JPS6312299A - ポリペプチドの生産のための発現ベクタ−、ポリペプチドの交換発現法、発現ベクタ−を含有する宿主、それによりつくられた生産物 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白質およびポリペプチド、製薬学的組成物
、プロモーター、オペレーター、遺伝子、ベクター、そ
れらを生産する宿主および方法に関する。

本発明は、蛋白質およびポリペプチド、ことにＭｅｔ−
アプロチニンおよびＭｅｔ−アプロチニン同族体（ｈｏ
ｍｏｌｏｇｕｅｓ）、組換えＤＮＡ技術によるそれらの
生産、新規な有機体発現遺伝子、新規な発現ベクター、
例えば、プロモーター、オペレーター、増幅された遺伝
子、およびオリゴマー遺伝子の構成手順に関する。

ここに開示する化学的に合成されたＤＮＡ分子は、ＤＮ
Ａ配列によって特徴づけられる。

Ｍｅｔ−アプロチニンおよびＭｅｔ　　７７’ロチニン
同族体の遺伝子の場合において、ＤＮＡ配列は、アミノ
酸配列および組成が７ブロチニンまたはアプロチニン同
族体のそれに実質的に一致し且つアプロチニンまたはア
プロチニン同族体の生物学的活性を有する新規なポリペ
プチドまたはポリペプチドの遺伝情報を指定する。

７ブロチニンは５８アミノ酸を含み且つトリプシン、キ
モトリプシン、プラスミンおよびカリクレインを阻害す
る作用を有する、よく知られたペプチドである。それは
ウシ器官からの塩基性プロイテナーゼ阻害剤であり、そ
して種々の病気、例えば、ｆｆ１ａ維素溶解性出血およ
びトラウマチン出血ショックの処置のための価値ある薬
物、Ｔｒａｓｙｌｏｌ［Ｆ］、となった［概観について
は、Ｈ，７リツツ（Ｆｒｉ’ｔｚ）およびＧ、ツンデレ
ル（Ｗｕｎｄｅｒｅｒ）、１９８３、薬物の研究（Ｄｒ
ｕｇ、　Ｒｅｓ、　）　３３．４７９−４９４８照］。

最近、位置１５にリジンの代わりに他のアミノ酸をもつ
アプロチニン同族体は、アプロチニンに比べて変更され
た作用および効能を有する価値あるプロイテナーゼ阻害
剤であることが示された［　ドイツ国公開明細書（ＤＥ
−Ｏ８＞３３　３９６９３号；　ＨｏＲ，ベンイル（Ｗ
ｅｎｚｅｌ）ら、１９８５、ペプチドおよび蛋白質の化
学、Ｖｏｌ。

３Ｊ、これらのアプロチニン同族体は膵臓および白血球
からのエラステラーゼ、お上びカテブシンＧに討して強
い阻害作用を有する。

このようなアプロチニン同族体は、次のエラステラーゼ
の過度の放出、膵臓エラステラーゼ（膵炎）、血清エラ
ステラーゼ［アルセロＳクレオシス（ａｒｔｈｅｒｏｓ
ｃｌｅｒｏｓｉｓ）　］　、結結合織への損傷を伴う急
性および慢性の炎症、血Ｗ壁への損傷、壊死の病気およ
び肺１ｔｔ維の変性における白血球エラステラーゼ、に
関連する病気において治療学的に使用することができる
。とくに白血球エラステラーゼ、免疫学的プロセスによ
る炎症反応、例えば、リウマチ性関節炎において、およ
び心筋抑制因子として、および衝撃症候群においてリゾ
シーム酵素が演する部分は同等に重要である。

アプロチニンおよびアプロチニン同族体はウシ器官から
、およびウシトリプシン阻害剤の半合成的転化により得
ることができる［チェシュ（Ｔｓｃｈｅｓｅｈｅ）　、
Ｍ、　、ベンイル（Ｗｅｎｚｅｌ）　、Ｍ、、シュムク
（５ｅｈＩＩ＋ｕｅｋ）　、Ｒ，、シュナベル（Ｓ　ｃ
ｈｎａｂｅｌ）　、Ｅ、　、ドイツ国公開明細書（０３
−ＤＥ）３３　３９　６９３号、１９８５年５月１５日
発行１が、収量は比較的少ない。

組換えＤＮＡ技術および関連する技術は高い品質の同族
体を必要な多い量で得る有効な方法であろうことが考え
られた。この目標は、宿主有機体から組換えＤＮＡ技術
の非融合生産物として、Ｍｅｔ−アプロチニンおよびＭ
ｅｔ−アプロチニン同族体を生産することであった。

既知のアミノ酸配列のポリペプチドの遺伝情報を指定す
るＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ配列、ｓ＋ＲＮＡに対して相
補的であるｅＤＮＡを使用することにより、あるいは遺
伝暗号に従うコドンを選択することおよび合成遺伝子を
ｉｌｌ！ｉ！することによって′ｆ１４製することがで
きる。

ウシ膵臓トリプシン阻害剤の遺伝子からのウシデノムク
ローンの部分的ＤＮＡ配列は、Ｓ、アンダーツ７　（Ａ
　ｎｄｅｒｓｏｎ）および１．Ｂ、キングストン（Ｋ　
１ｎＨｔｏｎ）　、１９８３、プロシーディンゲス・オ
プ・ナショナル・アカデ　ミー・オプ・サイエンシズ（
Ｐｒｏｅ、ＮａＬｌ、Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　）ＵＳＡ
、８０．６８３−６８４２、によってクローニングされ
て、ＢＰＰＴＩのためのデノムクローンが特徴づけられ
た。最近、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ＝アプ
ロチニン）およびウシ膵臓阻害剤ＩＩのための解読領域
を含有するウシデノムの２つのほぼ４キロ塩基対のセグ
メントが、キングストン（ＫｉｎＨｓｔｏｎ）　、１．
　　Ｂ、およびアングーンン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）　、
Ｓ、　、１９８６、バイオケミカル・ツヤ−ナル（Ｂｉ
ｏｃｈｅＩＩ、　　Ｊ、　）、２３３．４４３−４５０
に発表された。

最近、アプロチニン同族体はＤＮＡ技術により、遺伝子
がβ−ガラクトシダーゼに融合された構成体を使用して
調製できることが示された。

通常、宿主細胞のある属または種において天然に存在す
る異質（相同）ポリペプチドについての情報を、異質ポ
リペプチドの情報と組合せる融合した遺伝子のアプロー
チによって、バクテリア宿主中で咄乳動物の蛋白質を発
現されることは、バクチリフの宿主細胞に非融合異質ポ
リペプチドを発現させることよりも、非常に容易である
。これは完全には理解されない種々の複雑なプロセスの
ためである。宿主細胞中の異質ポリペプチドの発現また
はＭ積を妨害するとイ６じられる因子のいくつかは、次
のものを包含する： １、　異質ポリペプチドは宿主細胞により分解されるこ
とがある。

２、　異質ポリペプチドは宿主細胞に毒性の作用を及ぼ
すことがある。

分解の問題は、大きい異質ポリペプチドに関してより、
小さい異質ポリペプチドに関して一層きびしいと信じら
れる。

約１００より多いアミノ酸残基をもつ広範な種類の異質
ポリペプチドがＥ、ｃｏｌ、内で発現されてきたが、発
現をなそうとする多数の試みにもかかわらず、比較的わ
ずかの異質ポリペプチドがＥ。

ｃｏｌ、内で発現されただけである。

バクテリアの細胞内で異質ポリペプチドを発現させると
いう問題を克服するために、ある数の努力において融合
ポリペプチドが利用されてきた。

このようなアプローチの欠点は、次のものを包含する： １、　挿入された構造遺伝子は、Ｅ、　ｅｏｌ、遺伝子
のＡＵＧ開始コドンに関して適切なリーディング７レー
ム中に存在しなくてはならない。

２、　異質ポリペプチドは、融合ポリペプチドから、あ
る種のアミノ酸残基を修飾および／または分解する化学
物質（例えば、臭化シアンによるメチオニン；スクシン
アミド１こよるトリプトファン）により切断しなくては
ならず、それゆえ！４質ポリペプチドはこのような７ミ
／酸残基を含有してはならな警１゜ 発現すべき遺伝子のコピーの数は、各発現ベクターにつ
いて通常１つである。理論的には、いくつかの遺伝子を
１つの遺伝子発現制御系で調節することが可能である［
Ｎ、　　シー（’　Ｌｅｅｅ）ら、１９８４、核酸の研
究（Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）、１２、６
７９７−６８１２］。

ｙ４Ｙ！Ｉポリペプチドの発現レベルと増加すること、
あるいは発現されたポリペプチドを安定化することは、
Ｓ−Ｈ，ジエン（５ｈｓｎ）　、プロシーディンゲス・
オブ・ナショナル−アカデミ−・オプ・サイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳ
Ａ、８１．４６２７−４６３１に示されているように、
多領域（ｓ＋ｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ）ポリマー法によっ
て達成することができる。彼が示したところによると、
プロインシュリン解読配列は、融合発現系および非融合
発現系で発現された生産物の安定性を増加することがで
きた。彼の生産物は、臭化シアンによって切断されなく
てはならない多領域ポリペプチドであった。

異質ポリペプチドを含む以上蛋白質がＥ、　ｃｏｌ。

中で分解する機構は、完全には理解されていない。

ある種の宿主蔚株の選択は、そうでなければ不安定なポ
リペプチドのあるものを安定化することがある［ゴッテ
スマン（Ｇ　ｏｔｔｅｓｍａｎｎ）　、Ｓ　、およびノ
ブサー（Ｚ　１ｐｓｅｔ）、Ｄ、１９７０．ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　１ｏｃｈｅ
ａ＋、）、１３３．８４４−８５１１゜しかしながら、
これらの突然変異体はＥ、ｃａｌ、中で発現される異質
ポリペプチドの各々を安定化しない。

本発明の１つの目的は、Ｍｅｔ−アプロチニン、Ｍｅｔ
−アプロチニン同族体、それらを暗号化する核酸、前記
核酸を組込んだベクター、それで形質転換された新規な
修飾された細胞、およびＭ　ｅ　ｔ　−アプロチニンお
よびＭｅｔ−アプロチニン同族体を得る方法に関する。

用ｍ　Ｍ　ｅ　ｔ−アプロチニンは、ゼロ（０）位置に
おけるアミノ酸が７チオニンであるアブロチエンを意味
する。

遺伝子の構成のため、適切な設計（ｄｅｓｉｇｎ）をも
ち且つ広い用途を約束する合成遺伝子をｒｉｌｌ！Ｍす
るためのコドンを選択することは、最も有利であった。

これは、とくに、制限酵素の独特認識部位によって停止
するＤＮＡブロックまたはカセットからなる合成マスタ
ー遺伝子を構成する場合である。このような遺伝子の設
計は、このようなりＮＡブロック内のすべてのＤＮＡ配
列の容易な修飾または突然変異を可能とし、そしてここ
に開示する。

アミノ末端が追加のメチオニンで置換されたアプロチニ
ン同族体は組換えＤＮＡ技術によって調製さｈた。この
ようなアプロチニン同族体、例えば、Ｖａｌ−１５−１
Ｉｌｅ−１５−１Ｌｅｕ−１５−１Ｐｈｅ−１５−１Ａ
ｌａ−１５−１Ａｒｇ　１５−１Ｇｌｙ−１５−１Ｓｅ
ｒ１５−１Ｓｅｒ１５−１Ｔｈｒ−１５−１Ｔｒｐ−１
５−１お上りＴｙｒ−１５−アプロチニンは、既知のア
プロチニンおよびその同族体類に等しいことが発見され
た。

単位の投与または液体の形態の製薬学的組成物を記載す
る。

本発明は、さらに、調節配列、例えば、プロモーター、
オペレーター、リポソーム結合部位、リポソームをプー
ルするための配列、転写ターミネータ−を含む新規な発
現ベクターを提供し、さらにバクテリア宿主細胞に非融
合異質ポリペプチドを発現させる典型的なプラスミド機
能および遺伝子または遺伝子のオリゴマーを提供する。

本発明のそれ以上の面において、バクテリアの宿主にオ
リゴマー化遺伝子を発現させることによって、単一のく
非融合）ポリペプチドを結合しかつその遺伝情報を指定
するリポソームのためのＤＮＡ配列と組合わされた、遺
伝子のオリゴマーを含む遺伝子生産物を生産する方法が
提供される。

この面に関して、特別の構成（ｅｏｎｓＬｒｕｅｔｉｏ
ｎ）ベクターを使用する単一遺伝子のオリゴマー化の方
法、および遺伝子的に修飾されたバクテリア宿主を開示
する。

本発明は、微生物学的に生産されたＭｅｔ−アプロチニ
ンおよびＭｅｔ−アプロチニン同族体に関する。

微生物学的に生産されたＭｅｔ−アプロチニンは、位置
１５が天然に産出するアミノ酸、とくにＡｒｃ、Ｖａｌ
、Ｔｈｒ、　　Ｉ　Ｉｅ、　Ｌｅｕ％Ｐｈｅ、　Ｇｌｙ
、　Ｓｅｒ、Ｍｅｔ％Ｔ　ｒｐｓ　Ｔ　ｙｒおよびＡ　
ｆａ？置換されることができる。

微生物学的に生産されたＭｅｔ−アブロチエンは、また
、位置５２がＧｌｕ％Ｌｅｕ％Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＳ
ｅｒで置換されることができる。こうして、微生物学的
に生産されたＧｌｕ　　５２−Ｍｅｔ−アプロチニンま
たはＶａｌ　　１５　　Ｇｌｕ　　５２　　Ｍｅｔ−ア
プロチニン、またはＩ　ｌｅ−１５−Ｇｌｕ　−５２−
Ｍｅｔ−アプロチニンまたはＬｅｕ−１５−Ｇｌｕ　　
５２−Ｍｅｔ−アプロチニンを得ることがで鰺る。

Ｍｅｔ−アプロチニンの遺伝情報を指定するＤＮＡは、
コドン１５および／またはコドン５２において、天然に
産出するアミノ酸の遺伝情報を指定するコーンによって
置換されることができる。ＤＮＡ１．ｔＡｒｇ、Ｖａｌ
、Ｔｈｒｌｌ　Ｉｅ、　Ｌｅｕ、　ＰｈｅＳＧｌｙＳＳ
ｅｒ、　Ｍｅｔ、　Ｔｒｐ、　ＴｙｒおよびＡｌａから
成る群より選択されるアミノ酸の遺伝情報を指定するコ
ドンによってＩＲ換されることができる。

本発明は、さらに、配列 を有するＤＮＡを上流に有する蛋白質またはポリペプチ
ドの遺伝情報を指定するＤＮＡまたはその中幾能的同等
体、およびまた、配列 を有するＤＮＡを下流に有する蛋白質またはポリペプチ
ドの遺伝情報を指定するＤＮＡまたはその機能的同等体
に関に関する。

とくに、本発明は、配列 を有するＤＮＡを上流に有する蛋白質またはポリペプチ
ドの遺伝情報を指定するＤＮＡまたはその機能的同等体
、およびまた、配列 を有するＤＮＡを下流に有する蛋白質またはボリペプチ
ドの遺伝情報を指定するＤ　Ｎ　Ａまたはその機能的同
等体に関に関する６ 例えば、前記ＤＮＡが遺伝情報を指定するポリペプチド
は、インシュリン、プロインシュリン、バンプレシン、
オキシトシン、リボヌクレアーゼ、成長ホルモン、Ｍｅ
ｔ−アプロチニンお上りＭｃｔ−アプロチニン同族体で
あることができる。

本発明の他の目的は、解読配列のコピーが、配列 を有するＤＮＡを上流に有し、かつ配列を有するＤＮＡ
を下流に有する蛋白質またはポリペプチドの遺伝情報を
指定するＤＮＡまたはその機能的同等体の１または２以
上から成る蛋白質またはポリペプチドのための発現系で
ある。

配列、 蒼 を有するＤＮＡを記載する。このＤＮＡはアゲブタ−と
しの機能を有するＤＮＡ配列である。

さらに、配列、 を有するＤＮＡを記載する。このＤＮＡは結合配列とし
の機能を有するＤＮＡ配列である。

本発明の他の目的は、配列 １ＤＳ ＥｃｏＲＶ　　　　　Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｘｂａｌを有す
るＤＮＡである。

このＤＮＡは短いペプチドの遺伝情報を指定し、そして
発現エンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅｒ）としての機能を
有する。

配列、 ｃｏＲＶ を有する、オペレーターとしての機能を有するＤＮＡ、
および配列、 −３５プロモー、ター−１０ ｈｏｌ を有するプロモーターとしての機能を有するＤＮＡを記
載する。

この分野において知られているように、記載した配列中
の１または２以上の塩基対の置換は、機能の損失または
変更に必然的に関係しない、したがって、本発明は、ま
た、前記配列の機能的同等体に関する。

両者のＤＮＡ配列は、前記、 −３５プロモーター−１０ ｈｏｌ ｃｏＲＶ および前記配列の機能的同等体を有する、プロモーター
およびオペレーターとしての機能を有するＤＮＡに結合
することができる。

ここに記載する発現系は、プロモーターおよびオペレー
ターとしての機能を有するＤＮＡから構成されたＤＮＡ
配列を上流に有することができ、次いでプラスミド中に
組込まれる。

用語１−発現系」は、蛋白質またはポリペプチドの遺伝
情報を指定し、そして調節配列、例えば、プロモーター
遺伝子およびオペレーターヲ含む構造遺伝子からなるＤ
ＮＡ配列を意味する。

このプラスミドは、微生物、とくにＥ、ｅｅｌ。

微生物を形質転換するために有用である。

前記プラスミドで形質転換されかつＤＳＭ　　３６８５
およびＤＳＭ　　３６８６のＤＭＳ表示を有するＥ、　
ｃｏｌ、ＢＲＩ　７微生物は、最も好ましい。

本発明は、ｐｉＷｉ　　ＴＩＯｗＬｌおよびｐｉＷｉＴ
ｌｌの制限切断地図、およびまた、プラスミドｐｉＷｉ
　　ＴＩＯｗＬｌおよびｐｉＷｉＴｌｌに関する。

プラスミドｐｉＷｉ　　ＴＩＯｗＬｌおよびｐｉＷｉ］
゛１１は、蛋白質およびペプチド、とくにインシュリン
、プロインシュリン、バンプレシン、オキシトシン、リ
ボヌクレアーゼ、成氏ホルモン、Ｍｅｔ−アプロチニン
およびＭｅｔ−アプロチニン同族体から成る群より選択
されるポリペプチドを生産する方法において有用であり
。

本発明において使用する微生物は、トイチェ・ザンムル
ングｅ７オン帝ミクロオルガニスメン（Ｄ　ｅｕｔｑｃ
ｈｅ　　Ｓ　ａｍａｌｕｒ［ｒｖａｎ　　Ｍ　ｉｋｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ。

Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ、８＋　Ｄ−３４００Ｇａｔ
ｔｉｎｇｅｎ）に受託されている。宿主旦工Ｊ旦１．Ｂ
Ｒ１７−ノＤＳＭ表示は、ＤＳＭ　　３６８４である。

プラスミドｐｉＷｉＴ　１０　　ｗｌ　１およびｐｉＷ
ｉＴ１０ｗｉ７で形質転換された宿主微生物Ｅ、ｃｏｔ
。

−１玉１７のＤＳＭ表示は、それぞれ、ＤＳＭ３６８５
およびＤＳＭ　　３６８６である。

以下において、Ｍｅｔ−アプロチニンおよびＭｅｔ−ア
プロチニン同族体の遺伝情報を指定するＤＮＡｌｒ片、
ＦＲ虞ベクター、発現ベクター、発現ベクター、発現プ
ラスミド、それにより形質転換された全生物の構成およ
び選択、およびＭｅｔ−アプロチニンおよびＭｅｔ−ア
プロチニン同族体の微生物学的生産を示す。

組換えＤＮＡの研究のための標準の方法は、マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２、分子クローニング
（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎｌり　、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１米国、コー
ルド・スプリング・ハーバ−に記載される方法方法、お
よび後述するその修正法であった。

既知の蛋白質配列およびアプロチニンおよびアプロチニ
ン同族体の遺伝暗号を使用して、このようなポリペプチ
ドの遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を決定した。

遺伝暗号の同義性は、任意の所定のアミノ酸配列のため
のコドンの選択における実質的な自由砥を許す。

この蛋白質の７ミ／＃！配列を表示するコドンのなかの
すべての可能な塩基置換を決定した。これに従い、可能
なりＮＡ配列内に位置するすべての潜在的な制限部位を
決定した。

マスター遺伝子のためのコドンの選択は、次の考察によ
ってプイドされた： 第１に、断片の不都合な相補性を回避するように、コド
ンおよび断片を選択し、そして断片のアセンブリーを設
計した。

第２に、開始コドンより上流の領域は、リポソームの結
合部位を含有する。なぜなら、開始コドンの領域のまわ
りのコドンについて、リポソームの結合を増大するもの
を選択したからである［　リフ）（Ｌｉｔ）Ｇ、Ｆ、Ｅ
、シューレル（Ｓ　ｃｈｅｒｅｒ）ら、核酸の研究（Ｎ
ｕｅｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）　８．３８９５−
３９０７Ｊ。

第３に、アブロチエンの修飾を容易に生成できるように
、かつクローニングおよび発現の研究ための可能性の範
囲を広くするために、適切な断片の他の断片との置換に
よる形質転換体または塩基のｔｎ換の検証を促進するた
めに必要な制限部位を選択した。

第４に、選択したコドンの大部分は微生物ゲノムの発現
において好ましいものである（Ｈ，グロスノーン（Ｇ　
ｒｏｓｊｅａｎ）およびＷ、７フイ７−ス（Ｆ　１ｅｒ
ｓ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１８（１９８２）１９２−
２０９；　Ｍ、ゴウイ（Ｇｏｕｙ）お上びＣ０〃ウチー
ア（Ｇ　ａｕｔｉｅｒ）　、核酸の研究（Ｎｕｅｌｅｉ
ｅＡｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、１０（１９８
２）　７０５５−７０７４参照］。

合成アプロチニン遺伝子類およびそれらの同族体類の主
要な設計は第１ａ図に示さ虹ている。

含Ｌ１」辷Ｅｕ男處− Ｍｅｔ−アプロチニン同族体のための合成遺伝子を、１
４のＭ製したオリゴヌクレオチドのアセンブリーによっ
てマスター遺伝子を経て構成した。

合成阻害剤のだめの断片のＤＮＡ配列を第１ｂ図に示す
。

マスター遺伝子は、リポソーム結合部位、開始コドンＡ
ＴＧ１終止コドン、ＴＡＧ、Ｘｂａ　　Ｉのための５゛
末造制限部位、ＨｉｎｄＩＩＩのための３゛末端制限部
位、さらにＸｈｏ　　Ｉ、　Ａｐａ　　Ｉ、Ｓｔｕ　　
Ｉ％Ａｃｃ　　Ｉ％Ｐｓｔ　　Ｉ、Ｓｓｔ　　ＩＩおよ
びＳｐｈ　　ｒのための内部制限部位を含む。これらの
部位、ことに内部の部位は解読配列のクローニング、他
のアミノ酸の遺伝情報を指定するが、あるいは他のコド
ンの使用を有するＤＮＡ断片を交換することによるマス
ター遺伝子の修飾を促進する。蛋白質程作の合計のスペ
クトルは、このような構成を用いて可能である。

Ｍｅｔ−アプロチニン同族体の遺伝子を構成するため、
適当なりＮＡ配列をもつ制限断片のみを交換しな（では
ならない０位置１５におけるアミノ酸変更の遺伝情報を
指定するこのような断片、例えば、Ａｐａ　　Ｉ　−８
ｔｕ　　Ｉ断片の配列を第１ｂ図に記載した。

Ｍ成ベクター　ｉＷｉ　　’ｒ９お凝−ゾ」Ｌ伝ｊ−り
］１幅−爽験のＭｅｔ　　７プロチニンのクローニング
のために選択したプラスミドはｐｉＷｉ　　Ｔ９であっ
た（第２ａ図を参照）。

構成ベクターは、それぞれ、複製の起源を有するｐＢＲ
３２２およびテトラサイクリン遺伝子からの２つの断片
、転写終止信号を有するバクテリオ７アージｆ、（１１
ＤＮＡの断片、およびＩａｃＺ遺伝子をちょうど越えた
ｌａｅ　　Ｉ遺伝子のＣ−末端から伸びるＥ、ｅｏｌ、
のＩａｃオペロンからの断片からｖｔ戊し、Ｉａｅプロ
モーター−オペレーター領域全体は、欠失されておりそ
して合成りＮＡの短い伸張によって置換されでいる１合
成りＮＡはｌａｃ　　Ｚ遺伝子に向いた構成的プロモー
ター活性を有し、そしてプロモーターとＩａｃ　　Ｚ遺
伝子との間にクローニングＸｂａ　　Ｉ、Ｘａａ　　Ｉ
およびＨｉｎｃｌＩＩＩを含有する。これらの３つの部
位のν１ずれかの中にクローニングしたＤＮＡは合成プ
ロモーターから転写され、それが翻訳かどうかは、また
、配列に依存する。ＩａｃＺ遺伝子のための同時性（ｉ
ｎ　　ｐｈａｓｅ）の開始コドンを生成するクローニン
グ部位のいずれかの中に追加のＤＮＡがクローニングさ
れないかぎり、活性β−がラクトシグーゼが生成される
ように、ｐｉＷｉ　　Ｔ９のＩａｃＺ遺伝子は翻訳され
ない。構成ベクターｐｉＷｉＴ９の重要領域のＤＮＡ配
列を第２ｂ図に記載する。

遺伝子のオリゴマー化のため、合成遺伝子（第１ａｌ参
照）を構成ベクターｐｉＷｉ　　Ｔ９のＸｂａＩおよび
ｆ（ｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングした０合成遺
伝子の直列の重複のため、ＨｉｎｄＩＩＩ部位より上流
に位置する１つのコービーを含有するＢａａＩＨＩ　−
Ｈｌｎｄ　　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片を、Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ　
−Ｘｂａ　　Ｉアダプターの存在下に、Ｘｂａ　　ｒ部
位より下流に位置する遺伝子の１つのコピーを含有する
Ｘｂａ　　ｌ−Ｂａ＋＊　　ＨＩ断片に結合する（第：
（図参照）、Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ　　Ｘｂａ　　Ｉ７グ
プターは、ＨｉｎｄｌＩＩおよびＸｂａ　　Ｉによって
生成された粘着末端の中に適合するが、これらの部位を
再生しない。得られるプラスミドｐｉＷｉＴ９ＴＬ２は
、第１遺伝子より上流の独特Ｘｂａ　　Ｉ部位およびｔ
５２遺伝子より下流に独特Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ部位を有
する。こうして重複は同一系列の反応により反復させて
、各々の前にそれ自信のリポソーム結合部位が存在する
、４．８．１６および３２の直列に反復する遺伝子を含
有するそれ以上のプラスミドを生成する。ｌａｅ　　Ｚ
遺伝子はもはや必要としないので、３ｋｂのＥｃｏＲＩ
断片がプラスミドから欠失される。

Ｍ　ｅ　ｔ−アプロチニンおよびＭｅｔ−アプロチニン
同族体の発現のため、適当な遺伝子を強いプロモーター
−オペレーターの制御下に発現することができ、かつ％
質蛋白質およびポリペプチドの発現に非常に有用なりＮ
Ａをさらに含むプラスミドを構成した。発現ベクターｐ
ｉＷｉＴ１１の物理的地図を第４ａ図に示す。

発現ベクターｐｉＷｉＴ１１は構成ベクターｐｉＷｉＴ
９に非常に類似し、それらは共通の３゜３Ｋｂの長さの
Ｘｈｏ　　Ｉ−Ｅｃｏ　　ＲＩ断片を共有し、この断片
は３６ｂｐのＩａｃ　　Ｉ　　ＤＮＡ、　８８３ｂｐの
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（複製起源）、２０Ｇ？（＋８）ｂ
ｐのｐＢＲ３２２ＤＮＡ（テトラセイクリン制限遺伝子
）、９ｂｐのポリリンカー、３３２ｂｐのｆｄ　　１１
　　ＤＮＡ転写停止４３号、８ｂ＋１のＢａ＋ｍ＋−１
１オクタリンカ−および６８ｂｐの１ａｅＺ　　ＤＮＡ
を含む１発現を増強するために、合成りＮＡ断片を構成
し、そしてＥｃｏＲＩ部位−Ｘｈｏ　　Ｉ部位の闇に結
合した。この合成断片の配列を第４ｂ図に示す、この断
片は強いプロモーターのための配列、ＲＮＡＩＪ？ｌ始
、ｌａｃリプレッサー結合部位（オペレーター）、リポ
ソーム結合部位、ｉ白ａ開始コドン、クローニングのだ
めの５つの独特制限部位（Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ、Ｘｂａ
　　Ｉ、ＰｓＬｌ、ＢｇｌＩＩおよびＸ＋＊ａＩ）を含
有する短い解読領域を含む。

発現の目的で、次いで前述の合成遺伝子のオリゴマーを
もつ構成ベクターの小さいＸｂｏ　　Ｉ　　Ｘｂａ　　
ＩｐｉＷｉ　　Ｔ　１１のＸｈｏ　　Ｉ−Ｘｂａ　　Ｉ
断片で交換し、後者はプロモーター、オペレーター、リ
ポソーム結合部位、およびヘキサペプチドのための解読
配列を含有する。得られる岨換えプラスミドは、例えば
、Ｍｅｔ−アプロチニン遺伝子のオリゴマーをもつ発現
プラスミドｐｉＷｉ　　ＴＩＯｗＬｌである。

発現プラスミドの重要なｌｌ域のＩ）ＮＡ配列を第５ｂ
図に示す。

表１：　　Ｍｅｔ−７ブロチニ７およびＭｅｔ−１１ｅ
−１５−アプロチニンのアミノ酸シー クエンシング １、ＭｅＬ−アプロチニン；約１ｎモルの配列を２０サ
イクルにわたってシーフェンシングした：Ｍｅｔ−Ａｒ
ｃ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ　　Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ　−Ｇ
ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　Ｉｇ　
−Ｉ　Ｉｓ　−Ｉ　Ｉｅ　−２、Ｍｅｔ−Ｉ　ｌｅ　−
１５−アプロチニン；約１ｎモルの配列を２０サイクル
にわたってシーフェンシングした： Ｍｅｔ　−Ａ　ｒｇ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ｐ　
ｈｅ−Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ−Ｉ　ｌｅ
−Ａ　Ｉａ　−Ａ　Ｉｇ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｉ　Ｉｅ　−
亀九賞。

この分野において、形質転換に適当な多数の種々の微生
物、すなわち、培養または発酵において生長できる単細
胞の有機体、が知られている。形質転換に好ましい有機
体は、バクテリア、酵母菌および菌類（ｆｕｎｇｉ）を
包含する。

ここに開示する研究のために選択した特定の有機体は、
Ｅ、　ｃｏｌ、であった。

非常に適当な菌株はＥ、　ｃｏｌ、　Ｂ　　ｌａｍｂｄ
ａ　　Ｒ−１−亀１−であった。これはＪ、Ｈ，ミラー
（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９７２、分子遺伝子学における実
験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、：７−ルド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−１に記載されている方法
によってつくった。

Ｍｅｔ−アプロチニンの バクテリア中で大量に合成された多数の蛋白質は不溶性
の形態で蓄積する［　Ｄ、Ｃ，ウィリアムス（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ）　、Ｒ，Ｍ、パン・フランク（Ｖａｎ　　Ｆ
ｒａｎｋ）　、Ｊ、　Ｂ＋バーネット（Ｂ　ｕｒｎｅＬ
Ｌ）、Ｗ、Ｌ、ムス（Ｍｕｔｈ）　、１９８２、サイエ
ンス（５ｃｉｅｎｃｅ）２１５．６８７１　。

これらの不溶性蛋白質は封入体（１ｎｅｌｕｓｉｏｎ　
　ｂ（＋ｄｉｅｓ）と呼ばれる。これらは通常変性剤（
ｄｅｎａｔｕｒａｎｔｓ）でのみ可溶化でき、それゆえ
他の細、胞蛋白質から容易に精製することができるであ
ろう。

Ｅ、ｃｏｌ、菌株ＢＲ１７をプラスミドｐｉＷｉ　　Ｔ
ｌｏｗＬｌで形Ｉ！１転換した。ｐｉＷｉ　　ＴＩＯｗ
Ｌｌは、Ｅ、ｃｏｌ、のプロモーター、オペレーターお
よびリポソーム結合部位より１４倍下流のアプロチニン
遺伝子を暗号化する。

Ｇｌｕ−５２−アプロチニンβ−がフクトシグーゼ遺伝
子を暗号化する。　Ｅ、　ｅｏｌ、菌株ＢＲ１７ｐｉＷ
ｉ　　ＴＩＯｗＬｌの一夜の培養物を遠心し、次いで沈
殿物を破壊的（ｂｒｅａｋｉｎｇ）緩衝液中に再懸濁し
、そしてフレンチプレス（Ｆ　ｒｅｎｃｈ　　ｐｒｅｓ
ｓ）により細胞を溶解した。

封入体を回収するため細胞リゼイトを遠心した。沈澱を
破壊用ｔｔｍ液で２回洗浄した。

精製工程はラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　［Ｕ、　Ｋ、
ラエムリ、１９７０、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、
２７７．６８０−６８６）に従う５ＤＳ−ポリアクリル
アミドの電気泳動により検査した、！＠７図。

不活性阻害剤をクレイトンＥＴ、Ｅ、　　クレイトン（
ＣｒｅｉＨｈｔｏｎ）　、プロシーディンゲス・オブ・
ノエネックスーＵＣＬＡ・シンポノウム（ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ　　ｏｆ　　Ｇ　ｅｎｅｘ　−Ｕ　ＣＬ　Ａ
　　Ｓ　ｙｍｐｏｓｉｕ＋＊）　１９８５、キングスト
ーンズ１に従う手順によって巻戻した；ｔｔＳ８図、活
性阻害剤はトリプシンのアッセイおよびウェスターンプ
ロット分析により検出できた：第９図。

活性阻害剤を７リツツ［Ｈ１７リフツ（Ｆｒｉｔｚ）、
Ｍ、デブハルト（Ｇ　ｅｂｈａｒｄｔ）　、Ｒ、メイス
ター（Ｍｅｉｓｔｅｒ）　、　Ｋ、イルチマン（Ｉ　ｌ
ｌｃｈｍａｎｎ）、Ｋ、ホチストラベー（ｌ（０ｃｈｓ
ｔｒａβｅｒ）、１９７８、ホッヘーセイラ−（Ｈｏｐ
ｐｅ−Ｓ　ｅｙｌｅｒ）のゼイツシュリフト・ヒユーエ
ル・フイν才ロノフシェ・ヘ　　ミ　−　（Ｚ、　　　
Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　　Ｃｈｅ＋ａ、　　　）　　　３
　５　１　　、　５７１−５７４］に従うトリプシンセ
フ７０−ス力ラムのクロマトグラフィーによってさらに
精製した；第１０図。

次いで、阻害剤をヘライック［Ｒ，Ｍ、へ１クイツク（
Ｈｅｗｉｅｋ）　、Ｍ、Ｗ、　７ンカピラー（Ｈｕｎｋ
ａｐｉｌｌａｒ）　、Ｌ、　　Ｅ、　　７−ド（Ｈｏｏ
ｄ）　、Ｗ、　　Ｉ　、　　ドレガー（Ｄｒｅｇｅｒ）
　、　１９８１、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ−ｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　　）　　２５６．７９７０−７９９７１　
　に従うマイクロ配列決定（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｅ
ｉｎｇ）によって特徴づけた。

Ｎ−末端からの最初の２０残基を決定した。ゼロ位置に
メチオニンをもたないと、アミノ酸配列はアプロチニン
の七九と完全に同一である（表１）。

阻害剤のアミノ酸組成は期待する値を示す（表２）。

アプロチニンおよびＭｅｔ−アプロチニンをトリプシン
阻害活性を比較すると、同様な値が得られる（表３）。

これらの実験のすべてが示すように、Ｅ、　ｅｏｌ。

中でＭｅｔ−アプロチニンを生産し、そしてそれを活性
阻害剤に再生することが可能である。

Ｍｅｔ　−Ｉ　ｌｅ　−１５−アプロチニンの　製Ｍｅ
ｔ　　１．）ｅ　　１５−アプロチニンを、Ｍｅｔ−ア
プロチニンについて説明したのと同様な方法でＥ。

ｅｏｌ、中でｍｙできる（また、第６図参照）。

阻害活性をエラスターゼ−阻害７ツセイにより測定した
［Ｋ、ナカノｖ（Ｎａｋａｍａ）　、Ｍ、ジンマーマン
（Ｚｉｍ＋＊ｅｒｍａｎ）　、Ｊ、　Ｃ，バワーズ（Ｐ
ｏｗｅｒｓ）　、Ｍ、　　Ｊ、カスチｏ　（Ｃａ５ｔｉ
ｌｌｏ）　、Ｂ　。

Ｍ、アシェ（Ａｓｈｅ）　、１９７９、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ。

１、　ＣｈｅＩｌ、　）　２５４．４０２７］によって
測定した。

阻害剤はアミノ酸分析お上びＮ−末端配列決定によって
特徴づけた（表１．２）。

アプロチニンのすべての他の誘導体は、Ｍｅｔ−アプロ
チニンおよびＭｅｔ−Ｉ　Ｉｅ−１５−アプロチニンに
ついて記載したのと類似する方法で調製できた。

１漣 本発明は、無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤に加
えて、本発明による化合物のＩＮ！またはそれ以上を含
有するか、あるいは本発明の活性化介物の１種またはそ
れ以上から成る！ｌ！剣、およびこれらの製剤の製造法
を包含する。

本発明は、また、投与単位の形態の製剤を包含する。こ
れは、製剤が個々の部分の形態、例えば、錠剤、糖剤、
カプセル剤、ピル、坐薬およびアンプル剤の形態である
ことを意味し、その活性物質の含量は個々の投与量の数
分の１あるいは多数倍に相当する。投与単位は、例えば
、１．２．３または４倍の個々の投与量、あるいは個々
の投与量の１／２．１／３または１／４を含有すること
ができる６個々の投与量は、好ましくは、１回の投与で
与えられ且つ通常１日量の全部、半分または３分の１ま
たは４分の１に相当する量の活性化合物を含有する。

無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形屑とは、すべての
種類の固体、半固体または液体の希釈剤、充填剤お上り
配合助剤であると解釈すべきである。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピル、丸剤、坐薬、溶液、懸
濁液および乳濁液、泥膏、軟膏、デル、クリーム、ロー
ション、粉剤およびスプレーが好ましい製剤である。

錠Ｍ１糖剤、カプセルＭおよび丸剤は、活性化合物の１
種またはそれ以上と、次の普通の賦形剤を含有できる：
（ａ）充填剤および増量剤、例えば、でんぷん、ラクト
ース、グルコース、マンニトールおよびシリカ、（ｂ）
結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギ
ン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドン、（Ｃ）
保湿剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムおよび重炭酸ナ
トリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、お
よび（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アンモニウム化合
物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールまたはグ
リセリンモノステアレート、（１１）ｒＩ＆着剤、例え
ば、カオリンおよびベントナイト、および（ｉ）潤滑剤
、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウムおよびステ
アリン酸マグネシウムおよび固体のポリエチレングリコ
ール、または（、）〜（ｉ）に記載した物質の混合物。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび九Ｍは、普通の被
膜および外殻を含有することができ、これらは不透明剤
を含むことができ、そしてそれらは、活性化合物の１種
またはそれ以上のみを、あるいは好ましくは、腸管の特
定の部分において、可能ならば長時間にわたって、放出
するような組成物であることができ、使用可能な埋め込
み組成物の例はポリマー物質およびワックスである。

活性化合物の１種またはそれ以上は、賦形剤の１種また
はそれ以上と一緒に、マイクロカプセル化した形態にす
ることができる。

坐薬は、活性化合物の１種またはそれ以上に加えて、普
通の水溶性または非水溶性の賦形剤、例えば、ポリエチ
レングリコール、脂肪、例えば、カカオ脂肪、高級エス
テル、（例えば、Ｃｌ−アルコールとＣｌ１−脂肪酸と
のエステル）またはこれらの物質の混合物を含有するこ
とができる。

軟膏、泥膏、クリームおよびデルは、活性化合物の１種
またはそれ以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、動物
性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィン、デンプ
ン、トラがカント、セルソース誘導体、ポリエチレング
リコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク
および酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有することが
できる。

散剤および噴′Ｓ剤は、活性化合物の１種またはそれ以
上に加えて、普通の賦形剤、例えば、ラクトース、タル
ク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムお
よびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含有
することができる。噴霧剤は、普通の噴射剤、例えば、
クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することができる
。

溶液および乳濁液は、活性化合物の１種またはそれ以上
に加えて、普通の賦形剤、例元ば、溶媒、可溶化剤およ
び乳化剤、例えば、水、エチルアルコール、イソプロピ
ルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ペンシルアル
コール、安ｍ香酸ペンシル、プロピレングリコール、１
，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油
、ことに綿実油、落花生油、ト！クモロコシ胚油、オリ
ーブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセリン、グリセリ
ン−ポルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール、
ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エス
テル、またはこれらの混合物を含有することができる。

非経口的投与に対して、溶液および乳濁液は、血液等優
性の無菌の形態にすることができる。

懸濁液は、活性化合物の１種またはそれ以上に加えて、
普通の賦形剤、例えば、液状希釈剤、例えば、エチルア
ルコール、プロピレングリコール、懸濁剤、例えば、エ
トキシル化インステ７リルアルコール、ポリオキシエチ
レンソルビトールエステルおよびソルビタエステル、微
結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナ
イト、寒天およびトラがカントまたはこれらに混合物を
含有することができる。

また、前述の配合形態は、染料、防腐Ｍ、および芳香お
よび風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油お
よびユーカリ油、および甘味剤、例えば、サッカリンを
含有することができる。

治療学的に活性な化合物は、好ましくは、前述の製剤中
に、全混合物の約０．１〜９９．５重量％、好ましくは
約０．５〜９５重景％の量で存在する。

また、前述の製剤は、本発明による化合物に加えて、他
の製薬学的に活性な化合物を含有することができる。

前述の製剤は、既知の方法に従い普通に、活性化合物の
１種またはそれ以上を賦形剤の１種またはそれ以上と混
合することによってつくられる。

活性化合物または製剤は、局所的、経口的、非経口的、
腹腔内お上り／または経直腸的に、好ましくは経口的ま
たは非経口的、例えば、静脈内または筋肉内に投与する
ことができる。

一般に、所望の結果を得るためには、活性化合物の１種
またはそれ以上を２４時間毎に約０．５〜約５００、好
ましくは５−１００　ｍｇ／ｋｇ体重の合計量で、場合
によっては数回に分けて投与することが、人間および獣
の医学において有利であることがわかった０個々の投薬
物は、好ましくは、活性化合物の１１！またはそれ以上
を約１〜約２５０、ことに３〜６０　ｍｇｌ　ｋｇ体重
の量で含有する。

しかしながら、前述の投薬量からはずれなければならな
いことがあり、特にそのことは処置を受ける患者の性質
および体重、病気の性質および重さ、製剤の性質および
薬剤の投与方法、投与を行う時ｒ１１１＊たは間隔に依
存する。

か（して、ある場合には、活性化合物は前述の量よりも
少量で十分であり、一方他の場合には前記量を超えなけ
ればならない場合も起こるであろう。必要な特定の最適
な投与量および活性化合物の投与方法は、この分野に精
通するものにとっては、その専門知識に基づき容易に決
定することができる。

遺伝子を含むオリゴヌクレオチドを固相合成法により調
製した。オリゴマーの合成法は概説した通りであり、そ
してブトロン活性化され、保護された２′−デオキシリ
ボヌクレオチドホスホルアミゲイトを利用した。すべで
の順次に工程は、アプライド・バイオシステムス３８０
型ＤＮＡ合成装置で自動化された方法において、この製
造業者から人手した保護されたヌクレオチド、溶媒、お
よび化学物質および試薬を使用して実施した。同様に同
じｌ！！遺業者から入手した固相支持体は調節された孔
のガラスであり、これに出発３゛−ヌクレオチドはすで
に付着されていた。＊ｉ業者の掻作指導書および使用者
の社報に従う自動化さｆｉた反応サイクルに、ある種の
変更を導入した。合成が完結したとき、製造業者の推奨
に従いＤＮＡ合成装置内で、オリゴマーを脱保護しそし
て固体の支持体から切離した。

密封したバイアル中でオリゴマーを含有する水溶液を濃
水酸化７ン毫ニウムとともに５５℃に４〜２４時間過熱
することによって、保護基の除去を完結した。得られる
溶液を蒸発させ、残留物を０．０１モルの重炭酸トリエ
チルアンモニウム緩漬液、ｐＨ７，０（ＴＥＡＢ４１ｍ
液）中に溶解した。この溶液をセファデックス（Ｓ　ｅ
ｐｈ＠ｄｅｘ）−Ｇ　　５０■デルのｔｉｔ過樹脂のク
ロマトグラフィーにかけた。このカラムを同一のＴＥＡ
Ｂ緩衝液中で調製し、そして同一緩衝液で溶離した。空
隙体積で溶離する物質をプールし、そして溶液を蒸発さ
せた。

残留物の一部（２６０ｎ−における吸収単位の１０〜４
０％）を装入用緩衝液（組成二０．１％のブロモ７ヱノ
ールブルー、０．１％のキシレンシアツール、１０ミリ
モルのＥＤＴＡニナトリウム、ホルムアミド中）をポリ
アクリルアミドデルの電気泳動によりさらに精製した。

このデルの大きさは１８Ｘ３２ｃ鴎であり、厚さは１．
５１であった。

この方法において精製された各オリゴマーのための゛ン
エル（御ｅｌｆ）の大きさは幅が２〜５ｃ論であり、そ
して５オリゴマーまでを単一のゲルで精製した。

デル中のアクリルアミドの濃度は、所望生成物の値の長
さに依存して１４〜２０％であった。より長いオリゴマ
ーのため、１４％のアクリルアミドデルを調製し、これ
に対してより短いオリゴマーは２０％までのアクリルア
ミドデルでＭ製した。

ゲルは、また、７モルの尿素およびトリス−ホウ酸塩−
Ｅ　Ｄ　’Ｉ’　Ａ　４１衝液（０，１モルのトリス、
０゜１モルのホウ酸塩、２ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ８
，３）を含有した。展開用緩衝液は同一のトリス−ホウ
酸塩−Ｅ　Ｄ　’ｒ　Ａ混合物であった。電気泳動は２
０〜６０ワツトの一定電力で１８〜６時間実施した。こ
のような標準の技術はアプライド・バイオシステムスか
ら入手できる種々の使用者の情報の会報から得られる。

電気泳動の完結後、ゲルをプラスチックラップに包み、
そしてオリゴマーをＵＶ光のシャドウィング（ｓｈａｄ
ｏｗｉｎｇ）により可視化した。このシャドウィングは
次のようにして実施した。包装したデルを蛍光性の薄い
層状クロマトグラフィー用板上に配置し、そしてゲルを
短波長の紫外Ｍ源で見た。所望の生成物は最も遅く移動
する主要ブルーのＤＮＡ断片として、このシャドウィン
グ技術によって現われる。所望の帯をデルから切除した
。

ＤＮＡオリゴマーを、エピデン（ＥｐｉＧｅｎｅ）　Ｄ
−デル（Ｇｅｌ■）電気泳動装置を使用して、デルのス
ライスから粉末状ノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セ
ルロース上に溶離した。オリゴマーをセルロースから１
モルのＴＥＡＶ緩衝液で溶離した。オリゴマーを含有す
る緩衝液を蒸発させ、残留物をｏ、ｏｏｉモルのＴＥＡ
Ｂ緩衝液中に溶解し、次いで前述のようにセファデック
ス−Ｇ５０■のカラムに通過させて脱塩した。空隙体積
中にれする物質をプールし、そして凍結乾燥して最終生
成物を得た。

上に概説した手順を使用して、精製されたオリゴマーの
各々の約０．５〜５．ＯＡ２ｇ。単位を得た。

実施例１に肥戟するように精製した合成オリゴマーを、
標準条件下にポリヌクレオチドお上びアデノシントリホ
スフェート（ＡＴＰ）とともにインキュベージコンした
［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら］。各試料の１／
１０をＡＴＰの代わりにδ［３２Ｐ］　ＡＴＰとともに
インキュベージ１ンした。

両方の試料を後に混合し、そして実施例１に記載する電
気泳動にかけた。［識された帯を、前のように、ゲルか
ら切断し、溶離し、そして精製した。

次いで、１４オリゴヌクレオチド（第１ａｌｌ、第１ｂ
図）を３０μｌの二重に濃縮しなりが一ゼ緩衝液中で混
合しくマニアチス）そして４０℃で２０分間および室温
で３０号間アニーリングした。

次いで、２μｍのｉｏｏミリモルのＡＴＰ　　ｐＨ７゜
５．６μｍのＴ４ＤＮＡ−リガーゼおよ１２２μｌの水
を添加し、そして約１０℃で一夜結合を進行させた。

次いで、結合反応の生産物をＸ　ｂａ　ＩおよびＨｉｎ
ｄＩ　Ｉ　Ｉ″ｃｃ消化、開いたＸｂａＩ部位、リポソ
ーム結合部位、開始コドンＡ　１”　Ｇ、アプロチニン
解読配列、終止コドンＴＡＧ、および開いたＨｉｎｄＩ
ｌｌｌｌ、位を含む２０４ｂｐの全長の単一の合成遺伝
子のセグメントを生成した。

犬１ｊＬＬ 構成ベクターＤＮＡ（第２ａ図、＄２ｂ図）をＸｂａｒ
およびＨｉｎｄＩ　Ｉ　ｒで切断しくマニアチス）、実
施例２に記載するようにして調製した合成遺伝子セグメ
ントと混合し、そして前のように一夜結合した０次いで
、この試料を使用して、ハ７ナーン［Ｄ、ハ７ナーン（
Ｈａｈｎａｈａｎ）　、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　）　、１９８３．１６６．５５７−５８０
］の方法に従イＥ、　ｅｏｌ、　Ｓｕ３［１ａｃ−ｐｒ
ｏｌΔｍｅｔ−ａｒｇｓｕｐＦ　ｔｌ＋ｉ−）を形質転
換した。この細胞を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン
および０．００５％のＸ−がｇａｌ（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−がラクトシト）を補
充した′ざんだベトリ皿（ｒｉｃｈ　　ｐｌａｔｅ）上
に広げ（Ｊ。

ミラー（Ｍｉｌｅｒ）　、分子遺伝学における実験（Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎＬｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、１９７２、コールド・スプ
リング◆ハーバ−・ラボラトリ−１米国ニューヨーク州
コールド・スプリング・ハーバ−１そして３７°Ｃで一
夜インキエベーシａンした。青色コロニーからのプラス
ミドＤＮＡを抽出しくマニアチス）そして合成遺伝子セ
グメント上に存在する制限酵素の認識部位の存在につい
てスクリーニングした。最後に、ＤＮＡ配列をマクサム
（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の
方法［Ａ、マクサム（Ｍａｘａｍ）およびＷ。

ギルバート（Ｇ１１ｂｅｒｔ）　、メソッズ・イン・エ
ンノモロジー（Ｍｅｔｈ、　　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ、　
）　、１９８３．６５．４９９−５６０］に従い決定し
た。

前の実施例３に記載したようにして調製したｐｉＷｉ　
　ＴＩＯｉｗＬＩ　　ＤＮＡを使用して、アプロチニン
遺伝子のマルチマーを調製した。プラスミドＤＮＡＨｉ
ｎｄＩ　Ｉ　ＩおよびＢａＩＩＩ　ＨＩで消化し、そし
てテトラサイクリン抵抗遺伝子の３°末端、複製起源、
プロモーターおよびＭｅｔ−アプロチニン遺伝子を含有
する小さい断片を精製した（マニアチス）、プラスミド
ＤＮＡの第２試料をＸｂａＩおよびＢａＩＩＩ　ＨＩで
消化し、そして再びＭｅｔ−アプロチニン遺伝子、１ａ
ｅＺ遺伝子、転写停止信号およびテトラサイクリン抵抗
遺伝子の５゛を精製したアダプター分子 の存在下に結合しく実施例２参照）そしてＥ、ｃ。

１、ＢＲＩ７中に形質転換した〈実施例５参照）。

アダプター分子は、いずれの部位をも再生しないで、そ
れぞれＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位およびＸｂａＩｆｆｌＳ
位中に適合する突起する末端を有するので、２つの直列
に反復するアプロチニン遺伝子をもつ得られる新しいプ
ラスミドは、再び、第１アプロチニン遺伝子のリポソー
ム結合部位より上流に１つのみの独ｖｆＸｂａＩ部位お
よび、また、第２Ｍｅｔ−アプロチニン遺伝子の終止コ
ドンより下流に１つのみの独特Ｈｉｎｄｌ　１１部位を
有する。こうして、同一系列の反応を、この新しいｐｉ
Ｗｉ　　’ｒ９　　ＴＬ２　　ＤＮＡを使用して反復し
て、各々の前にそれ自身のリポソーム結合部位が存在す
る、４つの直列の反復Ｍｅｔ−アプロチニン遺伝子を有
する他のプラスミドを生成することができた。

ここで４つのアプロチニン遺伝子の第３の重複の前に、
３ｋｂのＥｅｏＲＩ断片をプラスミドから欠失させてそ
の全体の大きさを減少させた（ｔ５３図）。

第３の重複後、われわれは８つの代わりに７つのアプロ
チニン遺伝子をもつプラスミドをたまたま取り上げた。

奇数の遺伝子をもつプラスミドは、このような結合反応
の生産物のうちで通常低い頻度で発見される。それらの
発生は、精製手順の間のジ−プラーク（５ｅａｐｌａｑ
ｕｅ）　７がロース（マニアチス）の溶融の間のＤＮＡ
断片の部分的変性に起因する。Ｅ、ｅｏｌ、　ＢＲＩ　
７中のこれらのプラスミドのそれ以上の伸張（ｐｒｏｐ
ａｇａｔｉｏｎ）後、所定数の遺伝子からの変動を観察
できなかった。

こうして、前述のように実施した第４の重複は、人工オ
ペロン中において組立てられた１４アプロチニン遺伝子
をもつプラスミドを生じ、これはポリシストロンｗＲＮ
Ａ中に転写することができ、次いでこのｍＲＮＡを１４
の別の同一アブロナニンベプチドに翻訳できた。

１ＩＲＮＡの５°非翻訳領域、いわゆるｗＲＮＡの先導
配列の、そのｍＲＮＡ上に暗号化された１または２以上
の遺伝子の翻訳速度への影響はめったに理解されない。

いくつかのこのような先導配列をそれらの翻訳効率につ
いで試験し、そして異なる遺伝子を使用して異なるを結
果を得た。われわれの合成遺伝子を使用して最良の結果
を与えた１つの先導配列は、発現ベクターｐｉＷｉＴ１
１中に存在する配列である（第４ａ図、第４ｂ図）。

各々の前にそれ自信のリポソーム結合部位を有する１４
の同一アプロチニン遺伝子を含有する断片を、ＸｂａＩ
およびＥｃｏＲＩで構成プラスミドから切除し、そして
発現ベクターｐｉＷｉＴ１１のポリリンカーのＸｂａＩ
部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入した（マニアチス）
、第５ｂ図は、１４アプロチニンペプチドに加えて、へ
斗すベブチドが−ＲＮＡから翻σ（されることを示す。

このような小さいペプチドは絞く１または２以上の遺伝
子の翻訳を増大することが報告された［　Ｂ、Ｅ、ショ
ウナ−（Ｓ　ｃｈｏｎｅｒ）ら、プロシーディンゲス・
オプ・ナシタナル・アカデミ−・オプ・サイエンンズ（
Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　
ＵＳＡ、　　１９８４．８１．５４０３−５４０７Ｌ Ｅ、ｃｏｔ、Ｂｌ、８はパークレイ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ
）で分離された。ｍａｌ−およびλＲとして与えられる
表現型を評価した。それを次の手順にかけた：　ｌｌ１
１１の飽和培養物をエツベンドル７遠心磯内で１分間遠
心し、沈殿した細胞を１ｍｌの０．９％のＮａＣ１溶液
中に再懸濁させた。０．２ｍｌのこの懸濁液を、チミジ
ンを最終濃度Ｏ，ＯＳ％に補充しかつトリメトプリムｉ
ｕａ度０．００１％に補充した小さいグルコースのベト
リ皿上に広げて、ｔｂｙＡ突然変異体について選択した
。３７℃で３０時間後にこのベトリ皿上で生長したコロ
ニーの１つを、チミジンおよびトリベトブリムを含む他
の最小グルコース寒天ペトリ皿上で精製し、モしてＢ１
３と名つけた。このベトリ皿から、単一のコロニー選択
しそして、Ｉａｃ−でもあるｒｅｅＡ欠失Ｈｆｒ菌株で
あるＥ、　ｃｏｌ、　ＲＺ　４２３と交配させた。

交配（ｍａｔｉｎｉｒ）混合物を最小ラクトースベトリ
皿上で平板培養した。＃１の８１３は、そのチミジン栄
！！要求性のために、これらのベトリ皿上で生長できな
かった。１１１のＲＺ４２３は炭素源としてラクトース
を使用できなかった。こうして、ＲＺ４２３との交配後
、機能的ｔｂｙＡ遺伝子の遺伝情報を指定するＲＺ４２
３染色体の部分を安定に組込んだＢ１３Ｊｌｌ胞のみが
生長することができた。２４のこのようなコロニーを精
製し、そして−ａｌ−（ＥＭＢ＋＋＋ａｌペトリ皿上）
およびｒｅｃ　Ａ−にライて個々に試験した（メチルメ
タンスルホネートの存在下の生長を比較することにより
）、試験したコロニーのすべては亀ａ１″″であり、こ
うしてそれらはＲＺ４２３の偶然のＩａｃ＋復帰細胞で
はないことが確証され、それらの３つはメチルメタンス
ルホネートの存在下で生長の減少を示し、これによりこ
れらのバクテリアは密接に結合した野生型ｔｈｙＡ遺伝
子と同時にＲＺ４２３からのｒｅｅ　Ａ−アレルを組込
んでいたことが示された。それらは雄の特異的バクテリ
オファージＭ１３を平板培養で訃ないことが証明された
ので、Ｈｆｒ遺伝遺伝全型得しなかった。

３つのコロニーの１つを、阻害剤遺伝子を有する発現プ
ラスミドのための宿主菌株として使用した。それをＥ、
　ｃｏｌ、　ＢＲＩ　７と呼び、そしてそれは［トイチ
ェ・ザンムルング・ミクロオｌレガニズメン（Ｄ　ｅｕ
ｔｓｃｈｅ　　Ｓ　ａｍ＋１ｌｕｒＢｙ　　Ｍ　１ｋｒ
ｏｏｒ）（ａｎｉｓｅｅｎ）　Ｊプツチインデン（Ｇ６
ＬｔｉＢｅｎ）にＤＳＭＮｏ、３６８４で受託されてた
。

溶液： 緩衝ｍＡ、ｐＨ８，２ ５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、 １ミリモルのＥＤＴＡ。

ｐＨ８，２に調節、 緩衝液Ｂ％ｐＨ８，２ ８モルの尿素、 １ミリモルのビス−（２−ヒドロキシエチル）−ジサル
ファイド、 １ミリモルの２−メルカプトエタノール、緩衝ＭＡ中、 緩衝液Ｃ，ｐＨ８，２ １ミリモルのビス−（２−ヒドロキシエチル）−ジサル
ファイド、 １ミリモルの２−メルカプトエタノール、緩衝液Ａ中、 緩衝液り、　ｐＨ８，２ ０，６ミＩＪモルの塩化ナトリウム、緩衝液Ａ中。

ｌ１ｌｌ製の目的で、菌株ｐｉＷｉ　　ＴＩＯ＠Ｌ１の
Ｅ。

ｅｏｌ、の−夜の培養物の５リツトルを８，０００ｒｐ
−で１５分間遠心した。約１０ｇの細胞沈殿物を、２５
１の０．１モルのトリス拳ＨＣＩ、０．ＯＯｌ　モ）ｋ
ｔｎＥＤＴＡオヨヒｏ、　１ｍｔ１／ｍ１ｔｎ’）”Ｉ
＋−Ａ中に再懸濁した。細胞を７レンチプレス（Ｆｒｅ
ｎｃｈ　　ｐｒｅｓｓ）により溶解した。

細胞リゼイトを２９．ＱＯＯｒｐｍで２０分間遠心した
。懸濁液を廃棄した。沈殿物を、リゾチームを含まない
破壊用緩衝［（ｂｒｅａｋｉｎｇ　　ｂｕｆｆｅｒ）で
２回洗浄した。

沈殿物を１０−１の緩衝液Ｂ中に溶解した。この溶液を
５０℃で窒素雰囲気中で１時間還元した。

次いで、約１０１のＣＭ−セファロース・７アスト＋１
７０＋（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　　Ｆ　ａｓｔ　　Ｆ　
ｌｏｗ■）を充填したエコノ（Ｅ　ｅｏｎｏ）−カラム
（２５＋１０ｍｍ）に、上の溶液を適用した。このカラ
ムを緩衝液Ｂと平衡化した。カラムを、基線が安定とな
るまで、緩衝液Ｂで洗浄した。＃１の直線の勾配の溶離
において、カラムを１００１の緩衝液Ｂおよび１００１
の緩衝液Ｃで展開した。第２の直線の溶離勾配を適用す
る前に、カラムを、基線が安定となるまで、緩衝液Ａで
洗浄した。

１００論１の緩衝液Ａおよび１００＋Ｉの緩衝液りで、
第２の勾配を形成した６ビークの分画をトリプシン阻害
活性、エリザ（ＥＬＩＳＡ）およびウヱスターンプロッ
トについて試験した。

１系列の実験において、異なる試験によって推定した収
量は５〜２０Ｂの範囲であった。

庫（ ５Ｂの再生した（　ｒｅｎａｔｕｒｅｄ）　Ｍ　ｅｔ−
アプロチニンを１ミリの０．１モルのトリス−緩衝液ｐ
Ｈ６゜５中に溶解し、そしてトリプシンセファロースを
充填したエコ７−カラムに適用した。

このカラムを前もって０．１モルのトリス−緩衝液ｐＨ
６，５と平衡化した１次いで、このカラムを０．１モル
のトリス−緩衝液ｐＨ６，５で基線が安定となるまで洗
浄した。

このカラムを５容量の０．２モルの酢酸ナトリワム緩衝
ｆＬｐＨ４で洗浄し、次いで５容量の０゜２モルの酢１
’！！／Ｈｅ１ｐＨ１，８で洗浄した。

異なる分画を中和し、そしてそれらの活性を）リプシン
阻害アッセイで決定した。

活性の分画をプールし、次いで蒸留水に対する透析によ
り脱塩した。得られる阻害剤をＮ−末端配列決定および
アミノ酸分析によって特徴づけた。

Ｅ、ｃｏｌ、の発酵物をプラスミドプラスミドｐｉＷｉ
　　ＴＩＯＷｉ７で形質転換し、そしてＭｅｔ−Ｉｌｅ
−１５−アプロチニンの再生を実施例７に記載するのと
同一の手順に従い実施したが、ただし活性はトリプシン
阻害アッセイの代わりにエラスターゼ阻害アッセイによ
り試験した。１系列の実験において、異なる試験によっ
て推定した収量は５〜１１０１１Ｉの範囲であった。

再生したＭｅｔ　　Ｉｌｅ　　１５−アプロチニンを、
さらに、抗アプロチニンポリクローナル抗体カラムを使
用するクロマトグラフィーにより′ＭｇＪＩシた。

ｌｖａｇのＭｅｔ　　Ｉｌｅ　　１５　７ブロチニンを
２１１の０．０５モルのリン酸塩緩衝液、１モルのＮａ
Ｃ１ｐＨ７，０中に溶解し、そして抗アプロチニンポリ
クローナル抗体カラムを充填したエンコー力ラム（４１
＋１００ｍｍ）に適用した。

このカラムを３容量の出発緩衝液で洗浄した６エラスタ
ーゼ阻害剤のＭｅｔ　−Ｉ　ｌｅ　−１５−アプロチニ
ンを％０．２モルのＫＣＩ／ＨＣＩ　　ｐＨ２，２によ
って脱着した。活性分画をプールし、そして蒸留水に対
して透析した。この阻害剤を凍結乾燥により得た（約６
００μｇ）、この阻害剤の１ナノモルのを気相シークエ
ネーターに装入し、モしてＮ−末端配列決定により特徴
づけ、さらに１ナノモルをアミノ酸分析のために使用し
た。

回」Ｄり止−ｆΩｍ 第６図：　　Ｅ、　ｃｏｌ、　ＢＲ１７［ｐｉＷｉ　　
Ｔ　１０ｗＬ１］　・　Ｅ、　　ｃｏｌ、　　Ｂ　Ｒ１
７［ｐｉＷｉＴＩＯＷｉ？］およびＥ、　ｃｏｔ、　Ｂ
Ｒ１７［ｐｉＷｉ　　Ｔｌ０ｗ１からのＥ。

ｃｏｌ、蛋白質の５ＤＳ−ゲル電気泳動（１５％のポリ
アクリルアミド）。

１、ｐｉＷｉ　　ＴＩＯＷｉ７．１０”細胞； ２、ｐｉＷｉ　　ＴＩＯ騨Ｌ１．１０’細胞； ３、可溶性蛋白質ｐｉＷｉ　　Ｔｌ０ Ｗ　ｉ　７　： ４、可溶性蛋白質ｐｉＷｉ　　Ｔｌ０ Ｗｉｌ； ５、可溶性蛋白質ｐｉＷｉ　　ＴＩＯＷ：６、ｐｉＷｉ
　’ｒ　１０ｗ、２Ｘ１０’細胞；７、ｐｉＷｉ　　Ｔ
ＩＯＷｉ７．２× １０”細胞； ８、ｐｉＷｉ　　ＴＩＯＷｉｌ、２× ｉｏ”ｍ胞； 第７図：　　Ｅ、ｅｏｌ、菌株Ｂ　Ｒ１７ｐｉＷｉＴＩ
ＯｗＬｌからの蛋白質の５ＤＳ −デル電気泳動（１０〜２０％のポリ アクリルアミド）。

’Ｉｓ　９　Ｉ７Ｊ：　　再生およびトリプシンセフ７
０−スクロマトグラフイーからの組換えアプロ チニンを、ドデシル硫酸ナトリウムの 勾配（１０〜２０％の）ポリアクリル ７ミドデルの電気泳動のかけ、次いで トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）に従うウェスターンプロット
にかけた。

レーン（１ｉｎｅ）　　１　　アプロチニン；レーン２
　再生後の組換えアプロチニ ン； レーン３　トリプシンセファロースク ロマトグラフィー後の組換えアプロチ ニン。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、合成遺伝子の設計を示す。 第１ｂ図は、ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を示す。 第２ａｔＡは、構成ベクターｐｉＷｉ　　Ｔ９を示す。 第２ｂ図は、ｐｉＷｉ　　Ｔ９部分的ＤＮＡ配列を示す
。 ｔｊｒＪ３　ＩＩは、合成遺伝子のオリゴマー化のため
の増幅の概要を示す。 第４ａ図は、発現ベクターｐｉＷｉＴ１１を示す。 第４１３図は、ｐｉＷ　ｉ　　Ｔ　１１部分的１）　Ｎ
　Ａ配列を示す。 第５ａ図は、プラスミドｐｉＷｉ　　ＴＩＯｗＬｌを示
す。 第５ｂ図は、ｐｉＷｉ　　ＴＩＯｗＬ１部分的ＤＮＡ配
列を示す。 第６図は、ＳＤＳ蛋白質デル電気泳動を示す。 １７図は、ＳＤＳ蛋白質デル電気泳動を示す。 第８図は、Ｍｅｔ−アプロチニンの再生を示す。 第９図は、ウェスターンプロットを示す。 第１０図は、Ｍｅｔ−アプロチニンのクロマトグラフィ
ーを示す。 シｚｐＢＲ３２２ｉｌ−２０６７１ 目目ｐＢＲ３２２＋３２：３３−２３５０１ＦＩ０．３ Ｈ父 目日囲璽 ｘｌｏｌ　　　　　　　２　　　　３ ４３　　°゛− ＦＩＧ、　９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物学的に生産されたＭｅｔ−アプロチニンおよ
   びＭｅｔ−アプロチニン同族体。 ２、位置１５が天然に存在するアミノ酸で置換された微
   生物学的に生産されたＭｅｔ−アプロチニン。 ３、位置１５がＡｒｇ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅ
   ｕ）Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ
   またはＡｌａで置換された微生物学的に生産されたＭｅ
   ｔ−アプロチニン。 ４、位置５２がＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒまたは
   Ｓｅｒで置換された特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
   かに記載の微生物学的に生産されたＭｅｔ−アプロチニ
   ン。 ５、配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡおよびその機能的同等体。 ６、群： ａ）【遺伝子配列があります】 ｂ）【遺伝子配列があります】 ｃ）【遺伝子配列があります】 ｄ）【遺伝子配列があります】 ｅ）【遺伝子配列があります】 ｆ）【遺伝子配列があります】 ｇ）【遺伝子配列があります】 ｈ）【遺伝子配列があります】 から選択されるＤＮＡ配列。 ７、特許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列の１または
   ２以上を含んでなるプラスミド。 ８、ＤＳＭ３６８５およびＤＳＭ３６８６ のＤＳＭ表示を有するＥ．ｃｏｌ．ＢＲ１７微生物。 ９、微生物学的に生産されたＭｅｔ−アプロチニンおよ
   び／またはＭｅｔ−アプロチニン同族体を含有する製薬
   学的組成物。 １０、製剤の製造における微生物学的に生産されたＭｅ
   ｔ−アプロチニンおよびＭｅｔ−アプロチニン同族体の
   使用。