ES2229236T3 - Inhibidores de la plasmina humana derivados de los dominios de kunitz. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A NUEVOS MUTANTES DEL DOMINANTE PRIMARIO DE KUNITZ (K1) DEL INHIBIDOR DE LA COAGULACION ASOCIADO CON LA LIPOPROTEINA HUMANA (LACI) QUE INHIBEN LA PLASMINA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A OTROS DOMINANTES DE KUNITZ MODIFICADOS QUE INHIBEN LA PLASMINA Y A OTROS INHIBIDORES DE LA PLASMINA.
Description
Inhibidores de la plasmina humana derivados de
los dominios de Kunitz.
Esta invención se refiere a nuevos mutantes del
primer dominio Kunitz (K_{1}) del inhibidor de coagulación
asociado con lipoproteína LACI humano, que inhibe la plasmina. La
invención también se refiere a otros dominios Kunitz modificados que
inhiben la plasmina, y a otros inhibidores de plasmina.
El agente principal responsable de la
fibrinolisis es la plasmina, la forma activada del plasminógeno.
Muchas sustancias pueden activar el plasminógeno, incluyendo el
factor Hageman activado, estreptoquinasa, uroquinasa (uPA),
activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA), calicreína del
plasma (pKA). La pKA es tanto un activador de la forma de zimógeno
de la uroquinasa como un activador directo de plasminógeno.
La plasmina no se puede detectar en la sangre de
la circulación normal, pero el plasminógeno, el zimógeno, está
presente aproximadamente en concentración 3 \muM. Una cantidad
adicional, no medida, del plasminógeno está unida a fibrina y otros
componentes de la matriz extracelular y superficies celulares. La
sangre normal contiene el inhibidor fisiológico de la plasmina, el
inhibidor de plasmina \alpha_{2}
(\alpha_{2}-PI), en concentración de
aproximadamente 2 \muM. La plasmina y el
\alpha_{2}-PI forman un complejo 1:1. La
plasmina unida a la matriz o a la célula está relativamente
inaccesible para la inhibición por el
\alpha_{2}-PI. Por lo tanto, la activación de la
plasmina puede superar la capacidad neutralizante del
\alpha_{2}-PI produciendo un estado
profibrinolótico.
Una vez formada, la plasmina:
i. degrada los coágulos de fibrina, a veces de
forma prematura;
ii. digiere el fibrinógeno (el material de
construcción de los coágulos) afectando a la hemostasis produciendo
la formación de coágulos desmenuzables y que se pueden lisar
fácilmente a partir de los productos de degradación, y la inhibición
de la adhesión/agregación de plaquetas por los productos de
degradación del fibrinógeno;
iii. interacciona directamente con las plaquetas
para escindir las glicoproteínas Ib y IIb/IIIa impidiendo la
adhesión al endotelio dañado en zonas de flujo sanguíneo de alta
cizalladura, y afectando a la respuesta de agregación necesaria para
la formación de tapones de plaquetas (ADEL86);
iv. inactiva enzimas proteolíticamente en la ruta
de coagulación extrínseca promoviendo además un estado
proteolítico.
Robbins (ROBB87) revisa con detalle el sistema de
plasminógeno-plasmina. ROBB87 y las referencias
citadas en él se incorporan aquí como referencia.
La fibrinolisis y fibrinogenolisis inadecuadas
que conducen a la hemorragia excesiva son una complicación frecuente
en los procedimientos quirúrgicos que requieren circulación
extracorpórea, tal como la derivación cardiopulmonar, y también se
encuentra en la terapia trombolítica y transplante de órganos,
particularmente de hígado. Otros estados clínicos caracterizados por
una frecuencia alta de diátesis hemorrágica incluyen cirrosis
hepática, amiloidosis, leucemia promielocítica aguda, y tumores
sólidos La restauración de la hemostasis requiere la infusión de
plasma y/o productos del plasma, la cual tiene riesgo de reacciones
inmunológicas y exposición a patógenos, por ejemplo virus de la
hepatitis y VIH.
Una pérdida muy grande de sangre puede no
resolverse incluso con infusión masiva. Cuando se considera que
amenaza la vida, la hemorragia se trata con antifibrinolíticos tales
como ácido
\varepsilon-amino-caproico (Véase
HOOV93) (EACA), ácido tranexámico, o aprotonina (NEUH98). La
aprotonina también se conoce como Trasylol® y como inhibidor de la
tripsina pancreática bovina (BPTI). En lo sucesivo, la aprotinina se
denominará "BPTI". El EACA y el ácido tranexámico sólo impiden
la unión de la plasmina a la fibrina por unión a los kringles,
dejando así a la plasmina como una proteasa libre en el plasma. El
BPTI es un inhibidor directo de la plasmina y es el más eficaz de
estos agentes. Debido a las posibilidades de complicaciones
trombóticas, toxicidad renal, y en el caso del BPTI,
inmunogenicidad, estos agentes se usan con precaución y normalmente
se reservan como "último recurso" (PUTT89). Los tres agentes
antifibrinolíticos carecen de especificidad y afinidad de objetivo,
e interaccionan con tejidos y órganos por rutas metabólicas no
caracterizadas. Las grandes dosis necesarias debido a la baja
afinidad, efectos secundarios debidos a la falta de especificidad y
posibilidad de reacción inmunitaria y toxicidad en órganos/tejidos,
se unen contra el uso de estos antifibrinolíticos de forma
profiláctica para evitar hemorragias como una terapia
postoperatoria rutinaria, para evitar o reducir la terapia por
transfusión. Por lo tanto, se necesita un antifibrinolítico seguro.
Los atributos esenciales de dicho agente son:
i. Neutralización de la(s)
enzima(s) fibrinolítica(s) objetivo
relevante(s);
ii. Alta afinidad de unión a las enzimas objetivo
para minimizar la dosis;
iii. Alta especificidad por el objetivo, para
reducir los efectos secundarios; y
iv. Alto grado de similitud con la proteína
humana para minimizar la posible inmunogenicidad y/o toxicidad en
órganos/tejidos.
Todas las enzimas fibrinolíticas que son
objetivos candidatos para la inhibición por un antifibrinolítico
eficaz son serina-proteasas homólogas a la
quimiotripsina.
La hemorragia excesiva puede ser el resultado de
una actividad de coagulación deficiente, elevada actividad
fibrinolítica, o una combinación de los dos estados. En la mayoría
de las diátesis hemorrágicas se debe controlar la actividad de la
plasmina. Se cree que el efecto clínico beneficioso del BPTI de
reducir la pérdida de sangre resulta de la inhibición de la plasmina
(K_{D} \sim 0,3 nM) o la calicreína del plasma (K_{D} \sim
100 nM) o ambas enzimas.
En GARD93 se revisa los trombolíticos actualmente
usados, diciendo que aunque los agentes trombolíticos (por ejemplo,
tPA) abren los vasos sanguíneos, la hemorragia excesiva es un
problema de seguridad grave. Aunque el tPA y la estreptoquinasa
tienen semividas en el plasma cortas, la plasmina que activan
permanece en el sistema durante un periodo largo, y como se ha
expuesto, el sistema es potencialmente deficiente en inhibidores de
plasmina. Por lo tanto, la activación excesiva de plasminógeno puede
conducir a una incapacidad de coagular peligrosa y a hemorragias
perjudiciales o mortales. En dichos casos sería útil un inhibidor de
plasmina potente y altamente específico.
El BPTI es un inhibidor de plasmina potente, sin
embargo, se ha encontrado que es suficientemente antígeno para que
los segundos usos requieran ensayo de la piel. Además, las dosis de
BPTI necesarias para controlar la hemorragia son bastante altas y el
mecanismo de acción no está claro. Algunos dicen que el BPTI actúa
en la plasmina, mientras que otros dicen que actúa inhibiendo la
calicreína del plasma. En FRAE89 se describe que dosis de
aproximadamente 840 mg de BPTI a 80 paciente de cirugía a corazón
abierto, redujeron la pérdida de sangre en casi la mitad, y la
cantidad media de transfusión disminuyó en 74%. Miles inc.,
recientemente ha introducido el Trasylol en EE.UU. para reducir la
hemorragia en cirugía (véase el folleto del producto de Miles en el
Trasylol). En LOHM93 se sugiere que los inhibidores de plasmina
pueden ser útiles para controlar la hemorragia en cirugía de los
ojos. En SHER89 se describe que el BPTI puede ser útil para limitar
la hemorragia en la cirugía de colon.
Un inhibidor de plasmina que es aproximadamente
tan potente como el BPTI o más potente, pero que es casi idéntico a
un dominio de proteína humana, ofrece un potencial terapéutico
similar, pero tiene menor potencial antigénico.
La plasmina es la enzima clave en la
angiogénesis. En OREI94 se describe que un fragmento de 38 kDa de la
plasmina (que carece del dominio catalítico) es un potente inhibidor
de la metástasis, indicando que la inhibición de la plasmina podría
ser útil para bloquear la metástasis de tumores (FIDL94). Véase
también ELLI92.
La plasmina es una
serina-proteasa derivada del plasminógeno. El
dominio catalítico de la plasmina (o "CatDom") corta enlaces
peptídicos, particularmente después de restos de arginina y en menor
medida después de lisinas, y es altamente homólogo a la tripsina,
quimiotripsina, calicreína, y muchas otras
serina-proteasas. La mayor parte de la especificidad
de la plasmina deriva de la unión de la fibrina a los kringles
(LUCA83, VARA83, VARA84). Cuando se activa, corta el enlace entre
Arg_{561}-Val_{562}, permitiendo que los
extremos amino libres recién formados, formen un puente salino. Sin
embargo, los kringles permanecen unidos al CatDom por dos disulfuros
(COLM87, ROBB87).
Se ha descrito que el BPTI inhibe la plasmina con
K_{D} de aproximadamente 300 pM (SCHN86). En AUER88 se describe
que el BPTI(R_{15}) tiene una K_{i} para la plasmina de
aproximadamente 13 nM, sugiriendo que R_{15} es sustancialmente
peor que K_{15} para la unión a la plasmina. En SCHN86 se describe
que el BPTI en el que los restos C_{14} y C_{38} se han
convertido en Alanina, tiene una K_{i} para la plasmina de 4,5 nM.
En KIDO88 se describe que el APP-I tiene una K_{i}
para la plasmina de aproximadamente 75 pM (7,5 x 10^{-11} M), el
inhibidor más potente de la plasmina humana descrito hasta ahora.
Sin embargo, en DENN94a se describe que el APP-I
inhibe la plasmina con K_{i} = 225 nM (2,25 x 10^{-7} M). La
segunda y tercera biblioteca de la presente invención se diseñaron
suponiendo que el APP-I es un potente agente de
unión a la plasmina. El procedimiento de selección no selecciona los
restos del APP-I en la mayoría de las situaciones, y
en la descripción de DENN94a se explica por qué se produce esto.
Con técnicas de ADN recombinante, se puede
obtener una nueva proteína por expresión de un gen mutado que
codifica un mutante del gen de la proteína nativa. Se conocen varias
estrategias para seleccionar mutaciones. En una estrategia, se
mantienen constantes algunos restos, otros se mutan de forma
aleatoria, y todavía otros se mutan de una forma predeterminada.
Esto se llama "variegación" y es definido por Ladner et
al., documento USP 5.223.409.
En DENN94a y DENN94b se describen selecciones de
dominios Kunitz basados en el APP-I para la unión al
complejo del Factor tisular con el Factor VII. No usaron
LACI-K1 como pariente y no usaron plasmina como
objetivo. El agente de unión de mayor afinidad que obtuvieron tenía
K_{D} para su objetivo de aproximadamente 2 nM. Los seleccionados
en el primer ciclo de los autores de la invención tienen una
afinidad de este orden, pero los seleccionados en el segundo ciclo
de los autores de la invención son aproximadamente 25 veces mejores
que estos.
Se supone que es menos probable que las proteínas
cogidas de una especie particular produzcan una respuesta
inmunitaria cuando se inyectan a individuos de esa especie. Los
anticuerpos murinos son altamente antígenos en seres humanos. Los
anticuerpos "quiméricos" que tienen dominios constantes humanos
y dominios variables murinos son indudablemente menos antígenos. Los
anticuerpos llamados "humanizados" tienen dominios constantes
humanos y dominios variables en los que las CDR se cogen de
anticuerpos murinos mientras que la región armazón de los dominios
variables son de origen humano. Los anticuerpos "humanizados"
son mucho menos antígenos que los anticuerpos "quiméricos". En
un anticuerpo "humanizado", de cincuenta a sesenta restos de la
proteína no son de origen humano. Las proteínas de esta invención
comprenden, en la mayoría de los casos, sólo aproximadamente sesenta
aminoácidos, y normalmente hay diez diferencias o menos entre la
proteína diseñada y la proteína parental. Aunque los seres humanos
desarrollan anticuerpos incluso contra proteínas humanas, tales como
la insulina humana, dichos anticuerpos tienden a unirse débilmente y
con frecuencia no impiden que la proteína inyectada presente su
función biológica pretendida. El uso de una proteína de la especie
que se va a tratar no garantiza que no haya respuesta inmunitaria.
Sin embargo, la selección de una proteína con una secuencia muy
próxima a una proteína humana reduce mucho el riesgo de una
respuesta inmunitaria fuerte en seres humanos.
Los dominios Kunitz son muy estables y se pueden
producir eficazmente en levaduras u otros organismos hospedantes. Se
han descrito al menos diez dominios Kunitz humanos. Aunque en cierto
momento se pensó que el APP-I era un potente
inhibidor de plasmina, actualmente no hay dominios Kunitz humanos
que inhiban la plasmina tan bien como lo hace el BPTI. Por lo tanto,
un objetivo de la presente invención es proporcionar secuencias del
dominio Kunitz que sean tanto potentes inhibidores de plasmina como
que tengan una secuencia próxima a los dominios Kunitz humanos.
Se conoce en la técnica la mutagénesis
específica, sea aleatoria o no aleatoria, para obtener proteínas de
unión mutantes con mejor actividad, pero el éxito no está
asegurado.
Esta invención se refiere a mutantes de dominios
Kunitz homólogos al BPTI que inhiben potentemente la plasmina
humana. En particular, esta invención se refiere a mutantes de un
dominio de LACI humano, que es probable que no sean inmunógenos para
seres humanos, y que inhiben la plasmina con una K_{D},
preferiblemente, de aproximadamente 5 nM o menos, más
preferiblemente de aproximadamente 300 pM o menos, y más
preferiblemente de aproximadamente 100 pM o menos. La invención
también se refiere al uso terapéutico y de diagnóstico de estas
nuevas proteínas.
Las proteínas inhibidoras de la plasmina son
útiles para prevenir o tratar estados clínicos producidos o
exacerbados por la plasmina, incluyendo la fibrinolisis o
fibrinogenolisis inadecuada, hemorragia excesiva asociada con
trombolíticos, hemorragia postoperatoria, androgénesis inadecuada.
Los mutantes que se unen a la plasmina, sean o no inhibidores, son
útiles para el ensayo de muestras de plasmina, in vitro,
para la formación de imágenes de zonas de actividad de la plasmina,
in vivo, y para la purificación de la plasmina.
Se seleccionó una proteína especialmente
preferida, SPI11, de una biblioteca que permite la variabilidad en
las posiciones 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19 y 21, y tiene una
afinidad por la plasmina que es menor que 100 pM (es decir
aproximadamente 3 veces superior al BPTI en la unión), y además
tiene una secuencia mucho más parecida al LACI, una proteína humana,
que al BPTI, una proteína bovina. Entre otros mutantes de
LACI-K1 seleccionados de esta biblioteca y que se
piensa que tienen una afinidad muy alta por la plasmina, se incluyen
SPI15, SPI08 y SPI23. Se ha cribado una biblioteca adicional que
permite la variación en las posiciones 10, 11, 13 15, 16, 17, 18,
19, 21, 31, 32, 34, 35, y 39, y se ha encontrado una secuencia de
consenso (SPIcon1). Las variantes que se ha mostrado que son mejores
que QS4, y por lo tanto más preferidas, incluyen SPI15 y SPI47. Se
han identificado secuencias que es probable que tengan una afinidad
muy alta por la plasmina y retengan todavía una secuencia de
aminoácidos esencialmente humana, e incluyen las secuencias de
SPI60, SPI59, SPI42, SPI55, SPI56, SPI52, SPI46, SPI49, SPI53,
SPI41, y SPI57. La información de la secuencia de aminoácidos que
confiere una alta afinidad por el sitio activo de la plasmina se
puede transferir a otros dominios Kunitz, particularmente a dominios
Kunitz de origen humano; se describen diseños de varias de dichas
proteínas.
Los inhibidores de plasmina preferidos de la
presente invención cumplen uno o más de los siguientes
desiderata:
1) la K_{i} para la plasmina es como máximo 20
nM, preferiblemente no mayor de aproximadamente 5 nM, más
preferiblemente no mayor de aproximadamente 300 pM, y más
preferiblemente, no mayor de aproximadamente 100 pM,
2) el inhibidor comprende un dominio Kunitz que
satisface los requisitos mostrados en la Tabla 14 con el número de
los restos respecto al BPTI,
3) en las posiciones del dominio Kunitz
12-21 y 32-39, uno de los tipos de
aminoácidos listados para esa posición en la Tabla 15, y
4) el inhibidor tiene una secuencia de
aminoácidos más parecida a una secuencia de referencia seleccionada
del grupo de SPI11, SPI15, SPI08, que la secuencia de aminoácidos de
dicho dominio Kunitz respecto a la secuencia del BPTI.
En esta memoria, las afinidades se exponen como
K_{D} (K_{D}(A,B) = [A][B]/[A-B]). Una
K_{D} numéricamente más pequeña refleja una afinidad mayor. Para
los propósitos de esta invención, una "proteína inhibidora de
plasmina" es una que se une e inhibe la plasmina con K_{i} de
aproximadamente 20 mM. "Inhibición" se refiere a bloquear la
actividad catalítica de la plasmina, y se puede medir en ensayos
in vitro usando sustratos cromógenos o fluorógenos, o en
ensayos que implican macromoléculas.
Se habla de los restos de aminoácidos de tres
formas: nombre completo del aminoácido, código patrón de tres
letras, y código patrón de una letra. Las tablas usan sólo el código
de una letra. El texto usa los nombres completos y el código de tres
letras cuando se requiera claridad.
A = Ala | G = Gly | M = Met | S = Ser |
C = Cys | H = His | N = Asn | T = Thr |
D = Asp | I = Ile | P = Pro | V = Val |
E = Glu | K = Lys | Q = Gln | W = Trp |
F = Phe | L = Leu | R = Arg | Y = Tyr |
Para el propósito de esta invención, secuencias
"sustancialmente homólogas" son al menos 51%, más
preferiblemente al menos 80%, idénticas, en cualesquiera regiones
especificadas. En esta memoria, las secuencias que son idénticas se
entiende que son "sustancialmente homólogas". Las secuencias
todavía serían "sustancialmente homólogas" si dentro de una
región de al menos 20 aminoácidos son suficientemente similares (51%
o más) pero fuera de la región de comparación son totalmente
diferentes. Una inserción de un aminoácido en una secuencia respecto
a la otra cuenta como un malapareamiento. Más preferiblemente, no
hay más de seis restos, a parte de los extremos, que sean
diferentes. Preferiblemente, la divergencia de secuencia,
particularmente en las regiones especificadas, es en forma de
"modificaciones conservativas".
Las "modificaciones conservativas" se
definen como
(a) sustituciones conservativas de aminoácidos
como se definen en la Tabla 9; y
(b) inserciones puntuales o múltiples o
eliminaciones de aminoácidos en los extremos, en los límites de
dominios, en bucles, o en otros segmentos de movilidad relativamente
alta.
Preferiblemente, excepto en los extremos, no se
insertan o eliminan más de aproximadamente seis aminoácidos en
ningún locus, y las modificaciones están fuera de las regiones que
se sabe que contienen sitios de unión importantes.
En esta memoria, "dominio Kunitz" y
"KuDom" se usan de forma intercambiable para significar
un homólogo del BPTI (no del inhibidor de la tripsina de soja
Kunitz). Un KuDom es un dominio de una proteína que tiene al menos
51 aminoácidos (y hasta aproximadamente 61 aminoácidos) que
contienen al menos dos, y preferiblemente tres disulfuros. En esta
memoria, los restos de todos los dominios Kunitz se numeran con
referencia al BPTI (es decir, restos 1-58). Por
lo tanto, el primer resto de cisteína es el resto 5 y la última
cisteína es la 55. Una secuencia de aminoácidos, para el propósito
de esta invención, se considerará un dominio Kunitz si se puede
alinear, con tres o menos malapareamientos, con la secuencia
mostrada en la Tabla 14. Una inserción o eliminación de un resto
contará como un malapareamiento. En la Tabla 14, "x" empareja
con cualquier aminoácido y "X" empareja con los tipos listados
para esa posición. Los enlaces disulfuro unen al menos dos de 5 a
55, 14 a 38, y 30 a 51. El número de disulfuros se puede reducir en
uno, pero no se debe dejar desapareada ninguna de las cisteínas
patrón. Por lo tanto, si se cambia una cisteína, entonces se añade
una cisteína para compensar en una posición adecuada, o la cisteína
de emparejamiento se sustituye también por un resto no cisteína
(prefiriéndose generalmente esto último). Por ejemplo, el inhibidor
de proteasa de la glándula accesoria de la Drosophila
funebris macho no tiene cisteína en la posición 5, pero tiene
una cisteína en la posición 1 (justo antes de la posición 1); se
supone que ésta forma un disulfuro con la Cys_{55}. Si se
sustituyen la Cys_{14} y Cys_{38}, disminuyen los requisitos de
Gly_{12}, (Gly o Ser)_{37} y Gly_{36}. Se pueden unir a
cualquiera de los extremos de un dominio Kunitz desde cero hasta
muchos restos, incluyendo dominios adicionales (incluyendo otros
KuDoms).
Los inhibidores de proteasas, tales como los
dominios Kunitz, funcionan mediante la unión en el sitio activo de
la proteasa de forma que un enlace peptídico (el "enlace
escindible"): 1) no se escinde, 2) se escinde muy despacio, o 3)
se escinde sin efecto porque la estructura del inhibidor impide la
liberación o separación de los segmentos escindidos. En los dominios
Kunitz, los enlaces disulfuro actúan para mantener la proteína
junta, incluso si los enlaces peptídicos expuestos son escindidos.
Desde el resto en el lado amino del enlace escindible, y moviéndose
alejándose del enlace, los restos se denominan convencionalmente P1,
P2, P3, etc. Los restos que siguen al enlace escindible se denominan
P1', P2', P3', etc. (SCHE67, SCHE68). En general, se acepta que cada
serina-proteasa tiene sitios (que comprenden varios
restos) S1, S2, etc., que reciben los grupos laterales y los átomos
de la cadena principal de los restos P1, P2, etc. del sustrato o
inhibidor, y sitios S1', S2', etc., que reciben los grupos laterales
y los átomos de la cadena principal de P1', P2', etc. del sustrato o
inhibidor. Son las interacciones entre los sitios S y los grupos
laterales P y átomos de la cadena principal, las que dan la
especificidad de la proteasa con respecto a los sustratos y la
especificidad de los inhibidores respecto a las proteasas. Debido a
que el fragmento que tiene el nuevo extremo amino sale de la
proteasa primero, muchos investigadores que diseñan moléculas
pequeñas inhibidores de proteasas se han concentrado en compuestos
que se unen a los sitios S1, S2, S3, etc.
En LASK80 se revisan los inhibidores de proteasas
proteínicos. Algunos inhibidores tienen varios sitios reactivos en
una cadena de polipéptido, y estos dominios normalmente tienen
secuencias, especificidades e incluso topologías diferentes. Se sabe
que la sustitución de aminoácidos en la región P_{5} a P_{5}'
influye en la especificidad de un inhibidor. Previamente, se ha
centrado la atención en el resto P1 y en los que están muy cerca de
éste, porque estos pueden cambiar la especificidad de una clase de
enzima a otra. En LASK80 se sugiere que entre los KuDoms, los
inhibidores con P1 = Lys o Arg inhiben la tripsina, los que tienen
P1 = Tyr, Phe, Trp, Leu y Met inhiben la quimotripsina, y los que
tienen P1 = Ala o Ser es probable que inhiban la elastasa. Se
continua diciendo en LASK80, que entre los inhibidores de Kazal, los
inhibidores con P1 = Leu o Met son inhibidores fuertes de la
elastasa, y en la familia de Bowman-Kirk la elastasa
es inhibida con P1 = Ala, pero no con P1 = Leu. Dichos cambios
limitados no proporcionan inhibidores realmente con alta afinidad
(es decir, mejor que 1 a 10 nM).
Los dominios Kunitz se definen a continuación. Se
conoce la estructura 3D (con alta resolución) del BPTI (el dominio
Kutzal prototípico). Una de las estructuras de rayos X está
depositada en el Brookhaven Protein Data Bank como "6PTI". Se
conocen las estructuras 3D de algunos homólogos del BPTI (EIGE90,
HYNE90). Se conocen al menos setenta secuencias KuDom. Entre los
homólogos humanos conocidos se incluyen tres KuDoms de LACI (WUNT88,
GIRA89, NOVO89), dos KuDoms del inhibidor
inter-\alpha-tripsina,
APPI-I (KIDO88), un KuDom de colágeno, y tres KuDoms
de TFPI-2 (SPRE94).
El inhibidor de coagulación asociado a
lipoproteína (LACI) es una fosfoglicoproteína del suero humano con
un peso molecular de 39 kDa (secuencia de aminoácidos en la Tabla 1)
que contiene tres KuDoms. En lo sucesivo se denomina a la proteína
LACI y a sus dominios Kunitz LACI-K1 (restos 50 a
107), LACI-K2 (restos 121 a 178), y
LACI-K3 (213 a 270). La secuencia de ADNc de LACI se
describe en WUNT88. En GIRA89 se describen estudios de mutación en
los que se alteraban los restos P1 de cada uno de los tres KuDoms.
LACI-K1 inhibe el Factor VIIa (F.VII_{a}), cuando
F.VII_{a} forma complejo con el factor tisular, y
LACI-K2 inhibe el Factor X_{a}. No se sabe si
LACI-K3 inhibe algo. Ni LACI ni ninguno de los
KuDoms de LACI es un inhibidor potente de plasmina.
Los KuDoms de esta invención son sustancialmente
homólogos a LACI-K1, pero difieren de forma que
confieren la fuerte actividad inhibidora de plasmina antes
discutida. Otros KuDoms de esta invención son homólogos a otros
KuDoms naturales, particularmente a otros KuDoms humanos. Para usar
en seres humanos, las proteínas de esta invención se diseñan para
que tengan una secuencia más parecida a un KuDom humano que al BPTI,
para reducir el riesgo de producir una respuesta inmunitaria.
Los autores de la invención han cribado en una
primera biblioteca de LACI-K1 los mutantes que
tienen alta afinidad por la plasmina humana, y han obtenido las
secuencias mostradas en la Tabla 2 y Tabla 3. Estas secuencias se
pueden resumir como se muestra en la Tabla 16, donde "restos
preferidos" son los que aparecen en al menos una de las 32
variantes que se ha identificado que se unen a la plasmina. Las
preferencias en los restos 13, 16, 17, 18 y 19 son fuertes, como se
muestra en la Tabla 17. Aunque la variedad de tipos permitidos en 31
y 32 está limitada, la selección indica que se prefiere un grupo
ácido en 31 y un grupo neutro en 32. En el resto 17 se prefiere Arg;
la Lys, otro aminoácido positivamente cargado, no estaba en la
biblioteca, y puede ser un sustituto adecuado para la Arg. Muchos
tipos de aminoácidos en las posiciones 34 y 39 están de acuerdo con
la unión de alta afinidad a la plasmina, pero algunos tipos pueden
dificultar la unión.
Se entenderá que los autores de la invención no
han secuenciado todos los aislados positivos de estas y otras
bibliotecas descritas en esta memoria, y que algunas de las
proteínas posibles pueden haber estado presentes en cantidades no
detectables.
Los autores de la invención han preparado una
segunda biblioteca de derivados de LACI-K1 mostrados
en la Tabla 5, y que permite variaciones en los restos 10, 11, 13,
15, 16, 17, 18, 19, y 21. En ésta se cribó la unión a la plasmina, y
se obtuvieron las proteínas mostradas en la Tabla 6.
"Consenso" en la Tabla 6 es
E_{10}TGPCRARFERW_{21}, donde los
siete restos subrayados difieren de LACI-K1. En la
posición 10 sólo se vieron aminoácidos ácidos (Glu:17 o Asp:15); Lys
y Asn no son aceptables. Puesto que Glu y Asp aparecen casi con la
misma frecuencia, probablemente contribuyen igual a la unión. No se
vieron restos ácidos en la posición 11. La Thr era más común
(11/32), apareciendo la Ser con frecuencia (9/32); la Gly aparecía 8
veces. En 13, la Pro era muy preferida (24/32) siendo segunda la Ala
con 5/32. En 15, la Arg era realmente muy preferida (25/32), pero
algunos aislados (7/32) tenían Lys. Hay que indicar que
BPTI(R_{15}) es un inhibidor de plasmina peor que BPTI. En
16, la Ala era preferida (22/32), pero la Gly aparecía con bastante
frecuencia (10/32). En 17, la Arg era la más común (15/32), siendo
Lys la segunda (9/32). En los restos 17 y 18, APP-I
tenía Met e Ile. En 18, se permitía Ile o Phe. Sólo cuatro aislados
tienen Ile en 18, y ninguno de estos tiene Met en 17. Esto era
sorprendente de acuerdo con KIDO88, pero bastante comprensible de
acuerdo con DENN94a. Esta colección de aislados tiene una amplia
distribución en 19: (Glu:8, Pro:7, Asp:4. Ala:3, His:3, Gly:2,
Gln:2, Asn:1, Ser:1 y Arg:1), pero se prefieren más los grupos
laterales ácidos frente a los básicos. En 21, la distribución era
(Trp:16, Phe:14, Leu:2, Cys:0); BPTI tiene Tyr en 21.
Se comparó la unión del fago clónicamente puro
que presenta una u otra de estas proteínas, con la unión del fago de
BPTI (Tabla 6). Los autores de la invención han determinado la
K_{i} de la proteína SPI11, y han encontrado que es
aproximadamente 88 pM, que es sustancialmente superior a la de
BPTI.
Los autores de la invención usaron una mezcla de
fagos de la segunda biblioteca (variaciones en los restos 10, 11,
13, 15, 16, 17, 18, 19, y 21) que se habían seleccionado dos veces
por la unión a plasmina como una fuente de ADN en la que se había
introducido variegación en los restos 31, 32, 34, 35 y 39, como se
muestra en la Tabla 7.
En esta biblioteca se cribó en tres ciclos la
unión a plasmina, y se obtuvieron los aislados mostrados en la Tabla
8. La distribución de tipos de aminoácidos se muestra en la Tabla 18
donde "x" significa que el tipo de aminoácido no estaba
permitido, y "*" indica el tipo salvaje de
LACI-K1.
Las secuencias dieron un consenso en la región
10-21 y 31-40 de
E_{10}TGPCRAKFDRW_{21}...E_{31}AFVYGGCGG_{40}
(SPIcon1 en la Tabla 4). Los diez aminoácidos subrayados difieren de
LACI-K1. En ocho posiciones diferentes, era bastante
común un segundo tipo: Asp en 10, Ala en 11, Glu en 19, Phe en 21,
Thr en 31, Pro o Ser en 32, Leu o Ile en 34, y Glu en 39. En la
posición 17, el inhibidor SPI11 muy potente tiene R. Por lo tanto,
la secuencia
D_{10}TGPCRARFDRF_{21}...E_{31}AFIYGGCEG_{40}
(DPI-1.1.1 en la Tabla 4) difiere de
LACI-K1 sólo en seis restos, se empareja con las
secuencias seleccionadas en los restos que tienen fuerte consenso, y
tiene sustituciones preferidas en las posiciones 10, 17, 21, 34 y
39. Se espera que DPI-1.1.1 tenga una afinidad muy
alta por la plasmina y poco potencial de inmunogenicidad en seres
humanos.
Los ensayos previos de las proteínas SPI11, y por
comparación de BPTI, de la actividad inhibidora de la plasmina,
mostraron que SPI11 es significativamente más potente que BPTI con
K_{i} de aproximadamente 88 pM.
Un KuDom que es altamente homólogo en los restos
5-55 respecto a cualquiera de las secuencias de
SPI11 y SPI15 como se muestra en la Tabla 4, es probable que sea un
inhibidor potente (K_{D} > 5 mM) de la plasmina, y tenga una
baja posibilidad de antigenicidad en seres humanos. Más
preferiblemente, para tener una alta afinidad por la plasmina, un
KuDom tendría una secuencia que es idéntica en los restos
10-21 y 31-39 y tiene cinco o menos
diferencias en los restos 5-9, 22-30
y 40-55, cuando se compara con cualquiera de las
secuencias SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI47, QS4, y NS4.
Usando las secuencias seleccionadas y los datos
de unión de los KuDoms seleccionados y naturales, se puede escribir
una receta para un KuDom inhibidor de plasmina de alta afinidad, que
se puede aplicar a otros KuDom humanos parentales. Primero, el KuDom
debe cumplir los requisitos de la Tabla 14. Es probable que las
sustituciones mostradas en la Tabla 15 confieran actividad
inhibidora de plasmina de alta afinidad en cualquier KuDom. Así, una
proteína que contenga una secuencia que es un KuDom, como se muestra
en la Tabla 14, y que contenga en cada una de las posiciones
12-21 y 32-39 un tipo de aminoácido
mostrado en la Tabla 15 para esa posición, es probable que sea un
potente inhibidor de la plasmina humana. Más preferiblemente, la
proteína tendría un tipo de aminoácido mostrado en la Tabla 15 para
todas las posiciones listadas en la Tabla 15. Para reducir la
posibilidad de respuesta inmunitaria, se debe usar uno u otro KuDom
humano como proteína parental para dar la secuencia fuera de la
región de unión.
Es probable que una proteína que comprende una
secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a SPI11
desde el resto 5 al resto 55 (como se muestra en la Tabla 4) y que
es idéntica a SPI11 en las posiciones 13-19, 31, 32,
34 y 39, inhiba la plasmina humana con una K_{i} de 5 nM o menor.
SPI11 difiere de LACI-K1 en 7 posiciones. No está
claro que estas sustituciones sean igualmente importantes para
favorecer la unión a la plasmina e inhibición. Hay siete moléculas
en las que una de las posiciones sustituidas de SPI11 se cambia al
resto encontrado en LACI-K1 (es decir, "se
invierte"), 21 en las que se invierten dos de los restos, 35 en
las que se invierten tres restos, 35 en las que se invierten cuatro,
21 en las que se invierten cinco, y siete en las que se invierten
seis. Se espera que las que tienen más restos invertidos tengan
menos afinidad por la plasmina, pero también menor posibilidad de
inmunogenicidad. Un experto en la técnica puede seleccionar una
proteína de suficiente potencia y baja inmunogenicidad de esta
colección de 126. También es posible que las sustituciones en SPI11
por aminoácidos que difieren de LACI-K1, puedan
reducir la inmunogenicidad sin reducir la afinidad por la plasmina
en un grado que haga a la proteína inadecuada para usarla como un
fármaco.
En lo sucesivo, "DPI" significará
"Inhibidor de plasmina diseñado" (por sus siglas en inglés
" Designed Plasmin Inhibitor"), que
son KuDoms que incorporan información de secuencias de aminoácidos
de la serie de moléculas SPI, especialmente SPI11. En la Tabla 4 se
dan secuencias de varios DPI y sus proteínas parentales.
Las secuencias DPI-1.1.1,
DPI-1.1.2, DPI-1.1.3,
DPI-1.1.4, DPI-1.1.5 y
DPI-1.1.6 (en la Tabla 4) difieren de
LACI-K1 en los aminoácidos 6, 5, 5, 4, 3 y 2
respectivamente, y representan una serie en la que la afinidad por
la plasmina puede disminuir lentamente mientras que la similitud con
una secuencia humana aumenta, para reducir así la probabilidad de
inmunogenicidad. Las selecciones de cada una de las bibliotecas
muestra que M18F es una sustitución clave, y que I17K o I17R son muy
importantes. Las selecciones de la segunda y tercera biblioteca
indican que la Arg es muy preferida en 15, y que un grupo lateral
ácido en 11 es desventajoso para la unión. El inhibidor SPI11 muy
potente difiere del consenso en que tiene R_{17} como BPTI.
DPI-1.1.1 lleva las mutaciones D11T, K15R, I17R,
M18F, K19D, y E32A, y es probable que sea tan potente como un
inhibidor de plasmina. DPI-1.1.2 lleva D11A, K15R,
I17R, M18F y K19D, y es probable que sea muy potente.
DPI-1.1.3 lleva las mutaciones D11T, K15R, I17R,
M18F y K19D respecto a LACI-K1.
DPI-1.1.3 difiere de DPI-1.1.2 en
que tiene A_{11} en lugar de T_{11}; es probable que ambas
proteínas sean inhibidores de la plasmina muy potentes.
DPI-1.1.4 lleva las mutaciones I17R, M18F, K19D y
E32A y debería ser bastante potente. Puesto que
DPI-1.1.4 tiene menos mutaciones que SPI11, puede
ser menos potente, pero también es menos probable que sea
inmunógeno. DPI-1.1.5 lleva las mutaciones I17R,
M18F, y K19D. Es probable que esta proteína sea un buen inhibidor y
es menos probable que sea inmunógena. DPI-1.1.6
lleva sólo las mutaciones I17R y M18F pero debería inhibir la
plasmina.
La proteína DPI-1.2.1 se basa en
LACI-K2 humano y se muestra en la Tabla 4. Es
probable que las mutaciones P11T, I13P, Y17R, I18F, T19D, R32E,
K34I, y L39E confieran una alta afinidad por la plasmina. Algunas de
estas sustituciones pueden no ser necesarias; en particular P11T y
T19D pueden no ser necesarias. Entre otras mutaciones que pueden
mejorar la afinidad por la plasmina se incluyen E9A, D10E, G16A,
Y21W, Y21F, R32T, K34V, y L39G.
La proteína DPI-1.3.1 (Tabla 4)
se basa en LACI-K3 humano. Se pretende que las
mutaciones R11T, L13P, N17R, E18F, N19D, R31E, P32E, K34I, y S36G
confieran una alta afinidad por la plasmina. Algunas de esas
sustituciones pueden no ser necesarias; en particular N19D y P32E
pueden no ser necesarias. Entre otros cambios que pueden mejorar
K_{D} se incluyen D10E, N17K, F21 W y G39E.
La proteína DPI-2.1 (Tabla 4) se
basa en el KuDom \alpha3 de colágeno humano. Es probable que las
mutaciones E11T, T13P, D16A, F17R, I18F, L19D, A31E, R32E,y W34I
confieran una gran afinidad por la plasmina. Algunas de estas
sustituciones pueden no ser necesarias; en particular, L19D y A31E
pueden no ser necesarias. Entre otras mutaciones que pueden mejorar
la afinidad por la plasmina se incluyen K9A, D10E, D16G, K20R, R32T,
W34V, y G39E.
DPI-3.1.1 (Tabla 4) deriva del
dominio 1 de TFPI-2 humano. Es probable que
los intercambios Y11T, L17R, L18F, L19D, y R31E confieran una gran
afinidad por la plasmina. La mutación L19D puede no ser necesaria.
Entre otras mutaciones que pueden favorecer la unión a la plasmina,
se incluyen Y21W, Y21F, Q32E, L34I, L34V, y E39G.
DPI-3.2.1 (Tabla 4) deriva del
dominio 2 de TFPI-2 humano. Este dominio
parental contiene inserciones después del resto 9 (un resto) y 42
(dos restos). Es probable que las mutaciones (V_{9}SVDDQC_{14}
sustituido por V_{9}ETGPC_{14}), E15R, S17K, T18F, K32T, F34V, y
(H_{39}RNRIENR_{44} sustituido por E_{39}GNRNR_{44})
confieran afinidad por la plasmina. Debido a la necesidad de cambiar
el número de aminoácidos, DPI-3.2.1 tiene una mayor
posibilidad de inmunogenicidad mayor que otros KuDoms humanos
modificados.
DPI-3.3.1 (Tabla 4) deriva del
dominio 3 de TFPI-2 humano. Es probable que
las sustituciones E11T, L13P, S15R, N17R, V18F, T34I, y T36G
confieran alta afinidad por la plasmina. Las mutaciones E11T, L13P y
T34I pueden no ser necesarias. Entre otras mutaciones que pueden
favorecer la unión a la plasmina, se incluyen D10E, T19D, Y21W, y
G39E.
DPI-4.1.1 (Tabla 4) es de
ITI-K1 humano, por las mutaciones S10E, M15R,
M17K, T18F, Q34V, y M39G. Las mutaciones M39G y Q34V pueden no ser
necesarias. Entre otras mutaciones que deberían favorecer la unión a
la plasmina se incluyen: A11T, G16A, M17R, S19D, Y21W, y Y21F.
DPI-4.2.1 (Tabla 4) es de
ITI-K2 humano por las mutaciones V10D, R11T, F17R,
I18F, y P34V. La mutación P34V puede no ser necesaria. Entre otras
mutaciones que pueden favorecer la unión a la plasmina se incluyen:
V10E, Q19D, L20R, W21F, P34I, y Q39E. DPI-4.2.2 es
una proteína especialmente preferida puesto que sólo tiene tres
mutaciones: R11T, F17R y I18F. DPI-4.2.3 es una
proteína especialmente preferida puesto que sólo tiene cuatro
mutaciones R11T, F17R, I18F y L20R. DPI-4.2.4 es una
proteína especialmente preferida puesto que sólo tiene cinco
mutaciones: R11T, F17R, I18F, L20R y P34V. DPI-4.2.5
lleva las mutaciones V10E, R11T, F17R, I18F, L20R, V31E, L32T, P34V,
y Q39G, y es muy probable que inhiba la plasmina de forma muy
potente. Es muy probable que cada una de las proteínas
DPI-4.2.1, DPI-4.2.2,
DPI-4.2.3, DPI-4.2.4, y
DPI-4.2.5 sea un inhibidor muy potente de la
plasmina.
Antes de DENN94a, se pensó que
APP-I era un inhibidor de la plasmina muy
potente. Por lo tanto, era sorprendente seleccionar proteínas de una
biblioteca que se diseñó para permitir los restos de
APP-I en las posiciones 10-21, que
difieren mucho de APP-I. Sin embargo,
APP-I se puede convertir en un potente inhibidor de
plasmina. DPI-5.1 se obtiene de
APPI-I humano (también conocido como
Proteasa-Nexina-II) por las
mutaciones M17R y I18F, y es probable que sea un inhibidor de
plasmina mucho mejor que el propio APP-I.
DPI-5.2 lleva las mutaciones adicionales S19D, A31E
y F34I, que pueden favorecer la mayor afinidad por la plasmina.
DPI-6.1 deriva del KuDom de
HKIB9 (NORR93) por las cinco sustituciones: K11T, Q15R, T16A,
M17R, y M18F. Es probable que DPI-6.1 sea un potente
inhibidor de plasmina. DPI-6.2 lleva las mutaciones
adicionales T19D y A34V que favorecerían la unión a la plasmina.
Aunque BPTI es el mejor KuDom natural
inhibidor de plasmina conocido, se podía mejorar.
DPI-7.1 deriva de BPTI por la mutación I18F que es
probable que aumente la afinidad por la plasmina.
DPI-7.2 lleva la mutación adicional K15R que debería
aumentar la unión a la plasmina. DPI-7.3 lleva la
mutación añadida R39G. DPI-7.4 lleva las mutaciones
Y10D, K15R, I18F, I19D, Q31E, y R39G, y debería tener una afinidad
muy alta por la plasmina.
Los KuDoms son bastante pequeños; si esto pudiera
producir un problema farmacológico, tal como la eliminación
excesivamente rápida de la circulación, se pueden unir dos o más de
dichos dominios. Un conector preferido es una secuencia de uno o más
aminoácidos. Un conector preferido es uno encontrado entre los
dominios repetidos de una proteína humana, especialmente los
conectores encontrados en homólogos humanos de BPTI, uno de los
cuales tiene dos dominios (BALD85, ALBR83b) y otro de los cuales
tiene tres (WUNT88). Los conectores peptídicos tiene la ventaja de
que después se puede expresar la proteína entera por técnicas de ADN
recombinante. También se puede usar un conector no peptídico, tal
como uno de los usados normalmente para formar los conjugados
inmunógenos. Un medio alternativo para aumentar la permanencia en el
suero de un KuDom de tipo BPTI, es unirlo al polietilenglicol,
llamado PEGilación (DAV179).
Debido a que una gran parte de la superficie del
KuDom de SPI11 se ha hecho complementaria a la superficie de la
plasmina, R_{15} no es esencial para la unión específica a la
plasmina. Muchas de las enzimas de las rutas de coagulación y
fibrinolítica cortan preferiblemente después de Arg o Lys. No tener
un resto básico en la posición P1 puede dar una mayor especificidad.
La variante SPI11-R15A (mostrada en la Tabla 11) que
tiene una Ala en P1, es probable que sea un buen inhibidor de
plasmina y puede tener mayor especificidad por la plasmina respecto
a otras proteasas, que SPI11. Es probable que la afinidad de
SPI11-R15A por la plasmina sea menor que la afinidad
de SPI11 por la plasmina, pero es probable que la pérdida de
afinidad por otras enzimas que prefieren Arg/Lys sea mayor, y en
muchas aplicaciones la especificidad es más importante que la
afinidad. Entre otros mutantes que es probable que tengan buena
afinidad y una muy alta especificidad se incluyen
SPI11-R15G y
SPI11-R15N-E32A. Este planteamiento
se podría aplicar a otros inhibidores de plasmina de alta
afinidad.
Es probable que la variación de SPI11 como se
muestra en la Tabla 12 y la selección de conectores, produzca un
dominio Kunitz que tenga una afinidad por la plasmina mayor que
SPI11. Esta cuarta biblioteca permite la variegación del disulfuro
14-38. Se sintetizan los dos segmentos de ADN
mostrados y se usan con cebadores en una reacción PCR para producir
ADN que va de NsiI a BstEII. Los cebadores son
idénticos a los extremos 5' de los trozos sintéticos mostrados y
tienen una longitud de 21 el primero y 17 el segundo. Puesto que la
variabilidad es muy grande, se procuraría obtener entre 10^{8} y
10^{9} transformados (cuanto más mejor).
Las proteínas de la invención se pueden producir
por cualquier técnica convencional, incluyendo
a) síntesis no biológica por acoplamiento
secuencial de los componentes, por ejemplo aminoácidos,
b) producción por técnicas de ADN recombinante en
células hospedantes adecuadas, y
c) semisíntesis, por ejemplo, por eliminación de
secuencias no deseadas de LACI-K1 y acoplamiento de
secuencias sustitutivas sintéticas.
Las proteínas descritas en esta memoria
preferiblemente se producen de forma recombinante, en un hospedante
adecuado, tal como bacterias de los géneros Bacillus,
Escherichia, Salmonella, Erwinia, y levaduras de los géneros
Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhinosporidium, Saccharomyces,
y Schizosaccharomyces, o células de mamífero cultivadas tales
como COS-1. Los hospedantes más preferidos son
microorganismos de las especies Pichia pastoris, Bacillus
subtilis, Bacillus brevis, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia
coli y Yarrowia lipolytica. Se puede usar cualquier
promotor que sea funcional en la célula hospedante para controlar la
expresión del gen.
Preferiblemente, las proteínas son secretadas, y
más preferiblemente, se obtienen de medio condicionado. La secreción
es la vía preferida porque es más probable que las proteínas se
plieguen correctamente y se pueden producir en medio condicionado
con pocos contaminantes. No se requiere secreción.
Salvo que haya una razón específica para incluir
grupos glicol, se prefieren proteínas diseñadas para que carezcan de
sitios de glicosilación unidos a N, para reducir la posible
antigenicidad de los grupos glicol, y así, estas proteínas
equivalentes se pueden expresar en una amplia variedad de
organismos, incluyendo: 1) E. coli, 2) B. subtilis, 3)
P. pastoris, 4) S. cerevisiae, y 5) células de
mamífero.
Existen varios medios para disminuir el problema
de las células hospedantes que producen proteasas que degradan el
producto recombinante; véase, entre otros BANE90 y BANE91. En VAND92
se describe que la sobreexpresión de la peptidasa señal de B.
subtilis en E. coli conduce a mayor expresión de una
proteína de fusión heteróloga. ANBA88 describe que la adición de
PMSF (un inhibidor de serina-proteasas) al medio de
cultivo mejora el rendimiento de una proteína de fusión.
Entre otros factores que pueden afectar a la
producción de estas y otras proteínas descritas en esta memoria, se
incluyen: 1) uso de codón (se prefiere optimizar codones para el
hospedante), 2) secuencia señal, 3) secuencia de aminoácidos en los
sitios de procesamiento pretendidos, presencia y localización de
enzimas de procesamiento, eliminación, mutación o inhibición de
diferentes enzimas que pueden alterar o degradar el producto
diseñado y mutaciones que hacen al hospedante más permisivo en la
secreción (se prefieren hospedantes de secreción permisivas).
Entre los trabajos de referencia de principios
generales de la tecnología de ADN recombinante se incluyen Watson el
al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987);
Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific
American Books, Inc., New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II,
John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1985); Old, et al.,
Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic
Engineering, 2d edition, University of California Press,
Berkeley, CA (1981); Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, Wiley Interscience, NY, (1987, 1992). Estas
referencias se incorporan en su totalidad en esta memoria como
referencia así como las referencias que se citan en
ellas.
ellas.
Se puede usar cualquier método adecuado para
ensayar los compuestos de esta invención. Scatcherd (Ann. NY
Acad. Sci. (1949) 51:660-669) describió un
método clásico para medir y analizar la unión que es aplicable a la
unión de proteínas. Este método requiere la proteína relativamente
pura y la capacidad de distinguir la proteína unida de la no
unida.
Un segundo método adecuado para medir K_{D} es
medir la actividad inhibidora contra la enzima. Si la K_{D} que se
va a medir está en el intervalo de 1 nM a 1 \muM, este método
requiere sustratos cromógenos o fluorógenos y de decenas de
microgramos a miligramos de inhibidor relativamente puro. Para las
proteínas de esta invención, que tienen K_{D} en el intervalo de 5
nM a 50 pM, son suficientes de nanogramos a microgramos de
inhibidor. Cuando se usa este método, la competición entre el
inhibidor y el sustrato de la enzima puede dar una K_{i} medida
que es mayor que la verdadera K_{i}. Las mediciones presentadas
aquí no están corregidas porque la corrección sería muy pequeña, y
cualquier corrección reduciría la K_{i}. Aquí, se usa la K_{i}
medida como una medida directa de la KD.
Un tercer método para determinar la afinidad de
una proteína por un segundo material es tener la proteína presentada
en un paquete genético, tal como M13, y medir la capacidad de la
proteína para adherirse al "segundo material" inmovilizado.
Este método es muy sensible porque los paquetes genéticos se pueden
amplificar. Se obtienen valores al menos semicuantitativos para las
constantes de unión mediante el uso de un gradiente por pasos de pH.
Se usan inhibidores de afinidad conocida para la proteasa para
establecer perfiles patrón contra cualesquiera otros inhibidores
presentados en fagos que se consideren. Se puede usar cualquier otro
método adecuado para medir la unión de proteína.
Preferiblemente, las proteínas de esta invención
tienen una K_{D} para la plasmina como máximo de aproximadamente 5
nM, más preferiblemente como máximo de aproximadamente 300 pM, y más
preferiblemente 100 pM o menos. Preferiblemente, la unión es
inhibidora, de forma que K_{i} es la misma que K_{D}. La K_{i}
de SPI11 para la plasmina es aproximadamente 88 pM.
El sujeto preferido de esta invención es un
mamífero. La invención es particularmente útil en el tratamiento de
seres humanos, pero también es adecuada para aplicaciones
veterinarias.
En esta memoria, "protección" incluye
"prevención", "supresión", y "tratamiento".
"Prevención" implica la administración de fármaco antes de
la inducción de la enfermedad. "Supresión" implica la
administración de fármaco antes de la aparición clínica de la
enfermedad. "Tratamiento" implica la administración de fármaco
después de la aparición de la enfermedad.
En medicina humana y veterinaria, es posible que
no se distinga entre "prevenir" y "suprimir", puesto que
\hbox{el(los)}suceso(s) inductor(es) pueden no conocerse o ser latentes, o no se determina en el paciente hasta después de que aparece(n) el(los) suceso(s) inductor(es). Se usa el término "profilaxis" de forma distinta que "tratamiento" para abarcar "prevenir" y "suprimir". En esta invención, "protección" incluye "profilaxis". La protección no tiene que ser necesariamente útil.
Las proteínas de esta invención se pueden
administrar por cualquier medio por vía sistémica o tópica, para
proteger a un sujeto frente a una enfermedad o estado adverso. Por
ejemplo, la administración de dicha composición puede ser por
cualquier vía parenteral, por inyección de bolo o por perfusión
gradual. Alternativamente, o simultáneamente, la administración
puede ser por la vía oral. Un régimen adecuado comprende administrar
una cantidad eficaz de la proteína, administrada como una sola dosis
o como varias dosis en un periodo de horas, días, meses o años.
La dosificación adecuada de una proteína de esta
invención puede depender de la edad, sexo, salud, y peso del
receptor, tipo de tratamiento simultáneo, si hay alguno, frecuencia
del tratamiento, y el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación
más preferida se puede adaptar para el sujeto individual, como puede
entender y determinar un experto en la técnica, sin excesiva
experimentación, ajustando la dosis de formas conocidas en la
técnica.
Para métodos de ensayo preclínicos y clínicos de
fármacos, incluyendo proteínas, véase por ejemplo, Berkow et
al., eds., The Merck Manual, 15th edition, Merck and Co.,
Rahway, N.J., 1987; Goodman el al., eds., Goodman and Gilman's
The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition,
Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (1990); Avery's Drug
Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and
Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and
Wilkins, Baltimore, MD. (1987), Ebadi, Pharmacology, Little,
Brown and Co., Boston, (1985), cuyas referencias y las referencias
citadas en ellas se incorporan en esta memoria como referencia.
Además de una proteína descrita aquí, una
composición farmacéutica puede contener vehículos, excipientes o
auxiliares farmacéuticamente aceptables. Véase, por ejemplo, Berker,
véase antes, Goodman, véase antes, Avery, véase antes y Ebadi, véase
antes.
Las proteínas de la invención se pueden aplicar
in vitro a cualquier muestra adecuada que pueda contener
plasmina, para medir la plasmina presente. Para hacer esto, el
ensayo puede incluir un Sistema Productor de Señal (SPS) que
proporciona una señal detectable que depende de la cantidad de
plasmina presente. La señal se puede detectar de forma visual o
instrumental. Entre las señales posibles se incluyen la producción
de productos coloreados, fluorescentes o luminiscentes, alteración
de las características de absorción o emisión de radiación por un
compuesto o producto de ensayo, y precipitación o aglutinación de un
componente o producto.
El componente del SPS más íntimamente asociado
con el reactivo de diagnóstico se llama "marcador". Un marcador
puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo, una enzima,
una coenzima, un sustrato de enzima, un compuesto con densidad
electrónica, o una partícula aglutinable. Un isótopo radiactivo se
puede detectar usando, por ejemplo, un contador \gamma o un
contador de centelleo o por autorradiografía. Los isótopos que son
particularmente útiles son ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}S,
^{14}C, y preferiblemente, ^{125}I. También se puede marcar un
compuesto con un compuesto fluorescente. Cuando el compuesto con
marcador fluorescente se expone a la luz de la longitud de onda
adecuada, se puede detectar su presencia. Entre los compuestos
marcadores fluorescentes más habitualmente usados están el
isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina,
aloficocianina, o-ftalaldehído, y fluorescamina.
Alternativamente, se pueden unir metales emisores de fluorescencia,
tales como ^{125}Eu u otro lantánido, a la proteína de unión
usando grupos quelantes de metales tales como ácido
dietilentriaminapentaacético o ácido
etilendiamina-tetraacético. Las proteínas también se
pueden marcar de forma detectable por acoplamiento con un compuesto
quimioluminiscente, tal como luminol, isolumino, éster de acridinio
teromático, imidazol, sal de acridinio, y éster de oxalato.
Igualmente se puede usar un compuesto bioluminiscente, tal como
luciferina, luciferasa y acuorina para marcar la proteína de unión.
La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando
la presencia de luminiscencia. Se prefieren marcadores enzimáticos
tales como peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina.
Hay dos tipos básicos de ensayos: heterogéneos y
homogéneos. En los ensayos heterogéneos, la unión de la molécula de
afinidad al analito no afecta al marcador; por lo tanto, para
determinar la cantidad de analito, se debe separar el marcador unido
del marcador libre. En los ensayos homogéneos, la interacción afecta
a la actividad del marcador, y se puede medir el analito sin
separación.
En general, se puede usar una proteína de unión a
la plasmina (PBP, por sus siglas en inglés
plasmin-binding protein) para diagnóstico de la
misma forma que se usa un anticuerpo antiplasmina. Por lo tanto,
dependiendo del formato de ensayo, se puede usar para ensayar
plasmina, o para la inhibición competitiva, otras sustancias que se
unen a la plasmina.
Normalmente, la muestra será un fluido biológico,
tal como sangre, orina, linfa, semen, leche, o líquido
cefalorraquídeo, o uno de sus derivados, o un tejido biológico, por
ejemplo, una sección u homogeneizado de tejido. La muestra puede ser
cualquiera. Si la muestra es un fluido biológico o tejido, se puede
coger de un ser humano u otro mamífero, vertebrado o animal, o de
una planta. La muestra preferida es sangre, o una de sus fracciones
o derivados.
En una realización, la proteína de unión a la
plasmina (PBP) se inmoviliza, y se deja que la plasmina en la
muestra compita con una cantidad conocida de un análogo de plasmina
marcado o que se puede marcar específicamente. El "análogo de
plasmina" es una molécula que puede competir con la plasmina por
la unión a la PBP, que incluye la propia plasmina. Puede estar ya
marcada, o se puede marcar posteriormente por unión específica del
marcador a un resto que diferencie el análogo de plasmina de la
plasmina. Se separan las fases, y se cuantifica el análogo de
plasmina marcado de una fase.
En un "ensayo de tipo sándwich", se usa
tanto un agente de unión a la plasmina (PBA, por sus siglas en
inglés, plasmin-binding agent)
insolubilizado, como un PBA marcado. El analito de plasmina es
capturado por el PBA insolubilizado y es marcado por el PBA marcado,
formando un complejo terciario. Los reactivos se pueden añadir a la
muestra en cualquier orden. Los PBA pueden ser iguales o diferentes,
y de acuerdo con esta invención sólo es necesario que un PBA sea una
PBP (el otro puede ser, por ejemplo, un anticuerpo). La cantidad de
PBA marcado en el complejo terciario es directamente proporcional a
la cantidad de plasmina en la muestra.
Las dos realizaciones descritas antes son ambas
ensayos heterogéneos. Un ensayo homogéneo requiere que la unión de
la PBP a la plasmina afecte sólo al marcador. El analito de plasmina
puede actuar como su propio marcador si se usa un inhibidor de
plasmina como un reactivo de diagnóstico.
Se puede conjugar, directa o indirectamente (por
ejemplo, por un anticuerpo anti-PBP marcado),
covalente (por ejemplo, con SPDP) o no covalentemente, un marcador a
la proteína de unión a la plasmina, para producir un reactivo de
diagnóstico. Igualmente, la proteína de unión a la plasmina se puede
conjugar con un soporte en fase sólida para formar un reactivo de
diagnóstico en fase sólida ("captura"). Entre los soportes
adecuados se incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno,
polietileno, dextrano, nailon, amilasas y magnetita. El vehículo
puede ser soluble en cierta medida o insoluble para los propósitos
de esta invención. El material de soporte puede tener cualquier
estructura siempre que la molécula acoplada pueda unirse a la
plasmina.
Se puede usar un dominio Kunitz que se une muy
fuertemente a la plasmina para formar imágenes in vivo. Las
imágenes para diagnóstico de focos de enfermedad se consideró una de
las mayores oportunidades comerciales de los anticuerpos
monoclonales, pero esta oportunidad no ha avanzado. A pesar del
considerable esfuerzo, sólo se han aprobado dos agentes de formación
de imágenes basados en anticuerpos monoclonales. Los decepcionantes
resultados obtenidos con los anticuerpos monoclonales, se deben en
gran medida a:
i) la inadecuada afinidad y/o especificidad;
ii) poca penetración en los sitios objetivos;
iii) aclaramiento lento de los sitios que no son
objetivo;
iv) inmunogenicidad (la mayoría son murinos);
y
v) alto coste de producción y poca
estabilidad.
Estas limitaciones han hecho que en el campo de
la formación de imágenes de diagnóstico se empiecen a desarrollar
agentes de formación de imágenes basados en péptidos. Aunque
solucionan potencialmente los problemas de poca penetración y
aclaramiento lento, no es probable que los agentes de formación de
imágenes basados en péptidos tengan la afinidad, especificidad y
estabilidad in vivo adecuadas para se útiles en la mayoría de
las aplicaciones.
Las proteínas diseñadas son excepcionalmente
adecuadas para los requisitos de un agente de formación de imágenes.
En particular, la extraordinaria afinidad y especificidad que se
puede obtener diseñando dominios proteínicos de origen humano,
estables y pequeños, que tienen tasas de aclaramiento y mecanismos
in vivo conocidos, se combinan para proporcionar resultados
más fiables y más pronto, menos toxicidad/efectos secundarios, menor
coste de producción y almacenamiento, y mayor conveniencia de la
preparación del marcador. Realmente, se podría lograr el objetivo de
la formación de imágenes en tiempo real con los agentes de formación
de imágenes de proteínas diseñadas. Las proteínas de unión a la
plasmina, por ejemplo SPI11, pueden ser útiles para localizar sitios
de hemorragia
interna.
interna.
Se puede administrar la proteína de unión
radiomarcada al sujeto humano o animal. La administración
típicamente es por inyección, por ejemplo, intravenosa o arterial, u
otros medios de administración, en una cantidad suficiente para
permitir la posterior formación de imágenes dinámica y/o estática
usando dispositivos radiodetectores adecuados. La dosificación es la
cantidad más pequeña capaz de proporcionar una imagen eficaz para
diagnóstico, y se puede determinar por medios convencionales en la
técnica, usando agentes de formación de radioimágenes conocidos como
guías.
Típicamente, la formación de imágenes se lleva a
cabo en el cuerpo entero del sujeto, o en la parte del cuerpo u
órgano relacionado con el estado o enfermedad que se estudia. La
proteína de unión radiomarcada se ha acumulado. Después, se puede
cuantificar la cantidad de proteína de unión radiomarcada acumulada
en un momento determinado en órganos objetivo pertinentes.
Un dispositivo radiodetector particularmente
adecuado es una cámara de centelleo, tal como una cámara \gamma.
El dispositivo de detección en la cámara percibe y detecta (y
opcionalmente digitaliza) la desintegración radiactiva. La
información digitalizada se puede analizar de cualquier forma
adecuada, muchas de las cuales son conocidas en la técnica. Por
ejemplo, un análisis de tiempo-actividad puede
ilustrar la absorción por el aclaramiento de la proteína de unión
radiomarcada por los órganos objetivos con el tiempo.
Se tienen en cuenta diferentes factores para
seleccionar un radioisótopo adecuado. El isótopo se selecciona: para
permitir una resolución de buena calidad tras la formación de
imagen, que sea seguro para usar en el diagnóstico en seres humanos
y animales, y preferiblemente, que tenga una semivida corta de forma
que se disminuya la cantidad de radiación que recibe el cuerpo. El
radioisótopo usado preferiblemente debe ser farmacológicamente
inerte, y las cantidades administradas no deben tener un efecto
fisiológico sustancial. La proteína de unión se puede radiomarcar
con diferentes isótopos de yodo, por ejemplo ^{123}I, ^{125}I, o
^{131}I (véase por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.609.725). La
cantidad de marcador se debe seguir de forma adecuada.
En las aplicaciones a sujetos humanos, puede ser
conveniente usar radioisótopos distintos al ^{125}I para el
marcaje, para disminuir la exposición dosimétrica total del cuerpo,
y optimizar la detectabilidad de la molécula marcada. Considerando
la fácil disponibilidad clínica para usar en humanos, los
radiomarcadores preferidos incluyen: ^{99m}Tc, ^{67}Ga,
^{68}Ga, ^{90}Y, ^{111}In, ^{113m}In, ^{123}I, ^{186}Re,
^{188}Re o ^{211}At. Se puede preparar una proteína
radiomarcada por diferentes métodos. Entre estos se incluyen
radiohalogenación con cloramina T o el método de la lactoperoxidasa
y posterior purificación por cromatografía líquida de alta presión,
por ejemplo, véase Gutkowska et al., en "Endocrinology and
Metabolism Clinics of America": (1987) 16 (1):183. Se pueden usar
otros métodos de radiomarcaje, tales como IODOBEADS®.
Se puede administrar una proteína radiomarcada
por cualquier medio que permita que al agente activo alcanzar el
sitio de acción del agente en un mamífero. Debido a que las
proteínas son sometidas a digestión cuando se administran por vía
oral, normalmente se usará la administración parenteral, es decir,
intravenosa, subcutánea, intramuscular, para optimizar la
absorción.
Las proteínas de unión a la plasmina de esta
invención también se pueden usar para purificar la plasmina de un
fluido, por ejemplo, la sangre. Para este propósito, la PBP
preferiblemente se inmoviliza en un soporte insoluble. Entre dichos
soportes se incluyen los mencionados como útiles para preparar
reactivos de diagnóstico en fase sólida.
Las proteínas se pueden usar como marcadores de
peso molecular como referencia en la separación o purificación de
proteínas. Puede ser necesario desnaturalizar las proteínas para que
sirvan como marcadores de peso molecular. Una segunda utilidad
general de las proteínas es el uso de proteína hidrolizada como una
fuente nutriente. Las proteínas también se pueden usar para aumentar
la viscosidad de una solución.
La proteínas de esta invención se puede usar para
cualquiera de los propósitos anteriores, así como para propósitos
terapéuticos y de diagnóstico como se discute más adelante en esta
memoria descriptiva.
La síntesis química de polipéptidos es un área
que evoluciona rápidamente en la técnica, y en las siguientes
referencias se describen métodos de síntesis de polipéptidos en fase
sólida, incorporadas en esta memoria en su totalidad como
referencia: (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc.
85:2149-2154 (1963); Merrifield, Science
232:341-347 (1986); Wade et al.,
Biopolymers 25:S21-S37 (1986); Fields,
Int. J. Polypeptide Prot. Res. 35:161 (1990); MilliGen Report
Nos. 2 and 2a, Millipore Corporation, Bedford, MA, 1987) Ausubel
et al., véase antes, y Sambrook et al., véase antes.
Tan y Kaiser (Biochemistry, 1977, 16:1531-41)
sintetizaron hace dieciocho años el BPTI y un homólogo.
Como se sabe en la técnica, dichos métodos
implican el bloqueo o protección de grupos funcionales reactivos,
tales como grupos amino, carboxilo y tio libres. Después de la
formación del enlace de polipéptido, se quitan los grupos
protectores. Por lo tanto, la adición de cada resto de aminoácido
requiere varias etapas de reacción para proteger y desproteger. Los
métodos actuales usan la síntesis en fase sólida, en la que el
aminoácido C-terminal se une covalentemente a una
partícula de resina insoluble que se puede filtrar. Los reactivos se
separan por lavado de las partículas de resina con disolventes
adecuados usando una máquina automática. Se conocen bien en la
técnica diferentes métodos, incluyendo el método del "tBoc" y
el método del "Fmoc". Véase, entre otros, Atherton et
al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 1:538-546
(1981) y Sheppard et al., Int. J. Polypeptide Prot.Res.
20:451-454 (1982).
Se clonó un dúplex de oligonucleótido sintético
que tiene extremos NsiI- y MluI compatibles, en un
vector parental (LACI-K1::III) previamente escindido
con las dos enzimas anteriores. El material ligado resultante se
transfectó por electroporación en la cepa de E. coli XLIMR
(F^{-}) y se cultivó en placa en placas con ampicilina (Ap) para
obtener colonias Ap^{R} generadoras de fagos. El esquema de
variegación para la Fase 1 se centra en la región P1, y afectó a los
restos 13, 16, 17, 18 y 19. Permite 6,6 x 10^{5} secuencias de ADN
diferentes (3,1 x 10^{5} secuencias de proteínas diferentes). La
biblioteca obtenida consistía en 1,4 x 10^{6} ufc independientes,
que es aproximadamente una representación de dos veces la biblioteca
entera. El cultivo madre de fagos generado en este cultivo en placa
dio una valoración total de 1,4 x 10^{13} ufc en aproximadamente
3,9 ml, estando representado cada clon independientemente, como
media, 1 x 10^{7} en total y 2,6 x 10^{6} veces por ml de
cultivo madre de fagos.
Para permitir la variegación de los restos 31,
32, 34 y 39 (fase II), los dúplex de oligonucleótidos sintéticos con
extremos MluI- y BstEII- compatibles, se clonaron en
R_{f} ADN previamente escindido, obtenido de uno de los
siguientes:
i) la construcción parental,
ii) la biblioteca de fase I, o
iii) fago de presentación seleccionado de la
primera fase, que se une a un objetivo dado.
El esquema de variegación para la fase II permite
4096 secuencias de ADN diferentes (1600 secuencias de proteínas
diferentes) debido a las alteraciones en los restos 31, 32, 34 y 39.
La variegación de la fase final II depende del nivel de variegación
que queda después de tres ciclos de unión y elución con un objetivo
dado en la fase I.
La posible variegación combinada de ambas fases
es igual a 2,7 x 10^{8} secuencias de ADN diferentes o 5,0 x
10^{7} secuencias de proteínas diferentes. Cuando se usa el fago
de presentación previamente seleccionado, como el origen del R_{f}
ADN para la variegación de la fase II, probablemente el nivel de
variegación final está en el intervalo de 10^{5} a 10^{6}.
El esquema para seleccionar variantes de
LACI-K1 que se unen a la plasmina implica la
incubación de la biblioteca de presentación en fagos con perlas de
plasmina (Calbiochem, San Diego, CA; catálogo nº 527802) en un
tampón (PBS que contiene BSA 1 mg/ml) antes de lavar las variantes
de fagos de presentación no unidos o débilmente retenidos con PBS
que contiene Tween 20 al 0,1%. Los fagos de presentación unidos más
fuertemente se eluyen con un tampón de elución a pH bajo,
típicamente tampón de citrato (pH 2,0) que contiene BSA 1 mg/ml, que
inmediatamente se neutraliza con tampón Tris a pH 7,5. Este
procedimiento constituye un sólo ciclo de selección.
El fago de presentación eluido neutralizado se
puede usar:
i) para inocular una cepa F^{+} de E.
coli para generar un nuevo cultivo madre de fagos de
presentación, para usar en los siguientes ciclos de selección
(llamada cribado convencional), o
i) directamente para otro ciclo inmediato de
selección con las perlas de proteasa (llamada cribado rápido).
Típicamente, se llevan a cabo tres ciclos de cada
método, o una combinación de dos, para dar lugar al fago de
presentación final seleccionado, a partir del cual se secuencia un
número representativo y se analizan las propiedades de unión como
mezclas de fagos de presentación o como clones individuales.
Para la biblioteca de LACI-K1, se
llevaron a cabo dos fases de selección, que consistía cada una en
tres ciclos de unión y elución. La selección de la fase I usó la
biblioteca de Fase I (restos variegados 13, 16, 17, 18 y 19), que
pasó por tres ciclos de unión y elución frente a la plasmina, dando
lugar a una subpoblación de clones. El R_{f} ADN obtenido de esta
subpoblación seleccionada se usó para generar la biblioteca de Fase
II (adición de los restos variegados 31, 32, 34 y 39). Se obtuvieron
aproximadamente 5,6 x 10^{7} transformados independientes. Las
bibliotecas de Fase II experimentaron tres ciclos adicionales de
unión y elución con la misma proteasa objetivo dando lugar a los
seleccionados finales.
Después de las dos fases de selección frente a
perlas de agarosa-plasmina, se secuenció un número
representativo (16) de fagos de presentación de la selección final.
La Tabla 2 muestra las secuencias de los dominios
LACI-K1 seleccionados con los aminoácidos
seleccionados en las posiciones seleccionadas en mayúsculas.
Obsérvese la selección absoluta de los restos P_{13}, A_{16},
R_{17}, F_{18} y E_{19}. Hay una selección muy fuerte para E
en 31 y Q en 32. No hay consenso en 34; los aminoácidos observados
son {T_{3}, Y_{2}, H_{2}, D, R, A, V_{2}, I_{3}, y L}. Los
aminoácidos que tiene grupos laterales que se ramifican en el
C_{\beta} (T, I y V) está más representados y se prefieren. En la
posición 39, no hay un alto consenso (G_{6}, D_{3}, Q_{2},
A_{2}, R, F, E), pero parece que se prefieren G, D, Q y A (en este
orden).
Un cribado por separado de la biblioteca de
LACI-K1 frente a la plasmina dio un consenso muy
similar de 16 fagos de presentación seleccionados secuenciados.
Estas secuencias se muestran en la Tabla 3 (restos seleccionados en
mayúsculas). Estas secuencias se desvían de las de la Tabla 2 en que
aquí en la posición 19 predomina E. Hay un consenso en 34 (T_{5},
V_{3}, S_{3}, I_{2}, L, A, F) de T, V o S. Combinando los dos
grupos, hay una preferencia por (en orden de preferencia) T, V, I,
S, A, H, Y y L, estando permitidos F, D y R.
Se volvieron a clonar los tres aislados QS4,
ARFK#1, y ARFK#2 en un vector de expresión de levadura. El vector de
expresión de levadura se obtiene de pMFalfa8 (KURJ82 y MIYA85). Los
genes variantes de LACI se fusionaron con parte del gen
mat\alpha1, generando un gen híbrido que consistía en el promotor
de mat\alpha1-péptido señal y la secuencia líder
fusionada con la variante de LACI. El sitio de clonación se muestra
en la Tabla 24. Obsérvese que la proteína variante de
LACI-K1 correctamente procesada debería ser como se
detalla en la Tabla 2 y Tabla 3 con la adición de los restos
glu-ala-ala-glu en
la Met N-terminal (resto 1 en la Tabla 2 y Tabla 3).
La expresión en S. cerevisiae dio un rendimiento de
aproximadamente 500 \mug de inhibidor de proteasa por litro de
medio. LACI (dominio Kunitz 1), BPTI y variantes de LACI: QS4,
ARFK#1, y ARFK#2 expresados en levadura se purificaron por
cromatografía de afinidad usando perlas de
tripsina-agarosa.
El hospedante de producción más preferido es
Pichia pastoris que utiliza el sistema de la
alcohol-oxidasa. Se han producido una serie de
proteínas en la levadura Pichia pastoris. Por ejemplo,
Vedvick et al. (VEDV91) y Wagner et al. (WAGN92)
produjeron aprotinina a partir del promotor de la
alcohol-oxidasa con inducción con metanol, como una
proteína secretada en el medio de cultivo \approx 1 mg/ml. Gregg
et al. (GREG93) han revisado la producción de una serie de
proteínas en P. pastoris. La Tabla 1 de GREG93 muestra
proteínas que han sido producidas en P. pastoris y los
rendimientos.
La inhibición de la hidrólisis de
succinil-Ala-Phe-Lys-(F_{3}Ac)AMC
(una metil-cumarina) (Sigma Chemical, St. Louis,
Mo.) por la plasmina 2,5 x 10^{-8} M con diferentes cantidades del
inhibidor, se ajustó a la forma patrón para un sustrato que se une
fuertemente, por mínimos cuadrados. El análisis cinético preliminar
de las dos variantes ARFK demostró una actividad inhibidora muy
similar a la de la variante QS4. Estas mediciones se llevaron a cabo
con cantidades fisiológicas de sal (150 mM) de modo que las
afinidades son importantes para la acción de las proteínas en la
sangre.
La Tabla 23 muestra que QS4 es un inhibidor de la
plasmina humana muy específico. Los fagos que presentan el derivado
de LACI-K1 QS4 se unen a las perlas de plasmina al
menos 50 veces más de lo que se unen otros objetivos de
proteasas.
Se hizo una nueva biblioteca de dominios
LACI-K1, presentada en M13 gIIIp, y que contenía la
diversidad mostrada en la Tabla 5 y se cribó la unión a la plasmina.
La Tabla 6 muestra las secuencias seleccionadas y el consenso. Se
caracterizó la unión de las proteínas seleccionadas comparando la
unión del fago clonalmente puro a BPTI presentado en fago. Los
aislados 11, 15, 08, 23 y 22 eran superiores al fago de BPTI. Se
produjo SPI11 (Inhibidor de plasmina seleccionado #11) soluble, y se
ensayó su actividad inhibidora, obteniéndose una K_{i} de 88 pM,
que es al menos dos veces mejor que BPTI. Por lo tanto, se cree que
los seleccionados SPI15, SPI08 y SPI22 son muy superiores a BPTI y
que es probable que SPI23 sea aproximadamente tan potente como BPTI.
Todas las proteínas listadas están más cerca de una secuencia de
aminoácidos de proteína humana de lo que lo está BPTI, y por lo
tanto tienen menos posibilidad de inmunogenicidad.
Tabla 8
(continuación)
En la Tabla "-" significa que la proteína
tiene el tipo de consenso (Con1). Con 1 contiene el tipo más común
en cada posición; los aminoácidos mostrados en Con1 no se variaron.
Cuatro posiciones (10, 31, 34 y 39) mostraron significativa
tolerancia por un segundo tipo, conduciendo a 15 secuencias de
consenso secundarias: Con2-Con16. La columna "#
Difs" muestra el número de diferencias con CON1 en "C1", las
diferencias con el más cercano de Con1-Con16 en
"C", y las diferencias con LACI-K1 en
"K1". SPI11 se seleccionó de una biblioteca en la que los
restos 31-39 se bloquearon en el tipo salvaje.
El cambio de A, F, H, I, L, M, P, V, W o Y a C,
es semiconservativo, si la nueva cisteína permanece como un tiol
libre.
El cambio de M a E, R, K es semiconservativo si
el extremo iónico del nuevo grupo lateral puede alcanzar la
superficie de la proteína, mientras que los grupos metileno hacen
contactos hidrófobos.
El cambio de P a uno de K, R, E, o D es
semiconservativo si el grupo lateral está en o cerca de la
superficie de la proteína.
Abs-S Selección absoluta | |
VS-S Selección muy fuerte | |
S-S selección fuerte | |
G-S Buena selección |
La primera (superior) cadena de ADN tiene el SEQ
ID NO. 120.
La segunda (inferior) cadena de ADN tiene el SEQ
ID NO. 121.
La secuencia de aminoácidos tiene el SEQ ID NO.
122.
No es necesario sintetizar la cadena de los
codones 31-42 (mostrada tachada), pero se produce
por la PCR a partir de las cadenas mostradas.
Hay 1,37 x 10^{11} secuencias de ADN que
codifican 4,66 x 10^{10} secuencias de aminoácidos.
- En la Tabla 15, se prefieren los restos en negrilla.
El fago con LACI-K1 para cada
objetivo se consideró como unión unitaria, y los otros fagos de
presentación se muestran como de unión relativa. BPTI::fago III no
es liberado fácilmente de la tripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
No se espera que la secuencia previa a
Mat\alpha se escinda antes de
GLU_{a}-ALA_{b}-
\newpage
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Claims (8)
1. Un polipéptido aislado que comprende una
estructura de Dominio Kunitz que comprende la secuencia de
aminoácidos:
en la
que
cualquiera de Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56,
Xaa57 o Xaa58 puede estar ausente;
Xaa10 se selecciona de Asp y Glu;
Xaa11 se selecciona de Thr, Ala y Ser;
Xaa13 es Pro;
Xaa 15 es Arg;
Xaa 16 es Ala;
Xaa17 es Arg;
Xaa18 es Phe;
Xaa19 se selecciona de Glu y Asp;
Xaa21 se selecciona de Phe y Trp;
Xaa22 se selecciona de Tyr y Phe;
Xaa23 se selecciona de Tyr y Phe;
Xaa31 se selecciona de Asp y Glu;
Xaa32 se selecciona de Thr, Ala y Glu;
Xaa34 se selecciona de Val, Ile y Thr;
Xaa35 es Tyr;
Xaa36 es Gly;
Xaa39 se selecciona de Glu, Gly y Asp;
Xaa40 se selecciona de Gly y Ala;
Xaa43 se selecciona de Asn y Gly; y
Xaa45 se selecciona de Phe y Tyr,
en el que dicho polipéptido inhibe la
plasmina.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el
que dicho polipéptido inhibe la plasmina humana con una K_{i} de
20 nanomolar o menos, preferiblemente 5 nanomolar o menos, y más
preferiblemente 300 picomolar o menos, medido por inhibición
competitiva de la enzima para la unión entre el inhibidor y el
sustrato de la enzima.
3. El polipéptido de la reivindicación 2, en el
que dicho polipéptido inhibe la plasmina humana con una K_{i} de
100 picomolar o menos, medido por inhibición competitiva de la
enzima para la unión entre el inhibidor y el sustrato de la
enzima.
4. El polipéptido de la reivindicación 1,
seleccionado del grupo que consiste en SPI11 (SEQ ID NO:40), SPI15
(SEQ ID NO:41), DPI-1.1.1 (SEQ ID NO:61),
DPI-1.1.2 (SEQ ID NO:62) y DPI-1.1.3
(SEQ ID NO:63).
5. Uso de un polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para
preparar un medicamento para tratar la fibrinolisis o
fibrinogenolisis inadecuada, hemorragia excesiva asociada con
trombolíticos, hemorragia postoperatoria o angiogénesis
inadecuada.
6. Un método para ensayar la presencia de
plasmina en una muestra, que comprende añadir un polipéptido de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4
en forma marcada o insolubilizada a la muestra, y determinar si se
ha formado un complejo de dicho polipéptido y plasmina en la
muestra.
7. Un método para purificar plasmina de una
mezcla, que comprende poner en contacto la mezcla con el polipéptido
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-4 en forma insolubilizada, y dejar que la plasmina
se una.
8. Una composición farmacéutica que contiene el
polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones
1-4, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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