JPH03504009A

JPH03504009A - アプロチニン同族体およびその製造方法

Info

Publication number: JPH03504009A
Application number: JP1505101A
Authority: JP
Inventors: ノリス，ケルズ; ペテルセン，ラルス　クリスチャン
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1989-04-25
Publication date: 1991-09-05
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: JP2810743B2; FI93964B; NO904622L; ZA893075B; FI905275A0; AU619553B2; NO904622D0; NO302950B1; DE68914022T2; WO1989010374A1; FI93964C; NZ228896A; ES2061983T3; EP0339942A3; DE68914022D1; US5373090A; ATE103295T1; IE64230B1; AU3560389A; EP0339942B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】アプロチニン同族体およびその製造方法発明の分野発明の背景本明細書中、語句天然のアミノ酸（もしくはアミノ酸残基）は、個々のアミノ酸残基を示すために用いられる記号と共に以下に掲げられるα−アミノ酸の一種を言うものとする：Ａｓｐ　　アスパラギン酸　　　１１ｅ　　イソロイシンＴｈｒ　　）レオニン　　　　　Ｌｅｕ　　ロイシンＳｅｒ　　セリン　　　　　　　Ｔｙｒ　　チロシンＧｌｕ　　グルタミン酸　　　　Ｐｈｅ　　フェニルアラニンＰｒｏ　　プロリン　　　　　　Ｈｉｓ　　ヒスチジンｃｔｙ　　グリシン　　　　　　Ｌｙｓ　　リシンＡｌａ　　アラニン　　　　　　Ａｒｇ　　アルギニンＣｙｓ　　システィン　　　　　　Ｔｒｐ　　）リプトファンＶａｌ　　バリン　　　　　　　　Ｇｉｎ　　グルタミンＮｅｔ　　メチオニン　　　　　Ａｓｎ　　アスパラギンアプロチニン（ウシの膵臓トリプシン阻害剤、ＢＰＴＩ）は、幾つかのウシの器官および組織例えば、リンパ節、膵臓、肺、耳下腺、牌および肝内に存するポリペプチドである。

これは、次の配列：において３個のジスルフィド橋によって架橋された５８個のアミノ酸残基から成る単鎖ポリペプチドである。

３個のジスルフィド橋は、Ｃｙｓ　（５）　−Ｃｙｓ　（５５）間、Ｃｙｓ　（１４）−Ｃｙｓ　（３８）間およびＣｙｓ　（３０）　−Ｃｙｓ　（５１）間のそれぞれに位置する。

アプロチニンは、種々のセリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、プラスミンおよびカリクレインを阻害し、更に急性膵炎ショック症状の種々の状態、過線維素溶解性出血および心筋梗塞症の治療用に用いられる。アプロチニンを高用量で投与すると、心臓の手術に関連して出血の損失を著るしく減少させる。

アプロチニンは、種々のウシの器官又は組織、例えば肺、膵臓および耳下腺から抽出される。動物組織からの抽出は、やっかいなプロセスでありかつ多量のウシの器官もしくは組織を必要とする。アプロチニンは又、アプロチニンをコードする遺伝子を適当な微生物（これは適当な栄養培地中で培養すると目的生産物を与える）に挿入する組換えＤＮＡ技術によっても得ることができる。

Ｅ、コリー（ｃｏｌｉ）内でのアプロチニン同族体の生産は、ヨーロッパ公開特許出願第２３８．９９３号に記載されており、さらにアプロチニンの酵母内での生産は、デンマーク特許出願第４５０１／８７に記載されている。

ある種のアプロチニン同族体および誘導体は、例えばジエリングＨ６およびＨ，ティジエンチェＨ６によるＥｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｎ＋、　６１　（１９７６）、　４５３〜４５６頁に記載されており、これはＬｙｓ　（１５）をＡｒｇ　Ｐｈｅ又はＴｒｐで置換することを記載しており、あるいは又、アプロチニン同族体を記載する米国特許４．５９５，６７４に記載されており、該同族体において、アプロチニンの活性中心の１５位のりシン残基はＧｌｙ、　Ａｌａ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ。

１１ｅ＋　Ｍｅｔ、　Ａｒｇ＋　　Ｌ　　ａ−アミノ酪酸、Ｌ−ノルバリン、Ｌ −ノルロイシン、デヒドロアラニンもしくはＬ−ホモセリンによって置換されている。また、上記ヨーロッパ特許２３８．９９３は、　Ａｒｇ、　Ｖａｌ、　　Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ、　Ｐｈｅ、　Ｇ１ｙ＋　Ｓｅｒ、　Ｔｒｐ、　ＴｙｒもしくはＡｌａによって置換されたＬｙｓ　（１５）および／又はにｌｕ、　ＬｅＬＩ＋Ｖａｌ、　ＴｈｒもしくはＳｅｔによって置換されたｎｅｔ（５２）を有するアプロチニン同族体を記載する。

公知のアプロチニン同族体が、異なるプロテアーゼに対して変性された効果および有効性を有するため権利請求されている。例えば、アプロチニン（１５Ｖａｌ）は、顆粒球エラスターゼに対する高選択性並びにコラゲナーゼに対する抑制効果を有し、アプロチニン（１，５Ａ１ａ）はエラスターゼに対し極めて弱い抑制効果を有しさらにアプロチニン（１５ＧＩｙ）は顕著なアンチトリプシン活性を有し、更に驚くべきことにカリクレインを阻害する。

発明の要約本発明の目的は、ある種のセリンプロテアーゼ、例エバエステラーゼ、カリクレイン、ｔ−ＰＡ、ウロキナーゼおよび凝固因子、例えばトロンビンに対しより特異的抑制効果を有する新規アプロチニン同族体を提供することにある。

本発明は以下の知見に基づく。すなわち、アプロチニン（３−５８；　４２Ｓｅｒ）の１７位のＡｒｇをＡｌａで置換するか、又は１７位のＡｒｇをＡｌａで置換し更にアプロチニン（３５８；　４２Ｓｅｒ）の１９位のＩｌｅをＧｌｕで置換するとヒト血漿カリクレインの抑制を実質的に増加させる。このことは、アプロチニン（３−５８；　４２Ｓｅｒ）内の１５位のＬｙｓをＡｒｇで更に１７位のＡｒｇをＡｌａで置換するとより明白である。

従って、本発明は１６〜１９位のアミノ酸残基の内の少なくとも１個が別の天然に認められるアミノ残基により置換されているアプロチニン同族体に関する。

上記のデンマーク特許出願第４５０１／８７においてはある種のアミノ酸残基の置換および／又は欠失したアプロチニン同族体が開示されている。これらのアミノ酸残基の置換および／又は欠失の目的は、酵母内でのアプロチニン同族体の生産中において幾つかの塩基性アミノ酸残基での蛋白質分解を避けることにある。

特に、アミノ酸残基の１位および２位は欠失し得さらに二塩基性配列４１−４２位で塩基性アミノ酸残基の一方は、別のアミノ酸残基により置換され得る。このようなアプロチニン同族体は酵母内に産生されかつ天然アプロチニンと同じ特性を示すことが明らかにされている。

酵母内での高生産を確保するため、本発明のアプロチニン同族体は、同様の方法で更に修飾できる。従って、１６位のアミノ酸から１９位のアミノ酸までの配列において修飾された本発明のアプロチニン同族体は、またそれぞれ配列１〜２位および４１〜４２位で修飾されることができる：但し、そのような更なる修飾が本発明の目的に対し不都合な効果を与えないことを条件とする。

本発明のアプロチニン同族体は、天然のアミノ酸残基による公知の置換を含めて別の天然アミノ酸残基を１５位で挿入することによりこの位置で更に修飾され得る。

天然のアプロチニンは、Ｃｙｓ　（１４）とＣｙｓ　（１Ｂ）間にジスルフィド橋を有し、これはＬｙｓ　（１５）での活性部位付近において三次元的構造を強くもたらしている。このジスルフィド結合は、還元剤によって開裂しうる。分子内でのこの位置で、ジスルフィド橋の形成を避けるためのより好都合な方法は、システィン残基を他の残基で置換するか又は単にこれらの残基を欠失することであろう。従って本発明のアプロチニン同族体は更に修飾でき、その結果該同族体は、Ｃｙｓ　（１４）とＣｙｓ　（３８）間にジスルフィド結合を有しない。このことは更に分子に興味ある特性を付与する。

１２位および１３位での最終的修飾が考慮される。

従って、最も広い意味において、本発明は１２位から１９位のアミノ酸残基の配列において修飾されたアプロチニン同族体に関する：但し、もしもＬｙｓ　（１５）が別のアミノ酸で置換されている場合、該配列において少なくとも更に１種のアミノ酸残基は置換されているか、又は欠失している。本発明のアプロチニン同族体は更に上述のように公知方法で配列１〜２位および４１〜４２位で修飾されうる。

本発明の更に別の面によれば、上記アプロチニン同族体の製法が提供されこの方法はアプロチニン同族体をコードする遺伝子を含有する複製能を有する発現ベクターを有する酵母菌株を適当な栄養培地中で培養し、次いで培地より目的産物を回収することを含んでなる。

図面の簡単な説明本発明は更に以下の添付図面によって明らかにされるであろう：第１図はアプロチニン（３−５８；　４２Ｓｅｒ）をコードする合成遺伝子を示し；第２図は、プラスミドｐＫＦＮ３０６の構築を示し；第３図はプラスミドｐＫＦＮ５０４の構築を示し、第４図はプラスミドｐＭＴ６３６の構築を示し；第５Ａ図は、天然アプロチニン、アプロチニン同族体ＫＦＮ３９６およびＫＦＮ３９９による血漿カリクレインの抑制を示し；更に第５Ｂ図は、天然アプロチニン、アプロチニン同族体ＫＦＮ３９６、　ＫＦＮ１１２およびＸＦＮ７７３による血漿カリクレインの抑制を示す。

現在好ましい態様についての詳細な記載本発明のアプロチニン同族体は次の一般式Ｉによって表わすことができる：Ｘ　、　−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘｔ−Ｘ３−Ｘｓ−Ｘｓ　−Ｘ、−Ｘ？−Ｘｓ−Ｘ　９−Ａｒｇ− Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａ　１ａ−Ｌｙｓ−Ａ　１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　１　ｙ−Ｘ　ｒ　ｏ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−χｌ１−ＸＩ２−Ａ５ｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ　−Ｍｅｔ−Ａｒｇ −Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１）前記式中、Ｘ、はＡｒｇ−Ｐｒｏ、　Ｐｒｏもしくは水素好ましくはＡｒｇ　−Ｐｒｏもしくは水素、最も好ましくは水素を意味し；Ｘ２は天然のアミノ酸残基；好ましくはＧｕｙであり；ｘ３は天然のアミノ酸残基、好ましくはＰｒｏであり；Ｘ４およびＸＩｏは各々天然のアミノ酸残基、好ましくは、双方ともＣｙｓであるか又は双方ともＡｌａであり、最も好ましくは双方ともＣｙｓであり、Ｘ、はＬｙｓ、　Ａｒｇ、　Ｖａｌ、　Ｔｈｒ、　Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ＋　Ｐｈｅ＋　Ｇ１ｙ＋Ｓｅｒ、　Ｍｅｔ＋　Ｔｒｐ＋　Ｔｙｒ　ｏｒ　Ａｌａ　、好ましくは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり（但し、Ｘ、がＬｙｓと異なる場合、Ｘ２〜Ｘ４およびＸ６〜Ｘ、の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおいて対応する位置のアミノ酸残基とは異なる）；ＸｈはＡｌａもしくはＧ１３１好ましくはＡｌａであり；Ｘ７は天然のアミノ酸残基好ましくはＡｌａもしくはｃｌｙであり＋ＸＩはＩｌｅ、　Ｌｅｕ、　Ｍｅｔ、　ＶａｌもしくはＰｈｅ　、好ましくはＩｌｅであり；Ｘ９は天然のアミノ酸残基好ましくはＩｌｅもしくはＧｌｕであり；Ｘｌ、は天然のアミノ酸残基好ましくはＬｙｓもしくはＡｒｇであり；Ｘ、２はＬｙｓ　。

Ａｒｇ　、もしくはＳｅｔであり、アミノ酸残基Ｘ２〜Ｘ９、好ましくはＸ、〜Ｘ、より好ましくはＸ６〜Ｘ９の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおける対応するアミノ酸残基とは異なる。

より狭い面によれば本発明の天然のアプロチニン同族体は、次式■によって示される：Ｘ　、　−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−χｓ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘｓ−Ｘｗ−Ａｒｇ−５−Ｘ６−Ｘｓ−Ｘｓ−Ｘへ５ｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−Ｘ　＋　＋　−Ｘ　ｌ　２−　Ａｓｎ−Ａｓｎ −Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｍｅ　ｔ− Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｕ　）式中、ＸｌｌＸ５ＩＸ＆１Ｘ？１ＸＩＩＸ９１ＸＩ＋およびＸＩ□は式Ｉに対して先に定義した意味であり、アミノ酸残基Ｘ、〜Ｘ７、好ましくはＸ　ｂ　””　Ｘ　９の少なくとも１種は天然のアプロチニンにおける対応するアミノ酸残基とは異なる。

より狭い面によれば本発明の天然のアプロチニン同族体は、次式■によって示される：Ｘ　Ｉ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ −Ｔｈｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘｂ−Ｘｔ−Ｘｑ−Ｘｑ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−八５ｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−　Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−Ｘ　ｒ　＋　−Ｘ　＋　ｚ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇｌ　ｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ −Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　（ｍ　）式中、Ｘ１ｌＸ６１Ｘ７１ＸｌｌＸ９１ＸＩ！およびＸ、２は式Ｉに対して先に定義した意味であり、アミノ酸残基Ｘ６〜Ｘ９の少なくとも１種は天然のアプロチニンにおける対応するアミノ酸残基とは異なる。

本発明による好ましいアプロチニン同族体の例は、アプロチニン（３−５８；　　１７ＡＩａ＋４２Ｓｅｒ）であり、これは天然のアプロチニンの最初の２個のアミノ酸残基を欠きかつ１７位のＡｒｇに対して置換されたＡｌａを有し更に４２位のＡｒｇに対して置換されたＳｅｒを有し；またアプロチニン（３−５８ｉ　　１７八Ｉａ＋１９Ｇｌｕ　＋４２Ｓｅｒ）であり、これは天然のアプロチニンの最初の２個のアミノ酸残基を欠きかつ１７位のＡｒｇに対し置換されたＡｌａ　、１９位のＩｌｅに対し置換されたＧｌｕおよび４２位のＡｒｇに対し置換されたＳｅｔを有しており；更にアプロチニン（３−５８；　　１５Ａｒｇ＋　１７Ａｌａ＋４２Ｓｅｔ）であり、これは１５位のＬｙｓに対して置換されたＡｒｇ　、１７位のＡｒｇに対し置換されたＡｌａ　、４２位のＡｒｇに対し置換されたＳｅｔをそれぞれを有する。

本発明に係るアプロチニン同族体の別の例は次の如くである：アプロチニン（３−５８；　１７ＡＩａ）アプロチニン（３−５８；　１７Ａｌａ＋１９ＧＩｕ）アプロチニン（３−５８；　１５Ａｒｇ＋１７Ａ１ａ）アプロチニン（１７ＡＩａ＋４２Ｓｅｒ）アプロチニン（１５Ａｒｇ　＋１７ＡＩａ　＋　４２Ｓｅｒ）アプロチニン（１７Ａ］ａ）アプロチニン（１７Ａ１ａ＋１９Ｇ１ｕ）アプロチニン（１５Ａｒｇ　＋　１７Ａｌａ）分泌目的に対し、好ましいアプロチニン同族体をコードするＤＮＡ−配列を、シグナルおよびリーダーペプチド配列をコードするＤＮＡ−配列に融合させる。シグナルおよびリーダーペプチドは、細胞からの発現蛋白質生産物の分泌中に形質転換された微細物より開裂され、目的生産物のより簡易な単離手順が確保される。酵母に対して良好に適合したリーダーペプチド系は、酵母ＭＦＩｙ１　リーダー配列もしくはその一部である（Ｋｕｒｊａｎ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｋｏｅｉｉｔｚ、　ｒ、ｌ　Ｃｅ１ｌ　３０　（１９８２）９３３〜９４３）。しかし、酵母内で分泌を与えるシグナル−もしくはリーダー配列を用いることができかつ本発明は特定の分泌系に限定されるものではない。

発現の目的に対し、プロモーター配列は目的蛋白質生産物に対してのＤＮＡ−配列の上流に位置する。好ましくは、酵母宿主器官に固有の遺伝子からのプロモーター、例えばＴＰＩ−（トリロースホスフェートイソメラーゼ）のプロモーターが用いられる。目的生産物に対してのＤＮＡ−配列は次いで転写終結配列、好ましくは宿主酵母器官に固有の遺伝子からのターミネータ−１例えばＴＰＩ−遺伝子もしくはＭＦｌｙ１遺伝子のターミネータ−に続くであろう。

適当なプロモーター、シグナル、リーダーおよびターミネータ−配列に融合される目的アプロチニン同族体をコードするＤＮＡ−配列を、酵母内でアプロチニン同族体の発現用の発現ベクターに挿入する。

発現ベクターは、酵母内で独立に複製可能であるか又は酵母染色体に組込み可能なプラスミドである。該プラスミドは、生存もしくは宿主細胞の正常増殖に対して必須である遺伝子、例えば細胞分裂、細胞壁生合成、蛋白質合成等のコードする遺伝子の取込みにより宿主微生物によるプラスミド欠失に対して好ましく安定化される。

実施例１アプロチニン（３−５８；　１７Ａ１ａ＋４２Ｓｅｔ）　（ＫＦＮ３９６）アプロチニン（３−５８；　４２Ｓｅｒ）をコードする配列を多数のオリゴヌクレオチドを結合して構築した。

オリゴヌクレオチドを、制御された孔のグラス支持具上でホスホラミダイト化学を用い自動ＤＮＡ合成器で合成した（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ＋Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２２．１８５９−１８６９）。

次の１０個のオリゴヌクレオチドを合成した：５個の二重鎖Ａ−Ｅを第１図および第２図に示すように上記１０個のオリゴヌクレオチドから形成した。

各々２０ｐｍｏｌｅの二重鎖Ａ−Ｅを５′−ホスホリル化オリゴヌクレオチドＩ −Ｘの対応対から、９０°Ｃで５分間加熱し次いで７５分にわたって室温に冷却することにより形成した。５個の二重鎖を混合し、Ｔ４リガーゼで処理した。合成した配列を、２％ゲル上で連結反応混合物を電気泳動後１７６ｂｐバンドとして単離した。

合成した配列をＭＦ、１　シグナルおよびリーダー配列（１−８５）をコードするプラスミドｐＫＦＮ９からの３３０ｂｐ−ＥｃｏＲＩ　−Ｈｇａ　Ｉに連結し次いでｐＵｃ１９からの大きなＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ　Ｉに連結した。ＭＰ、１　リーダー配列・直後のＨｇａ　Ｉサイトを含有するｐＫＦＮ９の構成は、ヨーロッパ特許出願第０２１４８２６に記載されている。連結結合混合物を、アンピシリン耐性に対して選択された受容能Ｅ、コリー菌株Ｃｒ−１ｍ”　）を形質転換するために用いた。”　Ｐ　−Ｘｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｍａｘａｍ、　　八　ａｎｄ　　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　　Ｍ、（１９８０）　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏ！、　　６５゜４９９−５６０）の配列は、生成コロニーからのプラスミドがアプロチニン（３５８；　４２Ｓｅｒ）に対し正しいＤＮＡ−配列を有していることを示した。

更に使用するため１個のプラスミドｐＤ’１Ｎ３０６を選択した。

プラスミドｐＫＦＮ３０６の構築を第２図に示す。

１７位にＡｌａを導入するため、次のオリゴヌクレオチドを次のように合成した：ＡＴＰとＴ４−キナーゼで処理することにより、オリゴヌクレオチドを５′−〇 −リン酸化した。

５′−リン酸化オリゴヌクレオチドＩａおよびＵａをアニールすることによって形成した二重鎖を３５２ｂｐ　−ＥｃｏＲＩ−ＰｆｌＭ　Ｉフラグメントおよび３　ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｓｔｙ　Ｉフラグメントに連結したがそれらの双方はｐＫＦＮ３０６から得られる。ｐＸＦＮ３０６は、合成アプロチニン（３−５８；　４２Ｓｅｒ）遺伝子に融合した、Ｓ、セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）接合性因子αｌシグナル−リーダー（１−８５）をコードする。

連結混合物を用い、アンピシリン耐性に対して選択した適応能のあるＥ、　ｃｏｌｉ菌株（ｒ−、ｍ”　）を形質転換した。

”　Ｐ　−Ｘｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントの配列決定（Ｍａｘａｍ、　Ａ　ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ、　Ｍ、（１９８０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ＋ｎｏ１．６５．４９９−５６０）は、構成コロニーからのプラスミドがアプロチニン（３５８；　１７Ａ１ａ＋　４２Ｓｅｔ）に対し正しいＤＮＡ−配列を含有することを示した。

１個のプラスミド、ｐＫＦＮ５０１を選び更に使用した。プラスミドｐＫＦＮ５０１の構築を第３図に示す。

ｐＫＦＮ５０１をＥｃｏＲＩおよびＸｂａ　Ｉで切断し次いで０．５ｋｂフラグメントをｐＭＴ６３６からの９．５ｋｂ　Ｎｃｏ　Ｉ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントおよびｐＭＴ６３６からの１．４　ｋｂ　Ｎｃｏ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＫＦＮ５０４を得た（第３図参照）。プラスミドｐＭＴ６３６を、ＬＥＵ−２の欠失後ｐＭＴ６０８からおよびｐＭＴ４７９から構築した（第４図参照）。ｐＭ７６０８はヨーロッパ特許出願第１９５６９１号に記載されている。ｐＭＴ４７９はヨーロッパ特許出願第１６３５２９に記載されている。ｐＭＴ４７９は、５ｃｈｉｚｏ、　　匹頻狙ＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）　、Ｓ、セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　）リオホスフェートイソメラーゼブロモーターおよびターミネータ−を有する（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｋａｅｙａｓａｋｉ、　Ｇ、（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、　１゜４１９−４３４）。プラスミドｐＫＦＮ５０４は、次の配列を有する：ＴＰ１．−ＭＦｔｘｌ　−Ｉ７−ダー（１−８５）−アプロチニン（３−５８；１７Ａｌａ＋４２Ｓｅｔ）　−ＴＰＩｔここで、ＭＦ、、ＩはＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合性因子αＩコード配列であり（Ｋｕｒｊａｎ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍｅｒｓｋｏｗｉｔｚ＋　１．（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０＋　９３３−９４３）、シグナル−リーダー（１−８５）は、ＭＰ、１　シグナル−リーダー配列の最初の８５個のアミノ酸残基を有することを意味し、更にアプロチニン（３５８；　　１７Ａｌａ＋４２Ｓｅｒ）は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基を欠失しさらにそれぞれＡｌａおよびＳｅｔによって置換されたアミノ酸１７位あるいは４２位を有するアプロチニン誘導体をコードする合成配列である。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＭＴ６６３（Ｅ２−７ＢＸＥｌｌ　−３６ａ／　ｃｔ、　ΔｔｐｉΔｔｐｉ、　ｐｅｐ　４−３／ｐｅｐ　４−３）をＹＰＧａＬ（１％バクト酵母エキス、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、１％ラクトース）上で増殖させ６００ｎｍで光学密度０．６を得た。

１００ｄの培養物を遠心分離によって得、１００ｄの水で洗い、再遠心分離し次いで１ｏｄ（１，２Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＮａＪＤＴＡ　、　ｐＨ＝　８．０　、　６．７■／ｄジチオトレイトール）に懸濁させた。懸濁液を３０℃ で１５分間インキュベートし、遠心し次いで細胞をＬｏＲｌ（１，２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＮ　ａ　２　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　＋０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝５．８．２■のノボザイム■２３４）に再懸濁させた。懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、細胞を遠心して集め、１０威の゛１．２Ｍソルビトールおよび１０ｄのＣＡＳ　（１，２Ｍソルビトール、１０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、　１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ　　（Ｔｒｉｓ−トリス　（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）ｐＨ７，５）で洗い次いで２ＩｄのＣＡＳ中に再懸濁させた。形質転換するため、０．　Ｉ　Ｊｌ！１＋のＣＡＳ−再懸濁細胞を、約１■ のプラスミドｐＫＦＮ５０４と混合し、次いで室温で１５分間放置した。

１ｍ（２０％ポリエチレング！、／　−７ＪＬｔ４０００．　ＩＱｔａＭ　ＣａＣ１ｚ、　１０ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣｌ２　、　ｐＨ＝　７．５　）を加え、混合物を更に３０分間室温で放置した。混合物を遠心し次いでベレットを０．　Ｉ　Ｊｌｌｌｌ！の５Ｏ５（１，２Ｍのソルビトール、３３％ｖ／ｖのＹＰＤ、　６．７ｎ＋ＭのＣａＣＥ　ｚ　、　’１４ｔｒｇ　／　ｔｒｄｌのロイシン）に再懸濁させ次いで３０”Ｃで２時間インキュベートした。懸濁液を遠心し、ペレットを０．５　ｍの１．２Ｍソルビトールに再懸濁させた。６ｒＩ１１のｔｏｐ寒天（１，、２Ｍのソルビトール＋２．５％寒天を有するシカルマン等（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＹｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８１）のＳＣ培地）を５２°Ｃで加え、次いで同一の寒天で固化したソルビトール含有培地を存するプレートの頂部に懸濁液を注いだ。

形質転換細胞コロニーを３０゛ｃで３日後集め、再分離し次いで液体培養を開始するため用いた。１個のこのような形質転換細胞ＫＦＮ３９６を更に特性化するために選択した。

酵母菌株ＫＦＮ３９６をＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン（ディツユラボラトリ−市販）および２％グルコース）上で増殖させる。１ｊ２の菌株培養物を６００ｎｍで光学密度１３まで３０°Ｃで振とうした。遠心後、上澄みをＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーで精製した。酵母上澄みを０．２２１Ｍ１ｌｌｅｘ［Ｆ］Ｇシフイルター装置で口過し、次いでｌｌ１１１を２０ｍＭビシン（ｐＨ８，７）で平衡化したＭｏｎｏＳカチオン交換カラム（０，５Ｘ５ｃｍ）に通用した。平衡緩衝液で洗浄後、カラムを平衡緩衝液中線状ＮａＣＥグレデエント（０〜１Ｍ）で溶出した。トリプシン阻害活性を、溶出分画中、分光学的分析により更にＥｚ：Ｏアブロチン−８，３から２８０ｎｍでの吸収量を統合することにより測定した。

収率は約４．３■／！のアプロチニン（３−５８；　　１７Ａ１ａ＋４２Ｓｅｔ）であった。

アミノ酸分析に対し、酵母上澄み（７−）を０．ＩＭ　ＮａＯＨでｐ）１８．７に調節し、口過した（０．２２．ｃｏ）　、　２０ｍＭビシン（ｐＨ８，７）で平衡化したＱ−セファロースアニオン交換カラム（１×４ｃｍ）からの溶出物を、ＭｏｎｏＳカチオン交換カラム（０，５Ｘ５ｃｍ）に適用した。カチオン交換クロマトグラフィー処理を上記のように行った。勾配溶出アプロチニン（３−５８）の濃縮をＭｏｎｏＳでの再クロマトグラフィー処理並びに急勾配のＮａＣ１＝勾配による溶出によって行った。集めた分画を更に減圧遠心により約１００Ｊ１１に濃縮し次いでＲＰ　−ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ　Ｃ４゜４、６　Ｘ２５０　ｍｍ）に適用した。集めた分画を減圧遠心により約アミノ酸分析は次表１から明らかである。この表より、生産物は期待したアミノ酸組成を有することが分かる。

Ａｓｘ　　　　　　　　　５　　　　　　　　４．９０Ｍｅｔ　　　　　　　　　１　　　　　　　　０．９９１ｉｅ　　　　　　　　　２　　　　　　　　２．００Ａｒｇ　　　　　　３　　　　　３．２１１合計　５６　　５５．６０例２アプロチニン　３　５８　；　１７Ａ］ａ＋１９Ｇｌｕ＋４２Ｓｅｔ）　（ＫＦＮ３９９）アプロチニン（３−５８；　　１７＾１ａ＋　１９Ｇ１ｕ＋４２Ｓｅｔ）をコードする合成遺伝子を例１に記載のように構築した。次のオリゴヌクレオチドＩｂおよびｎｂを、ＩａおよびＩＩａの代りに用ｐＵｃ１９由来のプラスミドｐＫＦＮ５０３を、ｐＫＦＮ５０１と同様に構築した。

例１の手順に従い、次の構成を有するプラスミドｐＫＦＮ５０７を得た：ＴＰｂ　　ＭＦ、　１−シグナル−リーダー（１−８５）−アプロチニン（３５８；　　１７Ａｌａ＋　１９ＧＩｕ＋４２Ｓｅｔ）　　　ＴＰＩｔ。

ここでアプロチニン（３５８；　　１７Ａ１ａ＋　１９Ｇｌｕ＋４２Ｓｅｒ）は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基を欠失しかつそれぞれアラニン、グルタミン酸およびセリン残基で置換された天然アプロチニンの残基１７　、１９および４２を有するアプロチニン誘導体をコードする合成遺伝子である。

プラスミドｐＫＦＮ５０７を前記のように酵母菌株ＭＴ６６３内で形質転換し次いで形質転換された菌株ＫＦＮ３９９を培養し、約１０ｍｇ／Ｉｌのアプロチニン（３−５８；　　１７Ａ１ａ＋１９Ｇｌｕ＋４２Ｓｅｔ）を得た。

アミノ酸分析結果を第２表に示すが、この表より期待されるアミノ酸組成が確認される。

Ｍｅｔ　　　　　　１　　　　　０．８６Ｐｈｅ　　　　　　４　　　　　３．８９Ｌ　ｙ　ｓ　　　　　　４　　　　　４．０７Ａ　ｒ　ｇ　　　　　　３　　　　　３．０６合計　　５６　　５４．３６アブロチニン（３−５８；　　１５Ａｒｇ＋　１７Ａｌａ＋４２Ｓｅｒ）をコードする合成遺伝子を例１で記載した如く構築した。

ＩａおよびｌｌａＯ代りに次のオリゴヌクレオチドＩｃおよびＵｃを用いた：ｐＵｃ１９由来のプラスミドρＫＦＮ７０７を、ｐＫＦＮ５０１と同様に構築した。

例１の手順に従い、次の構成を有するプラスミドｐＫＦＮ８０７を得た：ＴＰＩＰ　　ＭＦｌｙｌ−シグナル−リーダー（１−８５）−アプロチニン（３ −５８ｉ　　１５＾ｒｇ＋　１７Ａ１ａ＋４２Ｓｅｒ）　−ＴＰＩＰ。

ここでアプロチニン（３−５８；　　１５Ａｒｇ＋　１７Ａ１ａ＋４２Ｓｅｒ）は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基を欠失しかつそれぞれアルギニン、アラニン、およびセリン残基で置換された天然アプロチニンの残基１５　、１７、および４２を有するアプロチニン誘導体をコードする合成遺伝子である。

プラスミドｐＫＦＮ８０７を前記のように酵母菌株ＭＴ６６３内で形質転換し次いで形質転換された菌株ＫＦＮ７７３を培養し、約８．５ｒｔｒｇ／ｊ２のアプロチニン（３−５８；　　１５Ａｒｇ＋　１７Ａｌａ＋４２Ｓｅｔ）を得た。

アミノ酸分析結果を第３表に示すが、この表より期待されるアミノ酸組成が確認される。

芽ユ」Ｌ−表合計　　５６　　５３．９１理論値と比較してわずかに低い含量のｌｉｅは、ｌ１ｅ（１８）−１ｉｅ（１９）の不完全加水分解におそらく最も寄与している。このことは当業者に周知である。

例４アプロチニン（３−５８；　　１７Ａ１ａ＋４２Ｓｅｒ）　（ＫＦＮ３９６）およびアプロチニン（３−５８；　　１７Ａｌａ＋　１９Ｇ１ｕ＋４２Ｓｅｒ）（ＫＦＮ３９９）、アプロチニン（３−５８；　　１５Ａｒｇ＋４２Ｓｅｒ）　（ＫＦＮ７７２）およびアプロチニン（３−５８；　　１５＾ｒｇ＋　１７八ｌａ　＋　４２Ｓｅｔ）　（ＫＦＮ７７３）によるプラスミドからのセリンプロテアーゼのアプロチニン（３−５８；　　１７Ａ１ａ＋４２Ｓｅｔ）　（ＫＦＮ３９６）、アプロチニン（３−５８；　　１７Ａｌａ＋１９Ｇ１ｕ＋４２Ｓｅｒ）（ＫＦＮ３９９）およびアプロチニン（３−５８；　　１５Ａｒｇ＋　１７Ａｌａ＋４２Ｓｅｒ）（ＫＦＮ７７３）を上記のように精製した。天然のものとして、ノボ社（バズグバエルト、デンマーク国）市販のウシの膵臓アプロチニン（１−５８）バッチＢ　５０２９−６５を用いた。Ｅ　２８０　ｎ１１＝　８−３およびＭｒ＝６５０’Ｏを用いて濃度を計算した。ヒト血漿カリクレインをシグマ社（セントルイス、　？ｌＯ）から得、ウシ因子ＸａをＨ，Ｎｏｂｕ−ｋａｚｕ等（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａ１．９７　（１９８５）　１３４７−１３５５）に従って精製した。ヒト因子１１ａ（スロンビン）は−ルａｗｓｏｎ教授にューヨークステートデパートメントオブヘルス、アルバニー、ニューヨーク）から得た。ｍ換え体ヒト因子■ａは、ノボ社（バズグバエルト、デンマーク国）から得、組換え体ヒト蛋白質ＣａはＺｙｍｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社（シアトル、　ＷＡ）から得た。

基質５２３０２　（Ｈ−Ｄ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ　−ｐ　−ニトロアニリド）基質５２２３８　（Ｈ−Ｄ　−Ｐｈｅ　−Ｐｉｐ　　　Ａｒｇ　−ｐ　 −ニトロアニリド）および基質５２３６６（Ｇｌｕ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−ｐ　　ニートロアニリド）は、カビ社（ストックホルム、スウェーデン国）から得た。基１ｉＦＸａ−ＨメトキシカルボニルＤＣＩ（−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）は、ＮｙｃｏＭｅｄ社（オスロ、ノルウェー国）カラ得り。実験は、１００ｍＭ　ＮａＣｌ１　、５０ｍＭ　トリフ、−ＨＣ／！０、Ｏ１％トウィーン８０　ｐＨ７，４中、２５℃で行った。

ヒト血漿カリクレイン（３ｎＭ）をミクロ−タイターウェルリン発生速度をグイナテックラボラトリー社市販のＥＬＩＳＡ＠オートリーダーＭＲ５８０を用い４０５ｎｍで測定した。速度は、遊離酵素の濃度に比例している。天然のアプロチニンおよび４個の同族体ＫＦＮ３９６．　ＫＦＮ３９９．　ＫＦＮ７７２およびＫＦＮ７７３による血漿カリクレインの抑制を第５Ａ図および第５Ｂ図に示す。

天然のアプロチニンについては適度の抑制が観察された。同族体ＫＦＮ３９６および１７位にＡｌａを有する同族体ＫＦＮ３９９によって抑制は強く増加された。

更に抑制の増加は、１５位のＡｒｇ　（ＫＦＮ７７２）について得られ；更に最も強い抑制が、１７位（Ａｌａ）と１５位（Ａｒｇ）の双方で置換した同族体（ＫＦＮ７７３）について観察された（第５Ｂ図）。同族体をまた、セリンプロテアーゼ：ウシ因子Ｘａ、ヒト因子１１ａ、ヒト組換え体因子■ａおよびヒト組換え体タンパク質Ｃａのアミド分解活性に対して試験した。実験は、血漿カリクレインに対して記載したと同様に行い、適当な基質のみを用いた。最後に、同族体を２種の凝固試験を用いたヒト血漿の凝固因子に対する効果について分析した。

これらの試験、プロトロンビン時間（ＰＴＴ）および活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を、製造者によって示された指示に従いオルグノン社（ダーハム、　ＮＣ）市販のＧｅｎｅｒａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ■試剤を用いて行った。抑制実験の結果を第４表に示すが、この表は４種のアプロチニン同族体による抑制傾向を示している。

ＫＦＮ７７３は、ヒト血漿カリクレインの法外に強い抑制により特徴づけられており、これはＡｒｇ同族体（ＫＦＮ７７２）のそれよりも１０倍強い。逆の効果が活性化蛋白質、Ｃについて認められる。

この場合、Ｌｙｓ１５をＡｒｇに置換することによって得られる、比較的に強い抑制は、Ａｒｇ１７を＾１ａに更に置換することによって弱められる。

Ｌ４ｕ　　アプロチニン同族体の抑制傾向−・・・１．０茹のアプロチニン同族体で抑制なし十・・・１．０団のアプロチニン同族体で凝固時間延長率）・・・ジキソンのグラフ的方法（Ｍ、　ジキソン、　Ｂｉｏｃｈｅ…１ｃａｌ。

Ｊ１月現（１９７２）　１９７−２０２）によって算定された抑制定数９・・・基質：血漿カリクレイン；　５２３０２　；　Ｆ　ＩＩ　ａ　；　５２２３８　；　ＦＶＩｒａ　：基質ＦＸａ　　Ｉ；ＦＸａ：基質ＦＸａ−１；　Ｐｒｏｔ、Ｃａ　：　５２３６６ＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕＧ１ｕＰ　ｒｏＰ　ｒｏＴｙｒＴｈｒＧ　ｌｙＰ　ｒｏＣｙ　５ＬｙｓＡ１　ａＡｒ　ｇ工１ｅＰｆ１Ｍ工２０　　　　　　　　　衿　　　　　　　　３０３５工ｌ　ｅＡｒｇＴｙｒ　Ｐ　ｈｅＴｙｒＡｓ　ｎＡ　ｌ　ａＬｙｓ　Ａｌ　ａＧ　１　ｙＬｅｕＣｙ　ｓＧ　ｌ　ｎＴｈｒＰ　ｈｅＶａ　ｌsｙ　ｒＧ　１ｙＧｌｙｃｙｓＡｒｇＡ１ａＬｙｓＳｅｒＡｓｎＡｓｎＰｈｅＬｙｓＳｅｒＡｌａＧｌｕＡｓｐｃｙｓＭｅセＡｒｑＴｈｒ５ｔＩＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｌａＳｔｏｐＦＩＧ。１ＦＩＧ、　２ＴｈｒＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬｙｓＡｌａＡｌａＺ　ｌｅＩ　１ｅＡｒｇτｙｒ？ｈｅＴｙｒＡｓｎＡｌａ図−丁　　　　　　　　　　　　Ｃ１ｏ　ＩＦＩＧ、５Ａ　　　　　　　　　　　　　　けプｏ＋＞：ｚ　］　（ｎＭ　ＩＦＩＧ、５Ｂ　　　　　　　　　　　　［７７°０＋二刈（ｎｉ１国際調査報告１ｍ５ｍ５＋ｅ＋＋ａｌＡＤ書Ｈｅａｈａ内−、、ＰＣＴ／ＤＫ８９１０００９７゜

Claims

【特許請求の範囲】

１．次式：【配列があります】（式中、Ｘ１はＡｒｇ−Ｐｒｏ，Ｐｒｏもしくは水素を意味し、Ｘ４およびＸ１０は双方ともＣｙｓであるか又は双方ともＡｌａであるか又は双方とも別の天然のアミノ酸残基であり、Ｘ２およびＸ３は独立に天然のアミノ酸残基であり；Ｘ５はＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｍｅｔ，ＴｒＰ，ＴｙｒまたはＡｌａであり（但し、Ｘ５がＬｙｓと異なる場合、Ｘ２〜Ｘ４およびＸ６〜Ｘ９の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおいて対応する位置のアミノ酸残基とは異なる）；Ｘ６はＡＩａもしくはＧｌｙであり；Ｘ７は天然のアミノ酸残基であり；Ｘ８はＩｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，ＶａｌもしくはＰｈｅであり；Ｘ９は天然のアミノ酸残基であり；Ｘ１１は天然のアミノ酸残基であり；Ｘ１２はＬｙｓ，Ａｒｇ、もしくはＳｅｒであり、アミノ酸残基Ｘ２〜Ｘ９の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおける対応するアミノ酸残基とは異なる）を有するアプロチニン同族体。
２．Ｘ１がＡｒｇ−Ｐｒｏもしくは水素、好ましくはＡｒｇ−Ｐｒｏもしくは水素、最も好ましくは水素である、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
３．Ｘ２がＧｌｙである、請求の範囲第１又は第２項記載のアプロチニン同族体。
４．Ｘ３がＰｒｏである、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
５．Ｘ４およびＸ１０がＣｙｓである、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
６．Ｘ５がＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｍｅｔ，Ｔｒｐ，ＴｙｒｏｒＡＩａ、好ましくはＬｙｓ又はＡｒｇである（但し、Ｘ５がＬｙｓと異なる場合、Ｘ２〜Ｘ４およびＸ６〜Ｘ９、好ましくはＸ６〜Ｘ９の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおいて対応する位置のアミノ酸残基とは異なる）請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
７．Ｘ６がＡｌａもしくはＧｌｙ、好ましくはＡｌａである、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
８．Ｘ７がＡｌａもしくはＧｌｙ、好ましくはＡＩａである、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
９．Ｘ８がＩｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｖａｌ、もしくはＰｈｅ、好ましくはＩｌｅである、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
１０．Ｘ９がＩｌｅもしくはＧｌｕ、好ましくはＩｌｅである、請求項第１〜９項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
１１．Ｘ１１がＬｙｓもしくはＡｒｇ、好ましくはＬｙｓである、請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
１２．Ｘ１がＬｙｓ，Ａｒｇ、もしくはＳｅｒ、好ましくはＡｒｇもしくはＳｅｒである、請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載のアプロチニン同族体。
１３．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
１４．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
１５．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
１６．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
１７．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
１８．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
１９．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
２０．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
２１．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
２２．次の構造：【配列があります】を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族体。
２３．次の一般式Ｉ：【配列があります】（式中、Ｘ１はＡｒｇ−Ｐｒｏ，Ｐｒｏもしくは水素を意味し；Ｘ２は天然のアミノ酸残基、好ましくはＧＩｙであり；Ｘ３は天然のアミノ酸残基、好ましくはＰｒｏであり；Ｘ４およびＸ１０は天然のアミノ酸残基、好ましくは、双方ともＣｙｓであるか又は双方ともＡｌａであり、Ｘ５はＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｍｅｔ，Ｔｒｐ，ＴｙｒｏｒＡＩａ好ましくは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり（但し、Ｘ５がＬｙｓと異なる場合、Ｘ２〜Ｘ４およびＸ６〜Ｘ９の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおいて対応する位置のアミノ酸残基とは異なる）；Ｘ６はＡＩａもしくはＧｌｙ好ましくはＡＩａであり；Ｘ７は天然のアミノ酸残基好ましくはＡＩａもしくはＧｌｙであり；Ｘ８はＩｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，ＶａｌもしくはＰｈｅ、好ましくはＩｌｅであり；Ｘ９は天然のアミノ酸残基好ましくはＩｌｅもしくはＧｌｕであり；Ｘ１１は天然のアミノ酸残基好ましくはＬｙｓもしくはＡｒｇであり；Ｘ１２はＬｙｓ，Ａｒｇ、もしくはＳｅｒ好ましくはＡｒｇもしくはＳｅｒであり、アミノ酸残基Ｘ２〜Ｘ９、好ましくはＸ５〜Ｘ９より好ましくはＸ６〜Ｘ９の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおける対応するアミノ酸残基とは異なる）を有するアプロチニン同族体の製造方法であって、複製能を有する発現ベクター（このベクターはアプロチニン同族体をコードする遺伝子並びにアプロチニン同族体を発現せしめるＤＮＡ配列を含んでなる）を有する酵母菌株を適当な栄養培地中で培養し、次いで発現されたアプロチニン同族体を回収することを含んでなる、前記方法。