RU2755227C2 - Иммуномодулирующие слитые белки и пути их применения - Google Patents

Иммуномодулирующие слитые белки и пути их применения Download PDF

Info

Publication number
RU2755227C2
RU2755227C2 RU2017133637A RU2017133637A RU2755227C2 RU 2755227 C2 RU2755227 C2 RU 2755227C2 RU 2017133637 A RU2017133637 A RU 2017133637A RU 2017133637 A RU2017133637 A RU 2017133637A RU 2755227 C2 RU2755227 C2 RU 2755227C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cell
fusion protein
cells
extracellular
amino acid
Prior art date
Application number
RU2017133637A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017133637A3 (ru
RU2017133637A (ru
Inventor
Шеннон К. ОДА
Филип Д. ГРИНБЕРГ
Томас М. ШМИТТ
Original Assignee
Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер filed Critical Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер
Publication of RU2017133637A publication Critical patent/RU2017133637A/ru
Publication of RU2017133637A3 publication Critical patent/RU2017133637A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2755227C2 publication Critical patent/RU2755227C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464452—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/464453—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70507—CD2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитому белку, связывающемуся с CD47 для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке, и может быть использовано в медицине. Слитый белок, состоящий из CD47-связывающей части SIRPα, трансмембранной части CD28 и сигнального домена костимулирующей молекулы CD28, может быть использован для создания Т-клеток для эффективной иммунотерапии рака, экспрессирующего CD47. 9 н. и 42 з.п. ф-лы, 13 ил., 13 пр.

Description

ИНФОРМАЦИЯ О ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, прилагающийся к данной заявке, представлен в текстовом формате вместо бумажной копии и, таким образом, включен посредством ссылки в настоящее описание. Названием текстового файла, содержащего перечень последовательности, является 360056_433WO_SEQUENCE_LISTING.txt. Текстовый файл имеет размер 286 KB, был создан 4 марта 2016 г. и подается в электронном виде посредством EFS-Web.
Предпосылки
Способы иммунотерапии на основе Т-клеток начали развиваться, когда были обнаружены реактивные в отношении опухоли Т-клетки среди популяции инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) (Clark et al., Cancer Res. 29:705, 1969). Одна стратегия, известная как адоптивный перенос Т-клеток, в некоторых ситуациях предусматривает выделение инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, предварительно отобранных по реактивности в отношении опухоли, клональное размножение реактивных в отношении опухоли Т-клеток, индуцированных антителами к CD3 и к CD28 в присутствии IL-2 и, наконец, инфузию размноженной популяции клеток обратно пациенту, имеющему опухоль (вместе с химиотерапией и повторяющимся введением IL-2) (Dudley et al., Science 298:850, 2002). Данная форма адоптивной Т-клеточной терапии с помощью инфильтрирующих опухоль лимфоцитов может быть технически громоздкой и приводит к полной ремиссии только у незначительной части пациентов с меланомой и редко является эффективной при других формах рака (Besser et al., Clin. Cancer Res. 16:2646, 2010).
Выделение реактивных в отношении опухолей Т-клеточных клонов привело к развитию еще одного иммунотерапевтического подхода - созданию рекомбинантных Т-клеточных рецепторов (TCR), специфичных к конкретным антигенам, которые могут быть введены в T-клетки, например, с помощью векторной системы доставки для придания специфичности к желаемой мишени, такой как ассоциированный с опухолью пептид, презентируемый молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC), экспрессируемой на опухолевой клетке (известной у людей как молекула лейкоцитарного антигена человека (HLA)). Другой подход представляет синтетический рецептор, называемый химерным антигенным рецептором (CAR), который обычно содержит антиген-связывающий домен, который, например, в контексте противоопухолевой терапии, может связываться с опухоль-специфическим или ассоциированным антигеном, связан с одним или более внутриклеточными компонентами, содержащими эффекторные домены, такие как первичный сигнальный домен, например, сигнальный домен TCR, или, в некоторых случаях, костимулирующие сигнальные домены. В отличие от введения TIL, основные процедуры для Т-клеточной иммунотерапии с помощью сконструированных TCR или CAR в целом представляют собой генетическую модификацию Т-клеток человека с помощью трансгена, кодирующего фрагмент, нацеливающийся на опухоль, размножение ex vivo рекомбинантных Т-клеток и переливание размноженных Т-клеток обратно пациентам.
Было показано, что адоптивная Т-клеточная терапия с использованием Т-клеток, экспрессирующих рекомбинантные TCR, имеет многообещающее клиническое преимущество, особенно при определенных В-клеточных формах рака. Однако эффективная активация Т-клеток часто требует или усиливается сопутствующим костимулирующим сигналом (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). В микроокружении опухоли костимулирующие молекулы обычно подавляются. В результате экзогенный стимул посредством IL-2, как правило, необходим для Т-клеток, которые экспрессируют рекомбинантные TCR, специфичные для антигенов рака.
Активация Т-клеток инициируется, когда TCR взаимодействует с конкретным пептидом, презентируемым в MHC на антиген-презентирующей клетке (APC) (Rossy et al., Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012). Точка взаимодействия Т-клетки и APC становится иммунологическим синапсом, который состоит из трех концентрических супрамолекулярных активационных кластеров (SMAC), в том числе центрального cSMAC, периферического pSMAC и дистального dSMAC (Rossy et al., Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012). В пределах cSMAC костимулирующие рецепторы могут привлекать сигнальные молекулы для усиления сигнала TCR. Такие костимулирующие рецепторы могут включать в себя CD28 и в некоторых случаях образовывать микрокластеры с TCR для снижения порога активации (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). Доступ к cSMAC для трансмембранных белков, экспрессируемых T-клетками, может ограничиваться размером внеклеточного домена. Например, CD45 имеет большой эктодомен и, как правило, исключается из иммунологического синапса, за счет чего предотвращается его способность ингибировать передачу сигнала TCR (James and Vale, Nature 487:64-69, 2012).
В области иммунотерапии остается потребность в альтернативных композициях и способах, которые обеспечивают иммуномодулирующие сигналы клеткам-хозяевам для лечения различных заболеваний, таких как рак или инфекции. Раскрытые в данном документе варианты осуществления касаются этих потребностей и предоставляют другие связанные преимущества.
Краткое описание
В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, который содержит связывающий домен, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе.
В некоторых вариантах осуществления длина или пространственное расстояние комплекса, образованного между слитым белком и мишенью, или части такого комплекса слитый белок::мишень (как правило, внеклеточной части такого комплекса), представляет собой или охватывает определенное расстояние, например, в некоторых вариантах осуществления это расстояние, которое представляет собой менее чем или менее чем приблизительно определенное расстояние. В некоторых аспектах расстояние комплекса слитый белок::мишень (или, как правило, его внеклеточной части) составляет менее чем около или приблизительно 50 нм, менее чем около или приблизительно 40 нм, менее чем около или приблизительно 30 нм или менее чем около или приблизительно 20 нм, или равно или менее чем около или приблизительно 15 нм. В некоторых вариантах осуществления оно составляет около или приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нм, например, около или приблизительно 14 или 15 нм. В некоторых аспектах расстояние является аналогичным расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, или представляет собой расстояние, которое является таким же, приблизительно таким же или по существу таким же, как расстояние между ближайшей частью мембраны, например остатком, внеклеточного домена TCR и ближайшей частью мембраны, например остатком, молекулы MHC (например, HLA, такой как MHCI или MHCII), относительно комплекса TCR-пептид/MHC или расстояния, охватываемого внеклеточными частями такого комплекса (или пространственного расстояния, охватываемого внеклеточной частью, которая, как известно, содержится в синапсе, такой как комплекс, содержащий CD8, CD4, CD28 и соответствующего партнера по связыванию или его лиганда). В некоторых вариантах осуществления пространственные расстояния комплексов относятся к расстоянию между мембранами двух разных клеток, где как первая клетка, так и вторая клетка экспрессирует на своей поверхности партнера по связыванию, который может образовывать комплекс между мембранами, когда клетки находятся вблизи друг от друга. В некоторых аспектах расстояние представляет собой расстояние, которое является таким же, приблизительно таким же или по существу таким же, как расстояние, охватываемое внеклеточными частями комплекса, образованного между TCR и молекулой MHC путем когнатного взаимодействия. В некоторых аспектах, например, когда слитый белок содержит связывающий домен из молекулы, обычно способной проникать в иммунологический синапс или колокализованной с антигенным рецептором, расстояние является аналогичным или таким же, как то, которое охватывается комплексом, образованным между молекулой (имеющей связывающий домен, используемый в слитом белке) и ее естественным партнером по связыванию. В некоторых аспектах, например, когда слитый белок содержит связывающий домен из молекулы, обычно не способной проникать в иммунологический синапс или обычно не способной к колокализации с антигенным рецептором, расстояние отличается, например меньше или по существу меньше, чем расстояние, охватываемое комплексом, образованным между молекулой (имеющей связывающий домен или его функциональную часть, используемую в слитом белке) и ее естественным партнером по связыванию.
В некоторых вариантах осуществления связывающий домен внутри внеклеточного компонента слитого белка по настоящему раскрытию содержит мишень-связывающую часть молекулы, способной передавать ингибирующий сигнал, такой как ингибирующая молекула, например, иммуноингибирующая молекула, такая как иммуноингибирующий рецептор или молекула иммунной контрольной точки. В некоторых аспектах такая молекула является гликопротеином, представителем семейства контрольных точек. В определенных вариантах осуществления слитый белок, содержащий связывающий домен из гликопротеина, представителя семейства контрольных точек, не является B7 или молекулой, связывающей B7, или не является представителем суперсемейства CD28-B7 (например, не является CD28, CTLA4, ICOS или другой связывающей молекулой семейства B7). Иллюстративные гликопротеины, представители семейства контрольных точек, включают CD200R, SIRPα, CD279 (PD-1), CD2, CD95 (Fas), CTLA4 (CD152), CD223 (LAG3), CD272 (BTLA), A2aR, KIR, TIM3, CD300 или LPA5, или связывающий вариант любой такой молекулы. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен внутри внеклеточного компонента слитого белка по настоящему раскрытию содержит партнера по связыванию любого из вышеперечисленных или связывающий вариант любой такой молекулы. В некоторых аспектах таких вариантов осуществления внутриклеточная часть слитого белка включает в себя сигнальный домен, способный передавать стимулирующий, например костимулирующий, сигнал лимфоциту, такому как Т-клетка, например костимулирующей области CD28, 41BB, ICOS или другой костимулирующей молекулы. В некоторых аспектах внутриклеточная часть слитого белка не включает внутриклеточный сигнальный домен ингибирующей молекулы, например контрольной точки или иммуноингибирующей молекулы, когда внеклеточную связывающую часть получают из контрольной точки или иммуноингибирующей молекулы. В некоторых аспектах слитый белок не включает первичный сигнальный домен, такой как сигнальный домен CD3ζ или другой домен, способный передавать первичный сигнал Т-клетке.
В определенных аспектах внеклеточный компонент или его связывающая часть содержит или является связывающим доменом молекулы или эктодомена, способным специфически связываться с CD200, таким как связывающая часть CD200R или его вариант. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой или включает связывающую область молекулы или эктодомена, которая способна специфически связываться с CD47, например эктодомен SIRP или его CD47-связывающая область, например эктодомен SIRPα или его CD47-связывающая область. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен способен связываться с молекулой PD-L1 или PD-L2, или LAG3. Иллюстративными мишенями могут быть один или более белков, экспрессия которых увеличивается или активируется в определенных клетках или тканях, связанных с или присущих заболеванию или состоянию, подлежащих лечению или улучшению с помощью слитых белков и композиций, предусмотренных в данном документе, таких как опухолевая клетка или микроокружение опухоли, или связана с рецептором, как правило, активируемым на иммунных клетках, таких как лимфоциты, инфильтрирующие пораженные ткани, такие как опухоль.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный компонент дополнительно содержит одну или более дополнительных областей или доменов, например, из молекулы, отличной от той, из которой получают связывающий домен, или отличной от молекулы, с которой связывающий домен разделяет идентичность. Один или более дополнительных внеклеточных доменов может содержать спейсерную область, такую как область из молекулы иммуноглобулина, которая может содержать весь или часть шарнира, или домен константной области, такой как домен CH2 или CH3, или из другой молекулы клеточной поверхности, такой как костимулирующий рецептор, например CD28. Дополнительный внеклеточный домен(-ы) может содержать в некоторых аспектах домен мультимеризации, например, домен или последовательность димеризации, которая может способствовать гомо- или гетеродимеризации с другой молекулой, такой как мультимеризация двух или более слитых белков. В некоторых вариантах осуществления такой домен содержит часть внеклеточного домена молекулы CD28, включающую по меньшей мере ближайший трансмембранный цистеин и, как правило, внеклеточную часть между таким цистеином и мембраной или его модифицированный вариант. В некоторых аспектах такой домен содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 32, или ее часть или ее вариант, такой как имеющий по меньшей мере 90%, 95% или 99% идентичности с ней. В некоторых аспектах такой домен может быть включен для облегчения или содействия мультимеризации. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий CD200-связывающий домен, такой как внеклеточная часть CD200R (или его часть, такую как его связывающий домен), например внеклеточная часть CD200R, имеющая аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 25, или кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO: 2, или его CD200-связывающую часть или его вариант, или его связывающую часть. В некоторых аспектах таких вариантов осуществления внеклеточная часть слитого белка дополнительно содержит часть внеклеточной области CD28, такую как до от приблизительно 9 до приблизительно 12 ее аминокислот (например, 9 аминокислот или 12 аминокислот), и в некоторых аспектах включая ближайший к мембране остаток цистеина внеклеточной области CD28. В некоторых таких вариантах осуществления длина части CD200R внеклеточной области уменьшена по длине, соответствующей количеству дополнительных остатков в части, полученной из CD28, например на от приблизительно 9 до приблизительно 12 аминокислот (например, 9 аминокислот или 12 аминокислот) или на достаточное количество аминокислот, так что расстояние, охватываемое внеклеточной частью комплекса между слитым белком и молекулой CD200, аналогично, по существу аналогично или такое же, как и охватываемое внеклеточной частью комплекса между CD200R человека, например CD200R, и CD200; или охватываемое внеклеточной частью комплекса между TCR в когнатном взаимодействии с молекулой MHC (например, MHC I или MHCII) при связывании с комплексом когнатный пептид-MHC; или иммунологическим синапсом. В некоторых аспектах слитый белок дополнительно содержит трансмембранный домен, такой как трансмембранный домен CD28, например, трансмембранный домен, кодируемый последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 4, или его часть, или его модифицированный вариант, такой как вариант, модифицированный так, чтобы он содержал дополнительные заряженные области или остатки или гидрофильные остатки для облегчения межмолекулярных взаимодействий. В некоторых вариантах осуществления белок дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28, такой как костимулирующий домен CD28, например домен, который способен привлекать одну или более адаптерных молекул к CD28 в ответ на связывание лиганда. В некоторых аспектах внутриклеточный домен CD28 включает или представляет собой последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5, или ее часть или функциональный вариант.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD200R, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD200R, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28 и внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB).
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD200R, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB).
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть SIRPα, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD279 (PD-1), (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD95 (Fas), (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть TIM3, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть LAG3, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD2, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.
В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, описываемый в данном документе.
В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый белок, описываемый в данном документе.
В некоторых других аспектах настоящее раскрытие относится к клетке-хозяину, содержащей слитый белок, нуклеиновую кислоту или вектор, описываемый в данном документе.
В некоторых других аспектах предусматривается способ повышения активности иммунной клетки, включающий введение субъекту, нуждающемуся в повышенной активности иммунных клеток, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.
В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу усиления или продления иммунного ответа, включающему введение субъекту, нуждающемуся в повышенной или продленной активности иммунных клеток, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.
В других аспектах настоящее раскрытие предусматривает способ стимуляции антигенспецифического ответа Т-клеток, включающий введение субъекту, нуждающемуся в повышенной активности иммунных клеток, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.
В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу ингибирования иммуносупрессивного сигнального пути, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.
В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу лечения рака, включающему введение субъекту, имеющему рак, терапевтически эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.
В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу ингибирования иммунной резистентности раковых клеток, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.
В других аспектах настоящее раскрытие предусматривает способ лечения опухоли, включающий введение субъекту, имеющему опухоль, терапевтически эффективного количества клеток-хозяев, описываемых в данном документе, где вводимая клетка-хозяин способна пролиферировать в иммуносупрессивном микроокружении опухоли.
В настоящем раскрытие также предусматривается способ лечения инфекции, включающий введение субъекту, имеющему инфекцию, терапевтически эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными при обращении к следующим подробному описанию и прилагающимся графическим материалам.
Краткое описание графических материалов
На фигурах 1A и 1B показаны конструкции CD200R-CD28, экспрессируемые на высоком уровне на первичных CD8+ T-клетках мыши. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций CD200R-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены CD200R и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (CD200Rtm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен CD200R и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (CD200R-CD28tm). Конструкции «III-V» также содержат часть внеклеточного домена CD28 до трансмембранного ближнего цистеина для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения каких-либо дополнительных внеклеточных аминокислот (например, от одной до приблизительно 50 аминокислот; например, иллюстративные мышиные конструкции, раскрытые в данном документе, содержат дополнительные девять (9) аминокислот, а иллюстративные человеческие конструкции, раскрытые в данном документе, содержат двенадцать (12) аминокислот), некоторые конструкции имеют усеченную часть внеклеточного или внутриклеточного домена (например, CD200R, который сохраняет N-связанный участок гликозилирования). Например, конструкция IV имеет усеченную часть CD200R, которая усекается на 3 аминокислоты. Конструкция V имеет усеченную часть CD200R, которая усекается на 9 аминокислот. Конструкции «I», «II» и «V» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Трансгенная экспрессия мышиных конструкций CD200R-CD28 на T-клетках TCRgag, обнаруживаемая с помощью антитела к CD200R. Контрольный вектор содержит зеленый флуоресцентный белок (GFP).
На фигурах 2A-2G показано, что конструкции CD200R-CD28 способствуют пролиферации, накоплению и эффекторной функции в ответ на опухолевые CD200+ клетки-мишени in vitro и накапливаются в иммунологическом синапсе. Спленоциты от наивных мышей TCRgag стимулировали in vitro с помощью антител к CD3, антител к CD28 и рекомбинантного IL-2 человека (100 ед./мл) и трансдуцировали с помощью ретровирусного супернатанта в течение 2 дней. Клетки рестимулировали каждые 7 дней с помощью облученных FBL и спленоцитов и культивировали с rhIL-2 (50 ед./мл) в течение до трех стимуляций. Т-клетки использовали для анализов через 5-7 дней после последней стимуляции. (A) Пролиферация CD200R-CD28 и контрольных GFP Т-клеток TCRgag, измеряемая с использованием разведения CellTrace Violet. Т-клетки стимулировали с помощью CD200- FBL (верхние секции) или CD200+ FBL (нижние секции) в течение 3 дней. (B) Предпочтительное размножение/выживание трансдуцированных Т-клеток TCRgag во время совместного культивирования с нетрансдуцированными Т-клетками TCRgag в ходе недельных циклов стимуляции облученными CD200+ FBL и спленоцитами. (C) Обогащение трансдуцированными Т-клетками. Повторная рестимуляция облученными опухолевыми CD200+ клетками обогащала клетками, трансдуцированными CD200R-9aas-CD28Cys, по сравнению с Т-клетками дикого типа, трансдуцированными пустым контрольным вектором GFP. (D) Повышенная интенсивность сигнала CD200R и CD200 в синапсе T-клетка:FBL. Липидные рафты увеличиваются в иммунологическом синапсе (I). Слитые белки CD200R-9aas-CD28Cys колокализованы с липидными рафтами, указывая, что эти слитые белки концентрируются в пределах иммунологического синапса (III, IV). (E) CD200R-CD28+ CD8+ Т-клетки демонстрируют повышенную способность лизировать клетки CD200+ FBL in vitro. Опухолевые клетки-мишени метили с использованием различных разведений флуоресцентного красителя сукцинимидилового сложного эфира 5,6-карбоксифлуоресцеина диацетата (CFSE), как указано. Эффекторные Т-клетки TCRgag, трансдуцированные указанным слитым белком CD200R-CD28 или пустым контрольным вектором, инкубировали при указанном соотношении эффектора к мишени со смесью 1:1 CD200+ FBL (CFSEhi) и неспецифических контрольных мишеней EL4 (CFSEl) в течение 5 часов. Процент FBL от суммы FBL и контрольных опухолевых клеток определяли с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса определяли путем деления процента FBL, инкубированных с Т-клетками, на процент FBL, инкубированных без Т-клеток. (F) Опухолевые клетки-мишени для анализа CFSE в (G). Опухолевые клетки-мишени метили с использованием различных разведений флуоресцентных красителей CellTrace Violet (CTV) или CFSE. Получали смесь 1:1:1 клеток EL4 (CTV+), CD200+ FBL (CFSEhi) и неспецифических контрольных мишеней EL4 (CFSEl). (G) Анализ цитотоксичности CFSE. Т-клетки TCRgag трансдуцировали рецептором CD200R-CD28 или контрольным вектором GFP. Эффекторные Т-клетки TCRgag инкубировали при указанном соотношении эффектора к мишени со смесью 1:1 CD200- FBL или CD200+ FBL и неспецифических контрольных мишеней EL4 в течение 4 часов. Процент FBL от суммы FBL и контрольных опухолевых клеток определяли с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса определяли путем деления процента FBL, инкубированных с Т-клетками, на процент FBL, инкубированных без Т-клеток.
На фигурах 3A-3D показано, что Т-клетки, трансдуцированные с помощью CD200R-9aas-CD28Cys, преимущественно накапливаются в ответ на введение опухоли in vivo и экспрессируют поверхностные белки в соответствии с эффекторным фенотипом после введения обработанным цитоксаном мышам, несущим FBL. Трансдуцированные Т-клетки TCRgag получали, как описано в примере 2. (A) Экспериментальная схема. Мышам C57BL/6 вводили 4×106 клеток CD200+ FBL. Через пять дней Т-клетки TCRgagCD200R-9aas-CD28Cys (Thy1.1 гомозиготные) и контрольные eGFP (Thy1.1 гетерозиготные) совместно вводили обработанным цитоксаном мышам B6, несущим FBL, при 4×106 клеток/мышь. IL-2 вводили каждые 2 дня (2×104 ед./дозу). На 8-й день после переноса Т-клеток мышей подвергали эвтаназии и собирали селезенку и паховые лимфатические узлы. (B) Т-клетки TCRgag CD200R-9aas-CD28Cys накапливались в селезенке в ответ на FBL. (LN=лимфатический узел; Spl=селезенка). (C) Сравнение поверхностных белков через 3 дня после переноса Т-клеток, трансдуцированных для экспрессии CD200R-9aas-CD28Cys, T-клеток, трансдуцированных пустым вектором, и эндогенных Т-клеток. Т-клетки TCRgag CD200R-9aas-CD28Cys экспрессировали сниженный CD62L по сравнению с контрольными Т-клетками TCRgag, что указывает на эффекторный фенотип Т-клеток. (D) Сравнение поверхностных белков через 15 дней после переноса Т-клеток, трансдуцированных для экспрессии CD200R-9aas-CD28Cys+, T-клеток, трансдуцированных пустым вектором, и эндогенных Т-клеток. Т-клетки TCRgag CD200R-9aas-CD28Cys экспрессируют сходные уровни белков клеточной поверхности по сравнению с контрольными Т-клетками TCRgag.
На фигурах 4A-4D показано, что адоптивная иммунотерапия CD200R-CD28-трансдуцированными T-клетками может устранять диссеминированный лейкоз. (A) Схема эксперимента. Мышам C57BL/6 вводили 4×106 клеток CD200+ FBL. Через пять дней Т-клетки TCRgag CD200R-CD28tm, CD200R-CD28Cys, CD200R-9aas-CD28Cys или eGFP вводили i.p. обработанным цитоксаном мышам, несущим FBL, при 105 клеток/мышь. IL-2 вводили каждые 2 дня (2×104 ед./дозу) в когорте мышей, как указано. (B) Иллюстративный пример экспрессии белков клеточной поверхности в T-клетках, трансдуцированных CD200R-CD28tm, и нетрансдуцированных Т-клетках в день инъекции IL-2, определяемой с помощью проточной цитометрии. (C) Выживаемость мышей, обработанных в присутствии инъекций IL-2. (D) Выживаемость мышей, обработанных в отсутствие инъекций IL-2. Перенос Т-клеток TCRgag CD200R-9aas-CD28Cys значительно улучшал выживаемость в отсутствие инъекций IL-2 (p < 0,05, логарифмический ранговый критерий Кокса-Мантеля).
На фигурах 5A-5C показано, что T-клетки, экспрессирующие CD200R-9aas-CD28Cys, не вызывают обнаруживаемое аутоиммунное повреждение печени или инфильтрацию нормальных тканей. (A) Схема эксперимента. Обработанным цитоксаном мышам Alb/Gag вводили 4×106 клеток CD200+ FBL. Через пять дней Т-клетки TCRgag CD200R-9aas-CD28Cys и eGFP вводили i.p. обработанным цитоксаном мышам, несущим FBL, при 105 клеток/мышь. IL-2 вводили каждые 2 дня (2×104 ед./дозу) в когорте мышей, как указано. Через три и 7 дней после переноса оценивали повреждение печени путем количественного определения уровней ферментов печени в сыворотке: аспартатаминотрансферазы (AST) и аланинаминотрансферазы (ALT). (B) Уровни AST и ALT, измеренные через 3 и 7 дней после переноса у мышей, не получавших Т-клетки, получавших контрольные Т-клетки, экспрессирующие GFP, или Т-клетки, экспрессирующие CD200R-9aas-CD28Cys, не изменялись при лечении. (C) Оценка Т-клеточной инфильтрации нормальной ткани. Ограниченное присутствие Т-клеток в ткани печени наблюдали с использованием антител, специфичных к маркеру Т-клеток CD3 (левая секция), без существенного отличия между реципиентами TCRgagCD200R-9aas-CD28Cys или контрольных T-клеток TCRgag (правая секция).
На фигурах 6A-6D показано, что костимулирующие сигнальные домены 4-1BB стимулируют накопление и эффекторную функцию трансдуцированных Т-клеток in vitro и способствуют выживаемости имеющих опухоль реципиентов трансдуцированных Т-клеток в ответ на опухолевые CD200+ клетки-мишени. (A) Схематическое представление конструкций CD200R-CD28 («V»), -4-1BB («VI») и -CD28-4-1BB («VII»). (B) Размножение трансдуцированных Т-клеток TCRgag по сравнению с не трансдуцированными Т-клетками TCRgag после недельной стимуляции облученными CD200+ FBL и спленоцитами. CD200R-4-1BB и CD200R-CD28-4-1BB также способствуют накоплению трансдуцированных Т-клеток in vitro. (C) CD200R-9aas-4-1BB+ CD8+ T-клетки демонстрируют повышенную способность к лизированию клеток CD200+ FBL in vitro по сравнению с контрольными с использованием стандартного анализа цитотоксичности на основе CFSE. Процент FBL от суммы FBL и контрольных опухолевых клеток определяли с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса определяли путем деления процента FBL, инкубированных с Т-клетками, на процент FBL, инкубированных без Т-клеток. (D) CD200R-41BB-трансдуцированные Т-клетки также стимулируют выживаемость по сравнению с контрольными. Мышам C57BL/6 вводили 4×106 клеток CD200+ FBL. Через пять дней Т-клетки TCRgagCD200R-9aas-CD28, CD200R-9aas-4-1BB, CD200R-9aas-CD28-4-1BB или eGFP вводили i.p. обработанным цитоксаном мышам, несущим FBL, при 105 клеток/мышь.
На фигурах 7A-7D показано, что первичные Т-клетки человека, трансдуцированные для экспрессии слитого белка с WT1-специфичным TCR и CD200Rtm-CD28, демонстрируют повышенную пролиферацию в отношении клеток-мишеней, которые экспрессируют CD200, и повышенное продуцирование цитокинов в ответ на опухолевые клетки, которые экспрессируют CD200. (A) Экспрессия WT1126-специфичного TCR, C4 и CD200Rtm-CD28. (B) Экспрессия CD200 в клетках T2 и K562. T2-клетки проявляют эндогенную экспрессию CD200 на низком уровне. (C) Пролиферация Т-клеток, как указано с помощью CFSE. Клетки, которые пролиферируют в ответ на антиген, демонстрируют снижение интенсивности флуоресценции CFSE. Т-клетки, трансдуцированные как C4, так и IFP, демонстрируют повышенную пролиферацию по отношению к клеткам-мишеням, экспрессирующим низкие уровни CD200, по сравнению с Т-клетками, трансдуцированными только C4. (D) Продуцирование цитокинов в ответ на воздействие опухолевых клеток CD200dim, как измерено с помощью проточной цитометрии. Относительно контрольных Т-клеток, трансдуцированных только TCR C4, T-клетки, трансдуцированные как C4, так и IFP CD200Rtm-CD28, показали повышенное продуцирование цитокинов.
На фигурах 8A-8E показано, что слитые белки, содержащие внеклеточные компоненты SIRPα и костимулирующие сигнальные домены CD28, способствуют накоплению и пролиферации трансдуцированных Т-клеток in vitro. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций SIRPα-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены SIRPα и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (SIRPαtm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен SIRPα и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (SIRPα-CD28tm). Конструкции «III-VI» также содержат часть внеклеточного домена CD28 до трансмембранного ближнего цистеина для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций) некоторые конструкции имеют усеченную часть внеклеточного или внутриклеточного домена (например, SIRPα который сохраняет N-связанный участок гликозилирования). Конструкция IV имеет усеченную часть SIRPα, которая усекается на 6 аминокислот, чтобы сохранить N-связанный участок гликозилирования. Конструкция V имеет усеченную часть SIRPα, которая усекается на 9 аминокислот. Конструкция VI имеет усеченную часть SIRPα, которая усекается на 23 аминокислоты. Конструкции «I», «II» и «V» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Размножение трансдуцированных Т-клеток TCRgag по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками TCRgag после недельной стимуляции облученными SIRPα+ FBL и спленоцитами. Конструкции SIRPα-CD28 стимулируют накопление трансдуцированных Т-клеток in vitro, при этом SIRPα-9aas-CD28Cys демонстрирует повышенное накопление. (C) Пролиферация Т-клеток, трансдуцированных конструкциями SIRPα-CD28, в анализе пролиферации с разведением CellTrace Violet (CTV). Т-клетки, экспрессирующие конструкции SIRPα-CD28, сконструированные для поддержания расстояния T-клетка - опухолевая клетка, показали повышенную пролиферацию по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками. (D) Опухолевые CD47+ клетки уничтожались после совместного культивирования с SIRPα-CD28+ T-клетками, трансдуцированными для экспрессии конструкций SIRPαtm-CD28 или SIRPα-9aas-CD28Cys. Напротив, опухолевые клетки не уничножались при культивировании с Т-клетками, получавшими пустой вектор или усеченный SIRPα, лишенный своего внутриклеточного домена. (E) Результаты анализа IncuCyte, используемого для количественного определения уничтожения опухолевых CD47+ клеток. Опухолевые клетки CD47+ FBL трансдуцировали с помощью mCherry. Потеря красного сигнала указывает на уничтожение опухолевых клеток. Уничтожение опухолевых клеток испытывали при соотношении эффектор:мишень, составляющем 10:1, 2:1 и 0,4:1. SIRPα-CD28+ T-клетки уничтожали опухолевые CD47+ клетки даже при самом низком испытываемом соотношении эффектора к мишени.
На фигурах 9A и 9B показано, что слитые белки, содержащие внеклеточные компоненты PD-1 и костимулирующие сигнальные домены CD28, способствуют продуцированию цитокинов in vitro. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций PD-1-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены PD-1 и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (PD1tm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен PD-1 и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (PD1-CD28tm). Конструкции «III-VII» также содержат часть внеклеточного домена CD28, смежную с трансмембранным ближним цистеином, для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций) конструкции IV-VII имеют усеченную часть PD-1. Конструкция IV имеет усеченную часть PD-1, которая усекается на 9 аминокислот. Конструкция V имеет усеченную часть PD-1, которая усекается на 12 аминокислот. Конструкция VI имеет усеченную часть PD-1, которая усекается на 15 аминокислот. Конструкция VII имеет усеченную часть PD-1, которая усекается на 21 аминокислоту. Конструкции «I», «II» и «V» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) PD1-CD28+ T-клетки демонстрировали повышенное продуцирование цитокинов в ответ на стимуляцию в течение 5 часов в присутствии Brefeldin A с клетками FBL, которые эндогенно экспрессируют лиганды PD-1, PD-L1 и PD-L2. Стимулированные Т-клетки оценивали в отношении внутриклеточной экспрессии эффекторных цитокинов, IFNγ и TNFα, с помощью проточной цитометрии.
На фигуре 10 показана коэкспрессия TCR C4 и IFP PD-1 (PD1-12aas-CD28Cys, PD1-15aas-CD28Cys или PD1-21aas-CD28Cys). T-клетки, трансдуцированные с помощью C4 и PD1-12aas-CD28Cys или PD1-15aas-CD28Cys, демонстрировали высокую эффективность трансдукции и экспрессию обоих белков.
На фигурах 11A-11C показано, что слитые белки, содержащие внеклеточные компоненты Fas и костимулирующие сигнальные домены CD28, накапливаются in vitro при стимуляции облученными клетками FBL. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций Fas-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены Fas и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (Fastm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен Fas и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (Fas-CD28tm). Конструкции «III» и «IV» также содержат часть внеклеточного домена CD28, смежную с трансмембранным ближним цистеином, для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций), конструкция IV имеет усеченную часть Fas, где внеклеточный домен Fas усекается на 9 аминокислот. Конструкции «I», «II» и «IV» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Накопление Т-клеток TCRgag, трансдуцированных конструкциями Fas, при множественных стимуляциях облученными клетками FBL. Все конструкции способствовали накоплению Т-клеток по сравнению с контрольными Т-клетками. (C) Экспрессия конструкций Fas-CD28, но не полноразмерного (FL) Fas, способствует выживаемости и размножению Т-клеток при множественных стимуляциях in vitro.
На фигурах 12A и 12B показана структура и экспрессия слитых белков, содержащих внеклеточные компоненты LAG3 и костимулирующие сигнальные домены CD28. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций LAG3-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены LAG3 и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (LAG3tm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен LAG3 и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (LAG3-CD28tm). Конструкции «III» и «IV» также содержат часть внеклеточного домена CD28, смежную с трансмембранным ближним цистеином, для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций), конструкция IV имеет усеченную часть LAG3, где внеклеточный домен LAG3 усекается на 9 аминокислот. Конструкции «I», «II» и «IV» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Экспрессия конструкций LAG3-CD28 CD8+ T-клетками мыши, как определено с помощью окрашивания антителами к LAG3 и проточной цитометрии. T-клетки, трансдуцированные для экспрессии конструкций LAG3-CD28 (LAG3tm-CD28; LAG3-CD28tm; LAG3-CD28Cys; LAG3-9aas-CD28Cys), демонстрировали экспрессию данных конструкций в отличие от контрольных Т-клеток, которые получили пустой вектор.
На фигурах 13A и 13B показана структура и экспрессия слитых белков, содержащих внеклеточные компоненты TIM3 и костимулирующие сигнальные домены CD28. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций TIM3-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены TIM3 и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (TIM3tm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен TIM3 и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (TIM3-CD28tm). Конструкции «III» и «IV» также содержат часть внеклеточного домена CD28, смежную с трансмембранным ближним цистеином, для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций), конструкция IV имеет усеченную часть TIM3, где внеклеточный домен TIM3 усекается на 9 аминокислот. Конструкции «I», «II» и «IV» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Экспрессия конструкций TIM3-CD28 CD8+ T-клетками мыши, как определено с помощью окрашивания антителами к TIM3 и проточной цитометрии. T-клетки, трансдуцированные для экспрессии конструкций TIM3-CD28 (TIM3tm-CD28; TIM3-CD28tm; TIM3-CD28Cys; TIM3-9aas-CD28Cys), как правило, демонстрировали экспрессию данных конструкций в отличие от контрольных Т-клеток, которые получили пустой вектор.
Подробное описание
Настоящее раскрытие предусматривает слитые белки, которые модулируют передачу сигнала в клетке-хозяине, такой как иммунная клетка. Например, слитые белки по настоящему раскрытию могут обеспечивать активационный или костимулирующий сигнал в Т-клетке человека, где Т-клетка может быть необязательно сконструирована так, чтобы иметь предпочтительный антигенспецифический TCR. Эти иммуномодулирующие слитые белки (IFP) могут взаимодействовать с повсеместно экспрессирующимися мишенями или с мишенями, которые обычно активируются или сверхэкспрессируются в аномальных клетках (например, раковой клетке). Такие IFP имеют внеклеточный связывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен. При трансдукции Т-клеток сконструированными TCR (например, высокоаффинными TCR) и слитыми белками по настоящему раскрытию, которые генерируют сигналы активации, определенные варианты осуществления Т-клеток могут больше не требовать экзогенной костимуляции при взаимодействии, например, с опухолевой клеткой.
В определенных аспектах настоящее раскрытие предусматривает клетки-хозяева (например, иммунные клетки, такие как Т-клетки, дендритные клетки, NK-клетки или т.п.), содержащие IFP, векторы, кодирующие IFP, и способы активации Т-клеток, содержащих IFP, для различных терапевтических применений, включая лечение заболевания у субъекта (например, рак, инфекционное заболевание).
Перед тем, как перейти к более подробному изложению настоящего раскрытия, для его понимания может быть полезным привести определения некоторых выражений, используемых в данном документе. Дополнительные определения изложены на всем протяжении настоящего раскрытия.
В настоящем описании любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон соотношений или диапазон целых чисел следует понимать с включением значения любого целого числа в пределах указанного диапазона и, при необходимости, его долей (таких как одна десятая и одна сотая целого числа), если не указано иное. Кроме того, любой числовой диапазон, указанный в данном документе, относящийся к любому из физических признаков, такому как субъединицы, размер или толщина полимера, следует понимать с включением любого целого числа в пределах указанного диапазона, если не указано иное. Используемое в данном документе выражение «приблизительно» означает ±20% к указанному диапазону, значению или позиции, если не указано иное. Следует понимать, что формы единственного числа, используемые в данном документе, относятся к «одному или более» перечисленным компонентам. Использование предлогов альтернативы (например, «или») следует понимать как обозначение одной, одной и другой или любой комбинации альтернатив. Используемые в данном документе выражения «включает», «имеет» и «содержит» используют синонимично, при этом подразумевают, что выражения и их варианты толкуют как неограничивающие.
Выражение «состоящий, по сути, из» ограничивает объем пункта формулы изобретения конкретными материалами или стадиями или тем, что существенно не влияет на основные характеристики заявленного изобретения. Например, домен белка, область или блок (например, связывающий домен, шарнирная область, линкерный блок) или белок (который может иметь одно или более из доменов, областей или блоков) «состоит, по сути, из» конкретной аминокислотной последовательности, когда аминокислотная последовательность домена, области или блока или белка содержит удлинения, делеции, мутации или любые их комбинации (например, аминокислоты на амино- или карбокси-конце или между доменами), которые, в комбинации, составляют не более 20% (например, не более 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%) от длины домена, области или блока или белка и не оказывают существенного влияния (т.e. не уменьшают активность более чем на 50%, например не более чем на 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 1%) на активность домена(-ов), области(-ей), блока(-ов) или белка (например, аффинность связывания мишени у связывающего белка).
Используемое в данном документе выражение «гетерологичный», или «неэндогенный», или «экзогенный» относится к любому из гена, белка, соединения, молекулы или активности, которые не являются нативными для клетки-хозяина или субъекта, или представляет собой любое из гена, белка, соединения, молекулы или активности, нативных для хозяина или клетки-хозяина, но которые были изменены или подвергнуты мутации, так что структура, активность или и то, и другое различны у нативной и мутированной молекулы. В определенных вариантах осуществления гетерологичные, неэндогенные или экзогенные молекулы (например, рецепторы, лиганды) могут не быть эндогенными для клетки-хозяина или субъекта, но вместо этого нуклеиновая кислота, кодирующая такие молекулы, может быть добавлена в клетку-хозяина путем конъюгации, трансформации, трансфекции, электропорации или тому подобного, где добавленная молекула нуклеиновой кислоты может интегрироваться в геном клетки-хозяина или может существовать в виде внехромосомного генетического материала (например, в виде плазмиды или другого самореплицирующегося вектора). Выражение «гомологичный» или «гомолог» относится к молекуле или активности, обнаруженной или полученной из клетки-хозяина, вида или штамма. Например, гетерологичные или экзогенные молекула или ген, кодирующий молекулу, могут быть гомологичными нативному хозяину или молекуле клетки-хозяина или гену, который кодирует молекулу, соответственно, но могут иметь измененные структуру, последовательность, уровень экспрессии или их комбинации. Неэндогенная молекула может быть получена от того же вида, от другого вида или их комбинации.
Используемое в данном документе выражение «эндогенный» или «нативный» относится к гену, белку, соединению, молекуле или активности, которая в норме присутствует у хозяина или в клетке-хозяине и не имеет сконструированных изменений.
Выражение «связывающий домен» (также называемый «связывающей областью» или «связывающим фрагментом»), используемое в данном документе, относится к молекуле, такой как пептид, олигопептид, полипептид или белок, которая обладает способностью специфически и нековалентно ассоциироваться, сопрягаться или объединяться с молекулой-мишенью (например, CD200, CD47, CD19, CD20, CD22, ROR1, мезотелином, PD-L1, PD-L2, PSMA, WT-1, циклином-A1). Связывающий домен включает любого встречающегося в природе, синтетического, полусинтетического или полученного рекомбинантным способом партнера по связыванию для биологической молекулы или другой мишени, представляющей интерес, или ее связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой антиген-связывающий домен, такой как антитело или Т-клеточный рецептор (TCR) или функциональный связывающий домен или его антиген-связывающий фрагмент. Иллюстративные связывающие домены включают эктодомены рецепторов (например, эктодомены CD200R, PD-1, CTLA4, BTLA, CD2, Fas) или их связывающие части, лиганды (например, цитокины, такие как IL35, хемокины) или их связывающие части, одноцепочечные вариабельные области антител (например, доменные антитела, sFv, scFv, Fab) или их связывающие части, антиген-связывающие области Т-клеточных рецепторов (TCR), такие как одноцепочечные TCR (scTCR), или синтетические полипептиды, выбранные по специфической способности связываться с биологической молекулой.
В некоторых вариантах осуществления выражение «специфически связывается» относится к ассоциации или сопряжению связывающего домена или его слитого белка с молекулой-мишенью с аффинностью или Ka (т.e. равновесной константой ассоциации для конкретного взаимодействия связывания с единицами 1/M), составляющей 105 M-1 или больше, или связыванию с такой молекулой-мишенью в то же время без существенных ассоциации или сопряжения с любыми другими молекулами или компонентами в образце. Связывающие домены (или их слитые белки) могут классифицироваться как «высокоаффинные» связывающие домены (или их слитые белки) или «низкоаффинные» связывающие домены (или их слитые белки). «Высокоаффинные» связывающие домены относятся к связывающим доменам с Ka по меньшей мере 107 M-1, по меньшей мере 108 M-1, по меньшей мере 109 M-1, по меньшей мере 1010 M-1, по меньшей мере 1011 M-1, по меньшей мере 1012 M-1 или по меньшей мере 1013 M-1. «Низкоаффинные» связывающие домены относятся к связывающим доменам с Ka до 107 M-1, до 106 M-1, до 105 M-1. В качестве альтернативы, аффинность может быть определена как равновесная константа диссоциации (Kd) конкретного взаимодействия связывания с единицами M (например, от 10-5 M до 10-13 M). В определенных вариантах осуществления связывающий домен может характеризоваться «повышенной аффинностью», что относится к подвергнутому отбору или сконструированному связывающему домену с более сильным связыванием с антигеном-мишенью, чем у связывающего домена дикого типа (или исходного). Например, повышенная аффинность может быть связана с Ka (равновесной константой ассоциации) для антигена-мишени, которая выше, чем у связывающего домена дикого типа, или связана с Kd (константой диссоциации) для антигена-мишени, которая меньше, чем у связывающего домена дикого типа, или связана со скоростью диссоциации (Koff) для антигена-мишени, которая меньше, чем у связывающего домена дикого типа. Различные анализы известны для идентификации связывающих доменов по настоящему раскрытию, которые специфически связывают конкретную мишень, а также для определения степеней аффинности связывающего домена или слитого белка, такие как вестерн-блот-анализ, ELISA и Biacore® (см. также, например, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; и патенты США №№5283173, 5468614 или их эквиваленты).
Используемое в данном документе выражение «слитый белок» относится к полипептиду, который в одной цепи имеет по меньшей мере два различных домена, где домены не встречаются естественным образом вместе в белке. Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок, можно сконструировать с использованием ПЦР, рекомбинантно сконструировать или т.п., или такие слитые белки можно получить с использованием способов белкового синтеза. Слитый белок может дополнительно содержать другие компоненты (например, ковалентно связанные), такие как метка или биологически активная молекула. В определенных вариантах осуществления слитый белок, экспрессированный или продуцированный клеткой-хозяином (например, T-клеткой), располагается на поверхности клетки, где слитый белок прикрепляется к клеточной мембране частью слитого белка, находящейся внеклеточно (например, содержащей связывающий домен), и частью слитого белка, находящейся внутриклеточно (например, содержащей сигнальный домен).
Выражение «гидрофобный компонент», используемое в данном документе, означает любую аминокислотную последовательность, имеющую трехмерную структуру, которая является термодинамически стабильной в клеточной мембране и обычно находится в диапазоне длин от приблизительно 15 аминокислот до приблизительно 30 аминокислот. Структура гидрофобного компонента может включать альфа-спираль, бета-цилиндр, бета-лист, бета-спираль или любую их комбинацию. В определенных вариантах осуществления гидрофобный компонент состоит из «трансмембранного домена» от известного трансмембранного белка, который представляет собой часть трансмембранного белка, способную встраиваться в клеточную мембрану или проникать через нее. В дополнительных вариантах осуществления гидрофобный компонент или трансмембранный домен могут располагаться между и соединять внеклеточные и внутриклеточные части слитого белка. Кроме того, гидрофобный компонент можно модифицировать так, чтобы он содержал заряженные области или гидрофильные остатки для облегчения межмолекулярных взаимодействий.
Используемый в данном документе «внутриклеточный сигнальный домен» представляет собой внутриклеточную часть молекулы, такую как та, которая используется в слитом белке по настоящему раскрытию, которая может непосредственно или опосредованно стимулировать ответ, например, костимулирующий, положительный или активирующий биологический или физиологический ответ в клетке при получении соответствующего сигнала. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен является частью белка или белкового комплекса, который принимает сигнал при связывании или сам может непосредственно связываться с молекулой-мишенью для передачи сигнала другим компонентам в клетке. Внутриклеточный сигнальный домен может непосредственно стимулировать клеточный ответ, если он содержит один или более сигнальных доменов или мотивов, таких как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM), киназный домен, костимулирующий домен и т.п. В других вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен будет опосредованно стимулировать клеточный ответ путем ассоциации с одним или более другими белками, которые, в свою очередь, непосредственно стимулируют клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или его функциональный фрагмент может быть из CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD134 (OX40), CD137 (4 1BB), CD150 (SLAMF1), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), CARD11, DAP10, DAP12, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или его функциональный фрагмент не содержит CD3ζ.
«Домен мультимеризации», используемый в данном документе, относится к полипептидной молекуле или области, которая преимущественно взаимодействует или ассоциируется с другой полипептидной молекулой или областью непосредственно или опосредованно, где взаимодействие доменов мультимеризации существенно способствует или эффективно стимулирует мультимеризацию (т.e. образование димера, тримера, тетрамера или мультимеров более высоких порядков, которые могут быть гомодимером, гетеродимером, гомотримером, гетеротримером, гомомультимером, гетеромультимером и т.п.). Например, мультимеризация может быть обусловлена одним или более типами молекулярных сил, включая ковалентные связи (например, дисульфидные связи или мостики), ионные связи, металлические связи, электростатические взаимодействия, солевые мостики, диполь-дипольные силы, водородную связь, Ван-дер-Ваальсовы силы, гидрофобные взаимодействия или любую их комбинацию. Мультимер стабилен при соответствующих условиях (например, физиологических условиях, в водном растворе, подходящем для экспрессии, очистки или хранения рекомбинантных или сконструированных белков, или в условиях не денатурирующего или не восстанавливающего электрофореза). Иллюстративные домены мультимеризации могут содержать одну или более дисульфидных связей, мотив цинкового пальца, мотив лейциновой «молнии», спираль-поворот-спираль, спираль-петлю-спираль и т.п.
В определенных вариантах осуществления слитый белок может содержать «линкер», который может обеспечивать спейсерную функцию для облегчения взаимодействия двух одноцепочечных слитых белков или располагать один или более связывающих доменов таким образом, что полученная полипептидная структура сохраняет специфическую аффинность связывания с молекулой-мишенью или сохраняет сигнальную активность (например, активность эффекторного домена) или и то, и другое. Иллюстративные линкеры содержат от одного до десяти повторов GlyxSery, где x и y независимо представляют собой целое число от 1 до 5.
«Соединительные аминокислоты» или «соединительные аминокислотные остатки» относятся к одному или более (например, приблизительно 2-20) аминокислотным остаткам между двумя соседними мотивами, областями или доменами слитого белка, например, между связывающим доменом и смежным гидрофобным компонентом или на одном или обоих концах гидрофобного компонента. Соединительные аминокислоты могут быть результатом моделирования конструкции слитого белка (например, аминокислотные остатки, полученные в результате применения участка для рестрикционного фермента при конструировании молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок). В определенных вариантах осуществления соединительные аминокислоты образуют линкер, такой как те, которые имеют от одного до приблизительно десяти повторов GlyxSery, где x и y независимо представляют собой целое число от 1 до 5.
Используемое в данном документе выражение «клетка иммунной системы» означает любую клетку иммунной системы, которая происходит из гемопоэтической стволовой клетки в костном мозге, которая является источником двух основных линий, миелоидной клетки-предшественника (которая является источником миелоидных клеток, таких как моноциты, макрофаги, дендритные клетки, мегакариоциты и гранулоциты) и лимфоидной клетки-предшественника (которая является источником лимфоидных клеток, таких как Т-клетки, В-клетки и естественные клетки-киллеры (NK)). Иллюстративные клетки иммунной системы включают CD4+ T-клетку, CD8+ T-клетку, CD4- CD8- двойную отрицательную T-клетку, γδ T-клетку, регуляторную T-клетку, естественную клетку-киллера и дендритную клетку. Макрофаги и дендритные клетки можно назвать «антиген-презентирующими клетками» или «APC», которые являются специализированными клетками, способными активировать Т-клетки, когда рецептор главного комплекса гистосовместимости (MHC) на поверхности APC, образовавший комплекс с пептидом, взаимодействует с TCR на поверхности Т-клетки.
«T-клетка» представляет собой клетку иммунной системы, которая созревает в тимусе и продуцирует Т-клеточные рецепторы (TCR). Т-клетки могут быть наивными (не подвергнутыми воздействию антигена; с повышенной экспрессией CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 и CD45RA и сниженной экспрессией CD45RO по сравнению с TCM), Т-клетками памяти (TM) (подвергнутыми воздействию антигена и долгоживущими) и эффекторными клетками (подвергнутыми воздействию антигена, цитотоксическими). TM можно дополнительно разделить на подмножества центральных Т-клеток памяти (TCM, с повышенной экспрессией CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO и CD95 и сниженной экспрессией CD54RA по сравнению с наивными Т-клетками) и эффекторных Т-клеток памяти (TEM, со сниженной экспрессией CD62L, CCR7, CD28, CD45RA и повышенной экспрессией CD127 по сравнению с наивными Т-клетками или TCM). Эффекторные Т-клетки (TE) относятся к подвергнутым воздействию антигена CD8+ цитотоксическим T-лимфоцитам, которые обладают сниженной экспрессией CD62L, CCR7, CD28 и являются положительными на гранзим и перфорин по сравнению с TCM. Другие иллюстративные Т-клетки включают регуляторные Т-клетки, такие как CD4+ CD25+ (Foxp3+) регуляторные Т-клетки и Treg17-клетки, а также Т-клетки, рестриктированные по Tr1, Th3, CD8+CD28- и Qa-1.
«T-клеточный рецептор» (TCR) относится к молекуле, находящейся на поверхности T-клеток (или T-лимфоцитов), которая совместно с CD3, как правило, отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). В большинстве T-клеток TCR представляет собой связанный дисульфидными связями гетеродимер высоковариабельных α- и β-цепей (также известных как TCRα и TCRβ, соответственно). В меньшей субпопуляции T-клеток TCR представляет собой гетеродимер вариабельных γ- и δ-цепей (также известных как TCRγ и TCRδ, соответственно). Каждая цепь TCR является представителем суперсемейства иммуноглобулинов и содержит один N-концевой вариабельный домен иммуноглобулина, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранную область и короткий цитоплазматический «хвост» на C-концевой области (см. Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3е изд., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). TCR, как используется в настоящем раскрытии, может быть получен от различных видов животных, в том числе человека, мыши, крысы, кошки, собаки, козы, лошади или других млекопитающих. TCR могут быть связанными с клетками (т.e. иметь трансмембранную область или домен) или могут быть в растворимой форме
Выражение «молекулы главного комплекса гистосовместимости» (молекулы MHC), которое используется взаимозаменяемо и понимается, так же, как относящееся к человеческому аналогу лейкоцитарного антигена человека (молекулы HLA), относится к гликопротеинам, которые доставляют пептидные антигены на поверхность клетки. Молекулы MHC класса I являются гетеродимерами, состоящими из трансмембранной α-цепи (с тремя α-доменами) и нековалентно связанного β2-микроглобулина. Молекулы MHC класса II состоят из двух трансмембранных гликопротеинов, α и β, оба из которых проходят через мембрану. Каждая цепь имеет два домена. Молекулы MHC (HLA) класса I доставляют пептиды, образующиеся в цитозоле, на поверхность клетки, где комплекс пептид:MHC (или пептид:HLA у человека) распознается CD8+ T-клетками. Молекулы MHC (HLA) класса II доставляют пептиды, образующиеся в везикулярной системе, на поверхность клетки, где они распознаются CD4+ T-клетками. Молекула MHC может быть получена от различных видов животных, в том числе человека, мыши, крысы или других млекопитающих.
«Молекула нуклеиновой кислоты» или полинуклеотид может быть в форме РНК или ДНК, что включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть двунитевой или однонитевой и в случае однонитевой может представлять собой кодирующую нить или некодирующую (антисмысловую нить). Кодирующая молекула может иметь кодирующую последовательность, идентичную кодирующей последовательности, известной из уровня техники, или может иметь другую кодирующую последовательность, которая в результате избыточности или вырожденности генетического кода или в результате сплайсинга может кодировать тот же полипептид.
Также рассматриваются варианты молекул нуклеиновых кислот или полинуклеотидов по настоящему раскрытию. Вариантные полинуклеотиды являются по меньшей мере на 90% и предпочтительно 95%, 99% или 99,9% идентичными одному из полинуклеотидов определенной последовательности, описываемой в данном документе, или теми, которые гибридизуются с одним из этих полинуклеотидов определенной последовательности в жестких условиях гибридизации с 0,015 М хлорида натрия, 0,0015 М цитрата натрия при температуре приблизительно 65-68°С или 0,015 М хлорида натрия, 0,0015 М цитрата натрия и 50% формамида при температуре приблизительно 42°С. Варианты полинуклеотидов сохраняют способность кодировать связывающий домен или его слитый белок, имеющий функциональные свойства, описанные в данном документе.
Выражение «жесткий» используется для обозначения условий, которые обычно понимаются в данной области техники как жесткие. Жесткость гибридизации в основном определяется температурой, ионной силой и концентрацией денатурирующих средств, таких как формамид. Примерами жестких условий для гибридизации и промывания являются 0,015 М хлорид натрия, 0,0015 М цитрат натрия при температуре приблизительно 65-68°С или 0,015 М хлорид натрия, 0,0015 М цитрат натрия и 50% формамид при температуре приблизительно 42°С (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1989).
Также могут быть использованы более жесткие условия (такие как более высокая температура, более низкая ионная сила, высший формамид или другое денатурирующее средство); однако это повлияет на скорость гибридизации. В случаях, когда речь идет о гибридизации дезоксиолигонуклеотидов, дополнительные иллюстративные жесткие условия гибридизации включают промывание в 6x SSC, 0,05% пирофосфата натрия при 37°C (для 14-основных олигонуклеотидов), 48°C (для 17-основных олигонуклеотидов), 55°C (для 20-основных олигонуклеотидов) и 60°C (для 23-основных олигонуклеотидов).
«Вектор» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту. Векторами могут являться, например, плазмиды, космиды, вирусы или фаг. «Вектор экспрессии» представляет собой вектор, способный управлять экспрессией белка, кодируемого одним или более генами, находящимися в векторе, когда он находится в соответствующем окружении.
«Ретровирусы» представляют собой вирусы с РНК-геномом. «Гаммаретровирус» относится к роду семейства Retroviridae. Иллюстративные гаммаретровирусы включают вирус, поражающий стволовые клетки мышей, вирус лейкоза мышей, вирус лейкоза кошачьих, вирус саркомы кошачьих и вирусы ретикулоэндотелиоза птиц.
«Лентивирус» относится к роду ретровирусов, способных инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки. Некоторые примеры лентивирусов включают HIV (вирус иммунодефицита человека: в том числе HIV 1 типа и HIV 2 типа); вирус инфекционной анемии лошадей; вирус иммунодефицита кошачьих (FIV); бычий вирус иммунодефицита (BIV) и вирус иммунодефицита обезьян (SIV).
Выражения «идентичный» или «процент идентичности» в контексте двух или более последовательностей молекул полипептида или нуклеиновой кислоты означает две или более последовательности или подпоследовательности, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми в определенной области (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения или в обозначенной области, как измерено с использованием способов, известных из уровня техники, таких как алгоритм сравнения последовательностей, путем ручного выравнивания или путем визуального осмотра. Например, предпочтительными алгоритмами, подходящими для определения процента идентичности последовательности и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389 и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403, соответственно.
«Лечить», или «лечение», или «облегчение» относится к медицинскому контролю заболевания, нарушения или состояния у субъекта (например, человека или отличного от человека млекопитающего, такого как примат, лошадь, собака, мышь или крыса). В целом, соответствующую дозу или схему лечения, включающую клетку-хозяина, экспрессирующую слитый белок по настоящему раскрытию, и, необязательно вспомогательное вещество или вспомогательную терапию, вводят в количестве, достаточном, чтобы вызвать терапевтическую или профилактическую пользу. Терапевтическая или профилактическая/предупредительная польза включает в себя улучшение клинического исхода; уменьшение или ослабление симптомов, ассоциированных с заболеванием; снижение степени проявления симптомов; улучшение качества жизни; более длительный период состояния без признаков заболевания; уменьшение степени заболевания, стабилизацию болезненного состояния; задержку прогрессирования заболевания; ремиссию; выживание; длительное выживание или любую их комбинацию.
«Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» слитого белка или клетки, экспрессирующей слитый белок по настоящему раскрытию (например, CD200R-CD28, SIRPα-CD28, CD200R-41BB, SIRPα-41BB, CD200R-CD28-41BB, SIRPα-CD28-4-1BB или другие такие слитые белки), в контексте заболевания или состояния, подлежащих лечению, относится к такому количеству слитого белка или количеству клеток, которое достаточно для улучшения одного или более симптомов заболевания, подлежащего лечению, статистически значимым образом (например, уменьшения инфекции, уменьшения размера опухоли, подавления развития рака или т.п.)
Иммуномодулирующие слитые белки (IFP)
В определенных аспектах настоящее раскрытие предусматривает слитый белок, содержащий внеклеточный компонент, гидрофобный компонент и внутриклеточный компонент. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный компонент включает связывающий домен, такой как тот, который специфически связывается с мишенью. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен получают из молекулы, которая обычно, например, в своей естественной обстановке, способна передавать отрицательный или ингибирующий сигнал при связывании со своим партнером по связыванию или лигандом или рецептором, таким как иммуноингибирующий рецептор или молекула контрольной точки, или мишень представляет собой ингибирующий рецептор или лиганд или молекулу контрольной точки или другой ингибирующий лиганд. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный компонент включает сигнальный домен, такой как костимулирующий сигнальный домен или сигнальная область молекулы, в целом способной передавать костимулирующий или положительный сигнал, например, иммунной клетке. Таким образом, в некоторых аспектах слитые белки способны передавать положительный или костимулирующий сигнал в ответ на событие связывания, которое в естественной обстановке приведет к ингибирующему сигналу.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок является таким, с которым достигается конкретное расстояние. Например, в некоторых вариантах осуществления комплекс слитый белок::мишень (такой как состоящий из внеклеточной части комплекса, образованного между слитым белком и мишенью посредством специфического связывания с ней) имеет определенную длину или охватывает определенное расстояние, такое как расстояние вплоть до расстояния между мембранами в иммунологическом синапсе или охваченное внеклеточной частью родственного комплекса между молекулой TCR и MHC, например, после их специфического распознавания с помощью TCR, или расстояние, охваченное внеклеточной частью комплекса, образованного между природной молекулой и ее естественным партнером по связыванию. В некоторых вариантах осуществления расстояние или длина достаточны для содействия колокализации слитого белка с антигенным рецептором или другой сигнальной молекулой при экспрессии в иммунной клетке, такой как Т-клетка, или вхождению в иммунологический синапс.
В качестве пояснения, иммунологический синапс представляет собой поверхность контакта между клетками, которая может образовываться между различными клетками, например, между иммунными клетками (Rossy et al., Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012; Hatherley et al., Structure 21:820, 2013). Например, в случае Т-клетки, контактирующей с антиген-презентирующей клеткой (APC), иммунологический синапс может образовываться путем связывания TCR (находящегося на поверхности Т-клетки) с комплексом HLA-пептид (MHC-пептид для отличных от человека хозяев) (находящимся на поверхности, например, APC; молекулы HLA класса I могут находиться на поверхности всех ядерных клеток, тогда как HLA класса II условно могут экспрессироваться на всех типах клеток, но постоянно находятся на APC). Кроме того, иммунологический синапс может быть организован в супрамолекулярные активационные кластеры (SMAC), которые могут влиять на активацию лимфоцитов, управлять презентацией комплекса антиген-HLA (или антиген-MHC) лимфоцитам и управлять секрецией цитокинов или литических гранул между клетками. SMAC может состоять из трех структур, расположенных в концентрических окружностях: центральной области (cSMAC), содержащей большое количество TCR, а также костимулирующие и ингибирующие молекулы, периферической области (pSMAC), где группируются LFA-1 и талины, и дистальной области (dSMAC), которая обогащена молекулами CD43 и CD45. В определенных вариантах осуществления иммунологический синапс будет охватывать от приблизительно 10 нм до приблизительно 15 нм. Например, белковые взаимодействия, обнаруженные в иммунологическом синапсе, такие как взаимодействие TCR::HLA-пептид или взаимодействие слитый белок-мишень, обычно охватывают приблизительно 14 нм между мембранами. В определенных вариантах осуществления ширина SMAC в иммунологическом синапсе не превышает 15 нм.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточная протяженность комплекса слитый белок: мишень такова, что он может локализоваться в конкретном компартменте иммунологического синапса. Некоторые комплексы, которые, как предполагается, локализуются в различных компартментах иммунологического синапса, хорошо охарактеризованы в отношении длины их внеклеточной протяженности. Например, считается, что комплекс MHC-TCR имеет внеклеточную протяженность приблизительно 10-15 нм, и полагают, что более сложные комплексы на основе интегрина имеют внеклеточную протяженность порядка приблизительно 40 нм (Alakoskela et al., Biophys J 100:2865, 2011). Дополнительные иллюстративные комплексы включают комплекс CD2-CD48, который, как считается, имеет внеклеточную протяженность приблизительно 12,8 нм (Milstein et al., J Biol Chem 283:34414, 2008). Кроме того, иллюстративные лигандсвязывающие молекулы, которые, как считается, локализуются в cSMAC, включают комплексы TCR и MHC, CD2, CD4, CD8, CD28 и их лиганды (Dustin et al., CSH Perspectives in Biology 2:a002311, 2010); таким образом, предполагается, что эти молекулы в комплексе с их природными лигандами имеют подходящий размер, чтобы локализоваться в cSMAC.
В некоторых аспектах длина или расстояние или приблизительная длина или расстояние конкретной конструкции или ее сконструированной внеклеточной части, такой как внеклеточная часть слитого белка, или комплекса любого из вышеперечисленного, например, с его партнером по связыванию, могут быть определены или смоделированы с помощью известных способов. В некоторых иллюстративных моделях третичную структуру белка, связывающие домены и другие характеристики можно аппроксимировать с использованием вводимой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновых кислот. Третичную структуру белка можно использовать для аппроксимации размера внеклеточной части, гибкости и других характеристик, полезных для определения приблизительной длины внеклеточной части белка или его комплекса. В целом, способы моделирования или аппроксимации длины внеклеточной части белка являются известными. Например, molbiol-tools.ca и Swiss-Model содержат несколько инструментов, полезных для прогнозирования структуры белка (см. также Schwede, T., Structure 21:1531, 2013).
В определенных вариантах осуществления слитый белок по настоящему раскрытию, находящийся в комплексе, связанный или взаимодействующий с мишенью, способен находиться в иммунологическом синапсе. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть комплекса слитый белок::мишень охватывает иммунологический синапс. В других вариантах осуществления комплекс слитый белок::мишень локализуется в супрамолекулярном активационном кластере (SMAC), таком как cSMAC. В дополнительных вариантах осуществления внеклеточная часть комплекса слитый белок::мишень охватывает иммунологический синапс, определяемый внеклеточной частью взаимодействия TCR::HLA-пептид. В еще одном варианте осуществления длина внеклеточной части комплекса слитый белок::мишень составляет от приблизительно 12 нм до приблизительно 15 нм или составляет приблизительно 14 нм.
Расстояние между клеточными мембранами клеток, взаимодействующих в иммунологическом синапсе, можно измерить любым способом, известным из уровня техники. Например, в конкретных вариантах осуществления расстояние можно измерить способом субдифракционного разрешения или электронной микроскопии (James and Vale, Nature 487:64-69, 2012).
В конкретных вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, содержит внеклеточную часть, которая тянется менее чем на 40 нм от клеточной мембраны. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, содержит внеклеточную часть, которая тянется менее чем на 30 нм от клеточной мембраны. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, содержит внеклеточную часть, которая тянется менее чем на 20 нм от клеточной мембраны. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, содержит внеклеточную часть, которая тянется менее чем на 15 нм от клеточной мембраны.
В некоторых вариантах осуществления предусмотренные слитые белки обеспечивают преимущество наличия внеклеточной длины или пространственного расстояния по сравнению с расстоянием между клеточной мембраной(-ами), которое позволяет вход в синапс или колокализацию с антигенным рецептором, или которое имитирует расстояние или длину, присутствующую в природных белках. В некоторых вариантах осуществления, где внеклеточная часть слитого белка включает домен(-ы) из дополнительной молекулы, который получают не из той молекулы, из которой получен связывающий домен, длина внеклеточного компонента, содержащего связывающий домен, уменьшена, например усечена, по сравнению с внеклеточной областью природной молекулы для обеспечения такой же длины или расстояния. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, описываемый в данном документе, содержит внеклеточный компонент, содержащий внеклеточный домен рецептора клеточной поверхности и второй домен (например, линкер или внеклеточный домен второго рецептора клеточной поверхности). В некоторых таких вариантах осуществления для сохранения внеклеточного компонента, способного находиться в иммунологическом синапсе или охватывать иммунологический синапс при образовании комплекса с молекулой-мишенью, один или более доменов внеклеточного компонента могут быть усечены.
При некоторых заболеваниях (например, раке) амплитуда и качество ответа Т-клетки, возникающего в результате распознавания антигена Т-клеточным рецептором (TCR), могут быть дисрегулированы (например, уменьшены) из-за дисбаланса между костимулирующими и ингибирующими сигналами, что может привести к иммунной резистентности. Одним из преимуществ определенных слитых белков настоящего раскрытия является то, что первый сигнал может быть преобразован в качественно другой второй сигнал. Например, в некоторых вариантах осуществления слитые белки таковы, что отрицательный или ингибирующий сигнал можно эффективно превратить в положительный или костимулирующий сигнал, чтобы тем самым облегчить или минимизировать иммунную резистентность, связанную с заболеванием, таким как рак. Например, при связывании с мишенью, которая, если она связана ее естественным партнером по связыванию, приведет к ингибированию или доставке отрицательного сигнала, слитый белок, предусматриваемый в данном документе, в некоторых вариантах осуществления способен вместо этого доставлять положительный, например, косимулирующий сигнал, в клетку, в которой он экспрессируется, например, в Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления слитый белок по настоящему раскрытию содержит внеклеточный компонент, связанный с отрицательным сигналом, и внутриклеточный компонент, связанный с положительным сигналом. Иллюстративный рецептор, находящийся на поверхности Т-клеток, ассоциированный с цитотоксическим T-лимфоцитом антиген 4 (CTLA4 или CD152), может получить ингибирующий сигнал при связывании одним из его лигандов, CD80 или CD86, находящимся на APC. CTLA4 регулирует амплитуду ранней стадии активации Т-клеток, противодействуя костимулирующему Т-клеточному рецептору CD28 (см. Rudd et al., Immunol. Rev. 229:12, 2009). Другой иллюстративный рецептор, обнаруженный на поверхности Т-клеток, белок запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1 или CD279), может принимать ингибирующий сигнал при связывании одним из его лигандов, PD-L1 (B7-H1, CD274) или PD-L2 (B7-DC, CD73), находящимся на APC. PD-1 ограничивает активность Т-клеток в периферических тканях во время воспаления и сводит к минимуму аутоиммунность (см. Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26:677, 2008). Типичные слитые белки по настоящему раскрытию, содержащие внеклеточный компонент, связанный с отрицательным сигналом (например, CTLA4 или PD-1), и внутриклеточный компонент, связанный с положительным сигналом (например, CD28, CD137), включают слитый белок CTLA4-CD28, слитый белок CTLA4-CD137, слитый белок CTLA4-CD28-CD137, слитый белок PD1-CD28, слитый белок PD1-CD137 или слитый белок PD1-CD28-CD137.
Слитые белки по настоящему раскрытию могут блокировать или уменьшать количество ингибирующих сигналов, принимаемых иммунной клеткой. Например, в некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, превращает ингибирующий сигнал в положительный сигнал, за счет чего уменьшается общее количество ингибирующих сигналов, принимаемых иммунной клеткой, или превращая обычно отрицательный или ингибирующий сигнал в положительный. В других вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, блокирует передачу сигнала рецептора дикого типа. Например, слитые белки с преобладанием отрицательного сигнала включены в объем настоящего раскрытия. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, связывается с рецептором дикого типа и блокирует передачу сигнала рецептора дикого типа путем образования олигомера с рецептором дикого типа.
Еще одно преимущество определенных слитых белков по настоящему раскрытию состоит в том, что более чем один такой слитый белок может экспрессироваться клеткой, обеспечивая множественные стимулирующие сигналы. Было замечено, что рекомбинантные TCR, обладающие несколькими костимулирующими доменами, могут не создавать адекватную передачу костимулирующего сигнала. Коэкспрессия нескольких иммуномодулирующих слитых белков, особенно тех, которые могут находиться в иммунологическом синапсе, может обеспечить передачу костимулирующего сигнала, необходимую Т-клеткам, чтобы избежать анергии и пролиферации.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок по настоящему раскрытию действует in trans относительно TCR или химерного антигенного рецептора (CAR) или другого антигенного рецептора. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, действует вне иммунологического синапса.
В еще одном аспекте слитый белок по настоящему раскрытию позволяет накапливать трансдуцированные Т-клетки при рестимуляции опухолевыми клетками, экспрессирующими лиганд, который связывается с слитым белком, без необходимости в сортировке.
В одном иллюстративном варианте осуществления предусмотрен слитый белок, содержащий (а) внеклеточную часть CD200R, (b) трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный сигнальный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, примыкающую к трансмембранному домену CD28. В дополнительных вариантах осуществления внеклеточная часть CD200R содержит по меньшей мере приблизительно 231 аминокислоту с N-конца CD200R. В еще одном варианте осуществления слитый белок дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB).
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает слитый белок, содержащий (а) внеклеточную часть SIRPα, (b) трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный сигнальный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления слитый белок дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, примыкающую к трансмембранному домену CD28. В дополнительных вариантах осуществления внеклеточная часть SIRPα содержит по меньшей мере приблизительно 361 аминокислоту с N-конца SIRPα. В еще одном варианте осуществления слитый белок дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB).
Составные части слитых белков по настоящему раскрытию дополнительно подробно описаны в данном документе.
Внеклеточный компонент
Описываемый в данном документе слитый белок по настоящему раскрытию обычно содержит внеклеточный компонент, содержащий связывающий домен, который специфически связывает мишень. Связывание мишени с помощью связывающего домена слитого белка может (1) блокировать взаимодействие мишени с другой молекулой (например, блокировать или препятствовать взаимодействию рецептор-лиганд), (2) препятствовать, уменьшать или устранять определенные функции мишени (например, ингибирующую сигнальную трансдукцию), (3) индуцировать определенные биологические пути, которые обычно не индуцируются при связывании мишени (например, превращение ингибирующего или отрицательного сигнала в стимулирующий или положительный сигнал), например, в клетке, в которой экспрессируется слитый белок, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления слитые белки, описываемые в данном документе, содержат внеклеточную часть, где внеклеточная часть содержит внеклеточную часть белка, связанного с отрицательным сигналом.
Иллюстративными связывающими доменами по настоящему раскрытию могут являться эктодомены рецепторов клеточной поверхности или их связывающие части, эктодомены лигандов клеточной поверхности, цитокины (например, IL35), хемокины, связывающие домены на основе антител, связывающие домены на основе TCR, нетрадиционные связывающие домены или любая их комбинация. Например, связывающие домены, содержащие эктодомен CD200R, SIRPα, CD279 (PD-1), CD2, CD95 (Fas), CTLA4 (CD152), CD223 (LAG3), CD272 (BTLA), A2aR, KIR, TIM3, CD300 или LPA5, входят в объем настоящего раскрытия. Используемое в данном документе выражение «эктодомен» из рецептора или лиганда клеточной поверхности включает полный внеклеточный домен или его функциональный (связывающий) фрагмент. В определенных вариантах осуществления эктодомен содержит мутированный внеклеточный домен или его функциональный (связывающий) фрагмент, который имеет более высокую авидность к мишени по сравнению с белком дикого типа или эталонным белком. В определенных вариантах осуществления эктодомен содержит домен, подобный вариабельному, или CDR домена, подобного вариабельному.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий CD200-связывающий домен, такой как эктодомен CD200R или его CD200-связывающую часть. В качестве пояснения, CD200R представляет собой рецептор, который связывается с CD200, мембранным белком типа 1 суперсемейства иммуноглобулинов (Tonks et al., Leukemia 21:566-568, 2007). Сообщалось, что CD200 активируется при различных злокачественных новообразованиях, включая лейкоз, множественную миелому и различные солидные опухоли (например, меланому, карциному молочной железы и плоскоклеточную карциному). Фактически, высокие уровни экспрессии CD200 были связаны с плохим прогнозом при остром миелоидном лейкозе (AML), и было показано, что передача сигнала CD200R оказывает ингибирующее действие на Т-клетки (Coles et al., Leukemia 26: 2148-2151, 2012). В определенных вариантах осуществления эктодомен CD200R включает полноразмерную внеклеточную часть белка CD200R, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка CD200R, связывающий фрагмент внеклеточной части белка CD200R или связывающий фрагмент внеклеточной части белка CD200R вместе с частью трансмембранного домена CD200R, или любую их комбинацию.
В дополнительных вариантах осуществления CD200R кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:2. В определенных других вариантах осуществления эктодомен CD200R содержит по меньшей мере 200 аминокислот с N-конца CD200R. В некоторых других вариантах осуществления CD200R кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:11. В других вариантах осуществления внеклеточная часть CD200R содержит по меньшей мере 180, 190, 200, 210, 220, 230, 231, 234 или 243 аминокислоты с N-конца CD200R. Например, в определенных вариантах осуществления CD200R кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:8. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления CD200R, эктодомен CD200R или любой его CD200R-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой CD200R человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD200R, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:2.
В некоторых вариантах осуществления CD200R содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления CD200R содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34. В определенных вариантах осуществления CD200R содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:31. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления CD200R, эктодомен CD200R или любой его CD200R-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой CD200R человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD200R, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:25.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий CD47-связывающий домен, такой как эктодомен SIRPα или его связывающую часть. В качестве пояснения, CD47 представляет собой широко экспрессируемый трансмембранный белок, который играет роль в защите клеток от фагоцитоза (Willingham et al., PNAS 109: 6662-6667, 2012). Связывание CD47 с SIRPα инициирует передачу сигнала SIRPα, который ингибирует фагоцитоз макрофагами. Соответственно, подавление SIRPα приведет к увеличению фагоцитоза макрофагами. SIRPα экспрессируется на множестве типов опухолей человека, включая AML, хронический миелолейкоз (CML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), неходжкинскую лимфому (NHL), множественную миелому (MM), солидные опухоли легкого, мочевого пузыря и другие солидные опухоли. В определенных вариантах осуществления эктодомен SIRPα включает полноразмерную внеклеточную часть белка SIRPα, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка SIRPα, связывающий фрагмент внеклеточной части белка SIRPα и связывающий фрагмент внеклеточной части белка SIRPα вместе с частью трансмембранного домена SIRPα, или любую их комбинацию.
В дополнительных вариантах осуществления эктодомен SIRPα или его связывающая часть кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:17. В определенных вариантах осуществления эктодомен SIRPα содержит по меньшей мере 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 361, 370, 373 или более аминокислоты с N-конца SIRPα. В некоторых других вариантах осуществления SIRPα кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:21. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления SIRPα, эктодомен SIRPα или любой его SIRPα-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой SIRPα человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены SIRPα, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:17.
В дополнительных вариантах осуществления эктодомен SIRPα содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:40. В некоторых вариантах осуществления SIRPα содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления SIRPα, эктодомен SIRPα или любой его SIRPα-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой SIRPα человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены SIRPα, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:40.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий связывающий домен, который связывается с PD-L1, PD-L2 или и с тем, и с другим. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен PD-1 или его лиганд-связывающую часть. В определенных вариантах осуществления эктодомен PD-1 включает полноразмерную внеклеточную часть белка PD-1, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка PD-1, связывающий фрагмент внеклеточной части белка PD-1 или связывающий фрагмент внеклеточной части белка PD-1 вместе с частью трансмембранного домена PD-1, или любую их комбинацию. В определенных вариантах осуществления эктодомен PD-1 содержит по меньшей мере 80, 90, 100, 110, 120, 125, 130, 132, 135, 137, 140, 149, 150, 155, 158, 160 или 170 аминокислот с N-конца PD-1. Например, в определенных вариантах осуществления эктодомен PD-1 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:91, 93 или 95. В дополнительных вариантах осуществления эктодомен PD-1 содержит по меньшей мере от приблизительно 90 аминокислот до по меньшей мере приблизительно 130 аминокислот из PD-1, как изложено под SEQ ID NO:60. В еще одном варианте осуществления эктодомен PD-1 содержит 170 аминокислот с N-конца эктодомена PD-1, как изложено под SEQ ID NO:90. В некоторых вариантах осуществления PD-1 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:89. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления PD-1, эктодомен PD-1 или любой его PD-1-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой PD-1 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены PD-1, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:60. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены PD-1, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:90. В других вариантах осуществления предусмотрены связывающие домены PD-1, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:89.
В определенных вариантах осуществления эктодомен PD-1 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:92, 94 или 96. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены PD-1, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 92, 94 или 96. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления PD-1, эктодомен PD-1 или любой его PD-1-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой PD-1 человека.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен CD2. В определенных вариантах осуществления эктодомен CD2 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:61. В определенных вариантах осуществления эктодомен CD2 включает полноразмерную внеклеточную часть белка CD2, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка CD2, связывающий фрагмент внеклеточной части белка CD2 или связывающий фрагмент внеклеточной части белка CD2 вместе с частью трансмембранного домена CD2, или любую их комбинацию. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления CD2, эктодомен CD2 или любой его CD2-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой CD2 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD2, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной в GenBank под номером доступа NM_001767.3. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD2, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:61.
В некоторых вариантах осуществления эктодомен CD2 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:62. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD2, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:62. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления CD2, эктодомен CD2 или любой его CD2-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой CD2 человека.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий связывающий домен, который связывается с FasL. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен Fas (CD95). Fas экспрессируется на опухолеассоциированной сосудистой сети и предотвращает инфильтрацию CD8 клеток путем индуцирования клеточной гибели. В определенных вариантах осуществления эктодомен Fas включает полноразмерную внеклеточную часть белка Fas, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка Fas, связывающий фрагмент внеклеточной части белка Fas и связывающий фрагмент внеклеточной части белка Fas вместе с частью трансмембранного домена Fas, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эктодомен Fas кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:71. В других вариантах осуществления эктодомен Fas содержит по меньшей мере 150, 160, 161, 166, 170 или 173 аминокислоты с N-конца Fas. Например, в определенных вариантах осуществления Fas кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:73. В определенных других вариантах осуществления Fas кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:75. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления Fas, эктодомен Fas или любой его Fas-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой Fas человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены Fas, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной в GenBank под номером доступа NM_000043.4. В других дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены Fas, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:71.
В некоторых вариантах осуществления эктодомен Fas содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:72. В определенных вариантах осуществления эктодомен Fas содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:74. В определенных других вариантах осуществления эктодомен Fas содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:76. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления Fas, эктодомен Fas или любой его Fas-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой Fas человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены Fas, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:72.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен LAG3 (CD223). В определенных вариантах осуществления эктодомен LAG3 включает полноразмерную внеклеточную часть белка LAG3, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка LAG3, связывающий фрагмент внеклеточной части белка LAG3 и связывающий фрагмент внеклеточной части белка LAG3 вместе с частью трансмембранного домена LAG3, или любую их комбинацию. Например, в некоторых вариантах осуществления эктодомен LAG3 содержит приблизительно 420, 416, 415, 413 или 410 аминокислот с N-конца LAG3. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления LAG3, эктодомен LAG3 или любой его LAG3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой LAG3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены LAG3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной в GenBank под номером доступа NM_ 002286.5.
В дополнительных вариантах осуществления LAG3 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:153. В определенных других вариантах осуществления эктодомен LAG3 содержит по меньшей мере 430, 435, 438, 440, 445 или 450 аминокислот с N-конца LAG3. Например, в определенных вариантах осуществления LAG3 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:161. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления LAG3, эктодомен LAG3 или любой его LAG3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой LAG3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены LAG3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:153.
В некоторых вариантах осуществления LAG3 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:154. В некоторых вариантах осуществления LAG3 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:162. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления LAG3, эктодомен LAG3 или любой его LAG3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой LAG3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены LAG3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:154.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен TIM3. В определенных вариантах осуществления эктодомен TIM3 включает полноразмерную внеклеточную часть белка TIM3, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка TIM3, связывающий фрагмент внеклеточной части белка TIM3 и связывающий фрагмент внеклеточной части белка TIM3 вместе с частью трансмембранного домена TIM3, или любую их комбинацию. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления TIM3, эктодомен TIM3 или любой его TIM3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой TIM3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены TIM3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной в GenBank под номером доступа NM_032782.4.
В дополнительных вариантах осуществления TIM3 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:167. В определенных других вариантах осуществления эктодомен TIM3 содержит по меньшей мере 180, 185, 190, 195 или 200 аминокислот с N-конца TIM3. Например, в определенных вариантах осуществления TIM3 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:177. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления TIM3, эктодомен TIM3 или любой его TIM3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой TIM3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены TIM3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:167.
В некоторых вариантах осуществления TIM3 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:168. В некоторых вариантах осуществления TIM3 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:178. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления TIM3, эктодомен TIM3 или любой его TIM3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой TIM3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены TIM3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:168.
Связывающий домен может являться любым пептидом, который специфически связывает представляющую интерес мишень. Источники связывающих доменов включают вариабельные области антител от различных видов (которые могут быть в форме антител, sFvs, scFvs, Fabs, «grababody» на основе scFv или растворимых VH-доменов или доменных антител), в том числе человека, грызуна, птицы или овцы. Дополнительные источники связывающих доменов включают вариабельные области антител от других видов, таких как верблюдовые (от верблюдов, дромадеров или лам; Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 и Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998), акулы-няньки (Roux et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998), американский гидролаг (Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002), или миноговые (Herrin et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008 и Alder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008). Эти антитела могут образовывать антиген-связывающие области с использованием только вариабельной области тяжелой цепи, т.e. эти функциональные антитела являются гомодимерами только тяжелых цепей (называемые «антителами, состоящими только из тяжелых цепей») (Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al., Nature Med. 12:580, 2006; и Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 283:3639, 2008).
Альтернативные источники нетрадиционных связывающих доменов по настоящему раскрытию включают последовательности, которые кодируют случайные пептидные библиотеки, или последовательности, которые кодируют сконструированное многообразие аминокислот в петлевых областях альтернативных, отличных от антител каркасов, таких как scTCR (см., например, Lake et al., Int. Immunol.11:745, 1999; Maynard et al., J. Immunol. Methods 306:51, 2005; патент США №8361794), домены фибриногена (см., например, Weisel et al., Science 230:1388, 1985), домены Куница (см., например, патент США №6423498), сконструированные белки анкириновых повторов (DARPin) (Binz et al., J. Mol. Biol. 332:489, 2003 и Binz et al., Nat. Biotechnol. 22:575, 2004), фибронектин-связывающие домены (аднектины или монотела) (Richards et al., J. Mol. Biol. 326:1475, 2003; Parker et al., Protein Eng. Des. Selec. 18:435, 2005 и Hackel et al. (2008) J. Mol. Biol. 381:1238-1252), минибелки с цистеиновыми узлами (Vita et al. (1995) Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin et al. (2002) Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 и Huang et al. (2005) Structure 13:755, 2005), домены тетратрикопептидных повторов (Main et al., Structure 11:497, 2003 и Cortajarena et al., ACS Chem. Biol. 3:161, 2008), домены богатых лейцином повторов (Stumpp et al., J. Mol. Biol. 332:471, 2003), липокалиновые домены (см., например, WO 2006/095164, Beste et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999 и Schönfeld et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009), V-подобные домены (см., например, публикацию заявки на патент США №2007/0065431), лектиновые домены C-типа (Zelensky and Gready, FEBS J. 272:6179, 2005; Beavil et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 89:753, 1992 и Sato et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003), mAb2 или Fcab™ (см., например, публикации заявок на выдачу патента PCT №№ WO 2007/098934; WO 2006/072620), белки с повторами армадилло (см., например, Madhurantakam et al., Protein Sci. 21: 1015, 2012; публикация заявки на выдачу патента PCT № WO 2009/040338), аффилин (Ebersbach et al., J. Mol. Biol. 372: 172, 2007), аффибоди, авимеры, ноттины (пептиды с цистиновыми узлами) финомеры, атримеры, ассоциированный с цитотоксическим Т-лимфоцитом белок-4 (Weidle et al., Cancer Gen. Proteo. 10:155, 2013) или подобные (Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995; Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Euro. J. Biochem. 268:4269, 2001; Binz et al., Nat. Biotechnol. 23:1257, 2005; Boersma and Plückthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849, 2011).
В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой одноцепочечный T-клеточный рецептор (scTCR), содержащий цепи Vα/β и Cα/β (например, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ) или содержащий пару Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ, специфичную для представляющей интерес мишени (например, комплекса пептид-MHC или комплекса пептид-HLA).
В определенных вариантах осуществления связывающий домен содержит или представляет собой последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или на 100% идентична эктодомену, молекулы, имеющей аминокислотную последовательность Vα, Vβ, Cα или Cβ TCR, где каждый CDR содержит ноль изменений или не более одного, двух или трех изменений из TCR или его фрагмента или производного, которое специфически связывается с представляющей интерес мишенью.
В определенных вариантах осуществления область Vα, Vβ, Cα или Cβ связывающего домена по настоящему раскрытию может быть получена из или на основе Vα, Vβ, Cα или Cβ известного TCR (например, высокоаффинного TCR) и содержать одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) вставок, одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) делеций или одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен или неконсервативных аминокислотных замен), или комбинацию вышеуказанных изменений по сравнению с Vα, Vβ, Cα или Cβ известного TCR. Вставка, делеция или замена может находиться в любом месте в области Vα, Vβ, Cα или Cβ, в том числе на амино- или карбокси-конце или на обоих концах данной области, при условии, что каждый CDR содержит ноль изменений или не более одного, двух или трех изменений, и при условии, что связывающий домен, содержащий модифицированную область Vα, Vβ, Cα или Cβ, по-прежнему может специфически связывать свою мишень с аффинностью, подобной аффинности дикого типа. В определенных вариантах осуществления TCR имеет аффинность к комплексу пептид-HLA в диапазоне от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 500 мкМ. В дополнительных вариантах осуществления TCR имеет высокую аффинность к комплексу пептид-HLA в диапазоне от приблизительно 10 нM до приблизительно 200 пM.
В определенных аспектах слитый белок по настоящему раскрытию имеет внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень (например, лиганд или рецептор), где внеклеточный компонент необязательно включает один или более другие функциональные подкомпоненты или домены, такие как домен мультимеризации, линкер, соединительные аминокислоты или любая их комбинация.
В определенных вариантах осуществления слитый белок, раскрытый в данном документе, также содержит дополнительную внеклеточную область в дополнение к связывающему домену или в дополнение к части, полученной из молекулы, из которой получен связывающий домен, такую как спейсер или домен мультимеризации. Например, в некоторых аспектах домен мультимеризации содержится в или является частью внеклеточного компонента слитого белка. Например, домен мультимеризации может быть создан путем изменения (например, мутации) внеклеточного компонента, или домен мультимеризации может быть создан путем добавления от 1 до приблизительно 50 аминокислотных остатков к внеклеточному компоненту. Домен мультимеризации может располагаться между связывающим доменом внеклеточного компонента и гидрофобным компонентом слитого белка по настоящему раскрытию. В определенных вариантах осуществления слитый белок, экспрессируемый на поверхности клетки, содержит домен мультимеризации во внеклеточном компоненте, который расположен близко к клеточной мембране на расстоянии от одной до 50 аминокислот от гидрофобного компонента. Например, домен мультимеризации слитого белка может содержать один или более остатков цистеина, расположенных на расстоянии 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот от гидрофобного компонента слитого белка, где такой один или более остатков цистеина из одного слитого белка могут образовывать один или более дисульфидных мостиков с одним или более другими слитыми белками. В некоторых вариантах осуществления дополнительную внеклеточную часть получают из той же молекулы, из которой получают трансмембранную или стимулирующую область слитого белка.
В дополнительных вариантах осуществления взаимодействие(-я) между доменами мультимеризации двух или более слитых белков по существу способствуют или эффективно стимулируют сигнальную трансдукцию (например, стимуляцию или активацию иммунных клеток) по сравнению с мономером слитого белка. В определенных вариантах осуществления мультимеризация слитых белков стимулирует сигнальную трансдукцию в клетке-хозяине статистически значимым образом относительно мономеров слитого белка. В дополнительных вариантах осуществления мультимеризация слитых белков, которая стимулирует или усиливает сигнальную трансдукцию в клетке-хозяине, осуществляется через дисульфидный мостик.
Иллюстративный мультимер - это «димер», который относится к биологическому объекту, содержащему две молекулы, такие как два слитых белка, связанные друг с другом. Такой димер считается «гомодимером», когда два связанных слитых белка имеют по существу сходные или идентичные аминокислотные последовательности. Аналогичным образом, мультимеризация трех существенно или полностью идентичных слитых белков упоминается как «гомотример». В некоторых вариантах осуществления домен мультимеризации содержит по меньшей мере один остаток цистеина, где остаток цистеина домена мультимеризации из первого слитого белка может образовывать дисульфидный мостик с остатком цистеина домена мультимеризации из второго слитого белка. В определенных вариантах осуществления димер слитого белка образуется с помощью дисульфидного мостика. В других вариантах осуществления тример слитого белка образуется с помощью двух или более дисульфидных мостиков. В качестве альтернативы, димер, гомодимер, тример или гомотример могут мультимеризоваться с помощью мотива цинкового пальца или мотива лейциновой «молнии». В другом дополнительном варианте осуществления слитый белок содержит несколько доменов мультимеризации, которые могут быть расположены внеклеточно, внутриклеточно или и то, и другое.
В некоторых вариантах осуществления домен мультимеризации, содержащийся во внеклеточном компоненте слитого белка, содержит внеклеточную часть, примыкающую к гидрофобному компоненту. Например, в некоторых вариантах осуществления домен мультимеризации, содержащийся во внеклеточном компоненте слитого белка, содержит внеклеточную часть CD28, примыкающую к трансмембранному домену CD28. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CD28 содержит приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или до приблизительно 25 аминокислот, смежных с трансмембранным доменом. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CD28 содержит 9 аминокислот или 12 аминокислот, смежных с трансмембранным доменом. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CD28 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CD28 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:32. В еще одном иллюстративном варианте осуществления домен мультимеризации, содержащийся во внеклеточном компоненте слитого белка, содержит внеклеточную часть CD137 (4-1BB) (например, в диапазоне от одной до приблизительно 50 аминокислот), примыкающую к трансмембранному домену CD137 (4-1BB). В определенных вариантах осуществления домен мультимеризации и гидрофобный компонент получают из разных белков. Например, домен мультимеризации, содержащийся во внеклеточном компоненте слитого белка, содержит внеклеточную часть CD28, тянущуюся от трансмембранного домена CD137, или содержит внеклеточную часть CD137, примыкающую к трансмембранному домену CD28. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления домен мультимеризации может дополнительно содержать участок гликозилирования.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок может содержать линкерные или соединительные аминокислоты, соединяющие, например, внеклеточный компонент с доменом мультимеризации, или соединяющие внеклеточный компонент с гидрофобным компонентом, или соединяющие гидрофобный компонент с внутриклеточным компонентом. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой GlyxSery, где x и y независимо представляют собой целое число от 1 до 5.
Молекула-мишень, которая специфически связывается связывающим доменом, содержащимся в слитом белке по настоящему раскрытию, может находиться на представляющей интерес клетке («клетке-мишени») или в ассоциации с ней. Иллюстративные клетки-мишени включают иммунную клетку, раковую клетку, клетку, связанную с аутоиммунным заболеванием или нарушением или с воспалительным заболеванием или нарушением, и инфекционные организм или клетку (например, бактерию, вирус, инфицированную вирусом клетку), или любую клетку, презентирующую антиген в комплексе с MHC или лейкоцитарным антигеном человека (HLA). Клетка инфекционного организма, такого как паразит млекопитающего, также предусматривается в качестве клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления мишень представляет собой иммуносупрессорый лиганд. В некоторых вариантах осуществления мишень выбрана из CD47, CD58, CD80, CD86, CD95L (FasL), CD200, CD270 (HVEM), CD274 (PD-L1) или GAL9.
Внутриклеточный компонент
Внутриклеточный компонент, содержащийся в слитом белке по настоящему раскрытию, будет иметь внутриклеточный сигнальный домен, такой как активирующий домен или костимулирующий домен, способный передавать функциональные сигналы в клетку. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен будет опосредованно стимулировать клеточный ответ путем ассоциации с одним или более другими белками, которые непосредственно стимулируют клеточный ответ. Внутриклеточный сигнальный домен может включать один, два, три или более рецепторных сигнальных домена, костимулирующих домена или их комбинации. Любой внутриклеточный компонент, содержащий активирующий домен, костимулирующий домен или и то, и другое из любой из множества сигнальных молекул (например, рецепторов сигнальной трансдукции), можно использовать в слитых белках по настоящему раскрытию.
Используемое в данном документе выражение «внутриклеточный сигнальный домен» из рецептора или лиганда клеточной поверхности включает полный внутриклеточный домен, часть, содержащую внутриклеточный сигнальный домен, или его функциональный (сигнальный) фрагмент. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит мутированный внутриклеточный домен или его функциональный (сигнальный) фрагмент, который имеет повышенную сигнальную активность по сравнению с внутриклеточным сигнальным доменом дикого типа или эталонным внутриклеточным сигнальным доменом.
Используемое в данном документе выражение «костимулирующая молекула» относится к рецептору или молекуле клеточной поверхности, которая может трансдуцировать сигналы в Т-клетки для положительной модуляции активации Т-клеток (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). В качестве пояснения, активация и пролиферация Т-клеток требует двух сигналов, опосредованных вовлечением Т-клеточного антигенспецифического рецептора (TCR) и костимулирующего сигнала, наиболее типично, связывания CD28 с CD80 и CD86 (Ledbetter et al., Blood 75:1531, 1990).
Внутриклеточный сигнальный домен или его функциональный фрагмент, пригодный в слитых белках по настоящему раскрытию, может быть получен из CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), CARD11, DAP10, DAP12, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или его функциональный фрагмент не содержит первичный сигнал. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен не содержит CD3ζ.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен слитого белка по настоящему раскрытию содержит CD28. Передача сигнала CD28 способствует пролиферации Т-клеток, стимулированных через TCR (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). CD28 образует связанные дисульфидами гомодимеры за счет остатков цистеина, ближайших к трансмембранному домену (Lazar-Molnar et al., Cell Immunol. 244: 125-129, 2006). В определенных вариантах осуществления сигнальный домен CD28 включает полноразмерную внутриклеточную часть белка CD28, полноразмерную зрелую внутриклеточную часть белка CD28, сигнальный фрагмент внутриклеточной части белка CD28 и сигнальный фрагмент внутриклеточной части белка CD28 вместе с трансмембранным доменом или его фрагментом из CD28, или любую их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен слитого белка содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB). CD137 представляет собой костимулирующую молекулу, где связывание CD137 с его лигандом (4-1BBL или CD137L) ассоциировано с активацией и пролиферацией Т-клеток (Cheuk et al., Cancer Gene Therapy 11: 215-226, 2004). В определенных вариантах осуществления сигнальный домен CD137 включает полноразмерную внутриклеточную часть белка CD137, полноразмерную зрелую внутриклеточную часть белка CD137, сигнальный фрагмент внутриклеточной части белка CD137 и сигнальный фрагмент внутриклеточной части белка CD137 вместе с трансмембранным доменом или его фрагментом из CD137, или любую их комбинацию.
В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен рецептора лимфоцитов или содержит аминокислотные последовательности с одним или множеством иммунорецепторных тирозиновых активирующих мотивов immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM). В других дополнительных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит цитоплазматическую часть, которая ассоциирована с цитоплазматическим сигнальным белком, где цитоплазматический сигнальный белок представляет собой рецептор лимфоцитов или его сигнальный домен, белок, содержащий множество ITAM, костимулирующий фактор или любую их комбинацию.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает слитый белок, имеющий внеклеточный компонент, содержащий внеклеточную часть CD200R, которая специфически связывает CD200, внутриклеточный компонент, содержащий внутриклеточную часть CD28, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что комплекс слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе.
В конкретных вариантах осуществления внутриклеточный компонент слитого белка по настоящему раскрытию содержит CD28, CD137 (4-1BB) или и то, и другое. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:5. В некоторых других вариантах осуществления внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:13. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный компонент содержит два внутриклеточных сигнальных домена, например, CD28 и CD137 (4-1BB). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:5 и аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:13.
Гидрофобный компонент
Гидрофобная часть, содержащаяся в одноцепочечном слитом белке по настоящему раскрытию, позволит слитому белку по данному раскрытию ассоциировать с клеточной мембраной таким образом, что часть слитого белка будет располагаться внеклеточно, а часть будет располагаться внутриклеточно (например, внутриклеточный сигнальный домен). Гидрофобный компонент, как правило, будет располагаться в пределах фосфолипидного бислоя клеточной мембраны. В определенных вариантах осуществления одна или более соединительных аминокислот могут располагаться между и соединять гидрофобную часть с внутриклеточным сигнальным доменом.
В определенных вариантах осуществления гидрофобный домен представляет собой трансмембранный домен, как, например, полученный из интегрального мембранного белка (например, рецептор, молекула кластера дифференцировки (CD), фермент, переносчик, молекула клеточной адгезии и т.п.). В некоторых вариантах осуществления гидрофобный домен содержит трансмембранный домен, находящийся или полученный из интегрального мембранного белка, где трансмембранный домен был модифицирован путем добавления, удаления или замены одной или более аминокислот по меньшей мере одной отличающейся аминокислотой, или любой их комбинацией, такой как заряженные или гидрофильные остатки, которые облегчают межмолекулярные взаимодействия. Таким образом, выражение «гидрофобный домен» включает трансмембранные домены, имеющие, например, модификации, которые могут снижать гидрофобность.
В некоторых вариантах осуществления гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD2, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95 (Fas), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD200R, CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD272 (BTLA), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), TIM3, CD300, CD357 (GITR), A2aR, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LPA5, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPα, pTα, TCRα, TCRβ, TIM3, TRIM или Zap70. В конкретных вариантах осуществления гидрофобная часть представляет собой трансмембранный домен CD28, CD4, CD8, CD27 или CD137 (4-1BB). В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD28 с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:4. В определенных других вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD200R с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:3. В других вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен SIRPα с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:18. В дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD2 с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:63. В других дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен Fas с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:77. В других дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен TIM3. В других дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен TIM3 с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:169. В других дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен LAG3. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен LAG3 с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:155.
Нуклеиновые кислоты и клетки-хозяева
В определенных аспектах настоящее раскрытие предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любой один или более из слитых белков, описанных в данном документе, которые могут быть иммуномодулирующими слитыми белками (IFP). Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть вставлены в соответствующий вектор (например, вирусный вектор или невирусный плазмидный вектор) для введения в клетку-хозяина, представляющую интерес (например, гемопоэтическую клетку-предшественника, Т-клетку).
Используемый в данном документе выражение «рекомбинантный» или «отличный от природного» относится к организму, микроорганизму, клетке, молекуле нуклеиновой кислоты или вектору, которые включают по меньшей мере одно генетическое изменение или были модифицированы путем введения экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты, где такие изменения или модификации вводят с помощью способов генной инженерии. Генетические изменения включают, например, модификации с введением экспрессируемых молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белки, слитые белки или ферменты, или другие добавления молекул нуклеиновых кислот, делеции, замены или другие функциональные нарушения генетического материала клетки. Дополнительные модификации включают, например, некодирующие регуляторные области, в которых модификации изменяют экспрессию гена или оперона. В определенных вариантах осуществления клетка, такая как Т-клетка, полученная от субъекта, может быть превращена в отличную от природной или рекомбинантную клетку (например, отличную от природной или рекомбинантную Т-клетку) путем введения нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый белок, описываемый в данном документе, и в результате чего клетка экспрессирует слитый белок.
В определенных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, могут быть кодон-оптимизированы для повышения или увеличения до максимума экспрессии в определенных типах клеток, таких как T-клетки (Scholten et al., Clin. Immunol. 119: 135-145, 2006).
В одном иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28 (huCD200Rtm-CD28), где внеклеточный компонент содержит эктодомен CD200R, гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD200R и внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28. Например, в одном варианте осуществления предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, изложенная под SEQ ID NO:1.
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28 (huCD200R-CD28tm), где гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28. Например, в одном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:6.
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен CD200R и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен CD200R может быть усечен на 9 аминокислот (например, huCD200R-9aas-CD28Cys, SEQ ID NO:7) или на 12 аминокислот (например, huCD200R-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:10).
В одном иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28-4-1BB (huCD200R-9aas-CD28Cystm-41BBic или huCD200R-12aas-CD28Cystm-41BBic), где внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB). Например, в одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14.
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28-4-1BB (huCD200R-9aas-CD28Cys tm ic 41BBic или huCD200R-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic), где внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28 и CD137 (4-1BB). В одном варианте осуществления, например, нуклеиновая кислота по настоящему раскрытию имеет нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:15.
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию SIRPα-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:16 (huSIRPαtm-CD28) или SEQ ID NO:19 (huSIRPα-CD28tm).
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию SIRPα-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен SIRPα и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен SIRPα может быть усечен на 12 аминокислот (например, huSIRPα-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:20).
В одном иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию SIRPα-CD28-4-1BB (huSIRPα-12aas-CD28Cystm-41BBic), где внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB). Например, в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по настоящему раскрытию имеет нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:22.
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию SIRPα-CD28-4-1BB (huSIRPα-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic), где внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28 и CD137 (4-1BB). В одном варианте осуществления, например, нуклеиновая кислота по настоящему раскрытию имеет нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:23.
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию PD-1-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:97 (huPD1-CD28Cys).
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию PD-1-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен PD-1 и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен PD-1 может быть усечен на 12 аминокислот (например, huPD1-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:99), 15 аминокислот (например, huPD1-15aas-CD28Cys, SEQ ID NO:101), или 21 аминокислоту (например, huPD1-21aas-CD28Cys, SEQ ID NO:103).
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD2-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:69 (huCD2-CD28Cys).
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию Fas-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:83 (huFas-CD28Cys).
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию Fas-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен Fas и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен Fas может быть усечен на 7 аминокислот (например, huFas-7aas-CD28Cys, SEQ ID NO:85) или 12 аминокислот (например, huFas-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:87).
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию TIM3-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:173 (huTIM3-CD28Cys). Также в объем настоящего раскрытия включен слитый белок TIM3-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен TIM3 и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен TIM3 может быть усечен на 12 аминокислот (например, huTIM3-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:175).
В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию LAG3-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:163 (huLAG3-CD28Cys). Также в объем настоящего раскрытия включен слитый белок LAG3-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен LAG3 и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен LAG3 может быть усечен на 12 аминокислот (например, huLAG3-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:159).
Вектор, который кодирует нуклеокапсид вируса, называют в данном документе «вирусным вектором». Существует большое количество доступных вирусных векторов, пригодных для применения с композициями по настоящему раскрытию, в том числе те, которые идентифицированы для применений в генной терапии человека (см. Pfeifer and Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001). Подходящие вирусные векторы включают векторы на основе РНК-вирусов, такие как векторы, полученные на основе ретровируса, например, векторы, полученные на основе вируса мышиного лейкоза Молони (MLV), и включают более сложные векторы, полученные на основе ретровируса, например, векторы, полученные на основе лентивируса. Векторы, полученные на основе HIV-1, относятся к этой категории. Другие примеры включают лентивирусные векторы, полученные из HIV-2, FIV, вируса инфекционной анемии лошадей, SIV и вируса Меди-Висна (лентивируса овец). Способы использования ретровирусных и лентивирусных вирусных векторов и упаковывающих клеток для трансдукции клеток млекопитающих-хозяев вирусными частицами, содержащими трансгены химерных антигенных рецепторов, известны из уровня техники и были ранее описаны, например, в патенте США №8119772; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009. Ретровирусные и лентивирусные векторные конструкции и системы экспрессии также коммерчески доступны.
В определенных вариантах осуществления вирусный вектор применяют для введения неэндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, или неэндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, специфичный к мишени. Вирусный вектор может представлять собой ретровирусный вектор или лентивирусный вектор. Вирусный вектор может также включать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие маркер трансдукции. Маркеры трансдукции для вирусных векторов известны из уровня техники и включают маркеры отбора, которые могут придавать устойчивость к лекарственным средствам, или детектируемые маркеры, такие как флуоресцентные маркеры, или белки клеточной поверхности, которые могут быть выявлены с помощью таких способов, как проточная цитометрия. В конкретных вариантах осуществления вирусный вектор дополнительно содержит ген-маркер для трансдукции, включающий зеленый флуоресцентный белок (GFP), внеклеточный домен CD2 человека или усеченный EGFR человека (huEGFRt; см. Wang et al., Blood 118:1255, 2011). Если геном вирусного вектора содержит множество последовательностей нуклеиновых кислот, которые необходимо экспрессировать в клетке-хозяине в виде отдельных транскриптов, то вирусный вектор может также содержать дополнительные последовательности между двумя (или более) транскриптами, что обеспечивает возможность бицистронной или мультицистронной экспрессии. Примеры таких последовательностей, применяемых в вирусных векторах, включают участки внутренней посадки рибосомы (IRES), участки расщепления фурином, вирусный пептид 2A или любую их комбинацию.
Другие векторы также можно применять для доставки полинуклеотидов, в том числе векторы на основе вирусной ДНК, включая, например, векторы на основе аденовируса и векторы на основе адено-ассоциированного вируса (AAV); векторы, полученные из вирусов простого герпеса (HSV), в том числе ампликон-векторы, HSV с недостаточной репликацией и аттенуированный HSV (Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998).
Другие векторы, недавно разработанные для применений в генной терапии, также можно применять с композициями и способами по настоящему раскрытию. Такие векторы включают векторы, полученные из бакуловирусов и α-вирусов (Jolly, D. J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp. 209-40, под ред. Friedmann T. The Development of Human Gene Therapy. Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Lab) или плазмидные векторы (такие как «спящая красавица» и другие транспозонные векторы). В некоторых вариантах осуществления вирусный или плазмидный вектор дополнительно содержит генный маркер трансдукции (например, зеленый флуоресцентный белок, huEGFRt).
В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий слитый белок, раскрываемый в данном документе, может кодировать более чем один слитый белок. Например, вектор может кодировать два разных слитых белка (например, первый слитый белок, содержащий эктодомен PD-1, и второй слитый белок, содержащий эктодомен TIM3).
В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий слитый белок, раскрываемый в данном документе, может дополнительно содержать антигенспецифический TCR. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифический TCR является экзогенным. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифический TCR специфичен в отношении антигена, рестриктированного по HLA (MHC) класса I. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой рак-специфический антиген. Варианты осуществления, в которых рак-специфический антиген включает WT-1, мезотелин или циклин-A1, также входят в объем настоящего раскрытия. В других вариантах осуществления вектор, который кодирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, дополнительно кодирует лиганд, который может представлять собой CD200, CD47, PD-L1 или CD58. В других вариантах осуществления вектор, который кодирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, дополнительно кодирует siRNA для уменьшения экспрессии эндогенного рецептора. В некоторых конкретных вариантах осуществления эндогенный рецептор представляет собой CD200R, SIRPα, CD279 (PD-1), CD95 (Fas) или CD2.
В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева, способные экспрессировать слитый белок по настоящему раскрытию на поверхности клетки, являются иммунными клетками. В некоторых вариантах осуществления клетками-хозяевами, способными экспрессировать слитый белок по настоящему раскрытию на клеточной поверхности, являются T-клетки, в том числе первичные клетки или клеточные линии, полученные от человека, мыши, крысы или других млекопитающих. При получении от млекопитающего Т-клетка может быть получена из различных источников, включая кровь, костный мозг, лимфатический узел, тимус или другие ткани или жидкости. T-клетка может быть накоплена или очищена. T-клеточные линии хорошо известны из уровня техники, некоторые из них описаны в Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000. В определенных вариантах осуществления применяют Т-клетки, лишенные эндогенной экспрессии цепей TCRα и β. Такие T-клетки могут естественным образом не иметь эндогенной экспрессии цепей TCRα и β или могут быть модифицированы с блокированием экспрессии (например, T-клетки от трансгенных мышей, которые не экспрессируют цепи TCRα и β, или клетки, которых подвергли манипуляции для ингибирования экспрессии цепей TCRα и β) или с нокаутом TCRα-цепи, TCRβ-цепи или обоих генов. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки могут быть сконструированы для экспрессии TCR, специфичного для конкретного антигена.
В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, является функциональной Т-клеткой, такой как вирус-специфичная Т-клетка, специфичная к опухолевому антигену цитотоксичная Т-клетка, наивная Т-клетка, стволовая Т-клетка памяти, центральная или эффекторная Т-клетка памяти, γδ T-клетки или регуляторная CD4+ CD25+ T-клетка. В дополнительных вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему раскрытию, вводят в совокупность CD8+ Т-клеток, наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ TCM-клеток, CD8+ TEM-клеток или любую их комбинацию. В других вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему раскрытию, вводят в совокупность CD4+ T-клеток, наивных CD4+ T-клеток, CD4+ TCM-клеток, CD4+ TEM-клеток или любую их комбинацию. В других вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему раскрытию, вводят в популяцию Т-клеток, обогащенную наивными CD8+ Т-клетками и CD8+ TCM-клетками. В других вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему раскрытию, вводят в популяцию T-клеток, обогащенную наивными CD4+ T-клетками и CD4+ TCM-клетками. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления Т-клетки дополнительно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую сконструированный антигенспецифический Т-клеточный рецептор (TCR), сконструированный антигенспецифический высокоаффинный TCR, экзогенную костимулирующую молекулу, химерный антигенный рецептор (CAR) или любую их комбинацию.
В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, является функциональной естественной клеткой-киллером.
В культуру, используемую для размножения Т-клеток, можно добавлять один или более факторов роста-цитокинов, которые стимулируют пролиферацию Т-клеток, экспрессирующих слитый белок по настоящему раскрытию. Цитокины могут быть человеческими или отличными от человеческих. Иллюстративные факторы роста-цитокины, которые можно применить для стимуляции пролиферации Т-клеток, включают IL2, IL15 или подобные.
В некоторых вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, представляет собой CD4+ Т-клетку, которая также экспрессирует антигенспецифический высокоаффинный TCR, специфичный в отношении антигена, рестриктированного по HLA (MHC) класса I (см. Soto et al., Cancer Immunol Immunother. 62: 359-369, 2013).
В определенных вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, также экспрессирует рекомбинантный TCR, специфичный к раковому антигену. В некоторых вариантах осуществления раковый антиген представляет собой WT1. «WT1»означает опухоль Вильма 1, фактор транскрипции, который содержит четыре мотива «цинковые пальцы» на C-конце и богатый пролином/глутамином ДНК-связывающий домен на N-конце. WT1 играет важную роль в нормальном развитии мочеполовой системы и является мутировавшим у небольшой субпопуляции пациентов с опухолями Вильма. Высокий уровень экспрессии WT1 наблюдается при различных формах рака, включая рак молочной железы, рак яичников, формы острого лейкоза, сосудистые новообразования, формы меланомы, рак толстой кишки, рак легких, рак щитовидной железы, саркому кости и мягких тканей и рак пищевода. Альтернативный сплайсинг был описан для WT1.
В определенных вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, также экспрессирует рекомбинантный TCR, специфичный к мезотелину. «Мезотелин» (MSLN) относится к гену, который кодирует белок-предшественник, который расщепляется на два продукта: фактор стимуляции мегакариоцитов и мезотелин. Фактор стимуляции мегакариоцитов действует как цитокин, который может стимулировать колониеобразование мегакариоцитов в костном мозге. Мезотелин представляет собой закрепленный с помощью гликозилфосфатидилинозита белок клеточной поверхности, который может функционировать как белок клеточной адгезии. Этот белок сверхэкспрессируется в эпителиальных мезотелиомах, формах рака яичников и в отдельных формах плоскоклеточных карцином. Альтернативный сплайсинг дает в результате множество вариантов транскриптов.
В определенных вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, также экспрессирует рекомбинантный TCR, специфичный к циклину-A1.
В определенных вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, также экспрессирует CAR.
В других вариантах осуществления клетка-хозяин, которая экспрессирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, дополнительно содержит лиганд, который может представлять собой CD200, CD47, PD-L1 или CD58. В других вариантах осуществления клетка-хозяин, которая экспрессирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, дополнительно экспрессирует siRNA для уменьшения экспрессии эндогенного рецептора. В некоторых конкретных вариантах осуществления эндогенный рецептор представляет собой CD200R, SIRPα, CD279 (PD-1), CD95 (Fas) или CD2.
В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин, которая экспрессирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, может экспрессировать более чем один слитый белок. Например, клетка-хозяин может экспрессировать два разных слитых белка (например, первый слитый белок, содержащий эктодомен PD-1, и второй слитый белок, содержащий эктодомен TIM3).
Применения
Заболевания, которые можно лечить с использованием клеток, экспрессирующих слитые белки, описываемые в настоящем раскрытии, включают рак, инфекционные заболевания (вирусные, бактериальные, протозойные инфекции), иммунные заболевания (например, аутоиммунные) или заболевания, связанные со старением (например, физиологическим старением). Адоптивная иммунная и генная терапия представляют собой перспективные способы лечения различных типов рака (Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007) и инфекционных заболеваний (Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011).
Разнообразные формы рака, включая солидные опухоли и формы лейкоза, восприимчивы к композициям и способам, раскрытым в данном документе. Иллюстративные типы рака, которые можно лечить, включают аденокарциному молочной железы, предстательной железы и толстой кишки; все формы бронхогенной карциномы легкого; миелоидный лейкоз; меланому; гепатому; нейробластому; папиллому; апудому; хористому; бранхиому; злокачественный карциноидный синдром; карциноидную болезнь сердца и карциному (например, крациносаркому Уокера, базально-клеточную карциному, базальную плоскоклеточную карциному, карциному Брауна-Пирса, внутрипротоковую карциному, опухоль Эрлиха, карциному Кребса 2, карциному из клеток Меркеля, слизеобразующий рак, немелкоклеточный рак легкого, овсяноклеточный рак, папиллярную карциному, фиброзный рак, рак бронха, бронхогенный рак, плоскоклеточный рак и переходноклеточный рак). Другие типы рака, которые можно лечить, включают гистиоцитарные нарушения; злокачественный гистиоцитоз; лейкоз; болезнь Ходжкина; средиземноморскую лимфому; неходжкинскую лимфому; плазмоцитому; ретикулоэндотелиоз; меланому; хондробластому; хондрому; хондросаркому; фиброму; фибросаркому; гигантоклеточные опухоли; гистиоцитому; липому; липосаркому; мезотелиому; миксому; миксосаркому; остеому; остеосаркому; хордому; краниофарингиому; дисгерминому; гамартому; мезенхимому; мезонефрому; миосаркому; амелобластому; цементому; одонтому; тератому; тимому; трофобластическую опухоль. Кроме того, следующие типы рака также рассматриваются как поддающиеся лечению: аденома; холангиома; холестеатома; циклиндрома; цистаденокарцинома; цистаденома; гранулезоклеточная опухоль; арренобластома; гепатома; гидраденома; инсулома; опухоль из клеток Лейдига; папиллома; опухоль из клеток Сертоли; текаклеточная опухоль; лейомиома; лейомиосаркома; зернисто-клеточная миобластома; миома; миосаркома; рабдомиома; рабдомиосаркома; эпендимома; ганглионеврома; глиома; медуллобластома; менингиома; невринома; нейробластома; эпендимома; нейрофиброма; неврома; параганглиома; нехромаффинная параганглиома. Типы рака, которые можно лечить, также включают ангиокератому; ангиолимфоидную гиперплазию с эозинофилией; склерозирующую ангиому; ангиоматоз; гломангиому; гемангиоэндотелиому; гемангиому; гемангиоперицитому; гемангиосаркому; лимфангиому; лимфангиомиому; лимфангиосаркому; пинеалому; карциносаркому; хондросаркому; листовидную цистосаркому; фибросаркому; гемангиосаркому; леймиосаркому; лейкосаркому; липосаркому; лимфангиосаркому; миосаркому; миксосаркому; карциному яичников; рабдомиосаркому; саркому; новообразования; нейрофиброматоз и дисплазию шейки матки.
Иллюстрацией различных гиперпролиферативных нарушений, восприимчивых к терапии с помощью Т-клеток со слитым белком, являются формы B-клеточного рака, в том числе B-клеточные лимфомы (такие как различные формы болезни Ходжкина, неходжкинская лимфома (NHL) или лимфомы центральной нервной системы), лейкозы (такие как острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), злокачественный ретикулоэндотелиоз, бластная трансформация В-клеток при хроническом миелоидном лейкозе) и миеломы (такие как множественная миелома). Дополнительные формы В-клеточного рака включают мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому маргинальной зоны селезенки, плазмаклеточную миелому, солитарную плазмоцитому кости, экстраоссальную плазмоцитому, экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), нодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны, фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную В-крупноклеточную лимфому, В-крупноклеточную лимфому средостения (из тимуса), внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфому/лейкоз Беркитта, формы B-клеточной пролиферации с неопределенным потенциалом злокачественности, лимфогранулематоз и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение.
Воспалительные и аутоиммунные заболевания включают артрит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, полихондрит, псориатический артрит, псориаз, дерматит, полимиозит/дерматомиозит, миозит с включенными тельцами, воспалительный миозит, токсический эпидермальный некролиз, системную склеродермию и склероз, CREST-синдром, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), менингит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзему, астму, состояния, включающие инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные реакции, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, нарушение адгезии лейкоцитов, системную красную волчанку (SLE), подострую кожную красную волчанку, дискоидную волчанку, миелит при системной красной волчанке, энцефалит при системной красной волчанке, ювенильный диабет, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, нейромиелит зрительного нерва, острый ревматизм, хорею Сиденгама, иммунные реакции, ассоциированные с острой гиперчувствительностью и гиперчувствительностью замедленного типа, опосредованными цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, в том числе гранулематоз Вегенера и болезнь Чарга-Стросса, агранулоцитоз, васкулит (в том числе аллергический васкулит/ангиит, ANCA и ревматоидный васкулит), апластическую анемию, анемию Даймонда-Блекфана, иммунную гемолитическую анемию, в том числе аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию, истинную эритроцитарную аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболевания, связанные с диапедезом лейкоцитов, воспалительные заболевания центральной нервной системы (CNS), синдром полиорганной недостаточности, миастению гравис, заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, легочный гемосидероз с гломерулонефритом, антифосфолипидный синдром, аллергический неврит, болезнь Бехчета, синдром Каслмана, синдром Гудпасчера, миастенический синдром Ламберта-Итона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, отторжение трансплантата паренхиматозных органов, болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD), буллезный пемфигоид, пемфигус, формы аутоиммунной полиэндокринопатии, формы серонегативной спондилоартропатии, болезнь Рейтера, синдром скованного человека, гигантоклеточный артериит, нефрит, ассоциированный с нарушенным выведением иммунных комплексов, IgA-нефропатию, формы IgM-полиневропатии или опосредованную IgM невропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромбоцитопенический акроангиотромбоз (TTP), пурпуру Шенлейна-Геноха, аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание яичек и яичников, в том числе аутоиммунные орхит и оофорит, первичный гипотиреоз, аутоиммунные эндокринные заболевания, в том числе аутоиммунный тиреоидит, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), подострый тиреоидит, идиопатический гипотиреоз, болезнь Аддисона, болезнь Грейвса, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или синдромы полигландулярной эндокринопатии), диабет I типа, также известный как инсулин-зависимый сахарный диабет (IDDM) и синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (HIV), облитерирующий бронхиолит (без пересадки), неспецифическую интерстициальную пневмонию (NSIP), синдром Гийена-Барре, васкулит крупных сосудов (в том числе ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (синдром Такаясу), васкулит средних сосудов (в том числе болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), узелковый полиартериит (PAN), анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Бергера (IgA-нефропатию), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный билиарный цирроз печени, целиакию-спру (глютеновую энтеропатию), криоглобулинемию, криоглобулинемию, ассоциированную с гепатитом, латеральный амиотрофический склероз (ALS), ишемическую болезнь сердца, семейную средиземноморскую лихорадку, микроскопический полиангиит, синдром Когана, синдром Вискотта-Олдрича и облитерирующий тромбангиит.
В конкретных вариантах осуществления способ лечения субъекта с использованием слитого белка, раскрываемого в данном документе, включает лечение острого миелоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза и хронического миелоцитарного лейкоза.
Инфекционные заболевания включают заболевания, связанные с возбудителями инфекции, которые включают любое из множества бактерий (например, патогенных E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa, B. anthracis, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, H. pylori, V. cholerae, Listeria spp., Rickettsia spp., Chlamydia spp. и т.п.), микобактерий и паразитов (в том числе любого из известных паразитарных представителей Protozoa). Инфекционные вирусы включают вирусы эукариотических клеток, такие как аденовирус, буньявирус, герпесвирус, паповавирус, папилломавирус (например, HPV), парамиксовирус, пикорнавирус, рабдовирус (например, вирус бешенства), ортомиксовирус (например, вирус гриппа), поксвирус (например, вирус коровьей оспы), реовирус, ретровирус, лентивирус (например, HIV), флавивирус (например, HCV, HBV) или т.п. В определенных вариантах осуществления инфекцию, вызванную цитозольными патогенами, антигены которых обрабатываются и презентируются молекулами HLA (MHC) класса I, лечат с использованием слитых белков по настоящему раскрытию.
Слитый белок по настоящему раскрытию можно вводить субъекту в связанной с клеткой форме (например, генная терапия популяции клеток-мишеней (зрелых T-клеток (например, CD8+ или CD4+ T-клеток) или других клеток Т-клеточной линии дифференцировки)). В конкретном варианте осуществления клетки Т-клеточной линии дифференцировки, экспрессирующие слитые белки, вводимые субъекту, являются сингенными, аллогенными или аутологичными клетками.
Фармацевтические композиции, содержащие слитые белки по настоящему раскрытию, можно вводить способом, подходящим для заболевания или состояния, подлежащих лечению (или предупреждению), определяемым специалистами в области медицины. Соответствующая доза, подходящая длительность и частота введения композиций будут определяться такими факторами, как состояние пациента, габариты, тип и тяжесть заболевания, конкретная форма активного ингредиента и способ введения. Настоящее раскрытие предусматривает фармацевтические композиции, содержащие клетки, экспрессирующие слитый белок, раскрываемый в данном документе, и фармацевтически приемлемые носитель, растворители или наполнитель. Подходящие наполнители включают воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин или подобное и их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к способу увеличения активности иммунной клетки, увеличения или продления иммунного ответа, стимулирования антигенспецифического ответа Т-клеток, ингибирования иммуносупрессорного сигнального пути, лечения рака или опухоли, подавления иммунной резистентности раковых клеток или лечения инфекции, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества клетки-хозяина, экспрессирующей слитый белок, описываемый в данном документе. В дополнительных вариантах осуществления клетка-хозяин для применения в любом из вышеупомянутых способов дополнительно экспрессирует сконструированный антигенспецифический TCR, сконструированный антигенспецифический высокоаффинный TCR, CAR, костимулирующую молекулу или любую их комбинацию. В конкретных вариантах осуществления предусмотрены способы лечения лейкоза, включающие коэкспрессию слитого белка, раскрываемого в данном документе, и рекомбинантного антигенспецифического TCR.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы индуцирования или усиления ответа HLA класса I с помощью CD4+ Т-клетки, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества CD4+ Т-клетки, экспрессирующей слитый белок, описываемый в данном документе. В дополнительных вариантах осуществления клетка-хозяин для применения в индуцировании или усилении ответа HLA класса I с помощью CD4+ Т-клетки дополнительно экспрессирует сконструированный антигенспецифический TCR, сконструированный антигенспецифический высокоаффинный TCR, CAR, костимулирующую молекулу или любую их комбинацию.
В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления способы эффективны в отсутствие введения экзогенного IL-2.
В других вариантах осуществления субъект в любом из вышеупомянутых способов дополнительно получает лечение с помощью вспомогательной терапии, такой как химиотерапия. Иллюстративные химиотерапевтические средства включают, например, алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; хлорэтиламины, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид мехлорэтамин оксида, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромоностанола, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства для угнетения функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльформитин; эллиптиний ацетат; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSKTM; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например, паклитаксел (Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси) и доцетаксел (Taxotere™, Rhone-Poulenc Rorer, Энтони, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины, капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных.
В некоторых вариантах осуществления вспомогательная терапия представляет собой вакцину, ингибитор сигнала иммуносупрессии, ингибитор B-Raf, ингибитор MEK, ингибитор тирозинкиназы, цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления ингибитор сигнала иммуносупрессии представляет собой антитело или siRNA. В некоторых вариантах осуществления антитело или siRNA специфичны для PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, LAG3, KIR, CD244, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, TIM3, A2aR или любой их комбинации.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Конструкции слитого белка CD200R-CD28
Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, проиллюстрированы с использованием схематических изображений на фигуре 1А. Иллюстративные слитые белки включают иммуномодулирующие слитые белки (IFP), состоящие из внеклеточного домена CD200R или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 или его части (фигура 1A, конструкции I-V). Гидрофобный компонент может состоять из трансмембранного домена либо CD200R (фигура 1А, конструкция I), либо CD28 (фигура 1А, конструкции II-V), или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках CD200R-CD28 гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с гидрофобным компонентом (например, фигура 1A конструкция III, CD200R-CD28Cys, конструкция IV, CD200R-3aas-CD28Cys и конструкция V, CD200R-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать всю или часть внеклеточного домена CD200R. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный компонент содержит целый внеклеточный домен CD200R (фигура 1А, конструкции I-III). В других примерах внеклеточный компонент содержит первые 235 аминокислот (с сохранением N-связанного участка гликозилирования) (например, фигура 1А, конструкция IV, CD200R-3aas-CD28Cys) или первые 229 аминокислот (например, фигура 1А, конструкция V, CD200R-9aas-CD28Cys) с N-конца CD200R. Размер внеклеточного компонента, на который можно воздействовать путем корректировки конструкции слитого белка, может влиять на способность слитого белка проникать в иммунологический синапс и колокализоваться с TCR в cSMAC для обеспечения сильного костимулирующего сигнала. Кроме того, конструкция CD200R-CD28 имеет возможность превращать то, что обычно является ингибирующим сигналом при связывании CD200R с его мишенью, в положительный сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.
Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок CD200R-CD28, содержит следующие элементы (от 5' к 3'): Внеклеточный компонент (CD200R)-домен мультимеризации (CD28-цистеин)-гидрофобный компонент (трансмембранный CD28)-внутриклеточный компонент (внутриклеточный CD28). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок CD200R-CD28, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под любым из SEQ ID NO:47-51 или 1, 6, 7, 10, 12, 14 или 15.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие конструкции, заказывали в Invitrogen или создавали на месте с помощью ПЦР, затем направленно TOPO-клонировали в вектор pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen) и переносили в ретровирусный вектор pMP71-attR с использованием технологии Gateway® (Invitrogen). В определенных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие IFP по настоящему раскрытию, кодон-оптимизировали перед клонированием в ретровирусный вектор pMP71-attR.
Пример 2
Трансгенная экспрессия конструкций CD200R-CD28
Доклиническую мышиную модель диссеминированного лейкоза на основе индуцированного у мышей C57BL/6 вирусом Френда эритролейкоза (FBL) и трансгенных мышей TCRgag использовали для определения того, могут ли химерные рецепторы CD200R-CD28 улучшить функцию T-клеток.
Трансгенных по TCR мышей получали для получения CD8+ T-клеток, специфичных к эпитопу gag (TCRgag). Мышей C57BL/6 (B6) приобретали в Jackson Laboratory. Трансгенные мыши TCRgag экспрессируют трансген TCR, специфичный для эпитопа gag вируса Френда в CD8+ T-клетке (Öhlén et al., J. Immunol. 166: 2863-2870, 2001). Все проведенные исследования на животных были одобрены в соответствии с протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию университета штата Вашингтон (протокол № 2013-01). Индуцированный вирусом B6 Френда мыши эритролейкоз (FBL) экспрессирует кодируемый F-MuLV эпитоп gag (пептид CCLCLTVFL).
Химерные конструкции CD200R-CD28 на основе генов мыши вставляли в ретровирусный вектор pMP71 и использовали для трансдукции первичных спленоцитов мыши, стимулированных антителами к CD3 и антителами к CD28. Конструкции конструировали, как описано в примере 1, и заказывались в Invitrogen или создавали на месте с помощью ПЦР. Затем конструкции направленно TOPO-клонировали в вектор pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen) и переносили в ретровирусный вектор pMP71-attR с использованием технологии Gateway® (Invitrogen). Ретровирусную упаковывающую клеточную линию Plat-E (Morita et al., 2000, Gene Therapy 7: 1063-1066, 2000; Cell Biolabs, Inc.) трансдуцировали ретровирусным вектором с использованием реагента для трансдукции Effectene (Qiagen). Вирусный супернатант собирали на 2-й и 3-й день, а затем использовали для трансдуцирования Т-клеток TCRgag.
За один день до трансфекции Т-клетки TCRgag стимулировали антителами к CD3/CD28 и 100 ед./мл rhIL-2. Трансдукцию Т-клеток TCRgag проводили на 12-луночных планшетах в присутствии IL-2 и полибрена путем центрифугирования в течение 90 минут при 1000 g. Клетки FBL трансдуцировали с помощью CD200 при центрифугировании с полибреном аналогично трансдукции Т-клеток и затем сортировали с получением гомогенной популяции.
Через пять дней после трансдукции CD8+ Т-клетки анализировали в отношении экспрессии конструкции с помощью окрашивания антителом к CD200R и проточной цитометрии (фигура 1B). Вектор, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), использовали в качестве контроля. Эффективность трансдукции варьировалась от 4 до 36%, а средняя интенсивность флуоресценции (MFI) трансдуцированных клеток была сходной между конструкциями.
Пример 3
Конструкции CD200R-CD28 стимулируют пролиферацию, накопление и эффекторную функцию трансдуцированных Т-клеток in vitro
Конструкции CD200R-CD28, описанные в примерах 1 и 2, оценивали в отношении их способности стимулировать пролиферацию, накопление и эффекторную функцию Т-клеток TCRgag.
Размножение эффекторных клеток in vitro
Эффекторные клетки TCRgag получали in vitro как описано ранее (Stromnes et al., J. Clin. Invest. 120: 3722-34, 2010). Облученные антиген-презентирующие спленоциты (5×106), облученные FBL (3×106) и клетки TCRgag tg (106) культивировали вместе с IL-2 (50 ед./мл) в 10 мл культуральной среды (IMDM, дополненная незаменимыми аминокислотами, 2 мкМ глутамина, 100 ед./мл смеси пенициллина/стрептомицина, 10% FBS и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола). Т-клетки рестимулировали еженедельно и оценивали с помощью проточной цитометрии через 5-7 дней после последней стимуляции.
Анализ пролиферации Т-клеток in vitro
Т-клетки TCRgag трансдуцировали, как в примере 2. Для оценки пролиферации Т-клеток in vitro Т-клетки TCRgag окрашивали с использованием CellTrace Violet (CTV, Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя. CTV-меченые Т-клетки Tg (105) и контрольные Т-клетки GFP стимулировали титруемым количеством клеток CD200- FBL или CD200+ FBL. Через 3 дня CTV-разведение Т-клеток TCRgagоценивали с помощью проточной цитометрии.
Результаты проточной цитометрии, указывающие количество Т-клеток TCRgag после стимуляции титруемым количеством клеток CD200-FBL (введху) или CD200+ FBL (внизу) показаны на фигуре 2A. Четыре из пяти испытываемых конструкций CD200R-CD28 значительно улучшали пролиферацию Т-клеток TCRgag в ответ на CD200+ FBL (синие линии) по сравнению с трансдуцированными GFP-контролем Т-клетками (красные линии).
Анализ накопления Т-клеток in vitro
Для определения того, приводит ли усиленная пролиферация также к повышенному накоплению трансдуцированных клеток, измеряли долю трансдуцированных клеток в общей популяции TCRgag в течение нескольких циклов стимуляции облученными CD200+ FBL.
Некоторые из конструкций способствовали накоплению трансдуцированных Т-клеток, включая CD200R-CD28tm, CD200R-CD28Cys, CD200R-3aas-CD28Cys и CD200R-9aas-CD28Cys (фигура 2B). Из этих конструкций CD200R-9aas-CD28Cys проявляла наибольший прирост трансдуцированных Т-клеток при множественных стимуляциях, что приводило к более чем 3-кратному росту за 3 стимуляции.
Анализ обогащения Т-клеток in vitro
Смешанную популяцию трансдуцированных и нетрансдуцированных CD8+ T-клеток рестимулировали с помощью облученных с помощью CD200+ или CD200- клеток FBL, чтобы определить, будет ли рестимуляция обогащать популяцию трансдуцированными CD200R-9aas-CD28Cys IFP+ T-клетками. Повторная рестимуляция облученными опухолевыми CD200+ клетками обогащала клетками, трансдуцированными с помощью IFP, по сравнению с Т-клетками дикого типа, демонстрируя, что распознавание мишени, экспрессирующей лиганд для IRP CD200R-9aas-CD28Cys, усиливает ответ (фигура 2C).
Анализ колокализации in vitro
Трансдуцированные Т-клетки визуализировали с помощью микроскопии, чтобы определить, был ли IFP CD200R-9aas-CD28Cys колокализован с когнатным лигандом в иммунологическом синапсе (IS) во время активации Т-клеток. CTxB использовали для окрашивания липидов в клеточной мембране, которые накапливаются в синапсе (фигура 2D, секция I). Для визуализации местоположения молекул относительно IS использовали меченые антитела, нацеленные на CD200, экспрессируемый клеткой FBL (фигура 2D, секция II) или CD200R, экспрессируемый Т-клеткой (фигура 2D, секция III). Лиганд CD200 и CD200R колокализованы в пределах IS (фигура 2D, секция IV), демонстрируя, что конструкция имеет размер, подходящий для размещения в иммунологическом синапсе.
Анализ цитотоксичности на основе CFSE
Увеличенная передача сигнала CD28 также способствует эффекторной функции (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). Трансдуцированные слитым белком CD200R-CD28 Т-клетки испытывали в отношении повышенного уничтожения опухолевых клеток-мишеней. Опухоли FBL и контрольные EL4 инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с 2,5 мкM (CFSEhi) или 0,25 мкM (CFSEl) CFSE в PBS, соответственно. Избыток красителя удаляли путем промывания опухолевых клеток в содержащей сыворотку среде. Смесь 1:1 опухолевых клеток EL4 и FBL инкубировали с титруемым количеством трансдуцированных вектором CD200R-CD28 или GFP размноженных in vitro эффекторных T-клеток TCRgag в течение 4 часов в 96-луночных круглодонных планшетах при 37°C и 5% CO2. Специфический лизис FBL определяли с помощью проточного цитометрического анализа % CFSEhi (FBL) от общего числа CFSE-положительных клеток (FBL+ EL4), оставшихся в лунке.
Т-клетки TCRgag, трансдуцированные конструкциями CD200R-CD28, демонстрировали повышенную способность лизировать опухоль FBL in vitro по сравнению с Т-клетками TCRgag, трансдуцированными пустым вектором (фигуры 2E, 2G). Опухолевые клетки-мишени метили с использованием различных разведений флуоресцентных красителей CellTrace Violet (CTV) или CFSE с получением смеси 1:1:1 клеток EL4 (CTV+), CD200+ FBL (CFSEhi) и неспецифических контрольных мишеней EL4 (CFSEl) (фигура 2F). Кроме того, контрольные GFP-трансдуцированные Т-клетки TCRgag лизировали CD200- FBL и CD200+ FBL с равной эффективностью (фигура 2G). В противоположность этому, Т-клетки TCRgag, трансдуцированные с помощью CD200R-9aas-CD28Cys, демонстрировали усиленное уничтожение клеток CD200+ FBL по сравнению с контрольными T-клетками, лизируя более 40% CD200+ FBL при самом низком испытанном соотношении E:T (фигура 2G).
В совокупности эти данные показывают, что конструкции CD200R-CD28 способствуют увеличению накопления и литической активности трансдуцированных Т-клеток в ответ на стимуляцию опухолевыми клетками.
Пример 4
T-клетки, трансдуцированные с помощью CD200R-9aas-CD28Cys, демонстрируют повышенное накопление in vivo в ответ на распознавание FBL
Мышам B6 внутрибрюшинно (i.p.) вводили 4×106 живых клеток лейкоза FBL, как описано ранее (Stromnes et al., J. Clin. Invest. 120: 3722-34, 2010). После обеспечения распространения FBL в течение 5 дней мыши получали 180 мг/кг циклофосфамида (Cy, «цитоксан») i.p. по меньшей мере за 6 часов до переноса эффекторных Т-клеток. Для исследований выживаемости 105 Т-клеток TCRgag, которых ранее подвергали 1-3 стимуляциям in vitro, пересаживали мышам, имеющим опухоль. Для оценки кратковременной пролиферации и накопления 2×106 каждой из трансдуцированных слитым белком и трансдуцированных GFP-контролем Т-клеток совместно вводили мышам, имеющим опухоль, и через 8 дней мышей подвергали эвтаназии для анализа. У мышей регулярно контролировали опухолевую нагрузку и подвергали эвтаназии, если ожидалась прогнозируемая по прогрессированию опухоли летальность в течение 24-48 часов.
Для оценки того, демонстрируют ли трансдуцированные слитым белком CD200R-9aas-CD28Cys T-клетки большую пролиферацию и накопление in vivo в ответ на распознавание FBL, смешанную популяцию клеток, трансдуцированных слитым белком и контролем, пересаживали мышам, имеющим опухоль, и сравнивали соотношение клеток с помощью анализа ex vivo через 8 дней после переноса (фигура 3A). С применением конгенных маркеров трансдуцированные Т-клетки обнаруживали при в 1,2-1,4 раза большем соотношении с контрольными клетками как в селезенке, так и в лимфатических узлах, по сравнению с соотношением, которое вводили (фигура 3В). Трансдуцированные Т-клетки CD200R-9aas-CD28Cys+ TCRgag демонстрировали сниженную экспрессию CD62L через 3 дня после переноса мышам, имеющим опухоль, что свидетельствует об эффекторном фенотипе Т-клеток (фигура 3C). К 15-му дню трансдуцированные и контрольные Т-клетки демонстрировали сходные фенотипы, в том числе отсутствие маркеров истощения (фигура 3D). Подобно результатам in vitro, Т-клетки, которые экспрессировали CD200R-9aas-CD28Cys, проявляли повышенное накопление в ответ на стимуляцию опухолями in vivo. Кроме того, они демонстрировали характер экспрессии белка, согласующийся с эффекторным фенотипом Т-клеток, в течение по меньшей мере 3 дней после переноса мышам, имеющим опухоль.
Пример 5
Адоптивная иммунотерапия с помощью CD200R-CD28+ T-клеток демонстрирует большую активность при лечении диссеминированного лейкоза
Адоптивная иммунотерапия с помощью Т-клеток, трансдуцированных с помощью CD200R-CD28, опосредовала повышенную терапевтическую активность на доклинической мышиной модели диссеминированного лейкоза.
Мышам вводили летальную дозу клеток лейкоза CD200+ FBL и через пять дней когорты Cy-обработанных мышей получали дополнительную терапию с помощью 105 T-клеток (фигура 4A). Вклад цистеиновой связи CD28 в эффективность, опосредованную конструкцией CD200R-CD28, оценивали путем сравнения Т-клеток, трансдуцированных с помощью CD200R-CD28tm, CD200R-9aas-CD28Cys и контрольных конструкций GFP, как показано на фигуре 1A. IL-2 вводили в течение 10 дней в качестве дополнительного терапевтического средства когорте мышей для стимуляции активности Т-клеток (Stromnes et al., J. Clin. Invest. 120: 3722-34, 2010). Перед введением Т-клетки оценивали в отношении различных поверхностных белков посредством проточной цитометрии. Трансдуцированные и контрольные Т-клетки TCRgag проявляли сходные фенотипы, указывая, что трансдукция не меняет фенотип клеток до введения (фигура 4B).
В небольшой когорте мышей, которые получали инъекции IL-2, T-клетки улучшали выживаемость, но значительная разница в выживаемости мышей, которые получали другие группы Т-клеток, не могла быть обнаружена (фигура 4C). Однако в когорте мышей, которые не получали инъекции IL-2, наблюдалось значительное улучшение выживаемости мышей, которые получали Т-клетки, трансдуцированные конструкциями CD200R-CD28 с размерами, подходящими для соответствия иммунологическому синапсу (фигура 4D). Большинство мышей, не получавшие Т-клетки, получавшие Т-клетки, трансдуцированные с помощью контрольного вектора GFP, или Т-клетки, трансдуцированные самым крупным эктодоменом (IFP CD200R-CD28Cys), не выживали дольше 30 дней (фигуры 4C и 4D, черная сплошная, пунктирная и оранжевая линии, соответственно). В отличие от этого, 71% мышей, которые получали CD200R-CD28tm+ T-клетки, и 83% мышей, которые получали CD200R-9aas-CD28Cys+ T-клетки, выживали более чем 100 дней после терапии (фигуры 4C и 4D, зеленая и красная линии, соответственно). Эти данные показывают, что трансдукция Т-клеток конструкциями CD200R-CD28, которые охватывают расстояние, подобное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, обеспечивает достаточную костимуляцию для преодоления зависимости Т-клеточной иммунотерапии от инъекции экзогенного IL-2. Кроме того, хотя были обнаружены различия в пролиферации и накоплении между конструкциями CD200Rtm-CD28 и CD200R-9aas-CD28Cys, испытанными на мышах, которые не получали инъекций экзогенного IL-2, оба IFP эффективно повышали Т-клеточную иммунотерапию со значительным улучшением клинического результата в остальных случаях прогрессирующего лейкоза.
Пример 6
CD200R-9aas-CD28Cys+ T-клетки не вызывают аутореактивность в отношении эндогенных тканей и не демонстрируют инфильтрацию нормальных тканей in vivo
Для определения того, снижала ли трансдукция Т-клеток TCRgag порог активации в достаточной степени, чтобы приводить к аутореактивности в отношении эндогенных тканей, оценивали аутоиммунную токсичность у трансгенных мышей, сконструированных для экспрессии опухолевого антигена FBL gag в виде аутоантигена в гепатоцитах под контролем альбуминового промотора (фигура 5А). Эффекторы TCRgag получали in vitro и 106 переносили обработанным цитоксаном мышам Alb:Gag с диссеминированным лейкозом. Через 3 и 7 дней после переноса оценивали повреждение печени путем количественного определения уровней ферментов печени в сыворотке: аспартатаминотрансферазы (AST) и аланинаминотрансферазы (ALT). Адоптивная терапия контрольными или CD200R-9aas-CD28Cys+ TCRgag клетками у мышей не влияла на уровни AST или ALT в сыворотке через 3 или 7 дней после переноса, указывая, что CD200R-9aas-CD28Cys не вызывает обнаруживаемого аутоиммунного повреждения печени у мышей Alb:Gag (фигура 5B).
Т-клетки, трансдуцированные с помощью IFP, не демонстрируют повышенной инфильтрации нормальных тканей по сравнению с контрольными Т-клетками. Мышей подвергали эвтаназии через 7 дней после переноса, и срезы печени окрашивали антителом к Т-клеточному маркеру CD3 для количественного определения инфильтрации Т-клеток. Наблюдалось ограниченное присутствие Т-клеток в тканях печени без существенной разницы между реципиентами CD200R-9aas-CD28Cys+ или контрольных TCRgag, что указывает на отсутствие повышенной лимфоцитарной клеточной инфильтрации в результате экспрессии IFP (фигура 5C).
Пример 7
Костимулирующий сигнальный домен 4-1BB стимулирует накопление трансдуцированных Т-клеток in vitro
Костимулирующий рецептор 4-1BB активируется на активированных Т-клетках, что способствует выживанию Т-клеток и продуцированию цитокинов (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). Для оценки того, может ли внутриклеточный сигнальный домен 4-1BB с внутриклеточным сигнальным доменом CD28 или без него индуцировать повышенную пролиферацию и накопление Т-клеток, получали IFP с использованием 4-1BB (CD200R-9aas-4-1BB) или комбинации 4-1BB с CD28 (CD200R-9aas-CD28-4-1BB) (фигура 6A) с помощью способов, описанных в примере 2. Т-клетки TCRgag трансдуцировали, как в примере 2, и in vitro получали эффекторные клетки TCRgag, как в примере 3.
Как наблюдалось с CD200R-9aas-CD28Cys, T-клетки, трансдуцированные конструкциями 4-1BB, накапливались в течение нескольких циклов стимуляции in vitro (фигура 6B). Эти данные показывают, что IFP 4-1BB также способствуют пролиферации и выживаемости Т-клеток.
Т-клетки TCRgag, трансдуцированные CD200R-4-1BB, демонстрировали повышенную способность к лизису опухоли FBL in vitro с использованием анализа цитотоксичности на основе CFSE, описанного в примере 3 (фигура 6C). CD200R-41BB-трансдуцированные Т-клетки также способствуют выживанию (фигура 6D).
Пример 8
Коэкспрессия CD200Rtm-CD28 улучшает функцию первичных Т-клеток с WT1-специфичным TCR
Человеческую конструкцию CD200Rtm-CD28 (SEQ ID NO:1) получали для определения того, улучшает ли экспрессия IFP Т-клеточную функцию первичных Т-клеток человека. Конструкцию объединяли с бета- и альфа-цепями рестриктированного по HLA-A2 WT1126-специфичного TCR «C4» путем связывания генов с элементами P2A (фигура 7A). Первую последовательность P2A кодон-оптимизировали для предотвращения генетической рекомбинации со второй последовательностью P2A. Для получения лентивирусов клетки 293 T/17 (3×106 клеток/планшет) трансдуцировали человеческими конструкциями в pRRLSIN и упаковочными векторами pMDLg/pRRE, pMD2-G и pRSV-REV с использованием Effectene (Qiagen). Культуральные среды меняли в 1-й день после трансфекции, а содержащий вирус супернатант собирали на 2-й и 3-й дни и замораживали аликвоты для будущего применения.
Сублинию Jurkat Т-клеток человека, которые лишены эндогенного TCR, использовали для испытания экспрессии IFP и TCR. Эти Т-клетки Jurkat трансдуцировали путем центрифугирования 2×106 клеток с 2 мл ретровирусного супернатанта при 1000 g в течение 90 мин. при 32°C. Трансдукция линии Jurkat Т-клеток человека трехгенной конструкцией приводила к высокой экспрессии IFP и экспрессии TCR с аналогичной MFI, как и в Т-клетках, трансдуцированных только TCR (фигура 7A).
Для трансдукции первичных Т-клеток человека собирали мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) у HLA-A2+ доноров. CD8+ T-клетки очищали с помощью магнитных гранул Miltenyi и стимулировали с использованием парамагнитных микрочастиц Dynabeads Human T cell Expander CD3/CD28 (Life Technologies) и 50 МЕ/мл IL-2. Через четыре часа после стимуляции Т-клетки трансдуцировали, как описано выше для Т-клеток Jurkat. Т-клетки рестимулировали каждые 10-14 дней с использованием протокола быстрого размножения (REP), как было описано ранее (Ho et al., J Immunol Methods 310:40-52, 2006).
Линию клеток T2 человека использовали в качестве APC, поскольку она является дефицитной по TAP и, следовательно, не способна презентовать эндогенные пептиды, тогда как низкоуровневая экспрессия MHCI обеспечивает презентацию экзогенно загруженных пептидов. Экспрессию CD200 клетками T2 оценивали с помощью проточной цитометрии (фигура 7B). Клетки Т2 проявляли низкий уровень эндогенной экспрессии CD200 (фигура 7B).
Трансдуцированные Т-клетки стимулировали с помощью WT1126-сенсибилизированных клеток T2. Несмотря на низкий уровень экспрессии CD200 на клетках-мишенях, CD200Rtm-CD28-трансдуцированные Т-клетки демонстрировали повышенную пролиферацию по сравнению с Т-клетками, трансдуцированными только TCR C4 (фигура 7C). Кроме того, стимулированные CD200Rtm-CD28-трансдуцированные Т-клетки (т.е. IFP+ Т-клетки) продуцировали повышенные уровни IFNγ и IL-2 по сравнению с контрольными Т-клетками под воздействием опухолевых CD200dim клеток (фигура 7D).
В целом, эти результаты показали, что первичные Т-клетки, трансдуцированные для экспрессии человеческой конструкции CD200Rtm-CD28 и бета- и альфа-цепей WT1126-специфичного TCR, демонстрировали повышенную пролиферацию и увеличенное продуцирование цитокинов по сравнению с Т-клетками, трансдуцированными только конструкцией TCR.
Пример 9
Конструкции слитого белка SIRPα-CD28 стимулируют накопление трансдуцированных Т-клеток in vitro
Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена SIRPα или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 8A). Гидрофобный компонент может состоять из трансмембранного домена либо SIRPα, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках SIRPα-CD28 гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с гидрофобным компонентом (например, SIRPα-CD28Cys, SIRPα-6aas-CD28Cys, SIRPα-9aas-CD28Cys и SIRPα-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать всю или часть внеклеточного домена SIRPα. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный компонент содержит целый внеклеточный домен SIRPα. В других примерах внеклеточный компонент содержит первые 367 аминокислот (например, SIRPα-6aas-CD28Cys), первые 364 аминокислоты (например, SIRPα-9aas-CD28Cys) или первые 350 аминокислот (SIRPα-23aas-CD28Cys) с N-конца SIRPα. Размер внеклеточного компонента может влиять на способность слитого белка проникать в иммунологический синапс и колокализоваться с TCR в cSMAC для обеспечения сильного костимулирующего сигнала. В некоторых примерах внеклеточный компонент содержит усеченный SIRPα, который может изменять размер внеклеточного компонента. Например, для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот внеклеточного домена слитого белка (например, дополнительных 9 или 12 аминокислот), SIRPα-6aas-CD28 имеет усеченную часть SIRPα, которая сохраняет природный N-связанный участок гликозилирования. В другом примере SIRPα-23aas-CD28 имеет усеченную часть SIRPα, которая лишена целой области стебля внеклеточного домена SIRPα. Кроме того, конструкция SIRPα-CD28 имеет возможность превращать сигнал, инициированный связыванием SIRPα с его мишенью, в положительный (например, костимулирующий) сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.
IFP с использованием внеклеточных компонентов SIRPα (фигура 8A) получали с помощью способов, описанных в примере 2. Т-клетки TCRgag трансдуцировали, как в примере 2, и in vitro получали эффекторные клетки TCRgag, как в примере 3. Клетки FBL трансдуцировали с помощью CD47 или mCherry при центрифугировании с полибреном аналогично трансдукции Т-клеток и затем сортировали с получением гомогенной популяции.
Как наблюдалось с CD200R-9aas-CD28Cys, T-клетки, трансдуцированные конструкциями SIRPα, накапливались в течение нескольких циклов стимуляции in vitro (фигура 8B). Эти данные показывают, что IFP SIRPα-CD28 также способствуют пролиферации и выживаемости Т-клеток.
Для оценки пролиферации Т-клеток in vitro проводили анализ пролиферации с разведениями CTV, как описано в примере 2. Как наблюдалось с CD200R-9aas-CD28Cys, T-клетки, трансдуцированные конструкциями SIRPα, сконструированными для поддержания расстояния в синапсе Т-клетка-опухолевая клетка, демонстрировали повышенную пролиферацию по сравнению с контрольными Т-клетками (фигура 8C). Кроме того, опухолевые CD47+ клетки эффективно уничтожались через 3 дня совместного культивирования с SIRPα-CD28+ T-клетками, но не с контрольными Т-клетками или Т-клетками, трансдуцированными конструкцией SIRPα, которая лишена внутриклеточного сигнального домена (фигура 8D). Чтобы дополнительно оценить литическую способность SIRPα-CD28+ T-клеток, использовали анализ IncuCyte для количественной оценки уничтожения CD47+ FBL. В общей сложности 105 mCherry+ CD47+ FBL совместно культивировали в 24-луночных планшетах с титрованием Т-клеток человека, трансдуцированных конструкциями SIRPα-CD28. Планшет инкубировали в IncuCyte (Essen BioScience) внутри инкубатора для клеточных культур в течение 70 часов. Изображения фиксировали каждый час для контроля уничтожения опухолевых клеток, как определялось по потере красного сигнала. SIRPα-CD28+ T-клетки уничтожали опухолевые CD47+ клетки даже при самом низком испытываемом соотношении эффектора и мишени (0,4:1; фигура 8E).
Пример 10
Конструкции слитого белка PD-1-CD28 стимулируют продуцирование цитокинов в трансдуцированных Т-клетках in vitro
Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена PD-1 или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 9A). Трансмембранный компонент может состоять из трансмембранного домена либо PD-1, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках PD1-CD28 трансмембранный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с трансмембранным компонентом (например, PD1-CD28Cys, PD1-9aas-CD28Cys и PD1-21aas-CD28Cys) для содействия межцепочечной димеризации. Внеклеточный компонент может содержать весь или часть внеклеточного домена PD-1 или может быть усечен (например, -9aas в мышиной конструкции, -12aas или -15aas в человеческих конструкциях; не имеет области стебля PD-1, -21aas) для поддержания короткого пространственного расстояния между клетками, чтобы облегчить доступ рецептора с лигандом в иммунологический синапс. Кроме того, конструкция PD1-CD28 имеет возможность превращать то, что обычно является ингибирующим сигналом при связывании PD1 с его мишенью, в положительный (например, костимулирующий) сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.
IFP, содержащие внеклеточные компоненты PD-1 (фигура 9A), получали с помощью способов, описанных в примере 2. Т-клетки TCRgag трансдуцировали, как в примере 2, и in vitro получали эффекторные клетки TCRgag, как в примере 3.
Мышиные IFP PD1-CD28 получали с использованием конструкций I-IV и VII (фиг. 9A). PD1-CD28+ Т-клетки рестимулировали в присутствии Brefeldin A (для сохранения продуцируемых цитокинов) с клетками FBL, эндогенно экспрессирующими лиганды PD-1, PD-L1 и PD-L2. Через 5 часов клетки фиксировали и обрабатывали с использованием набора BD Cytofix/Cytoperm, чтобы обеспечить внутриклеточное окрашивание эффекторных цитокинов, IFNγ и TNFα. Трансдукция с помощью каждой из пяти конструкций PD1-CD28 усиливала продуцирование внутриклеточных цитокинов по сравнению с контрольными Т-клетками (фигура 9B).
Человеческие IFP PD1-CD28 получали с использованием конструкций I-III и V-VII (фигура 9A). Векторы, содержащие IFP PD1-CD28 и TCR C4, получали, как описано выше. Т-клетки Jurkat трансдуцировали, как описано выше. T-клетки, трансдуцированные с помощью TCR и PD1-12aas-CD28Cys или PD1-15aas-CD28Cys, демонстрировали высокую эффективность трансдукции и экспрессию обоих белков (фигура 10).
Пример 11
Конструкции слитого белка Fas-CD28 стимулируют накопление и усиливают функцию трансдуцированных Т-клеток in vitro
Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена Fas или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 11A). Трансмембранный компонент может состоять из домена либо Fas, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках Fas-CD28 трансмембранный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с трансмембранным компонентом (например, Fas-CD28Cys и Fas-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать весь или часть внеклеточного домена Fas или может быть усечен, чтобы сохранить поддержание короткого пространственного расстояния между клетками (-9aas) при взаимодействии рецептор-лиганд. Кроме того, конструкция Fas-CD28 имеет возможность превращать сигнал, инициированный связыванием Fas с его мишенью, в положительный (например, костимулирующий) сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.
IFP, содержащие внеклеточные компоненты Fas (фигура 11A), получали с помощью способов, описанных в примере 2. Т-клетки TCRgag трансдуцировали, как в примере 2, и in vitro получали эффекторные клетки TCRgag, как в примере 3.
Для определения того, приводит ли экспрессия IFP Fas-CD28 к повышенному накоплению трансдуцированных клеток, измеряли долю трансдуцированных клеток из смешанной популяции в общей популяции TCRgag в течение нескольких циклов стимуляции облученными FBL, как описано в примере 3. Все конструкции способствовали накоплению трансдуцированных Т-клеток по сравнению с контрольными Т-клетками (фигура 11B). Кроме того, экспрессия конструкций Fas-CD28, но не полноразмерного (FL) Fas, способствовала выживанию или размножению Т-клеток при множественных стимуляциях in vitro (фигура 11C).
Пример 12
Конструкции слитого белка LAG3-CD28
Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена LAG3 или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 12A). Трансмембранный компонент может состоять из домена либо LAG3, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках LAG3-CD28 трансмембранный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с трансмембранным компонентом (например, LAG3-CD28Cys и LAG3-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать весь или часть внеклеточного домена LAG3 или может быть усечен, чтобы поддержать короткое пространственное расстояние между клетками (например, -9aas) при взаимодействии рецептор-лиганд. Кроме того, конструкция LAG3-CD28 имеет возможность превращать то, что обычно является ингибирующим сигналом при связывании LAG3 с его мишенью, в положительный (например, костимулирующий) сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.
IFP с использованием внеклеточных компонентов LAG3 (фигура 12A) получали с помощью способов, описанных в примере 2. T-клетки трансдуцировали конструкциями LAG3-eGFP, как описано. Через пять дней после трансдукции CD8+ Т-клетки анализировали в отношении экспрессии конструкции с помощью окрашивания антителом к LAG3 и проточной цитометрии (фигура 12B). Вектор, кодирующий только зеленый флуоресцентный белок (GFP), использовали в качестве контроля. Все конструкции демонстрировали экспрессию LAG3 (фигура 12B).
Пример 13
Конструкции слитого белка TIM3-CD28
Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена TIM3 или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 13A). Трансмембранный компонент может состоять из домена либо TIM3, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках TIM3-CD28 трансмембранный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с трансмембранным компонентом (например, TIM3-CD28Cys и TIM3-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать весь или часть внеклеточного домена TIM3 или может быть усечен, чтобы поддерживать короткое пространственное расстояние между клетками (например, -9aas). Кроме того, конструкция TIM3-CD28 имеет возможность превращать то, что обычно является ингибирующим сигналом при связывании TIM3 с его мишенью, в положительный сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.
Новые IFP с использованием внеклеточных компонентов TIM3 (фигура 13A) получали с помощью способов, описанных в примере 2. T-клетки трансдуцировали конструкциями GFP-TIM3, как описано. Через пять дней после трансдукции CD8+ Т-клетки анализировали в отношении экспрессии конструкции с помощью окрашивания антителом к TIM3 и проточной цитометрии (фигура 13B). Вектор, кодирующий только зеленый флуоресцентный белок (GFP), использовали в качестве контроля. Большинство конструкций демонстрировали сходную экспрессию TIM3 (фигура 13B).
Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы и описаны, будет понятно, что различные варианты осуществления, описанные выше, могут быть объединены для обеспечения дополнительных вариантов осуществления и что в них могут быть внесены различные изменения без отступления от сущности и объема настоящего изобретения.
Все патенты США, публикации заявок на патент США, заявки на патент США, иностранные патенты, заявки на иностранный патент и непатентные публикации, упомянутые в настоящем описании и/или перечисленные в информационном листке заявки, включая без ограничения предварительную заявку на патент США №62/128979, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Аспекты вариантов осуществления могут быть модифицированы, если необходимо использовать концепции различных патентов, заявок и публикаций, для получения дополнительных вариантов осуществления.
Эти и другие изменения могут быть сделаны в вариантах осуществления с учетом приведенного выше подробного описания. В целом, в нижеследующей формуле изобретения используемые термины не должны толковаться как ограничивающие формулу изобретения конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в настоящем описании и формуле изобретения, но должны быть истолкованы с включением всех возможных вариантов наряду с полным объемом эквивалентов, на которые эта формула изобретения имеет право. Соответственно, формула изобретения не ограничивается настоящим раскрытием.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
<110> ФРЕД ХАТЧИНСОН КАНСЭР РИСЁЧ СЕНТЕР
Ода, Шеннон К.
Гринберг, Филипп Д.
<120> ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СЛИТЫЕ БЕЛКИ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 360056.433WO
<140> PCT
<141> 2016-03-04
<150> US 62/128,979
<151> 2015-03-05
<160> 178
<170> FastSEQ для Windows версии 4.0
<210> 1
<211> 915
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huCD200Rtm-CD28
<400> 1
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgcctggcgc caagaagtcc 720
gccaagctgt acatccccta catcatcctg acaatcatca ttctgaccat cgtgggcttc 780
atctggctgc tgcgcagcaa gcggagcaga ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc 840
cctagacggc ctggccccac cagaaagcac taccagccct acgcccctcc ccgggacttt 900
gccgcctaca gaagc 915
<210> 2
<211> 728
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целый внеклеточный домен huCD200R
<400> 2
tgctgtgccc ttggagaacc gccaacctgg gcctgctgct gatcctgacc atcttcctgg 60
tggccgccag cagcagcctg tgcatggacg agaagcagat cacccagaac tacagcaagg 120
tgctggccga agtgaacacc agctggcccg tgaagatggc caccaacgcc gtgctgtgct 180
gccctcctat cgccctgcgg aacctgatca tcatcacctg ggagatcatc ctgcggggcc 240
agcccagctg taccaaggcc taccggaaag agacaaacga gacaaaagaa acaaactgca 300
ccgacgagcg gatcacatgg gtgtccagac ccgaccagaa cagcgacctg cagatcagac 360
ccgtggccat cacccacgac ggctactacc ggtgcatcat ggtcaccccc gatggcaact 420
tccaccgggg ataccatctg caggtgctcg tgacccccga agtgaccctg ttccagaacc 480
ggaacagaac cgccgtgtgc aaggccgtgg ccggaaaacc tgccgcccag atctcttgga 540
tccccgaggg cgattgcgcc accaagcagg aatactggtc caacggcacc gtgaccgtga 600
agtccacctg tcactgggag gtgcacaacg tgtccaccgt gacatgccac gtgtcccacc 660
tgaccggcaa caagagcctg tacatcgagc tgctgcctgt gcctggcgcc aagaagtccg 720
ccaagctg 728
<210> 3
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huCD200R
<400> 3
tacatcccct acatcatcct gacaatcatc attctgacca tcgtgggctt catctggctg 60
ctg 63
<210> 4
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен CD28
<400> 4
ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 60
gccttcatca tcttttgggt c 81
<210> 5
<211> 123
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> внутриклеточный домен CD28
<400> 5
cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 60
ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 120
agc 123
<210> 6
<211> 933
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huCD200R-CD28tm
<400> 6
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgcctggcgc caagaagtcc 720
gccaagctgt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 780
gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc 840
gactacatga acatgacccc tagacggcct ggccccacca gaaagcacta ccagccctac 900
gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga agc 933
<210> 7
<211> 942
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huCD200R-9aas-CD28Cys
<400> 7
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgtgtcccag ccctctgttt 720
cccggcccta gcaagccttt ctgggtgctg gtggtggtcg gaggcgtgct ggcctgctac 780
agcctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc ttttgggtcc gcagcaagcg gagcagaggc 840
ggccacagcg actacatgaa catgacccct agacggcctg gccccaccag aaagcactac 900
cagccctacg cccctccccg ggactttgcc gcctacagaa gc 942
<210> 8
<211> 702
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huCD200R-9aas часть внеклеточного домена
<400> 8
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tg 702
<210> 9
<211> 36
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD28Cys домен мультимеризации
<400> 9
tgtcccagcc ctctgtttcc cggccctagc aagcct 36
<210> 10
<211> 933
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huCD200R-12aas-CD28Cys
<400> 10
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgtgtccca gccctctgtt tcccggccct 720
agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 780
gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc 840
gactacatga acatgacccc tagacggcct ggccccacca gaaagcacta ccagccctac 900
gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga agc 933
<210> 11
<211> 693
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huCD200R-12aas часть внеклеточного домена
<400> 11
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctg 693
<210> 12
<211> 945
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huCD200R-9aas-CD28Cys tm-41BBic
<400> 12
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgtgtcccag ccctctgttt 720
cccggcccta gcaagccttt ctgggtgctg gtggtggtcg gaggcgtgct ggcctgctac 780
agcctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc ttttgggtca agcggggcag aaagaagctg 840
ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgcgg cccgtgcaga ccacccagga agaggacggc 900
tgctcctgca gattccccga ggaagaagaa ggcggctgcg agctg 945
<210> 13
<211> 126
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> внутриклеточный компонент 4-1BB
<400> 13
aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgcg gcccgtgcag 60
accacccagg aagaggacgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 120
gagctg 126
<210> 14
<211> 936
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huCD200R-12aas-CD28Cys tm-41BBic
<400> 14
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgtgtccca gccctctgtt tcccggccct 720
agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 780
gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc 840
ttcaagcagc ctttcatgcg gcccgtgcag accacccagg aagaggacgg ctgctcctgc 900
agattccccg aggaagaaga aggcggctgc gagctg 936
<210> 15
<211> 1059
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huCD200R-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic
<400> 15
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgtgtccca gccctctgtt tcccggccct 720
agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 780
gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc 840
gactacatga acatgacccc tagacggcct ggccccacca gaaagcacta ccagccctac 900
gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga agcaagcggg gcagaaagaa gctgctgtac 960
atcttcaagc agcctttcat gcggcccgtg cagaccaccc aggaagagga cggctgctcc 1020
tgcagattcc ccgaggaaga agaaggcggc tgcgagctg 1059
<210> 16
<211> 1305
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huSIRP альфа tm-CD28
<400> 16
atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60
gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120
aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180
atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240
aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360
tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420
gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480
acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540
accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600
gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660
gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720
agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780
cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840
cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900
accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960
tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020
gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080
gccgccgaga acaccggcag caacgagcgg aacatctaca tcgtcgtggg cgtcgtgtgc 1140
accctgctgg tggcactgct gatggccgct ctgtacctcg tgcgcagcaa gcggagcaga 1200
ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc cctagacggc ctggccccac cagaaagcac 1260
taccagccct acgcccctcc ccgggacttt gccgcctaca gaagc 1305
<210> 17
<211> 1119
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целый внеклеточный домен huSIRP-альфа
<400> 17
atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60
gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120
aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180
atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240
aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360
tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420
gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480
acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540
accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600
gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660
gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720
agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780
cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840
cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900
accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960
tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020
gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080
gccgccgaga acaccggcag caacgagcgg aacatctac 1119
<210> 18
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huSIRP-альфа
<400> 18
atcgtcgtgg gcgtcgtgtg caccctgctg gtggcactgc tgatggccgc tctgtacctc 60
gtg 63
<210> 19
<211> 1323
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huSIRP альфа-CD28tm
<400> 19
atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60
gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120
aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180
atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240
aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360
tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420
gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480
acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540
accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600
gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660
gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720
agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780
cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840
cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900
accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960
tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020
gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080
gccgccgaga acaccggcag caacgagcgg aacatctact tctgggtgct ggtggtggtc 1140
ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1200
cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 1260
ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 1320
agc 1323
<210> 20
<211> 1323
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huSIRP альфа 12aas-CD28Cys
<400> 20
atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60
gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120
aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180
atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240
aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360
tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420
gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480
acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540
accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600
gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660
gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720
agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780
cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840
cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900
accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960
tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020
gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080
gcctgtccca gccctctgtt tcccggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc 1140
ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1200
cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 1260
ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 1320
agc 1323
<210> 21
<211> 1083
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> часть внеклеточного домена huSIRP альфа 12aas
<400> 21
atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60
gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120
aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180
atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240
aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360
tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420
gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480
acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540
accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600
gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660
gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720
agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780
cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840
cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900
accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960
tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020
gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080
gcc 1083
<210> 22
<211> 1326
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huSIRP альфа-12aas-CD28Cys tm-41BBic
<400> 22
atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60
gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120
aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180
atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240
aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360
tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420
gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480
acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540
accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600
gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660
gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720
agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780
cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840
cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900
accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960
tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020
gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080
gcctgtccca gccctctgtt tcccggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc 1140
ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1200
aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgcg gcccgtgcag 1260
accacccagg aagaggacgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 1320
gagctg 1326
<210> 23
<211> 1449
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> конструкция huSIRP альфа-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic
<400> 23
atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60
gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120
aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180
atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240
aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360
tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420
gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480
acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540
accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600
gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660
gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720
agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780
cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840
cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900
accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960
tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020
gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080
gcctgtccca gccctctgtt tcccggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc 1140
ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1200
cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 1260
ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 1320
agcaagcggg gcagaaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcctttcat gcggcccgtg 1380
cagaccaccc aggaagagga cggctgctcc tgcagattcc ccgaggaaga agaaggcggc 1440
tgcgagctg 1449
<210> 24
<211> 305
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200Rtm-CD28
<400> 24
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser
225 230 235 240
Ala Lys Leu Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr
245 250 255
Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly
260 265 270
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
275 280 285
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
290 295 300
Ser
305
<210> 25
<211> 243
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целый внеклеточный домен huCD200R
<400> 25
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser
225 230 235 240
Ala Lys Leu
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huCD200R
<400> 26
Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr Ile Val Gly
1 5 10 15
Phe Ile Trp Leu Leu
20
<210> 27
<211> 27
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD28 трансмембранный домен белок
<400> 27
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 28
<211> 41
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD28 внутриклеточный домен белок
<400> 28
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 29
<211> 311
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200R-CD28tm
<400> 29
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser
225 230 235 240
Ala Lys Leu Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
245 250 255
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
260 265 270
Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
275 280 285
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
290 295 300
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
305 310
<210> 30
<211> 314
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200R-9aas-CD28Cys
<400> 30
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Cys Pro Ser Pro Leu Phe
225 230 235 240
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
245 250 255
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
260 265 270
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met
275 280 285
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
290 295 300
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
305 310
<210> 31
<211> 234
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200R-9aas
<400> 31
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val
225 230
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок (внеклеточная часть) CD28Cys
<400> 32
Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
1 5 10
<210> 33
<211> 311
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200R-12aas-CD28Cys
<400> 33
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
225 230 235 240
Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
245 250 255
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
260 265 270
Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
275 280 285
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
290 295 300
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
305 310
<210> 34
<211> 231
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200R-12aas
<400> 34
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu
225 230
<210> 35
<211> 315
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200R-9aas-CD28Cys tm-41BBic
<400> 35
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Cys Pro Ser Pro Leu Phe
225 230 235 240
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
245 250 255
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
260 265 270
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
275 280 285
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
290 295 300
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
305 310 315
<210> 36
<211> 42
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок 4-1BB внутриклеточный компонент
<400> 36
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 37
<211> 312
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200R-12aas-CD28Cys tm-41BBic
<400> 37
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
225 230 235 240
Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
245 250 255
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg
260 265 270
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
275 280 285
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
290 295 300
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
305 310
<210> 38
<211> 353
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huCD200R-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic
<400> 38
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
225 230 235 240
Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
245 250 255
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
260 265 270
Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
275 280 285
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
290 295 300
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu
<210> 39
<211> 435
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huSIRP альфа tm-CD28
<400> 39
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val
370 375 380
Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
385 390 395 400
Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
405 410 415
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
420 425 430
Tyr Arg Ser
435
<210> 40
<211> 373
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huSIRP-альфа целый внеклеточный домен
<400> 40
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr
370
<210> 41
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huSIRP-альфа трансмембранный домен
<400> 41
Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala Leu Leu Met Ala
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Leu Val
20
<210> 42
<211> 441
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huSIRP альфа-CD28tm
<400> 42
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
370 375 380
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
385 390 395 400
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
405 410 415
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
420 425 430
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
435 440
<210> 43
<211> 441
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huSIRP альфа-12aas-CD28Cys
<400> 43
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
355 360 365
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
370 375 380
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
385 390 395 400
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
405 410 415
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
420 425 430
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
435 440
<210> 44
<211> 361
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huSIRP альфа-12aas
<400> 44
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala
355 360
<210> 45
<211> 442
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huSIRP альфа-12aas-CD28Cys tm-41BBic
<400> 45
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
355 360 365
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
370 375 380
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
385 390 395 400
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
405 410 415
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
420 425 430
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
435 440
<210> 46
<211> 483
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> белок huSIRP альфа-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic
<400> 46
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
355 360 365
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
370 375 380
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
385 390 395 400
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
405 410 415
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
420 425 430
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
435 440 445
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
450 455 460
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
465 470 475 480
Cys Glu Leu
<210> 47
<211> 900
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200Rtm-CD28
<400> 47
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtccctgag gccctacatc 720
ccttacatca tccccagcat catcatcctg atcatcatcg gctgcatctg cctgctgaac 780
agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc 840
ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 900
<210> 48
<211> 918
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-CD28tm
<400> 48
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtccctgag gcccttctgg 720
gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 780
tgcgtgatct ggaccaacag cagaagaaac agaggcggcc agagcgacta catgaacatg 840
acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 900
ttcgccgcct acagacct 918
<210> 49
<211> 945
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-CD28Cys
<400> 49
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtccctgag gccctgccac 720
acccagagca gccccaagct gttctgggcc ctggtggtgg tggccggcgt gctgttttgt 780
tacggcctgc tcgtgaccgt ggccctgtgc gtgatctgga ccaacagcag aagaaacaga 840
ggcggccaga gcgactacat gaacatgacc cccagaaggc ctggcctgac cagaaagccc 900
taccagcctt acgcccctgc cagagacttc gccgcctaca gacct 945
<210> 50
<211> 936
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-3aas-CD28Cys
<400> 50
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtcctgcca cacccagagc 720
agccccaagc tgttctgggc cctggtggtg gtggccggcg tgctgttttg ttacggcctg 780
ctcgtgaccg tggccctgtg cgtgatctgg accaacagca gaagaaacag aggcggccag 840
agcgactaca tgaacatgac ccccagaagg cctggcctga ccagaaagcc ctaccagcct 900
tacgcccctg ccagagactt cgccgcctac agacct 936
<210> 51
<211> 918
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-9aas-CD28Cys
<400> 51
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagctgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 720
gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 780
tgcgtgatct ggaccaacag cagaagaaac agaggcggcc agagcgacta catgaacatg 840
acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 900
ttcgccgcct acagacct 918
<210> 52
<211> 939
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-9aas-CD28Cys tm-41BBic
<400> 52
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagctgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 720
gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 780
tgcgtgatct ggaccagcgt gctgaagtgg atcagaaaga agttccccca catcttcaag 840
cagcccttca agaaaaccac cggcgctgcc caggaagagg acgcctgcag ctgtagatgc 900
cctcaggaag aagaaggcgg cggaggcggc tacgagctg 939
<210> 53
<211> 1062
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-9aas-CD28Cys tm ic-41BBic
<400> 53
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagctgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 720
gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 780
tgcgtgatct ggaccaacag cagaagaaac agaggcggcc agagcgacta catgaacatg 840
acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 900
ttcgccgcct acagacctag cgtgctgaag tggatcagaa agaagttccc ccacatcttc 960
aagcagccct tcaagaaaac caccggcgct gcccaggaag aggacgcctg cagctgtaga 1020
tgccctcagg aagaagaagg cggcggaggc ggctacgagc tg 1062
<210> 54
<211> 1305
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muSIRP альфа tm-CD28
<400> 54
atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60
agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120
aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180
ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240
agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360
tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420
accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480
ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540
atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600
cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660
atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720
ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780
cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840
cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900
aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960
tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020
gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080
cagaccttcc ccgacaacaa cgccacccac aactggaacg tgttcatcgg cgtgggcgtg 1140
gcctgtgctc tgctggtggt gctgctgatg gccgccctgt ataacagcag aagaaacaga 1200
ggcggccaga gcgactacat gaacatgacc cccagaaggc ctggcctgac cagaaagccc 1260
taccagcctt acgcccctgc cagagacttc gccgcctaca gacct 1305
<210> 55
<211> 1323
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muSIRP альфа-CD28tm
<400> 55
atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60
agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120
aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180
ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240
agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360
tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420
accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480
ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540
atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600
cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660
atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720
ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780
cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840
cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900
aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960
tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020
gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080
cagaccttcc ccgacaacaa cgccacccac aactggaact tctgggccct ggtggtggtg 1140
gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc 1200
aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcct 1260
ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga 1320
cct 1323
<210> 56
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muSIRP альфа-CD28cys
<400> 56
atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60
agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120
aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180
ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240
agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360
tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420
accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480
ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540
atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600
cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660
atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720
ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780
cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840
cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900
aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960
tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020
gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080
cagaccttcc ccgacaacaa cgccacccac aactggaact gccacaccca gagcagcccc 1140
aagctgttct gggctctggt ggtggtggcc ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg 1200
accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac 1260
tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgacccgga agccttacca gccttacgcc 1320
cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 1350
<210> 57
<211> 1332
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muSIRP альфа-6aas-CD28cys
<400> 57
atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60
agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120
aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180
ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240
agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360
tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420
accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480
ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540
atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600
cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660
atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720
ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780
cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840
cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900
aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960
tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020
gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080
cagaccttcc ccgacaacaa ctgccacacc cagagcagcc ccaagctgtt ctgggctctg 1140
gtggtggtgg ccggcgtgct gttttgttac ggcctgctcg tgaccgtggc cctgtgcgtg 1200
atctggacca acagcagaag aaacagaggc ggccagagcg actacatgaa catgaccccc 1260
agaaggcctg gcctgacccg gaagccttac cagccttacg cccctgccag agacttcgcc 1320
gcctacagac ct 1332
<210> 58
<211> 1323
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muSIRP альфа-9aas-CD28cys
<400> 58
atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60
agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120
aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180
ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240
agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360
tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420
accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480
ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540
atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600
cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660
atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720
ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780
cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840
cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900
aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960
tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020
gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080
cagaccttcc cctgccacac ccagagcagc cccaagctgt tctgggctct ggtggtggtg 1140
gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc 1200
aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcct 1260
ggcctgaccc ggaagcctta ccagccttac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga 1320
cct 1323
<210> 59
<211> 1281
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muSIRP альфа-23aas-CD28cys
<400> 59
atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60
agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120
aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180
ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240
agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300
aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360
tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420
accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480
ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540
atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600
cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660
atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720
ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780
cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840
cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900
aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960
tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020
gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc tgccacaccc agagcagccc caagctgttc 1080
tgggctctgg tggtggtggc cggcgtgctg ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc 1140
ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagaaga aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac 1200
atgaccccca gaaggcctgg cctgacccgg aagccttacc agccttacgc ccctgccaga 1260
gacttcgccg cctacagacc t 1281
<210> 60
<211> 137
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен huPD-1
<400> 60
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg
115 120 125
Ser Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val
130 135
<210> 61
<211> 627
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целый внеклеточный домен huCD2
<400> 61
atgagctttc catgtaaatt tgtagccagc ttccttctga ttttcaatgt ttcttccaaa 60
ggtgcagtct ccaaagagat tacgaatgcc ttggaaacct ggggtgcctt gggtcaggac 120
atcaacttgg acattcctag ttttcaaatg agtgatgata ttgacgatat aaaatgggaa 180
aaaacttcag acaagaaaaa gattgcacaa ttcagaaaag agaaagagac tttcaaggaa 240
aaagatacat ataagctatt taaaaatgga actctgaaaa ttaagcatct gaagaccgat 300
gatcaggata tctacaaggt atcaatatat gatacaaaag gaaaaaatgt gttggaaaaa 360
atatttgatt tgaagattca agagagggtc tcaaaaccaa agatctcctg gacttgtatc 420
aacacaaccc tgacctgtga ggtaatgaat ggaactgacc ccgaattaaa cctgtatcaa 480
gatgggaaac atctaaaact ttctcagagg gtcatcacac acaagtggac caccagcctg 540
agtgcaaaat tcaagtgcac agcagggaac aaagtcagca aggaatccag tgtcgagcct 600
gtcagctgtc cagagaaagg tctggac 627
<210> 62
<211> 209
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целый внеклеточный домен huCD2
<400> 62
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu
195 200 205
Asp
<210> 63
<211> 78
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huCD2
<400> 63
atctatctca tcattggcat atgtggagga ggcagcctct tgatggtctt tgtggcactg 60
ctcgttttct atatcacc 78
<210> 64
<211> 26
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huCD2
<400> 64
Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met Val
1 5 10 15
Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr
20 25
<210> 65
<211> 828
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК huCD2tm-CD28
<400> 65
atgagctttc catgtaaatt tgtagccagc ttccttctga ttttcaatgt ttcttccaaa 60
ggtgcagtct ccaaagagat tacgaatgcc ttggaaacct ggggtgcctt gggtcaggac 120
atcaacttgg acattcctag ttttcaaatg agtgatgata ttgacgatat aaaatgggaa 180
aaaacttcag acaagaaaaa gattgcacaa ttcagaaaag agaaagagac tttcaaggaa 240
aaagatacat ataagctatt taaaaatgga actctgaaaa ttaagcatct gaagaccgat 300
gatcaggata tctacaaggt atcaatatat gatacaaaag gaaaaaatgt gttggaaaaa 360
atatttgatt tgaagattca agagagggtc tcaaaaccaa agatctcctg gacttgtatc 420
aacacaaccc tgacctgtga ggtaatgaat ggaactgacc ccgaattaaa cctgtatcaa 480
gatgggaaac atctaaaact ttctcagagg gtcatcacac acaagtggac caccagcctg 540
agtgcaaaat tcaagtgcac agcagggaac aaagtcagca aggaatccag tgtcgagcct 600
gtcagctgtc cagagaaagg tctggacatc tatctcatca ttggcatatg tggaggaggc 660
agcctcttga tggtctttgt ggcactgctc gttttctata tcacccgcag caagcggagc 720
agaggcggcc acagcgacta catgaacatg acccctagac ggcctggccc caccagaaag 780
cactaccagc cctacgcccc tccccgggac tttgccgcct acagaagc 828
<210> 66
<211> 276
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huCD2tm-CD28
<400> 66
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu
195 200 205
Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met
210 215 220
Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Arg Ser Lys Arg Ser
225 230 235 240
Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
245 250 255
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
260 265 270
Ala Tyr Arg Ser
275
<210> 67
<211> 831
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huCD2-CD28tm
<400> 67
atgagctttc catgtaaatt tgtagccagc ttccttctga ttttcaatgt ttcttccaaa 60
ggtgcagtct ccaaagagat tacgaatgcc ttggaaacct ggggtgcctt gggtcaggac 120
atcaacttgg acattcctag ttttcaaatg agtgatgata ttgacgatat aaaatgggaa 180
aaaacttcag acaagaaaaa gattgcacaa ttcagaaaag agaaagagac tttcaaggaa 240
aaagatacat ataagctatt taaaaatgga actctgaaaa ttaagcatct gaagaccgat 300
gatcaggata tctacaaggt atcaatatat gatacaaaag gaaaaaatgt gttggaaaaa 360
atatttgatt tgaagattca agagagggtc tcaaaaccaa agatctcctg gacttgtatc 420
aacacaaccc tgacctgtga ggtaatgaat ggaactgacc ccgaattaaa cctgtatcaa 480
gatgggaaac atctaaaact ttctcagagg gtcatcacac acaagtggac caccagcctg 540
agtgcaaaat tcaagtgcac agcagggaac aaagtcagca aggaatccag tgtcgagcct 600
gtcagctgtc cagagaaagg tctggacttc tgggtgctgg tggtggtcgg aggcgtgctg 660
gcctgctaca gcctgctggt caccgtggcc ttcatcatct tttgggtccg cagcaagcgg 720
agcagaggcg gccacagcga ctacatgaac atgaccccta gacggcctgg ccccaccaga 780
aagcactacc agccctacgc ccctccccgg gactttgccg cctacagaag c 831
<210> 68
<211> 277
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huCD2-CD28tm
<400> 68
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu
195 200 205
Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
210 215 220
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
225 230 235 240
Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
245 250 255
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
260 265 270
Ala Ala Tyr Arg Ser
275
<210> 69
<211> 969
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huCD200R-CD28Cys
<400> 69
atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60
gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120
gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180
tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240
cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300
accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360
cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420
ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480
cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540
atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600
aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660
ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgcctggcgc caagaagtcc 720
gccaagctgt gtcccagccc tctgtttccc ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg 780
gtggtcggag gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtca ccgtggcctt catcatcttt 840
tgggtccgca gcaagcggag cagaggcggc cacagcgact acatgaacat gacccctaga 900
cggcctggcc ccaccagaaa gcactaccag ccctacgccc ctccccggga ctttgccgcc 960
tacagaagc 969
<210> 70
<211> 323
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huCD200R-CD28Cys
<400> 70
Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser
35 40 45
Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys
85 90 95
Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp
100 105 110
Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly
115 120 125
Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly
130 135 140
Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn
145 150 155 160
Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala
165 170 175
Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr
180 185 190
Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val
195 200 205
His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn
210 215 220
Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser
225 230 235 240
Ala Lys Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe
245 250 255
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
260 265 270
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
275 280 285
Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
290 295 300
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
305 310 315 320
Tyr Arg Ser
<210> 71
<211> 519
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целый внеклеточный домен huFas
<400> 71
atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60
aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120
gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180
aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240
gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300
tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360
cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420
gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480
tccaacacaa agtgcaaaga ggaaggcagc agaagcaac 519
<210> 72
<211> 173
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целый внеклеточный домен huFas
<400> 72
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn
165 170
<210> 73
<211> 498
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFas внеклеточный домен -7aas
<400> 73
atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60
aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120
gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180
aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240
gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300
tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360
cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420
gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480
tccaacacaa agtgcaaa 498
<210> 74
<211> 166
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFas внеклеточный домен -7aas
<400> 74
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys
165
<210> 75
<211> 483
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFas внеклеточный домен -12aas
<400> 75
atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60
aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120
gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180
aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240
gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300
tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360
cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420
gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480
tcc 483
<210> 76
<211> 161
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFas внеклеточный домен -12aas
<400> 76
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser
<210> 77
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huFas
<400> 77
ctgggctggc tgtgcctcct gctgctgccc atccctctga tcgtgtgggt c 51
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huFas
<400> 78
Leu Gly Trp Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp
1 5 10 15
Val
<210> 79
<211> 693
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFAStm-CD28
<400> 79
atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60
aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120
gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180
aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240
gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300
tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360
cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420
gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480
tccaacacaa agtgcaaaga ggaaggcagc agaagcaacc tgggctggct gtgcctcctg 540
ctgctgccca tccctctgat cgtgtgggtc cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc 600
gactacatga acatgacccc tagacggcct ggccccacca gaaagcacta ccagccctac 660
gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga agc 693
<210> 80
<211> 231
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFAStm-CD28
<400> 80
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp
165 170 175
Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Arg Ser
180 185 190
Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
195 200 205
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
210 215 220
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
225 230
<210> 81
<211> 723
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFAS-CD28tm
<400> 81
atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60
aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120
gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180
aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240
gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300
tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360
cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420
gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480
tccaacacaa agtgcaaaga ggaaggcagc agaagcaact tctgggtgct ggtggtggtc 540
ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 600
cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 660
ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 720
agc 723
<210> 82
<211> 241
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFAS-CD28tm
<400> 82
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Phe Trp Val
165 170 175
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
180 185 190
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly
195 200 205
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
210 215 220
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
225 230 235 240
Ser
<210> 83
<211> 759
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFAS-CD28Cys
<400> 83
atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60
aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120
gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180
aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240
gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300
tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360
cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420
gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480
tccaacacaa agtgcaaaga ggaaggcagc agaagcaact gtcccagccc tctgtttccc 540
ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtggtcggag gcgtgctggc ctgctacagc 600
ctgctggtca ccgtggcctt catcatcttt tgggtccgca gcaagcggag cagaggcggc 660
cacagcgact acatgaacat gacccctaga cggcctggcc ccaccagaaa gcactaccag 720
ccctacgccc ctccccggga ctttgccgcc tacagaagc 759
<210> 84
<211> 253
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFAS-CD28Cys
<400> 84
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Cys Pro Ser
165 170 175
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
180 185 190
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
195 200 205
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr
210 215 220
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
225 230 235 240
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
245 250
<210> 85
<211> 738
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFAS-7aas-CD28Cys
<400> 85
atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60
aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120
gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180
aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240
gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300
tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360
cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420
gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480
tccaacacaa agtgcaaatg tcccagccct ctgtttcccg gccctagcaa gcctttctgg 540
gtgctggtgg tggtcggagg cgtgctggcc tgctacagcc tgctggtcac cgtggccttc 600
atcatctttt gggtccgcag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 660
acccctagac ggcctggccc caccagaaag cactaccagc cctacgcccc tccccgggac 720
tttgccgcct acagaagc 738
<210> 86
<211> 246
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huFAS-7aas-CD28Cys
<400> 86
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
165 170 175
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
180 185 190
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
195 200 205
Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
210 215 220
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
225 230 235 240
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
245
<210> 87
<211> 723
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FAS-12aas-CD28Cys
<400> 87
atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60
aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120
gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180
aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240
gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300
tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360
cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420
gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480
tcctgtccca gccctctgtt tcccggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc 540
ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 600
cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 660
ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 720
agc 723
<210> 88
<211> 241
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FAS-12aas-CD28Cys
<400> 88
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val
165 170 175
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
180 185 190
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly
195 200 205
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
210 215 220
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
225 230 235 240
Ser
<210> 89
<211> 510
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1 целый внеклеточный домен 2
<400> 89
atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60
cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120
ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240
gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360
tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420
gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccaccctag cccatctcca 480
agacctgccg gccagttcca gacactggtc 510
<210> 90
<211> 170
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1 целый внеклеточный домен 2
<400> 90
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val
165 170
<210> 91
<211> 474
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1 2 -12aas
<400> 91
atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60
cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120
ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240
gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360
tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420
gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccaccctag ccca 474
<210> 92
<211> 158
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1 2 -12aas
<400> 92
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro
145 150 155
<210> 93
<211> 465
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1 2 -15aas
<400> 93
atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60
cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120
ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240
gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360
tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420
gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccac 465
<210> 94
<211> 155
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1 2 -15aas
<400> 94
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 95
<211> 447
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1 2 -21aas
<400> 95
atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60
cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120
ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240
gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360
tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420
gagctgagag tgaccgagag aagggcc 447
<210> 96
<211> 149
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1 2 -21aas
<400> 96
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala
145
<210> 97
<211> 750
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1-CD28Cys
<400> 97
atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60
cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120
ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240
gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360
tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420
gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccaccctag cccatctcca 480
agacctgccg gccagttcca gacactggtc tgtcccagcc ctctgtttcc cggccctagc 540
aagcctttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 600
accgtggcct tcatcatctt ttgggtccgc agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 660
tacatgaaca tgacccctag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccctacgcc 720
cctccccggg actttgccgc ctacagaagc 750
<210> 98
<211> 250
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1-CD28Cys
<400> 98
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Cys Pro Ser Pro Leu Phe
165 170 175
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
180 185 190
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
195 200 205
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met
210 215 220
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
225 230 235 240
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
245 250
<210> 99
<211> 714
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1-12aas-CD28Cys
<400> 99
atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60
cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120
ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240
gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360
tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420
gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccaccctag cccatgtccc 480
agccctctgt ttcccggccc tagcaagcct ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg 540
ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg gccttcatca tcttttgggt ccgcagcaag 600
cggagcagag gcggccacag cgactacatg aacatgaccc ctagacggcc tggccccacc 660
agaaagcact accagcccta cgcccctccc cgggactttg ccgcctacag aagc 714
<210> 100
<211> 238
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1-12aas-CD28Cys
<400> 100
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Cys Pro
145 150 155 160
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
165 170 175
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
180 185 190
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
195 200 205
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
210 215 220
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
225 230 235
<210> 101
<211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1-15aas-CD28Cys
<400> 101
atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60
cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120
ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240
gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360
tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420
gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccactgtcc cagccctctg 480
tttcccggcc ctagcaagcc tttctgggtg ctggtggtgg tcggaggcgt gctggcctgc 540
tacagcctgc tggtcaccgt ggccttcatc atcttttggg tccgcagcaa gcggagcaga 600
ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc cctagacggc ctggccccac cagaaagcac 660
taccagccct acgcccctcc ccgggacttt gccgcctaca gaagc 705
<210> 102
<211> 235
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1-15aas-CD28Cys
<400> 102
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Cys Pro Ser Pro Leu
145 150 155 160
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
165 170 175
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
180 185 190
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn
195 200 205
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
210 215 220
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
225 230 235
<210> 103
<211> 687
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1-21aas-CD28Cys
<400> 103
atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60
cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120
ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240
gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360
tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420
gagctgagag tgaccgagag aagggcctgt cccagccctc tgtttcccgg ccctagcaag 480
cctttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 540
gtggccttca tcatcttttg ggtccgcagc aagcggagca gaggcggcca cagcgactac 600
atgaacatga cccctagacg gcctggcccc accagaaagc actaccagcc ctacgcccct 660
ccccgggact ttgccgccta cagaagc 687
<210> 104
<211> 229
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huPD1-21aas-CD28Cys
<400> 104
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
145 150 155 160
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
165 170 175
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
180 185 190
Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
195 200 205
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
210 215 220
Ala Ala Tyr Arg Ser
225
<210> 105
<211> 810
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD2tm-CD28
<400> 105
atgaagtgca agttcctggg ctcattcttc ctgctgttca gcctgagcgg caagggcgcc 60
gactgcagag acaacgagac aatctggggc gtgctgggcc acggcatcac cctgaacatc 120
cccaacttcc agatgaccga cgacatcgac gaagtgcgct gggtgcgaag aggcacactg 180
gtggccgagt tcaagagaaa gaagccccca ttcctgatca gcgagacata cgaggtgctg 240
gccaacggca gcctgaagat caagaaaccc atgatgagaa acgacagcgg cacctacaac 300
gtgatggtgt acggcaccaa cggcatgacc agactggaaa aggacctgga cgtgcggatc 360
ctggaaaggg tgtccaagcc catgatccac tgggagtgcc ccaacaccac cctgacctgt 420
gctgtgctgc agggcaccga cttcgagctg aagctgtacc agggcgagac actgctgaac 480
tccctgcccc agaaaaacat gagctaccag tggaccaacc tgaacgcccc cttcaagtgc 540
gaggccatca accccgtgtc caaagaaagc aagatggaag tcgtgaactg ccccgagaag 600
ggcctgagct tctacgtgac agtgggcgtg ggagctggcg gactgctgct ggtgctgctg 660
gtggccctgt tcatcttctg catctgcaac agcagacgga acagaggcgg ccagagcgac 720
tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc 780
cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 810
<210> 106
<211> 270
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD2tm-CD28
<400> 106
Met Lys Cys Lys Phe Leu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Phe Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Lys Gly Ala Asp Cys Arg Asp Asn Glu Thr Ile Trp Gly Val Leu
20 25 30
Gly His Gly Ile Thr Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp
35 40 45
Ile Asp Glu Val Arg Trp Val Arg Arg Gly Thr Leu Val Ala Glu Phe
50 55 60
Lys Arg Lys Lys Pro Pro Phe Leu Ile Ser Glu Thr Tyr Glu Val Leu
65 70 75 80
Ala Asn Gly Ser Leu Lys Ile Lys Lys Pro Met Met Arg Asn Asp Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Asn Val Met Val Tyr Gly Thr Asn Gly Met Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Lys Asp Leu Asp Val Arg Ile Leu Glu Arg Val Ser Lys Pro Met
115 120 125
Ile His Trp Glu Cys Pro Asn Thr Thr Leu Thr Cys Ala Val Leu Gln
130 135 140
Gly Thr Asp Phe Glu Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Leu Asn
145 150 155 160
Ser Leu Pro Gln Lys Asn Met Ser Tyr Gln Trp Thr Asn Leu Asn Ala
165 170 175
Pro Phe Lys Cys Glu Ala Ile Asn Pro Val Ser Lys Glu Ser Lys Met
180 185 190
Glu Val Val Asn Cys Pro Glu Lys Gly Leu Ser Phe Tyr Val Thr Val
195 200 205
Gly Val Gly Ala Gly Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Phe
210 215 220
Ile Phe Cys Ile Cys Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp
225 230 235 240
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr
245 250 255
Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
260 265 270
<210> 107
<211> 813
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD2-CD28tm
<400> 107
atgaagtgca agttcctggg ctcattcttc ctgctgttca gcctgagcgg caagggcgcc 60
gactgcagag acaacgagac aatctggggc gtgctgggcc acggcatcac cctgaacatc 120
cccaacttcc agatgaccga cgacatcgac gaagtgcgct gggtgcgaag aggcacactg 180
gtggccgagt tcaagagaaa gaagccccca ttcctgatca gcgagacata cgaggtgctg 240
gccaacggca gcctgaagat caagaaaccc atgatgagaa acgacagcgg cacctacaac 300
gtgatggtgt acggcaccaa cggcatgacc agactggaaa aggacctgga cgtgcggatc 360
ctggaaaggg tgtccaagcc catgatccac tgggagtgcc ccaacaccac cctgacctgt 420
gctgtgctgc agggcaccga cttcgagctg aagctgtacc agggcgagac actgctgaac 480
tccctgcccc agaaaaacat gagctaccag tggaccaacc tgaacgcccc cttcaagtgc 540
gaggccatca accccgtgtc caaagaaagc aagatggaag tcgtgaactg ccccgagaag 600
ggcctgagct tctgggccct ggtggtggtg gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc 660
gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc 720
gactacatga acatgacccc cagaaggcct ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac 780
gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga ccc 813
<210> 108
<211> 271
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD2-CD28tm
<400> 108
Met Lys Cys Lys Phe Leu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Phe Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Lys Gly Ala Asp Cys Arg Asp Asn Glu Thr Ile Trp Gly Val Leu
20 25 30
Gly His Gly Ile Thr Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp
35 40 45
Ile Asp Glu Val Arg Trp Val Arg Arg Gly Thr Leu Val Ala Glu Phe
50 55 60
Lys Arg Lys Lys Pro Pro Phe Leu Ile Ser Glu Thr Tyr Glu Val Leu
65 70 75 80
Ala Asn Gly Ser Leu Lys Ile Lys Lys Pro Met Met Arg Asn Asp Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Asn Val Met Val Tyr Gly Thr Asn Gly Met Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Lys Asp Leu Asp Val Arg Ile Leu Glu Arg Val Ser Lys Pro Met
115 120 125
Ile His Trp Glu Cys Pro Asn Thr Thr Leu Thr Cys Ala Val Leu Gln
130 135 140
Gly Thr Asp Phe Glu Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Leu Asn
145 150 155 160
Ser Leu Pro Gln Lys Asn Met Ser Tyr Gln Trp Thr Asn Leu Asn Ala
165 170 175
Pro Phe Lys Cys Glu Ala Ile Asn Pro Val Ser Lys Glu Ser Lys Met
180 185 190
Glu Val Val Asn Cys Pro Glu Lys Gly Leu Ser Phe Trp Ala Leu Val
195 200 205
Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala
210 215 220
Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser
225 230 235 240
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro
245 250 255
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
260 265 270
<210> 109
<211> 840
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD2-CD28Cys
<400> 109
atgaagtgca agttcctggg ctcattcttc ctgctgttca gcctgagcgg caagggcgcc 60
gactgcagag acaacgagac aatctggggc gtgctgggcc acggcatcac cctgaacatc 120
cccaacttcc agatgaccga cgacatcgac gaagtgcgct gggtgcgaag aggcacactg 180
gtggccgagt tcaagagaaa gaagccccca ttcctgatca gcgagacata cgaggtgctg 240
gccaacggca gcctgaagat caagaaaccc atgatgagaa acgacagcgg cacctacaac 300
gtgatggtgt acggcaccaa cggcatgacc agactggaaa aggacctgga cgtgcggatc 360
ctggaaaggg tgtccaagcc catgatccac tgggagtgcc ccaacaccac cctgacctgt 420
gctgtgctgc agggcaccga cttcgagctg aagctgtacc agggcgagac actgctgaac 480
tccctgcccc agaaaaacat gagctaccag tggaccaacc tgaacgcccc cttcaagtgc 540
gaggccatca accccgtgtc caaagaaagc aagatggaag tcgtgaactg ccccgagaag 600
ggcctgagct gccacaccca gagcagcccc aagctgttct gggccctggt ggtggtggcc 660
ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac 720
agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc 780
ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 840
<210> 110
<211> 280
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD2-CD28Cys
<400> 110
Met Lys Cys Lys Phe Leu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Phe Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Lys Gly Ala Asp Cys Arg Asp Asn Glu Thr Ile Trp Gly Val Leu
20 25 30
Gly His Gly Ile Thr Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp
35 40 45
Ile Asp Glu Val Arg Trp Val Arg Arg Gly Thr Leu Val Ala Glu Phe
50 55 60
Lys Arg Lys Lys Pro Pro Phe Leu Ile Ser Glu Thr Tyr Glu Val Leu
65 70 75 80
Ala Asn Gly Ser Leu Lys Ile Lys Lys Pro Met Met Arg Asn Asp Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Asn Val Met Val Tyr Gly Thr Asn Gly Met Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Lys Asp Leu Asp Val Arg Ile Leu Glu Arg Val Ser Lys Pro Met
115 120 125
Ile His Trp Glu Cys Pro Asn Thr Thr Leu Thr Cys Ala Val Leu Gln
130 135 140
Gly Thr Asp Phe Glu Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Leu Asn
145 150 155 160
Ser Leu Pro Gln Lys Asn Met Ser Tyr Gln Trp Thr Asn Leu Asn Ala
165 170 175
Pro Phe Lys Cys Glu Ala Ile Asn Pro Val Ser Lys Glu Ser Lys Met
180 185 190
Glu Val Val Asn Cys Pro Glu Lys Gly Leu Ser Cys His Thr Gln Ser
195 200 205
Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe
210 215 220
Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn
225 230 235 240
Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
245 250 255
Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala
260 265 270
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
275 280
<210> 111
<211> 861
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD2-CD28Cys-41BBic
<400> 111
atgaagtgca agttcctggg ctcattcttc ctgctgttca gcctgagcgg caagggcgcc 60
gactgcagag acaacgagac aatctggggc gtgctgggcc acggcatcac cctgaacatc 120
cccaacttcc agatgaccga cgacatcgac gaagtgcgct gggtgcgaag aggcacactg 180
gtggccgagt tcaagagaaa gaagccccca ttcctgatca gcgagacata cgaggtgctg 240
gccaacggca gcctgaagat caagaaaccc atgatgagaa acgacagcgg cacctacaac 300
gtgatggtgt acggcaccaa cggcatgacc agactggaaa aggacctgga cgtgcggatc 360
ctggaaaggg tgtccaagcc catgatccac tgggagtgcc ccaacaccac cctgacctgt 420
gctgtgctgc agggcaccga cttcgagctg aagctgtacc agggcgagac actgctgaac 480
tccctgcccc agaaaaacat gagctaccag tggaccaacc tgaacgcccc cttcaagtgc 540
gaggccatca accccgtgtc caaagaaagc aagatggaag tcgtgaactg ccccgagaag 600
ggcctgagct gccacaccca gagcagcccc aagctgttct gggccctggt ggtggtggcc 660
ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccagc 720
gtgctgaagt ggatcagaaa gaagttcccc cacatcttca agcagccctt caagaaaacc 780
accggcgctg cccaggaaga ggacgcctgc agctgtagat gccctcagga agaagaaggc 840
ggcggaggcg gctacgagct g 861
<210> 112
<211> 287
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD2-CD28Cys-41BBic
<400> 112
Met Lys Cys Lys Phe Leu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Phe Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Lys Gly Ala Asp Cys Arg Asp Asn Glu Thr Ile Trp Gly Val Leu
20 25 30
Gly His Gly Ile Thr Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp
35 40 45
Ile Asp Glu Val Arg Trp Val Arg Arg Gly Thr Leu Val Ala Glu Phe
50 55 60
Lys Arg Lys Lys Pro Pro Phe Leu Ile Ser Glu Thr Tyr Glu Val Leu
65 70 75 80
Ala Asn Gly Ser Leu Lys Ile Lys Lys Pro Met Met Arg Asn Asp Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Asn Val Met Val Tyr Gly Thr Asn Gly Met Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Lys Asp Leu Asp Val Arg Ile Leu Glu Arg Val Ser Lys Pro Met
115 120 125
Ile His Trp Glu Cys Pro Asn Thr Thr Leu Thr Cys Ala Val Leu Gln
130 135 140
Gly Thr Asp Phe Glu Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Leu Asn
145 150 155 160
Ser Leu Pro Gln Lys Asn Met Ser Tyr Gln Trp Thr Asn Leu Asn Ala
165 170 175
Pro Phe Lys Cys Glu Ala Ile Asn Pro Val Ser Lys Glu Ser Lys Met
180 185 190
Glu Val Val Asn Cys Pro Glu Lys Gly Leu Ser Cys His Thr Gln Ser
195 200 205
Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe
210 215 220
Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Ser
225 230 235 240
Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro
245 250 255
Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys
260 265 270
Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
275 280 285
<210> 113
<211> 1080
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-3aas-CD28Cys tm ic-41BB
<400> 113
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtcctgcca cacccagagc 720
agccccaagc tgttctgggc cctggtggtg gtggccggcg tgctgttttg ttacggcctg 780
ctcgtgaccg tggccctgtg cgtgatctgg accaacagca gaagaaacag aggcggccag 840
agcgactaca tgaacatgac ccccagaagg cctggcctga ccagaaagcc ctaccagcct 900
tacgcccctg ccagagactt cgccgcctac agacctagcg tgctgaagtg gatcagaaag 960
aagttccccc acatcttcaa gcagcccttc aagaaaacca ccggcgctgc ccaggaagag 1020
gacgcctgca gctgtagatg ccctcaggaa gaagaaggcg gcggaggcgg ctacgagctg 1080
<210> 114
<211> 360
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-3aas-CD28Cys tm ic-41BB
<400> 114
Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu Ile Trp
1 5 10 15
Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln Thr Thr
20 25 30
Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Val Ser
35 40 45
Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile Pro Leu
50 55 60
Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly Leu Pro
65 70 75 80
Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu Thr Ser
85 90 95
Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro
100 105 110
Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr
115 120 125
Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr Asp Leu
130 135 140
Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys Asn Arg
145 150 155 160
Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser
165 170 175
Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His Ser Asn
180 185 190
Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val
195 200 205
Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln Ser Leu
210 215 220
Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Cys His Thr Gln Ser
225 230 235 240
Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe
245 250 255
Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn
260 265 270
Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
275 280 285
Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala
290 295 300
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys
305 310 315 320
Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala
325 330 335
Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
355 360
<210> 115
<211> 966
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-CD28Cys tm ic-41BB
<400> 115
atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60
gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120
acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180
agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240
agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300
aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360
ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420
aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480
agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540
ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600
tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660
aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtccctgag gccctgccac 720
acccagagca gccccaagct gttctgggcc ctggtggtgg tggccggcgt gctgttttgt 780
tacggcctgc tcgtgaccgt ggccctgtgc gtgatctgga ccagcgtgct gaagtggatc 840
agaaagaagt tcccccacat cttcaagcag cccttcaaga aaaccaccgg cgctgcccag 900
gaagaggacg cctgcagctg tagatgccct caggaagaag aaggcggcgg aggcggctac 960
gagctg 966
<210> 116
<211> 322
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muCD200R-CD28Cys tm ic-41BB
<400> 116
Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu Ile Trp
1 5 10 15
Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln Thr Thr
20 25 30
Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Val Ser
35 40 45
Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile Pro Leu
50 55 60
Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly Leu Pro
65 70 75 80
Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu Thr Ser
85 90 95
Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro
100 105 110
Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr
115 120 125
Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr Asp Leu
130 135 140
Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys Asn Arg
145 150 155 160
Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser
165 170 175
Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His Ser Asn
180 185 190
Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val
195 200 205
Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln Ser Leu
210 215 220
Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Leu Arg Pro Cys His
225 230 235 240
Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly
245 250 255
Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile
260 265 270
Trp Thr Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe
275 280 285
Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala
290 295 300
Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr
305 310 315 320
Glu Leu
<210> 117
<211> 681
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muFas tm-CD28
<400> 117
atgctgtgga tctgggccgt gctgcctctg gtgctggctg gatcacagct gagagtgcac 60
acccagggca ccaacagcat cagcgagagc ctgaagctga gaagaagagt gcgcgagaca 120
gacaagaact gcagcgaggg cctgtaccag ggcggaccct tctgctgtca gccttgccag 180
cccggcaaga aaaaggtgga agattgcaag atgaacggcg gcacccctac ctgcgcccct 240
tgtacagagg gcaaagagta catggacaag aaccactacg ccgacaagtg cagacggtgc 300
accctgtgcg acgaggaaca cggcctggaa gtggaaacaa actgcaccct gacccagaac 360
accaagtgca agtgcaaacc cgacttctac tgcgacagcc ccggctgcga gcactgcgtc 420
agatgtgcct cttgcgagca cggcaccctg gaaccttgta ccgccaccag caacaccaac 480
tgccggaagc agagccccag aaacagactg tggctgctga ccatcctggt gctgctgatc 540
cccctggtgt tcatctacaa cagcagaaga aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac 600
atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga aagccctacc agccttacgc ccctgccaga 660
gacttcgccg cctacagacc t 681
<210> 118
<211> 227
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muFas tm-CD28
<400> 118
Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln
1 5 10 15
Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys
20 25 30
Leu Arg Arg Arg Val Arg Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu
35 40 45
Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys
50 55 60
Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro
65 70 75 80
Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys
85 90 95
Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu
100 105 110
Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp
115 120 125
Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser
130 135 140
Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn
145 150 155 160
Cys Arg Lys Gln Ser Pro Arg Asn Arg Leu Trp Leu Leu Thr Ile Leu
165 170 175
Val Leu Leu Ile Pro Leu Val Phe Ile Tyr Asn Ser Arg Arg Asn Arg
180 185 190
Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu
195 200 205
Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala
210 215 220
Tyr Arg Pro
225
<210> 119
<211> 711
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muFas-CD28tm
<400> 119
atgctgtgga tctgggccgt gctgcctctg gtgctggctg gatcacagct gagagtgcac 60
acccagggca ccaacagcat cagcgagagc ctgaagctga gaagaagagt gcgcgagaca 120
gacaagaact gcagcgaggg cctgtaccag ggcggaccct tctgctgtca gccttgccag 180
cccggcaaga aaaaggtgga agattgcaag atgaacggcg gcacccctac ctgcgcccct 240
tgtacagagg gcaaagagta catggacaag aaccactacg ccgacaagtg cagacggtgc 300
accctgtgcg acgaggaaca cggcctggaa gtggaaacaa actgcaccct gacccagaac 360
accaagtgca agtgcaaacc cgacttctac tgcgacagcc ccggctgcga gcactgcgtc 420
agatgtgcct cttgcgagca cggcaccctg gaaccttgta ccgccaccag caacaccaac 480
tgccggaagc agagccccag aaacagattc tgggccctgg tggtggtggc cggcgtgctg 540
ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagaaga 600
aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga 660
aagccctacc agccttacgc ccctgccaga gacttcgccg cctacagacc t 711
<210> 120
<211> 237
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muFas-CD28tm
<400> 120
Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln
1 5 10 15
Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys
20 25 30
Leu Arg Arg Arg Val Arg Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu
35 40 45
Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys
50 55 60
Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro
65 70 75 80
Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys
85 90 95
Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu
100 105 110
Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp
115 120 125
Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser
130 135 140
Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn
145 150 155 160
Cys Arg Lys Gln Ser Pro Arg Asn Arg Phe Trp Ala Leu Val Val Val
165 170 175
Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys
180 185 190
Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr
195 200 205
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln
210 215 220
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
225 230 235
<210> 121
<211> 738
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muFas-CD28Cys
<400> 121
atgctgtgga tctgggccgt gctgcctctg gtgctggctg gatcacagct gagagtgcac 60
acccagggca ccaacagcat cagcgagagc ctgaagctga gaagaagagt gcgcgagaca 120
gacaagaact gcagcgaggg cctgtaccag ggcggaccct tctgctgtca gccttgccag 180
cccggcaaga aaaaggtgga agattgcaag atgaacggcg gcacccctac ctgcgcccct 240
tgtacagagg gcaaagagta catggacaag aaccactacg ccgacaagtg cagacggtgc 300
accctgtgcg acgaggaaca cggcctggaa gtggaaacaa actgcaccct gacccagaac 360
accaagtgca agtgcaaacc cgacttctac tgcgacagcc ccggctgcga gcactgcgtc 420
agatgtgcct cttgcgagca cggcaccctg gaaccttgta ccgccaccag caacaccaac 480
tgccggaagc agagccccag aaacagatgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 540
gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 600
tgcgtgatct ggaccaacag cagaagaaac agaggcggcc agagcgacta catgaacatg 660
acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 720
ttcgccgcct acagacct 738
<210> 122
<211> 246
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muFas-CD28Cys
<400> 122
Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln
1 5 10 15
Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys
20 25 30
Leu Arg Arg Arg Val Arg Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu
35 40 45
Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys
50 55 60
Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro
65 70 75 80
Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys
85 90 95
Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu
100 105 110
Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp
115 120 125
Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser
130 135 140
Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn
145 150 155 160
Cys Arg Lys Gln Ser Pro Arg Asn Arg Cys His Thr Gln Ser Ser Pro
165 170 175
Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr
180 185 190
Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg
195 200 205
Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
210 215 220
Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp
225 230 235 240
Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
245
<210> 123
<211> 711
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muFas-9aas-CD28Cys
<400> 123
atgctgtgga tctgggccgt gctgcctctg gtgctggctg gatcacagct gagagtgcac 60
acccagggca ccaacagcat cagcgagagc ctgaagctga gaagaagagt gcgcgagaca 120
gacaagaact gcagcgaggg cctgtaccag ggcggaccct tctgctgtca gccttgccag 180
cccggcaaga aaaaggtgga agattgcaag atgaacggcg gcacccctac ctgcgcccct 240
tgtacagagg gcaaagagta catggacaag aaccactacg ccgacaagtg cagacggtgc 300
accctgtgcg acgaggaaca cggcctggaa gtggaaacaa actgcaccct gacccagaac 360
accaagtgca agtgcaaacc cgacttctac tgcgacagcc ccggctgcga gcactgcgtc 420
agatgtgcct cttgcgagca cggcaccctg gaaccttgta ccgccaccag caacaccaac 480
tgccacaccc agagcagccc caagctgttc tgggccctgg tggtggtggc cggcgtgctg 540
ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagaaga 600
aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga 660
aagccctacc agccttacgc ccctgccaga gacttcgccg cctacagacc t 711
<210> 124
<211> 237
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muFas-9aas-CD28Cys
<400> 124
Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln
1 5 10 15
Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys
20 25 30
Leu Arg Arg Arg Val Arg Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu
35 40 45
Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys
50 55 60
Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro
65 70 75 80
Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys
85 90 95
Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu
100 105 110
Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp
115 120 125
Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser
130 135 140
Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn
145 150 155 160
Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val
165 170 175
Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys
180 185 190
Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr
195 200 205
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln
210 215 220
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
225 230 235
<210> 125
<211> 693
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1tm-CD28
<400> 125
atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60
tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120
tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180
gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240
gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300
cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360
tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420
gagctggtcg tgaccgagag aatcctggaa acctccacca gataccccag ccccagccct 480
aagcccgagg gcagatttca gggcatggtc atcggcatca tgagcgccct cgtgggcatc 540
ccagtgttgc tgctgctggc ctgggccctg aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc 600
gactacatga acatgacccc cagaaggcct ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac 660
gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga cct 693
<210> 126
<211> 231
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1tm-CD28
<400> 126
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala
165 170 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Asn Ser
180 185 190
Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
195 200 205
Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg
210 215 220
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
225 230
<210> 127
<211> 711
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1-CD28tm
<400> 127
atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60
tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120
tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180
gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240
gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300
cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360
tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420
gagctggtcg tgaccgagag aatcctggaa acctccacca gataccccag ccccagccct 480
aagcccgagg gcagatttca gggcatgttc tgggccctgg tggtggtggc cggcgtgctg 540
ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagaaga 600
aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga 660
aagccctacc agccttacgc ccctgccaga gacttcgccg cctacagacc t 711
<210> 128
<211> 237
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1-CD28tm
<400> 128
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Phe Trp Ala Leu Val Val Val
165 170 175
Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys
180 185 190
Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr
195 200 205
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln
210 215 220
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
225 230 235
<210> 129
<211> 738
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1-CD28Cys
<400> 129
atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60
tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120
tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180
gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240
gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300
cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360
tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420
gagctggtcg tgaccgagag aatcctggaa acctccacca gataccccag ccccagccct 480
aagcccgagg gcagatttca gggcatgtgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 540
gctctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 600
tgcgtgatct ggaccaacag cagacggaac agaggcggcc agagcgacta catgaatatg 660
acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 720
ttcgccgcct acagacct 738
<210> 130
<211> 246
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1-CD28Cys
<400> 130
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Cys His Thr Gln Ser Ser Pro
165 170 175
Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr
180 185 190
Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg
195 200 205
Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
210 215 220
Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp
225 230 235 240
Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
245
<210> 131
<211> 711
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1-9aas-CD28Cys
<400> 131
atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60
tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120
tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180
gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240
gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300
cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360
tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420
gagctggtcg tgaccgagag aatcctggaa acctccacca gataccccag ccccagccct 480
tgccacaccc agagcagccc caagctgttc tgggctctgg tggtggtggc cggcgtgctg 540
ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagacgg 600
aacagaggcg gccagagcga ctacatgaat atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga 660
aagccctacc agccttacgc ccctgccaga gacttcgccg cctacagacc t 711
<210> 132
<211> 237
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1-9aas-CD28Cys
<400> 132
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val
165 170 175
Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys
180 185 190
Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr
195 200 205
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln
210 215 220
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
225 230 235
<210> 133
<211> 675
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1-21aas-CD28Cys
<400> 133
atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60
tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120
tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180
gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240
gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300
cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360
tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420
gagctggtcg tgaccgagag aatctgccac acccagagca gccccaagct gttctgggct 480
ctggtggtgg tggccggcgt gctgttttgt tacggcctgc tcgtgaccgt ggccctgtgc 540
gtgatctgga ccaacagcag acggaacaga ggcggccaga gcgactacat gaatatgacc 600
cccagaaggc ctggcctgac cagaaagccc taccagcctt acgcccctgc cagagacttc 660
gccgcctaca gacct 675
<210> 134
<211> 225
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muPD1-21aas-CD28Cys
<400> 134
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala
145 150 155 160
Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr
165 170 175
Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly
180 185 190
Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg
195 200 205
Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
210 215 220
Pro
225
<210> 135
<211> 1512
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muLag3tm-CD28
<400> 135
atgagagagg acctgctgct gggctttctg ctgctgggac tgctgtggga ggcccctgtg 60
gtgtcatctg gccctggcaa agaactgccc gtcgtgtggg ctcaggaagg cgctcctgtg 120
catctgccct gcagcctgaa gtcccccaac ctggacccca acttcctgag aagaggcggc 180
gtgatctggc agcaccagcc tgattctggc cagcccacac ctatccctgc cctggatctg 240
caccagggca tgcctagccc tagacagcct gcccctggca gatacaccgt gctgtctgtg 300
gctcctggcg gcctgagaag tggcagacag cctctgcacc ctcacgtgca gctggaagag 360
aggggactgc agaggggcga cttcagcctg tggctgaggc ctgccctgag aacagatgcc 420
ggcgagtacc acgctaccgt gcggctgcct aacagagccc tgagctgctc cctgagactg 480
agagtgggcc aggccagcat gatcgcctct ccatctggcg tgctgaagct gagcgactgg 540
gtgctgctga actgcagctt ctccagaccc gacagacccg tgtccgtgca ctggttccag 600
ggacagaaca gagtgcccgt gtacaacagc cccagacact tcctggccga gacattcctg 660
ctgctgcccc aggtgtcccc tctggactct ggcacatggg gctgcgtgct gacatacagg 720
gacggcttca acgtgtccat cacctacaac ctgaaggtgc tgggcctgga acccgtggct 780
cctctgacag tgtacgccgc cgagggcagc agagtggaac tgccttgtca tctgccaccc 840
ggcgtgggca caccttctct gctgatcgcc aagtggaccc ctccaggcgg aggacctgaa 900
ctgccagtgg ctggcaagag cggcaacttc accctgcacc tggaagcagt gggcctggct 960
caggccggca cctacacctg tagcatccat ctgcagggcc agcagctgaa cgccaccgtg 1020
acactggccg tgatcaccgt gacccccaag agctttggcc tgcctggctc cagaggcaag 1080
ctgctgtgtg aagtgacccc cgccagcggc aaagaaagat tcgtgtggcg gcctctgaac 1140
aacctgagca gatcctgccc aggccccgtg ctggaaatcc aggaagccag actgctggcc 1200
gagcggtggc agtgccagct gtatgaggga cagcgactgc tgggcgccac tgtgtacgct 1260
gctgagtcta gctctggcgc ccacagcgcc agaagaatca gcggcgatct gaagggcggc 1320
cacctggtgc tggtgctgat cctgggcgct ctgagcctgt tcctgctggt ggctggcgct 1380
ttcggcttta acagcagaag aaacagaggc ggccagagcg actacatgaa catgaccccc 1440
agaaggcctg gcctgaccag aaagccctac cagccttacg cccctgccag agacttcgcc 1500
gcctacagac ct 1512
<210> 136
<211> 504
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muLag3tm-CD28
<400> 136
Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp
1 5 10 15
Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu
65 70 75 80
His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr
85 90 95
Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu
100 105 110
His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe
115 120 125
Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His
130 135 140
Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys
165 170 175
Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg
180 185 190
Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr
195 200 205
Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln
210 215 220
Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg
225 230 235 240
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu
245 250 255
Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val
260 265 270
Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu
275 280 285
Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala
290 295 300
Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu
325 330 335
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
340 345 350
Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala
355 360 365
Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala
385 390 395 400
Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala
405 410 415
Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg
420 425 430
Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Val Leu Val Leu Ile Leu
435 440 445
Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Phe Gly Phe Asn
450 455 460
Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
465 470 475 480
Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala
485 490 495
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
500
<210> 137
<211> 1530
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muLag3-CD28tm
<400> 137
atgagagagg acctgctgct gggctttctg ctgctgggac tgctgtggga ggcccctgtg 60
gtgtcatctg gccctggcaa agaactgccc gtcgtgtggg ctcaggaagg cgctcctgtg 120
catctgccct gcagcctgaa gtcccccaac ctggacccca acttcctgag aagaggcggc 180
gtgatctggc agcaccagcc tgattctggc cagcccacac ctatccctgc cctggatctg 240
caccagggca tgcctagccc tagacagcct gcccctggca gatacaccgt gctgtctgtg 300
gctcctggcg gcctgagaag tggcagacag cctctgcacc ctcacgtgca gctggaagag 360
aggggactgc agaggggcga cttcagcctg tggctgaggc ctgccctgag aacagatgcc 420
ggcgagtacc acgctaccgt gcggctgcct aacagagccc tgagctgctc cctgagactg 480
agagtgggcc aggccagcat gatcgcctct ccatctggcg tgctgaagct gagcgactgg 540
gtgctgctga actgcagctt ctccagaccc gacagacccg tgtccgtgca ctggttccag 600
ggacagaaca gagtgcccgt gtacaacagc cccagacact tcctggccga gacattcctg 660
ctgctgcccc aggtgtcccc tctggactct ggcacatggg gctgcgtgct gacatacagg 720
gacggcttca acgtgtccat cacctacaac ctgaaggtgc tgggcctgga acccgtggct 780
cctctgacag tgtacgccgc cgagggcagc agagtggaac tgccttgtca tctgccaccc 840
ggcgtgggca caccttctct gctgatcgcc aagtggaccc ctccaggcgg aggacctgaa 900
ctgccagtgg ctggcaagag cggcaacttc accctgcacc tggaagcagt gggcctggct 960
caggccggca cctacacctg tagcatccat ctgcagggcc agcagctgaa cgccaccgtg 1020
acactggccg tgatcaccgt gacccccaag agctttggcc tgcctggctc cagaggcaag 1080
ctgctgtgtg aagtgacccc cgccagcggc aaagaaagat tcgtgtggcg gcctctgaac 1140
aacctgagca gatcctgccc aggccccgtg ctggaaatcc aggaagccag actgctggcc 1200
gagcggtggc agtgccagct gtatgaggga cagcgactgc tgggcgccac tgtgtacgct 1260
gctgagtcta gctctggcgc ccacagcgcc agaagaatca gcggcgatct gaagggcggc 1320
cacctgttct gggccctggt ggtggtggcc ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg 1380
accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac 1440
tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc 1500
cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 1530
<210> 138
<211> 510
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muLag3-CD28tm
<400> 138
Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp
1 5 10 15
Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu
65 70 75 80
His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr
85 90 95
Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu
100 105 110
His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe
115 120 125
Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His
130 135 140
Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys
165 170 175
Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg
180 185 190
Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr
195 200 205
Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln
210 215 220
Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg
225 230 235 240
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu
245 250 255
Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val
260 265 270
Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu
275 280 285
Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala
290 295 300
Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu
325 330 335
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
340 345 350
Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala
355 360 365
Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala
385 390 395 400
Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala
405 410 415
Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg
420 425 430
Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Phe Trp Ala Leu Val Val
435 440 445
Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu
450 455 460
Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp
465 470 475 480
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr
485 490 495
Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
500 505 510
<210> 139
<211> 1557
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muLag3-CD28Cys
<400> 139
atgagagagg acctgctgct gggctttctg ctgctgggac tgctgtggga ggcccctgtg 60
gtgtcatctg gccctggcaa agaactgccc gtcgtgtggg ctcaggaagg cgctcctgtg 120
catctgccct gcagcctgaa gtcccccaac ctggacccca acttcctgag aagaggcggc 180
gtgatctggc agcaccagcc tgattctggc cagcccacac ctatccctgc cctggatctg 240
caccagggca tgcctagccc tagacagcct gcccctggca gatacaccgt gctgtctgtg 300
gctcctggcg gcctgagaag tggcagacag cctctgcacc ctcacgtgca gctggaagag 360
aggggactgc agaggggcga cttcagcctg tggctgaggc ctgccctgag aacagatgcc 420
ggcgagtacc acgctaccgt gcggctgcct aacagagccc tgagctgctc cctgagactg 480
agagtgggcc aggccagcat gatcgcctct ccatctggcg tgctgaagct gagcgactgg 540
gtgctgctga actgcagctt ctccagaccc gacagacccg tgtccgtgca ctggttccag 600
ggacagaaca gagtgcccgt gtacaacagc cccagacact tcctggccga gacattcctg 660
ctgctgcccc aggtgtcccc tctggactct ggcacatggg gctgcgtgct gacatacagg 720
gacggcttca acgtgtccat cacctacaac ctgaaggtgc tgggcctgga acccgtggct 780
cctctgacag tgtacgccgc cgagggcagc agagtggaac tgccttgtca tctgccaccc 840
ggcgtgggca caccttctct gctgatcgcc aagtggaccc ctccaggcgg aggacctgaa 900
ctgccagtgg ctggcaagag cggcaacttc accctgcacc tggaagcagt gggcctggct 960
caggccggca cctacacctg tagcatccat ctgcagggcc agcagctgaa cgccaccgtg 1020
acactggccg tgatcaccgt gacccccaag agctttggcc tgcctggctc cagaggcaag 1080
ctgctgtgtg aagtgacccc cgccagcggc aaagaaagat tcgtgtggcg gcctctgaac 1140
aacctgagca gatcctgccc aggccccgtg ctggaaatcc aggaagccag actgctggcc 1200
gagcggtggc agtgccagct gtatgaggga cagcgactgc tgggcgccac tgtgtacgct 1260
gctgagtcta gctctggcgc ccacagcgcc agaagaatca gcggcgatct gaagggcggc 1320
cacctgtgcc acacccagag cagccccaag ctgttctggg ccctggtggt ggtggccggc 1380
gtgctgtttt gttacggcct gctcgtgacc gtggccctgt gcgtgatctg gaccaacagc 1440
agaagaaaca gaggcggcca gagcgactac atgaacatga cccccagaag gcctggcctg 1500
accagaaagc cctaccagcc ttacgcccct gccagagact tcgccgccta cagacct 1557
<210> 140
<211> 519
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muLag3-CD28Cys
<400> 140
Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp
1 5 10 15
Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu
65 70 75 80
His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr
85 90 95
Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu
100 105 110
His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe
115 120 125
Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His
130 135 140
Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys
165 170 175
Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg
180 185 190
Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr
195 200 205
Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln
210 215 220
Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg
225 230 235 240
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu
245 250 255
Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val
260 265 270
Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu
275 280 285
Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala
290 295 300
Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu
325 330 335
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
340 345 350
Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala
355 360 365
Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala
385 390 395 400
Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala
405 410 415
Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg
420 425 430
Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Cys His Thr Gln Ser Ser
435 440 445
Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys
450 455 460
Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser
465 470 475 480
Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
485 490 495
Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg
500 505 510
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
515
<210> 141
<211> 1530
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muLag3-9aas-CD28Cys
<400> 141
atgagagagg acctgctgct gggctttctg ctgctgggac tgctgtggga ggcccctgtg 60
gtgtcatctg gccctggcaa agaactgccc gtcgtgtggg ctcaggaagg cgctcctgtg 120
catctgccct gcagcctgaa gtcccccaac ctggacccca acttcctgag aagaggcggc 180
gtgatctggc agcaccagcc tgattctggc cagcccacac ctatccctgc cctggatctg 240
caccagggca tgcctagccc tagacagcct gcccctggca gatacaccgt gctgtctgtg 300
gctcctggcg gcctgagaag tggcagacag cctctgcacc ctcacgtgca gctggaagag 360
aggggactgc agaggggcga cttcagcctg tggctgaggc ctgccctgag aacagatgcc 420
ggcgagtacc acgctaccgt gcggctgcct aacagagccc tgagctgctc cctgagactg 480
agagtgggcc aggccagcat gatcgcctct ccatctggcg tgctgaagct gagcgactgg 540
gtgctgctga actgcagctt ctccagaccc gacagacccg tgtccgtgca ctggttccag 600
ggacagaaca gagtgcccgt gtacaacagc cccagacact tcctggccga gacattcctg 660
ctgctgcccc aggtgtcccc tctggactct ggcacatggg gctgcgtgct gacatacagg 720
gacggcttca acgtgtccat cacctacaac ctgaaggtgc tgggcctgga acccgtggct 780
cctctgacag tgtacgccgc cgagggcagc agagtggaac tgccttgtca tctgccaccc 840
ggcgtgggca caccttctct gctgatcgcc aagtggaccc ctccaggcgg aggacctgaa 900
ctgccagtgg ctggcaagag cggcaacttc accctgcacc tggaagcagt gggcctggct 960
caggccggca cctacacctg tagcatccat ctgcagggcc agcagctgaa cgccaccgtg 1020
acactggccg tgatcaccgt gacccccaag agctttggcc tgcctggctc cagaggcaag 1080
ctgctgtgtg aagtgacccc cgccagcggc aaagaaagat tcgtgtggcg gcctctgaac 1140
aacctgagca gatcctgccc aggccccgtg ctggaaatcc aggaagccag actgctggcc 1200
gagcggtggc agtgccagct gtatgaggga cagcgactgc tgggcgccac tgtgtacgct 1260
gctgagtcta gctctggcgc ccacagcgcc agaagaatct gccacaccca gagcagcccc 1320
aagctgttct gggccctggt ggtggtggcc ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg 1380
accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac 1440
tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc 1500
cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 1530
<210> 142
<211> 510
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muLag3-9aas-CD28Cys
<400> 142
Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp
1 5 10 15
Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu
65 70 75 80
His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr
85 90 95
Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu
100 105 110
His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe
115 120 125
Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His
130 135 140
Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys
165 170 175
Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg
180 185 190
Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr
195 200 205
Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln
210 215 220
Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg
225 230 235 240
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu
245 250 255
Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val
260 265 270
Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu
275 280 285
Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala
290 295 300
Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu
325 330 335
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
340 345 350
Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala
355 360 365
Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala
385 390 395 400
Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala
405 410 415
Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg
420 425 430
Ile Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val
435 440 445
Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu
450 455 460
Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp
465 470 475 480
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr
485 490 495
Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
500 505 510
<210> 143
<211> 765
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muTim3tm-CD28
<400> 143
atgttcagcg gcctgaccct gaactgcgtg ctcctgctgc tgcagctgct gctggccaga 60
agcctggaaa acgcctacgt gttcgaagtg ggcaagaacg cctacctgcc ctgcagctac 120
accctgtcta cacctggcgc cctggtgcct atgtgttggg gcaagggctt ctgcccttgg 180
agccagtgca ccaacgagct gctgagaacc gacgagagaa acgtgaccta ccagaagtcc 240
agcagatacc agctgaaggg cgacctgaac aagggcgacg tgtccctgat catcaagaac 300
gtgaccctgg acgaccacgg cacctactgc tgcagaatcc agttccccgg cctgatgaac 360
gacaagaagc tggaactgaa gctggacatc aaggccgcca aagtgacccc tgcccagaca 420
gcccacggcg actctacaac agccagcccc agaaccctga ccaccgagag gaacggcagc 480
gagacacaga ccctcgtgac actgcacaac aacaacggca ccaagatcag cacctgggcc 540
gacgagatca aggacagcgg cgagacaatc agaaccgcca tccacatcgg cgtgggcgtg 600
tccgctggac tgacactggc tctgatcatc ggagtgctga tcaacagcag aagaaacaga 660
ggcggccaga gcgactacat gaacatgacc cccagaaggc ctggcctgac cagaaagccc 720
taccagcctt acgcccctgc cagagacttc gccgcctaca gacct 765
<210> 144
<211> 255
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muTim3tm-CD28
<400> 144
Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu
35 40 45
Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr
50 55 60
Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser
65 70 75 80
Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu
85 90 95
Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg
100 105 110
Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu
115 120 125
Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp
130 135 140
Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile
165 170 175
Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr
180 185 190
Ala Ile His Ile Gly Val Gly Val Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala Leu
195 200 205
Ile Ile Gly Val Leu Ile Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser
210 215 220
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro
225 230 235 240
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
245 250 255
<210> 145
<211> 783
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muTim3-CD28tm
<400> 145
atgttcagcg gcctgaccct gaactgcgtg ctcctgctgc tgcagctgct gctggccaga 60
agcctggaaa acgcctacgt gttcgaagtg ggcaagaacg cctacctgcc ctgcagctac 120
accctgtcta cacctggcgc cctggtgcct atgtgttggg gcaagggctt ctgcccttgg 180
agccagtgca ccaacgagct gctgagaacc gacgagagaa acgtgaccta ccagaagtcc 240
agcagatacc agctgaaggg cgacctgaac aagggcgacg tgtccctgat catcaagaac 300
gtgaccctgg acgaccacgg cacctactgc tgcagaatcc agttccccgg cctgatgaac 360
gacaagaagc tggaactgaa gctggacatc aaggccgcca aagtgacccc tgcccagaca 420
gcccacggcg actctacaac agccagcccc agaaccctga ccaccgagag gaacggcagc 480
gagacacaga ccctcgtgac actgcacaac aacaacggca ccaagatcag cacctgggcc 540
gacgagatca aggacagcgg cgagacaatc agaaccgcct tctgggccct ggtggtggtg 600
gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc 660
aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcct 720
ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga 780
cct 783
<210> 146
<211> 261
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muTim3-CD28tm
<400> 146
Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu
35 40 45
Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr
50 55 60
Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser
65 70 75 80
Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu
85 90 95
Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg
100 105 110
Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu
115 120 125
Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp
130 135 140
Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile
165 170 175
Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr
180 185 190
Ala Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly
195 200 205
Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg
210 215 220
Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
225 230 235 240
Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe
245 250 255
Ala Ala Tyr Arg Pro
260
<210> 147
<211> 810
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muTim3-CD28Cys
<400> 147
atgttcagcg gcctgaccct gaactgcgtg ctcctgctgc tgcagctgct gctggccaga 60
agcctggaaa acgcctacgt gttcgaagtg ggcaagaacg cctacctgcc ctgcagctac 120
accctgtcta cacctggcgc cctggtgcct atgtgttggg gcaagggctt ctgcccttgg 180
agccagtgca ccaacgagct gctgagaacc gacgagagaa acgtgaccta ccagaagtcc 240
agcagatacc agctgaaggg cgacctgaac aagggcgacg tgtccctgat catcaagaac 300
gtgaccctgg acgaccacgg cacctactgc tgcagaatcc agttccccgg cctgatgaac 360
gacaagaagc tggaactgaa gctggacatc aaggccgcca aagtgacccc tgcccagaca 420
gcccacggcg actctacaac agccagcccc agaaccctga ccaccgagag gaacggcagc 480
gagacacaga ccctcgtgac actgcacaac aacaacggca ccaagatcag cacctgggcc 540
gacgagatca aggacagcgg cgagacaatc agaaccgcct gccacaccca gagcagcccc 600
aagctgttct gggccctggt ggtggtggcc ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg 660
accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac 720
tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc 780
cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 810
<210> 148
<211> 270
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muTim3-CD28Cys
<400> 148
Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu
35 40 45
Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr
50 55 60
Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser
65 70 75 80
Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu
85 90 95
Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg
100 105 110
Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu
115 120 125
Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp
130 135 140
Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile
165 170 175
Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr
180 185 190
Ala Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val
195 200 205
Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu
210 215 220
Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp
225 230 235 240
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr
245 250 255
Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
260 265 270
<210> 149
<211> 783
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muTim3-9aas-CD28Cys
<400> 149
atgttcagcg gcctgaccct gaactgcgtg ctcctgctgc tgcagctgct gctggccaga 60
agcctggaaa acgcctacgt gttcgaagtg ggcaagaacg cctacctgcc ctgcagctac 120
accctgtcta cacctggcgc cctggtgcct atgtgttggg gcaagggctt ctgcccttgg 180
agccagtgca ccaacgagct gctgagaacc gacgagagaa acgtgaccta ccagaagtcc 240
agcagatacc agctgaaggg cgacctgaac aagggcgacg tgtccctgat catcaagaac 300
gtgaccctgg acgaccacgg cacctactgc tgcagaatcc agttccccgg cctgatgaac 360
gacaagaagc tggaactgaa gctggacatc aaggccgcca aagtgacccc tgcccagaca 420
gcccacggcg actctacaac agccagcccc agaaccctga ccaccgagag gaacggcagc 480
gagacacaga ccctcgtgac actgcacaac aacaacggca ccaagatcag cacctgggcc 540
gacgagatca agtgccacac ccagagcagc cccaagctgt tctgggccct ggtggtggtg 600
gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc 660
aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcct 720
ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga 780
cct 783
<210> 150
<211> 261
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> muTim3-9aas-CD28Cys
<400> 150
Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu
35 40 45
Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr
50 55 60
Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser
65 70 75 80
Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu
85 90 95
Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg
100 105 110
Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu
115 120 125
Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp
130 135 140
Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile
165 170 175
Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys
180 185 190
Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly
195 200 205
Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg
210 215 220
Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
225 230 235 240
Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe
245 250 255
Ala Ala Tyr Arg Pro
260
<210> 151
<211> 1536
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3tm-CD28
<400> 151
atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60
aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120
cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180
gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240
gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300
gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360
cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420
cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480
agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540
gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600
cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660
ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720
tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780
ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840
ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900
ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960
gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020
cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080
ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140
gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200
caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260
ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagtggacgc 1320
gccccagggg ccctcccggc aggacacctt ctgctgtttt tgattttggg ggtacttagt 1380
ttgctgctgc ttgtcacagg cgctttcggt ttccgcagca agcggagcag aggcggccac 1440
agcgactaca tgaacatgac ccctagacgg cctggcccca ccagaaagca ctaccagccc 1500
tacgcccctc cccgggactt tgccgcctac agaagc 1536
<210> 152
<211> 512
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3tm-CD28
<400> 152
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His
465 470 475 480
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
485 490 495
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
500 505 510
<210> 153
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен huLag3
<400> 153
atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60
aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120
cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180
gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240
gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300
gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360
cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420
cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480
agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540
gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600
cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660
ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720
tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780
ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840
ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900
ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960
gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020
cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080
ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140
gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200
caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260
ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagtggacgc 1320
gccccagggg ccctcccggc aggacacctt 1350
<210> 154
<211> 450
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен huLag3
<400> 154
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu
450
<210> 155
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huLag3
<400> 155
ctgctgtttt tgattttggg ggtacttagt ttgctgctgc ttgtcacagg cgctttcggt 60
ttc 63
<210> 156
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен huLag3
<400> 156
Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Thr
1 5 10 15
Gly Ala Phe Gly Phe
20
<210> 157
<211> 1554
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3-CD28tm
<400> 157
atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60
aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120
cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180
gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240
gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300
gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360
cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420
cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480
agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540
gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600
cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660
ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720
tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780
ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840
ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900
ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960
gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020
cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080
ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140
gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200
caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260
ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagtggacgc 1320
gccccagggg ccctcccggc aggacacctt ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg 1380
ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg gccttcatca tcttttgggt ccgcagcaag 1440
cggagcagag gcggccacag cgactacatg aacatgaccc ctagacggcc tggccccacc 1500
agaaagcact accagcccta cgcccctccc cgggactttg ccgcctacag aagc 1554
<210> 158
<211> 518
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3-CD28tm
<400> 158
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
450 455 460
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
465 470 475 480
Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
485 490 495
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
500 505 510
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
515
<210> 159
<211> 1554
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3-12aas-CD28Cys
<400> 159
atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60
aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120
cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180
gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240
gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300
gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360
cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420
cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480
agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540
gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600
cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660
ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720
tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780
ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840
ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900
ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960
gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020
cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080
ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140
gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200
caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260
ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagttgtccc 1320
agccctctgt ttcccggccc tagcaagcct ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg 1380
ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg gccttcatca tcttttgggt ccgcagcaag 1440
cggagcagag gcggccacag cgactacatg aacatgaccc ctagacggcc tggccccacc 1500
agaaagcact accagcccta cgcccctccc cgggactttg ccgcctacag aagc 1554
<210> 160
<211> 518
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3-12aas-CD28Cys
<400> 160
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
435 440 445
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
450 455 460
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
465 470 475 480
Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
485 490 495
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
500 505 510
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
515
<210> 161
<211> 1314
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3-12aas
<400> 161
atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60
aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120
cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180
gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240
gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300
gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360
cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420
cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480
agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540
gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600
cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660
ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720
tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780
ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840
ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900
ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960
gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020
cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080
ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140
gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200
caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260
ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagt 1314
<210> 162
<211> 438
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3-12aas
<400> 162
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser
435
<210> 163
<211> 1590
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3-CD28Cys
<400> 163
atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60
aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120
cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180
gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240
gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300
gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360
cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420
cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480
agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540
gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600
cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660
ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720
tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780
ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840
ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900
ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960
gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020
cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080
ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140
gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200
caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260
ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagtggacgc 1320
gccccagggg ccctcccggc aggacacctt tgtcccagcc ctctgtttcc cggccctagc 1380
aagcctttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 1440
accgtggcct tcatcatctt ttgggtccgc agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 1500
tacatgaaca tgacccctag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccctacgcc 1560
cctccccggg actttgccgc ctacagaagc 1590
<210> 164
<211> 530
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huLag3-CD28Cys
<400> 164
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp
450 455 460
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
465 470 475 480
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly
485 490 495
Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
500 505 510
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
515 520 525
Arg Ser
530
<210> 165
<211> 792
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3tm-CD28
<400> 165
atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60
tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120
acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180
ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240
agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300
acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360
gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420
cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480
gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540
aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat gacctgaggg attctggagc taccatcaga 600
atcggtatct acataggtgc cgggatatgc gccggtctcg cacttgcctt gattttcggg 660
gcactgattc gcagcaagcg gagcagaggc ggccacagcg actacatgaa catgacccct 720
agacggcctg gccccaccag aaagcactac cagccctacg cccctccccg ggactttgcc 780
gcctacagaa gc 792
<210> 166
<211> 264
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3tm-CD28
<400> 166
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly
195 200 205
Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Arg
210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
260
<210> 167
<211> 606
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен huTim3
<400> 167
atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60
tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120
acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180
ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240
agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300
acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360
gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420
cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480
gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540
aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat gacctgaggg attctggagc taccatcaga 600
atcggt 606
<210> 168
<211> 202
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен huTim3
<400> 168
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly
195 200
<210> 169
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный huTim3
<400> 169
atctacatag gtgccgggat atgcgccggt ctcgcacttg ccttgatttt cggggcactg 60
att 63
<210> 170
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный huTim3
<400> 170
Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Phe Gly Ala Leu Ile
20
<210> 171
<211> 810
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3-CD28tm
<400> 171
atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60
tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120
acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180
ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240
agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300
acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360
gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420
cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480
gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540
aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat gacctgaggg attctggagc taccatcaga 600
atcggtttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 660
accgtggcct tcatcatctt ttgggtccgc agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 720
tacatgaaca tgacccctag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccctacgcc 780
cctccccggg actttgccgc ctacagaagc 810
<210> 172
<211> 270
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3-CD28tm
<400> 172
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Phe Trp Val Leu Val Val
195 200 205
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
210 215 220
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
225 230 235 240
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
245 250 255
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
260 265 270
<210> 173
<211> 846
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3-CD28Cys
<400> 173
atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60
tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120
acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180
ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240
agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300
acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360
gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420
cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480
gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540
aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat gacctgaggg attctggagc taccatcaga 600
atcggttgtc ccagccctct gtttcccggc cctagcaagc ctttctgggt gctggtggtg 660
gtcggaggcg tgctggcctg ctacagcctg ctggtcaccg tggccttcat catcttttgg 720
gtccgcagca agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac ccctagacgg 780
cctggcccca ccagaaagca ctaccagccc tacgcccctc cccgggactt tgccgcctac 840
agaagc 846
<210> 174
<211> 282
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3-CD28Cys
<400> 174
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Cys Pro Ser Pro Leu Phe
195 200 205
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
210 215 220
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
225 230 235 240
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met
245 250 255
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
260 265 270
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
275 280
<210> 175
<211> 810
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3-12aas-CD28Cys
<400> 175
atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60
tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120
acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180
ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240
agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300
acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360
gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420
cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480
gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540
aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat tgtcccagcc ctctgtttcc cggccctagc 600
aagcctttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 660
accgtggcct tcatcatctt ttgggtccgc agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 720
tacatgaaca tgacccctag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccctacgcc 780
cctccccggg actttgccgc ctacagaagc 810
<210> 176
<211> 270
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3-12aas-CD28Cys
<400> 176
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Cys Pro
180 185 190
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
195 200 205
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
210 215 220
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
225 230 235 240
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
245 250 255
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
260 265 270
<210> 177
<211> 570
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3-12aas
<400> 177
atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60
tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120
acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180
ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240
agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300
acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360
gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420
cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480
gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540
aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat 570
<210> 178
<211> 190
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> huTim3-12aas
<400> 178
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn
180 185 190
<---

Claims (51)

1. Слитый белок, связывающийся с CD47 для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке, содержащий: (а) внеклеточный компонент, состоящий из CD47-связывающей части SIRPα или его связывающего варианта, где внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:44, (b) внутриклеточный компонент, состоящий из сигнального домена костимулирующей молекулы CD28 или его варианта, где внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:28, и (с) гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, содержащий трансмембранную часть CD28, где гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27.
2. Слитый белок по п. 1, где экспрессия слитого белка в Т-клетке, содержащей TCR или химерный антигенный рецептор, специфичный в отношении антигена, приводит к по меньшей мере 1,5-кратному, 2-кратному или 3-кратному увеличению показателя выживания, размножения, цитотоксичности, секреции цитокинов и/или ответа на несколько циклов стимуляции у Т-клетки в ответ на связывание антигена и/или после введения субъекту и/или приводит к по меньшей мере 1,5-кратному, 2-кратному или 3-кратному увеличению показателя времени выживания, выживаемости без признаков заболевания или уменьшению интенсивности одного или более симптомов заболевания у субъекта, которому вводится клетка, по сравнению с клеткой по существу такой же, как Т-клетка, но не содержащей слитый белок.
3. Слитый белок по п. 1, где в случае экспрессии в Т-клетке слитый белок способен колокализоваться с TCR или CAR, экспрессируемыми Т-клеткой.
4. Слитый белок по п. 1, где внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:40.
5. Слитый белок по п. 4, где внеклеточный компонент дополнительно содержит дополнительную внеклеточную часть, где дополнительная внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:32.
6. Слитый белок по п. 1, где внутриклеточный компонент дополнительно содержит второй сигнальный домен костимулирующей молекулы, предусматривающий внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB) или его вариант, где второй сигнальный домен костимулирующей молекулы содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95% идентичностью к аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:36.
7. Слитый белок по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:42.
8. Слитый белок по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:43.
9. Слитый белок по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:46.
10. Слитый белок по п. 1, где (a) внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:40, (b) гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27, и (c) внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:28.
11. Слитый белок по п. 1, где (a) внеклеточный компонент содержит связывающий домен с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:44, и домен мультимеризации с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:32, (b) гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27, и (c) внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:28.
12. Слитый белок по п. 1, где (a) внеклеточный компонент содержит связывающий домен с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:44, и домен мультимеризации с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:32, (b) гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27, и (c) внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:28, и аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:36.
13. Слитый белок для передачи костимулирующего сигнала CD-28 Т-клетке, содержащий: (а) внеклеточный компонент, состоящий из CD47-связывающей части SIRPα или его связывающего варианта, где внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21, (b) внутриклеточный компонент, состоящий из сигнального домена костимулирующей молекулы CD-28 или его варианта, где внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5, и (с) гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, содержащий трансмембранную часть CD28, где гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:4.
14. Слитый белок по п. 13, где внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:17.
15. Слитый белок по п. 13, где внеклеточный компонент дополнительно содержит дополнительную внеклеточную часть, где дополнительная внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:9.
16. Слитый белок по п. 13, где внутриклеточный компонент дополнительно содержит второй сигнальный домен костимулирующей молекулы, предусматривающий внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB) или его вариант, где второй сигнальный домен костимулирующей молекулы содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:13.
17. Слитый белок по п. 13, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:19.
18. Слитый белок по п. 13, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:20.
19. Слитый белок по п. 13, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:23.
20. Слитый белок по п. 13, где (a) внеклеточный компонент содержит связывающий домен с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:21, и домен мультимеризации с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:9, (b) гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:4, и (c) внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:5.
21. Слитый белок по п. 20, где внутриклеточный компонент дополнительно содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:13.
22. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп. 13-21.
23. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 22.
24. Вектор экспрессии по п. 23, где вектор является вирусным вектором.
25. Вектор экспрессии по п. 24, где вирусный вектор является лентивирусным или ретровирусным вектором.
26. Вектор экспрессии по п. 25, где вирусный вектор является лентивирусным вектором.
27. Вектор экспрессии для доставки молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, и нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенспецифический TCR, содержащий: (а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке, содержащую (i) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный компонент и характеризующуюся по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21, (b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гидрофобный компонент и содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:4, и (c) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую внутриклеточный компонент и характеризующуюся по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5; и (b) нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенспецифический TCR.
28. Вектор экспрессии по п. 27, где TCR является экзогенным для клетки-хозяина.
29. Вектор экспрессии по п. 27, где TCR является специфичным к рестриктированному по HLA класса I антигену.
30. Вектор экспрессии по п. 27, где антиген представляет собой ракспецифический антиген.
31. Вектор экспрессии по п. 30, где ракспецифический антиген предусматривает WT-1, мезотелин или циклин-A1.
32. Вектор экспрессии по п. 27, дополнительно кодирующий CD47.
33. Вектор экспрессии по п. 27, дополнительно кодирующий siRNA для снижения экспрессии эндогенного рецептора, где эндогенный рецептор предусматривает SIRPα или представляет собой TCR или его часть.
34. Т-клетка, презентирующая слитый белок по любому из пп. 13-21, содержащая вектор экспрессии по п. 23, причем указанная клетка не является клеткой эмбриона человека или клеткой зародышевой линии человека.
35. Т-клетка по п. 34, где T-клетка представляет собой CD4+ T-клетку.
36. Т-клетка по п. 34, где T-клетка представляет собой CD8+ T-клетку.
37. Т-клетка, презентирующая слитый белок для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке и для нацеливания на антиген, содержащая: (а) слитый белок для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке, содержащий (i) внеклеточный компонент, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21, (b) гидрофобный компонент, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:4, и (c) внутриклеточный компонент, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5, где гидрофобный компонент соединяет внеклеточный и внутриклеточный компоненты; и (b) антигенный рецептор, который необязательно представляет собой антигенспецифический TCR.
38. Т-клетка по п. 37, где антигенспецифический TCR является экзогенным для клетки или хозяина.
39. Т-клетка по п. 37, где TCR связывается с комплексом антиген::HLA с высокой аффинностью.
40. Т-клетка по п. 39, где высокоаффинное связывание характеризуется значением Ka, составляющим 107 M-1 или больше.
41. Т-клетка по п. 37, где TCR является специфичным к рестриктированному по HLA класса I антигену.
42. Т-клетка по п. 37, где антиген представляет собой ракспецифический антиген.
43. Т-клетка по п. 42, где ракспецифический антиген предусматривает WT-1, мезотелин или циклин-A1.
44. Т-клетка по п. 37, где антигенный рецептор является химерным антигенным рецептором.
45. Т-клетка по п. 44, где химерный антигенный рецептор содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен, способный передавать первичный сигнал Т-клетке, и необязательно костимулирующий домен.
46. Т-клетка по п. 37, дополнительно cодержащая CD47.
47. Т-клетка по п. 37, дополнительно cодержащая siRNA для снижения экспрессии эндогенного SIRPα.
48. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту вектора экспрессии по п. 23, где раковые клетки экспрессируют CD47.
49. Способ по п. 48, где субъект является человеком.
50. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту Т-клетки по п. 34, где раковые клетки экспрессируют CD47.
51. Способ по п. 50, где субъект является человеком.
RU2017133637A 2015-03-05 2016-03-04 Иммуномодулирующие слитые белки и пути их применения RU2755227C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562128979P 2015-03-05 2015-03-05
US62/128,979 2015-03-05
PCT/US2016/021064 WO2016141357A1 (en) 2015-03-05 2016-03-04 Immunomodulatory fusion proteins and uses thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017133637A RU2017133637A (ru) 2019-04-08
RU2017133637A3 RU2017133637A3 (ru) 2019-08-08
RU2755227C2 true RU2755227C2 (ru) 2021-09-14

Family

ID=55587371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017133637A RU2755227C2 (ru) 2015-03-05 2016-03-04 Иммуномодулирующие слитые белки и пути их применения

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20180044404A1 (ru)
EP (1) EP3265481A1 (ru)
JP (3) JP6917896B2 (ru)
KR (1) KR20170120701A (ru)
CN (1) CN107531805A (ru)
AU (3) AU2016226022B2 (ru)
BR (1) BR112017018919A8 (ru)
CA (2) CA3177938A1 (ru)
HK (1) HK1246317A1 (ru)
IL (1) IL254165B (ru)
MX (4) MX2017011201A (ru)
MY (2) MY189195A (ru)
RU (1) RU2755227C2 (ru)
SA (1) SA517382216B1 (ru)
SG (2) SG10201908203SA (ru)
WO (1) WO2016141357A1 (ru)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201505858VA (en) 2013-01-28 2015-09-29 St Jude Childrens Res Hospital A chimeric receptor with nkg2d specificity for use in cell therapy against cancer and infectious disease
CN112175911B (zh) 2014-05-15 2023-10-13 新加坡国立大学 经修饰的自然杀伤细胞及其用途
WO2017112944A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity t cell receptors and uses thereof
WO2017162797A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins of pd-1 and 4-1bb
WO2017201210A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
WO2018009972A1 (en) * 2016-07-14 2018-01-18 Peter Maccallum Cancer Institute Chimeric antigen receptor modified t cells
AU2017297506A1 (en) 2016-07-14 2019-02-21 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against TIM3 and uses thereof
JP7291396B2 (ja) 2016-11-22 2023-06-15 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
US20200095547A1 (en) * 2016-12-02 2020-03-26 Darya ALIZADEH Methods for manufacturing t cells expressing of chimeric antigen receptors and other receptors
CN116970060A (zh) 2016-12-22 2023-10-31 库尔生物制药有限公司 T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法
AU2017382243A1 (en) * 2016-12-22 2019-05-02 Windmil Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating the immune system
WO2018129474A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
KR102619015B1 (ko) 2017-03-15 2023-12-28 큐 바이오파마, 인크. 면역 반응을 조절하는 방법
CA3055784A1 (en) * 2017-03-17 2018-09-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunomodulatory fusion proteins and uses thereof
CA3056439A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Truncated nkg2d chimeric receptors and uses thereof in natural killer cell immunotherapy
US11896616B2 (en) 2017-03-27 2024-02-13 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
CA3071860A1 (en) 2017-08-02 2019-02-07 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-cd47 antibodies and uses thereof
US10960071B2 (en) 2017-08-07 2021-03-30 The Regents Of The University Of California Platform for generating safe cell therapeutics
KR20220124817A (ko) 2017-08-07 2022-09-14 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 안전한 세포 치료제를 생성하기 위한 플랫폼
WO2019051094A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Cue Biopharma, Inc. ANTIGEN PRESENTATION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE
WO2019055862A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGH AFFINITY T CELL RECEPTORS AND USES THEREOF
WO2019090355A1 (en) * 2017-11-06 2019-05-09 Children's National Medical Center Cells expressing antibodies and methods of treatment using the same
WO2019091478A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 Chineo Medical Technology Co., Ltd. Modified immune cells and uses thereof
CN111886241A (zh) 2018-01-09 2020-11-03 库尔生物制药有限公司 多聚体t细胞调节多肽及其使用方法
CA3103975A1 (en) * 2018-06-21 2019-12-26 Shattuck Labs, Inc. Heterodimeric proteins and uses thereof
KR102261407B1 (ko) * 2018-10-10 2021-06-08 한국화학연구원 Hvem을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체
TW202039542A (zh) 2018-12-19 2020-11-01 美商庫爾生物製藥有限公司 多聚體ｔ細胞調節多肽及其使用方法
GB201900858D0 (en) * 2019-01-22 2019-03-13 Price Nicola Kaye Receptors providing targeted costimulation for adoptive cell therapy
CN113766956A (zh) 2019-03-05 2021-12-07 恩卡尔塔公司 Cd19定向性嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途
KR20210138043A (ko) 2019-03-11 2021-11-18 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 고 결합 활성 wt1 t 세포 수용체 및 이의 용도
WO2020190771A1 (en) * 2019-03-15 2020-09-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric adaptor and kinase signaling proteins and their use in immunotherapy
AU2020242305A1 (en) * 2019-03-21 2021-09-30 Onk Therapeutics Limited Modified immune effector cells with increased resistance to cell death
EP4066842A4 (en) * 2019-11-29 2023-01-25 Suzhou Nova Therapeutics Co. Ltd APPLICATION OF CAR-T CELLS IN MANUFACTURE OF DRUG FOR TREATMENT OF CANCER
GB202101491D0 (en) * 2021-02-03 2021-03-17 Autolus Ltd Molecule
CN115315439A (zh) * 2020-04-09 2022-11-08 奥托路斯有限公司 细胞
EP4132962A1 (en) * 2020-04-09 2023-02-15 Autolus Limited Molecule
WO2021231376A2 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Cue Biopharma, Inc. Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof
JP2023527194A (ja) * 2020-05-22 2023-06-27 重▲慶▼精准生物技▲術▼有限公司 腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質及びその使用
US20230295564A1 (en) * 2020-07-23 2023-09-21 Emory University Galectin-9 Specific Binding Agents for Use in Treating Cancer
WO2022246053A2 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Achelois Biopharma, Inc. Immune checkpoint multivalent particles compositions and methods of use
WO2022246041A2 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Achelois Biopharma, Inc. Compositions and methods for multivalent surface display on enveloped particles
US11945876B2 (en) 2021-06-16 2024-04-02 Instil Bio (Uk) Limited Receptors providing targeted costimulation for adoptive cell therapy
WO2023288278A1 (en) 2021-07-16 2023-01-19 Instil Bio (Uk) Limited Chimeric molecules providing targeted costimulation for adoptive cell therapy
CN113621077B (zh) * 2021-09-02 2023-01-31 山东大学 一种tim-3/cd28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的car-t细胞
WO2023150801A2 (en) * 2022-02-07 2023-08-10 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Recombinant proteins that stimulate an immune response in the presence of naturally inhibitory ligand binding

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
CA2180954C (en) 1994-01-11 2007-03-20 William Markland Inhibitors of human plasmin derived from the kunitz domains
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
DK1791865T3 (da) 2004-06-29 2010-11-01 Immunocore Ltd Celler der udtrykker en modificeret T-cellerecptor
PL1772465T3 (pl) 2005-01-05 2009-08-31 F Star Biotechnologische Forschungs Und Entw M B H Syntetyczne domeny immunoglobulinowe o właściwościach wiążących modyfikowane w regionach cząsteczki różnych od regionów determinujących komplementarność
GB0504767D0 (en) 2005-03-08 2005-04-13 Ares Trading Sa Lipocalin protein
EP1829895A1 (en) 2006-03-03 2007-09-05 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Bispecific molecule binding TLR9 and CD32 and comprising a T cell epitope for treatment of allergies
US8119772B2 (en) 2006-09-29 2012-02-21 California Institute Of Technology MART-1 T cell receptors
JP2010539915A (ja) 2007-09-24 2010-12-24 ユニバーシティ・オブ・チューリッヒ 設計されたアルマジロリピートタンパク質
WO2012012695A2 (en) * 2010-07-23 2012-01-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center A method for the treatment of obesity
SG10201510092QA (en) * 2010-12-09 2016-01-28 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
CN110200997A (zh) * 2011-03-23 2019-09-06 弗雷德哈钦森癌症研究中心 用于细胞免疫治疗的方法和组合物
CN107266584B (zh) 2011-07-29 2022-05-13 宾夕法尼亚大学董事会 转换共刺激受体
JP6074435B2 (ja) 2011-10-26 2017-02-01 ナショナル キャンサー センター 変異ｃｔｌａ４遺伝子移入ｔ細胞及びこれを含む抗がん免疫治療用組成物
US20160008399A1 (en) * 2013-01-14 2016-01-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for delivery of immune cells to treat un-resectable or non-resected tumor cells and tumor relapse
WO2016022400A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center T cell immunotherapy specific for wt-1
PL3180363T3 (pl) * 2014-08-15 2020-02-28 Merck Patent Gmbh Białka fuzyjne immunoglobulin sirp-alfa
JP6734283B2 (ja) * 2015-01-21 2020-08-05 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 遺伝子治療用ポイントオブケア及び／又はポータブルプラットフォーム
WO2017112944A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity t cell receptors and uses thereof
US10188749B2 (en) * 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
JP7198670B2 (ja) * 2016-04-20 2023-01-04 フレッド ハッチンソン キャンサー センター 免疫調整性ｉｌ２ｒ融合タンパク質およびその使用
CA3055784A1 (en) * 2017-03-17 2018-09-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunomodulatory fusion proteins and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, V. 65, N. 10, p.1357-1369. *
FRANKEL A.E. et al., Characterization of diphtheria fusion proteins targeted to the human interleukin-3 receptor, Protein engineering, 2000, V. 13, N. 8, p.575-581. *
I. N. LAVRIK, Regulation of apoptosis induced through CD95 / FAS and other "death receptors", Molecular Biology, 2011, V. 45, N. 1, pp. 173-179. *
JONES S. et al., Lentiviral vector design for optimal T cell receptor gene expression in the transduction of peripheral blood lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes, Human gene therapy, 2009, V. 20, N. 6, p.630-640. *
KHARFAN-DABAJA M. A. et al., Immunotherapy for chronic lymphocytic leukemia in the era of BTK inhibitors, Leukemia, 2014, V. 28, N. 3, p.507-517. *
KHARFAN-DABAJA M. A. et al., Immunotherapy for chronic lymphocytic leukemia in the era of BTK inhibitors, Leukemia, 2014, V. 28, N. 3, p.507-517. CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, V. 65, N. 10, p.1357-1369. MAEDA Y. et al., Engineering of functional chimeric protein G-VargulaLuciferase, Analytical biochemistry, 1997, V. 249, N. 2, p.147-152. MA B. Y. et al., CD28 T cell costimulatory receptor function is negatively regulated by N-linked carbohydrates, Biochemical and biophysical research communications, 2004, V. 317, N. 1, p.60-67. SUBRAMANIAN S. et al., Species-and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPα, Blood, 2006, V. 107, N. 6, p.2548-2556. FRANKEL A.E. et al., Characterization of diphtheria fusion proteins targeted to the human interleukin-3 receptor, Protein engineering, 2000, V. 13, N. 8, p.575-581. PAKULA A.A. et al., Genetic analysis of protein stability and function, Annual r *
MA B. Y. et al., CD28 T cell costimulatory receptor function is negatively regulated by N-linked carbohydrates, Biochemical and biophysical research communications, 2004, V. 317, N. 1, p.60-67. *
MAEDA Y. et al., Engineering of functional chimeric protein G-VargulaLuciferase, Analytical biochemistry, 1997, V. 249, N. 2, p.147-152. *
MOREAUX J. et al., CD200: a putative therapeutic target in cancer, Biochemical and biophysical research communications, 2008, V. 366, N. 1, p.117-122. *
PAKULA A.A. et al., Genetic analysis of protein stability and function, Annual review of genetics, 1989, V. 23, N. 1, p.289-310. *
PROSSER M. E. et al., Tumor PD-L1 co-stimulates primary human CD8+ cytotoxic T cells modified to express a PD1: CD28 chimeric receptor, Molecular immunology, 2012, V. 51, N. 3-4, p.263-272. *
SUBRAMANIAN S. et al., Species-and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPα, Blood, 2006, V. 107, N. 6, p.2548-2556. *

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201908203SA (en) 2019-10-30
SA517382216B1 (ar) 2022-11-30
WO2016141357A1 (en) 2016-09-09
KR20170120701A (ko) 2017-10-31
HK1246317A1 (zh) 2018-09-07
AU2020244495B2 (en) 2022-12-01
JP7026161B2 (ja) 2022-02-25
AU2016226022B2 (en) 2020-07-09
AU2022271411A1 (en) 2022-12-22
JP2021184771A (ja) 2021-12-09
MX2022006004A (es) 2022-06-22
CN107531805A (zh) 2018-01-02
AU2016226022A1 (en) 2017-09-14
IL254165B (en) 2021-08-31
SG11201707182WA (en) 2017-10-30
US20180044404A1 (en) 2018-02-15
JP2018508219A (ja) 2018-03-29
IL254165A0 (en) 2017-10-31
EP3265481A1 (en) 2018-01-10
JP2020114264A (ja) 2020-07-30
RU2017133637A3 (ru) 2019-08-08
RU2017133637A (ru) 2019-04-08
US20210403532A1 (en) 2021-12-30
BR112017018919A2 (pt) 2018-04-17
JP7441201B2 (ja) 2024-02-29
MX2022006002A (es) 2022-06-17
MX2022006006A (es) 2022-06-22
CA3177938A1 (en) 2016-09-09
BR112017018919A8 (pt) 2023-04-11
CA2978186A1 (en) 2016-09-09
JP6917896B2 (ja) 2021-08-18
MX2017011201A (es) 2018-01-30
MY189195A (en) 2022-01-31
MY196588A (en) 2023-04-19
AU2020244495A1 (en) 2020-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020244495B2 (en) Immunomodulatory fusion proteins and uses thereof
JP7465306B2 (ja) 免疫調節性融合タンパク質およびその使用
JP7372728B2 (ja) 改変ｔ細胞に関する方法および組成物
JP7198670B2 (ja) 免疫調整性ｉｌ２ｒ融合タンパク質およびその使用
US20240052008A1 (en) Methods and compositions of a follicle stimulating hormone receptor immunoreceptor or chimeric antigen receptor
CA3098184A1 (en) Auto/allo-immune defense receptors for the selective targeting of activated pathogenic t cells and nk cells
KR20230010228A (ko) 자연 살해 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 (cars)
US20240117002A1 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
JP2024502170A (ja) 癌のための改良された養子細胞移植療法
TW202132326A (zh) Hla限制性hormad1 t細胞受體及其用途