＮ
Ｆ変換体遺伝子を実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの
構築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有する発現ベ
クターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ変換体発現ベク
ターを構築した。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子（約４８０ｂ
ｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラスミドｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４２９１あるいはｐｕＣ１１９−Ｆ４２
９２より、前記の方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断後分離精製した。目的
とするヒトＴＮＦ変換体発現ベクター（ｐＫＦ４２９１
或はｐＫＦ４２９２）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐ
ＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ ＪＭ１０３株を用いて取得した。
を用い、前記実施例５（１）及び（２）の方法に準じて
目的の変異導入ＤＮＡを含むプラスミド（約３．７Ｋｂ
ｐ）を得た。ジデオキシ法によりデザイン通りの変換体
ＤＮＡに変異していることを確認し、このプラスミドを
ｐＵＣ１１９−Ｆ４２９１或はｐＵＣ１１９−Ｆ４２９
２と命名した。変異導入により得られた目的のヒトＴＮ
Ｆ変換体遺伝子を実施例４のヒトＴＮＦ発現ベクターの
構築方法に準じて、ｔａｃプロモーターを有する発現ベ
クターｐＫＫ１０１に組込みヒトＴＮＦ変換体発現ベク
ターを構築した。ヒトＴＮＦ変換体遺伝子（約４８０ｂ
ｐ）は、上記で得られた約３．７Ｋｂｐのプラスミドｐ
ＵＣ１１９−Ｆ４２９１あるいはｐｕＣ１１９−Ｆ４２
９２より、前記の方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄ ＩＩＩによる切断後分離精製した。目的
とするヒトＴＮＦ変換体発現ベクター（ｐＫＦ４２９１
或はｐＫＦ４２９２）は、ヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐ
ＫＦ４１０２）と同様、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ ＪＭ１０３株を用いて取得した。
【０１０１】実施例１１（ヒトＴＮＦ転換体発現ベクタ
ーｐＫＦ４６０３及びｐＫＦ４６０４の構築）前記実施
例８で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベクターｐＫＦ４
２３６（約４．５Ｋｂｐ）５μｇを、前記実施例３の方
法に準じて、ミディアム・ソルトバッファーに溶解し制
限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、
複製起点及び転写調節領域等を含む約４．１ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）に
より分離精製した。一方、前記実施例１０で得られたヒ
トＴＮＦ変換体発現ベクターｐＫＦ４２９１又はｐＫＦ
４２９２各５μｇを、前記と同様にして、制限酵素Ｓａ
ｃ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末部分を
欠失したＦ４２９１又はＦ４２９２遺伝子を含む約３６
０ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。
ーｐＫＦ４６０３及びｐＫＦ４６０４の構築）前記実施
例８で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベクターｐＫＦ４
２３６（約４．５Ｋｂｐ）５μｇを、前記実施例３の方
法に準じて、ミディアム・ソルトバッファーに溶解し制
限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、
複製起点及び転写調節領域等を含む約４．１ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）に
より分離精製した。一方、前記実施例１０で得られたヒ
トＴＮＦ変換体発現ベクターｐＫＦ４２９１又はｐＫＦ
４２９２各５μｇを、前記と同様にして、制限酵素Ｓａ
ｃ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｎ末部分を
欠失したＦ４２９１又はＦ４２９２遺伝子を含む約３６
０ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。
【０１０２】上記方法に従って得られた２本のＤＮＡ断
片を、前記実施例３の方法に準じてＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１
０１株のコンピテントセルに導入した。得られた形質転
換体の中より、目的のＦ４６０３又はＦ４６０４発現ベ
クターｐＫＦ４６０３又はｐＫＦ４６０４（約４．５Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを、制限酵素Ｓａｃ Ｉ及び
Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに変
換体ポリペプチド由来の変換部位周辺の塩基配列を調べ
ることにより選択した。
片を、前記実施例３の方法に準じてＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１
０１株のコンピテントセルに導入した。得られた形質転
換体の中より、目的のＦ４６０３又はＦ４６０４発現ベ
クターｐＫＦ４６０３又はｐＫＦ４６０４（約４．５Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを、制限酵素Ｓａｃ Ｉ及び
Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる切断パターンの確認並びに変
換体ポリペプチド由来の変換部位周辺の塩基配列を調べ
ることにより選択した。
【０１０３】上記方法に従って構築した転換体発現ベク
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産するベクターｐ
ＫＦ４６０３：配列表の配列番号１で示した１番目〜８
番目のアミノ酸配列が配列表の配列番号２で示したアミ
ノ酸配列で置換され、６８番目のＰｒｏがＡｓｐに変換
されたポリペプチドＦ４６０３をコードする。ベクター
ｐＫＦ４６０４：配列表の配列番号１で示した１番目〜
８番目のアミノ酸配列が配列表の配列番号２で示したア
ミノ酸配列で置換され、６８番目のＰｒｏがＭｅｔに変
換されたポリペプチドＦ４６０４をコードする。
ターは、発現誘導により、以下に示す変換を有する新規
生理活性ポリペプチドを大腸菌内に生産するベクターｐ
ＫＦ４６０３：配列表の配列番号１で示した１番目〜８
番目のアミノ酸配列が配列表の配列番号２で示したアミ
ノ酸配列で置換され、６８番目のＰｒｏがＡｓｐに変換
されたポリペプチドＦ４６０３をコードする。ベクター
ｐＫＦ４６０４：配列表の配列番号１で示した１番目〜
８番目のアミノ酸配列が配列表の配列番号２で示したア
ミノ酸配列で置換され、６８番目のＰｒｏがＭｅｔに変
換されたポリペプチドＦ４６０４をコードする。
【０１０４】実施例１２（ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリ
ペプチドの大腸菌による発現及び精製）実施例４で得ら
れたヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２）並びに
実施例６、７及び９で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベ
クター（ｐＫＦ４４１９、ｐＫＦ４１４６、ｐＫＦ４４
２２及びｐＫＦ４４２３）を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ ＪＭ１０３株を、２５〜５０μｇ／ｍｌアン
ピシリン及び０．００１％ビタミンＢ１を含むＭ９培地
（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０
．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ４、０．２％グルコース及び０．１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ２）２０ｍｌに接種し、３７℃、１８時間振とう培
養を行った。この培養液２０ｍｌを上記培地１リットル
中に加え、３７℃、２〜３時間振とう培養を行った。次
いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、更
に３７℃、１８時間振とう培養を続けた。
ペプチドの大腸菌による発現及び精製）実施例４で得ら
れたヒトＴＮＦ発現ベクター（ｐＫＦ４１０２）並びに
実施例６、７及び９で得られたヒトＴＮＦ転換体発現ベ
クター（ｐＫＦ４４１９、ｐＫＦ４１４６、ｐＫＦ４４
２２及びｐＫＦ４４２３）を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ ＪＭ１０３株を、２５〜５０μｇ／ｍｌアン
ピシリン及び０．００１％ビタミンＢ１を含むＭ９培地
（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０
．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ４、０．２％グルコース及び０．１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ２）２０ｍｌに接種し、３７℃、１８時間振とう培
養を行った。この培養液２０ｍｌを上記培地１リットル
中に加え、３７℃、２〜３時間振とう培養を行った。次
いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、更
に３７℃、１８時間振とう培養を続けた。
【０１０５】実施例８及び１１で得られたヒトＴＮＦ転
換体発現ベクター（ｐＫＦ４２３６及びｐＫＦ４６０３
）を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０１株
については、２５〜５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．
００１％ビタミンＢ１及び５μｇ／ｍｌトリプトファン
を含むＭ９ＣＡ培地（０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０
．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％Ｎ
Ｈ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２％グルコース
及び０．１ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．２％カザミノ酸
）２０ｍｌに接種し、３７℃、１８時間振とう培養を行
った。 ５μｇ／ｍｌトリプトファンを含まない上記培地１リッ
トル中にこの培養液２０ｍｌを加え、３７℃、１８時間
振とう培養を行った。
換体発現ベクター（ｐＫＦ４２３６及びｐＫＦ４６０３
）を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＢ１０１株
については、２５〜５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．
００１％ビタミンＢ１及び５μｇ／ｍｌトリプトファン
を含むＭ９ＣＡ培地（０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０
．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％Ｎ
Ｈ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２％グルコース
及び０．１ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．２％カザミノ酸
）２０ｍｌに接種し、３７℃、１８時間振とう培養を行
った。 ５μｇ／ｍｌトリプトファンを含まない上記培地１リッ
トル中にこの培養液２０ｍｌを加え、３７℃、１８時間
振とう培養を行った。
【０１０６】遠心分離操作による大腸菌菌体の回収後、
ＴＰバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．
０及び１００μＭ ＰＭＳＦ）を用いて菌体の洗浄を
行った。洗浄後、菌体グラム当たり１０容量（ｍｌ）の
ＴＰバッファーに菌体を懸濁させ、超音波発生装置（ヒ
ート・システムズ；モデル Ｗ−２２５）を用いて菌
体を超音波破砕処理した。得られた懸濁液を遠心分離す
ることにより、菌体残渣を除去し上清画分を回収した。 この超音波破砕処理以降の精製工程は、主に低温下（０
℃〜４℃）で行った。
ＴＰバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．
０及び１００μＭ ＰＭＳＦ）を用いて菌体の洗浄を
行った。洗浄後、菌体グラム当たり１０容量（ｍｌ）の
ＴＰバッファーに菌体を懸濁させ、超音波発生装置（ヒ
ート・システムズ；モデル Ｗ−２２５）を用いて菌
体を超音波破砕処理した。得られた懸濁液を遠心分離す
ることにより、菌体残渣を除去し上清画分を回収した。 この超音波破砕処理以降の精製工程は、主に低温下（０
℃〜４℃）で行った。
【０１０７】この上清を０．４５μｍフィルターにてろ
過した後、セパビーズＦＰ−ＤＡ１３（三菱化成）を用
いた陰イオン交換クロマトグラフィー（カラムサイズ：
φ２．５×１．５ｃｍ及び流速：０．５ｍｌ／分）で分
画し、後記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びＬ９２９細胞を用いた実施例１３の方法に準じて活性
の有無を検定することによって活性画分を得た。溶出に
はＮａＣｌを含むＴＰバッファーを用い、ＮａＣｌ濃度
を０．０５Ｍから０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍへと段
階的に上げ、ヒトＴＮＦ（１）は０．１Ｍ ＮａＣｌ
で、ヒトＴＮＦ（２）、ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４４１９、
同Ｆ４４２２及び同Ｆ４６０３は０．２ＭＮａＣｌで並
びにヒトＴＮＦ転換体Ｆ４１４６及び同Ｆ４２３６は０
．５ＭＮａＣｌ でそれぞれ溶出した。更に大腸菌菌
体由来のエンドトキシン等を除去するために、核酸・エ
ンドトキシン除去剤Ｃ−９（栗田工業製造、大日本製薬
販売）処理を添付マニュアルに準じて行った。かくして
、ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試
料を得た。この試料を使用して、後記実施例１３、１４
及び１５の抗腫瘍活性の評価及び実験的肺転移に及ぼす
効果の評価を行った。なお、転換体ポリペプチドＦ４４
２３については使用した宿主大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ ＪＭ１０３株中での不安定性のためか、活性
画分を得ることができなかった。しかしながら他の宿主
を使用すれば活性画分を得られる可能性がある。
過した後、セパビーズＦＰ−ＤＡ１３（三菱化成）を用
いた陰イオン交換クロマトグラフィー（カラムサイズ：
φ２．５×１．５ｃｍ及び流速：０．５ｍｌ／分）で分
画し、後記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びＬ９２９細胞を用いた実施例１３の方法に準じて活性
の有無を検定することによって活性画分を得た。溶出に
はＮａＣｌを含むＴＰバッファーを用い、ＮａＣｌ濃度
を０．０５Ｍから０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍへと段
階的に上げ、ヒトＴＮＦ（１）は０．１Ｍ ＮａＣｌ
で、ヒトＴＮＦ（２）、ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４４１９、
同Ｆ４４２２及び同Ｆ４６０３は０．２ＭＮａＣｌで並
びにヒトＴＮＦ転換体Ｆ４１４６及び同Ｆ４２３６は０
．５ＭＮａＣｌ でそれぞれ溶出した。更に大腸菌菌
体由来のエンドトキシン等を除去するために、核酸・エ
ンドトキシン除去剤Ｃ−９（栗田工業製造、大日本製薬
販売）処理を添付マニュアルに準じて行った。かくして
、ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試
料を得た。この試料を使用して、後記実施例１３、１４
及び１５の抗腫瘍活性の評価及び実験的肺転移に及ぼす
効果の評価を行った。なお、転換体ポリペプチドＦ４４
２３については使用した宿主大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
−１２ ＪＭ１０３株中での不安定性のためか、活性
画分を得ることができなかった。しかしながら他の宿主
を使用すれば活性画分を得られる可能性がある。
【０１０８】上記試料を０．２０μｍフィルターにてろ
過した後、ＦＰＬＣシステムによる制御下のモノＱ（登
録商標）（ＨＲ１０／１０及びＨＲ５／５）プレパック
カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで、ＮａＣｌ
を含むＴＰＱバッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ
８．０及び１０μＭ ＰＭＳＦ）によって溶出し、分
画を後記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
Ｌ９２９細胞を用いた実施例１３の方法に準じて活性の
有無を検定することによって活性画分を得た。溶出方法
は、ＦＰＬＣシステムの制御下で下記プログラムに従っ
て行った。第３ステップは、精製純度を上げるためにＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バ
ンドとなるまで数回繰り返した。
過した後、ＦＰＬＣシステムによる制御下のモノＱ（登
録商標）（ＨＲ１０／１０及びＨＲ５／５）プレパック
カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで、ＮａＣｌ
を含むＴＰＱバッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ
８．０及び１０μＭ ＰＭＳＦ）によって溶出し、分
画を後記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
Ｌ９２９細胞を用いた実施例１３の方法に準じて活性の
有無を検定することによって活性画分を得た。溶出方法
は、ＦＰＬＣシステムの制御下で下記プログラムに従っ
て行った。第３ステップは、精製純度を上げるためにＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バ
ンドとなるまで数回繰り返した。
【０１０９】第１ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ
１０／１０）カラム使用 （流速：４ｍｌ／分） ０〜５分；０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配５〜
１６分；０．２Ｍ ＮａＣｌ １６〜２０分；０．２−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度
勾配 ２０〜２４分；０．５Ｍ ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｌ濃度及
び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．２Ｍ、６．６
分、ヒトＴＮＦ（２）が０．２Ｍ、５．６分、ヒトＴＮ
Ｆ転換体Ｆ４１４６が０．２Ｍ、６．５分、同Ｆ４２３
６が０．２Ｍ、６．４分、同Ｆ４４１９が０．２Ｍ、５
．４分及び同Ｆ４６０３が０．２Ｍ、７．６分であった
。
１０／１０）カラム使用 （流速：４ｍｌ／分） ０〜５分；０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配５〜
１６分；０．２Ｍ ＮａＣｌ １６〜２０分；０．２−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度
勾配 ２０〜２４分；０．５Ｍ ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ＮａＣｌ濃度及
び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．２Ｍ、６．６
分、ヒトＴＮＦ（２）が０．２Ｍ、５．６分、ヒトＴＮ
Ｆ転換体Ｆ４１４６が０．２Ｍ、６．５分、同Ｆ４２３
６が０．２Ｍ、６．４分、同Ｆ４４１９が０．２Ｍ、５
．４分及び同Ｆ４６０３が０．２Ｍ、７．６分であった
。
【０１１０】第２ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ
５／５）カラム使用 （流速：１ｍｌ／分） ０〜２．５分；０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配
２．５〜８分；０．２Ｍ ＮａＣｌ ８〜１０分；０．２−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾
配１０〜１２分；０．５Ｍ ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ ＮａＣｌ
濃度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．２Ｍ
、３．７分、ヒトＴＮＦ（２）が０．２Ｍ、４．１分、
ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４１４６が０．２Ｍ、４．１分、同
Ｆ４２３６が０．２Ｍ、３．８分、同Ｆ４４１９が０．
２Ｍ、３．８分及び同Ｆ４６０３が０．２Ｍ、５．７分
であった。
５／５）カラム使用 （流速：１ｍｌ／分） ０〜２．５分；０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配
２．５〜８分；０．２Ｍ ＮａＣｌ ８〜１０分；０．２−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾
配１０〜１２分；０．５Ｍ ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ ＮａＣｌ
濃度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．２Ｍ
、３．７分、ヒトＴＮＦ（２）が０．２Ｍ、４．１分、
ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４１４６が０．２Ｍ、４．１分、同
Ｆ４２３６が０．２Ｍ、３．８分、同Ｆ４４１９が０．
２Ｍ、３．８分及び同Ｆ４６０３が０．２Ｍ、５．７分
であった。
【０１１１】第３ステップ：モノＱ（登録商標）（ＨＲ
５／５）カラム使用 （流速：１ｍｌ／分） ０〜６分；０−０．１５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配６
〜１１分；０．１５，０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾
配 １１〜１３分；０．２−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度
勾配 １３〜１５分；０．５Ｍ ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ ＮａＣｌ
濃度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．１６
Ｍ、６．５分、ヒトＴＮＦ（２）が０．１６Ｍ、６．５
分、ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４１４６が０．１７Ｍ、７．１
分、同Ｆ４２３６が０．１７Ｍ、６．７分、同Ｆ４４１
９が０．１６Ｍ、６．３分及び同Ｆ４６０３が０．２３
Ｍ、１０．８分であった。
５／５）カラム使用 （流速：１ｍｌ／分） ０〜６分；０−０．１５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配６
〜１１分；０．１５，０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾
配 １１〜１３分；０．２−０．５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度
勾配 １３〜１５分；０．５Ｍ ＮａＣｌ 上記方法に従った活性画分の分画結果（ ＮａＣｌ
濃度及び保持時間）は、ヒトＴＮＦ（１）が０．１６
Ｍ、６．５分、ヒトＴＮＦ（２）が０．１６Ｍ、６．５
分、ヒトＴＮＦ転換体Ｆ４１４６が０．１７Ｍ、７．１
分、同Ｆ４２３６が０．１７Ｍ、６．７分、同Ｆ４４１
９が０．１６Ｍ、６．３分及び同Ｆ４６０３が０．２３
Ｍ、１０．８分であった。
【０１１２】かくしてヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプ
チドの精製試料を得た。この試料を使用して後記実施例
１３の抗腫瘍活性の評価を行った。なお、転換体ポリペ
プチドＦ４４２２については精製過程でＮ末端部分の欠
失が認められたため、精製を途中で中止した。
チドの精製試料を得た。この試料を使用して後記実施例
１３の抗腫瘍活性の評価を行った。なお、転換体ポリペ
プチドＦ４４２２については精製過程でＮ末端部分の欠
失が認められたため、精製を途中で中止した。
【０１１３】上記精製の過程及び精製試料についてＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒトＴＮ
Ｆ及び同転換体ポリペプチドの発現及び精製の確認をし
た。各試料を１０ｍＭ ＤＴＴを含有するＬａｅｍｍ
ｌｉ′ｓ サンプル・バッファー（６２．５ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、０．０１％Ｂ
ＰＢ及び１０％グリセロール）に加え、Ｌａｅｍｍｌｉ
〔Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）〕の方法
に準じ、１５％の分離用ゲルを用いて電気泳動を行った
。電気泳動終了後、分離用ゲル中の蛋白質をクマシー・
ブリリアント・ブルーで染色することにより確認した。 図１３及び１４にその結果の一部を示した。活性画分を
得ることのできたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチド
のそれぞれの発現ベクターによる発現量はほぼ同程度で
あり、得られた染色ゲルをクロマト・スキャナー（島津
、ＣＳ−９２０型）にかけてその発現効率を算出したと
ころ、大腸菌総菌体蛋白質の約２０％であった。また、
最終精製試料は、得られた染色ゲルにおいて単一バンド
であった。その泳動位置より、ヒトＴＮＦ及び同転換体
ポリペプチドの分子量を算出し表１に示した。
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒトＴＮ
Ｆ及び同転換体ポリペプチドの発現及び精製の確認をし
た。各試料を１０ｍＭ ＤＴＴを含有するＬａｅｍｍ
ｌｉ′ｓ サンプル・バッファー（６２．５ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、０．０１％Ｂ
ＰＢ及び１０％グリセロール）に加え、Ｌａｅｍｍｌｉ
〔Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）〕の方法
に準じ、１５％の分離用ゲルを用いて電気泳動を行った
。電気泳動終了後、分離用ゲル中の蛋白質をクマシー・
ブリリアント・ブルーで染色することにより確認した。 図１３及び１４にその結果の一部を示した。活性画分を
得ることのできたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチド
のそれぞれの発現ベクターによる発現量はほぼ同程度で
あり、得られた染色ゲルをクロマト・スキャナー（島津
、ＣＳ−９２０型）にかけてその発現効率を算出したと
ころ、大腸菌総菌体蛋白質の約２０％であった。また、
最終精製試料は、得られた染色ゲルにおいて単一バンド
であった。その泳動位置より、ヒトＴＮＦ及び同転換体
ポリペプチドの分子量を算出し表１に示した。
【０１１４】なお、蛋白質の物性の一つとして、ヒトＴ
ＮＦ及び同転換体ポリペプチドの等電点をアンフォライ
ン（ＬＫＢ社製）を用いた等電点ゲル電気泳動法により
測定し、得られた結果を表１に示した。
ＮＦ及び同転換体ポリペプチドの等電点をアンフォライ
ン（ＬＫＢ社製）を用いた等電点ゲル電気泳動法により
測定し、得られた結果を表１に示した。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
実施例１３（ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性の評価）実
施例１２で得られたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチ
ドの一段階精製試料及び精製試料について、マウス由来
結合組織細胞Ｌ９２９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１）に対す
る細胞傷害活性をＡｇｇａｒｗａｌら〔Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ．ｃｈｅｍ．，２６０，２３４５（１９８５）〕の方
法に準じて求めた。すなわち、９６ウエルの組織培養用
のマイクロプレート（コーニング社製）に３×１０４細
胞／０．１ｍｌ／ウエルでＬ９２９細胞を植え、５％炭
酸ガス存在下３７℃で一晩培養した。培地としては、１
０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏによって修
飾されたイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（Ｄ
ＭＥ培地、シグマ社製）を用いた。翌日、最終濃度１μ
ｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを添加した上記培地に培
地を交換し、この培地にて段階希釈した試料を各ウエル
に処理した（総培地量０．１ｍｌ）。更に２０時間の培
養後、０．５％クリスタル・バイオレット溶液（０．５
％クリスタル・バイオレット／２０％メタノール）にて
プレートに付着した生細胞を染色（室温、１５分間）し
た。１ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を
含むリン酸バッファーＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ・Ｋリ
ン酸塩ｐＨ７．４、０．８％ＮａＣｌ及び０．０２％Ｋ
Ｃｌ）で充分洗浄した後、３０％エタノールを含む０．
０１Ｎ塩酸溶液０．１ｍｌを用いてプレートに残ったク
リスタル・バイオレットを抽出し、その吸光度（４９２
ｎｍ）をＥＩＡリーダー（バイオ・ラド社製、モデル２
５５０）で測定した。この吸光度は生存細胞数に比例す
る。 そこで、試料無処理ウエルの吸光度の５０％の値に相当
する吸光度を示すウエルにおける試料の最終希釈率を求
め、この試料希釈率の逆数をその試料の１ｍｌ当りのユ
ニット数〔ユニット／ｍｌ〕と定義する。
施例１２で得られたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチ
ドの一段階精製試料及び精製試料について、マウス由来
結合組織細胞Ｌ９２９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１）に対す
る細胞傷害活性をＡｇｇａｒｗａｌら〔Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ．ｃｈｅｍ．，２６０，２３４５（１９８５）〕の方
法に準じて求めた。すなわち、９６ウエルの組織培養用
のマイクロプレート（コーニング社製）に３×１０４細
胞／０．１ｍｌ／ウエルでＬ９２９細胞を植え、５％炭
酸ガス存在下３７℃で一晩培養した。培地としては、１
０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏによって修
飾されたイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（Ｄ
ＭＥ培地、シグマ社製）を用いた。翌日、最終濃度１μ
ｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを添加した上記培地に培
地を交換し、この培地にて段階希釈した試料を各ウエル
に処理した（総培地量０．１ｍｌ）。更に２０時間の培
養後、０．５％クリスタル・バイオレット溶液（０．５
％クリスタル・バイオレット／２０％メタノール）にて
プレートに付着した生細胞を染色（室温、１５分間）し
た。１ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を
含むリン酸バッファーＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ・Ｋリ
ン酸塩ｐＨ７．４、０．８％ＮａＣｌ及び０．０２％Ｋ
Ｃｌ）で充分洗浄した後、３０％エタノールを含む０．
０１Ｎ塩酸溶液０．１ｍｌを用いてプレートに残ったク
リスタル・バイオレットを抽出し、その吸光度（４９２
ｎｍ）をＥＩＡリーダー（バイオ・ラド社製、モデル２
５５０）で測定した。この吸光度は生存細胞数に比例す
る。 そこで、試料無処理ウエルの吸光度の５０％の値に相当
する吸光度を示すウエルにおける試料の最終希釈率を求
め、この試料希釈率の逆数をその試料の１ｍｌ当りのユ
ニット数〔ユニット／ｍｌ〕と定義する。
【０１１７】上記方法に準じて求めたＬ９２９細胞傷害
活性（ユニット／ｍｌ）から各試料の比活性（ユニット
／ｍｇ・蛋白）を算出するために、各試料の蛋白定量を
行った。定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，７２，２４８（１９７６）〕に準じ、標準
試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白濃度（ｍｇ
／ｍｌ）を求めた。これらの結果より、ヒトＴＮＦ及び
同転換体ポリペプチド試料について算出した比活性を表
２に示した。
活性（ユニット／ｍｌ）から各試料の比活性（ユニット
／ｍｇ・蛋白）を算出するために、各試料の蛋白定量を
行った。定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，７２，２４８（１９７６）〕に準じ、標準
試料としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白濃度（ｍｇ
／ｍｌ）を求めた。これらの結果より、ヒトＴＮＦ及び
同転換体ポリペプチド試料について算出した比活性を表
２に示した。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】上記表２から、本発明のヒトＴＮＦ転換体
ポリペプチドは、ヒトＴＮＦと同様、マウス由来結合組
織細胞Ｌ９２９に対する細胞傷害活性作用を有すること
がわかる。
ポリペプチドは、ヒトＴＮＦと同様、マウス由来結合組
織細胞Ｌ９２９に対する細胞傷害活性作用を有すること
がわかる。
【０１２０】
実施例１４（ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の評価）実施
例１２で得られたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチド
の一段階精製試料について、マウス可移植線維芽肉腫Ｍ
ｅｔｈＡ腫瘍に対する抗腫瘍治療活性を求めた。試験は
、生理食塩水に懸濁した１×１０６細胞／０．２ｍｌの
ＭｅｔｈＡ腫瘍細胞（佐々木研究所より分与）をＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（雄、５週令、チャールズ・リバー）の背
中部皮下に移植し、８日後腫瘍径が６〜１０ｍｍに達し
たのを確認し、生理食塩水にて段階希釈した試料（０．
２ｍｌ／マウス）を尾静脈より投与することにより行っ
た。致死量を最高投与量とし、数段階の希釈により各投
与試料を作製した。
例１２で得られたヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチド
の一段階精製試料について、マウス可移植線維芽肉腫Ｍ
ｅｔｈＡ腫瘍に対する抗腫瘍治療活性を求めた。試験は
、生理食塩水に懸濁した１×１０６細胞／０．２ｍｌの
ＭｅｔｈＡ腫瘍細胞（佐々木研究所より分与）をＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（雄、５週令、チャールズ・リバー）の背
中部皮下に移植し、８日後腫瘍径が６〜１０ｍｍに達し
たのを確認し、生理食塩水にて段階希釈した試料（０．
２ｍｌ／マウス）を尾静脈より投与することにより行っ
た。致死量を最高投与量とし、数段階の希釈により各投
与試料を作製した。
【０１２１】投与後約２週間、腫瘍増殖等の観察を続け
た。腫瘍増殖については、腫瘍容積（腫瘍塊の長径×短
径２／２）を計測し、試料投与日（０日）の腫瘍容積に
対する腫瘍容積率を求め、この値が２又は５となる試料
投与日からの日数（Ｄ２又はＤ５）を算定する。そして
、コントロール群（生理食塩水投与）に対する比率を算
出し、Ｄ２％コントロール値及びＤ５％コントロール値
を求めた。その値が大きい程、腫瘍増殖能が低下してお
り高い抗腫瘍活性を示すことを意味する。上記に準じて
得られた結果を表３及び表４に掲載した。
た。腫瘍増殖については、腫瘍容積（腫瘍塊の長径×短
径２／２）を計測し、試料投与日（０日）の腫瘍容積に
対する腫瘍容積率を求め、この値が２又は５となる試料
投与日からの日数（Ｄ２又はＤ５）を算定する。そして
、コントロール群（生理食塩水投与）に対する比率を算
出し、Ｄ２％コントロール値及びＤ５％コントロール値
を求めた。その値が大きい程、腫瘍増殖能が低下してお
り高い抗腫瘍活性を示すことを意味する。上記に準じて
得られた結果を表３及び表４に掲載した。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
【表４】
【０１２４】表３及び表４からヒトＴＮＦ転換体ポリペ
プチドは、ヒトＴＮＦと同様、マウス移植ＭｅｔｈＡ腫
瘍に対する抗腫瘍治療活性作用を有することがわかる。
プチドは、ヒトＴＮＦと同様、マウス移植ＭｅｔｈＡ腫
瘍に対する抗腫瘍治療活性作用を有することがわかる。
【０１２５】実施例１５（腫瘍の肺転移に及ぼす効果）
Ｂ１６Ｆ１０マウス悪性黒色腫細胞（千葉大 医学部
より分与）を以下の方法でクローン化することにより、
肺に対して高転移性を示すクローンを樹立した。すなわ
ち、イーグルのミニマム・エッセンシャル培地（ＭＥＭ
培地、日水製薬社製）に懸濁した２×１０４細胞／０．
２ｍｌのＢ１６Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６ ＮＣｒ
ｊマウス（雌、６週令、チャールズ・リバー）の尾静脈
内に注入し、１４日後に肺を摘出した。ＤＭＥ培地で洗
浄後、肺表面に形成された直径１ｍｍ程度の転移結節の
１つを２６Ｇ注射針付シリンジ（テルモ社製）を用いて
吸引し、１ｍｌのＤＭＥ培地に懸濁した後、１０％のウ
シ胎児血清を含むＤＭＥ培地含有軟寒天上で、５％炭酸
ガス存在下３７℃で培養することによりコロニー形成を
行った。このコロニー形成法は、「組織培養の技術」（
ページ３５〜３６、１９８４年、日本組織培養学会編、
朝倉書店）記載の方法に準じた。１０〜１２日後、コロ
ニーの径が１〜２ｍｍに達したところでパスツールピペ
ットを用いてコロニーを吸引し、１０％のウシ胎児血清
を含むＤＭＥ培地中にて培養した。培養後、増殖した細
胞を再びＭＥＭ培地を用いて２×１０４細胞／０．２ｍ
ｌの細胞濃度に調製し、上記の場合と同様、同マウスの
尾静脈内に注入した。１４日後に肺を摘出し、前回と同
様にして、転移結節の１つを単離・培養した。このよう
な操作を５回繰り返し、肺に高転移性を示すクローン（
Ｂ１６Ｆ１０／Ｌ５と命名）を獲得した。
Ｂ１６Ｆ１０マウス悪性黒色腫細胞（千葉大 医学部
より分与）を以下の方法でクローン化することにより、
肺に対して高転移性を示すクローンを樹立した。すなわ
ち、イーグルのミニマム・エッセンシャル培地（ＭＥＭ
培地、日水製薬社製）に懸濁した２×１０４細胞／０．
２ｍｌのＢ１６Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６ ＮＣｒ
ｊマウス（雌、６週令、チャールズ・リバー）の尾静脈
内に注入し、１４日後に肺を摘出した。ＤＭＥ培地で洗
浄後、肺表面に形成された直径１ｍｍ程度の転移結節の
１つを２６Ｇ注射針付シリンジ（テルモ社製）を用いて
吸引し、１ｍｌのＤＭＥ培地に懸濁した後、１０％のウ
シ胎児血清を含むＤＭＥ培地含有軟寒天上で、５％炭酸
ガス存在下３７℃で培養することによりコロニー形成を
行った。このコロニー形成法は、「組織培養の技術」（
ページ３５〜３６、１９８４年、日本組織培養学会編、
朝倉書店）記載の方法に準じた。１０〜１２日後、コロ
ニーの径が１〜２ｍｍに達したところでパスツールピペ
ットを用いてコロニーを吸引し、１０％のウシ胎児血清
を含むＤＭＥ培地中にて培養した。培養後、増殖した細
胞を再びＭＥＭ培地を用いて２×１０４細胞／０．２ｍ
ｌの細胞濃度に調製し、上記の場合と同様、同マウスの
尾静脈内に注入した。１４日後に肺を摘出し、前回と同
様にして、転移結節の１つを単離・培養した。このよう
な操作を５回繰り返し、肺に高転移性を示すクローン（
Ｂ１６Ｆ１０／Ｌ５と命名）を獲得した。
【０１２６】１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地中
で直径１０ｃｍの組織培養用ディッシュ（コーニング（
登録商標）、岩城硝子社製）を用いて培養した対数増殖
期のＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞を、ディッシュ付着状態で
リン酸バッファーＰＢＳを用いて１回洗浄し、ＭＥＭ培
地５ｍｌを加えピペッティングを行うことにより細胞懸
濁液とした。遠心分離操作により細胞を集め、２ｍｌの
ＭＥＭ培地に再懸濁した。一方、実施例１２で得られた
ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試料
を、所定の濃度（実施例１４の抗腫瘍治療試験において
、治療効果を示した投与量を本試験の投与量として使用
した。）になるようにＭＥＭ培地で希釈し、その溶液中
に先に調製したＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞懸濁液を添加す
ることにより、２×１０４細胞／０．２ｍｌの各一段階
精製試料を含む細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液
をＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（雌、６週令）の尾静
脈より投与した（０．２ｍｌ／マウス）。コントロール
群はＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞のみを投与した。投与１４
日後に肺を摘出し、肺表面の転移結節数を計測した。 上記に準じて得られた結果を表５及び表６に掲載した。
で直径１０ｃｍの組織培養用ディッシュ（コーニング（
登録商標）、岩城硝子社製）を用いて培養した対数増殖
期のＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞を、ディッシュ付着状態で
リン酸バッファーＰＢＳを用いて１回洗浄し、ＭＥＭ培
地５ｍｌを加えピペッティングを行うことにより細胞懸
濁液とした。遠心分離操作により細胞を集め、２ｍｌの
ＭＥＭ培地に再懸濁した。一方、実施例１２で得られた
ヒトＴＮＦ及び同転換体ポリペプチドの一段階精製試料
を、所定の濃度（実施例１４の抗腫瘍治療試験において
、治療効果を示した投与量を本試験の投与量として使用
した。）になるようにＭＥＭ培地で希釈し、その溶液中
に先に調製したＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞懸濁液を添加す
ることにより、２×１０４細胞／０．２ｍｌの各一段階
精製試料を含む細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液
をＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（雌、６週令）の尾静
脈より投与した（０．２ｍｌ／マウス）。コントロール
群はＢ１６Ｆ１０／Ｌ５細胞のみを投与した。投与１４
日後に肺を摘出し、肺表面の転移結節数を計測した。 上記に準じて得られた結果を表５及び表６に掲載した。
【０１２７】
【表５】
【０１２８】
【表６】
【０１２９】表５及び表６から、ヒトＴＮＦ及び同変換
体ポリペプチドが実験的肺転移を亢進する作用を有する
のに対し、そのＮ末端近傍にＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ配列を導入した本発明のヒトＴＮＦ転換
体ポリペプチドは実験的肺転移を亢進しないことがわか
る。
体ポリペプチドが実験的肺転移を亢進する作用を有する
のに対し、そのＮ末端近傍にＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ配列を導入した本発明のヒトＴＮＦ転換
体ポリペプチドは実験的肺転移を亢進しないことがわか
る。
【０１３０】
【発明の効果】本発明によれば、ヒトＴＮＦ又はその変
換体において、配列表の配列番号１の１番目のＳｅｒか
ら８番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対
応するヒトＴＮＦ変換体のアミノ酸配列がラミニンの細
胞接着性ペプチド配列を少なくとも１個含み、かつ、５
個〜３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換さ
れることにより、ヒトＴＮＦ又はその変換体と同様の抗
腫瘍活性作用を有し、一方それらで認められた癌転移の
亢進作用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体が提供され
る。
換体において、配列表の配列番号１の１番目のＳｅｒか
ら８番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対
応するヒトＴＮＦ変換体のアミノ酸配列がラミニンの細
胞接着性ペプチド配列を少なくとも１個含み、かつ、５
個〜３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換さ
れることにより、ヒトＴＮＦ又はその変換体と同様の抗
腫瘍活性作用を有し、一方それらで認められた癌転移の
亢進作用を示さない新規なヒトＴＮＦ転換体が提供され
る。
配列番号 ：１
配列の長さ：１５５
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配 列
配列番号 ：２
配列の長さ：１５
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配 列
配列番号 ：３
配列の長さ：１７
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配 列
配列番号 ：４
配列の長さ：１１
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配 列
配列番号 ：５
配列の長さ：１３
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖伏
配列の種類：ペプチド
配 列
配列番号 ：６
配列の長さ：１８
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配 列
配列番号 ：７
配列の長さ：４６５
配列の型 ：核 酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ
配 列
配列番号 ：８
配列の長さ：４３
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配 列
配列番号 ：９
配列の長さ：２１
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配 列
配列番号 ：１０
配列の長さ：３６
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配 列
配列番号 ：１１
配列の長さ：３２
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配 列
配列番号 ：１２
配列の長さ：２７
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配 列
【図１】合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の構築過程を示す工程図である。
Ｆ遺伝子の構築過程を示す工程図である。
【図２】合成オリゴヌクレオチドの連結によるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の構築過程を示す工程図である。
Ｆ遺伝子の構築過程を示す工程図である。
【図３】ヒトＴＮＦ発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。
程を示す工程図である。
【図４】ヒトＴＮＦ発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。
図である。
【図５】部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ変換体遺伝
子の作製過程を示す工程図である。
子の作製過程を示す工程図である。
【図６】部位特異的変異法によるヒトＴＮＦ転換体遺伝
子の作製過程を示す工程図である。
子の作製過程を示す工程図である。
【図７】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。
るヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工程
図である。
【図８】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。
るヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。
【図９】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えによ
るヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。
るヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築過
程を示す工程図である。
【図１０】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築
過程を示す工程図である。
よるヒトＴＮＦ転換体発現型プラスミドベクターの構築
過程を示す工程図である。
【図１１】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工
程図である。
よるヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工
程図である。
【図１２】制限酵素切断部位を利用する遺伝子組換えに
よるヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工
程図である。
よるヒトＴＮＦ転換体発現ベクターの構築過程を示す工
程図である。
【図１３】大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ及び同転
換体ポリペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図で
ある。
換体ポリペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図で
ある。
【図１４】大腸菌により発現されたヒトＴＮＦ転換体ポ
リペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図である。
リペプチドの精製試料の電気泳動結果を示す図である。
Claims (19)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示した１番目の
Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
前記変換体のアミノ酸配列がラミニンの細胞接着性ペプ
チド配列を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個の
アミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されていること
を特徴とするポリペプチド。 - 【請求項２】 前記ラミニンの細胞接着性ペプチド配
列が配列表の配列番号２で示したアミノ酸配列において
３番目のＴｙｒから７番目のＡｒｇまでで表わされるア
ミノ酸配列である請求項１記載のポリペプチド。 - 【請求項３】 ラミニンの細胞接着性ペプチド配列を
少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個のアミノ酸を
含むアミノ酸配列が配列表の配列番号２、３、４、５又
は６でそれぞれ示したアミノ酸配列である請求項１記載
のポリペプチド。 - 【請求項４】 ラミニンの細胞接着性ペプチド配列を
少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個のアミノ酸を
含むアミノ酸配列が配列表の配列番号２、３又は４でそ
れぞれ示したアミノ酸配列である請求項１記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５】 前記腫瘍壊死因子ポリペプチドあるい
はその変換体が、配列番号１で示した９番目のＬｙｓか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列あ
るいは当該アミノ酸配列の６８番目のＰｒｏが他のアミ
ノ酸により置換されたアミノ酸配列を有する請求項１又
は３記載のポリペプチド。 - 【請求項６】 他のアミノ酸がＡｓｐ又はＭｅｔであ
る請求項５記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 配列表の配列番号１で示した１番目の
Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
前記変換体のアミノ酸配列がラミニンの細胞接着性ペプ
チド配列を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個の
アミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているポリ
ペブチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする組
換えプラスミド。 - 【請求項８】 前記組換えプラスミドがｐＫＦ４１４
６、ｐＫＦ４２３６、ｐＫＦ４４１９、ｐＫＦ４４２２
、ｐＫＦ４４２３、ｐＫＦ４６０３又はｐＫＦ４６０４
である請求項７記載の組換えプラスミド。 - 【請求項９】 配列表の配列番号１で示した１番目の
Ｓｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ
酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変換
体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８番
目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応する
前記変換体のアミノ酸配列がラミニンの細胞接着性ペプ
チド配列を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個の
アミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドに
より形質転換された組換え微生物細胞。 - 【請求項１０】 前記組換え微生物細胞が大腸菌であ
る請求項９記載の組換え微生物細胞。 - 【請求項１１】 配列表の配列番号１で示した１番目
のＳｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミ
ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
換体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８
番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
る前記変換体のアミノ酸配列がラミニンの細胞接着性ペ
プチド配列を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個
のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているポ
リペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド
により形質転換された組換え微生物細胞を培地中で培養
し、当該アミノ酸配列を有するポリペプチドを産生し分
離することを特徴とするポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１２】 配列表の配列番号１で示した１番目
のＳｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミ
ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
換体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８
番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
る前記変換体のアミノ酸配列がラミニンの細胞接着性ペ
プチド配列を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個
のアミノ酸を含むアミノ酸配列により置換されているポ
リペプチドを有効成分として含有することを特徴とする
医薬組成物。 - 【請求項１３】 前記ラミニンの細胞接着性ペプチド
配列が配列表の配列番号２で示したアミノ酸配列におい
て３番目のＴｙｒから７番目のＡｒｇまでで表わされる
アミノ酸配列であるポリペプチドを含有する請求項１２
記載の医薬組成物。 - 【請求項１４】 ラミニンの細胞接着性ペプチド配列
を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個のアミノ酸
を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号２、３、４、５
又は６でそれぞれ示したアミノ酸配列であるポリペプチ
ドを含有する請求項１２記載の医薬組成物。 - 【請求項１５】 ラミニンの細胞接着性ペプチド配列
を少なくとも１個含み、かつ、５個〜３０個のアミノ酸
を含むアミノ酸配列が配列表の配列番号２、３又は４で
それぞれ示したアミノ酸配列であるポリペプチドを含有
する請求項１２記載の医薬組成物。 - 【請求項１６】 前記腫瘍壊死因子ポリペプチドある
いはその変換体が配列番号１で示した９番目のＬｙｓか
ら１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列あ
るいは当該アミノ酸配列の６８番目のＰｒｏが他のアミ
ノ酸により置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを含有する請求項１２又は１４記載の医薬組成物。 - 【請求項１７】 他のアミノ酸がＡｓｐ又はＭｅｔで
あるポリペプチドを含有する請求項１６記載の医薬組成
物。 - 【請求項１８】 配列表の配列番号１で示した１番目
のＳｅｒから１５５番目のＬｅｕまでで表わされるアミ
ノ酸配列を有する腫瘍壊死因子ポリペプチド又はその変
換体において、前記配列番号１の１番目のＳｅｒから８
番目のＡｓｐまでのアミノ酸配列あるいはそれに対応す
る前記変換体のアミノ酸配列がラミニンの細胞接着性ペ
プチド配列を有するアミノ酸配列を少なくとも１個含み
、かつ、５個〜３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列に
より置換されており、更にそのＮ末端にＭｅｔを有する
ことを特徴とするポリペプチド。 - 【請求項１９】 配列表の配列番号７で示した１番目
のＴから４６５番目のＧまでで表わされる塩基配列を有
する腫瘍壊死因子ポリペプチドのＤＮＡ又はその変異導
入ＤＮＡにおいて、前記配列番号７の１〜３番目のＴＣ
Ａから２２〜２４番目のＧＡＣまでの塩基配列あるいは
それらに対応する前記変異導入ＤＮＡの塩基配列がラミ
ニンの細胞接着性ペプチド配列を少なくとも１個含み、
かつ、５個〜３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列により置換されていることを特徴とす
るＤＮＡ。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3240130A JPH04368397A (ja) | 1991-06-17 | 1991-06-17 | ポリペプチド |
| JP3311284A JPH05255393A (ja) | 1990-09-21 | 1991-09-19 | ポリペプチド |
| EP91116065A EP0479071B1 (en) | 1990-09-21 | 1991-09-20 | Polypeptide |
| DE69120626T DE69120626T2 (de) | 1990-09-21 | 1991-09-20 | Polypeptid |
| US07/763,512 US5247070A (en) | 1990-09-21 | 1991-09-20 | N-terminal muteins of tumor necrosis factor |
| AT91116065T ATE140008T1 (de) | 1990-09-21 | 1991-09-20 | Polypeptid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3240130A JPH04368397A (ja) | 1991-06-17 | 1991-06-17 | ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04368397A true JPH04368397A (ja) | 1992-12-21 |
Family
ID=17054947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3240130A Pending JPH04368397A (ja) | 1990-09-21 | 1991-06-17 | ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04368397A (ja) |
-
1991
- 1991-06-17 JP JP3240130A patent/JPH04368397A/ja active Pending
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