JP2007504169A - 修飾されたプロテアーゼインヒビター - Google Patents
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Abstract
ＤＸ−８９０は、エラスターゼを阻害する。ＤＸ−８９０は、単一のポリエチレングリコール部分に結合され得る。ポリエチレングリコールは、少なくとも１８ｋＤａの分子量であり、そしてポリペプチドのＮ末端に対する単一の共有結合によってこのポリペプチドに結合される。１局面では、本発明は、ａ）エラスターゼに特異的に結合して阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと、ｂ）このポリペプチドと物理的に会合して、この化合物の分子量を増大する非タンパク質部分とを含む、化合物を特徴とする。
Description
（関連出願の引用）
本出願は、米国特許出願第６０／４９８，８４５号（２００３年８月２９日出願）への優先権を主張する。
本出願は、米国特許出願第６０／４９８，８４５号（２００３年８月２９日出願）への優先権を主張する。
（背景）
本発明は、修飾されたプロテアーゼインヒビターに関する。
本発明は、修飾されたプロテアーゼインヒビターに関する。
（要旨）
１局面では、本発明は、化合物であって、ａ）エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ））に特異的に結合して阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと、ｂ）このポリペプチドと物理的に会合して、この化合物の分子量を増大する非タンパク質部分とを含み、この非タンパク質部分が少なくとも７ｋＤａの分子量を有し、この化合物が１８ｋＤａより大きい分子量を有する化合物を特徴とする。
１局面では、本発明は、化合物であって、ａ）エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ））に特異的に結合して阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと、ｂ）このポリペプチドと物理的に会合して、この化合物の分子量を増大する非タンパク質部分とを含み、この非タンパク質部分が少なくとも７ｋＤａの分子量を有し、この化合物が１８ｋＤａより大きい分子量を有する化合物を特徴とする。
１実施形態では、この非タンパク質部分は、親水性のポリマー、例えば、実質的に相同なポリマーを含む。このポリマーは、分枝していても分枝していなくてもよい。例えば、このポリマーは、少なくとも１０、１８、２０、２８または３０ｋＤａの分子量を有する。１実施形態では、このポリマーは、ポリアルキレンオキシドである。例えば、ポリマーのコポリマーブロックの少なくとも２０、３０、５０、７０、８０、９０または９５％がエチレングリコールである。１実施形態では、このポリマーは、ポリエチレングリコールである。
１実施形態では、この化合物は以下の構造：
Ｐ−Ｘ０−［（ＣＲ’Ｒ’’）ｎ−Ｘ１］ａ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ２−Ｒｔ
を有し、ここで、Ｐはポリペプチドであり、
Ｒ’およびＲ’’の各々が独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；
Ｘ０がＯ、Ｎ−Ｒ１、Ｓであるかまたは存在せず、Ｒ１がＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールであり、
Ｘ１がＯ、Ｎ−Ｒ２、Ｓであり、Ｒ２がＨ、アルキルまたはアリールであり、
Ｘ２がＯ、Ｎ−Ｒ３、Ｓであるかまたは存在せず、Ｒ３がＨ、アルキルまたはアリールであり、
各々のｎが１〜５、例えば２であり、
ａが少なくとも４であり、
ｍが０〜５であり、そして
ＲｔがＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールである。
Ｐ−Ｘ０−［（ＣＲ’Ｒ’’）ｎ−Ｘ１］ａ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ２−Ｒｔ
を有し、ここで、Ｐはポリペプチドであり、
Ｒ’およびＲ’’の各々が独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；
Ｘ０がＯ、Ｎ−Ｒ１、Ｓであるかまたは存在せず、Ｒ１がＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールであり、
Ｘ１がＯ、Ｎ−Ｒ２、Ｓであり、Ｒ２がＨ、アルキルまたはアリールであり、
Ｘ２がＯ、Ｎ−Ｒ３、Ｓであるかまたは存在せず、Ｒ３がＨ、アルキルまたはアリールであり、
各々のｎが１〜５、例えば２であり、
ａが少なくとも４であり、
ｍが０〜５であり、そして
ＲｔがＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールである。
Ｒ’およびＲ’’はＨであってもよい。１実施形態では、Ｒ’またはＲ’’は独立してＨまたはＣ１−Ｃ４、Ｃ１−Ｃ６またはＣ１−Ｃ１０アルキルである。
１実施形態では、この化合物は以下の構造：
Ｐ−Ｘ０−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ａ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ２−Ｒｔ
を有し、ここで、Ｐはポリペプチドであり、
ａは少なくとも４であり、
ｍは０〜５であり、
Ｘ２がＯ、Ｎ−Ｒ１、Ｓであるかまたは存在せず、Ｒ１がＨ、アルキルまたはアリールであり、
Ｘ０がＯ、Ｎ−Ｒ２、Ｓであるかまたは存在せず、Ｒ２がＨ、アルキルまたはアリールであり、そして
ＲｔがＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールである。例えば、Ｘ２はＯであり、そしてＲｔはＨである。
Ｐ−Ｘ０−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ａ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ２−Ｒｔ
を有し、ここで、Ｐはポリペプチドであり、
ａは少なくとも４であり、
ｍは０〜５であり、
Ｘ２がＯ、Ｎ−Ｒ１、Ｓであるかまたは存在せず、Ｒ１がＨ、アルキルまたはアリールであり、
Ｘ０がＯ、Ｎ−Ｒ２、Ｓであるかまたは存在せず、Ｒ２がＨ、アルキルまたはアリールであり、そして
ＲｔがＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールである。例えば、Ｘ２はＯであり、そしてＲｔはＨである。
１実施形態では、このポリペプチドは１４、８または７ｋＤａの分子量未満である。１実施形態では、この化合物は、単一のＫｕｎｉｔｚドメインのみを含む。
１実施形態では、このＫｕｎｉｔｚドメインは、ＤＸ−８９０のアミノ酸配列、またはＤＸ−８９０のアミノ酸配列から少なくとも１つ、ただし６つ、５つ、４つ、３つもしくは２つ未満のアミノ酸の相違（例えば、置換、挿入または欠失）によって異なるアミノ酸配列を含む。代表的には、このＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒトには天然に存在しない。このＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒトＫｕｎｉｔｚドメインとは１０未満、７未満または４未満のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含んでもよい。
１実施形態では、この化合物のＫｉは、エラスターゼの未修飾ポリペプチドのＫｉの０．５〜１．５、０．８〜１．２、または０．３〜３．０の倍数内である。例えば、ｈＮＥのＫｉは、１００、５０、１８、１２、１０または９ｐＭ未満であってもよい。
１実施形態では、この化合物は、ウサギまたはマウスのモデルにおいて、ポリマーを含まない実質的に同一の化合物よりも少なくとも１．５、２、４または８倍大きい循環半減期を有する。この化合物は、ウサギまたはマウスのモデルでは、非タンパク質部分を含まない実質的に同一の化合物より少なくとも１．５、２、２．５、または４倍大きい振幅を有するβ相循環半減期を有し得る。この化合物は、ウサギまたはマウスのモデルでは、非タンパク質部分を含まない実質的に同一の化合物より少なくとも２０、３０、４０または５０％小さい振幅を有するα相循環半減期を有し得る。例えば、この化合物は、少なくとも４０、５０、６０または６５％の振幅を有するβ相を有する。１実施形態では、この化合物は、ウサギまたはマウスのモデルでは、少なくとも２、３、４、５、６または７時間のβ相循環半減期を有する。１実施形態では、この化合物は、７０ｋｇのヒトにおいて、少なくとも６時間、１２時間、２４時間、２日、５日、７日または１０日間のβ相循環半減期を有する。
１実施形態では、ポリペプチドはポリマーの単一の分子に結合される。例えば、ポリペプチドのＮ末端がこのポリマーに結合される。１実施形態では、ポリエチレングリコールは、ポリペプチドへのモノメトキシ−ＰＥＧプロピオンアルデヒドまたはモノメトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸のカップリングによって結合される。この化合物は、約６．８〜８．０またはｐＨ７．２〜７．６、例えば、約ｐＨ７．４または約ｐＨ５．６〜６．５、例えば、５．８〜６．２、例えば、約ｐＨ６でのｍＰＥＧのカップリングによって形成され得る。
別の局面では、本発明は、（１）ＤＸ−８９０のアミノ酸配列、またはＤＸ−８９０のアミノ酸配列から少なくとも１つ、ただし６つ、５つ、４つ、３つもしくは２つ未満のアミノ酸の相違（例えば、置換、挿入または欠失）によって異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（２）少なくとも１５、１８、２０、２５、２７または３０ｋＤａの分子量であり、かつ単一の共有結合によってポリペプチドに結合される、ポリエチレングリコールとを含む、化合物を特徴とする。１実施形態では、このポリエチレングリコールは、Ｎ末端に結合される。
１実施形態では。アミノ酸配列は、ＤＸ−８９０のアミノ酸配列から少なくとも１アミノ酸ずつ異なる。このアミノ酸配列は、ＢＰＴＩの番号付けに従って、５、１３、１４、１６、１７、１８、１９、３０、３１、３２、３４、３８、３９、５１および５５の位置に相当する１つ以上の位置（例えば、少なくとも２、３、５、７、１０、１２、１３、１４または全て）においてＤＸ−８９０のアミノ酸配列に対して同一である。
本発明はまた、本明細書において記載される、例えば上記の化合物を含む調製物を特徴とする。例えば、この化合物は、例えば、ｐＨ６〜８の溶液中に、１ミリリットルあたり少なくとも０．１、１、２または５ｍｇのポリペプチド濃度で存在する。１実施形態では、この化合物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、注入物質（ｉｎｊｅｃｔａｔｅ）に対して少なくとも７０％の化合物を含む主要なピークを生じる。１実施形態では。この化合物の種の９５％の分子量はこの化合物の平均分子量の５、４、３、２または１ｋＤａ内である。
別の局面では、本発明は、（１）本発明における上記の化合物と、（２）薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的調製物を特徴とする。１実施形態では、この調製物中の化合物の少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または１００％が、そこに結合されたＰＥＧ分子の同一の分布を有する。１実施形態では、この調製物は、水性であり、そしてこの化合物は、１ミリリットルあたり少なくとも０．１ｍｇのポリペプチドの濃度で存在する。１実施形態では、マウスへのこの調製物の注射によって、化合物のうち５０、３０、２５、１５または１０％未満が、１２時間後にこの調製物より高い移動度を有するＳＥＣピークを生じる。
別の局面では、本発明は、本明細書に記載される化合物を含む、実質的に（例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％）単分散の調製物を特徴とする。例えば、この化合物は、１ミリリットルあたりポリペプチドの少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１．０、１．５、２．０もしくは２．５ミリグラムの濃度で、または１ミリリットルあたりポリペプチドの０．０５〜１０ミリグラムの濃度で存在する。１実施形態では、この調製物は乾燥している。例えば、調製物は、粒子を含むか、または粉末の形態である。
別の局面では、本発明は、親水性かつ実質的に相同なポリマーに結合体化されたエラスターゼ−阻害Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む化合物を含む水性調製物を特徴とする。１実施形態では、このＫｕｎｉｔｚドメインは、ＤＸ−８９０のアミノ酸配列、またはＤＸ−８９０のアミノ酸配列と少なくとも１つ、ただし６つ、５つ、４つ、３つもしくは２つ未満のアミノ酸配列の相違（例えば、置換、挿入または欠失）が異なるアミノ酸配列を含む。本発明はまた、この調製物を含む密閉容器を提供する。この容器は、光に対して不透明であってもよい。この容器は、この容器の外部領域に印字情報を備え得る。
別の局面では、本発明は、エラスターゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドを提供する工程と；共有結合を形成し得る単一の反応性基を含む親水性ポリマー（例えば、ポリアルキレンオキシド）と、このポリペプチドとを、このポリペプチドとの結合を形成するのに適切な条件下で接触させて、それによって修飾されたエラスターゼインヒビターを提供する工程とを包含する方法を特徴とする。
１実施形態では、この親水性ポリマーは、単一活性である。例えば、親水性ポリマーは、アルコキシで終わる。１実施形態では、このポリマーは、スクシンイミジル基を含む。
１実施形態では、このポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、モノメトキシ−ポリエチレングリコールである。例えば、このポリマーは、ｍＰＥＧプロピオンアルデヒドまたはｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸である。
１実施形態では、この条件はｐＨ５．５〜６．５であるか、またはｐＨ６．５〜８．０である。１実施形態では、この親水性ポリマーはポリペプチドのＮ末端に共有結合される。
この方法はさらに、単結合したポリマーを有するポリペプチドを、他の産物または反応物から分離する工程を包含し得る。この方法はさらに、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、接触する産物をクロマトグラフィーで分離する工程を包含し得る。
別の局面では、本発明は、ＤＸ−８９０の結合体を調製するための方法を特徴とし、この方法は、ＤＸ−８９０と、ＤＸ−８９０上に存在するアミノ基にカップリングするために適切な活性化ＰＥＧ試薬とを、このＤＸ−８９０の１つ以上のアミノ部位をＰＥＧ化して本明細書において上記される結合体を生成するのに有効な条件下で反応させる工程を包含する。１実施形態では、この活性化されたＰＥＧ試薬は、親電気的に活性なＰＥＧである。１実施形態では、この活性化されたＰＥＧ試薬は、メトキシ−ＰＥＧプロピオン酸の反応性エステル、メトキシ−ＰＥＧブタン酸の反応性エステル、メトキシ−ＰＥＧαメチル置換ブタノエートの活性化エステル、メトキシ−ＰＥＧベンザミドカルボナートの活性化エステル、およびメトキシＰＥＧの活性化エステルからなる群より選択される。例えば、反応性工程は、水性緩衝液中で、例えば約５．５〜約７．６におよぶｐＨで行われる。この方法は、例えば、カラムクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィーを用いて、この反応工程において形成された結合体を精製する工程をさらに包含し得る。例えば、イオン交換クロマトグラフィーは、約６．０未満のｐＨで水性溶出液を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーである。この精製工程は、全てのＤＸ−８９０分子がそこに共有結合された同数のＰＥＧ部分を有する、精製されたＰＥＧ化ＤＸ−８９０結合体混合物を得るのに有効であり得る。
本発明はまた、本明細書に記載の方法、例えば上記の方法によって調製された修飾エラスターゼインヒビターを特徴とする。
別の局面では、本発明は、肺障害を処置または予防する方法を特徴とする。本発明は、本明細書に記載された化合物を被験体に対して、例えばその障害の少なくとも１つの症状を寛解するのに有効な量で投与する工程を包含する。例えば、この化合物は、ａ）エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ））に特異的に結合して阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと、ｂ）このポリペプチドと物理的に会合してこの化合物の分子量を増大する非タンパク質部分と、を包含する。例えば、この化合物は、（１）ＤＸ−８９０のアミノ酸配列、またはＤＸ−８９０のアミノ酸配列から少なくとも１つ、ただし６つ、５つ、４つ、３つもしくは２つ未満のアミノ酸の相違（例えば、置換、挿入または欠失）によって異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（２）少なくとも１５、１８、２０、２５、２７または３０ｋＤａの分子量である、ポリエチレングリコールとを含む。
１実施形態では、この化合物は、１２時間、２４時間、３６時間または７２時間ごとに１回以下投与される。別の実施形態では、この化合物は、４日、７日、１０日、１２日または１４日ごとに１回以下投与される。この化合物は、１回投与されても複数回（例えば、規則的に）投与されてもよい。
１実施形態では、この投与工程は、肺送達を包含する。例えば、この投与工程としては、吸入器および／または噴霧器の作動が挙げられる。１実施形態では、この投与工程としては、循環系への直接または間接の組成物の送達が挙げられる。例えば、この投与工程としては、注射または静脈送達が挙げられる。
１実施形態では、この被験体は、嚢胞性線維症または嚢胞性線維症遺伝子における遺伝子欠損を有する。別の実施形態では、この被験体は、慢性閉塞性肺疾患を有する。
この症状は、肺組織の完全性または組織破壊の係数であり得る。
別の局面では、本発明は、炎症性障害を処置するかまたは予防する方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載される化合物を、例えばこの障害の少なくとも１つの症状を寛解するのに有効な量で被験体に投与する工程を包含する。例えば、この化合物は、ａ）エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ））に特異的に結合して阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと、ｂ）このポリペプチドと物理的に会合してこの化合物の分子量を増大する非タンパク質部分と、を包含する。例えば、この化合物は、（１）ＤＸ−８９０のアミノ酸配列、またはＤＸ−８９０のアミノ酸配列から少なくとも１つ、ただし６つ、５つ、４つ、３つもしくは２つ未満のアミノ酸の相違（例えば、置換、挿入または欠失）によって異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（２）少なくとも１５、１８、２０、２５、２７または３０ｋＤａの分子量である、ポリエチレングリコールとを含む。
１実施形態では、この障害は、炎症性腸障害、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎である。１実施形態では、この化合物は坐剤によって送達される。
１実施形態では、この化合物は、１２時間、２４時間、３６時間または７２時間ごとに１回以下投与される。別の実施形態では、この化合物は、４日、７日、１０日、１２日または１４日ごとに１回以下投与される。この化合物は、１回投与されても複数回（例えば、規則的に）投与されてもよい。
別の局面では、本発明は、不適切なエラスターゼ活性または好中球活性によって少なくとも部分的には特徴付けられる障害を処置または予防する方法を特徴とする。この方法は、被験体に対して、本明細書に記載の化合物を、例えば、この障害の少なくとも１つの症状を寛解するか、またはエラスターゼもしくは好中球の活性を変化させるために、例えば、エラスターゼ媒介性タンパク質分解を軽減するために有効な量で投与する工程を包含する。例えば、この障害とは、関節リウマチである。
１実施形態では、この化合物は、１２時間、２４時間、３６時間または７２時間ごとに１回以下投与される。別の実施形態では、この化合物は、４日、７日、１０日、１２日または１４日ごとに１回以下投与される。この化合物は、１回投与されても複数回（例えば、規則的に）投与されてもよい。
本明細書に提供される多くの実施例は、Ｋｕｎｉｔｚドメインおよび特定のプロテアーゼ標的−エラスターゼに関する方法および組成物を記載する。しかし、これらの方法および組成物は、他の標的、例えば、他のプロテアーゼまたは他のタンパク質に関する方法および組成物に相当する工程を提供するように改変されてもよい。同様に、それらの方法および組成物は、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含まないか、またはＫｕｎｉｔｚドメインおよび他のタイプのドメインを含むポリペプチドに関する方法および組成物に相当する工程に改変されてもよい。
本明細書において用いる場合、「結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは、みかけの結合定数すなわちＫａをいう。このＫａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。リガンドは、例えば、特定の標的分子について少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２Ｍ−１の結合親和性を有する。第二の標的に対して、第一の標的に対するリガンドの結合親和性が高いほど、第二標的の結合についてのＫａ（または数値Ｋｄ）よりも第一の標的の結合について高いＫａ（または小さい数値Ｋｄ）によって示され得る。このような場合に、リガンドは、第二の標的に対して、第一の標的について特異性を有する。ｈＮＥに対する結合のためのＫａ測定は代表的には、以下の条件：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のもとで、３０℃で１００ｐＭのｈＮＥを用いて行われる。
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴または分光光度法（例えば、蛍光アッセイを用いる）を含む種々の方法によって決定され得る。これらの技術を用いて、結合または遊離のリガンドの濃度をリガンド（または標的）濃度の関数として測定し得る。結合されたリガンドの濃度（［Ｂｏｕｎｄ］）は、遊離のリガンドの濃度（［Ｆｒｅｅ］）および標的上のリガンドの結合部位の濃度に関し、ここで（Ｎ）は、以下の式：
［Ｂｏｕｎｄ］＝Ｎ・［Ｆｒｅｅ］／（（１／Ｋａ）＋［Ｆｒｅｅ］）
による標的分子あたりの結合部位の数である。
［Ｂｏｕｎｄ］＝Ｎ・［Ｆｒｅｅ］／（（１／Ｋａ）＋［Ｆｒｅｅ］）
による標的分子あたりの結合部位の数である。
しかし、Ｋａの正確な決定を行うことは必ずしも常に必要ではない。なぜなら、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析のような方法を用いて決定された、親和性の定量的な測定を得ることが時には十分であり、これはＫａに対して比例しており、従って、高い親和性、例えば、２倍以上であるか否かを決定するような比較のために用いられ得るためである。
「単離された組成物（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、単離された組成物を得ることができる天然のサンプルの少なくとも１つの成分のうち少なくとも９０％を除かれている組成物をいう。人工的または天然に生成された組成物は、目的の種または種の集団が分子量ベースで少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９５、９８または９９％純粋である場合に、「少なくともある程度の純度の組成物」であり得る。
「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」とは、リガンド、例えば、ポリペプチドリガンド、例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、低分子ペプチドまたは抗体によって結合される標的化合物上の部位をいう。標的化合物がタンパク質である場合、例えば、エピトープとは、リガンドによって結合されるアミノ酸をいってもよい。このようなアミノ酸は、内在するポリペプチド骨格に関して連続的であっても非連続的であってもよい。重複するエピトープは、少なくとも１つの共通のアミノ酸残基を含む。
本明細書において用いる場合、「実質的に同一（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」（または「実質的に相同な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ」）という用語は、第一および第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列が同様の活性を有するように、第二のアミノ酸またはヌクレオチドの配列に対して、十分な数の同一または等価な（例えば、同様の側鎖を有する、例えば、保存されたアミノ酸置換を有する）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第一のアミノ酸またはヌクレオチド配列をいうものとして本明細書において用いられる。Ｋｕｎｉｔｚドメインの場合は、この第二のドメインは同じ特異性を有し、そして第一のドメインの親和性の少なくとも５０％を有する。十分な程度の同一性とは、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であってもよい。
本明細書に開示される配列に対して類似または相同な（例えば、少なくとも約８５％の配列同一性）配列も、本出願の一部である。ある実施形態では、この配列同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であってもよい。あるいは、相補鎖に対して、選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で核酸セグメントがハイブリダイズする場合に、実質的な同一性が存在する。核酸は、細胞全体に、細胞溶解液に存在してもよく、または部分的に精製されるかもしくは実質的に精製された形態で存在してもよい。
２つの配列の間の「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（本明細書において互換可能に用いられる用語）の計算は以下のとおり行われる。配列は、最適比較目的のために整列される（例えば、ギャップは、最適アラインメントのために第一および第二のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に導入されてもよく、そして相同でない配列は比較目的については無視されてもよい）。好ましい実施形態では、比較目的のために整列される参照配列の長さは、この参照配列の長さの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列における位置が、第二の配列における相当する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、この分子は、その位置で同一である（本明細書において用いる場合、アミノ酸または核酸の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、アミノ酸または核酸の「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」と等価である。２つの配列の間の同一性パーセントは、この配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、これはその２つの配列の最適アラインメントについて導入される必要があるギャップの数および各々のギャップの長さを考慮する。
配列の比較、および２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３）アルゴリズムを用いて決定されるが、このアルゴリズムは、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５もしくは６の長さウェイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム中に組み込まれている。別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよびギャップウェイト４０、５０、６０、７０もしくは８０、および長さウェイト１、２、３、４、５もしくは６を用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて、決定される。特に好ましいセットのパラメーター（ある分子が本発明の配列同一性または相同性の限界内であるか否かを決定するためにどんなパラメーターが適用されるべきかについて実施者が不明確である場合に用いられるべきもの）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスであり、これは、１２というギャップペナルティー、４というギャップ伸長ペナルティーおよび５というフレームシフトギャップペナルティーを用いる。
本明細書において用いる場合、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」と同義であり、そして目的の配列が１つ以上のアミノ酸置換の存在によって参照配列と異なることを意味する（ただし、適度なアミノ酸挿入または欠失が存在してもよい）。参照配列に対する相同性または類似性の程度を算出する現在好ましい方法は、各々の場合に、算出された配列関連性の有意性を決定するためのアルゴリズムデフォールトまたは推奨パラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤから入手可能）の使用による。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０ウェイト残留テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２というギャップ長ペナルティーおよび４というギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１〜１７）のアルゴリズムを用いて決定されてもよい。
本明細書において用いる場合、「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または極めて高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ，ｍｅｄｉｕｍ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ，ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ，ｏｒ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載する。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。水性および非水性の方法は、その引用文献に記載されており、そしていずれかが用いられ得る。本明細書において言及される特異的なハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである：１）６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で少なくとも５０℃での２回の洗浄（洗浄の温度は、低ストリンジェンシー条件について５５℃まで増大され得る）；２）６×ＳＳＣ中での約４５℃の中等度にストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での６０℃の１回以上の洗浄；３）６×ＳＳＣ中の約４５℃での高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での６５℃での１回以上の洗浄；そして好ましくは４）極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、６５℃、続いて０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃での１回以上の洗浄である。極めて高ストリンジェンシーの条件（４）が好ましい条件であり、そして他に特定されない限り用いられるべき条件である。従って、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸に対して適切なストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸は、このような核酸によってコードされるポリペプチドと同様に提供される。
本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド）は、ポリペプチド機能に対して実質的な影響を有さない変異（例えば、保存的アミノ酸置換または非必須のアミノ酸置換）を、本明細書に記載される特定のポリペプチドに対して有し得ることが理解される。特定の置換基が耐容される、すなわち結合活性のような所望の生物学的な特性に有害に影響しないか否かは、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０に記載されるように決定され得る。「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。多くのフレームワークおよびＣＤＲアミノ酸残基について、１つ以上の保存的置換を含むことが可能である。
「非必須（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）」アミノ酸残基は、生物学的活性を廃することなく、さらに好ましくは生物学的活性を実質的に変更することなく、結合因子、例えば、抗体の野性型配列とは異なり得る残基であるが、「必須（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）」アミノ酸残基は、このような変化を生じる。
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」または「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語（交換可能に用いられ得る）は、ペプチド結合によって結合される３つ以上のアミノ酸、例えば、３〜３０アミノ酸、１２〜６０アミノ酸、または３０〜３００アミノ酸または３００以上のアミノ酸長のポリマーをいう。このポリペプチドは、１つ以上の非天然のアミノ酸を含み得る。代表的には、このポリペプチドは、天然のアミノ酸のみを含む。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含んでもよい。従って、「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、ポリペプチドを包含する。タンパク質またはポリペプチドはまた、１つ以上の修飾、例えば、グリコシル化、アミド化、リン酸化などを含み得る。「低分子ペプチド（ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、３〜３０アミノ酸長、例えば、８〜２４アミノ酸長であるポリペプチドを記載するために用いられ得る。
「アルキル（ａｌｋｙｌ）」という用語は、示した数の炭素原子を含む、直鎖であってもまたは分枝鎖であってもよい炭化水素鎖をいう。例えば、Ｃ１−Ｃ１２アルキルは、この基が、その中に１〜１２（包括的）炭素原子を有し得ることを示す。
「アリール（ａｒｙｌ）」という用語は、置換し得る任意の環原子が置換基によって置換され得る、芳香族単環式、二環式または三環式の炭化水素環系をいう。アリール部分の例としては、限定はしないが、フェニル、ナフチルおよびアントラセニルが挙げられる。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の詳細な説明に記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、詳細な説明および図面から、そして特許請求の範囲から明らかである。全ての公開された特許出願、発行された特許および本明細書に引用された公開された参考文献は、その全体が参考によって本明細書に援用される。詳細には、米国特許第５，６６３，１４３号；同第５，２２３，４０９号、同第６，０１０，０８０号および同第６，３３３，４０２号は、その全体が参照によって援用されている。
（詳細な説明）
本発明は、部分的には、プロテアーゼ（例えば、エラスターゼ、例えば、好中球エラスターゼ）に結合して阻害する化合物を提供する。この化合物は、（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド、および（ｉｉ）このポリペプチド単一に対して化合物の分子量を増大する部分（例えば、ポリマー）を含む。この化合物に対する部分の付加は、この化合物のインビボの循環半減期を増大し得る。ある実施形態では、この化合物は、高い親和性および選択性で好中球エラスターゼを阻害し得る。
本発明は、部分的には、プロテアーゼ（例えば、エラスターゼ、例えば、好中球エラスターゼ）に結合して阻害する化合物を提供する。この化合物は、（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド、および（ｉｉ）このポリペプチド単一に対して化合物の分子量を増大する部分（例えば、ポリマー）を含む。この化合物に対する部分の付加は、この化合物のインビボの循環半減期を増大し得る。ある実施形態では、この化合物は、高い親和性および選択性で好中球エラスターゼを阻害し得る。
（ポリマー）
種々の部分を用いて、Ｋｕｎｉｔｚドメインまたは他のプロテアーゼインヒビターを含むポリペプチドの分子量を増大することができる。１実施形態では、この部分はポリマー、例えば、水溶性および／または実質的に非抗原性のポリマー、例えば、ホモポリマーまたは非生物学的ポリマーである。実質的に非抗原性のポリマーとしては、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドが挙げられる。この部分は、循環中、例えば、血中、血清中、リンパまたは他の組織中のＫｕｎｉｔｚドメインの安定化および／または保持を、例えば、少なくとも１．５、２、５、１０、５０、７５または１００倍まで改善し得る。
種々の部分を用いて、Ｋｕｎｉｔｚドメインまたは他のプロテアーゼインヒビターを含むポリペプチドの分子量を増大することができる。１実施形態では、この部分はポリマー、例えば、水溶性および／または実質的に非抗原性のポリマー、例えば、ホモポリマーまたは非生物学的ポリマーである。実質的に非抗原性のポリマーとしては、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドが挙げられる。この部分は、循環中、例えば、血中、血清中、リンパまたは他の組織中のＫｕｎｉｔｚドメインの安定化および／または保持を、例えば、少なくとも１．５、２、５、１０、５０、７５または１００倍まで改善し得る。
適切なポリマーは、実質的に重量で変化し得る。例えば、約２００ダルトン〜約４０ｋＤａ、例えば、１〜３５ｋＤａまたは１０〜３２ｋＤａにわたる平均分子量を有するポリマーを使用することができる。１実施形態では、この化合物に会合されるポリマーの平均分子量は、１５〜２５ｋＤａ、または１８〜２２ｋＤａまたは約２０ｋＤａである。別の実施形態では、この化合物に会合されるポリマーの平均分子量は、２０〜３５ｋＤａ、または２７〜３２ｋＤａ、または約３０ｋＤａである。最終分子量はまた、結合体の所望の有効サイズ、ポリマーの性質（例えば、直線構造または分枝構造のような構造）、および誘導体化の程度に依存し得る。
例示的なポリマーの非限定的な列挙としては、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーであって、ただしこのブロックコポリマーの水溶性が維持されている条件でのポリマーが挙げられる。このポリマーは、親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンであってもよい。さらなる有用なポリマーとしては以下が挙げられる：ポリオキシアルキレン、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ならびにポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）；ポリ乳酸；ポリグリコール酸；ポリメタクリラート；カルボマー；分枝または非分枝ポリサッカライドであって以下を含むもの、サッカライドモノマーＤ−マンノース、Ｄ−ガラクトースおよびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸、これは以下を含む：ホモポリサッカライドおよびヘテロポリサッカライド、例えば、ラクトース、セルロース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミラーゼ、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンまたは酸ムコポリサッカライドのポリサッカライドサブユニット、例えば、ヒアルロン酸；ポリソルビトールおよびポリマンニトールのような糖アルコールのポリマー；ヘパリンまたはヘパロン。ある実施形態では、このポリマーは、種々の異なるコポリマーブロックを含む。
Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドは、種々の方法でこのポリマーと物理的に会合され得る。代表的には、このポリペプチドは、ポリマーに共有結合される。例えば、このポリペプチドは、このポリマーに結合体化される。他の化合物がまた、同じポリマーに結合されてもよい。例えば、細胞毒素、標識または別の標的因子、例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインと同じ標識に結合する別のリガンド、または別の標的に結合するリガンド、例えば、関連のないリガンド。
１実施形態では、このポリマーは、ポリペプチドに対する結合体化の前に水溶性である（ただし、必ずしもその必要はない）。一般には、ポリペプチドに対する結合体化後、この生成物は水溶性であり、例えば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。さらに、このポリマーは、結合体型では高度に免疫原性であってはならず、この結合体がこのような経路で投与されることを意図する場合、静脈内注入または注射と不適合である粘性を有してもならない。
１実施形態では、このポリマーは、反応性である単一の基のみを含む。これによって、複数のタンパク質分子に対する１つのポリマーの結合体化を回避することが助けられる。一活性化、アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ’ｓ）、例えば、モノメトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ’ｓ）；Ｃ１−４アルキル末端ポリマー；およびビス−活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）は、ポリペプチドに対する結合体化のために用いられ得る。例えば、米国特許第５，９５１，９７４号を参照のこと。
その最も一般的な形態では、ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧは、ヒドロキシ基で末端化された直線または分枝したポリエーテルである。直線のＰＥＧは、以下の一般的構造を有し得る：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ＰＥＧは、エポキシド環上の水酸化物イオンの求核攻撃によって開始されるエチレンオキシドの陰イオン性環開口重合化によって合成され得る。ポリペプチド修飾に特に有用なのは、一般構造：
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有するモノメトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧである。
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ＰＥＧは、エポキシド環上の水酸化物イオンの求核攻撃によって開始されるエチレンオキシドの陰イオン性環開口重合化によって合成され得る。ポリペプチド修飾に特に有用なのは、一般構造：
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有するモノメトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧである。
さらなる説明については、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９〜４７６を参照のこと。１実施形態では、結合体のために用いられるポリマー単位は、単分散であるか、そうでなければ高度に相同性であり、例えば、分子の９５％または全てがお互いの７、５、４、３、２または１ｋＤａとともに調製物に存在する。別の実施形態では、このポリマー単位は多分散系である。
ポリマー単位間の架橋または複数のポリペプチドに対する結合体化を減少させる反応条件を選択すること、そしてゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを通じて反応生成物を精製して、実質的に相同な誘導体、例えば、単一Ｋｕｎｉｔｚドメインポリペプチドのみを含む誘導体を回収することが可能である。他の実施形態では、このポリマーは、ポリマーに対して多数のポリペプチド（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインポリペプチドの複数の単位）を結合する目的のための２つ以上の反応基を含む。ここでも、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを用いて、所望の誘導体を実質的に相同な形態で回収することができる。
１実施形態では、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドは、ＰＥＧの単一の分子に対して結合される。例えば、エラスターゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインは、ＰＥＧの単一の３０ｋＤａ分子に結合される。
共有結合を用いて、ポリマーに対してポリペプチド（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド）を結合し得る。例えば、Ｎ末端アミノ基に対する結合体化。このポリマーは、多機能性（通常は、二機能性）の架橋剤の使用なしにポリペプチドに対して直接共有結合され得る。アミノ基に対する共有結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシドに加えてブロモアセトアルデヒドのジエチルアセチル；ＰＥＧに加えてＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧ塩化物に加えて４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシンイミジルエステル、活性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロギ酸またはＰ−ニトロフェニルクロロギ酸活性化ＰＥＧ）に基づいて公知の化合物によって達成され得る。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いてＰＥＧアミンをカップリングすることによって誘導体化され得る。スルフヒドリル基は、マレイミド置換ＰＥＧ（例えば、ＷＯ９７／１０８４７を参照のこと）またはＰＥＧマレイミド（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．から市販されている）に対してカップリングすることによって誘導体化され得る。
Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドに対して結合体化され得る官能化ＰＥＧポリマーとしては、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．）から市販されているポリマーが挙げられる。このようなＰＥＧ誘導体としては、例えば、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−コハク酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧプロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸塩、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジルカーボネート、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカーボネート、ＰＥＧトレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、異種機能的（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン、およびＰＥＧホスホリドが挙げられる。これらのＰＥＧ誘導体をカップリングするための反応条件は、ポリペプチド、所望の程度のＰＥＧ化、および利用されるＰＥＧ誘導体に依存して変化し得る。ＰＥＧ誘導体の選択に関与するいくつかの因子としては、付着の所望のポイント、加水分解性の安定性および誘導体の反応性、結合の安定性、毒性および抗原性、分析の適切性などが挙げられる。
Ｋｕｎｉｔｚドメインおよびポリマーを含むポリペプチドの結合体は、クロマトグラフィー方法を用いて、例えば、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣによって未反応の出発材料から分離され得る。異種の種の結合体は、同じ方式でお互いから精製される。種々の種の分解はまた、未反応のアミノ酸のイオン特性における相違に起因し得る。例えば、ＷＯ９６／３４０１５を参照のこと。
（Ｋｕｎｉｔｚドメイン）
本明細書において用いる場合、「Ｋｕｎｉｔｚドメイン（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ）」とは、少なくとも５１のアミノ酸を有し、かつ少なくとも２つ、そして好ましくは３つのジスルフィドを含むポリペプチドドメインである。このドメインは、第一および第六のシステイン、第二および第四、ならびに第三および第五のシステインがジスルフィド結合を形成するように折り畳まれる（例えば、５８アミノ酸を有するＫｕｎｉｔｚドメインでは、以下に提供されるＢＰＴＩ配列の数に従って、システインがアミノ酸５、１４、３０、３８、５１および５５に相当する位置に存在し得、そしてジスルフィドは、５と５５、１４と３８、そして３０と５１の位置で、システイン間で形成し得る）か、または２つのジスルフィドが存在する場合、それらは、そのシステインの対応するサブセットの間で形成し得る。それぞれのシステインの間の間隔は、以下に提供されるＢＰＴＩ配列の数に従って、以下の５〜５５、１４〜３８、および３０〜５１に相当する位置の間にまたがる間隔の７、５、４、３または２アミノ酸内であり得る。このＢＰＴＩ配列は、任意の一般的Ｋｕｎｉｔｚドメインにおける特定の位置を指す参照に用いられ得る。ＢＰＴＩに対する目的のＫｕｎｉｔｚドメインの比較は、配列されたシステインの数が最大であるベストフィットアラインメントを特定することによって行うことができる。
本明細書において用いる場合、「Ｋｕｎｉｔｚドメイン（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ）」とは、少なくとも５１のアミノ酸を有し、かつ少なくとも２つ、そして好ましくは３つのジスルフィドを含むポリペプチドドメインである。このドメインは、第一および第六のシステイン、第二および第四、ならびに第三および第五のシステインがジスルフィド結合を形成するように折り畳まれる（例えば、５８アミノ酸を有するＫｕｎｉｔｚドメインでは、以下に提供されるＢＰＴＩ配列の数に従って、システインがアミノ酸５、１４、３０、３８、５１および５５に相当する位置に存在し得、そしてジスルフィドは、５と５５、１４と３８、そして３０と５１の位置で、システイン間で形成し得る）か、または２つのジスルフィドが存在する場合、それらは、そのシステインの対応するサブセットの間で形成し得る。それぞれのシステインの間の間隔は、以下に提供されるＢＰＴＩ配列の数に従って、以下の５〜５５、１４〜３８、および３０〜５１に相当する位置の間にまたがる間隔の７、５、４、３または２アミノ酸内であり得る。このＢＰＴＩ配列は、任意の一般的Ｋｕｎｉｔｚドメインにおける特定の位置を指す参照に用いられ得る。ＢＰＴＩに対する目的のＫｕｎｉｔｚドメインの比較は、配列されたシステインの数が最大であるベストフィットアラインメントを特定することによって行うことができる。
ＢＰＴＩのＫｕｎｉｔｚドメインの３Ｄ構造（高解像度）は公知である。Ｘ線構造の１つは、「６ＰＴＩ」としてＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託されている。いくつかのＢＰＴＩホモログの３Ｄ構造（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（７）：５９１〜５９８；Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１００１８〜１００２２）は公知である。少なくとも７０個のＫｕｎｉｔｚドメイン配列が公知である。公知のヒトホモログとしては、ＬＡＣＩの３つのＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｗｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１３）：６００１〜６００４；Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５１８〜２０；Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（３１）：１８８３２〜１８８３７）Ｉｎｔｅｒ−α−トリプシンインヒビター、ＡＰＰ−Ｉの２つのＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（３４）：１８１０４〜１８１０７）、コラーゲン由来のＫｕｎｉｔｚドメイン、およびＴＦＰＩ−２の３つのＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９１：３３５３〜３３５７）が挙げられる。ＬＡＣＩは、３９ｋＤａの分子量を有するヒト血清ホスホグリコプロテイン（表１におけるアミノ酸配列）であって、これは３つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む。
（表１：例示的な天然のＫｕｎｉｔｚドメイン）
種々の方法を用いて、配列データベースからＫｕｎｉｔｚドメインを特定し得る。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインの公知のアミノ酸配列、コンセンサス配列またはモチーフ（例えば、ＰｒｏＳｉｔｅ Ｍｏｔｉｆ）は、例えば、ＨＭＭｓ（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ）のＰｆａｍデータベースに対してＢＬＡＳＴを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）に対して検索され得る（例えば、Ｐｆａｍ検索についてデフォールトパラメーターを用いる；ＳＭＡＲＴデータベースに対して；またはＰｒｏＤｏｍデータベースに対して。例えば、Ｐｆａｍ Ｒｅｌｅａｓｅ ９のＰｆａｍアクセッション番号ＰＦ０００１４は、多数のＫｕｎｉｔｚドメインおよびＫｕｎｉｔｚドメイン特定のためのＨＭＭを提供する。Ｐｆａｍデータベースの説明は、Ｓｏｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２８（３）：４０５〜４２０に見出すことが可能であり、そしてＨＭＭｓの詳細な説明は、例えば、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６〜１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４３５５〜４３５８；Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１〜１５３１；およびＳｔｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：３０５〜３１４に見出すことが可能である。Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：５８５７およびＳｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：２３１に記載されるようなＨＭＭｓのＳＭＡＲＴデータベース（Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ，ＥＭＢＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＤＥ）。ＳＭＡＲＴデータベースは、ＨＭＭｅｒ２検索プログラム（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）の隠しＭａｒｋｏｖモデル（ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ）でのプロファイリングによって同定したドメインを含む。このデータベースはまた、注釈されてモニターされる。ＰｒｏＤｏｍタンパク質ドメインデータベースは、相同なドメインの自動的な編集から構成される（Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２６３〜２６７）。ＰｒｏＤｏｍの現行バージョンは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ３８およびＴＲＥＭＢＬタンパク質データベースの再帰的ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２；Ｇｏｕｚｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：３３３〜３４０）を用いて構築される。このデータベースは自動的に各々のドメインについてのコンセンサス配列を作製する。Ｐｒｏｓｉｔｅは、モチーフとしてＫｕｎｉｔｚドメインを挙げており、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質を特定する。例えば、Ｆａｌｑｕｅｔｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：２３５〜２３８（２００２）を参照のこと。
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、２つのループ領域におけるアミノ酸を主に用いて標的プロテアーゼと相互作用する。この第一のループ領域は、ＢＰＴＩのアミノ酸１５〜２０に相当するおよその残基の間である。この第二のループ領域はＢＰＴＩのアミノ酸３１〜３７に相当するおよその残基の間である。Ｋｕｎｉｔｚドメインの例示的なライブラリーは、第一および／または第二のループ領域において１つ以上のアミノ酸位置が変化する。変化に特に有用な位置としては以下が挙げられる：ＢＰＴＩの配列に対して１３、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４および３９位置。これらの位置の少なくともいくつかは、標的プロテアーゼと近位に接触すると期待される。
反対に、これらの特定の位置ではない残基、またはループ領域にない残基は、これらのアミノ酸位置よりも広い範囲のアミノ酸置換（例えば、保存的および／または非保存的置換）を許容し得る。
（エラスターゼ阻害Ｋｕｎｉｔｚドメイン）
ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）に結合して阻害する１つの例示的なポリペプチドはＤＸ−８９０（「ＥＰＩ−ｈＮＥ４」としても公知）である。ＤＸ−８９０は極めて特異的であり、かつ強力な（Ｋｉ＝４×１０−１２Ｍ）ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）のインヒビターである。ＤＸ−８９０は、以下のアミノ酸配列を含む：
ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）に結合して阻害する１つの例示的なポリペプチドはＤＸ−８９０（「ＥＰＩ−ｈＮＥ４」としても公知）である。ＤＸ−８９０は極めて特異的であり、かつ強力な（Ｋｉ＝４×１０−１２Ｍ）ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）のインヒビターである。ＤＸ−８９０は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＤＸ−８９０の構造とｈＮＥに結合する能力との間の相関も公知である。例えば、米国特許第５，６６３，１４３号を参照のこと。米国特許第５，６６３，１４３号はまた、エラスターゼを阻害する他のＫｕｎｉｔｚドメインを記載する。これらおよび関連のドメイン（例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０または９５％同一なドメイン）も用いられ得る。
（表２：ｈＮＥインヒビターに例示的なアミノ酸）
種々の方法を用いて、プロテアーゼに結合し、そして／または阻害するタンパク質を特定することができる。これらの方法を用いて、本明細書に記載される化合物の成分として用いられ得る天然に存在するＫｕｎｉｔｚドメイン、および天然に存在しないＫｕｎｉｔｚドメインを特定することができる。
例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、複数のライブラリーメンバーの各々が変化したＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質のライブラリーから同定され得る。種々のアミノ酸がドメイン中で変化し得る。米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第５，６６３，１４３号、および米国特許第６，３３３，４０２号を参照のこと。Ｋｕｎｉｔｚドメインは、例えば、ＤＮＡ変異原性、ＤＮＡシャッフリング、オリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、サブユニットとしてコドンを用いる）、および天然の遺伝子のクローニングを用いて変化され得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号および米国特許第２００３−０１２９６５９号を参照のこと。
このライブラリーは、タンパク質を産生するために用いられる発現ライブラリーであってもよい。タンパク質は、例えば、タンパク質アレイを用いて、整列されてもよい。米国特許第５，１４３，８５４号；Ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９〜９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３〜１１１；Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，ｅ３，Ｉ−ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６０〜１７６３；ＷＯ０／９８５３４、ＷＯ０１／８３８２７、ＷＯ０２／１２８９３、ＷＯ００／６３７０１、ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３。
このタンパク質はまた、複製可能な遺伝子パッケージ上で、例えば、ファージディスプレイのようなファージライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイ、または核酸−タンパク質融合ライブラリーの形態で、提示され得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５〜１３１７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：１８２１８〜３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１〜２０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２：３７１−８；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；Ｒｅｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：１２９−４９；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３−４１３７；そしてファージディスプレイおよび他の方法の例については、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８−７９８２を参照のこと。例えば、酵母細胞ディスプレイおよび他の方法の例については、ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７およびＷＯ０３／０２９４５６を参照のこと。リボソームディスプレイおよび他の方法の例については、例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２およびＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７−９２；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４０４−３０ならびにＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１（１〜２）：１１９〜３５を参照のこと。核酸−タンパク質融合の例については、例えば、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２２９７−１２３０２，ならびに米国特許第６，２０７，４４６号を参照のこと。このようなライブラリーは、ハイスループットフォーマットにおいてスクリーニングされ得る。例えば、米国特許第２００３−０１２９６５９を参照のこと。
（ディスプレイライブラリーのスクリーニング）
本節は、エラスターゼと相互作用するポリペプチドを同定するためのディスプレイライブラリーをスクリーニングする例示的な方法を記載する。これらの方法は、他の標的、例えば、他のプロテアーゼまたは他のタンパク質と相互作用する他のポリペプチドを特定するために改変され得る。この方法はまた、改変されて、他のタイプのライブラリー、例えば、発現ライブラリーまたはタンパク質アレイなどと組み合わせて用いられてもよい。
本節は、エラスターゼと相互作用するポリペプチドを同定するためのディスプレイライブラリーをスクリーニングする例示的な方法を記載する。これらの方法は、他の標的、例えば、他のプロテアーゼまたは他のタンパク質と相互作用する他のポリペプチドを特定するために改変され得る。この方法はまた、改変されて、他のタイプのライブラリー、例えば、発現ライブラリーまたはタンパク質アレイなどと組み合わせて用いられてもよい。
例示的なディスプレイライブラリーのスクリーニングでは、ファージライブラリーは、標的のエラスターゼタンパク質（例えば、活性または不活性型（例えば、変異体または化学的に不活性なタンパク質）またはそのフラグメント）と接触されて、結合させられる。スクリーニングプロセスにおいて結合剤および非結合剤の分離を促進するために、固体支持体上にエラスターゼを固定することがしばしば好都合であるが、溶液中のエラスターゼに対する結合を最初に可能にさせて、次いで支持体に対して標的化合物をカップリングさせることによって非結合剤から結合剤を分離することも可能である。例示の目的で、エラスターゼの存在においてインキュベートされる場合、エラスターゼと相互作用するポリペプチドを提示するファージは、固体支持体上に固定されたエラスターゼと複合体を形成するが、非結合ファージは、溶液中に残っており、緩衝液から洗浄され得る。次いで、結合されたファージは、多数の方法、例えば、緩衝液を比較的高い酸性または塩基性のｐＨ（例えば、ｐＨ２またはｐＨ１０）に変化させること、緩衝液のイオン強度を変化させること、変性剤を添加すること、競合物を添加すること、感染され得る宿主細胞を加えること、または他の公知の方法によってエラスターゼから遊離され得る。
例えば、エラスターゼ結合ペプチドを特定するために、エラスターゼは、マルチウェルアッセイプレート中のウェルのプラスチック表面のような、固体表面に吸着され得る。引き続き、ファージディスプレイライブラリーのアリコートを、固定されたエラスターゼおよびファージの構造を維持するのに十分な適切な条件下、例えばｐＨ６〜７で添加する。固定されたエラスターゼを結合するポリペプチドを提示するライブラリー中のファージは、エラスターゼに結合されて、ウェル中に保持される。非結合ファージは、取り除かれ得る。固定されたエラスターゼに対するファージライブラリーの結合の間、ブロッキング剤または競合リガンドを含むことも可能である。
次いで、固定されたエラスターゼに対して結合されたファージは比較的強い酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ２）またはアルカリｐＨ（例えば、ｐＨ８〜９）を有する緩衝液で洗浄することによって溶出され得る。次いで、エラスターゼから溶出される回収されたファージの溶液を中和して、所望の場合、エラスターゼ結合ペプチドを提示するファージの濃縮された混合ライブラリー集団としてプールしてもよい。あるいは、各々のライブラリーから溶出したファージは、エラスターゼ結合剤のライブラリー特異的な濃縮された集団として別々に維持され得る。次いで、エラスターゼ結合ペプチドを提示するファージの濃縮集団は、さらに数回のスクリーニングのため、および／またはファージ上で提示されたペプチドの分析のため、および／または提示された結合ペプチドをコードするＤＮＡを配列決定するための標準的な方法によって成長され得る。
多くの可能な別のスクリーニングプロトコールの１つは、ビオチン化され、そして例えば、粒子上にコーティングされたストレプトアビジンに対する結合によって捕獲され得る、エラスターゼ標的分子を用いる。
次いで、回収されたファージは細菌細胞の感染によって増殖され得、そしてスクリーニングプロセスは、非エラスターゼ結合剤を現在欠いており、エラスターゼ結合剤が濃縮されているファージの新しいプールで繰り返してもよい。２〜３の結合ファージの回収でさえ、完成プロセスを行うのには十分であり得る。２〜３回の選択後、結合プールにおける選択されたファージクローン由来の結合部分をコードする遺伝子配列を、従来の方法によって決定して、標的に対してファージの結合親和性を付与するペプチド配列を明らかにする。各々の回の選択および密接に関連する配列の回収後に回復されたファージの数の増大によって、このスクリーニングは、所望の特徴を有するライブラリーの配列をカバーしていることが示される。
結合ポリペプチドのセットが同定された後、配列情報を用いて、他の二次ライブラリーを設計してもよい。例えば、二次ライブラリーは、配列スペースの小さいセグメントを最初のライブラリーよりも詳細に探索することができる。同じ実施形態では、二次ライブラリーは、さらに所望の特性を有しているメンバー、例えばヒトタンパク質に高い同一性パーセントを有する配列について偏向されているタンパク質を含む。
ディスプレイ技術はまた、標的の特定のエピトープに対して特異的であるポリペプチドを得るために用いられ得る。これは、例えば、特定のエピトープを欠く競合する非標的分子を用いることによって行われてもよく、またはエピトープ内で、例えば、アラニンで変異される。このような非標的分子は、下記のようなネガティブ選択手順において、標的に対してディスプレイライブラリーを結合する場合、競合分子として、または例えば、ディスプレイライブラリーを分離する洗浄溶液中で捕獲するためにプレ溶出因子として、用いられ得る。
（インタラクティブ選択）
１つの好ましい実施形態では、ディスプレイライブラリー技術は、インタラクティブ方式で用いられる。第一のディスプレイライブラリーは、標的と相互作用する１つ以上のタンパク質を同定するために用いられる。次いで、これらの同定されたタンパク質は二次ディスプレイライブラリーを形成するために変異原性の方法を用いて変化される。次いで、例えば、より高いストリンジェンシーまたはより競合的な結合および洗浄条件を用いることによって、より高い親和性のタンパク質を第二のライブラリーから選択する。
１つの好ましい実施形態では、ディスプレイライブラリー技術は、インタラクティブ方式で用いられる。第一のディスプレイライブラリーは、標的と相互作用する１つ以上のタンパク質を同定するために用いられる。次いで、これらの同定されたタンパク質は二次ディスプレイライブラリーを形成するために変異原性の方法を用いて変化される。次いで、例えば、より高いストリンジェンシーまたはより競合的な結合および洗浄条件を用いることによって、より高い親和性のタンパク質を第二のライブラリーから選択する。
ある実施では、変異原性は、公知の領域に対して標的されるか、または結合の境界である可能性が高い。いくつかの例示的な変異原性技術としては以下が挙げられる：エラー・プローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５）、組み換え、無作為な切断を用いるＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３８９−３９１；「核酸シャッフリング（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」と呼ばれる）、ＲＡＣＨＩＴＴＴＭ（Ｃｏｃｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、部位指向性変異原性（Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：６４８７〜６５０４）、カセット変異原性（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）および縮重オリゴヌクレオチドの組み込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５）。Ｋｕｎｉｔｚドメインについては、結合境界付近の多くの位置が公知である。このような位置としては、例えば、ＢＰＴＩの配列に対して位置１３、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４および３９が挙げられる。（米国特許第６，３３３，４０２号におけるＢＰＴＩ番号付けに従って）。このような位置は、一定に保つことが可能であり、そして他の位置は変化されてもよく、またはこれらの位置自体が変化されてもよい。
インタラクティブ選択の１例では、本明細書に記載される方法を用いて、標的について少なくとも最小の結合特異性、または最小の活性、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭより大きいという結合についての平衡解離定数でエラスターゼに結合するディスプレイライブラリーからタンパク質を最初に特定する。最初に特定されたタンパク質をコードする核酸配列は、例えば、最初のタンパク質リガンドに対して増強された特性（例えば、結合親和性、動態学または安定性）を有する第二のタンパク質リガンドを特定するために、バラツキの導入のためのテンプレート核酸として用いられる。
（オフレート選択（ｏｆｆ−ｒａｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ））
遅い分離速度は、特にタンパク質とそれらの標的との間の相互作用に関して、高い親和性の指標であり得るため、本明細書に記載される方法を用いて、標的に対する結合相互作用について所望の動態学的な解離速度（すなわち、低下した）を有するタンパク質を単離し得る。
遅い分離速度は、特にタンパク質とそれらの標的との間の相互作用に関して、高い親和性の指標であり得るため、本明細書に記載される方法を用いて、標的に対する結合相互作用について所望の動態学的な解離速度（すなわち、低下した）を有するタンパク質を単離し得る。
ディスプレイライブラリーからのタンパク質の緩徐な分離について選択するため、このライブラリーは、固定された標的、例えば、固定されたエラスターゼに対して接触される。次いで、この固定された標的は、非特異的にまたは弱く結合された生体分子を除去する第一溶液で洗浄される。次いで、この固定された標的は、飽和量の遊離の標的、すなわち、粒子に結合されない標的の複製物を含む第二の溶液で溶出される。この遊離の標的は、標的から解離する生体分子に結合する。再結合は、かなり低濃度の固定された標的に対して飽和量である遊離の標的によって効率的に阻止される。
この第二溶液は、実質的に生理学的であるか、またはストリンジェントである溶液条件を有し得る。代表的には、この第二溶液の溶液条件は、第一の溶液の溶液条件と同一である。第二の溶液の画分は、後期の画分から初期の画分を識別するために時間的な順序で収集される。後期の画分は、初期の画分における生体分子よりも標的からより遅い速度で解離する生体分子を含む。
さらに、長いインキュベーションの後でさえ標的に結合したままであるディスプレイライブラリーメンバーを回収することも可能である。これらは、カオトロピック条件を用いて解離されてもよいし、または標的に結合したままで増幅されてもよい。例えば、標的に結合したファージは、細菌細胞に対して接触され得る。
（特異性についての選択およびスクリーニング）
本明細書に記載されるディスプレイライブラリースクリーニング方法は、非標的分子、例えば、トリプシンのような、エラスターゼ以外のプロテアーゼに結合するディスプレイライブラリーメンバーを破棄する選択またはスクリーニングプロセスを包含し得る。１実施形態では、この非標的分子は、不可逆性に結合したインヒビター、例えば、共有結合性インヒビターでの処置によって活性化されているエラスターゼである。
本明細書に記載されるディスプレイライブラリースクリーニング方法は、非標的分子、例えば、トリプシンのような、エラスターゼ以外のプロテアーゼに結合するディスプレイライブラリーメンバーを破棄する選択またはスクリーニングプロセスを包含し得る。１実施形態では、この非標的分子は、不可逆性に結合したインヒビター、例えば、共有結合性インヒビターでの処置によって活性化されているエラスターゼである。
１つの実施では、いわゆる「ネガティブ選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」工程または「枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」を用いて、標的と関連の非標的分子と関連であるが別個の非標的分子との間を識別する。ディスプレイライブラリーまたはそのプールは、非標的分子に接触される。非標的に結合されないサンプルのメンバーを収集して、標的分子に対する結合のための引き続く選択、またはその後のネガティブ選択についてさえ用いる。このネガティブ選択工程は、標的分子に結合するライブラリーメンバーを選択する前であっても後であってもよい。
別の実施では、スクリーニング工程を用いる。ディスプレイライブラリーメンバーを標的分子に対する結合について単離した後、各々の単離されたライブラリーメンバーを、非標的分子（例えば、上記の非標的）に対して結合する能力について試験する。例えば、ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを用いてこのデータを得ることができる。ＥＬＩＳＡスクリーニングはまた、標的に対する各々のライブラリーメンバーの結合のための定量的なデータを得るためにも用いられ得る。非標的および標的結合データを比較して（例えば、コンピュータおよびソフトウェアを用いて）、この標的に特異的に結合するライブラリーメンバーを特定する。
（ポリペプチドの修飾および変化）
エラスターゼと相互作用するタンパク質を変化させて、エラスターゼと相互作用する有用な改変体タンパク質を得ることもできる。代表的には、多数の改変体が可能である。改変体は、調製されて、次いで例えば、本明細書に記載の結合アッセイを用いて試験され得る（例えば、蛍光異方性）。
エラスターゼと相互作用するタンパク質を変化させて、エラスターゼと相互作用する有用な改変体タンパク質を得ることもできる。代表的には、多数の改変体が可能である。改変体は、調製されて、次いで例えば、本明細書に記載の結合アッセイを用いて試験され得る（例えば、蛍光異方性）。
１タイプの改変体は、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載される方法によって単離されるリガンドの切断である。この実施例では、この改変体は、Ｎ末端またはＣ末端からリガンドの１つ以上のアミノ酸残基を除去することによって調製される。ある場合には、一連のこのような改変体が調製され試験される。このシリーズを試験することによる情報を用いて、エラスターゼタンパク質を結合するのに必須であるリガンドの領域を決定する。一連の内部欠失または挿入は、同様に構築されて試験され得る。Ｋｕｎｉｔｚドメインについては、例えば、第一のシステインであるＣ５対してＮ末端側である１〜５つの残基または１〜３つの残基、ならびに最終のシステインであるＣ５５に対してＣ末端である１〜５つの残基または１〜３つの残基を除去することが可能であるが、このシステインの各々はＢＰＴＩ中のそれぞれ番号付けされたシステインに相当する。
別のタイプの改変体は置換である。１実施例では、このリガンドを、アラニンスキャンニングに供して、結合活性に寄与する残基を同定する。別の例では、置換基のライブラリーは１つ以上の位置で構築される。このライブラリーは、偏向されてなくてもよいし、または特に複数の位置が変化される場合、もとの残基にむかって変化され、偏向される。ある場合には、この置換は、全て保存的置換である。
別のタイプの改変体は、１つ以上の天然には存在しないアミノ酸を含む。このような改変体リガンドは、化学的な合成または修飾によって生成され得る。１つ以上の位置が、天然には存在しないアミノ酸で置換されてもよい。ある場合には、この置換されたアミノ酸は、もとの天然に存在する残基（例えば、脂肪族、荷電、塩基性、酸性、芳香族、親水性の残基）、またはもとの残基のアイソスターに対して化学的に関連し得る。
非ペプチド結合および他の化学的修飾を含むことも可能であり得る。例えば、このリガンドの一部または全ては、ペプチド模倣物、例えば、ペプトイドとして合成されてもよい（例えば、Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７〜７１、およびＨｏｒｗａｌｌ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１３２〜４を参照のこと）。また、以下に考察される他の修飾も参照のこと。
（結合相互作用の特徴）
タンパク質（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド）の結合特性は、種々のアッセイ形式を用いて容易に評価され得る。例えば、タンパク質の結合特性は、蛍光異方性によって溶液中で測定され得、これによって特定の標的についてタンパク質の解離定数（ＫＤ）または結合定数（Ｋａ）を決定する簡便かつ正確な方法が得られる。１つのこのような手順では、評価されるべきタンパク質は、フルオレセインで標識される。フルオレセイン標識タンパク質は、マルチウェルアッセイプレートのウェル中で、種々の濃度の特定の標的（例えば、エラスターゼ）と混合される。蛍光異方性の測定は、蛍光偏極プレートリーダーを用いて行う。
タンパク質（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド）の結合特性は、種々のアッセイ形式を用いて容易に評価され得る。例えば、タンパク質の結合特性は、蛍光異方性によって溶液中で測定され得、これによって特定の標的についてタンパク質の解離定数（ＫＤ）または結合定数（Ｋａ）を決定する簡便かつ正確な方法が得られる。１つのこのような手順では、評価されるべきタンパク質は、フルオレセインで標識される。フルオレセイン標識タンパク質は、マルチウェルアッセイプレートのウェル中で、種々の濃度の特定の標的（例えば、エラスターゼ）と混合される。蛍光異方性の測定は、蛍光偏極プレートリーダーを用いて行う。
（ＥＬＩＳＡ）
結合相互作用はまた、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析され得る。例えば、評価されるべきタンパク質は、その底面が標的、例えば限られた量の標的でコーティングされているマイクロタイタープレートに接触される。この分子はプレートに接触される。このプレートを緩衝液で洗浄して、非特異的に結合した分子を除去する。次いで、このプレートに結合したタンパク質の量を、このタンパク質を認識する抗体を用いてこのプレートをプローブすることによって決定する。例えば、このタンパク質は、エピトープタグを含んでもよい。この抗体は、適切な基質を与えられたとき比色定量生成物を生じる、アルカリホスファターゼのような酵素に結合されてもよい。ディスプレイライブラリーのメンバーが試験されるべきタンパク質を含む場合、抗体は、全てのディスプレイライブラリーメンバーの中でも一定である領域、例えば、ファージディスプレイライブラリーのメンバーについては主なファージコートタンパク質を認識し得る。
結合相互作用はまた、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析され得る。例えば、評価されるべきタンパク質は、その底面が標的、例えば限られた量の標的でコーティングされているマイクロタイタープレートに接触される。この分子はプレートに接触される。このプレートを緩衝液で洗浄して、非特異的に結合した分子を除去する。次いで、このプレートに結合したタンパク質の量を、このタンパク質を認識する抗体を用いてこのプレートをプローブすることによって決定する。例えば、このタンパク質は、エピトープタグを含んでもよい。この抗体は、適切な基質を与えられたとき比色定量生成物を生じる、アルカリホスファターゼのような酵素に結合されてもよい。ディスプレイライブラリーのメンバーが試験されるべきタンパク質を含む場合、抗体は、全てのディスプレイライブラリーメンバーの中でも一定である領域、例えば、ファージディスプレイライブラリーのメンバーについては主なファージコートタンパク質を認識し得る。
（均一アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙｓ））
タンパク質と特定の標的との間の結合相互作用は、均一アッセイを用いて分析され得、すなわち、アッセイの全ての成分が添加された後、さらなる液体の操作は必要ない。例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を均質アッセイとして用いてもよい（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）。第一の分子上の発蛍光団標識（例えば、この画分中で同定された分子）は、第二の分子が第一の分子に対して近接している場合、その放射された蛍光エネルギーが第二の分子（例えば、標的）上の蛍光標識によって吸収され得るように選択される。この第二の分子上の蛍光標識は、伝達されたエネルギーを吸収するとき、蛍光を発する。標識の間のエネルギー伝達の効率は、分子間の距離に関係するので、この分子の間の空間的関係は、アッセイされ得る。分子間で結合が生じる状況では、アッセイ中の「アクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）」分子標識の蛍光発光が最大であるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当該分野で周知である標準的な蛍光検出方法を通じて（例えば蛍光定量法を用いる）都合よく測定され得る。第一または第二の結合分子の量を滴定することによって、結合曲線を作成して、平衡結合定数を評価し得る。
タンパク質と特定の標的との間の結合相互作用は、均一アッセイを用いて分析され得、すなわち、アッセイの全ての成分が添加された後、さらなる液体の操作は必要ない。例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を均質アッセイとして用いてもよい（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）。第一の分子上の発蛍光団標識（例えば、この画分中で同定された分子）は、第二の分子が第一の分子に対して近接している場合、その放射された蛍光エネルギーが第二の分子（例えば、標的）上の蛍光標識によって吸収され得るように選択される。この第二の分子上の蛍光標識は、伝達されたエネルギーを吸収するとき、蛍光を発する。標識の間のエネルギー伝達の効率は、分子間の距離に関係するので、この分子の間の空間的関係は、アッセイされ得る。分子間で結合が生じる状況では、アッセイ中の「アクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）」分子標識の蛍光発光が最大であるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当該分野で周知である標準的な蛍光検出方法を通じて（例えば蛍光定量法を用いる）都合よく測定され得る。第一または第二の結合分子の量を滴定することによって、結合曲線を作成して、平衡結合定数を評価し得る。
（表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ））
タンパク質と特定の標的との間の結合相互作用は、ＳＰＲを用いて分析され得る。例えば、サンプルに存在し、そして例えば、ＥＬＩＳＡによって必要に応じて確証されたディスプレイライブラリーメンバーの配列決定後、提示されたタンパク質は、多量に産生されて、ＳＰＲを用いて標的結合についてアッセイされ得る。ＳＰＲまたはリアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）は、反応体（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）を標識することなく、生体特異的な相互作用をリアルタイムで検出する。ＢＩＡチップの結合表面での質量の変化（結合事象の指標）は、この表面近くで光の屈折率の変化を生じる（表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）。屈折度の変化によって検出可能なシグナルが生じ、これが生物学的分子の間のリアルタイムの反応の指標として測定される。ＳＰＲを用いるための方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５に記載される。
タンパク質と特定の標的との間の結合相互作用は、ＳＰＲを用いて分析され得る。例えば、サンプルに存在し、そして例えば、ＥＬＩＳＡによって必要に応じて確証されたディスプレイライブラリーメンバーの配列決定後、提示されたタンパク質は、多量に産生されて、ＳＰＲを用いて標的結合についてアッセイされ得る。ＳＰＲまたはリアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）は、反応体（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）を標識することなく、生体特異的な相互作用をリアルタイムで検出する。ＢＩＡチップの結合表面での質量の変化（結合事象の指標）は、この表面近くで光の屈折率の変化を生じる（表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）。屈折度の変化によって検出可能なシグナルが生じ、これが生物学的分子の間のリアルタイムの反応の指標として測定される。ＳＰＲを用いるための方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５に記載される。
ＳＰＲによる情報を用いて、標的に対する生体分子の結合についての、平衡解離定数（Ｋｄ）、ならびにｋｏｎおよびｋｏｆｆを含む動態学的パラメーターの正確かつ定量的な測定を行うことができる。このようなデータを用いて、異なる生体分子を比較することができる。例えば、ディスプレイライブラリーから選択されるタンパク質を比較して、標的に高い親和性を有するか、または低いｋｏｆｆを有する個体を特定することができる。この情報を用いて、この生体分子が関連される場合、構造活性関係（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）（ＳＡＲ）を明らかにさせることもできる。例えば、このタンパク質が全て、単独の親の抗体の変異した改変体、または１セットの公知の親の抗体である場合、特定の結合パラメーター、例えば、高い親和性および低いｋｏｆｆと相関する所定の位置の改変体アミノ酸が、特定され得る。
結合親和性を測定するためのさらなる方法としては、蛍光偏光（ＦＰ）（例えば、米国特許第５，８００，９８９号を参照のこと）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および結合滴定（例えば、蛍光エネルギー伝達を用いる）が挙げられる。
結合特性を研究するための他の解決方法としては、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）およびＮＭＲが挙げられる。
（エラスターゼ阻害の特徴づけ）
エラスターゼに特異的なＫｕｎｉｔｚドメインを有するポリペプチドを化合物が含む実施形態に関して、エラスターゼを阻害するポリペプチドの能力を特徴付けることが有用であり得る。
エラスターゼに特異的なＫｕｎｉｔｚドメインを有するポリペプチドを化合物が含む実施形態に関して、エラスターゼを阻害するポリペプチドの能力を特徴付けることが有用であり得る。
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、エラスターゼに対する結合について、そしてエラスターゼタンパク質分解性活性の阻害についてスクリーニングされ得る。Ｋｕｎｉｔｚドメインは、エラスターゼの阻害のその能力および選択性について選択され得る。１実施例では、エラスターゼおよびその基質を、プロテアーゼとその基質との反応を可能にするアッセイ条件下で合わす。このアッセイを、Ｋｕｎｉｔｚドメインの非存在下で、そしてＫｕｎｉｔｚドメインの漸増する濃度の存在下で行う。エラスターゼ活性の５０％が試験化合物によって阻害されるという試験化合物の濃度は、その化合物についてのＩＣ５０値（阻害濃度）またはＥＣ５０（有効濃度）値である。一連のまたは一群のＫｕｎｉｔｚドメイン内で、低いＩＣ５０またはＥＣ５０値を有するドメインほど、より高いＩＣ５０またはＥＣ５０値を有する化合物よりもエラスターゼのさらに強力なインヒビターであると考えられる。この局面による好ましい化合物は、エラスターゼ活性の阻害についてインビトロアッセイにおいて測定した場合、１００ｎＭ以下のＩＣ５０値を有する。
Ｋｕｎｉｔｚドメインはまた、エラスターゼに向かう選択性について評価され得る。試験化合物は、セリンプロテアーゼおよび他の酵素のパネルに向かうその効力についてアッセイされて、ＩＣ５０値が各々のペプチドについて決定される。試験パネル内の、エラスターゼ酵素について低いＩＣ５０値、および他の酵素（例えば、トリプシン、プラスミン、カリクレイン）について高いＩＣ５０値を示すＫｕｎｉｔｚドメインは、エラスターゼに向かって選択されると考えられる。一般に、化合物は、そのＩＣ５０値が、酵素のパネル中で測定された次に最小のＩＣ５０値よりも少なくとも１ケタ小さい場合に選択性であるとみなされる。
エラスターゼの阻害を評価するための特定の方法は、実施例１に記載される。
インビボで、または本明細書に記載される化合物が投与されている被験体のサンプルにおいて、Ｋｕｎｉｔｚドメイン活性を評価することも可能である。
（プロテアーゼ標的）
ヒト好中球エラスターゼは、約２１８のアミノ酸残基から構成され、２つのアスパラギン連結炭水化物側鎖を含み、そして２つのジスルフィド結合によって一緒に連結される（Ｓｉｎｈａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２２２８−２２３２，１９８７）。主な顆粒中に活性型で貯蔵されるが、通常炎症の部位で、顆粒から放出された場合完全な酵素活性を発揮する状態である、酵素前駆体として好中球を発達させることでこれは、通常合成される（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ Ｕ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９７；５８：１３７−１５３；Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ，Ｃｏｗｌａｎｄ ＪＢ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：３５０３−３５２１）。
ヒト好中球エラスターゼは、約２１８のアミノ酸残基から構成され、２つのアスパラギン連結炭水化物側鎖を含み、そして２つのジスルフィド結合によって一緒に連結される（Ｓｉｎｈａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２２２８−２２３２，１９８７）。主な顆粒中に活性型で貯蔵されるが、通常炎症の部位で、顆粒から放出された場合完全な酵素活性を発揮する状態である、酵素前駆体として好中球を発達させることでこれは、通常合成される（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ Ｕ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９７；５８：１３７−１５３；Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ，Ｃｏｗｌａｎｄ ＪＢ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：３５０３−３５２１）。
（合成ペプチド）
結合リガンドは、標的分子、例えば、標的プロテアーゼ、例えばエラスターゼに独立して結合する、３２個以下のアミノ酸の人工的なペプチドを含んでもよい。いくつかの合成ペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合を含んでもよい。他の合成ペプチド、いわゆる、「直鎖ペプチド（ｌｉｎｅａｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」は、システインを欠く。合成ペプチドは、溶液中で構造をほとんど含まなくても、または全く含まなくてもよく（例えば、非構造化）、異種構造（例えば、別の高次構造または「ゆるく構築された（ｌｏｏｓｅｌｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）、または単数の天然構造（例えば、協調的に折り畳まれた）であってもよい。いくつかの合成ペプチドは、標的分子に結合された場合、特定の構造をとる。いくつかの例示的な合成ペプチドは、少なくともジスルフィド結合、および例えば、約４〜１２の非システイン残基のループを有するいわゆる「環状ペプチド（ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」である。例示的なペプチドは、２８、２４、２０または１８アミノ酸長未満である。
結合リガンドは、標的分子、例えば、標的プロテアーゼ、例えばエラスターゼに独立して結合する、３２個以下のアミノ酸の人工的なペプチドを含んでもよい。いくつかの合成ペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合を含んでもよい。他の合成ペプチド、いわゆる、「直鎖ペプチド（ｌｉｎｅａｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」は、システインを欠く。合成ペプチドは、溶液中で構造をほとんど含まなくても、または全く含まなくてもよく（例えば、非構造化）、異種構造（例えば、別の高次構造または「ゆるく構築された（ｌｏｏｓｅｌｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）、または単数の天然構造（例えば、協調的に折り畳まれた）であってもよい。いくつかの合成ペプチドは、標的分子に結合された場合、特定の構造をとる。いくつかの例示的な合成ペプチドは、少なくともジスルフィド結合、および例えば、約４〜１２の非システイン残基のループを有するいわゆる「環状ペプチド（ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」である。例示的なペプチドは、２８、２４、２０または１８アミノ酸長未満である。
分子標的、例えばエラスターゼのようなプロテアーゼに独立して結合するペプチド配列は、ディスプレイライブラリーまたはペプチドのアレイから選択され得る。例えば、米国特許第２００３−０１２９６５９を参照のこと。同定後、このようなペプチドは、合成的に産生されてもまたは組み換え方法によって産生されてもよい。この配列は、さらに長い配列に組み込まれ（例えば、挿入、付加または付着され）てもよい。この配列は、標的、例えば、エラスターゼを阻害する能力について試験され得る。
プロテアーゼに結合するペプチドリガンドは、６つ以上のアミノ酸を含んでもよい。アミノ酸サブユニットは、天然に存在するアミノ酸（例えば、２０個の通常用いられる天然に存在するアミノ酸の１つ）または天然に存在しない）アミノ酸であっても、またはそれらの組み合わせであってもよい。同様に、アミノ酸配列は、天然に存在しても、天然に存在しなくてもよい。ペプチドアナログはまた、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチドエラスターゼリガンドとして用いられ得る。例えば、Ｌｕｔｈｍａｎら，Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４；３８６〜４０６、第２版、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６）；Ｊｏａｃｈｉｍ Ｇｒａｎｔｅ（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１６９９〜１７２０；Ｆａｕｃｈｅｒｅ（１９８６）Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ，ｐ．３９２；およびＥｖａｎｓら（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８３）Ｕｎｕｓｕａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５（６）：３４１〜４４９；Ｍｏｒｇａｎら（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４：２４３〜２５２；Ｍｕｒｒａｙら（１９９５）Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，第５版、ＶｏＬ １，Ｍａｎｆｒｅｄ Ｅ．Ｗｏｌｆ（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｚａｌｌｉｐｓｋｙ（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６；１５０〜１６５；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６；６２〜６９；米国特許第４，６４０，８３５号；米国特許第４，４９６，６８９号；米国特許第４，３０１，１４４号；米国特許第４，６７０，４１７号；米国特許第４，７９１，１９２号；米国特許第４，１７９，３３７号およびＷＯ９５／３４３２６；Ｈｒｕｂｙ ら（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，２６８（２）：２４９〜２６２を参照のこと。
（他の例示的な足場）
エラスターゼに結合するタンパク質を産生するように変化を与えられ得る他の例示的な足場としては、細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、ＥＧＦリピート）；プロテアーゼインヒビター（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、エコチン、ＢＰＴＩ、など）；ＴＲＰリピート；三つ葉（ｔｒｉｆｏｉｌ）構造；ジンクフィンガードメイン；ＤＮＡ結合タンパク質；特に単量体ＤＮＡ結合タンパク質；ＲＮＡ結合タンパク質；酵素、例えば、プロテアーゼ（特に不活性なプロテアーゼ）、ＲＮａｓｅ；シャペロン、例えば、チオレドキシンおよび熱ショックタンパク質；ならびに細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＳＨ２およびＳＨ３ドメイン）および抗体（例えば、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦＶ）、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体、およびラクダ化抗体）；Ｔ細胞レセプターおよびＭＨＣタンパク質を挙げることができる。
エラスターゼに結合するタンパク質を産生するように変化を与えられ得る他の例示的な足場としては、細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、ＥＧＦリピート）；プロテアーゼインヒビター（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、エコチン、ＢＰＴＩ、など）；ＴＲＰリピート；三つ葉（ｔｒｉｆｏｉｌ）構造；ジンクフィンガードメイン；ＤＮＡ結合タンパク質；特に単量体ＤＮＡ結合タンパク質；ＲＮＡ結合タンパク質；酵素、例えば、プロテアーゼ（特に不活性なプロテアーゼ）、ＲＮａｓｅ；シャペロン、例えば、チオレドキシンおよび熱ショックタンパク質；ならびに細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＳＨ２およびＳＨ３ドメイン）および抗体（例えば、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦＶ）、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体、およびラクダ化抗体）；Ｔ細胞レセプターおよびＭＨＣタンパク質を挙げることができる。
米国特許第５，２２３，４０９号はまた、多数のいわゆる、「ミニプロテイン（ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、例えば、αコノトキシン後にモデル化されたミニプロテイン（改変体ＧＩ、ＧＩＩおよびＭＩを含む）、μ−（ＧＩＩＩＡ、ＧＩＩＩＢ、ＧＩＩＩＣ）またはＯＭＥＧＡ−（ＧＶＩＡ、ＧＶＩＢ、ＧＶＩＣ、ＧＶＩＩＡ、ＧＶＩＩＢ、ＭＶＩＩＡ、ＭＶＩＩＢなど）コノトキシンを記載している。
（タンパク質産生）
ポリペプチドの組み換え産生。標準的な組み換え核酸法を用いて、本明細書に記載される化合物のポリペプチド成分（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド）を発現し得る。一般には、ポリペプチドをコードする核酸配列を核酸発現ベクター中にクローニングする。ポリペプチドが十分小さい場合、例えば、タンパク質が５０アミノ酸未満のペプチドである場合、このタンパク質は、自動的な有機合成方法を用いて合成され得る。
ポリペプチドの組み換え産生。標準的な組み換え核酸法を用いて、本明細書に記載される化合物のポリペプチド成分（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチド）を発現し得る。一般には、ポリペプチドをコードする核酸配列を核酸発現ベクター中にクローニングする。ポリペプチドが十分小さい場合、例えば、タンパク質が５０アミノ酸未満のペプチドである場合、このタンパク質は、自動的な有機合成方法を用いて合成され得る。
ポリペプチドを発現するための発現ベクターは、ポリペプチドをコードするセグメント、および調節性配列、例えば、必要に応じてこのコードセグメントに結合されたプロモーターを含んでもよい。適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、そして本発明の組み換え構築物を生成するために市販されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される技術を参照のこと。
Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、および他のテキストは、組み換え（および非組み換え）タンパク質を精製するための多数の一般的方法を提供する。
（ペプチドの合成による産生）
化合物のポリペプチド成分はまた、合成手段によって産生され得る。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９を参照のこと。例えば、合成ペプチドまたはペプチド模倣物の分子量は、約２５０〜約８０，０００ダルトンにおよんでもよい。ペプチドは、例えば、このペプチドの有効な分子量を増大する部分に対する結合によって、修飾され得る。ペプチドがオリゴマー形成され、二量体化され、そして／または、例えば、親水性ポリマーと誘導体化されれば（例えば、ペプチドの親和性および／または活性を増大するために）、その分子量は、大きくなってもよく、そして約５００〜約５０，０００ダルトンのいずれかにおよんでもよい。
化合物のポリペプチド成分はまた、合成手段によって産生され得る。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９を参照のこと。例えば、合成ペプチドまたはペプチド模倣物の分子量は、約２５０〜約８０，０００ダルトンにおよんでもよい。ペプチドは、例えば、このペプチドの有効な分子量を増大する部分に対する結合によって、修飾され得る。ペプチドがオリゴマー形成され、二量体化され、そして／または、例えば、親水性ポリマーと誘導体化されれば（例えば、ペプチドの親和性および／または活性を増大するために）、その分子量は、大きくなってもよく、そして約５００〜約５０，０００ダルトンのいずれかにおよんでもよい。
（薬学的組成物）
組成物、例えば、（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと、（ｉｉ）化合物の分子量を増大する部分（例えばポリマー）とを含む化合物を含む、薬学的に受容可能な組成物もまた特徴付けられる。１実施形態では、このポリペプチドは、エラスターゼのようなプロテアーゼに結合する。本明細書において用いる場合、「薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」とは、診断用（例えば、インビボ画像）用途のための化合物（例えば、標識化合物）、ならびに治療用途または予防用途のための化合物を包含する。
組成物、例えば、（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと、（ｉｉ）化合物の分子量を増大する部分（例えばポリマー）とを含む化合物を含む、薬学的に受容可能な組成物もまた特徴付けられる。１実施形態では、このポリペプチドは、エラスターゼのようなプロテアーゼに結合する。本明細書において用いる場合、「薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」とは、診断用（例えば、インビボ画像）用途のための化合物（例えば、標識化合物）、ならびに治療用途または予防用途のための化合物を包含する。
本明細書において用いる場合、「薬学的に受容可能なキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」としては、任意のかつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などの生理学的に適合するものが挙げられる。１実施形態では、このキャリアは、水以外である。好ましくはこのキャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口的、脊髄または上皮の投与（例えば、注射または注入による）のために適切である。投与の経路に依存して、活性化合物は、酸およびこの化合物を不活性化し得る他の天然の条件の作用からこの化合物を保護するように物質中でコーティングされる。
「薬学的に受容可能な塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔ）」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒性学的な影響をなんら付与しない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。このような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸など由来の塩、ならびに非毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸など由来の塩が挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど由来の塩、ならびに非毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなど由来の塩が挙げられる。
本発明の組成物は、種々の形態であってもよい。これらとしては、例えば、液体、半固体および固体投薬形態、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソームおよび坐剤が挙げられる。この好ましい形態は、投与および治療の適用の意図される方式に依存する。代表的な好ましい組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態、例えば、抗体とともにヒトの投与のために用いられる組成物と類似の組成物である。投与の好ましい方式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態では、この化合物は、静脈内注入または注射によって投与される。別の好ましい実施形態では、この化合物は、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
「非経口投与（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「非経口的に投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）」という句は、本明細書において用いる場合、通常は、注射による、腸内投与および局所投与以外の投与の方式を意味し、そして限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管支内、皮下、表皮内、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内硬膜外および胸骨内の注射および注入を包含する。
薬学的組成物は代表的に、製造および保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。薬学的組成物はまた、投与についての規則および産業上の標準を満たすことを確実にするように試験され得る。例えば、調製物中のエンドトキシンレベルは、ＵＳＰ ２４／ＮＦ １９法に従って、Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ溶解物アッセイ（例えば、感度０．１２５ＥＵ／ｍＬ、Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒロット番号＃７Ｌ３７９０由来のキットを用いる）を用いて試験され得る。薬学的組成物の無菌性は、ＵＳＰ ２４／ＮＦ１９法によってチオグリコレート培地を用いて決定され得る。例えば、この調製物を用いて、チオグリコレート培地を接種して、３５℃で１４日間以上インキュベートする。この培地を周期的に検査して、微生物の増殖を検出する。
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散、リポソーム、または高い薬物濃度に適切な他の高次構造として処方され得る。無菌の注射可能溶液は、必要な量の活性化合物を、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込むことによって調製され得、必要に応じてその後に濾過滅菌されてもよい。一般には、分散剤は、基礎の分散培地および上記由来の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性な化合物を組み込むことによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これによってその以前に無菌濾過された溶液から活性成分に加えて任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子の維持によって、そしてサーファクタントの使用によって維持され得る。注射可能組成物の吸収の延長は、この組成物中に吸収を遅らせる因子、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。
本明細書において所望される化合物は、当該分野で公知の種々の方法によって投与され得る。多くの出願について、投与の経路／方式は、静脈内注射または注入である。例えば、治療適用のために、この化合物は、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量に達するように、３０、２０、１０、５または１ｍｇ／分未満の速度での静脈内注入によって投与され得る。投与の経路および／または方式は、望まれる結果次第で変化する。特定の実施形態では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、徐放性処方物のように、この化合物の急速な放出を妨げるキャリアとともに調製されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性の生体適合性のポリマーが用いられ得る。このような処方物の調製のための多くの方法は、特許されるかまたは一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（編），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。薬学的処方物は、当該分野で十分確立されており、そしてＧｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，第７版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ（編），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，第３版．（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）にさらに記載されている。
特定の実施形態では、この組成物は、例えば、不活性の希釈液または吸収性の食用キャリアとともに経口投与され得る。この化合物（および、所望の場合、他の成分）はまた、硬性もしくは軟性のシェルのゼラチンカプセルに包含されても、錠剤中に圧縮されても、または被験体の食餌に直接組み込まれてもよい。経口治療投与のためには、この化合物は、賦形剤とともに組み込まれても、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウェーハなどの形態で用いられてもよい。非経口投与以外で化合物を投与するために、その不活性化を妨げる物質を用いてこの化合物をコーティングすること、またはそのような物質とともにこの化合物を同時投与することが必要であるかもしれない。
薬学的組成物は、当該分野で公知の医学的デバイスとともに投与され得る。例えば、好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイスのような、ハリなしの皮下注射デバイスを用いて投与され得る。周知のインプラントおよび本発明において有用なモジュールの例としては以下が挙げられる：徐放性の速度で医薬を投与するための移植可能な微小注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通じて医薬を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬インフュージョン（注入）ポンプを開示する、米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達のための可変式流量の移植可能な注入装置を開示する、米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバ区画を有する浸透圧性薬物送達システムを開示する、米国特許第４，４３９，１９６号；ならびに浸透圧性薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号。当然ながら、多くの他のこのようなインプラント、送達システムおよびモジュールがまた公知である。
特定の実施形態では、化合物は、インビボでの適切な分布を確実にするように処方され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高い親水性の化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢ（所望の場合）を横切ることを確実にするために、それらは、例えばリポソーム中に処方されてもよい。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号を参照のこと。このリポソームは、特定の細胞または器官中に選択的に輸送される１つ以上の部分を含み得、これによって標的された薬物送達を強化する（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照のこと）。
また、本明細書に記載される組成物（例えば、（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと（ｉｉ）この化合物の分子量を増大する部分（例えばポリマー）とを含む組成物化合物）と、使用、例えば、治療、予防または診断の使用のための指示書とを備えるキットも本発明の範囲内である。１実施形態では、このキットは、（ａ）化合物、例えば、この化合物を含む組成物と、必要に応じて、（ｂ）情報物とを備える。この情報物は、本明細書に記載される方法、および／または本明細書に記載される方法についての、この化合物の使用に関する記述的、教育的、販売的または他の物質を含む。例えば、この情報物質は、エラスターゼ活性を低下させる化合物を投与するか、または肺の障害（例えば、ＣＦまたはＣＯＰＤ）、炎症性障害（例えば、ＩＢＤ）または過剰なエラスターゼ活性によって特徴付けられる障害を処置または予防するための方法を記載する。
１実施形態では、この情報物は、適切な方式で、例えば適切な用量、投薬形態または投与方式（例えば、本明細書に記載される用量、投薬形態または投与の方式）でこの化合物を投与する指示書を備えてもよい。別の実施形態では、この情報物は、適切な被験体、例えばヒト、例えば過剰なエラスターゼ活性によって特徴付けられる障害を有するかまたはそのリスクのあるヒトを特定するための指示書を備えてもよい。この情報物は、化合物の産生についての情報、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチまたは産生部位の情報などを含んでもよい。このキットの情報物は、その形態に限定されない。多くの場合に、この情報物、例えば、指示書は、印刷物で、例えば、印刷されたテキスト、図面および／または写真、例えば表示または印刷されたシートで与えられる。しかし、この情報物はまた、他の方式で、例えば、点字、コンピュータ読み取り可能物、ビデオ記録、または音声記録で提供され得る。別の実施形態では、このキットの情報物は、リンクまたは接触の情報、例えば、実際の住所、Ｅメールアドレス、ハイパーリンク、ウェブサイト、または電話番号であり、これによってキットの使用者は、この化合物および／または本明細書に記載される方法におけるその使用についての実質的な情報を得ることが可能である。当然ながら、情報物はまた、任意の組み合わせの方式で提供されてもよい。
この化合物に加えて、キットの組成物は、他の成分、例えば、溶媒または緩衝液、安定化剤または防腐剤および／または本明細書に記載される条件もしくは障害、例えば肺の障害（例えば、ＣＦまたはＣＯＰＤ）または炎症性障害（例えば、ＩＢＤまたはＲＡ）を処置するための第二の因子を含んでもよい。あるいは、他の成分が、このキット中に、ただしこの化合物とは異なる組成物または容器中に含まれてもよい。このような実施形態では、キットは、化合物および他の成分を混合するため、またはこの化合物を他の成分と一緒に用いるための指示書を備えてもよい。
この化合物は、任意の形態で、例えば、液体、乾燥または凍結乾燥型で提供されてもよい。この化合物は実質的に純粋および／または無菌であることが好ましい。この化合物が液体溶液に提供される場合、この液体溶液は好ましくは、水溶液であり、無菌水溶液が好ましい。この化合物が乾燥型で提供される場合、再構成は一般に、適切な溶媒の添加による。この溶媒、例えば、滅菌水または緩衝液を、必要に応じてこのキットに備えてもよい。
このキットは、この化合物を含む組成物のための１つ以上の容器を備えてもよい。ある実施形態では、キットは、この組成物および情報物のために、別々の容器、分配器または区画を備える。例えば、この組成物は、ボトル、バイアルまたはシリンジ中に含まれてもよく、そしてこの情報物は、プラスチックのスリーブまたはパケットに含まれてもよい。他の実施形態では、このキットの別の構成要素は単一の分割されてない容器内に含まれる。例えば、この組成物は、表示の形態で情報物に付着されているボトル、バイアルまたはシリンジに含まれる。ある実施形態では、キットは複数の（例えば、パック）の個々の容器を備え、この各々がこの化合物の１つ以上の単位投薬形態（例えば、本明細書に記載される投薬形態）を含む。例えば、このキットは、複数のシリンジ、アンプル、フォイルパケットまたはブリスターパックを備え、この各々がこの化合物の単一の単位用量を含む。このキットの容器は、気密、防水（例えば、湿度または蒸発における変化に対して不浸透性）および／または遮光であってもよい。
この化合物がエラスターゼに結合するポリペプチドを含む１実施形態では、診断の適用のための指示書は、インビトロにおいて、例えば、サンプル、例えば、肺の障害を有する患者由来の生検もしくは細胞中において、またはインビボにおいて、エラスターゼを検出するための化合物の使用を含む。別の実施形態では、治療適用のための指示書は、肺障害を有する患者における、示唆された投薬量および／または投与の方式を含む。このキットはさらに、必要に応じて処方された、少なくとも１つのさらなる試薬、例えば、診断剤もしくは治療剤、例えば本明細書において上記されるような診断剤もしくは治療剤、および／または肺障害を処置するための１つ以上のさらなる因子（例えば、別のエラスターゼインヒビター）を、１つ以上の別の薬学的な調製物中に含んでもよい。
（処置）
（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと（ｉｉ）化合物の分子量を増大する部分（例えばポリマー）とを含む化合物は、治療または予防の有用性を有する。
（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと（ｉｉ）化合物の分子量を増大する部分（例えばポリマー）とを含む化合物は、治療または予防の有用性を有する。
１実施形態では、このポリペプチドは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、またはエラスターゼ、例えば、好中球エラスターゼを阻害する他のインヒビターを含む。この化合物は、種々の障害、例えば、望ましくない、または異常なエラスターゼ活性によって特徴付けられる疾患を処置、予防および／または診断するために被験体に投与され得る。例えば、この疾患または障害は、好中球のエラスターゼ分解活性の向上によって特徴づけられ得る。この疾患または障害は、組織、例えば、肺の上皮表面のような上皮組織上に負荷された好中球の増大から生じ得る。例えば、エラスターゼを阻害するポリペプチドは、嚢胞性線維症（ＣＦ）または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、例えば、肺気腫のような肺疾患を処置または防止するために用いられ得る。この化合物はまた、組織中で、例えば、インビトロまたはエキソビボで細胞、組織または器官に投与され得る。
他のプロテアーゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドを用いて、このような他のそれぞれのプロテアーゼの活性と関連する障害を処置または予防し得る。
本明細書において用いる場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと（ｉｉ）化合物の分子量を増大する部分（例えばポリマー）とを含む化合物の、単独でのまたは第二の因子と組み合わせての、被験体、例えば、患者への適用もしくは投与、または被験体、例えば、障害（例えば、本明細書に記載されるような障害）、障害の症状もしくは障害に向かう素因を有する患者から単離された組織もしくは細胞、例えば細胞株へのこの因子の適用もしくは投与であって、この障害、障害の症状もしくは障害に向かう素因を治療、治癒、緩和、救済、変更、修復、寛解、改善もしくは影響する目的での適用もしくは投与として規定される。細胞を処置するとは、インビトロまたはインビボにおける細胞の阻害、切除、殺傷、そうでなければ、細胞、例えば異常な細胞の能力を低下させて障害、例えば、本明細書に記載される障害（例えば肺障害）を調停させることをいう。１実施形態では、「細胞を処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ ａ ｃｅｌｌ）」とは、細胞、例えば、白血球または好中球の活性および／または増殖における軽減をいう。このような軽減は、細胞の全体的な排除を示す必要はないが、軽減、例えば、細胞の活性または数における統計学的に有意な軽減を示す。
本明細書において用いる場合、障害を処置するために有効なエラスターゼ結合化合物の量、すなわち「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、被験体を処置するのにおいて、例えば、このような処置の非存在下で期待される程度を超えて被験体における障害の少なくとも１つの症状を治療、緩和、救済または改善するのにおいて、この被験体に対する単回または複数回の用量の投与の際に有効である化合物の量を指す。例えば、この障害は、肺の障害、例えば、本明細書に記載される肺の障害であってもよい。
「局所的に有効な量（ｌｏｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、化合物の量（例えば、濃度）であって、組織中で、例えば、エラスターゼに曝された肺の領域で、またはエラスターゼ産生細胞、例えば好中球において、標的タンパク質（例えば、エラスターゼ）の活性を検出可能に調節するのに有効な量をいう。調節の証拠としては、例えば、基質の量の増大、例えば、細胞外マトリックスのタンパク質分解の減少を挙げることができる。
本明細書において用いる場合、障害を防止するのに有効なエラスターゼ結合化合物の量、または化合物の「予防上有効な量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、エラスターゼ結合化合物、例えば、本明細書に記載されるポリペプチド−ポリマー化合物の量であって、障害、例えば肺障害の発症または再発の予防または遅延において、被験体に対する単回または複数回の用量の投与の際に有効である量をいう。
「誘導する（ｉｎｄｕｃｅ）」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「増強する（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ）」、「上昇させる（ｅｌｅｖａｔｅ）」、「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」などの用語は、例えば、２つの状態の間の定量的な相違を意味し、これは相違、例えば、２つの状態の間の統計学的に有意な相違（たとえば、Ｐ＜０．０５、０．０２または０．０００５）をいう。
投薬レジメンは、最適の所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスが投与されてもよく、数回に分割された用量が経時的に投与されてもよく、またはこの用量は、治療状況の要件によって示されるとおり、比例して減少または増大され得る。投与の簡便性および投薬の均質性のために非経口的組成物を投薬単位形態に処方することが特に有利である。本明細書において用いられる投薬単位形態は、処置されるべき被験体のための単位投薬量として適合する物理的に別個の単位をいう；各々の単位は、必要な薬学的キャリアと会合して所望の治療効果を生じるように算出された、活性化合物の事前に決定された量を含む。
本明細書に記載される化合物の治療上または予防上有効な量の例示的な非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。この化合物は、約１〜５０ｍｇ／ｍ２または約５〜２０ｍｇ／ｍ２の用量に達するように、２０、１０、５または１ｍｇ／分未満の速度での静脈内注入によって投与され得る。投薬量の値は、軽減されるべき条件のタイプおよび重篤度によって変化し得るということが注意されるべきである。任意の特定の被験体について、特定の投薬レジメンは、個体の必要性、および組成物を投与するかまたは組成物の投与を管理する人の専門的な判定に従って経時的に調節されるべきであるということ、そして本明細書に記載される投薬範囲は例示に過ぎないということがさらに理解されるべきである。
薬学的組成物は、本明細書に記載される化合物、例えば、プロテアーゼ（例えば、エラスターゼ）に結合して阻害するポリペプチドを含む化合物の「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」または「予防上有効な量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」を包含し得る。「治療上有効な量」とは、所望の治療結果を得るための、必要な用量および期間において有効な量をいう。組成物の治療上有効な量は、固体の疾患の状態、年齢、性別および体重のような因子、ならびに個体においてこの化合物が所望の応答を惹起する能力に応じて変化し得る。治療上有効な量とはまた、組成物の任意の毒性または有害な影響を治療上有利な効果が上回る量である。「治療上有効な投薬量」は好ましくは、測定可能なパラメーター、例えば肺機能における増大を、処置されてない被験体に比較して阻害する。化合物が測定可能なパラメーターを阻害する能力は、ヒトの障害における有効性の指標である動物モデルシステムにおいて評価され得る。あるいは、組成物のこの特性は、この化合物が阻害する能力、例えば、当業者に公知のアッセイ、例えば本明細書に記載されるアッセイによりインビトロでの阻害を試験することによって評価され得る。
「予防上有効な量」とは、所望の予防結果を得るための、必要な用量および期間において有効な量をいう。代表的には、予防的な用量は、疾患の前に、または早期の段階で被験体に用いられるので、この予防上有効な量は、治療上有効な量よりも少なくてもよい。
本明細書において用いる場合、「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。本発明の「非ヒト動物（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ａｎｉｍａｌｓ）」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト哺乳動物（例えば、ニワトリ、両生類、爬虫類）および哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタなどを包含する。
１実施形態では、被験体はヒト被験体である。あるいは、この被験体は、ヒト好中球エラスターゼまたは内因性の非ヒト好中球エラスターゼタンパク質またはエラスターゼ結合化合物が交差反応するエラスターゼ様抗原を発現する非ヒト哺乳動物であってもよい。本発明の化合物は、治療目的（以下にさらに考察される）のためにヒト被験体に投与され得る。さらに、エラスターゼ結合化合物は、獣医の目的で（例えば、霊長類、ブタまたはマウス）またはヒト疾患の動物モデルとして、この化合物が結合するエラスターゼ様抗原を発現する非ヒト哺乳動物に投与され得る。後者に関して、このような動物モデルは、この化合物の治療上の有効性を評価する（例えば、投与の投薬量および時間経過の試験）ために有用であり得る。
本発明の方法は、例えばインビトロまたはエキソビボにおいて、培養物中の細胞上で用いられ得る。この方法は、インビボ（例えば、治療または予防の）プロトコールの一部として、被験体に存在する細胞で行うことができる。インビボの実施形態については、接触工程は、被験体において発揮され、そして被験体において標的（例えば、エラスターゼ）に対する化合物の両方の結合を可能にするのに有効な条件下で、この被験体に対してエラスターゼ結合化合物を投与する工程を包含する。
エラスターゼを阻害する化合物は、エラスターゼ媒介性の分解およびその後遺症、例えば、組織の破壊（例えば、気道上皮の破壊）をもたらす、持続的な感染および炎症を軽減し得る。
化合物を投与する方法は、「薬学的組成物（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」において記載される。用いられる化合物の適切な投与量は、被験体の年齢および体重、ならびに用いられる特定の薬物に依存する。この化合物を競合因子として用いて、例えば、天然または病的な因子とエラスターゼとの間、例えば、細胞外基質とエラスターゼとの間の所望されない相互作用を阻害、軽減し得る。
１実施形態では、この化合物を用いて、インビボでエラスターゼを発現する細胞を殺傷または切断する。この化合物は、それ自体で用いられてもよいし、または因子、例えば、細胞毒性薬物、放射性同位元素に対して結合体化されてもよい。この方法は、化合物単独または細胞毒性薬物と結合された化合物を、このような処置を要する被験体に対して投与する工程を包含する。
「細胞毒性因子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）」および「細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」という用語は、成長または増殖を阻害する特性を有する因子（例えば、細胞増殖抑制因子）、または細胞の殺傷を誘導する特性を有する因子をいう。
Ｋｕｎｉｔｚドメインおよびある部分を含むポリペプチドを含む化合物は、治療薬、放射線を発する化合物、植物、真菌または細菌由来の分子、生物学的タンパク質、およびそれらの混合物を含む、種々の薬物を送達するためにも用いられ得る。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを用いて、Ｋｕｎｉｔｚドメインと特異的に相互作用するプロテアーゼを含む被験体の領域に対する荷重を目標とすることができる。
酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｎｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サクリン、特定のＡｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、特定のＤｉａｎｔｈｉｎタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｒｏｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クリシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトジリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシンおよびエノマイシンによって例示される。免疫毒素の酵素的に活性なポリペプチドを調製するための手順は、ＷＯ８４／０３５０８およびＷＯ８５／０３５０８に記載される。抗体に対して結合体化され得る細胞毒性部分の例としては、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキセート、ネオカルジノスタチンおよび白金が挙げられる。
ポリペプチド毒素の場合、組み換え核酸技術を用いて、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドおよび細胞毒素（またはそのポリペプチド成分）をコードする核酸を翻訳融合物として構築し得る。次いで、この組み換え核酸を、例えば、細胞中で発現して、コードされた融合ポリペプチドを単離する。次いでこの融合タンパク質を、例えば、インビボでの半減期を安定化させるために、この化合物の分子量を増大する部分と物理的に会合させて、次いである部分（例えば、ポリマー）に結合させる。
タンパク質を細胞毒性因子と結合体化させるための手順は、以前に記載されている。クロラムブシルとタンパク質との結合体化については、例えば、Ｆｌｅｃｈｎｅｒ（１９７３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，９：７４１−７４５；Ｇｈｏｓｅら（１９７２）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，３：４９５−４９９；およびＳｚｅｋｅｒｋｅら（１９７２）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ，１９：２１１−２１５を参照のこと。タンパク質に対するダウノマイシンおよびアドリアマイシンの結合体化については、例えば、Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｅ．ら（１９７５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１１７５−１１８１、およびＡｒｎｏｎら（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ，１：４２９−４４９を参照のこと。タンパク質−リシン結合体の調製については、例えば、米国特許第４，４１４，１４８号、およびＯｓａｗａ，Ｔ．らによる（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ，１：３７３−３８８、そしてそこに引用される参考文献を参照のこと。カップリング手順はまた、欧州特許第２２６ ４１９号に記載される。
本発明によってまた包含されるのは、予防用の化合物を用いる工程を包含する、殺傷または切除の方法である。例えば、これらの物質は、肺疾患の発生または進行を予防または遅延させるために用いられ得る。
肺疾患を処置するための本発明の治療方法の使用は多数の利点を有する。この化合物のポリペプチド部分は、エラスターゼを特異的に認識するので、他の組織をとっておいて、高レベルの因子を治療が必要な部位に直接送達する。本発明による処置は、臨床パラメーターを用いて有効にモニターされ得る。あるいは、これらのパラメーターを用いて、このような処置が使用されなければならない時を示すことができる。
（肺障害およびそのための方法および処方物）
ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドは、肺障害、例えば、肺気腫、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺高血圧症、急性呼吸窮迫症候群、間質性肺炎、喘息、タバコ中毒症（ｓｍｏｋｅ ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）、気管支肺異形成症、肺炎、熱傷および肺移植片拒絶反応を処置するために用いられ得る。
ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドは、肺障害、例えば、肺気腫、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺高血圧症、急性呼吸窮迫症候群、間質性肺炎、喘息、タバコ中毒症（ｓｍｏｋｅ ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）、気管支肺異形成症、肺炎、熱傷および肺移植片拒絶反応を処置するために用いられ得る。
嚢胞性線維症。嚢胞性線維症（ＣＦ）は、米国において約３０，０００例の小児および成人に影響する遺伝的疾患である。ＣＦ遺伝子の欠損は、身体を異常に厚くさせ、肺を詰まらせるべとつく粘液を生じ、そして生命にかかわる肺の感染をもたらす。遺伝的障害の診断は、汗の試験を包含し、これはガーゼおよび濾紙で収集した汗の中の塩化物の濃度を測定する工程、ガーゼまたは濾紙上に収集した汗の中のナトリウム濃度、ならびに汗の収集物中のピロカルピン送達および現在の密度を測定する工程を包含し得る。ＣＦを生じる遺伝子は、同定されており、そしてこの遺伝子中の多数の変異が公知である。
１実施形態では、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドは、ＣＦの少なくとも１つの症状を寛解するために、例えば、ＣＦ患者の肺における肺病変を軽減するために用いられる。
本化合物はまた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の少なくとも１つの症状を寛解するために用いられ得る。肺気腫は慢性気管支炎とともに、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の一部である。これは重篤な肺疾患であり、そして進行性で、高齢の患者に通常存在する。ＣＯＰＤは、肺胞または気嚢として公知の肺における構造の過剰膨張を生じる。肺胞の壁の破壊は、肺の呼吸能力の低下を生じる。この疾患を有する患者は、最初に息切れおよび咳を経験し得る。ＣＯＰＤを評価するための臨床的指数の１つは、肺胞中隔の損傷および肺気腫の指標を測定する、破壊係数（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）であり、機能的な異常、特に弾性収縮力の損失を密接に反映する肺破壊の鋭敏な指数として提唱されている。例えば、Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １９９１ Ｊｕｌ；１４４（１）：１５６〜９を参照のこと。この化合物を用いて、患者の破壊係数を、例えば、統計学的に有意な量、例えば、相当する年齢および性別の適合する個体の正常値の少なくとも１０、２０、３０もしくは４０％、または少なくとも５０、４０、３０もしくは２０％低下させることができる。
１局面では、本発明は、肺の障害（例えば、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ）の処置のための部分に物理的に会合するｈＮＥインヒビターポリペプチドを含む組成物を提供する。この組成物は、吸入または他の方式の肺送達のために処方され得る。従って、本明細書に記載される化合物は、吸入によって肺疾患に対して投与され得る。「肺組織（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｉｓｓｕｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、呼吸器の任意の組織を指し、これは、他に示す場合を除いて、上気道および下気道の両方を含む。ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドは、肺疾患を処置するために１つ以上の既存の様式と組み合わせて投与され得る。
１実施例ではこの化合物は、ネブライザーのために処方される。１実施形態では、この化合物は、凍結乾燥型で（例えば、室温で）保管されて、吸入の前に溶液に再構成されてもよい。
医療デバイス、例えば、吸入器を用いる吸入のためにこの化合物を処方することもできる。例えば、米国特許第６，１０２，０３５号（粉末吸入器）および同第６，０１２，４５４号（乾燥粉末吸入器）を参照のこと。１実施形態では、吸入器は、定量吸入器である。
肺の気道に対して局所的に薬物を送達するために用いられる３つの共通のシステムとしては、乾燥粉末吸入器（ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ ｉｎｈａｌｅｒｓ）（ＤＰＩｓ）、定量吸入器（ＭＤＩｓ）およびネブライザーが挙げられる。ＭＤＩｓは、吸入投与の最も一般的な方法であり、可溶化型でまたは分散として医薬を送達するために用いられ得る。代表的にはＭＤＩｓは、Ｆｒｅｏｎまたは他の比較的高い蒸気圧の噴霧剤を含み、これがこのデバイスの起動の際にエアロゾル化した医薬を気道に差し向ける。ＭＩＤｓと異なり、ＤＰＩｓは一般に、患者の吸気力に対して完全に依存して、医薬を乾燥粉末型で肺に導入する。ネブライザーは液体溶液にエネルギーを付与することによって、吸入される医薬エアロゾルを形成する。フルオロケミカル培地を用いる液体換気または肺洗浄の間の薬物の直接の肺送達も探索されている。これらおよび他の方法を用いて、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドを送達することができる。
例えば、吸入による投与のためには、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドは、適切な噴霧剤を含む圧縮容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。この化合物は、乾燥粒子の形態であっても液体としてでもよい。この化合物を含む粒子は、例えば、噴霧乾燥によって、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドの水溶液を充填中和剤とともに乾燥すること、次いでこの乾燥粉末から粒子を作製することによって、または有機修飾因子中で水溶液を乾燥すること、次いでこの乾燥粉末から粒子を作製することによって、調製され得る。
この化合物は、安定な噴霧剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジエリルオロテトラフルオロクトリアン（ｄｉｅｌｉｌｏｒｏｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｃｔｌｉａｎｅ）、二酸化炭素または他の適切なガスの使用によって、圧縮パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で便利に送達され得る。圧縮エアロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するようなバルブを設けることによって決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）における使用のためのカプセルおよびカートリッジは、粒子が処方された粒子である場合、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドと適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンとの粉末混合物を含んで処方されてもよい。処方されるかまたは処方されていない化合物に加えて、他の物質、例えば、１００％ＤＰＰＣまたは他のサーファクタントを、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドと混合して、処方されるかまたは処方されていない化合物の送達および分散を促進することができる。乾燥粒子を調製する方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／３２４０６号に記載されている。
ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドは、例えば、乾燥エアロゾル粒子として投与された場合、急速に吸収されて、急速な局所または全身の治療結果を生じ得る。投与は、投与の２分、５分、１時間、または３時間内に検出可能な活性を提供するように調整され得る。ある実施形態では、ピーク活性は、例えば、３０分または１０分以内でさえ、さらに迅速に達成され得る。あるいは、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドは、より長い生物学的半減期のために処方されてもよく、他の投与方式の代替として用いられてもよく、例えば、その結果、この化合物は肺からの循環に入って、他の器官または特定の標的器官に対して分布される。
１実施形態では、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドは、このポリペプチドの少なくとも５％の量が下気道または肺深部に送達されるような量で送達される。肺深部は、毛細血管網が極めて富んでいる。肺胞空隙から毛細管管腔を隔てる呼吸器膜は極めて薄く（≦６μｍ）、かつ極めて透過性である。さらに、肺胞表面に位置する液体層は、肺サーファクタントに富んでいる。他の実施形態では、ある部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドの組成物の少なくとも２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％が、下気道に、または肺深部に送達される。これらの組織のいずれかまたは両方に対する送達によってこの化合物の効率的な吸収および高いバイオアベイラビリティが生じる。１実施形態では、この化合物は、例えば、吸入器またはネブライザーを用いて定量で提供される。例えば、この化合物は、少なくとも約０．０２、０．１、０．５、１、１．５、２、５、１０、２０、４０または５０ｍｇ／ｐｕｆｆ以上の投薬単位形態で送達される。
バイオアベイラビリティの割合は、以下のように算出され得る：バイオアベイラビリティのパーセント＝（ＡＵＣｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ／ＡＵＣｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．）×（ｄｏｓｅｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．／ｄｏｓｅｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）×１００。
必須ではないが、送達増強因子、例えば、サーファクタントを用いて肺送達をさらに増強し得る。本明細書において用いる場合、「サーファクタント（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）」とは、親水性部分および親油性部分を有する化合物であって、２つの不混和性の層の間の界面と相互作用することによって薬物の吸収を促進する化合物をいう。サーファクタントは、いくつかの理由、例えば、粒子凝集作用の低下、マクロファージ食作用の低下などによって乾燥粒子中で有用である。肺サーファクタントとカップリングされた場合、ＤＰＰＣのようなサーファクタントは、この化合物の拡散を大きく促進するので、この化合物のさらに有効な吸収が達成され得る。サーファクタントは当該分野で周知であり、そして限定はしないが、ホスホグリセリド、例えば、ホスファチジルコリン、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジパルミトイル（ＤＰＰＣ）およびジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；ヘキサデカノール；脂肪酸；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリオキシエチレン−９−；アウリル（ａｕｒｙｌ）エーテル；パルミチン酸；オレイン酸；ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ ８５）；グリココール酸塩；サルファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）；ポロキソマー（ｐｏｌｏｘｏｍｅｒ）；ソルビタン脂肪酸エステル；ソルビタントリオレアート；チロキサポール；およびリン脂質が挙げられる。
（ＩＢＤならびにその方法および処方物）
１実施形態では、エラスターゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含み、そして化合物の分子量を増大する部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドを用いて、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病の少なくとも１つの症状を寛解する。
１実施形態では、エラスターゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含み、そして化合物の分子量を増大する部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドを用いて、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病の少なくとも１つの症状を寛解する。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、一般に慢性であり、腸の炎症を再発する。ＩＢＤとは、２つの別個の障害、クローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）をいう。両方の疾患は、ＧＩ管抗原に対する調節のない免疫応答、粘膜障壁の裂け目、および／または腸の持続的な感染に対する有害な炎症性反応のいずれかを含み得る（例えば、ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｒ．Ｐ．，Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，３１：９０７：〜９１６（１９９６）を参照のこと）。
ＩＢＤを有する患者では、腸の内側の裏層の潰瘍および炎症が、腹部疼痛、下痢および直腸の出血の症状をもたらす。潰瘍性大腸炎は、大腸で生じるが、クローン病では、疾患は、ＧＩ管全体ならびに小腸および大腸に関与し得る。ほとんどの患者については、ＩＢＤは、慢性の状態であって、数ヶ月から数年の期間にわたって症状を伴う。ＩＢＤの臨床症状は、間欠的な直腸出血、けいれん性の腹痛、体重減少および下痢である。ＩＢＤの診断は、臨床症状、バリウム注腸の使用に基づくが、直接の資格化（Ｓ字結腸鏡検査または結腸鏡検査）が最も正確な検査である。
ＩＢＤの症状としては、例えば、腹痛、下痢、直腸出血、体重減少、発熱、食欲減退および他のさらに重篤な合併症、例えば、脱水、貧血、栄養失調が挙げられる。このような多数の症状を定量的分析（例えば、体重減少、発熱、貧血など）に供する。いくつかの症状は血液検査（例えば、貧血）、または血液の存在を検出する検査（例えば、直腸出血）によって、容易に決定される。潰瘍性大腸炎の臨床活性係数（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ ｆｏｒ Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ）のような臨床的な指標を用いて、ＩＢＤをモニターすることもできる。例えば、Ｗａｌｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ．１９９８ Ｊｕｌ；４３（１）：２９〜３２、およびＪｏｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３８（２）：１６４〜７１を参照のこと。
１実施形態では、潰瘍性大腸炎を有するかまたは潰瘍性大腸炎を有する素因のある被験体に対する化合物の投与によって、この係数の改善、例えば、この係数の統計学的に有意な変化が生じる。この化合物は、ある部分（例えば、親水性ポリマー）に物理的に会合されているｈＮＥインヒビターポリペプチドを含む。
１実施形態では、ＩＢＤを有するかＩＢＤを有する素因のある被験体に対するこの化合物の投与は、ＩＢＤの少なくとも１つの症状の寛解を生じる。
特発性の炎症性腸疾患であるクローン病は、胃腸管の種々の部位における慢性の炎症によって特徴付けられる。クローン病は最も一般的には回腸末端部および大腸に影響するが、これは、口から肛門および肛門周辺の領域にわたる胃腸管の任意の部分において顕在化し得る。クローン病の予測および診断は、臨床的な係数、例えば、クローン病活性係数（Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）を用いて測定され得る。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｕｌｙ／Ａｕｇ １９９７，およびＢｅｓｔ Ｗ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ．」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ７０：４３９〜４４４，１９７６を参照のこと。１実施形態では、クローン病を有するかまたはその素因のある被験体に対するこの化合物の投与によって、この係数の改善、例えば、この係数の統計学的に有意な変化、またはクローン病の少なくとも１つの症状の寛解が生じる。
従って、１局面では、本発明は、腸の疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病またはＩＢＰのような大腸炎）または他の胃腸もしくは直腸の疾患の処置のためのｈＮＥインヒビターポリペプチドを含む組成物を提供する。このｈＮＥインヒビターポリペプチドは、エラスターゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含み、そして化合物の分子量を増大する部分（例えば、ポリマー）と物理的に会合されている。この組成物は、坐剤として処方され得る。
坐剤は、室温では固体状態を維持し、そして体温では融解するという特徴を有する、基剤成分、例えば、ワックス、オイルおよび脂肪アルコールを用いて処方され得る。本発明の活性成分は、必要に応じてヒドロコルチゾン（１．０％）のような治療成分の有無によって、ベンゾカイン（１．０〜６．０％）のような局所麻酔薬または既に挙げられた他のものを適切なｐＨ値で調製してもよい；例えば、ｐＨ５の液体脂肪アルコール、例えば、オレイルアルコール（４５％〜６５％におよぶ）または固体の高級脂肪アルコール、例えば、セチルまたはステアリルアルコール（３０％〜５０％）。基剤成分は本産業の当該分野において周知である。例えば、米国特許第４，９４５，０８４号および同第５，１９６，４０５号を参照のこと。
この組成物は、活性成分として、クリーム、ローション、軟膏、スプレー、パッド、パッチ、浣腸剤、泡状物および坐剤などの中で、またはリポソームもしくはグリコスフェア中のマイクロカプセル封入のように送達ビヒクル中で、用いられ得る。他の送達技術としては、保護および徐放性の両方のために活性成分を捕捉している、マイクロスポンジまたは代用細胞膜（ＣｏｍｐｌｅｔｅｃｈＴＭ）が挙げられる。直腸の泡状物は、局所エアロゾル組成物として調製されてもよく、例えば、（潰瘍性大腸炎、クローン大腸炎など）を処置するためにも用いられ得る。
（診断用途）
化合物であって（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと（ｉｉ）この化合物の分子量を増大する部分（例えばポリマー）とを含む化合物はまた診断上の有用性を有する。
化合物であって（ｉ）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドと（ｉｉ）この化合物の分子量を増大する部分（例えばポリマー）とを含む化合物はまた診断上の有用性を有する。
１局面では、本発明は、インビトロ（例えば、生物学的サンプル、例えば、組織、生検において、またはインビボ（例えば、被験体におけるインビボ画像化）において、エラスターゼタンパク質の存在を検出するための診断方法を提供する。この方法は、（ｉ）サンプルと、ポリペプチドおよびポリマーを含む化合物とを接触させる工程であって、このポリペプチドがＫｕｎｉｔｚドメインを含み、このＫｕｎｉｔｚドメインがエラスターゼに結合する工程と；（ｉｉ）エラスターゼリガンドとサンプルとの間の複合体の形成を検出する工程とを包含する。この方法はまた、参照サンプル（例えば、コントロールサンプル）とリガンドとを接触させる工程と、このリガンドとサンプルとの間の複合体の形成の、参照サンプルについての複合体の形成に対する程度を決定する工程とを包含する。サンプルまたは被験体における複合体の形成における、コントロールのサンプルまたは被験体と比較した、変化、例えば統計学的に有意な変化は、サンプル中のエラスターゼの存在の指標であり得る。
別の方法は、（ｉ）被験体に対して化合物を投与する工程と；（ｉｉｉ）化合物と標的エラスターゼとの間の複合体の形成を決定する工程とを包含する。この検出工程は、複合体の形成の位置または時間を決定する工程を包含し得る。
この化合物を、検出可能な物質で直接または間接的に標識して、結合または未結合の抗体の検出を容易にすることができる。適切な検出可能物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。
化合物とエラスターゼとの間の複合体形成は、エラスターゼに結合したリガンドまたは未結合のリガンドのいずれかを測定または可視化することによって検出され得る。従来の検出アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学を用いてもよい。さらに、この化合物を標識するために、エラスターゼの存在をサンプル中で、検出可能物質で標識された標準および未標識のエラスターゼリガンドを利用する競合イムノアッセイによってアッセイしてもよい。このアッセイの１実施例では、生物学的サンプル、標識された標準、および化合物を組み合わせて、未標識のリガンドに結合された標識標準の量を決定する。サンプル中のエラスターゼの量は、この化合物に対して結合された標識された標準の量に対して反比例する。
発蛍光団および発色団で標識したタンパク質リガンドを調製し得る。種々の適切な蛍光剤および発色団は、Ｓｔｒｙｅｒ（１９６８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６２：５２６、およびＢｒａｎｄ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４３−８６８によって記載される。タンパク質リガンドは、米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号、および同第４，３７６，１１０号に開示される手順のような従来の手順によって蛍光発色団基で標識され得る。上記の多数の所望の特性を有する１群の蛍光剤は、キサンテン色素であり、これにはフルオレセインおよびローダミンが挙げられる。別の群の蛍光化合物は、ナフチルアミンである。発蛍光団または発色団で一旦標識されれば、このタンパク質リガンドは、例えば、蛍光顕微鏡（例えば、共焦点またはデコンボリューション顕微鏡）を用いて、サンプル中のエラスターゼの存在または局在を検出するために用いられ得る。
（タンパク質アレイ）
この化合物はまた、タンパク質アレイ上に固定され得る。タンパク質アレイは、例えば、医学的サンプル（例えば、単離された細胞、血液、血清、生検など）をスクリーニングするために、診断ツールとして用いられ得る。ポリペプチドアレイを産生する方法は、例えば、上記されている。
この化合物はまた、タンパク質アレイ上に固定され得る。タンパク質アレイは、例えば、医学的サンプル（例えば、単離された細胞、血液、血清、生検など）をスクリーニングするために、診断ツールとして用いられ得る。ポリペプチドアレイを産生する方法は、例えば、上記されている。
（インビボ画像化）
さらに別の実施形態では、本発明は、インビボにおいてエラスターゼまたはエラスターゼ発現組織の存在を検出するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）被験体（例えば、肺または呼吸器の障害を有する患者）に対して、検出可能マーカーに結合体化されたエラスターゼ結合化合物を投与する工程と、（ｉｉ）エラスターゼ発現組織または細胞に対するこの検出可能マーカーを検出するための手段に対してこの被験体を曝す工程とを包含する。例えば、この被験体は、ＮＭＲまたは他の断層撮影法によって画像化される。
さらに別の実施形態では、本発明は、インビボにおいてエラスターゼまたはエラスターゼ発現組織の存在を検出するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）被験体（例えば、肺または呼吸器の障害を有する患者）に対して、検出可能マーカーに結合体化されたエラスターゼ結合化合物を投与する工程と、（ｉｉ）エラスターゼ発現組織または細胞に対するこの検出可能マーカーを検出するための手段に対してこの被験体を曝す工程とを包含する。例えば、この被験体は、ＮＭＲまたは他の断層撮影法によって画像化される。
本発明による診断画像化のために有用な標識の例としては、放射性標識、例えば、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈ、蛍光標識、例えば、フルオレセインおよびローダミン、核磁気共鳴放射性標識、ポジトロン放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーによって検出可能なポジトロン放出同位体、化学発光剤、例えば、ルシフェリンおよび酵素マーカー、例えば、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼが挙げられる。短距離発光体、例えば、短距離の検出器プローブによって検出可能な同位体も使用することができる。エラスターゼ結合化合物は、公知の技術を用いてこのような試薬で標識され得る。例えば、タンパク質の放射性標識に関する技術については、ＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋそしてＤ．Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６を参照のこと。
本発明の放射性化合物はまた、インビトロ診断試験のために用いられ得る。同位体で標識された化合物の比活性は、半減期、放射性標識の同位体純度、およびこの標識がこの化合物に組み込まれる方法に依存する。
放射性同位体（例えば、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、１３１Ｉ）を用いてポリペプチド（例えば、化合物のポリペプチド部分）を標識するための手順は、一般に公知である。例えば、トリチウム標識手順は、米国特許第４，３０２，４３８号に記載される。ヨウ素化、トリチウム標識および３５Ｓ標識手順は、例えば、マウスモノクローナル抗体について適合される場合、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第２版、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｏｒｌａｎｄｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６．ｐｐ １２４−１２６）、およびそこに引用される引用文献によって記載されている。ポリペプチドをヨウ素化するための他の手順は、ＨｕｎｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５，Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４−１０２１、ならびに米国特許第３，８６７，５１７号、および同第４，３７６，１１０号に記載される。画像化に有用である放射性標識元素としては、例えば、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、および９９ｍＴｃが挙げられる。ポリペプチドをヨウ素化するための手順は、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８９：１１４−１２３；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，Ｊ．（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３：２９９−３０５；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９７１）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８９−２９７によって記載される。９９ｍＴｃ−標識のための手順は、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌによって、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（編），Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｓｓｏｎ １１１−１２３（１９８２）、およびそこに引用されている参考文献によって記載される。１１１Ｉｎ−標識抗体に適切な手順は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：１４７−１５７、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ，３５：５５４−５５７、およびＢｕｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．１６６：２０２−２０４によって記載される。
放射性標識された化合物の場合、この化合物は、患者に投与され、この化合物が相互作用する抗原がこの組織に局在され、そして例えば、ガンマ線カメラまたはエミッショントモグラフィーを用いる放射性核種スキャンニングのような公知の技術を用いてインビボで検出すなわち「画像化（ｉｍａｇｅｄ）」される。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍａｇｉｎｇ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，（編），ｐｐ６５〜８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）を参照のこと。あるいは、ポジトロン放射形横断断層撮影スキャナー（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓａｘｉａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｓｃａｎｎｅｒ）、例えば、指定済みの、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに位置するＰｅｔ ＶＩを用いてもよく、ここでは放射性標識がポジトロン（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）を放射する。
（ＭＲＩ造影剤）
磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）は、ＮＭＲを用いて、生きている被験体の内部の特徴を可視化し、予測、診断、処置および手術に有用である。ＭＲＩは、放射性の微量の化合物なしの明白な利点について用いられ得る。いくつかのＭＲＩ技術は、ＥＰ−Ａ−０ ５０２ ８１４にまとめられる。一般には、異なる環境における水プロトンの緩和時間定数Ｔ１およびＴ２に関する相違を用いて画像を生成する。しかし、これらの相違は、鮮明な高解像度の画像を提供するために十分であり得る。
磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）は、ＮＭＲを用いて、生きている被験体の内部の特徴を可視化し、予測、診断、処置および手術に有用である。ＭＲＩは、放射性の微量の化合物なしの明白な利点について用いられ得る。いくつかのＭＲＩ技術は、ＥＰ−Ａ−０ ５０２ ８１４にまとめられる。一般には、異なる環境における水プロトンの緩和時間定数Ｔ１およびＴ２に関する相違を用いて画像を生成する。しかし、これらの相違は、鮮明な高解像度の画像を提供するために十分であり得る。
これらの緩和時間定数の相違は、造影剤によって増強され得る。このような造影剤の例としては、多数の磁性剤 常磁性剤（主にＴ１を変化する）および強磁性または超常磁性（主にＴ２応答を変える）が挙げられる。キレート（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡおよびＮＴＡキレート）を用いて、いくつかの常磁性物質（例えば、Ｆｅ＋３、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３）を付着（そして毒性を減少）することができる。他の因子は、粒子の形態で、例えば、１０μｍ未満〜約１０ｎＭの直径であってもよい。粒子は、強磁性、反強磁性または超常磁性の特性を有し得る。粒子は、例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライトおよび他の遷移元素の磁性無機化合物を包含し得る。磁性粒子は、非磁性物質の有無とともに１つ以上の磁性結晶を含んでもよい。非磁性材料は、合成または天然のポリマー（例えば、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなど）を含み得る。
この化合物はまた、ＮＭＲ活性１９Ｆ原子または複数のこのような原子を含む指示基で標識されてもよく、従って、（ｉ）天然に豊富なフッ素原子の実質的に全てが１９Ｆ同位体であり、従って実質的に全てのフッ素含有化合物がＮＭＲ活性であり；（ｉｉ）多くの化学的に活性なポリフッ素化化合物、例えば、トリフルオロ酢酸無水物が比較的低コストで市販されており、そして（ｉｉｉ）ヘモグロビン代用として酸素を担持するために利用される過フッ化ポリエーテルのような、多くのフッ素化化合物が、ヒトでの使用のために医学的に適用可能であることが見出されている。このような時間、インキュベーションをさせた後、ＭＲＩ全体を、Ｐｙｋｅｔｔ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４６：７８−８８に記載された装置の１つのような装置を用いて行って、ガン性の組織を位置決めして画像化する。
また、エラスターゼに結合する化合物を備えるキット、ならびに使用、例えば、その化合物（例えば、エラスターゼ結合ポリペプチドおよびポリマーを含む）の使用のための装置であって、インビトロで、例えば、サンプル、例えば、肺の障害を有する患者由来の生検もしくは細胞において、またはエキソビボで、例えば、被験体を画像化することによって、エラスターゼを検出するための装置も本発明の範囲内である。このキットはさらに少なくとも１つのさらなる試薬、例えば、標識またはさらなる診断剤を含む。インビボでの使用のためには、この化合物は、薬学的組成物として処方され得る。
ヒト好中球エラスターゼの例示的アミノ酸配列：
（また、ｇｉ｜４５０３５４９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１９６３．１｜ｅｌａｓｔａｓｅ ２，好中球［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］としてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に挙げられる）
（また、ｇｉ｜４５０３５４９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１９６３．１｜ｅｌａｓｔａｓｅ ２，好中球［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］としてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に挙げられる）
（また、ｇｉ｜４５０３５４８｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１９７２．１｜Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｅｌａｓｔａｓｅ ２，好中球（ＥＬＡ２）、ｍＲＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に挙げられる）
ペプチドおよび低分子タンパク質は、インビボにおいて循環から急速に排出される。この急速なクリアランスはしばしば、治療効力を大きく制限する。治療効果を達成するためには高用量および頻繁な投与が必要である。ＤＸ−８９０は、５６アミノ酸から構成され、３つの分子内ジスルフィド結合を含み、そして６，２３７Ｄａの分子量を有する。ＭＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸（以下を参照のこと）のｐＨ６での使用を用いて、Ｎ末端に対して優先的にカップリングし得る。
未修飾のＤＸ−８９０は低分子のタンパク質である。
マウスでは、循環からの未修飾のＤＸ−８９０のクリアランスは、注射の３０分後に循環に残っているのはその物質の２０％未満であるという程度に速い。それより大型の哺乳動物（例えば、ヒト）における循環からのクリアランスも急速であり得る。
ＤＸ−８９０に対する単一のＰＥＧ ２０ＫＤａまたは３０ＫＤａ部分の付加によって、静脈内に送達される場合、この化合物のインビボにおける循環半減期は大きく延長される。マウスでは、一ＰＥＧ化ＤＸ−８９０のインビボ半減期は、少なくとも５倍〜１０倍（用いられるＰＥＧに依存して）延長される。ウサギでは、３０ＫＤａの一ＰＥＧ化ＤＸ−８９０は、未修飾のＤＸ−８９０に対して、インビボ半減期において少なくとも２５〜１００倍の延長（約３日めで）を示す。ＤＸ−８９０循環半減期における改善によって、治療用途のための低い用量および／または低い頻度の投与が可能になり得る。
（実施例１．ＰＥＧ化ＤＸ−８９０の調製）
（材料）
ネイティブなＤＸ−８９０（Ｍｗ＝６，３７Ｄａ，Ｄｙａｘ、ロット番号ＢＢＧ２０１６／９ ＨＩＣ２、４．４６ｍｇ／ｍｌ）
ＭＡＳＰＡ２０Ｋ（Ｍｗ＝２１，６００，Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ロット番号ＰＴ−Ｏ５Ｃ−１１）
ＭＡＳＰＡ３０Ｋ（Ｍｎ＝３１，３００，Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ロット番号ＰＴ−Ｏ５Ｃ−１２）
リン酸二水素ナトリウム、一水和物（Ｆｉｓｈｅｒ，ＦＷ １３７．９９、ロット番号０１５５０７Ｂ）
リン酸水素二ナトリウム、無水物（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＦＷ １４１．９６、ロット番号１２７０７４−１ １７６１７）
水酸化ナトリウム、Ａ．Ｃ．Ｓ．認定（Ｆｉｓｈｅｒ，ＦＷ ４０．００、ロット番号９９５３１２）
塩化ナトリウム、Ａ．Ｃ．Ｓ．認定（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ、１０×、タンパク質電気泳動緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
ＳｉｇｍａＭａｒｋｅｒ、低レンジ（Ｍ．Ｗ．６，５００〜６６，０００）（Ｓｉｇｍａ）
ＳｉｇｍａＭａｒｋｅｒ、高レンジ（Ｍ．Ｗ．３６，０００〜２０５，０００）（Ｓｉｇｍａ）
１０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌレディー・ゲル（ｒｅａｄｙ ｇｅｌ）（１０ウェル、３０μｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
ＧｅｌＣｏｄｅブルー染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）
（分析方法）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。サンプルは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって特徴付けた。各々のサンプルの２０μｌを２０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と混合した後、各々のサンプル混合物を、煮沸水浴中で５分間加熱した。次いで、各々のサンプルを１０％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌレディー・ゲル上にロードして、これをＢｉｏ−Ｒａｄが製造したＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＩＮ ３ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ電気泳動緩衝液によって２００Ｖで３０分間、泳動した。
（材料）
ネイティブなＤＸ−８９０（Ｍｗ＝６，３７Ｄａ，Ｄｙａｘ、ロット番号ＢＢＧ２０１６／９ ＨＩＣ２、４．４６ｍｇ／ｍｌ）
ＭＡＳＰＡ２０Ｋ（Ｍｗ＝２１，６００，Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ロット番号ＰＴ−Ｏ５Ｃ−１１）
ＭＡＳＰＡ３０Ｋ（Ｍｎ＝３１，３００，Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ロット番号ＰＴ−Ｏ５Ｃ−１２）
リン酸二水素ナトリウム、一水和物（Ｆｉｓｈｅｒ，ＦＷ １３７．９９、ロット番号０１５５０７Ｂ）
リン酸水素二ナトリウム、無水物（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＦＷ １４１．９６、ロット番号１２７０７４−１ １７６１７）
水酸化ナトリウム、Ａ．Ｃ．Ｓ．認定（Ｆｉｓｈｅｒ，ＦＷ ４０．００、ロット番号９９５３１２）
塩化ナトリウム、Ａ．Ｃ．Ｓ．認定（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ、１０×、タンパク質電気泳動緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
ＳｉｇｍａＭａｒｋｅｒ、低レンジ（Ｍ．Ｗ．６，５００〜６６，０００）（Ｓｉｇｍａ）
ＳｉｇｍａＭａｒｋｅｒ、高レンジ（Ｍ．Ｗ．３６，０００〜２０５，０００）（Ｓｉｇｍａ）
１０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌレディー・ゲル（ｒｅａｄｙ ｇｅｌ）（１０ウェル、３０μｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
ＧｅｌＣｏｄｅブルー染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）
（分析方法）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。サンプルは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって特徴付けた。各々のサンプルの２０μｌを２０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と混合した後、各々のサンプル混合物を、煮沸水浴中で５分間加熱した。次いで、各々のサンプルを１０％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌレディー・ゲル上にロードして、これをＢｉｏ−Ｒａｄが製造したＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＩＮ ３ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ電気泳動緩衝液によって２００Ｖで３０分間、泳動した。
（ＤＸ−８９０のＰＥＧ化および精製）
（１．ランダムな部位の修飾）
（１．１ ＭＰＥＧ−ＳＰＡ２０Ｋを用いるｐＨ７．４でのＤＸ−８９０のＰＥＧ化）
ＤＸ−８９０（４．４６ｍｇ／ｍｌのストック溶液）を、ｐＨ７．４でＭＰＥＧ−ＳＰＡ２０Ｋと反応させた。この反応をクエンチした後、ＰＥＧ化反応混合物を精製するまで−２０℃で保管した。
（１．ランダムな部位の修飾）
（１．１ ＭＰＥＧ−ＳＰＡ２０Ｋを用いるｐＨ７．４でのＤＸ−８９０のＰＥＧ化）
ＤＸ−８９０（４．４６ｍｇ／ｍｌのストック溶液）を、ｐＨ７．４でＭＰＥＧ−ＳＰＡ２０Ｋと反応させた。この反応をクエンチした後、ＰＥＧ化反応混合物を精製するまで−２０℃で保管した。
ＰＥＧ化した反応混合物を解凍した後、その溶液を一晩凍結乾燥した。翌日、その粗ＰＥＧ化タンパク質をイオン交換カラム上にロードした。純粋な一ＰＥＧ化したＤＸ−８９０を含む７〜１５の画分を収集し（図１）、次いで、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析した。透析後、一ＰＥＧ化タンパク質を、−４℃でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０を用いて、４９００×ｇでの遠心分離中で溶液をスピンさせることによって遠心分離させた。
濃縮されたタンパク質を０．２２μｍの細孔サイズのシリンジフィルターを通して濾過した。この一ＰＥＧ化タンパク質を−２０℃で保管した。
（１．２ ＭＰＥＧ−ＳＰＡ３０Ｋを用いたｐＨ７．４でのＤＸ−８９０のＰＥＧ化）
ＤＸ−８９０（４．４６ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）を、ｐＨ７．４でＭＰＥＧ−ＳＰＡ３０Ｋと反応させた。反応をクエンチさせた後、ＰＥＧ化反応混合物を、精製するまで−２０℃で保管した。
ＤＸ−８９０（４．４６ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）を、ｐＨ７．４でＭＰＥＧ−ＳＰＡ３０Ｋと反応させた。反応をクエンチさせた後、ＰＥＧ化反応混合物を、精製するまで−２０℃で保管した。
ＰＥＧ化した反応混合物を解凍した後、その溶液を一晩透析した。翌日、粗ＰＥＧ化タンパク質をイオン交換カラムにロードした。純粋な一ＰＥＧ化ＤＸ−８９０を含む１８〜２４の画分を収集して（図２）、次いで１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析した。透析後、一ＰＥＧ化タンパク質を、−４℃でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０を用いて、４９００×ｇでの遠心分離中で溶液をスピンさせることによって遠心分離させた。
濃縮されたタンパク質を０．２２μｍの細孔サイズのシリンジフィルターを通して濾過した。この一ＰＥＧ化タンパク質を−２０℃で保管した。
（２．Ｎ末端部位の修飾）
（２．１ ＭＰＥＧ−ＳＰＡ２０Ｋを用いたｐＨ６．０でのＤＸ−８９０のＰＥＧ化）
ＤＸ−８９０（４．４６ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）とＭＰＥＧ−ＳＰＡ２０ＫとをｐＨ６．０で反応させた。反応をクエンチさせた後、ＰＥＧ化反応混合物を、精製するまで−２０℃で保管した。
（２．１ ＭＰＥＧ−ＳＰＡ２０Ｋを用いたｐＨ６．０でのＤＸ−８９０のＰＥＧ化）
ＤＸ−８９０（４．４６ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）とＭＰＥＧ−ＳＰＡ２０ＫとをｐＨ６．０で反応させた。反応をクエンチさせた後、ＰＥＧ化反応混合物を、精製するまで−２０℃で保管した。
ＰＥＧ化した反応混合物を解凍した後、その溶液を一晩透析した。翌日、粗ＰＥＧ化タンパク質をイオン交換カラムにロードした。純粋な一ＰＥＧ化ＤＸ−８９０を含む７〜１３の画分を収集して（図３）、次いで１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析した。透析後、一ＰＥＧ化タンパク質を、−４℃でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０を用いて、４９００×ｇでの遠心分離中で溶液をスピンさせることによって遠心分離させた。
濃縮されたタンパク質を０．２２μｍの細孔サイズのシリンジフィルターを通して濾過した。この一ＰＥＧ化タンパク質を−２０℃で保管した。
（２．２ ＭＰＥＧ−ＳＰＡ３０Ｋを用いたｐＨ６．０でのＤＸ−８９０のＰＥＧ化）
ＤＸ−８９０（４．４６ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）を、ｐＨ６．０でＭＰＥＧ−ＳＰＡ３０Ｋと反応させた。反応をクエンチさせた後、ＰＥＧ化反応混合物を、精製するまで−２０℃で保管した。
ＤＸ−８９０（４．４６ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）を、ｐＨ６．０でＭＰＥＧ−ＳＰＡ３０Ｋと反応させた。反応をクエンチさせた後、ＰＥＧ化反応混合物を、精製するまで−２０℃で保管した。
ＰＥＧ化した反応混合物を解凍した後、その溶液を一晩透析した。翌日、粗ＰＥＧ化タンパク質をイオン交換カラムにロードした。純粋な一ＰＥＧ化ＤＸ−８９０を含む７〜１５の画分を収集して（図４）、次いで１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析した。透析後、一ＰＥＧ化タンパク質を、−４℃でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０を用いて、４９００×ｇでの遠心分離中で溶液をスピンさせることによって遠心分離させた。
濃縮されたタンパク質を０．２２μｍの細孔サイズのシリンジフィルターを通して濾過した。この一ＰＥＧ化タンパク質を−２０℃で保管した。
ＰＥＧ化したＤＸ−８９０調製物の各々について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、このサンプルがネイティブのタンパク質も、二ＰＥＧ化タンパク質も、複数ＰＥＧ化されたタンパク質も伴わない、実質的に全て一ＰＥＧしたＤＸ−８９０から構成されることが示される。ＰＥＧは、ゲルマトリックスを通じてＰＥＧタンパク質の遊走を歪曲し、その結果ＰＥＧ結合体はその予想分子量よりも大きいようにみえる（ＰＥＧ２０−ＤＸ−８９０について約２６ＫＤａ、そしてＰＥＧ３０−ＤＸ−８９０について約３６ｋＤａ）。
（実施例２：ＤＸ−８９０およびＰＥＧ化ＤＸ−８９０の特徴づけ）
以下のＰＥＧ化したＤＸ−８９０結合体を試験した：
２０ｋＤａ（「２０Ｋ」ともいう）のＰＥＧ部分に結合体化したＤＸ−８９０（ｐＨ ７．４で結合体化）
２０ｋＤａのＰＥＧ部分に結合体化したＤＸ−８９０（ｐＨ ６で結合体化）
３０ｋＤａ（「３０Ｋ」ともいう）のＰＥＧ部分に結合体化したＤＸ−８９０（ｐＨ ６で結合体化）
３０ｋＤａのＰＥＧ部分に結合体化したＤＸ−８９０（ｐＨ ７．４で結合体化）
（機能的定量（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＦＱ）による活性なＤＸ−８９０の決定）
ＤＸ−８９０は、ＨＮＥのインヒビターである。ストック溶液中の活性なＤＸ−８９０および活性なＰＥＧ化ＤＸ−８９０タンパク質の濃度の決定は、偽不可逆性阻害（ｐｓｅｕｄｏ−ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）の条件下（［ＨＮＥ］＞＞Ｋｉ）で行った。これらの条件下では、活性なインヒビターによる活性なＨＮＥの阻害は、１：１のモル比で本質的に化学量論的であり、その結果この反応物中に存在するピコモルの活性なインヒビターは、阻害されたピコモルの活性なＨＮＥから直接決定される。反応物を調製して、この中で１．７ｎＭ ｈＮＥ（約２８０×Ｋｉ）を、ある範囲の添加した容積の希釈されたインヒビターストックの存在下で、３０℃において５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中でインキュベートさせた。３０分のインキュベーション後、酵素−インヒビター溶液に基質を添加して（１００μＭまで）、３０℃でさらに３０分間、基質の加水分解を進行させた。ＳＤＳの添加（０．５％まで）によって反応を停止させて、蛍光の最終レベル（λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ）を各々の反応について記録した。蛍光の値（Ｆ）は、式１：
以下のＰＥＧ化したＤＸ−８９０結合体を試験した：
２０ｋＤａ（「２０Ｋ」ともいう）のＰＥＧ部分に結合体化したＤＸ−８９０（ｐＨ ７．４で結合体化）
２０ｋＤａのＰＥＧ部分に結合体化したＤＸ−８９０（ｐＨ ６で結合体化）
３０ｋＤａ（「３０Ｋ」ともいう）のＰＥＧ部分に結合体化したＤＸ−８９０（ｐＨ ６で結合体化）
３０ｋＤａのＰＥＧ部分に結合体化したＤＸ−８９０（ｐＨ ７．４で結合体化）
（機能的定量（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＦＱ）による活性なＤＸ−８９０の決定）
ＤＸ−８９０は、ＨＮＥのインヒビターである。ストック溶液中の活性なＤＸ−８９０および活性なＰＥＧ化ＤＸ−８９０タンパク質の濃度の決定は、偽不可逆性阻害（ｐｓｅｕｄｏ−ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）の条件下（［ＨＮＥ］＞＞Ｋｉ）で行った。これらの条件下では、活性なインヒビターによる活性なＨＮＥの阻害は、１：１のモル比で本質的に化学量論的であり、その結果この反応物中に存在するピコモルの活性なインヒビターは、阻害されたピコモルの活性なＨＮＥから直接決定される。反応物を調製して、この中で１．７ｎＭ ｈＮＥ（約２８０×Ｋｉ）を、ある範囲の添加した容積の希釈されたインヒビターストックの存在下で、３０℃において５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中でインキュベートさせた。３０分のインキュベーション後、酵素−インヒビター溶液に基質を添加して（１００μＭまで）、３０℃でさらに３０分間、基質の加水分解を進行させた。ＳＤＳの添加（０．５％まで）によって反応を停止させて、蛍光の最終レベル（λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ）を各々の反応について記録した。蛍光の値（Ｆ）は、式１：
を用いて残りの阻害されていないＨＮＥのピコモルに変換するが、
ここでＦ−ＤＸ−８９０は、ＤＸ−８９０の非存在下で観察される蛍光であり；
Ｆ＋ＤＸ−８９０は、ＤＸ−８９０の存在下で観察される蛍光であり；
Ｃ−ｅｎｚｙｍｅは、酵素コントロールなしの蛍光である
（０．２５ｐｍｏｌがこのアッセイに存在する酵素の量である）。
反応物に存在する活性なインヒビターは、（総ＨＮＥ）−（残りの遊離のＨＮＥ）として算出され、そしてこの値を希釈について補正して用いて、ストック溶液中に存在する活性なインヒビターの濃度を算出する。
（Ｋｉ測定）
ＰＥＧ化したＤＸ−８９０サンプルについての平衡阻害定数は、可逆性複合体（１：１化学量論）の形成をともなうタイト・バインディング阻害モデルに従って決定した。反応は、１００ｐＭの酵素、そしてある範囲のインヒビター濃度（０〜４ｎＭ）を用いて、３０℃で、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で設定した。２４時間のインキュベーション後、酵素インヒビター溶液中に基質を添加して（２５μＭ）、基質加水分解の速度を３６０ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光でモニターした。活性なインヒビター濃度に対する残りの活性の割合のプロットを、式１に対する非直線回帰分析によってフィットさせて、平衡解離定数を決定した。Ｄｙｎａｘ ＤＸ−８９０参照ロット００Ｂ１６およびＤＸ−８９０の両方をＰＥＧ化に用い、ＮＢＧ２０１６／９を比較のために分析した。
ＰＥＧ化したＤＸ−８９０サンプルについての平衡阻害定数は、可逆性複合体（１：１化学量論）の形成をともなうタイト・バインディング阻害モデルに従って決定した。反応は、１００ｐＭの酵素、そしてある範囲のインヒビター濃度（０〜４ｎＭ）を用いて、３０℃で、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で設定した。２４時間のインキュベーション後、酵素インヒビター溶液中に基質を添加して（２５μＭ）、基質加水分解の速度を３６０ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光でモニターした。活性なインヒビター濃度に対する残りの活性の割合のプロットを、式１に対する非直線回帰分析によってフィットさせて、平衡解離定数を決定した。Ｄｙｎａｘ ＤＸ−８９０参照ロット００Ｂ１６およびＤＸ−８９０の両方をＰＥＧ化に用い、ＮＢＧ２０１６／９を比較のために分析した。
％Ａ＝活性パーセント
Ｉ＝ＤＸ−８９０
Ｅ＝ＨＮＥ濃度
Ｋｉ＝平衡阻害定数
ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）について、ＤＸ−８９０および４つのＰＥＧ化ＤＸ−８９０化合物のうちの３つのＫｉは、お互いに同様であって、ｐＨ７．４で調製した３０Ｋ ＰＥＧ ＤＸ−８９０のＫｉはネイティブのＤＸ−８９０のＫｉの２倍を有した（図１）。この結果によって、ｐＨ６もしくは７．４での２０Ｋ ＰＥＧでの、またはｐＨ６での３０Ｋ ＰＥＧを用いるＰＥＧ−８９０のＰＥＧ化は、ＨＮＥのインヒビターとしてのＤＸ−８９０の力価に影響しないことが示される。
（実施例３：インビボの結果：ＤＸ−８９０およびＰＥＧ化ＤＸ−８９０のＫｉおよびＰＫの比較）
ネイティブのＤＸ−８９０と同じＫｉを有するこれらの３つのＰＥＧ化ＤＸ−８９０結合体の薬物動態をマウスで試験した。
ネイティブのＤＸ−８９０と同じＫｉを有するこれらの３つのＰＥＧ化ＤＸ−８９０結合体の薬物動態をマウスで試験した。
（マウスにおける薬物動態学的研究：）
ＤＸ−８９０およびＰＥＧ化したＤＸ−８９０化合物の薬物動態は、利用可能なチロシン残基上でタンパク質をヨウ素化すること、およびマウスにおいてそのクリアランスを測定することによって測定した。
ＤＸ−８９０およびＰＥＧ化したＤＸ−８９０化合物の薬物動態は、利用可能なチロシン残基上でタンパク質をヨウ素化すること、およびマウスにおいてそのクリアランスを測定することによって測定した。
サンプルは、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，の方法であって、最初にＣｈｉｚｚｏｎｉｔｅ［Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７，１５４８〜１５５６，１９９１；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８，３１１７〜３１２４，１９９２］によって記載された）を用いる直接法によって放射性ヨウ素化した。サンプルを１２５Ｉ−ＮａＩ溶液とともに９分間インキュベートして、その時にチロシン（１０ｍｇ／ｍＬ、飽和溶液）を添加して反応物をクエンチした。約１５分後、５μｌのアリコートをカウントの標準として取り出した。
各々の標識反応について、１２５Ｉ標識物質（約０．６ｍＬ）を、単一の５ｍＬ Ｄ−ｓａｌｔ１８００ポリアクリルアミドカラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を用いて精製した。カラムは最初に、２．５％ＨＳＡを含有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄して非特異的部位をブロックし、次いでＨＳＡを含まない同じ緩衝液でよく洗浄した。サンプルをカラムに加え、カラムを一連の０．３ｍＬアリコートで溶出させた。全てのタンパク質画分において加えた活性の回復は７５％より大きく、加えた活性の全部の回復は９０％より大きかった。標識タンパク質のピークレベルを含む画分を動物の注射のためにプールした。注入物質を調製するために、１００μＬの注射容積に約１０μｇの標識物質を含むように、プールをＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈した。
動物の尾静脈に注射して、ネイティブなＤＸ−８９０についてはその見込みの半減期が短いために４ポイントより少なく、４匹の動物を注射後およそ０、７、１５、３０および９０分、４時間、８時間、１６時間、２４時間後に屠殺した。注射の時間およびサンプリグの時間を記録した。屠殺時点で、約０．５ｍｌのサンプルを抗凝結剤（０．０２ｍｌ ＥＤＴＡ）中に収集した。細胞をスピンダウンして血漿から分離して、細胞を−２０℃で保管した。血漿を２つのアリコートに分けて、１つは凍結させて、１つは直ちに分析するために４℃で保管した。分析には全てのサンプルのガンマカウントを含んだ。さらに、各々の時点、すなわち１２５Ｉ−ＤＸ−８９０については０分および３０分で、そして１２５Ｉ−ＤＸ−８９０−ＰＥＧ結合体については０分、３０分および２４時間で、２つの血漿サンプル（Ｎ＝２）について分析を行った。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムを、インラインの放射線検出器とともに用いた（図４〜７）。
この結果によって、ＤＸ−８９０のＰＥＧ化はβ（排除）半減期を約５倍まで劇的に向上することが示される（図２および３）。さらに、ＰＥＧ化ＤＸ−８９０化合物はＤＸ−８９０よりもマウス血漿において安定であると思われる（図３）。
図３に示されるデータの各セットは、インビボのクリアランスの「高速（ｆａｓｔ）」および「低速（ｓｌｏｗ）」の相を示す二成分の指数関数減衰曲線（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｄｅｃａｙ ｃｕｒｖｅ）にフィットされ得る：
ｙ＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔ
式３
ここで：
ｙ＝投与後の時点ｔで血漿中に残っている標識の量
Ａ＝「高速」クリアランス相における総標識
Ｂ＝「低速」クリアランス相における総標識
α＝「高速」クリアランス相の減衰定数
β＝「低速」クリアランス相の減衰定数
ｔ＝投与後時間
（表３：マウスにおけるＰＫおよびＫｉ測定からの結果のまとめ）
ｙ＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔ
式３
ここで：
ｙ＝投与後の時点ｔで血漿中に残っている標識の量
Ａ＝「高速」クリアランス相における総標識
Ｂ＝「低速」クリアランス相における総標識
α＝「高速」クリアランス相の減衰定数
β＝「低速」クリアランス相の減衰定数
ｔ＝投与後時間
（表３：マウスにおけるＰＫおよびＫｉ測定からの結果のまとめ）
α相半減期＝０．６９（１／α）
β相半減期＝０．６９（１／β）
に変換され得る。
α相およびβ相を通じてインビボ循環から排出される総標識の割合は、以下のとおり算出される：
％α相＝［Ａ／（Ａ＋Ｂ）］×１００
％β相＝［Ｂ／（Ａ＋Ｂ）］×１００
図３にプロットしたデータのセットを通じた固相曲線は、このデータに対する、式３の４パラメーター、最小二乗フィットである。表３は、マウスにおいて試験した４つの化合物の各々について得たインビボクリアランスデータセットに対する最小二乗フィットから抽出したα相％、α相半減期、β相％、およびβ相半減期についての値である。
％α相＝［Ａ／（Ａ＋Ｂ）］×１００
％β相＝［Ｂ／（Ａ＋Ｂ）］×１００
図３にプロットしたデータのセットを通じた固相曲線は、このデータに対する、式３の４パラメーター、最小二乗フィットである。表３は、マウスにおいて試験した４つの化合物の各々について得たインビボクリアランスデータセットに対する最小二乗フィットから抽出したα相％、α相半減期、β相％、およびβ相半減期についての値である。
ＰＥＧ２０またはＰＥＧ３０のいずれかを用いたＤＸ−８９０の一ＰＥＧ化によって、２つの方式でタンパク質のインビボ循環レベルが増大する：
１．α相およびβ相の両方について半減期が増大する。
１．α相およびβ相の両方について半減期が増大する。
・単一の２０ｋＤａのＰＥＧ部分のｐＨ６．０またはｐＨ７．４のいずれかでの付加によって、α相半減期は１分から約２０分に伸びる。３０ｋＤａのＰＥＧを用いたｐＨ６．０でのＤＸ−８９０の一ＰＥＧ化によって、α相半減期において同様の増大が生じる。
・単一の２０ｋＤａのＰＥＧ部分のｐＨ６．０またはｐＨ７．４のいずれかでの付加によって、β相半減期は１時間から約５時間に伸びる。β相半減期はさらに、３０ｋＤａのＰＥＧ ＤＸ−８９０誘導体について約８時間に伸びる。
２．低速のβ相を通じてインビボ循環から排出された標識タンパク質の割合は増大される。
・単一の２０ｋＤａのＰＥＧ部分のＤＸ−８９０に対する付加の結果として、β相において排出された割合は、未修飾のＤＸ−８９０についての約１５％から一ＰＥＧ化タンパク質についての約４５％まで増大する。
・単一の３０ｋＤａのＰＥＧ部分のＤＸ−８９０に対する付加の結果として、β相を通じて生じるクリアランスは約２／３となる。
結論：２０Ｋ ＰＥＧでのＰＥＧ化（ｐＨ６または７．４で）または３０Ｋ ＰＥＧでのＰＥＧ化（ｐＨ６で）によって、ＨＮＥのインヒビターとしてのその力価に影響することなくマウスにおけるＤＸ−８９０の循環半減期が延長する。
（表４：ＰＫおよびＫｉの結果のまとめ）
以下のＰＥＧ化ＤＸ−８９０結合体を試験した：
ｐＨ７．４で２０Ｋ ＰＥＧに結合体化したＤＸ−８９０
ｐＨ６で２０Ｋ ＰＥＧに結合体化したＤＸ−８９０
ｐＨ６で３０Ｋ ＰＥＧに結合体化したＤＸ−８９０
ｐＨ７．４で３０Ｋ ＰＥＧに結合体化したＤＸ−８９０
実施例２は、４つのＰＥＧ結合体による、そして未修飾のＤＸ−８９０のｈＮＥの阻害についての溶液阻害定数（Ｋｉ）の決定を記載した。さらに、この報告は、３つのＰＥＧ結合体（２つが２０Ｋで１つが３０Ｋ）とともに、未修飾のＤＸ−８９０についてマウスでのインビボのクリアランス特性を測定する実験を記載した。この結果は表４にまとめる。この実験は、ウサギにおけるＤＸ−８９０およびＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０（ｐＨ７．４での結合体）の薬物動態学的特性の測定を記載する。
ＤＸ−８９０およびＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０（ｐＨ７．４での結合体）の薬物動態学的特性は、このタンパク質をヨウ素化すること、およびウサギにおける循環から放射性標識のクリアランスを測定することによって測定した。２つのＤＸ−８９０調製物は、ヨードゲン（ｉｏｄｏｇｅｎ）法を用いてヨウ素−１２５でヨウ素化した。放射線標識後、２つの標識されたタンパク質調製物を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって未結合の標識から精製した。最高の放射能を有するＳＥＣカラムからの画分をプールした。精製された放射性標識調製物は、ガンマカウントによって比活性について、そしてインラインの放射線検出器を装備したＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムを用いてＳＥＣによって純度について特徴付けた。
ニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）ウサギ（約２．５Ｋｇ）をクリアランス測定のために用い、２つの標識されたタンパク質調製物の各々について１匹の動物を用いた。放射性標識した調製物を耳の静脈から動物に注射した。１つの血液サンプルを１時点あたり１匹の動物について収集し、これは早期の時点では、注射後ほぼ０、２．５、５、７、１５、３０、６０および９０分で、後期の時点では注射後、４、８、１６、２４、３０、４８、７２、９６、１４４、１６８および１９２時間での収集であった。サンプル（約０．５ｍＬ）を抗凝血剤（ＥＤＴＡ）を含有する試験管中に収集した。遠心分離によって血漿画分から細胞を分離した。血漿画分を２つのアリコートに分けた。１つの血漿アリコートを−７０℃で保管して、他のアリコートは直ちに分析するために４℃で保持した。サンプル分析には、クリアランス速度決定のための放射線カウントおよびインビボにおける放射性物質のサイズ分布の変化（安定性）について試験するためのＳＥＣクロマトグラフィーを含んだ。
ウサギクリアランス研究の結果を、図８〜図１０に、そして表５にまとめる。
ＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０は、未修飾のＤＸ−８９０のインビボ循環特性に対して実質的に長いという循環特性を示す。血漿クリアランス速度はＰＥＧ化したタンパク質について大きく低下されて、その結果、注射の１日後に測定した循環中の放射性標識の相対レベルは、未修飾のタンパク質についてよりもＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０について１００倍より高い（図８）。
このデータに対する簡易な二成分指数関数フィット（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｆｉｔ）は、クリアランス曲線のα部分およびβ部分の両方で大きな増大を示す（表５）。詳細には、Ｔ１／２βの値は、未修飾のタンパク質についての約１６５分（２．７５時間）からＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０についての約４１５４分（約６９時間、約２．９日）まで、約２５倍増大される。さらに、曲線の低速クリアランス部分に関与する総物質の画分は、未修飾のＤＸ−８９０に対してＰＥＧ化タンパク質についてはほぼ２倍である（表５）。
最終的に、インビボ安定性は、未修飾のＤＸ−８９０に対してＰＥＧ化タンパク質について改善されるものと思われる（図９および１０）。１２５Ｉ−ＤＸ−８９０を注射したウサギ由来の血漿のＳＥＣ分析（図９）は、より高分子量の血漿成分（より早期に溶出するピーク）を有する標識の比較的急速な会合を示す。さらに、高分子量の物質と会合された残りの循環標識の全ての相対的な割合は、注射後の時間の増大につれて増大する（３０分と４時間の溶出プロフィールを比較する）。
対照的に、１２５Ｉ−ＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０を注射したウサギ由来の血漿サンプルのＳＥＣ分析（図１０）によって、循環する標識のほぼ全ての部分が注入物質中にみられる１２５Ｉ−ＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０のピークと会合されること、およびこの標識が少なくとも７２時間、これらのピークと安定に会合したままであるということが示される。より後期の時点（１６８時間および１９２時間）で、ＳＥＣ分析によって、少量の標識が、未修飾のＤＸ−８９０（図９）を用いる実験でみられるものと同様の位置（画分４５および６３）でカラムから溶出されるということが示される。画分６３で溶出する標識はおそらく、未修飾のＤＸ−８９０（ＰＥＧなし）に相当する。画分４５で溶出する標識は、高分子量血清成分と会合した未修飾のＤＸ−８９０を反映し得る（図９に示されるとおり）。
２つのピークは、標識後の１２５Ｉ−ＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０と会合している。ＳＥＣ分析におけるこの挙動は、ＰＥＧ化プロセスから生じる異質性を反映する可能性がある。より早期に溶出するピーク（画分３１で最大）は、より後期に溶出するピーク（画分３７で最大）よりもかなり遅い速度で循環から排出するようである。
未修飾のＤＸ−８９０に対して、ＰＥＧ−３０−ＤＸ−８９０構築物は、ウサギにおいて、実質的に長いインビボ循環および安定性特性を示す。マウスのデータに基づいて、ＤＸ−８９０に対する２０ｋＤａまたは３０ＫＤａのいずれかのＰＥＧ部分の結合体化は、インビボでの循環の延長および安定性を生じ、ここでは３０ＫＤａのＰＥＧが最大の効果を有する。ＤＸ−８９０に対する２０ＫＤａ ＰＥＧまたは３０ＫＤａ ＰＥＧのいずれかの結合体化は、この分子の力価に対してほとんど影響を有さないようである。
（表５：ウサギにおけるクリアランス時間
小型の実験哺乳動物（例えば、げっ歯類、イヌおよびサル）から得たインビボの薬物動態学的パラメーターでのデータは、種間スケーリングによってヒトに対して推定され得る（ＭａｈｍｏｏｄおよびＢａｌｉａｎ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７：５７９〜５８５、１９９６、およびＣｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｋｏｋｉｎｅｔ ３６：１〜１１，１９９９によってまとめられた）。簡単な非比例的なアプローチは、べき関数：
Ｙ＝ａＷｂ （式４）
の観点から体重（Ｗ）と目的の薬物動態学的パラメーター（Ｙ）との間の関係を記載しており、ここでａおよびｂは、それぞれ実験的に決定された係数および非比例的な式の指数である。一般に、非比例的なアプローチは、３つ以上の種が用いられる場合に最も有効である。さらに、代表的には測定した３つの最も重要な薬物動態学的パラメーター（全身クリアランス、分布容積、およびｔ１／２β）のうち、ｔ１／２βが式４によって最も十分に予想されない。これらの警告を考慮すれば、表２および４に提示されるデータを用いて、ヒトで期待されるｔ１／２βのおおまかな推定を得ることができる。
図１０は、未修飾のＤＸ−８９０（三角）および一ＰＥＧ３０−ＤＸ−８９０（丸）について、ｌｏｇ［β相半減期］対ｌｏｇ［体重（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ）］としてプロットした、表２および４由来のデータを示す。ヒト（７０Ｋｇ）に対するマウス（２５ｇｍ）およびウサギ（２．５Ｋｇ）の実験データの直線的外挿入（推定）は、図中の十字によって示される。ヒトにおけるβ相半減期についての推定値は、未修飾のＤＸ−８９０について約５時間、そして一ＰＥＧ３０−ＤＸ−８９０について約１４日間である。図１０は、ヒトにおいてβ相半減期を決定するための非比例的推定を示す。マウス（表２を参照のこと）およびウサギ（表４を参照のこと）由来のデータが、未修飾のＤＸ−８９０（三角）と一ＰＥＧ３０−ＤＸ−８９０（丸）について含まれる。このデータでの直線回帰は、それらの式にそって示される。７０Ｋｇのヒトに対して推定されるβ相半減期の値は、十字によって示される。
（実施例：ｐＨ７．４で修飾したＭＰＥＧ２０Ｋ−ＤＸ−８９０の精製）
１．３ｍｇのタンパク質を５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．５中に含む希釈された粗ＰＥＧ化ＤＸ−８９０（６００μＬ）を２５ｍＬ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にロードした。この三ＰＥＧ化、二ＰＥＧ化、一ＰＥＧ化されたＤＸ−８９０および非ＰＥＧ化ＤＸ−８９０は、５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５（緩衝液Ａ）および５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ５．５（緩衝液Ｂ）の勾配を用いて、１分あたり約１．５ｍＬの流速で分離した。
１．３ｍｇのタンパク質を５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．５中に含む希釈された粗ＰＥＧ化ＤＸ−８９０（６００μＬ）を２５ｍＬ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にロードした。この三ＰＥＧ化、二ＰＥＧ化、一ＰＥＧ化されたＤＸ−８９０および非ＰＥＧ化ＤＸ−８９０は、５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５（緩衝液Ａ）および５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ５．５（緩衝液Ｂ）の勾配を用いて、１分あたり約１．５ｍＬの流速で分離した。
タンパク質を含む画分は、カラムを出ていく物質の吸光度をモニタリングすることによって決定した。画分２、３、５〜６、１４〜１５、１７および２４〜２５を収集して、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（ＭＷ、１０，０００Ｄａでカットオフ）を用いて約４℃で濃縮した。
濃縮画分は、１０％ゲルおよびｔｒｉｓ／グリシンを泳動緩衝液として用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、画分２が三ＰＥＧ化および二ＰＥＧ化ＤＸ−８９０を含んだこと；画分３が二ＰＥＧ化および一ＰＥＧ化したタンパク質の混合物を含んだことが確認された。画分５〜６、１４〜１５および１７は、一ＰＥＧ化ＤＸ−８９０のみを含んだ。画分２４〜２５は、可視のバンドを示さなかった。この方法を用いて、一ＰＥＧ化ＤＸ−８９０の調製物を調製し得る。
（他の実施形態）
本発明の多数の実施形態が記載されている。にもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行い得ることが理解される。従って、他の実施形態も、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明の多数の実施形態が記載されている。にもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行い得ることが理解される。従って、他の実施形態も、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (45)
- ポリ（アルキレンオキシド）に共有結合されたＤＸ−８９０を含む結合体。
- 前記ポリ（アルキレンオキシド）がポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である、請求項１に記載の結合体。
- 前記ポリ（アルキレンオキシド）がヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシおよび置換アリールオキシからなる群より選択されるエンドキャッピング部分で末端キャップされる、請求項１〜２のいずれか１項に記載の結合体。
- 前記ポリ（アルキレンオキシド）がメトキシ基で末端キャップされる、請求項３に記載の結合体。
- 前記ＤＸ−８９０が１つ以上のポリ（アルキレンオキシド）部分に共有結合される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合体。
- ポリ（アルキレンオキシド）の総分子量が２０，０００ダルトン以上である、請求項５に記載の結合体。
- 前記ポリ（アルキレンオキシド）が、直線、分枝および分岐からなる群より選択される構造を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体。
- 前記ＤＸ−８９０が加水分解性の結合によって前記ポリ（アルキレンオキシド）に共有結合される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合体。
- 前記加水分解性結合が、カルボン酸エステル、リン酸エステル、加水分解性カルバメート、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステルおよびカーボネートからなる群より選択される原子の集団を含む、請求項８に記載の結合体。
- 前記加水分解性結合が、加水分解性カルバメート、エステルおよびカーボネートからなる群より選択される原子の集団を含む、請求項９に記載の結合体。
- 前記加水分解性結合が加水分解性カルバメートであり、そして前記結合体が構造：
ＰＥＧ−Ｌ−Ａｒ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｐ
を含み、
ここで、
ＰＥＧが約１００〜約６０ｋＤの分子量を有するポリ（エチレングリコール）であり、
Ｌが加水分解性に安定な結合基であり、
Ａｒが芳香族基であり、
ＰがＤＸ−８９０であり、そして
−ＮＨがＤＸ−８９０のアミノ基に相当する、
請求項１０に記載の結合体。 - ＰＥＧがＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−という構造を保有するメトキシＰＥＧであって、ｎが約１０〜約１２００の範囲におよび、そしてＬが−Ｏ−または−ＮＨ−ＣＯ−である、請求項１１に記載の結合体。
- 構造：
- 前記ＤＸ−８９０が加水分解に安定な結合によって前記ポリ（アルキレンオキシド）に共有結合される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合体。
- 前記加水分解性に安定な結合が、エーテル、チオエーテル、アミドおよびウレタンからなる群より選択される原子または原子の集団を含む、請求項１４に記載の結合体。
- 前記加水分解に安定な結合が、ＤＸ−８９０のアミノ基に対する前記ポリ（アルキレンオキシド）の共有結合から生じるアミド結合である、請求項１５に記載の結合体。
- 前記ポリ（アルキレンオキシド）がＤＸ−８９０のリジン残基およびＮ末端からなる群より選択される１つ以上のアミノ基に共有結合される、請求項１１または請求項１６に記載の結合体。
- 前記ポリ（アルキレンオキシド）がＧｌｕ１、ｌｙｓ２５、ｌｙｓ２７、ｌｙｓ４２、およびｌｙｓ４７からなる群より選択される１つ以上のＤＸ−８９０アミノ酸部位に共有結合される、請求項１７に記載の結合体。
- ＤＸ−８９０が単一のポリ（アルキレン）オキシド部分に共有結合される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の結合体。
- 複数の、請求項２〜１９のいずれか１項に記載の一ＰＥＧ化結合体を含む組成物であって、該一ＰＥＧ化結合体の各々がＤＸ−８９０の異なるアミノ酸部位に共有結合された単一のＰＥＧ部分を含む、組成物。
- 二ＰＥＧ化ＤＸ−８９０および三ＰＥＧ化ＤＸ−８９０をさらに含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
- 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の結合体を含む組成物であって、非共有結合したポリ（アルキレンオキシド）を実質的に含まない、組成物。
- 精製された組成物であって、その唯一のＰＥＧ結合体成分として、一ＰＥＧ化ＤＸ−８９０を含む、組成物。
- 精製された組成物であって、その唯一のＰＥＧ結合体成分として、二ＰＥＧ化ＤＸ−８９０を含む、組成物。
- 請求項１〜７および請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の結合体であって：
Ｐ−［ＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨ２）２，３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３］１−５
または
Ｐ−［ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２，３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３］１−５
のいずれかから選択される構造を有し、
ＰがＤＸ−８９０であり
−ＮＨがＤＸ−８９０のアミノ基であり、そして
ｎが１０〜１５５０におよぶ、
結合体。 - ＤＸ−８９０のアミノ酸配列、またはＤＸ−８９０のアミノ酸配列から少なくとも１つ、ただし６つ未満のアミノ酸の相違によって異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物であって、該ペプチドが単一のポリエチレングリコール部分に結合され、該ポリエチレングリコール部分が少なくとも１８ｋＤａの分子量であり、かつ該ポリペプチドのＮ末端のポリペプチドに結合される、化合物。
- 前記ポリエチレングリコール部分が少なくとも２０ｋＤａの分子量である、請求項２６に記載の化合物。
- 前記ポリエチレングリコール部分が、少なくとも２５ｋＤａの分子量である、請求項２７に記載の化合物。
- エラスターゼを阻害する請求項２６に記載の化合物。
- 前記ポリペプチドがＤＸ−８９０のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の化合物。
- 前記ポリペプチドが、ＤＸ−８９０のアミノ酸配列から少なくとも１つ、ただし６つ未満のアミノ酸の相違によって異なるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の化合物。
- 前記ポリペプチドが、ＤＸ−８９０のアミノ酸配列から少なくとも１つ、ただし３つ未満のアミノ酸の相違によって異なるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の化合物。
- 前記相違がアミノ酸置換である、請求項３１に記載の化合物。
- 請求項３１に記載の化合物であって、前記アミノ酸配列が、ＢＰＴＩの番号付けに従って、５、１３、１４、１６、１７、１８、１９、３０、３１、３２、３４、３８、３９、５１および５５の位置からなる群より選択される少なくとも５つの位置でＤＸ−８９０のアミノ酸配列と同一である、化合物。
- （ｉ）請求項２６に記載の化合物と、（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的調製物。
- （ｉ）請求項５に記載の化合物と、（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的調製物。
- 肺障害を処置または予防する方法であって：
肺障害を有するかそのリスクのある被験体に対して、該障害を処置または予防するために有効な量で、請求項１に記載の化合物を投与する工程、
を包含する方法。 - 前記障害が嚢胞性線維症である、請求項３７に記載の方法。
- 前記障害が慢性閉塞性肺疾患である、請求項３７に記載の方法。
- 前記化合物が、被験体の破壊係数を低下させるために有効な量で投与される、請求項３９に記載の方法。
- 前記化合物が吸入によって送達される、請求項３７に記載の方法。
- 炎症性障害を処置または予防する方法であって：
炎症性障害を有するかそのリスクのある被験体に対して、該障害を処置または予防するために有効な量で、請求項１に記載の化合物を投与する工程、
を包含する方法。 - 前記障害が炎症性の腸障害である、請求項４２に記載の方法。
- 前記障害がクローン病である、請求項４３に記載の方法。
- 前記障害が潰瘍性大腸炎である、請求項４３に記載の方法。
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