CN113766956A - Cd19定向性嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途 - Google Patents

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Abstract

在若干实施方案中，本文提供了基于免疫细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞)的组合物，该组合物包含CD19定向性嵌合抗原受体。在一些实施方案中，CAR的抗CD19结合剂部分是人源化的。在若干实施方案中，表达人源化抗CD19CAR的细胞表现出增强的CAR表达以及增强的细胞毒性和/或持久性。若干实施方案包括在免疫疗法中使用表达抗CD19CAR的免疫细胞的方法。

Description

CD19定向性嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途
相关案
本申请要求于2019年3月5日提交的第62/814,180号、2019年9月4日提交的第62/895,910号和2019年11月7日提交的第62/932,165号美国临时专利申请的优先权，这些临时专利申请中的每一个的全部内容均通过引用并入本文。
技术领域
本文提供的方法和组合物的一些实施方案涉及CD19定向性受体。在一些实施方案中，受体是嵌合的。一些实施方案包括在免疫疗法中使用嵌合受体的方法。
背景技术
随着对各种癌症以及癌性细胞具有哪些特征可以用于特异性区分该细胞与健康细胞的进一步了解，正在开发利用癌性细胞的独特特征的治疗剂。采用工程化免疫细胞的免疫疗法是治疗癌症的一种方案。
通过引用并入ASCII文本文件中的材料
本申请通过引用并入了含在与本申请同时提交的以下ASCII文本文件中的序列表：文件名：NKT033WO_ST25.txt；创建于2020年2月8日，大小为434KB。
发明内容
免疫疗法代表一种在疾病治疗中的新的技术进步，其中免疫细胞工程化改造成表达某些靶向和/或效应分子，这些分子特异性地识别患病或受损细胞并对其作出反应。与所有细胞都受到影响的更传统的方法(如化学疗法)相反，这表示一种有希望的进展，至少部分地是由于具有特异性地靶向患病或受损细胞的潜能所致，并且期望的结果是有足够的健康细胞存活以允许患者生存。一种免疫疗法方案是在免疫细胞中重组表达嵌合受体，以实现对感兴趣的异常细胞的靶向识别和破坏。
在若干实施方案中，本文提供了表达CD19定向性嵌合受体的免疫细胞以及免疫细胞群体，该嵌合受体包含细胞外抗CD19结合部分、铰链和/或跨膜域、以及细胞内信号传导域。本文还提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸(以及用于使用其转染细胞的载体)，该嵌合抗原受体包含细胞外抗CD19结合部分、铰链和/或跨膜域、以及细胞内信号传导域。
在若干实施方案中，提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含单链可变片段(scFv)的可变重(VH)域和scFv的可变轻(VL)域；铰链；跨膜域；以及细胞内信号传导域，并且其中该细胞内信号传导域包含OX40亚域、CD3ζ亚域。
在若干实施方案中，提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含单链可变片段(scFv)的可变重(VH)域和scFv的可变轻(VL)域，其中编码的VH域包含选自下组的至少一个重链互补决定区(CDR)，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135，其中编码的VL域包含选自下组的至少一个轻链互补决定区(CDR)，该组由以下各项组成：SEQID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129；铰链域；跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该细胞内信号传导域包含OX40亚域和CD3ζ亚域。
在若干实施方案中，多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。然而，在一些实施方案中，使用单独的多核苷酸来编码mbIL15。在若干实施方案中，跨膜域衍生自或包含CD8α跨膜域。在若干实施方案中，CD8α跨膜域由SEQ ID NO:3编码。在若干实施方案中，铰链衍生自或包含CD8α铰链。在若干实施方案中，CD8α铰链由SEQ ID NO:1编码。在若干实施方案中，OX40亚域由与SEQ ID NO.5具有至少90％(例如，90-95％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码。在若干实施方案中，CD3ζ亚域由与SEQ ID NO.7具有至少90％(例如，90-95％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码。在若干实施方案中，mbIL15由与SEQ ID NO.11具有至少90％(例如，90-95％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码。在若干实施方案中，OX40域由SEQ ID NO:5编码，CD3ζ亚域由SEQ ID NO.7编码，和/或mbIL15(无论是单独编码还是双顺反子编码)由SEQ ID NO:11编码。在若干实施方案中，编码的OX40亚域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，经编码的CD3ζ亚域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，和/或mbIL15(无论是单独编码还是双顺反子编码)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在若干实施方案中，VH域包含选自SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123的VH域，并且其中VL域包含选自SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118和SEQID NO:119的VL域。在若干实施方案中，多核苷酸编码包含选自下组的至少一个轻链互补决定区(CDR)的VL域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129。在若干实施方案中，多核苷酸编码包含选自下组的至少一个重链互补决定区(CDR)的VH域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135。在若干实施方案中，多核苷酸被设计(例如，工程化)成减少经编码的蛋白质的潜在抗原性和/或增强经编码的蛋白质的一种或多种特征(例如，靶识别和/或结合特征)。因此，根据若干实施方案，抗CD19结合部分不包含某些序列。例如，根据若干实施方案，多核苷酸不编码以下中的一个或多个：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54或SEQ ID NO:55。在若干实施方案中，经编码的VH域包含与SEQ ID NO:120具有至少90％(例如，90-95％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在若干实施方案中，经编码的VH域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在若干实施方案中，经编码的VL域包含与SEQ ID NO:118具有至少90％(例如，90-95％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在若干实施方案中，经编码的VL域包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列。在若干实施方案中，VH域衍生自亲本氨基酸序列，并且从亲本序列中进行修饰。例如，引入突变、截短、延伸、保守性替换或其他修饰，以增加域对其靶标的亲和力、增加对靶标的亲合力和/或减少序列的潜在抗原性。在若干实施方案中，VH域由SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列的人源化产生。同样地，在若干实施方案中，VL域由SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列的人源化产生。在若干实施方案中，多核苷酸编码CD19定向性嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体与SEQ ID NO:187中所列出的氨基酸序列具有至少90％(例如，90-95％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在若干实施方案中，多核苷酸编码CD19定向性嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:187中所列出的氨基酸序列。
在若干实施方案中，多核苷酸不编码或以其他方式包含DAP10域。在若干实施方案中，多核苷酸不编码或以其他方式包含DAP12域。在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含额外的亚域，该亚域有利地增强由表达构建体的细胞生成细胞毒性信号。在若干实施方案中，多核苷酸进一步编码作为信号传导亚域的CD44和CD27中的一种或多种。在若干实施方案中，多核苷酸任选地进一步编码检测标签或其他部分(例如，标志物)，该检测标签或其他部分允许检测宿主细胞对由多核苷酸编码的蛋白质的表达。
本文还提供了所公开的多核苷酸在制造用于在有此需要的哺乳动物中增强NK细胞细胞毒性的药物中的用途、在制造用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的药物中的用途、和/或用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的用途。
本文还提供了工程化免疫细胞，其表达由本文公开的多核苷酸编码的CD19定向性嵌合抗原受体。在若干实施方案中，工程化免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，然而在一些实施方案中，使用NK细胞和T细胞(以及任选的其他免疫细胞类型)的组合。在若干实施方案中，免疫细胞相对于接受细胞的受试者是同种异体的。本文还提供了免疫细胞用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的用途，该免疫细胞表达由本文公开的多核苷酸编码的CD19定向性嵌合抗原受体。本文还提供了免疫细胞用于制造用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的药物的用途，该免疫细胞表达由本文公开的多核苷酸编码的CD19定向性嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，提供了用于使用本文公开的多核苷酸治疗癌症的方法。例如，在若干实施方案中，方法包含将包含免疫细胞群体的组合物施用于患有癌症的受试者，该免疫细胞表达如本文所公开的CD19定向性嵌合抗原受体。在若干实施方案中，CAR包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含单链可变片段(scFv)的可变重(VH)域和scFv的可变轻(VL)域；铰链，如CD8α铰链；跨膜域，如CD8α跨膜域；以及细胞内信号传导域，其包含OX40亚域和CD3ζ亚域，并且其中该细胞还表达膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，OX40亚域由与SEQ ID NO.5具有至少95％序列同一性的序列编码，CD3ζ亚域由与SEQ ID NO.7具有至少95％序列同一性的序列编码，和/或mbIL15由与SEQ ID NO.11具有至少95％序列同一性的序列编码。在若干实施方案中，经编码的VH域包含与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中编码的VL域包含与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在若干实施方案中，多核苷酸编码CD19定向性嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体与SEQ ID NO:187中所列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。如上文所讨论的，在若干实施方案中，表达此类CD19 CAR构建体的免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在若干实施方案中，使用NK细胞和T细胞(以及任选的其他免疫细胞)的组合。在若干实施方案中，细胞是源自非受试者供体的同种异体细胞。在若干实施方案中，细胞是源自受试者的自体细胞。在若干实施方案中，也可以使用同种异体细胞和自体细胞的混合物。在若干实施方案中，所施用的群体包含每千克受试者体重约2x106个细胞。在若干实施方案中，施用是静脉内的。在若干实施方案中，方法进一步包含将一个或多个剂量的白介素2施用于受试者。在若干实施方案中，方法还涉及将另一疗法施用于受试者。例如，在若干实施方案中，方法涉及在施用细胞之前将化学疗法治疗施用于受试者。在若干实施方案中，化学疗法治疗在受试者中诱导淋巴消减。在一些实施方案中，在施用细胞之前将环磷酰胺(cyclophosphamide)和氟达拉滨(fludarabine)的组合施用于受试者。在若干实施方案中，环磷酰胺以约400至约600mg/m2之间的剂量施用。在若干实施方案中，氟达拉滨以约25至25mg/m2之间的剂量施用。在若干实施方案中，在施用工程化免疫细胞之前，施用淋巴消减化学疗法若干天，并且任选地施用多次。例如，在若干实施方案中，在施用本文公开的工程化免疫细胞之前的至少第五、第四和/或第三天施用淋巴消减化学疗法。
在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含人源化抗CD19结合部分、共刺激域和信号传导域。在若干实施方案中，共刺激域包含OX40。在若干实施方案中，人源化抗CD19结合部分包含人源化scFv，其中重链和轻链中的一条或多条已被人源化。在若干实施方案中，重链和/或轻链上的CDR中的一个或多个已被人源化。例如，在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域，该VH域包含选自SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQID NO:122和SEQ ID NO:123的VH域，并且该VL域包含选自SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119的VL域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域。
在若干实施方案中，提供了编码人源化嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，其中该CAR包含：单链抗体或单链抗体片段，其包含人源化抗CD19结合域；跨膜域；初级性细胞内信号传导域，其包含CD3ζ或其功能片段的天然性细胞内信号传导域；以及共刺激域，其包含选自下组的蛋白质的天然性细胞内信号传导域，该组由以下各项组成：OX40、CD27、CD28、ICOS和4-1BB或其功能片段，其中所述抗CD19结合域包含SEQ ID NO:124、127或130的轻链互补决定区1(LC CDR1)、SEQ ID NO:125、128或131的轻链互补决定区2(LC CDR2)和SEQ ID NO:126、129或132的轻链互补决定区3(LC CDR3)以及SEQ ID NO:133、136、139或142的重链互补决定区1(HC CDR1)、SEQ ID NO:134、137、140或143的重链互补决定区2(HC CDR2)和SEQID NO:135、138、141或144的重链互补决定区3(HC CDR3)。
在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQ ID NO:117的可变轻链(VL)域；铰链和/或跨膜域；以及细胞内信号传导域。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:173、SEQID NO:179、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:203的人源化嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQ ID NO:118的可变轻链(VL)域；铰链和/或跨膜域；以及细胞内信号传导域。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:175、SEQID NO:181、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:205的人源化嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQ ID NO:119的可变轻链(VL)域；铰链和/或跨膜域；以及细胞内信号传导域。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:177、SEQID NO:183、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:207的人源化嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQ ID NO:120的可变重链(VH)域；铰链和/或跨膜域；以及细胞内信号传导域。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQID NO:185、SEQ ID NO:187或SEQ ID NO:189的人源化嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQ ID NO:121的可变重链(VH)域；铰链和/或跨膜域；以及细胞内信号传导域。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQID NO:191、SEQ ID NO:193或SEQ ID NO:195的人源化嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQ ID NO:122的可变重链(VH)域；铰链和/或跨膜域；以及细胞内信号传导域。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQID NO:197、SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:201的人源化嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQ ID NO:123的可变重链(VH)域；铰链和/或跨膜域；以及细胞内信号传导域。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQID NO:203、SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:207的人源化嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，所提供的多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。
在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含OX40亚域。然而，在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含以下中的一种或多种：OX40亚域、CD28亚域、iCOS亚域、CD28-41BB亚域、CD27亚域、CD44亚域或其组合。
在若干实施方案中，嵌合抗原受体包含铰链和跨膜域，其中该铰链是CD8α铰链，其中该跨膜域是CD8α或NKG2D跨膜域。在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含CD3ζ域。
在若干实施方案中，多核苷酸不编码SEQ ID NO:112、113或114。在若干实施方案中，多核苷酸不编码SEQ ID NO:116。
在若干实施方案中，提供了工程化NK细胞、工程化T细胞和/或NK细胞和T细胞的混合群体，它们表达本文提供的人源化的CD19定向性嵌合抗原受体中的一种或多种。
还提供了用于在受试者中治疗癌症的方法，该方法包含将如本文所公开的表达嵌合抗原受体的工程化NK和/或T细胞施用于患有癌症的受试者。还提供了本文提供的多核苷酸用于治疗癌症的用途以及本文提供的多核苷酸在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
在若干实施方案中，本文还提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含scFv；跨膜域；以及细胞内信号传导域，其中该细胞内信号传导域包含CD28共刺激域和CD3ζ信号传导域。
在若干实施方案中，本文还提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含scFv；铰链，其中该铰链是CD8α铰链；跨膜域；以及细胞内信号传导域，其中该细胞内信号传导域包含CD3ζITAM。
在若干实施方案中，本文还提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含scFv的可变重链或scFv的可变轻链；铰链，其中该铰链是CD8α铰链；跨膜域，其中该跨膜域包含CD8α跨膜域；以及细胞内信号传导域，其中该细胞内信号传导域包含CD3ζITAM。
在若干实施方案中，跨膜域包含CD8α跨膜域。在若干实施方案中，跨膜域包含NKG2D跨膜域。在若干实施方案中，跨膜域包含CD28跨膜域。
在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含或进一步包含CD28信号传导域。在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含或进一步包含4-1BB信号传导域。在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含或进一步包含OX40域。
在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含或进一步包含4-1BB信号传导域。在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含或进一步包含选自ICOS、CD70、CD161、CD40L、CD44及其组合的域。
在若干实施方案中，多核苷酸还编码截短的表皮生长因子受体(EGFRt)。在若干实施方案中，EGFRt在细胞中表达为可溶性因子。在若干实施方案中，EGFRt以膜结合的形式表达。在若干实施方案中，EGFRt用来在工程化NK细胞中提供“自杀开关”功能。在若干实施方案中，多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。本文还提供了工程化免疫细胞(例如，NK或T细胞或其混合物)，其表达由本文公开的多核苷酸编码的CD19定向性嵌合抗原受体。进一步提供了用于在受试者中治疗癌症的方法，该方法包含将本文公开的表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞施用于患有癌症的受试者。在若干实施方案中，提供了本文公开的多核苷酸在治疗癌症中和/或在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
在若干实施方案中，抗CD19结合部分包含重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域。在若干实施方案中，该VH域与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少95％(例如，95、96、97、98或99％)同一性。在若干实施方案中，该VL域与SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少95％(例如，95、96、97、98或99％)同一性。在若干实施方案中，抗CD19结合部分衍生自SEQ ID NO:33或32的VH和/或VL序列。例如，在若干实施方案中，SEQ IDNO:33和/或32的VH和VL序列经受人源化改造，并且因此在施用于人类受试者时更容易表达和/或免疫原性更小。因此，在若干实施方案中，抗CD19结合部分不包含SEQ ID NO:32和/或SEQ ID NO:33。在若干实施方案中，抗CD19结合部分包含靶向CD19的scFv，其中该scFv包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO.35的序列或与SEQ ID NO:35至少95％(例如，95、96、97、98或99％)相同的序列。在若干实施方案中，抗CD19结合部分包含靶向CD19的scFv，其中该scFv包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO.36的序列或与SEQ IDNO:36至少95％(例如，95、96、97、98或99％)相同的序列。在若干实施方案中，抗CD19结合部分包含轻链CDR和/或重链CDR，该轻链CDR包含第一、第二和第三互补决定区(分别为LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3)，并且该重链CDR包含第一、第二和第三互补决定区(分别为HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3)。取决于实施方案，使用LC CDR和HC CDR的各种组合。例如，在一个实施方案中，抗CD19结合部分包含LC CDR1、LC CDR3、HC CD2和HC CDR3。在一些实施方案中，使用其他组合。在若干实施方案中，LC CDR1包含SEQ ID NO.37的序列或与SEQ NO.37的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，LC CDR2包含SEQ ID NO.38的序列或与SEQ NO.38的序列至少约95％(例如，96、97、98或99％)同源的序列。在若干实施方案中，LCCDR3包含SEQ ID NO.39的序列或与SEQ NO.39的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，HC CDR1包含SEQ ID NO.40的序列或与SEQ NO.40的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，HC CDR2包含SEQ ID NO.41、42或43的序列或与SEQ NO.41、42或43的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，HC CDR3包含SEQ ID NO.44的序列或与SEQNO.44的序列至少约95％(例如，96、97、98、99或99％)同源的序列。
在若干实施方案中，还提供了包含轻链可变区(VL)和重链可变区(HL)的抗CD19结合部分，该VL区包含第一、第二和第三互补决定区(分别为VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3)，并且该VH区包含第一、第二和第三互补决定区(分别为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)。在若干实施方案中，该VL区包含SEQ ID NO.45、46、47或48的序列或与SEQ NO.45、46、47或48的序列至少约95％(例如，96、97、98、99或99％)同源的序列。在若干实施方案中，该VH区包含SEQID NO.49、50、51或52的序列或与SEQ NO.49、50、51或52的序列至少约95％(例如，96、97、98、99或99％)同源的序列。
在若干实施方案中，还提供了包含轻链CDR的抗CD19结合部分，该轻链CDR包含第一、第二和第三互补决定区(分别为LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在若干实施方案中，抗CD19结合部分进一步包含重链CDR，该重链CDR包含第一、第二和第三互补决定区(分别为HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3)。在若干实施方案中，LC CDR1包含SEQ ID NO.53的序列或与SEQNO.53的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，LC CDR2包含SEQ ID NO.54的序列或与SEQ NO.54的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，LC CDR3包含SEQ IDNO.55的序列或与SEQ NO.55的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，HC CDR1包含SEQ ID NO.56的序列或与SEQ NO.56的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，HC CDR2包含SEQ ID NO.57的序列或与SEQ NO.57的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，HC CDR3包含SEQ ID NO.58的序列或与SEQ NO.58的序列至少约95％同源的序列。在若干实施方案中，抗CD19结合部分(以及因此所得的CAR)工程化改造不包括某些序列，如例如，可能导致免疫原性和/或副作用(如细胞因子释放综合征)的风险增加的那些。因此，根据若干实施方案，抗CD19结合部分不包含以下中的一个或多个：SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQID NO:32或SEQ ID NO:33。
在若干实施方案中，嵌合受体的细胞内信号传导域包含OX40亚域。在若干实施方案中，细胞内信号传导域进一步包含CD3ζ亚域。在若干实施方案中，OX40亚域包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列(或与SEQ ID NO.16的序列至少约95％同源的序列)，并且CD3ζ亚域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:8的序列至少约95％同源的序列)。
在若干实施方案中，铰链域包含CD8a铰链域。在若干实施方案中，CD8a铰链域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的序列至少约95％同源的序列)。
在若干实施方案中，免疫细胞还表达膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，mbIL15包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的序列至少约95％同源的序列。
在若干实施方案中，其中嵌合受体进一步包含NKG2D受体的细胞外域。在若干实施方案中，免疫细胞表达第二嵌合受体，该第二嵌合受体包含NKG2D受体的细胞外域、跨膜域、细胞毒性信号传导复合物和任选的mbIL15。在若干实施方案中，NKG2D受体的细胞外域包含NKG2D的功能片段，该功能片段包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26的序列至少约95％同源的序列。在各种实施方案中，工程化改造表达本文公开的嵌合抗原受体和/或嵌合受体的免疫细胞是NK细胞。在一些实施方案中，使用T细胞。在若干实施方案中，使用NK细胞和T细胞(和/或其他免疫细胞)的组合。
在若干实施方案中，本文提供了在受试者中治疗癌症的方法，该方法包含将如本文所公开的靶向CD19的工程化免疫细胞施用于患有癌症的受试者。本文还提供了如本文所公开的靶向CD19的免疫细胞用于治疗癌症的用途。同样地，本文还提供了如本文所公开的靶向CD19的免疫细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在若干实施方案中，所治疗的癌症是急性淋巴细胞白血病。
本文描述的方法和组合物的一些实施方案涉及免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞表达CD19定向性嵌合受体，该嵌合受体包含细胞外抗CD19部分、铰链和/或跨膜域、和/或细胞内信号传导域。在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。
在一些实施方案中，铰链域包含CD8a铰链域。在一些实施方案中，铰链域包含Ig4SH域。
在一些实施方案中，跨膜域包含CD8a跨膜域。在一些实施方案中，跨膜域包含CD28跨膜域。在一些实施方案中，跨膜域包含CD3跨膜域。
在一些实施方案中，信号传导域包含OX40信号传导域。在一些实施方案中，信号传导域包含4-1BB信号传导域。在一些实施方案中，信号传导域包含CD28信号传导域。在一些实施方案中，信号传导域包含NKp80信号传导域。在一些实施方案中，信号传导域包含CD16IC信号传导域。在一些实施方案中，信号传导域包含CD3ζ或CD3ζITAM信号传导域。在一些实施方案中，信号传导域包含mbIL-15信号传导域。在一些实施方案中，信号传导域包含2A切割域。在一些实施方案中，通过2A切割域将mIL-15信号传导域与CD19定向性嵌合受体的其余或另一部分分开。
一些实施方案涉及包含将如本文所描述的免疫细胞施用于有需要的受试者的方法。在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，施用可以治疗、抑制或预防癌症的进展。
附图说明
图1A包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘。
图1B包括对CD19定向性嵌合受体的额外非限制性实例的描绘。
图2也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘。
图3A也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘。
图3B也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘。
图3C也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘。
图3D也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘，该嵌合受体包含人源化CD19结合域。
图3E也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘，该嵌合受体包含人源化CD19结合域。
图3F也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘，该嵌合受体包含人源化CD19结合域。
图3G也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘，该嵌合受体包含无标签序列的人源化CD19结合域。
图3H也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘，该嵌合受体包含无标签序列的人源化CD19结合域。
图3I也包括对CD19定向性嵌合受体的非限制性实例的描绘，该嵌合受体包含无标签序列的人源化CD19结合域。
图4描绘了非限制性NK细胞扩增方案的示意图。
图5示出了根据本文公开的若干实施方案评估CD19定向性嵌合抗原受体的效力的实验方案的示意图。
图6A描绘了与各种非限制性CD19定向性嵌合受体的抗肿瘤作用相关的体内数据。
图6B描绘了与各种非限制性CD19定向性嵌合受体的抗肿瘤作用相关的汇总数据。
图7描绘了与NK细胞对各种CD19定向性嵌合受体构建体的表达相关的数据。
图8A描绘了与所选的CD19定向性嵌合受体的表达相关的原始荧光数据(平均荧光强度，MFI)。
图8B描绘了与所选的CD19定向性嵌合受体的表达相关的数据，其显示为表达所指示受体的NK细胞的百分比。
图9A至9D描绘了与所指示的CD19定向性嵌合受体的细胞毒性(对抗Nalm6或Raji细胞)相关的数据。
图9E描绘了与所指示的CD19定向性嵌合受体在各种比率(效应子:靶标)下的细胞毒性(对抗Nalm6细胞)相关的汇总数据。
图9F描绘了与所指示的CD19定向性嵌合受体在各种比率(效应子:靶标)下的细胞毒性(对抗Raji细胞)相关的汇总数据。
图10A描绘了与所指示的CD19定向性嵌合受体在转导后第7天的细胞毒性(对抗Nalm6细胞)增强程度相关的数据。
图10B描绘了与所指示的CD19定向性嵌合受体在转导后第7天的细胞毒性(对抗Raji细胞)增强程度相关的数据。
图10C描绘了与所指示的CD19定向性嵌合受体在转导后第14天的细胞毒性(对抗Nalm6细胞)增强程度相关的数据。
图10D描绘了与所指示的CD19定向性嵌合受体在转导后第14天的细胞毒性(对抗Raji细胞)增强程度相关的数据。
图11A至11E描绘了与表达各种CD19定向性嵌合受体的NK细胞同Nalm6细胞共培养时的细胞因子释放相关的数据。图11A描绘了粒酶B释放。图11B描绘了穿孔素释放。图11C描绘了TNF-α释放。图11D描绘了GM-CSF释放。图11E描绘了干扰素γ释放。
图12A至12E描绘了与表达各种CD19定向性嵌合受体的NK细胞同Raji细胞共培养时的细胞因子释放相关的数据。图12A描绘了粒酶B释放。图12B描绘了穿孔素释放。图12C描绘了TNF-α释放。图12D描绘了GM-CSF释放。图12E描绘了干扰素γ释放。
图13描绘了与用PBS、未转导的NK细胞或表达所指示的CD19定向性嵌合受体的NK细胞处理过的小鼠中随时间推移的肿瘤负荷相关的体内成像数据，其中施用所指示数目的工程化NK细胞(M＝百万个细胞)。
图14A示出了与检测到的来自图13所示体内数据的荧光信号相关的原始数据，其中施用Nalm6细胞后追踪数据25天。
图14B以对数刻度示出了来自图14A的数据。
图14C示出了与表达所指示构建体的所指示细胞的CD3表达相关的数据。
图14D示出了与表达所指示构建体的所指示细胞的CD56表达相关的数据。
图14E示出了与同表达所指示构建体的所指示细胞接触时的表达GFP的肿瘤细胞相关的数据。
图14F示出了与同表达所指示构建体的所指示细胞接触时的表达CD19的肿瘤细胞相关的数据。
图15描绘了与所选人源化抗CD19 CAR构建体的所选功能特征相关的数据。
图16描绘了与本文实施方案中所公开的各种人源化抗CD19 CAR构建体的表达相关的数据。
图17A至17E示出了细胞毒性数据。17A示出了与来自第一供体的NK细胞对抗Nalm6细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19CAR构建体。17A示出了与来自第一供体的NK细胞对抗Raji细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体。17C示出了与来自第二供体的NK细胞对抗Nalm6细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体。17D示出了与来自第三供体的NK细胞对抗Raji细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体。17E示出了与来自第三供体的NK细胞对抗Nalm6细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体。
图18示出了表达所指示非限制性抗CD19 CAR构建体的NK细胞在转导后第3天的汇总(来自3个供体)表达数据。
图19A至19D示出了细胞毒性再攻击数据。图19A示出了与来自第一供体的NK细胞对抗Raji细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Raji细胞添加至NK细胞培养物中。图19B示出了与来自第一供体的NK细胞对抗Nalm6细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Nalm6细胞添加至NK细胞培养物中。图19C示出了与来自第二供体的NK细胞对抗Raji细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Raji细胞添加至NK细胞培养物中。图19D示出了与来自第二供体的NK细胞对抗Nalm6细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Nalm6细胞添加至NK细胞培养物中。
图20A至20B示出了表达数据。图20A示出了来自转导后10天两个供体的人源化抗CD19 CAR构建体的非限制性实例的表达的荧光数据。图20B示出了与表达CD19的细胞的百分比相关的数据(指示给定抗CD19 CAR的表达效率。
图21A至21B示出了细胞毒性数据。图21A示出了与NK细胞(来自图20的两个供体中的第一供体)对抗Raji细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Raji细胞添加至NK细胞培养物中。图21B示出了与NK细胞(来自图20的两个供体中的第二供体)对抗Raji细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Raji细胞添加至NK细胞培养物中。
图22A至22E示出了与表达各种CD19定向性嵌合受体的NK细胞同Raji细胞共培养时的细胞因子释放相关的数据。图22A示出了干扰素γ释放。图22B示出了GM-CSF释放。图22C示出了肿瘤坏死因子释放。图22D示出了穿孔素释放。图22E示出了粒酶释放。
图23A至23D示出了与NK细胞存活相关的数据。图23A示出了对来自第一供体的NK细胞在转导后第7、13、19和26天的存活的分析，该NK细胞工程化改造成表达所指示抗CD19CAR构建体的非限制性实施方案。图23B示出了对来自第二供体的NK细胞在转导后第7、13、19和26天的存活的分析，该NK细胞工程化改造成表达所指示抗CD19 CAR构建体的非限制性实施方案。图23C示出了对来自第三供体的NK细胞在转导后第11、19和26天的存活的分析，该NK细胞工程化改造成表达所指示抗CD19 CAR构建体的非限制性实施方案。图23D示出了对来自第四供体的NK细胞在转导后第11、19和26天的存活的分析，该NK细胞工程化改造成表达所指示抗CD19 CAR构建体的非限制性实施方案。对于每个实验，每周两次更换培养基。
图24示出了与表达抗CD19 CAR构建体的所指示非限制性实施方案的NK细胞在转导后第11天的百分比相关的数据。
图25A至25I示出了与用本文公开的抗CD19 CAR构建体的各种非限制性实施方案转导的NK细胞的CD19表达相关的数据。图25A示出了GFP转导的NK细胞作为对照。图25B示出了用NK19-1转导的NK细胞中的CD19表达。图25C示出了用NK19H-1转导的NK细胞中的CD19表达。图25D示出了用NK19H-2转导的NK细胞中的CD19表达。图25E示出了用NK19H-3转导的NK细胞中的CD19表达。图25F示出了用NK19H-4转导的NK细胞中的CD19表达。图25G示出了用NK19H-5转导的NK细胞中的CD19表达。图25H示出了用NK19H-11转导的NK细胞中的CD19表达。图25I示出了用NK19H-12转导的NK细胞中的CD19表达。
图26A至26D示出了细胞毒性数据。图26A示出了与NK细胞(来自第一供体)对抗Raji细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Raji细胞添加至NK细胞培养物中。图26B示出了与NK细胞(来自第一供体)对抗Nalm6细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Nalm6细胞添加至NK细胞培养物中。图26C示出了与NK细胞(来自第二供体)对抗Raji细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Raji细胞添加至NK细胞培养物中。图26D示出了与NK细胞(来自第二供体)对抗Nalm6细胞的细胞毒性相关的数据，该NK细胞工程化改造成表达所选的本文公开的人源化CD19 CAR构建体，其中在第7天并再次在第14天将Nalm6细胞添加至NK细胞培养物中。
图27A至27B示出了与工程化NK细胞的CD19表达相关的数据。图27A示出了来自供体的NK细胞的流式细胞术数据，该NK细胞工程化改造成表达本文公开的各种非限制性抗CD19 CAR构建体。图27B示出了从额外供体分离出来的NK细胞的相应数据。
图28A至28B示出了细胞毒性数据。图28A示出了当暴露(以1:1E:T比率)于NK细胞(来自图27的第一供体)时Raji细胞随时间推移的计数，该NK细胞表达所指示抗CD19 CAR构建体的非限制性实例。图28B示出了当暴露(以1:1E:T比率)于NK细胞(来自图27的第二供体)时Raji细胞随时间推移的计数，该NK细胞表达所指示抗CD19 CAR构建体的非限制性实例。
图29A至29E示出了与各种人源化的CD19定向性CAR构建体及其在体内模型中的功效相关的数据。图29A示出了对实验方案的示意性描绘，该实验方案用于评估CD19定向性CAR构建体在体内的效力。图29B示出了对已被施用NALM6肿瘤细胞并用所指示构建体处理过的小鼠的体内生物发光成像。图29C示出了从图29B收集的生物发光数据的线形图。图29D是示出了每个处理组中动物存活的天数的存活曲线。图29E示出了NK细胞对所指示构建体的相对表达水平，如通过包括在CD19 CAR构建体中的标签的MFI所测量的。
图30A至30F涉及所指示的CD19定向性CAR构建体的表达。图30A示出了与所指示构建体的表达相关的数据，其表示为NK细胞施用后15天的小鼠的血液样品中所有CD56阳性细胞的百分比(例如，根据图29A中的示意性描绘)。图30B示出了与所指示构建体的表达相关的数据，其表示为同样在NK细胞施用后第15天既为CD56阳性且又表达Flag标签(作为CD19CAR构建体的一部分)的细胞的百分比。图30C示出了与同样在NK细胞施用后第15天对样品中的GFP+肿瘤细胞的检测相关的数据，该样品来自用所指示构建体处理过的动物。图30D、30E和30F示出了NK细胞施用后第32天的相应数据。
图31A至31B示出了与未标记CD19 CAR构建体的表达相关的数据。如本文所讨论，在若干实施方案中，CD19 CAR构建体包含用于检测目的的Flag或其他标签。然而，本文还包括所有带有标签的本文公开的构建体的不带有标签的情形。图31A示出了与所选的非flag标记人源化抗CD19 CAR构建体随时间推移的表达相关的数据。图31B示出了与所指示构建体的检测到的平均荧光强度有关的相应数据。
图32A至32D示出了与体外再攻击实验相关的数据，在该实验中，将第一肿瘤细胞群体与表达所指示构建体的NK细胞共培养，并且用额外的肿瘤细胞团“再攻击”NK细胞。图32A示出了与Raji细胞共培养开始后第10天的数据。图32B示出了与最后时间点(第14天)处的Raji相关的数据。图32C示出了与第10天的Nalm6细胞相关的数据。图32D示出了与第14天的Nalm6细胞相关的数据。
图33A至33J涉及对表达所指示构建体的NK细胞的细胞因子产生的评价。图33A示出了在与Raji细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对干扰素γ的表达。图33B示出了在与Raji细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对GM-CSF的表达。图33C示出了在与Raji细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对肿瘤坏死因子α的表达。图33D示出了在与Raji细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对穿孔素的表达。图33E示出了在与Raji细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对粒酶B的表达。图33F示出了在与Nalm6细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对干扰素γ的表达。图33G示出了在与Nalm6细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对GM-CSF的表达。图33H示出了在与Nalm6细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对肿瘤坏死因子α的表达。图33I示出了在与Nalm6细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对穿孔素的表达。图33J示出了在与Nalm6细胞共培养后表达所指示构建体的NK细胞对粒酶B的表达。
图34示出了与表达人源化未标记CD19 CAR构建体的NK细胞在转导后四周内的生存力相关的数据。
图35A至35D示出了与各种人源化未标记CD19定向性CAR构建体及其在体内模型中的功效相关的数据。图35A示出了对实验方案的示意性描绘，该实验方案用于评估人源化未标记CD19定向性CAR构建体在体内的效力。图35B示出了对已被施用NALM6肿瘤细胞并用所指示构建体处理过的小鼠的体内生物发光成像。图35C示出了从图35B收集的生物发光数据的线形图。图35D示出了NK细胞对所指示构建体的相对表达水平，如通过检测结合至CD19CAR构建体的CD19-Fc融合蛋白所测量的。
图36A至36F涉及所指示的CD19定向性CAR构建体的表达。图36A示出了与所指示构建体的表达相关的数据，其表示为NK细胞施用后13天的小鼠的血液样品中所有CD56阳性细胞的百分比(例如，根据图35A中的示意性描绘)。图36B示出了与检测同样在NK细胞施用后第13天的样品中的CD19+肿瘤细胞相关的数据，该样品来自用所指示构建体处理过的动物。图36C示出了与检测同样在NK细胞施用后第13天的样品中的GFP+肿瘤细胞相关的数据，该样品来自用所指示构建体处理过的动物。图36D、36E和36F示出了NK细胞施用后第27天的相应数据。
图37A至37C涉及根据本文公开实施方案的各种CD19定向性CAR的体内功效。图37A示出了对实验方案的示意性描绘，该实验方案用于评估人源化NK细胞在体内的效力，该NK细胞表达各种CD19定向性CAR构建体。所测试的各个实验组如所指示。对于具有“IL12/IL18”名称的细胞，该细胞在可溶性IL12和/或IL18存在的情况下进行扩增，如在2019年7月31日提交的美国临时专利申请第62/881311号和2019年11月7日提交的申请第62/932342号中所描述的，这些申请中的每一个都通过引用以其整体并入本文。图37B和37C示出了来自被给予Nalm6肿瘤细胞并用所指示构建体处理过的动物的生物发光数据。
图38A至38J示出了对来自图37B的生物发光数据的图形化描绘。图38A示出了来自接受未转导的NK细胞的动物的生物发光(作为光子/第二通量)。图38B示出了在接受作为载剂的PBS的动物中测得的通量。图38C示出了在接受先前冷冻的表达NK19 NF2 CAR(作为CAR的非限制性实例)的NK细胞的动物中测得的通量。图38D示出了在接受先前冷冻的使用IL12和/或IL18进行扩增的表达NK19 NF2 CAR(作为CAR的非限制性实例)的NK细胞的动物中测得的通量。图38E和图38F示出了在接受新鲜的表达NK19 NF2 CAR(作为CAR的非限制性实例)的NK细胞的动物中测得的通量。图38G和图38H示出了在接受先前新鲜的使用IL12和/或IL18进行扩增的表达NK19 NF2 CAR(作为CAR的非限制性实例)的NK细胞的动物中测得的通量。图38I示出了描绘在肿瘤接种后的最初30天内在各个组中测得的生物发光的线形图。图38J示出了描绘在肿瘤接种后的最初56天内在各个组中测得的生物发光的线形图。
图39示出了与在接受所指示的疗法时小鼠随时间推移的体重相关的数据。
具体实施方式
本文提供的方法和组合物的一些实施方案涉及CD19定向性嵌合受体。在一些实施方案中，受体在如本文所描述的细胞上表达。一些实施方案包括在免疫疗法中使用组合物或细胞的方法。
术语“抗癌作用”是指可以通过多种手段表现出来的生物学作用，包括但不限于肿瘤体积降低、癌细胞数目降低、转移数目降低、预期寿命增加、癌细胞增殖降低、癌细胞存活降低、或与癌性病况相关联的各种生理症状的改善。“抗癌作用”还可以通过SIR首先预防癌症发生的能力表现出来。
细胞类型
本文提供的方法和组合物的一些实施方案涉及细胞，如免疫细胞。例如，免疫细胞可以工程化改造成包括嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)，或工程化改造成包括编码如本文所描述的嵌合受体的核酸。
传统的抗癌疗法依赖于手术方案、放射疗法、化学疗法或这些方法的组合。随着研究的进行，对某些癌症的机制中的一些有了更深入的了解，从而利用这些知识来开发癌症靶向疗法。靶向疗法是一种癌症治疗，其采用靶向存在于癌细胞或支持癌细胞生长的细胞(如血管细胞)中的特异性基因或蛋白质的某些药物，以减少或阻止癌细胞生长。最近，基因工程已经使得利用免疫系统的某些方面来对抗癌症的方案得到发展。在一些情况下，患者自身的免疫细胞被修饰以特异性地根除该患者的癌症类型。可以使用各种类型的免疫细胞(如T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞))，如下文更详细地描述的。
为了促进癌症免疫疗法，本文提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸、多肽和载体，该嵌合抗原受体包含靶结合部分(例如，配体的细胞外结合剂或者CD19定向性嵌合受体，它们由癌细胞表达)和细胞毒性信号传导复合物。例如，一些实施方案包括编码CD19定向性嵌合受体的多核苷酸、多肽或载体，以促进将免疫细胞靶向至癌症并对癌细胞发挥细胞毒性作用。还提供了表达此类CAR的工程化免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在若干实施方案中，本文还提供了编码包含细胞外域的构建体的多核苷酸、多肽和载体，该细胞外域包含两个或更多个亚域，例如，第一靶向CD19的亚域和第二亚域，该第一靶向CD19的亚域包含如本文所公开的CD19结合部分，并且该第二亚域包含C型凝集素样受体和细胞毒性信号传导复合物。还提供了表达此类双特异性构建体的工程化免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)。还提供了表达多特异性构建体和/或具有结合多个靶标标志物的能力的工程化免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)。本文还提供了治疗癌症的方法以及此类细胞用于癌症免疫疗法的其他用途。
用于免疫疗法的工程化细胞
在若干实施方案中，免疫系统的细胞工程化改造成对靶细胞(如肿瘤细胞)具有增强的细胞毒性作用。例如，免疫系统的细胞可以工程化改造成包括如本文所描述的CD19定向性嵌合受体。在若干实施方案中，使用白细胞或白血球，因为其天然功能是保护身体对抗异常细胞的生长和感染性疾病。多种类型的白细胞在人免疫系统中起着特定作用，因此是本文公开的细胞工程化改造的优选起点。白细胞包括粒细胞和无粒细胞(分别在细胞质中存在或不存在颗粒)。粒细胞包括嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞。无粒细胞包括淋巴细胞和单核细胞。细胞(如本文随后出现或以其他方式描述的那些细胞)可以工程化改造成包括嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)或编码该嵌合受体的核酸和/或工程化改造共表达膜结合的白介素15(mbIL15)共刺激域。
用于免疫疗法的单核细胞
单核细胞是白细胞的亚型。单核细胞可以分化成巨噬细胞和髓样谱系树突细胞。单核细胞与适应性免疫系统相关联，并且提供以下主要功能：吞噬作用、抗原呈递和细胞因子产生。吞噬作用是摄取细胞物质或整个细胞，然后消化和破坏被吞没的细胞物质的过程。在若干实施方案中，单核细胞与一种或多种额外的如本文所公开的工程化细胞结合使用。本文描述的方法和组合物的一些实施方案涉及包括CD19定向性嵌合受体或编码该CD19定向性嵌合受体的核酸的单核细胞。本文公开的方法和组合物的若干实施方案涉及工程化改造表达CD19定向性嵌合受体和膜结合的白介素15(mbIL15)共刺激域的单核细胞。
用于免疫疗法的淋巴细胞
淋巴细胞是白细胞的另一主要亚型，包括T细胞(细胞介导的细胞毒性适应性免疫)、自然杀伤细胞(细胞介导的细胞毒性先天免疫)和B细胞(体液、抗体驱动的适应性免疫)。虽然根据本文公开的若干实施方案对B细胞进行工程化改造，但若干实施方案还涉及工程化T细胞或工程化NK细胞(在一些实施方案中使用T细胞和NK细胞的混合物)。本文描述的方法和组合物的一些实施方案涉及包括CD19定向性嵌合受体或编码该CD19定向性嵌合受体的核酸的淋巴细胞。本文公开的方法和组合物的若干实施方案涉及工程化改造表达CD19定向性嵌合受体和膜结合的白介素15(mbIL15)共刺激域的淋巴细胞。
用于免疫疗法的T细胞
基于细胞表面上T细胞受体的存在，T细胞可与其他淋巴细胞亚型(例如，B细胞或NK细胞)区分开来。可以将T细胞划分为各种不同的亚型，包括效应T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆性T细胞、调控性T细胞、自然杀伤性T细胞、粘膜相关联不变性T细胞和γΔT细胞。在一些实施方案中，对T细胞的特异性亚型进行工程化改造。在一些实施方案中，对T细胞的混合库进行工程化改造。在一些实施方案中，对于要工程化改造表达本文公开的细胞毒性受体复合物的T细胞类型没有特定选择。在若干实施方案中，使用特定技术(如使用细胞因子刺激)来增强具有特定标志物谱的T细胞的扩增/收集。例如，在若干实施方案中，通过使用作为刺激分子的CD3和/或CD28来实现某些人T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞)的活化。在若干实施方案中，提供了治疗或预防癌症或感染性疾病的方法，该方法包含施用治疗有效量的如本文所描述的表达细胞毒性受体复合物和/或归巢部分的T细胞。在若干实施方案中，工程化T细胞是自体细胞，而在一些实施方案中，该T细胞是同种异体细胞。本文描述的方法和组合物的一些实施方案涉及包括CD19定向性嵌合受体或编码该CD19定向性嵌合受体的核酸的T细胞。本文公开的方法和组合物的若干实施方案涉及工程化改造表达CD19定向性嵌合受体和膜结合的白介素15(mbIL15)共刺激域的T细胞。
用于免疫疗法的NK细胞
在若干实施方案中，提供了治疗或预防癌症或感染性疾病的方法，该方法包含施用治疗有效量的如本文所描述的表达细胞毒性受体复合物和/或归巢部分的自然杀伤(NK)细胞。在若干实施方案中，工程化NK细胞是自体细胞，而在一些实施方案中，该NK细胞是同种异体细胞。在若干实施方案中，NK细胞是优选的，因为NK细胞的自然细胞毒性潜力相对较高。在若干实施方案中，出乎意料地有利的是，本文公开的工程化细胞可以进一步上调NK细胞的细胞毒性活性，从而导致甚至更有效的对抗靶细胞(例如，肿瘤或其他患病细胞)的活性。本文描述的方法和组合物的一些实施方案涉及包括CD19定向性嵌合受体或编码该CD19定向性嵌合受体的核酸的NK。本文公开的方法和组合物的若干实施方案涉及工程化改造表达CD19定向性嵌合受体和膜结合的白介素15(mbIL15)共刺激域的NK细胞。
用于癌症免疫疗法的造血干细胞
在一些实施方案中，造血干细胞(HSC)用于本文公开的免疫疗法方法。在若干实施方案中，细胞工程化改造成表达归巢部分和/或细胞毒性受体复合物。在若干实施方案中，使用HSC以利用其移植能力来进行长期血细胞产生(这可能导致靶向抗癌效应细胞的持续来源)，例如以防止癌症缓解。在若干实施方案中，这种持续进行的产生有助于抵消其他细胞例如由于肿瘤微环境而引起的无反应性或耗竭。在若干实施方案中，使用同种异体HSC，而在一些实施方案中，使用自体HSC。在若干实施方案中，HSC与一种或多种额外的本文公开的工程化细胞类型组合使用。本文描述的方法和组合物的一些实施方案涉及包括CD19定向性嵌合受体或编码该CD19定向性嵌合受体的核酸的干细胞，如造血干细胞。本文公开的方法和组合物的若干实施方案涉及工程化改造表达CD19定向性嵌合受体和膜结合的白介素15(mbIL15)共刺激域的干细胞，如造血干细胞。
细胞外域(肿瘤结合剂)
本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及包括细胞外域的嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)。在一些实施方案中，细胞外域包含如本文所描述的肿瘤结合域(也被称为抗原结合蛋白或抗原结合域)。在一些实施方案中，抗原结合域衍生自或包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单域抗体(SDAB)、vH或vL域、骆驼科动物VHH域或非免疫球蛋白支架，如DARPIN、亲和体、affilin、adnectin、affitin、repebody、fynomer、α体、avimer、atrimer、centyrin、pronectin、anticalin、kunitz域、犰狳重复蛋白、自体抗原、受体或配体。在一些实施方案中，肿瘤结合域含有多于一个的抗原结合域。在实施方案中，抗原结合域直接或经由任选的接头可操作地连接至TCR域的NH2末端(例如，TCR-α、TCR-β1、TCR-β2、前TCR-α、前TCR-α-Del48、TCR-γ或TCR-Δ的恒定链)。
抗原结合蛋白
在若干实施方案中，提供了抗原结合蛋白。如本文所用，术语“抗原结合蛋白”应被给予其普通含义，并且还应指包含抗原结合片段的蛋白，该抗原结合片段与抗原和任选的支架或构架部分结合，该支架或构架部分允许抗原结合片段采用促进抗原结合蛋白与抗原的结合的构象。在一些实施方案中，抗原是癌抗原(例如，CD19)或其片段。在一些实施方案中，抗原结合片段包含来自与抗原结合的抗体的至少一个CDR。在一些实施方案中，抗原结合片段包含来自与抗原结合的抗体的重链或来自与抗原结合的抗体的轻链的所有三个CDR。在另外一些实施方案中，抗原结合片段包含来自与抗原结合的抗体的所有六个CDR(三个来自重链，并且三个来自轻链)。在若干实施方案中，抗原结合片段包含来自与抗原结合的抗体的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，并且在若干实施方案中，CDR可以是重链和/或轻链CDR的任何组合。在一些实施方案中，抗原结合片段是抗体片段。
抗原结合蛋白的非限制性实例包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合片段)、抗体衍生物和抗体类似物。进一步的具体实例包括但不限于单链可变片段(scFv)、纳米抗体(例如，骆驼科动物重链抗体的VH域；VHH片段)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、Fd片段和互补决定区(CDR)片段。这些分子可以衍生自任何哺乳动物来源，如人、小鼠、大鼠、兔或猪、狗、或骆驼科动物。抗体片段可以与完整的(例如，天然的)抗体竞争同靶抗原的结合，并且片段可以通过对完整抗体的修饰(例如，酶促或化学切割)来产生或使用重组DNA技术或肽合成来从头合成。抗原结合蛋白可以包含例如具有移植CDR或CDR衍生物的替代性蛋白支架或人工支架。此类支架包括但不限于包含突变的抗体衍生支架以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架，其中引入该突变以例如稳定抗原结合蛋白的三维结构。此外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及基于利用纤连蛋白组分作为支架的抗体模拟物的支架。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含并入至单条多肽链中或并入至多条多肽链中的一个或多个抗体片段。举例来说，抗原结合蛋白可以包括但不限于双体抗体(diabody)；胞内抗体；域抗体(单个VL或VH域或者通过肽接头接合的两个或更多个VH域)；大抗体(maxibody)(融合至Fc区的2个scFv)；三抗体(triabody)；四抗体(tetrabody)；微抗体(minibody)(融合至CH3域的scFv)；肽抗体(peptibody)(附接至Fc区的一个或多个肽)；线性抗体(一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区)；小型模块化免疫药物；以及免疫球蛋白融合蛋白(例如，IgG-scFv、IgG-Fab、2scFv-IgG、4scFv-IgG、VH-IgG、IgG-VH和Fab-scFv-Fc)。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有免疫球蛋白的结构。如本文所用，术语“免疫球蛋白”应被给予其普通含义，并且还应指四聚体分子，其中每个四聚体包含两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。
在轻链和重链中，可变区(V)和恒定区(C)通过约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
免疫球蛋白链表现出相同的通过三个高变区(也被称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的构架区(FR)的一般结构。从N末端至C末端，轻链和重链均包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
人轻链被分类为κ轻链和λ轻链。抗体“轻链”是指以天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中较小的一种。Kappa(K)轻链和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。轻链可以包括从氨基末端至羧基末端包含以下各项的多肽：单个免疫球蛋白轻链可变区(VL)和单个免疫球蛋白轻链恒定域(CL)。
重链被分类为mu(μ)、delta(Δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。抗体“重链”是指以天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中较大的一种，其通常决定抗体所属的类别。重链可以包括从氨基末端至羧基末端包含以下各项的多肽：单个免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白重链恒定域1(CH1)、免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白重链恒定域2(CH2)、免疫球蛋白重链恒定域3(CH3)和任选的免疫球蛋白重链恒定域4(CH4)。
进一步将IgG类划分为亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。进一步将IgA类划分为亚类，即IgA1和IgA2。IgM具有包括但不限于IgM1和IgM2的亚类。IgG、IgA和IgD抗体中的重链具有三个域(CH1、CH2和CH3)，然而IgM和IgE抗体中的重链具有四个域(CH1、CH2、CH3和CH4)。免疫球蛋白重链恒定域可以来自任何免疫球蛋白同种型，其包括亚型。抗体链经由CL域与CH1域之间(例如，轻链与重链之间)以及抗体重链铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是单克隆的或多克隆的、多链或单链的、或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自自然来源或衍生自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以是“人源化的”、“嵌合的”或非人的。抗体可以包括任何同种型的完整免疫球蛋白，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和双特异性抗体。完整抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链。抗体序列可以仅衍生自单一物种，或者可以是“嵌合的”，也就是说，抗体的不同部分可以衍生自两个不同的物种，如下文进一步描述的。除非另有指示，否则术语“抗体”还包括包含两条基本上全长的重链和两条基本上全长的轻链的抗体，条件是这些抗体保留了与由两条全长轻链和重链构成的抗体相同或类似的结合和/或功能。例如，在重链和/或轻链的N末端和/或C末端具有1、2、3、4或5个氨基酸残基替换、插入或缺失的抗体包括在定义中，条件是这些抗体保留了与包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体相同或类似的结合和/或功能。抗体的实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体和合成抗体。在一些实施方案中，提供了单克隆抗体和多克隆抗体。如本文所用，术语“多克隆抗体”应被给予其普通含义，并且还应指通常在组成和结合特异性方面广泛变化的抗体的群体。如本文所用，术语“单克隆抗体”(“mAb”)应被给予其普通含义，并且还应指具有相同序列的抗体的群体中的一个或多个。单克隆抗体在抗原上的特定表位处与抗原结合。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体的片段或抗原结合片段。术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，其保留了与抗原的表位特异性相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、由VH和CHI域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体(如sdAb(vL或vH))、骆驼科动物vHH域、由抗体片段(如包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、以及抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。还可以将抗原结合片段并入至单域抗体、大抗体、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson，NatureBiotechnology 23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植至基于多肽(如纤连蛋白III型(Fn3))的支架中(参见美国专利第6,703,199号，其描述了纤连蛋白多肽微型体)。抗体片段可以包括Fab、Fab’、F(ab’)2和/或Fv片段，其包含足以赋予与癌抗原(例如，CD19)的特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一个CDR。抗体片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。
在一些实施方案中，提供了Fab片段。Fab片段是具有VL、VH、CL和CH1域的单价片段；F(ab’)2片段是具有通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段具有VH和CH1域；Fv片段具有抗体单臂的VL和VH域；并且dAb片段具有VH域、VL域、或者VH或VL域的抗原结合片段。在一些实施方案中，可以将这些抗体片段并入至单域抗体、单链抗体、大抗体、微抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中。在一些实施方案中，抗体包含如本文所描述的至少一个CDR。
在若干实施方案中，本文还提供了单链可变片段。如本文所用，术语“单链可变片段”(“scFv”)应被给予其普通含义，并且还应指融合蛋白，在该融合蛋白中，VL区和VH区经由接头(例如，氨基酸残基的合成序列)接合以形成连续的蛋白质链，其中该接头足够长以允许蛋白质链自身向后折叠并形成单价抗原结合位点。为了清楚起见，除非另外如此指示，否则“单链可变片段”不是如本文所定义的抗体或抗体片段。双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头接合的VH域和VL域，该接头被配置成减少或不允许同一链上的两个域之间的配对，从而允许每个域与另一条多肽链上的互补域配对。根据若干实施方案，如果双抗体的两条多肽链相同，则通过它们的配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制造具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体是分别包含三条和四条多肽链并分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，这些结合位点可以相同或不同。
在若干实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个CDR。如本文所用，术语“CDR”应被给予其普通含义，并且还应指抗体可变区序列内的互补决定区(也被称为“最小识别单元”或“高变区”)。CDR允许抗原结合蛋白与感兴趣的特定抗原特异性结合。有三个重链可变区CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变区CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。两条链中的每一条中的CDR通常通过构架区对齐，以形成与靶蛋白上的特定表位或域特异性结合的结构。从N末端至C末端，天然存在的轻链可变区和重链可变区二者通常遵循这些元件的以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已经设计了编号系统以用于为占据这些域中的每一个中的位置的氨基酸分配编号。在Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(1987and 1991,NIH,Bethesda,MD)或Chothia&Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia et al.,1989,Nature 342:878-883中对这种编号系统进行了定义。可以使用这种系统来鉴定给定抗体的互补决定区(CDR)和构架区(FR)。用于免疫球蛋白链中的氨基酸的其他编号系统包括
Figure BDA0003331382650000291
(国际免疫遗传学信息系统(the internationalImMunoGeneTics information system)；Lefranc et al,Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(Honegger和Pluckthun，J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。可以将一个或多个CDR共价地或非共价地并入至分子中以使其成为抗原结合蛋白。在若干实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:106的重链可变区。在若干实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:107的轻链可变区。
在若干实施方案中，例如出于改善表达、功能或减少宿主对抗原结合蛋白的潜在免疫应答的目的，抗原结合蛋白已从其原始序列中进行修饰。在若干实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119的轻链可变区和/或具有至少90％同一性和/或同源性(例如，90-95％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列。在若干实施方案中，轻链可变区与SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118或SEQ ID NO:119的序列差异为5％以上(例如，为5-7％、5-10％、10-20％或更高)，其中配体结合功能(或其他功能性)与SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118或SEQ ID NO:119类似、基本类似或相同。在若干实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123的重链可变区和/或具有至少90％同一性和/或同源性(例如，90-95％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列。在若干实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123的序列差异为5％以上(例如，为5-7％、5-10％、10-20％或更高)，其中配体结合功能(或其他功能性)与SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQID NO:122或SEQ ID NO:123类似、基本类似或相同。取决于实施方案，可以使用重链区和轻链区的任何组合(例如，在组装scFv中)。在若干实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ IDNO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144的一个或多个CDR。
在额外的实施方案中，CDR选自SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115以及任何组合。在一个实施方案中，组装CDR以生成导向CD19并包含SEQ ID NO:116的CAR。
在若干实施方案中，抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:88的序列的重链。在若干实施方案中，该重链与SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和/或SEQ ID NO:91的轻链中的一条偶联(例如，作为scFv)。在若干实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99和SEQ ID NO:100的一个或多个CDR。
在若干实施方案中，抗原结合蛋白包含FMC63抗体的轻链区，其具有SEQ ID NO:150的序列。在若干实施方案中，抗原结合蛋白包含FMC63抗体的轻链区，其具有SEQ ID NO:148的序列。在若干实施方案中，在重链与轻链之间使用接头，并且在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:149的序列。在若干实施方案中，此类重链和轻链与CD28共刺激域(如SEQID NO:153的CD28共刺激域)结合使用。通常使用间隔物来分隔CAR的组分部分。例如，在若干实施方案中，使用包含SEQ ID NO:151的序列的间隔物。在若干实施方案中，使用具有SEQID NO:152的序列的跨膜域。在若干实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:147共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的核酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白包含作为较大多肽链的一部分的一个或多个CDR。在一些实施方案中，抗原结合蛋白将该一个或多个CDR共价地连接至另一多肽链。在一些实施方案中，抗原结合蛋白非共价地合并有该一个或多个CDR。在一些实施方案中，抗原结合蛋白可以包含本文描述的并入至生物相容性构架结构中的CDR中的至少一种。在一些实施方案中，生物相容性构架结构包含足以形成构象稳定的结构支持物、或构架、或支架的多肽或其部分，该支持物或构架或支架能够将与抗原(例如，CDR、可变区等)结合的氨基酸序列中的一个或多个显示在局部表面区域中。此类结构可以是天然存在的多肽或多肽“折叠”(结构基序)，或者可以具有相对于天然存在的多肽或折叠的一个或多个修饰，如氨基酸的添加、缺失和/或替换。取决于实施方案，支架可以衍生自多个不同物种(或多于一个物种)(如人、非人灵长类动物或其他哺乳动物、其他脊椎动物、无脊椎动物、植物、细菌或病毒)的多肽。
取决于实施方案，生物相容性构架结构基于除免疫球蛋白域之外的蛋白质支架或骨架。在一些此类实施方案中，那些构架结构基于纤连蛋白、锚蛋白、脂质运载蛋白、新制癌菌素(neocarzinostatin)、细胞色素b、CP1锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z域和/或淀粉酶抑肽域。
在一些实施方案中，还提供了具有多于一个结合位点的抗原结合蛋白。在若干实施方案中，结合位点彼此相同，而在若干实施方案中，结合位点彼此不同。例如，抗体通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将与两个不同的表位结合，这些表位可以位于相同或不同的蛋白质靶标上。在若干实施方案中，这是特别有利的，因为双特异性嵌合抗原受体可以赋予工程化细胞靶向多个肿瘤标志物的能力。例如，CD19和额外的肿瘤标志物，如CD123、NKG2D或者本文公开的或本领域中被理解为肿瘤特异性抗原或肿瘤相关联抗原的任何其他标志物。
如本文所用，术语“嵌合抗体”应被给予其普通含义，并且还应指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。在一些实施方案中，CDR中的一个或多个衍生自抗癌抗原(例如，CD19)抗体。在若干实施方案中，所有CDR均衍生自抗癌抗原抗体(如抗CD19抗体)。在一些实施方案中，将来自多于一种抗癌抗原抗体的CDR在嵌合抗体中进行混合和匹配。举例来说，嵌合抗体可以包含来自第一抗癌抗原抗体的轻链的CDR1、来自第二抗癌抗原抗体的轻链的CDR2和CDR3、以及来自第三抗癌抗原抗体的重链的CDR。进一步地，本文公开的抗原结合蛋白的构架区可以衍生自相同的抗癌抗原(例如，CD19)抗体中的一种、衍生自一种或多种不同的抗体(如人抗体)或衍生自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体相同、与其同源或衍生自其，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的一个或多个抗体相同、与其同源或衍生自其。本文还提供了表现出期望生物活性的此类抗体的片段。
在一些实施方案中，提供了抗原结合蛋白，其包含与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少96、97、98或99％同一性的重链可变域。在若干实施方案中，重链可变域可以具有SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列中的一个或多个额外的突变(例如，出于人源化的目的)，但保留了与癌抗原(例如，CD19)的特异性结合。在若干实施方案中，重链可变域可以具有SEQ IDNO:33中所列出的VH域氨基酸序列中的一个或多个额外的突变，但已改善了与癌抗原(例如，CD19)的特异性结合。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ IDNO:32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少96、97、98或99％同一性的轻链可变域。在若干实施方案中，轻链可变域可以具有SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列中的一个或多个额外的突变(例如，出于人源化的目的)，但保留了与癌抗原(例如，CD19)的特异性结合。在若干实施方案中，轻链可变域可以具有SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列中的一个或多个额外的突变，但已改善了与癌抗原(例如，CD19)的特异性结合。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少90％同一性，并且该轻链可变域与SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少95％同一性，并且该轻链可变域与SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少96、97、98或99％同一性，并且该轻链可变域与SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少96、97、98或99％同一性。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域具有SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列，并且该轻链可变域具有SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变域包含与SEQ ID NO:32的轻链可变域序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变域包含与根据SEQ ID NO:33的重链可变域序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，轻链可变域包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与多核苷酸序列SEQ ID NO:32至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，轻链可变域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸在中等严格条件下与编码根据SEQ ID NO:32中的序列的轻链可变域的多核苷酸的补体杂交。在一些实施方案中，轻链可变域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸在严格条件下与编码根据SEQ ID NO:32中的序列的轻链可变域的多核苷酸的补体杂交。
在一些实施方案中，重链可变域包含与根据SEQ ID NO:33的序列的重链可变域序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸在中等严格条件下与编码根据SEQ ID NO:33的序列的重链可变域的多核苷酸的补体杂交。在一些实施方案中，重链可变域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸在严格条件下与编码根据SEQ ID NO:33的序列的重链可变域的多核苷酸的补体杂交。
在若干实施方案中，提供了额外的抗CD19结合构建体。例如，在若干实施方案中，提供了靶向CD19的scFv，其中该scFv包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO.35的序列。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:35中所列出的HCV域氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:35中所列出的HCV域氨基酸序列具有至少96、97、98或99％同一性的重链可变域。在若干实施方案中，重链可变域可以具有SEQ ID NO:35中所列出的HCV域氨基酸序列中的一个或多个额外的突变(例如，出于人源化的目的)，但保留了与癌抗原(例如，CD19)的特异性结合。在若干实施方案中，重链可变域可以具有SEQ ID NO:35中所列出的HCV域氨基酸序列中的一个或多个额外的突变，但已改善了与癌抗原(例如，CD19)的特异性结合。
另外，在若干实施方案中，靶向CD19的scFv包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO.36的序列。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:36中所列出的LCV域氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:36中所列出的LCV域氨基酸序列具有至少96、97、98或99％同一性的轻链可变域。在若干实施方案中，轻链可变域可以具有SEQ ID NO:36中所列出的LCV域氨基酸序列中的一个或多个额外的突变(例如，出于人源化的目的)，但保留了与癌抗原(例如，CD19)的特异性结合。在若干实施方案中，轻链可变域可以具有SEQ ID NO:36中所列出的LCV域氨基酸序列中的一个或多个额外的突变，但已改善了与癌抗原(例如，CD19)的特异性结合。
在若干实施方案中，还提供了包含轻链CDR的抗CD19结合部分，该轻链CDR包含第一、第二和第三互补决定区(分别为LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在若干实施方案中，抗CD19结合部分进一步包含重链CDR，该重链CDR包含第一、第二和第三互补决定区(分别为HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3)。在若干实施方案中，LC CDR1包含SEQ ID NO.37的序列。在若干实施方案中，LC CDR1包含与SEQ NO.37的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，LC CDR2包含SEQ ID NO.38的序列。在若干实施方案中，LC CDR2包含与SEQ NO.38的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，LC CDR3包含SEQ ID NO.39的序列。在若干实施方案中，LCCDR3包含与SEQ NO.39的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，HC CDR1包含SEQ ID NO.40的序列。在若干实施方案中，HC CDR1包含与SEQ NO.40的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，HC CDR2包含SEQ ID NO.41、42或43的序列。在若干实施方案中，HC CDR2包含与SEQ NO.41、42或43的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，HC CDR3包含SEQ ID NO.44的序列。在若干实施方案中，HCCDR3包含与SEQ NO.44的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，还提供了包含轻链可变区(VL)和重链可变区(HL)的抗CD19结合部分，该VL区包含第一、第二和第三互补决定区(分别为VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)，并且该VH区包含第一、第二和第三互补决定区(分别为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)。在若干实施方案中，VL区包含SEQ ID NO.45、46、47或48的序列。在若干实施方案中，VL区包含与SEQ NO.45、46、47或48的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，VH区包含SEQ ID NO.49、50、51或52的序列。在若干实施方案中，VH区包含与SEQ NO.49、50、51或52的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，还提供了包含轻链CDR的抗CD19结合部分，该轻链CDR包含第一、第二和第三互补决定区(分别为LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在若干实施方案中，抗CD19结合部分进一步包含重链CDR，该重链CDR包含第一、第二和第三互补决定区(分别为HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3)。在若干实施方案中，LC CDR1包含SEQ ID NO.53的序列。在若干实施方案中，LC CDR1包含与SEQ NO.53的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，LC CDR2包含SEQ ID NO.54的序列。在若干实施方案中，LC CDR2包含与SEQ NO.54的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，LC CDR3包含SEQ ID NO.55的序列。在若干实施方案中，LCCDR3包含与SEQ NO.55的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，HC CDR1包含SEQ ID NO.56的序列。在若干实施方案中，HC CDR1包含与SEQ NO.56的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，HC CDR2包含SEQ ID NO.57的序列。在若干实施方案中，HC CDR2包含与SEQ NO.57的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。在若干实施方案中，HC CDR3包含SEQ ID NO.58的序列。在若干实施方案中，HC CDR3包含与SEQNO.58的序列具有至少约85％、约90％、约95％或约98％同源性的氨基酸序列。
本领域已知额外的抗CD19结合部分，如公开在例如美国专利第8,399,645号、美国专利公告第2018/0153977号、美国专利公告第2014/0271635号、美国专利公告第2018/0251514号和美国专利公告第2018/0312588号中的那些，这些专利中的每一个的全部内容均通过引用并入本文。
结合肿瘤配体的自然杀伤组域
在若干实施方案中，工程化免疫细胞(如NK细胞)因其识别和破坏肿瘤细胞的能力而被利用。例如，工程化NK细胞可以包括CD19定向性嵌合受体或编码所述嵌合受体的核酸。NK细胞在细胞表面上表达抑制性受体和活化性受体二者。抑制性受体结合在健康细胞表面上表达的自身分子(从而防止对抗“自身”细胞的免疫应答)，而活化性受体结合在异常细胞(如肿瘤细胞)上表达的配体。当抑制性受体活化与活化性受体活化之间的平衡有利于活化性受体时，NK细胞活化发生，并且靶(例如，肿瘤)细胞被裂解。
自然杀伤组2成员D(NKG2D)是一种NK细胞活化性受体，其可识别在细胞上表达的多种配体。各种NKG2D配体的表面表达在健康细胞中通常较低，但在例如恶性转化时上调。由NKG2D识别的配体的非限制性实例包括但不限于MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6，以及在靶细胞上表达的控制NK细胞的细胞溶解或细胞毒性功能的其他分子。在若干实施方案中，T细胞工程化改造成表达细胞外域以与一种或多种肿瘤配体结合并活化T细胞。例如，在若干实施方案中，T细胞工程化改造成将NKG2D受体表达为结合剂/活化部分。在若干实施方案中，如本文所公开的工程细胞工程化改造成表达NKG2家族的另一成员，例如，NKG2A、NKG2C和/或NKG2E。在一些实施方案中，对此类受体的组合进行工程化改造。此外，在若干实施方案中，表达了其他受体，如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。
在若干实施方案中，细胞工程化改造成将包含全长NKG2D的细胞毒性受体复合物表达为细胞外组分，以识别肿瘤细胞(例如，肝细胞)表面上的配体。在一个实施方案中，全长NKG2D具有SEQ ID NO:27的核酸序列。在若干实施方案中，全长NKG2D或其功能片段是人NKG2D。
在若干实施方案中，细胞工程化改造成将包含全长NKG2D的功能片段的细胞毒性受体复合物表达为细胞外组分，以识别肿瘤细胞其他患病细胞表面上的配体。在一个实施方案中，NKG2D的功能片段具有SEQ ID NO:25的核酸序列。在若干实施方案中，NKG2D的片段与全长野生型NKG2D至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。在若干实施方案中，该片段可以具有来自SEQ ID NO:25的一个或多个额外的突变，但保留了或在一些实施方案中增强了配体结合功能。在若干实施方案中，NKG2D的功能片段包含SEQ ID NO:26的核酸序列。在若干实施方案中，NKG2D片段以二聚体、三聚体或其他多联体形式提供，此类实施方案提供增强的配体结合活性。在若干实施方案中，对编码NKG2D片段的序列任选地进行完全或部分密码子优化。在一个实施方案中，编码密码子优化的NKG2D片段的序列包含SEQ ID NO:28的序列。有利地，根据若干实施方案，功能片段缺乏其天然跨膜域或细胞内域，但保留了其结合NKG2D的配体以及在配体结合时转导活化信号的能力。此种片段的进一步优点是，表达DAP10以将NKG2D定位至细胞膜是不需要的。因此，在若干实施方案中，由本文公开的多肽编码的细胞毒性受体复合物不包含DAP10。在若干实施方案中，免疫细胞(如NK或T细胞)工程化改造表达靶向CD19和NGG2D配体的一种或多种嵌合受体。在若干实施方案中，此类细胞还共表达mbIL15。
在若干实施方案中，配置细胞毒性受体复合物以二聚化。取决于实施方案，二聚化可以包括同二聚体或异二聚体。在若干实施方案中，二聚化导致细胞毒性受体复合物(并因此表达受体的NK细胞)对配体的识别改善，从而导致不利毒性作用的减少(或缺乏)。在若干实施方案中，细胞毒性受体复合物采用内部二聚体或者一种或多种组分亚单位的重复。例如，在若干实施方案中，细胞毒性受体复合物可以任选地包含偶联至第二NKG2D细胞外域的第一NKG2D细胞外域以及跨膜/信号传导区(或单独的跨膜区连同单独的信号传导区)。
在若干实施方案中，各种域/亚域通过接头分开，如使用GS3接头(SEQ ID NO：15和16，分别为核苷酸和蛋白质)(或GSn接头)。根据本文公开的各种实施方案使用的其他接头包括但不限于由SEQ ID NO:17、19、21或23编码的那些。这提供了沿着多核苷酸分开受体复合物的各个组分部分的潜力，从而可以增强受体复合物的表达、稳定性和/或功能性。
细胞毒性信号传导复合物
本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及包括细胞毒性信号传导复合物的嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)。如本文所公开的，根据若干实施方案，所提供的细胞毒性受体复合物包含一个或多个跨膜和/或细胞内域，其在细胞外域与靶细胞表面上的配体结合时启动细胞毒性信号传导级联反应。本文公开的某些实施方案涉及嵌合抗原受体构建体，其中靶向肿瘤的域(或CD19定向性域)偶联至细胞毒性信号传导复合物。
在若干实施方案中，细胞毒性信号传导复合物包含至少一个跨膜域、至少一个共刺激域和/或至少一个信号传导域。在一些实施方案中，多于一个组分部分构成给定域，例如，共刺激域可以包含两个亚域。此外，在一些实施方案中，域可以提供多种功能，例如，跨膜域还可以用来提供信号传导功能。
跨膜域
本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及包括跨膜域的嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)。一些实施方案包括来自NKG2D或另一跨膜蛋白的跨膜域。在其中采用跨膜域的若干实施方案中，所采用的跨膜蛋白部分保留了其正常跨膜域的至少一部分。
然而，在若干实施方案中，跨膜域包含CD8的至少一部分，该CD8是一种在T细胞和NK细胞二者上正常表达的跨膜糖蛋白。在若干实施方案中，跨膜域包含CD8α。在若干实施方案中，跨膜域被称为“铰链”。在若干实施方案中，CD8α的“铰链”具有SEQ ID NO:1的核酸序列。在若干实施方案中，CD8α铰链被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:1的序列的CD8α至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，CD8α的“铰链”包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD8α可以被截短或修饰，使得其与SEQ ID NO:2的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。
在若干实施方案中，跨膜域包含CD8α跨膜区。在若干实施方案中，CD8α跨膜域具有SEQ ID NO:3的核酸序列。在若干实施方案中，CD8α铰链被截短或修饰，并且与具有SEQ IDNO:3的序列的CD8α至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，CD8α跨膜域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD8α铰链被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:4的序列的CD8α至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。
合在一起，在若干实施方案中，CD8铰链/跨膜复合物由SEQ ID NO:13的核酸序列编码。在若干实施方案中，该CD8铰链/跨膜复合物被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:13的序列的CD8铰链/跨膜复合物至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，CD8铰链/跨膜复合物包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD8铰链/跨膜复合物铰链被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:14的序列的CD8铰链/跨膜复合物至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。
在一些实施方案中，跨膜域包含CD28跨膜域或其片段。在若干实施方案中，CD28跨膜域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD28跨膜域复合物铰链被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:30的序列的CD28跨膜域至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。
共刺激域
本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及包括共刺激域的嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)。在若干实施方案中，除了各种跨膜域和信号传导域(以及组合跨膜/信号传导域)，还可以提供额外的共活化分子。例如，这些可以是某些例如进一步增强免疫细胞的活性的分子。在一些实施方案中，可以使用细胞因子。例如，使用某些白介素，如作为非限制性实例的IL-2和/或IL-15。在一些实施方案中，用于疗法的免疫细胞工程化改造成将此类分子表达为分泌型。在额外的实施方案中，此类共刺激域工程化改造膜结合的，从而充当自分泌刺激分子(或甚至充当针对所递送的相邻细胞的旁分泌刺激物)。在若干实施方案中，NK细胞工程化改造成表达膜结合的白介素15(mbIL15)。在此类实施方案中，NK上的mbIL15表达通过增强NK细胞的增殖和/或寿命来增强工程化NK细胞的细胞毒性作用。在若干实施方案中，mbIL15具有SEQ ID NO:11的核酸序列。在若干实施方案中，mbIL15可以被截短或修饰，使得其与SEQ ID NO:11的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，mbIL15包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在若干实施方案中，该mbIL15被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:12的序列的mbIL15至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。
在一些实施方案中，CD19定向性嵌合受体或工程化细胞毒性受体复合物由多核苷酸编码，该多核苷酸包括一个或多个胞质蛋白酶切割位点，例如T2A切割位点、P2A切割位点、E2A切割位点和/或F2A切割位点。此类位点被胞质蛋白酶识别并切割，这可能导致由多核苷酸编码的受体的各个组分部分的分开(和单独表达)。结果，取决于实施方案，可以在单个载体中或通过多个载体，将CD19定向性嵌合受体或工程化细胞毒性受体复合物的各个成分部分递送至NK细胞或T细胞。因此，如图中示意性所示，构建体可以由单个多核苷酸编码，而且包括切割位点，使得构建体的下游元件由细胞表达为单独的蛋白质(如在一些实施方案中使用IL-15的情况一样)。在若干实施方案中，使用T2A切割位点。在若干实施方案中，T2A切割位点具有SEQ ID NO:9的核酸序列。在若干实施方案中，T2A切割位点可以被截短或修饰，使得其与SEQ ID NO:9的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，T2A切割位点包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在若干实施方案中，该T2A切割位点被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:10的序列的T2A切割位点至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。
信号传导域
本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及包括信号传导域的嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)。例如，根据本文公开的若干实施方案工程化的免疫细胞可以包含CD3 T细胞受体复合物(或其片段)的至少一个亚单位。在若干实施方案中，信号传导域包含CD3ζ亚单位。在若干实施方案中，CD3ζ由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。在若干实施方案中，该CD3ζ可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO:7的序列的CD3ζ至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，CD3ζ域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在若干实施方案中，该CD3ζ域被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:8的序列的CD3ζ域至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。
在若干实施方案中，通过使用其活动协同作用的多个信号传导域来实现出乎意料增强的信号传导。例如，在若干实施方案中，信号传导域进一步包含OX40域。在若干实施方案中，OX40域是细胞内信号传导域。在若干实施方案中，OX40细胞内信号传导域具有SEQ IDNO:5的核酸序列。在若干实施方案中，OX40细胞内信号传导域可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO:5的序列的OX40至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，OX40细胞内信号传导域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在若干实施方案中，该OX40细胞内信号传导域被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:6的序列的OX40细胞内信号传导域至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，OX40用作构建体中唯一的跨膜/信号传导域，然而，在若干实施方案中，OX40可以与一个或多个其他域一起使用。例如，在一些实施方案中，使用OX40和CD3ζ的组合。作为进一步的实例，在一些实施方案中，使用CD28、OX40、4-1BB和/或CD3ζ的组合。
在若干实施方案中，信号传导域包含4-1BB域。在若干实施方案中，4-1BB域是细胞内信号传导域。在若干实施方案中，4-1BB细胞内信号传导域包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在若干实施方案中，该4-1BB细胞内信号传导域被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:29的序列的4-1BB细胞内信号传导域至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，4-1BB用作构建体中唯一的跨膜/信号传导域，然而，在若干实施方案中，4-1BB可以与一个或多个其他域一起使用。例如，在一些实施方案中，使用4-1BB和CD3ζ的组合。作为进一步的实例，在一些实施方案中，使用CD28、OX40、4-1BB和/或CD3ζ的组合。
在若干实施方案中，信号传导域包含CD28域。在若干实施方案中，CD28域是细胞内信号传导域。在若干实施方案中，CD28细胞内信号传导域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在若干实施方案中，该CD28细胞内信号传导域被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO:31的序列的CD28细胞内信号传导域至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同源。在若干实施方案中，CD28用作构建体中唯一的跨膜/信号传导域，然而，在若干实施方案中，CD28可以与一个或多个其他域一起使用。例如，在一些实施方案中，使用CD28和CD3ζ的组合。作为进一步的实例，在一些实施方案中，使用CD28、OX40、4-1BB和/或CD3ζ的组合。
细胞毒性受体复合物构建体
本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及包含细胞毒性受体复合物或细胞毒性受体复合物构建体的嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)。与以上所述一致，本文提供了多种细胞毒性受体复合物(也被称为细胞毒性受体)。这些复合物在免疫细胞(如T细胞和/或NK细胞)中的表达允许靶向和破坏特定的靶细胞，如癌性细胞。下文更详细地讨论此类细胞毒性受体复合物的非限制性实例。
嵌合抗原受体细胞毒性受体复合物构建体
在若干实施方案中，本文提供了多种具有嵌合抗原受体的一般结构的细胞毒性受体复合物(也被称为细胞毒性受体)。图1A、1B和2示意性地描绘了包含抗CD19部分的构建体的非限制性示意图，该抗CD19部分与在癌细胞表面上表达的肿瘤抗原或肿瘤相关联抗原结合并活化表达嵌合抗原受体的工程化细胞。如这些图所示，嵌合受体的若干实施方案包括抗CD19部分、CD8a铰链域、Ig4 SH域(或铰链)、CD8a跨膜域、CD28跨膜域、OX40域、4-1BB域、CD28域、CD3ζITAM域或亚域、CD3ζ域、NKp80域、CD16IC域、2A切割位点和膜结合的IL-15域(然而如上所述，在若干实施方案中，使用可溶性IL-15)。在若干实施方案中，结合和活化功能工程化改造由单独的域执行。若干实施方案涉及具有多于一个抗CD19部分或其他结合剂/活化部分的复合物。在一些实施方案中，除靶向CD19之外，结合剂/活化部分还靶向其他标志物，如本文描述的癌症靶标。在若干实施方案中，嵌合抗原受体构建体的一般结构包括铰链和/或跨膜域。在一些实施方案中，这些可以由单域来实现，或在若干实施方案中，可以使用多个亚域。受体复合物进一步包含信号传导域，其在归巢部分与靶细胞结合之后转导信号，最终导致对靶细胞的细胞毒性作用。在若干实施方案中，复合物进一步包含共刺激域，其在若干实施方案中协同地操作以增强信号传导域的功能。这些复合物在免疫细胞(如T细胞和/或NK细胞)中的表达允许靶向和破坏特定的靶细胞，如表达CD19的癌性细胞。一些此类受体复合物包含细胞外域，该细胞外域包含抗CD19部分或CD19结合部分，该抗CD19部分结合靶细胞表面上的CD19并且活化工程化细胞。CD3ζITAM亚域可以协同地充当信号传导域。IL-15域(例如，mbIL-15域)可以充当共刺激域。IL-15域(例如，mbIL-15域)可以使表达其的免疫细胞(例如，NK或T细胞)对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据若干实施方案，IL-15域(如mbIL-15域)可以被编码在单独的构建体上。另外，组分中的每一个都可以被编码在一个或多个单独的构建体中。在一些实施方案中，细胞毒性受体或CD19定向性受体包含与SEQ ID NO:34的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或由上述百分比中的任何两个定义的范围相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链-CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图1A，CD19-1a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NO产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链-CD8TM/OX40/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图1A，CD19-1b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/Ig4SH-CD8TM/4-1BB/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图1A，CD19-2a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、Ig4 SH域、CD8a跨膜域、4-1BB域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NO产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/Ig4SH-CD8TM/4-1BB/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图1A，CD19-2b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、Ig4 SH域、CD8a跨膜域、4-1BB域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8hinge-CD28TM/CD28/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图1A，CD19-3a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD28跨膜域、CD28域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链-CD28TM/CD28/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图1A，CD19-3b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD28跨膜域、CD28域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/Ig4SH-CD28TM/CD28/CD3ζ嵌合抗原受体复合物的(参见图1A，CD19-4a)多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、Ig4 SH域、CD28跨膜域、CD28域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/Ig4SH-CD28TM/CD28/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图1A，CD19-4b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、Ig4 SH域、CD28跨膜域、CD28域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/Ig4SH-CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图2A，CD19-5a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、Ig4 SH域、CD8a跨膜域、OX40域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/Ig4SH-CD8TM/OX40/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图2A，CD19-5b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、Ig4 SH域、CD8a跨膜域、OX40域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链-CD3αTM/CD28/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图1B，CD19-6a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD3α跨膜域、CD28域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链-CD3αTM/CD28/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图1B，CD19-6b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD3α跨膜域、CD28域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链-CD28TM/CD28/4-1BB/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图1B，CD19-7a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD28跨膜域、CD28域、4-1BB域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链-CD28TM/CD28/4-1BB/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图1B，CD19-7b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD28跨膜域、CD28域、4-1BB域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8α铰链/CD8αTM/4-1BB/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19-8a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD8a跨膜域、4-1BB域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8α铰链/CD8αTM/4-1BB/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19-8b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD8a跨膜域、4-1BB域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8α铰链/CD3TM/4-1BB/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19-39_5a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD3跨膜域、4-1BB域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8α铰链/CD3TM/4-1BB/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19-39_5b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD8a跨膜域、4-1BB域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ IDNOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8α铰链/CD3TM/4-1BB/NKp80嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19-39_6a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD3跨膜域、4-1BB域和NKp80域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8α铰链/CD3TM/4-1BB/NKp80/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19-39_6b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD8a跨膜域、4-1BB域、NKp80域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ IDNOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8α铰链/CD3TM/CD16细胞内域/4-1BB嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19-39_10a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD3跨膜域、CD16细胞内域和4-1BB域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8α铰链/CD3TM/CD16/4-1BB/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19-39_10b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD16细胞内域、4-1BB域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/NKG2D细胞外域/CD8铰链-CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19/NKG2D-1a)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、NKG2D细胞外域(全长或片段)、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/NKG2D EC域/CD8铰链-CD8TM/OX40/CD3ζ/2A/mIL-15嵌合抗原受体复合物(参见图2，CD19/NKG2D-1b)的多核苷酸。该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19部分、NKG2D细胞外域(全长或片段)、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40域、CD3ζ域、2A切割位点和mIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由包含从本文公开的序列的组合获得的序列的核酸分子编码，或包含从本文公开的序列的组合获得的氨基酸序列。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含根据如本文所描述的一个或多个SEQ ID NOS的序列，如作为成分部分的实例包括在本文中的那些。在若干实施方案中，该编码核酸序列或该氨基酸序列包含与从如本文所描述的组合一个或多个SEQ ID NOS产生的序列共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/4-1BB/CD3ζ/mbIL15嵌合抗原受体复合物(参见图3A，NK19)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、4-1BB域和CD3ζ域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:85的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:85共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:86共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中示意性地描绘和使用，提供了缺乏mbIL15域的NK19构建体(图3A，NK19 opt.)
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3A，NK19-1a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3A，NK19-1b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:59的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:59共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:60共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD28TM/CD28/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3A，NK19-2a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD28跨膜域、CD28信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3A，NK19-2b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD28跨膜域、CD28信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:61的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:61共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQID NO:62共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/ICOS/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3A，NK19-3a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、可诱导共刺激分子(ICOS)信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3A，NK19-3b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、可诱导共刺激分子(ICOS)信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:63的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:63共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:64共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD28/4-1BB/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3A，NK19-4a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD28信号传导域、4-1BB信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3A，NK19-4b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD28信号传导域、4-1BB信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:65的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:65共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:66共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/NKG2DTM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3B，NK19-5a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、NKG2D跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3B，NK19-5b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、NKG2D跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:67的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:67共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQID NO:68共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3B，NK19-6a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv可变重链、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD40信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3B，NK19-6b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv可变重链、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:69的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:69共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:70共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/OX40/CD3ζ/2A/EGFRt嵌合抗原受体复合物(参见图3B，NK19-7a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和表皮生长因子受体(EGFRt)的截短版本。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3B，NK19-7b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点、表皮生长因子受体(EGFRt)的截短版本、额外的2A切割位点以及mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:71的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:71共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:72共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3B，NK19-8a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv可变轻链、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD40信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3B，NK19-7b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv可变轻链、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:73的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:73共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:74共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3B，NK19-8a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv可变轻链、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD40信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3B，NK19-7b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv可变轻链、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:73的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:73共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:74共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD27/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3C，NK19-9a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD27信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3C，NK19-9b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD27信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:75的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:75共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQID NO:76共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD70/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3C，NK19-10a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD70信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3C，NK19-10b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD70信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:77的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:77共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQID NO:78共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD161/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3C，NK19-11a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD161信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3C，NK19-11b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD161信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:79的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:79共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQID NO:80共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD40L/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3C，NK19-12a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD40L信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3C，NK19-12b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD40L信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:81的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:81共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQID NO:82共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD44/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3C，NK19-13)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD44信号传导域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3C，NK19-13b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD44信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:83的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:83共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQID NO:84共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CD19 scFv不包含Flag标签。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3D，NK19H-1a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第一人源化重链(L1/H1)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3D，NK19H-1b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第一人源化重链(L1/H1)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:160的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:160共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:161共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3D，NK19H-2a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第一人源化重链(L2/H1)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3D，NK19H-2b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第一人源化重链(L2/H1)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:162的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:162共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:162共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3D，NK19H-3a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第一人源化重链(L3/H1)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3D，NK19H-3b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第一人源化重链(L3/H1)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:164的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:164共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:165共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3D，NK19H-4a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第二人源化重链(L1/H2)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3D，NK19H-4b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第二人源化重链(L1/H2)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:166的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:166共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:167共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3E，NK19H-5a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第二人源化重链(L2/H2)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3E，NK19H-5b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第二人源化重链(L2/H2)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:168的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:168共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:169共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3E，NK19H-6a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第二人源化重链(L3/H2)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3E，NK19H-6b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第二人源化重链(L3/H2)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:170的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:170共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:171共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3E，NK19H-7a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第三人源化重链(L1/H3)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3E，NK19H-7b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点、表皮生长因子受体(EGFRt)的截短版本、额外的2A切割位点以及mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第三人源化重链(L1/H3)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:172的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:172共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:174共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3E，NK19H-8a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第三人源化重链(L2/H3)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3E，NKH19-8b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第三人源化重链(L2/H3)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:174的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:174共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:175共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3E，NK19H-9a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第三人源化重链(L3/H3)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3E，NKH19-9b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第三人源化重链(L3/H3)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:176的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:176共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:177共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3E，NKH19-10a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第四人源化重链(L1/H4)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3E，NK19H-10b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第四人源化重链(L1/H4)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:178的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:178共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:179共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3F，NK19H-11a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第四人源化重链(L2/H4)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3F，NK19H-11b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第四人源化重链(L2/H4)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:180的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:180共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:181共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3F，NK19H-12a)的多核苷酸。该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第四人源化重链(L3/H4)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3F，NK19H-12b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第四人源化重链(L3/H4)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:182的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:182共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:183共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含Flag标签人源化抗CD19部分和多个共刺激域。例如，示意性架构是抗CD19部分/跨膜域/共刺激域1/共刺激域2/共刺激域3/信号传导域。取决于实施方案，共刺激域按顺序变化。例如，在若干实施方案中，共刺激域(“CSD”)可以如下定位：CSD1/CSD2、CSD2/CSD1、CSD1/CSD2/CSD3、CSD1/CSD2/CSD3、CSD3/CSD2/CSD1等。在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD44/OX40/CD27/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3F，NK19H-13a)的多核苷酸。该多核苷酸包含已经过人源化改造的抗CD19 scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD44共刺激域、OX40共刺激域、CD27共刺激域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3F，NK19H-13b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含已经过人源化改造的抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD44共刺激域、OX40共刺激域、CD27共刺激域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3G，NK19H-NF-1a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第一人源化重链(L1/H1)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3G，NK19H-NF-1b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第一人源化重链(L1/H1)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:184的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:184共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:185共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3G，NK19H—NF-2a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第一人源化重链(L2/H1)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3G，NK19H-NF-2b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第一人源化重链(L2/H1)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ IDNO:186的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:186共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:187共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3G，NK19H-NF-3a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第一人源化重链(L3/H1)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3G，NK19H-NF-3b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第一人源化重链(L3/H1)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ IDNO:188的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:188共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:189共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3G，NK19H-NF-4a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第二人源化重链(L1/H2)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3G，NK19H-NF-4b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第二人源化重链(L1/H2)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ IDNO:190的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:190共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:191共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3H，NK19H-NF-5a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第二人源化重链(L2/H2)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3H，NK19H-NF-5b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第二人源化重链(L2/H2)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:192的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:192共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:193共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3H，NK19H-NF-6a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第二人源化重链(L3/H2)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3H，NK19H-NF-6b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第二人源化重链(L3/H2)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:194的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:194共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:195共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3G，NK19H-NF-7a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第三人源化重链(L1/H3)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3H，NK19H-NF-7b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第三人源化重链(L1/H3)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:196的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:196共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:197共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3H，NK19H-NF-8a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第三人源化重链(L2/H3)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3H，NKH19-NF-8b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv可变轻链、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv可变轻链已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第三人源化重链(L2/H3)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:198的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:198共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:199共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3H，NK19H-NF-9a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第三人源化重链(L3/H3)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3H，NKH19-NF-9b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第三人源化重链(L3/H3)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ IDNO:200的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:200共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:201共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3H，NKH19-NF-10a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第四人源化重链(L1/H4)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3H，NK19H-NF-10b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第一人源化轻链和第四人源化重链(L1/H4)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ IDNO:202的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:202共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:203共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3I，NK19H-NF-11a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第四人源化重链(L2/H4)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3I，NK19H-NF-11b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第二人源化轻链和第四人源化重链(L2/H4)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ IDNO:204的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:204共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:205共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8TM/OX40/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3I，NK19H-12a)的多核苷酸。该多核苷酸包含以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域和CD3ζ域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第四人源化重链(L3/H4)。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3I，NK19H-NF-12b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含如本文所描述的以下各项或由其构成：抗CD19 scFv、CD8a铰链、CD8a跨膜域、OX40信号传导域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域，该抗CD19 scFv已经过人源化改造并包含第三人源化轻链和第四人源化重链(L3/H4)。在若干实施方案中，这种受体复合物由具有SEQ ID NO:206的序列的核酸分子编码。在若干实施方案中，编码NK19嵌合抗原受体的核酸序列包含与SEQ ID NO:206共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的序列。在若干实施方案中，嵌合受体包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列。在若干实施方案中，NK19嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:207共享至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性、同源性和/或功能等效性的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了编码嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含Flag标签人源化抗CD19部分和多个共刺激域。例如，示意性架构是抗CD19部分/跨膜域/共刺激域1/共刺激域2/共刺激域3/信号传导域。取决于实施方案，共刺激域按顺序变化。例如，在若干实施方案中，共刺激域(“CSD”)可以如下定位：CSD1/CSD2、CSD2/CSD1、CSD1/CSD2/CSD3、CSD1/CSD2/CSD3、CSD3/CSD2/CSD1等。在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD44/OX40/CD27/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3I，NK19H-NF-13a)的多核苷酸。该多核苷酸包含已经过人源化改造的抗CD19 scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD44共刺激域、OX40共刺激域、CD27共刺激域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3I，NK19H-NF-13b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含已经过人源化改造的抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD44共刺激域、OX40共刺激域、CD27共刺激域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。
在若干实施方案中，提供了编码嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含Flag标签人源化抗CD19部分和多个共刺激域。例如，示意性架构是抗CD19部分/跨膜域/共刺激域1/共刺激域2/共刺激域3/信号传导域。取决于实施方案，共刺激域按顺序变化。例如，在若干实施方案中，共刺激域(“CSD”)可以如下定位：CSD1/CSD2、CSD2/CSD1、CSD1/CSD2/CSD3、CSD1/CSD2/CSD3、CSD3/CSD2/CSD1等。在若干实施方案中，提供了编码Flag标签人源化抗CD19部分/CD8铰链/CD8aTM/CD44/OX40/CD27/CD3ζ嵌合抗原受体复合物(参见图3F，NK19H-13a)的多核苷酸。该多核苷酸包含已经过人源化改造的抗CD19 scFv或由其构成，并且包含Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD44共刺激域、OX40共刺激域、CD27共刺激域和CD3ζ域。在若干实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含mbIL15(参见图3F，NK19H-13b)。在此类实施方案中，该多核苷酸包含已经过人源化改造的抗CD19 scFv或由其构成，并且包含如本文所描述的Flag标签、CD8a铰链、CD8a跨膜域、CD44共刺激域、OX40共刺激域、CD27共刺激域、CD3ζ域、2A切割位点和mbIL-15域。
应当理解，对于本文描述的任何受体构建体，由于例如克隆(例如，用于创建限制位点)的容易性或效率，因此当组合序列时，可能会导致所公开序列的某些序列可变性、延伸和/或截短。
治疗方法
一些实施方案涉及用包含嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)的细胞或免疫细胞来治疗、改善、抑制或预防癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括治疗或预防癌症。在一些实施方案中，该方法包括施用治疗有效量的表达如本文所描述的CD19定向性嵌合受体的免疫细胞。本文描述了可以如此治疗的癌症类型的实例。
在某些实施方案中，用本文描述的基因工程化细胞治疗受试者实现了以下效果中的一种、两种、三种、四种或更多种，这些效果包括例如：(i)减少或改善疾病或与其相关联的症状的严重程度；(ii)减少与疾病相关联的症状的持续时间；(iii)防止疾病或与其相关联的症状的进展；(iv)疾病或与其相关联的症状的消退；(v)防止与疾病相关联的症状的发展或发作；(vi)防止与疾病相关联的症状的复发；(vii)减少受试者的住院治疗；(viii)减少住院治疗时长；(ix)增加患有疾病的受试者的存活率；(x)减少与疾病相关联的症状的数目；(xi)增强、改善、补充、互补或增大另一疗法的预防性或治疗性效果。可以通过多种途径施用，包括但不限于静脉内、动脉内、皮下、肌内、肝内、腹膜内和/或局部递送至受影响组织。
施用和给药
本文进一步提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包含将包含工程化改造表达如本文所公开的细胞毒性受体复合物的免疫细胞(例如NK和/或T细胞)的组合物施用于受试者。例如，本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及CD19定向性嵌合受体或表达CD19定向性嵌合受体的细胞用于治疗癌症患者的用途。还提供了此类工程化免疫细胞用于治疗癌症的用途。
在某些实施方案中，用本文描述的基因工程化细胞治疗受试者实现了以下效果中的一种、两种、三种、四种或更多种，这些效果包括例如：(i)减少或改善疾病或与其相关联的症状的严重程度；(ii)减少与疾病相关联的症状的持续时间；(iii)防止疾病或与其相关联的症状的进展；(iv)疾病或与其相关联的症状的消退；(v)防止与疾病相关联的症状的发展或发作；(vi)防止与疾病相关联的症状的复发；(vii)减少受试者的住院治疗；(viii)减少住院治疗时长；(ix)增加患有疾病的受试者的存活率；(x)减少与疾病相关联的症状的数目；(xi)增强、改善、补充、互补或增大另一疗法的预防性或治疗性效果。这些比较中的每一个都相对于例如针对疾病的不同疗法，其包括针对疾病的基于细胞的免疫疗法，该免疫疗法使用不表达本文公开的构建体的细胞。
可以通过多种途径施用，包括但不限于静脉内、动脉内、皮下、肌内、肝内、腹膜内和/或局部递送至受影响组织。对于给定的受试者，基于其体重、疾病类型和状态以及期望的治疗攻击性，可以容易地确定免疫细胞(如NK和/或T细胞)的剂量，但范围取决于实施方案，从每kg约105个细胞至每kg约1012个细胞(例如，105-107、107-1010、1010-1012和其中的重叠范围)。在一个实施方案中，使用剂量递增方案。在若干实施方案中，施用一定范围的免疫细胞(如NK和/或T细胞)，例如在约1x106个细胞/kg至约1x108个细胞/kg之间。在若干实施方案中，剂量范围为约2x105个细胞/kg至约2x108个细胞/kg，包括约2x106和2x107个细胞/kg。在若干实施方案中，剂量由给药时活工程化细胞的最大数目来确定。例如，在一些实施方案中，单一剂量包含最大数约2x105至约2x109个活工程化细胞，包括约2x106、约2x107或约2x108个活工程化细胞。取决于实施方案，可以治疗各种类型的癌症。在若干实施方案中，治疗肝细胞性肝癌。本文提供的额外实施方案包括治疗或预防癌症的以下非限制性实例，其包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、肾上腺皮质癌、卡波西(kaposi)肉瘤、淋巴瘤、胃肠癌、阑尾癌、中枢神经系统癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(包括但不限于星形细胞瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓质上皮瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性疾病、导管癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛细胞白血病、肾细胞癌、白血病、口腔癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、(NSCLC)和小细胞肺癌)、胰腺癌、肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤、眼癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、垂体癌、子宫癌和阴道癌。
在一些实施方案中，本文还提供了核酸和氨基酸序列，该核酸和氨基酸序列与SEQID NOS.1-207(或SEQ ID NOS:1-207中的两个或更多个的组合)的相应核酸或氨基酸序列相比，具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％(以及其中的范围)的序列同一性或同源性，并且与相应的SEQ ID NOS.1-207(或SEQ ID NOS:1-207中的两个或更多个的组合)相比，还表现出以下功能中的一个或多个，这些功能包括但不限于：(i)增强增殖；(ii)增强活化；(iii)增强对抗提供配体的细胞的细胞毒性活性，该配体与含有由核酸和氨基酸序列编码的受体的NK细胞结合；(iv)增强对肿瘤或感染位点的归巢；(v)减少偏离靶标的细胞毒性效应；(vi)增强免疫刺激性细胞因子和趋化因子(包括但不限于IFNg、TNFa、IL-22、CCL3、CCL4和CCL5)的分泌；(vii)增强刺激进一步先天性和适应性免疫应答的能力；以及(viii)其组合。
另外，在若干实施方案中，提供了对应于本文公开的任何核酸的氨基酸序列，同时考虑了核酸密码的简并性。此外，与本文明确公开的序列不同但具有功能类似性或等效性的那些序列(无论是核酸还是氨基酸)也被考虑在本公开的范围内。前述包括突变体、截短、替换或其他类型的修饰。
在若干实施方案中，编码所公开的细胞毒性受体复合物或CD19定向性嵌合受体的多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接至用于表达细胞毒性受体复合物的至少一个调控元件。
根据若干实施方案，另外提供了包含编码本文提供的任何多核苷酸的多核苷酸的载体，其中该多核苷酸任选地可操作地连接至用于表达细胞毒性受体复合物的至少一个调控元件。在若干实施方案中，载体是逆转录病毒。
本文进一步提供了包含如本文所公开的多核苷酸、载体或细胞毒性受体复合物的工程化免疫细胞(如NK和/或T细胞)。本文进一步提供了包含工程化免疫细胞(如NK细胞和/或工程化T细胞)的混合物的组合物，每个群体包含如本文所公开的多核苷酸、载体或细胞毒性受体复合物。
对于给定的受试者，基于其体重、疾病类型和状态以及期望的治疗攻击性，可以容易地确定免疫细胞(如NK细胞或T细胞)的剂量，但范围取决于实施方案，从每kg约105个细胞至每kg约1012个细胞(例如，105-107、107-1010、1010-1012和其中的重叠范围)。在一个实施方案中，使用剂量递增方案。在若干实施方案中，施用一定范围的NK细胞，例如在约1x106个细胞/kg至约1x108个细胞/kg之间。取决于实施方案，可以治疗各种类型的癌症或感染性疾病。
癌症类型
本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及将包含嵌合受体(如CD19定向性嵌合受体)的免疫细胞施用于患有癌症的受试者。本文提供的各种实施方案包括治疗或预防癌症的以下非限制性实例。癌症的实例包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、淋巴瘤、胃肠癌、阑尾癌、中枢神经系统癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(包括但不限于星形细胞瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓质上皮瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性疾病、导管癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛细胞白血病、肾细胞癌、白血病、口腔癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、(NSCLC)和小细胞肺癌)、胰腺癌、肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤、眼癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、垂体癌、子宫癌和阴道癌。
癌症靶标
本文描述的组合物和方法的一些实施方案涉及包含靶向癌抗原的嵌合受体的免疫细胞。靶抗原的非限制性实例包括：CD5、CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(也被称为CD2子集1、CRAC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变异体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAca-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关联糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚单位α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α(FRa或FR1)；叶酸受体β(FRb)；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关联(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶(Prostase)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；延长因子2突变(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚单位，Beta型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)(bcr-abl)组成的致癌基因融合蛋白；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；唾液酸化Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关联抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放读码框架61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(globoH glycoceramide，GloboH)的多聚己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白(uroplakin)2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代阅读框架蛋白(TARP)；Wilms肿瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ES0-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-la)；黑色素瘤相关联抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变同种异体6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌症睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺素(prostein)；存活素；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳糖凝集素8)、由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶；逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断裂点；黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因成神经细胞瘤源性同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 IB 1(CYPIB1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断裂点2(SSX2)；高级糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾普遍存在物(ubiquitous)1(RU1)；肾普遍存在物2(RU2)；豆荚蛋白(legumain)；人乳头瘤病毒E6(HPVE6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠道羧基酯酶；热休克蛋白70-2突变(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关联免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLLl)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸化Lewis抗原)；岩藻糖基-GMl、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、ILl 1Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLll、TCRγ-Δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Timl-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-Δ链、FITC、促黄体激素受体(LHR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、促性腺激素受体(CGHR或GR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、鸟苷酸环化酶C(GCC)、针对桥粒芯蛋白3(Dsg3)的自身抗体、针对桥粒芯蛋白1(Dsgl)的自身抗体、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、密封蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2))、P-糖蛋白、STEAP1、Livl、粘连蛋白-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低电导率氯离子通道以及由TNT抗体识别的抗原。
另外，在若干实施方案中，提供了表达CD19定向性嵌合抗原受体的免疫细胞，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域，该VH域包含与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少95％同一性的VH域，该VL域与SEQ ID NO：32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少95％同一性；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，其中该细胞内信号域包含OX40亚域，并且其中该细胞还表达膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，细胞内信号传导域进一步包含CD3ζ亚域。在若干实施方案中，OX40亚域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且CD3ζ亚域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在若干实施方案中，铰链域包含CD8a铰链域。在若干实施方案中，CD8a铰链域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在若干实施方案中，mbIL15包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列。在若干实施方案中，嵌合受体进一步包含NKG2D受体的细胞外域。在若干实施方案中，NKG2D受体的细胞外域包含NKG2D的功能片段，该功能片段包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在若干实施方案中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在若干实施方案中，免疫细胞是T细胞。在若干实施方案中，在治疗癌症的方法中将此类免疫细胞施用于受试者，或以其它方式将此类免疫细胞用于治疗癌症，如在制备用于治疗癌症的药物中使用。在若干实施方案中，癌症是急性淋巴细胞白血病。
在若干实施方案中，提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域，该VH域与SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列具有至少95％同一性，该VL域与SEQ ID NO：32中所列出的VL域氨基酸序列具有至少95％同一性；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，其中该细胞内信号域包含OX40亚域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，细胞内信号传导域进一步包含CD3ζ亚域。在若干实施方案中，编码的OX40亚域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且经编码的CD3ζ亚域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在若干实施方案中，铰链域包含CD8a铰链域，并且包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在若干实施方案中，经编码的mbIL15包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在若干实施方案中，嵌合受体进一步包含NKG2D受体的细胞外域。在若干实施方案中，经编码的NKG2D受体细胞外域包含NKG2D的功能片段，该功能片段包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
还提供了表达CD19定向性嵌合受体的免疫细胞，该嵌合受体包含细胞外抗CD19部分、铰链和/或跨膜域以及细胞内信号传导域。在若干实施方案中，免疫细胞是NK细胞。在若干实施方案中，免疫细胞是T细胞。在若干实施方案中，铰链域包含CD8a铰链域或Ig4 SH域。在若干实施方案中，跨膜域包含CD8a跨膜域、CD28跨膜域和/或CD3跨膜域。在若干实施方案中，信号传导域包含OX40信号传导域、4-1BB信号传导域、CD28信号传导域、NKp80信号传导域、CD16 IC信号传导域、CD3ζ或CD3ζITAM信号传导域和/或mIL-15信号传导域。在若干实施方案中，信号传导域包含2A切割域。在若干实施方案中，通过2A切割域将mIL-15信号传导域与CD19定向性嵌合受体的其余或另一部分分开。在若干实施方案中，将此类免疫细胞施用于患有癌症的受试者，以便治疗、抑制癌症或预防癌症的进展。
本文还提供了表达CD19定向性嵌合抗原受体的工程化NK或T细胞，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域，该VH域包含由SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列的人源化产生的VH域，该VL域包含由SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列的人源化产生的VL域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，其中该细胞内信号域包含OX40亚域，并且其中该细胞还表达膜结合的白介素-15(mbIL15)。
本文提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域，该VH域包含由SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列的人源化产生的VH域，该VL域包含由SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列的人源化产生的VL域；铰链和/或跨膜域；
细胞内信号传导域，其中该细胞内信号域包含OX40亚域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。
本文提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含scFv；铰链，其中该铰链是CD8α铰链；跨膜域；以及细胞内信号传导域，其中该细胞内信号传导域包含CD3ζITAM。在若干实施方案中，跨膜域包含CD8α跨膜域、NKG2D跨膜域和/或CD28跨膜域。在若干实施方案中细胞内信号传导域包含CD28信号传导域、4-1BB信号传导域和/或OX40域。在若干实施方案中，细胞内信号传导域还可以包含选自ICOS、CD70、CD161、CD40L、CD44及其组合的域。
本文提供了编码CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含scFv的可变重链或scFv的可变轻链；铰链，其中该铰链是CD8α铰链；跨膜域，其中该跨膜域包含CD8α跨膜域；以及细胞内信号传导域，其中该细胞内信号传导域包含CD3ζITAM。在若干实施方案中，多核苷酸还编码被截短的表皮生长因子受体(EGFRt)。在若干实施方案中，多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。本文提供了表达此种CD19定向性嵌合抗原的工程化NK或T细胞，以及通过施用此种NK细胞或T细胞来治疗癌症的方法。还提供了此类多核苷酸在治疗癌症中的用途，例如，在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
还提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域，该VH域包含选自SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123的VH域，该VL域包含选自SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119的VL域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含OX40亚域、CD28亚域、iCOS亚域、CD28-41BB亚域、CD27亚域、CD44亚域或其组合。在若干实施方案中，嵌合抗原受体包含铰链和跨膜域，其中该铰链是CD8α铰链，其中该跨膜域是CD8α或NKG2D跨膜域。在若干实施方案中，细胞内信号传导域包含CD3ζ域。
本文提供了编码人源化嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，其中该CAR包含：单链抗体或单链抗体片段，其包含人源化抗CD19结合域；跨膜域；初级性细胞内信号传导域，其包含CD3ζ或其功能片段的天然性细胞内信号传导域；以及共刺激域，其包含选自下组的蛋白质的天然性细胞内信号传导域，该组由以下各项组成：OX40、CD27、CD28、ICOS和4-1BB或其功能片段，其中所述抗CD19结合域包含SEQ ID NO:124、127或130的轻链互补决定区1(LCCDR1)、SEQ ID NO:125、128或131的轻链互补决定区2(LC CDR2)和SEQ ID NO:126、129或132的轻链互补决定区3(LC CDR3)以及SEQ ID NO:133、136、139或142的重链互补决定区1(HC CDR1)、SEQ ID NO:134、137、140或143的重链互补决定区2(HC CDR2)和SEQ ID NO:135、138、141或144的重链互补决定区3(HC CDR3)。在若干实施方案中，多核苷酸进一步包含编码膜结合的白介素15(mbIL15)的区域。
本文提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQ ID NO:117的可变轻链(VL)域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:191、SEQID NO:197或SEQ ID NO:203的人源化嵌合抗原受体。
提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQID NO:118的可变轻链(VL)域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:193、SEQ IDNO:199或SEQ ID NO:205的人源化嵌合抗原受体。
提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQID NO:119的可变轻链(VL)域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:195、SEQ IDNO:201或SEQ ID NO:207的人源化嵌合抗原受体。
提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQID NO:120的可变重链(VH)域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187或SEQ ID NO:189的人源化嵌合抗原受体。
提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQID NO:121的可变重链(VH)域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193或SEQ ID NO:195的人源化嵌合抗原受体。
提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQID NO:122的可变重链(VH)域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:201的人源化嵌合抗原受体。
提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分，其中该抗CD19结合部分包含人源化scFv序列，该序列包含SEQID NO:123的可变重链(VH)域；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。在若干实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:207的人源化嵌合抗原受体。
在若干实施方案中，所提供的多核苷酸不编码SEQ ID NO:112、113、114或116。
提供了编码人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含：细胞外抗CD19结合部分；铰链和/或跨膜域；细胞内信号传导域，并且其中该多核苷酸还编码膜结合白介素-15(mbIL15)，并且其中该多核苷酸选自由与SEQ ID NO:184、SEQ IDNO:186、SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:200具有至少95％同一性的多核苷酸组成的组。在若干实施方案中，多核苷酸具有SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:192或SEQ IDNO:200的序列。在若干实施方案中，提供了表达此种人源化的CD19定向性嵌合抗原受体的工程化NK或T细胞。还提供了在受试者中治疗癌症的方法，该方法包含将此类工程化NK或T细胞施用于患有癌症的受试者。还提供了此类多核苷酸在治疗癌症中的用途，如在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
实施例
本文公开的材料和方法是根据本文公开的某些实施方案采用的非限制性实施例。
根据若干实施方案，将NK细胞从外周血单个核细胞分离出来，并且通过使用饲养细胞系进行扩增。如下文更详细地讨论的，在若干实施方案中，饲养细胞工程化改造成表达某些刺激分子(例如白介素、CD3、4-1BBL等)，以促进免疫细胞扩增和活化。工程化饲养细胞公开在例如国际专利申请PCT/SG2018/050138中，该专利通过引用以其整体并入本文。在若干实施方案中，例如在定义的时间下并以特定的量，将刺激分子(如白介素12、18和/或21)单独地添加至共培养基中，以使免疫细胞的期望亚群体的扩增增强。
将从PBMC中分离出来的NK细胞与表达膜结合的IL15和4-1BBL的K562细胞进行共培养，其中培养基补充有IL2。对于一组工程化NK细胞，它们在培养基中进行扩增，该培养基补充(在第0天)有可溶性IL12和可溶性IL18的组合。在第4天，用额外的可溶性IL12可溶性IL18更新该培养基。关于此类培养方法的实施方案的额外细节公开在2019年7月31日提交的美国临时专利申请第62/881311号中，并且该申请通过引用以其整体并入本文。在第7天，用CD19定向性嵌合受体构建体进行病毒性转导。在总培养时间的第14天或更多天，对所得工程化NK细胞进行评价。
实施例1
图5描绘了用于评价根据本文公开的方法生成的工程化NK细胞的抗肿瘤功效的示意性实验模型。在第0天，对NOD-scid IL2Rγnull小鼠静脉内施用2x105个Nalm6细胞(B细胞前体白血病细胞系)。在第4天，一组小鼠接受2.7x107个表达NK19 CAR(参见图3A，然而应理解，可以使用其他CD19定向性嵌合受体)的NK细胞，而另一组接受已使用可溶性IL12/IL18扩增的NK细胞(鉴定为NK19-IL12/18细胞)。通过在第3、7、11、18和25天进行的荧光成像来评估白血病肿瘤负荷。图6A示出了第3、7、11和18天的成像结果。可以看到，相比于接受作为对照的非转导NK细胞或PBS的小鼠，接受NK19或NK19 IL12/18的小鼠的肿瘤负荷显著较小。图6B以线形图的形式示出了成像数据的汇总(通量(光子/秒)值越大，指示荧光信号检测越多以及肿瘤负担越大)。早在注射Nalm6白血病细胞后第7天，NK19和NK19 IL12/18组二者的肿瘤负荷就较小。这种差异在第11天甚至更为明显，此时PBS和NT Nk细胞组表现出大量的肿瘤生长。甚至远到第18天，此时PBS和NT NK组中的肿瘤负荷是广泛的，NK19和NK19 IL12/18组示出了小得多的肿瘤负荷。出乎意料地，相比于接受NK19构建体的组，NK19 IL12/18组示出了较小的肿瘤负担。这是令人惊讶的，不仅因为NK19细胞在预防白血病细胞生长方面相当有效，以至于这种效果的进一步增强是出乎意料的，而且因为上游的扩增细胞方法不仅影响了细胞数目本身，而且还影响了那些扩增细胞的活性水平。
实施例2
进行实验以确定CAR中所采用的给定刺激域(也称为共刺激域，这是考虑到许多构建体采用呈串联、三联体或其他多重方式的多个“信号传导”域)是否影响表达(以及活性)。通过用编码图3A至3C中所描绘的各种CAR的病毒进行转导来生成NK细胞(然而在若干实施方案中使用其他的构建体)。作为非限制性实例，NK细胞是通过用双顺反子病毒进行转导所生成的细胞，该双顺反子病毒编码抗CD19 scFv、细胞内OX40共刺激域、CD3ζ信号传导域以及支持细胞存活和增殖延长的膜结合的IL-15(参见NK19，图3A)。以类似的方式将所测试的其他CAR构建体(NK19-1、2、3、4、5、8、9、10、11、12以及NK19-13)转导至NK细胞中。应当理解，在若干实施方案中，对于那些采用Flag域来确定表达的构建体，提供了不包括Flag(或其他标签域)的类似构建体。
图7汇总了NK19-1至NK5以及NK8至NK19-13的表达数据，如通过CD19Flag的检测所证明的。数据呈现为表达CD19-Flag的NK细胞相对于所呈现的NK细胞的总数目的百分比。在用编码NK19-“X”CAR的相关病毒转导后第4天收集数据。如通过表达数据所证明的，所有构建体均由至少55％的NK细胞表达。事实上，对于生成数据的11种构建体中的8种，在NK细胞总数目的大约75％或更多中检测到表达，其中若干种构建体以超过80％的效率表达。这种表达数据指示，根据若干实施方案，特定刺激域的选择可以使NK细胞更有效地表达CAR。在若干实施方案中，这是有利的，因为给定NK细胞制剂的较大部分在临床上是有用的(例如，生成临床相关的工程化NK细胞剂量所需的输入NK细胞较少)。
如本文所讨论，可以在靶向CD19(或其他肿瘤标志物)的嵌合抗原受体中采用各种共刺激域。图8A描绘了与使用各种共刺激域靶向CD19的CAR的表达相关的数据。作为非限制性实例，共刺激域可以包括但不限于OX40、CD28、iCOS、CD28/41BB、CS27和CD44)。图8A示出了平均荧光强度数据，其表示NK细胞对所指示CAR构建体的表达。如通过针对GFP对照检测到的低MFI所证明的，这些数据指示，这些构建体(a)由NK细胞表达，并且(b)由NK细胞在转导后4周内相对稳定地表达。图8B示出了具有所指示共刺激域的CAR的表达效率。虽然表达效率存在一些变化，效率范围从约60％至约80％，但具有所指示共刺激域的CAR中的每一个表达良好，并且还在至少4周内相对一致地表达。
关于表达采用各种共刺激域的CD19定向性CAR的NK细胞的细胞毒性功效，该数据示出在图9A至9F中。将培养的Nalm6或Raji细胞暴露于表达所指示NK19构建体的工程化NK细胞，并且进行共培养达所指示数目的暴露于表达NK19-X的NK细胞的天数(X轴表示天数)。图9A示出了在来自第一供体的NK细胞用所指示构建体转导后第7天，所指示构建体对抗Nalm6细胞的细胞毒性作用。对于本实验，效应细胞与靶细胞的比率为1:1。如迹线所示，NK19-10、NK19-8、NK-1911、NK19-5和NK19-12中的每一种都允许检测到的Nalm6细胞的数目增加，与作为对照的仅表达GFP的NK细胞的数目相当。然而，NK19-3、NK19-9、NK19-4、NK19-13、NK19-1和NK19-2中的每一种都示出了显著较少的Nalm6细胞数目增加(例如，更大的细胞毒性)。在若干实施方案中，此类构建体因此在NK细胞中表达，并且用于治疗B细胞白血病(或其他肿瘤类型)。在若干实施方案中，来自构建体之一的刺激域中的一个或多个工程化改造到具有不同刺激域的另一构建体中，这有利地导致协同信号传导以及进一步增强的细胞毒性。作为非限制性实例，在若干实施方案中，具有OX40刺激域的NK19-1构建体进一步工程化改造成除OX40之外还表达CD44刺激域。作为进一步的非限制性实例，在若干实施方案中，具有OX40刺激域的NK19-1构建体进一步工程化改造成除OX40之外还表达CD44刺激域和CD17刺激域。
图9B示出了来自第二供体的工程化NK细胞在转导后第7天对抗Raji B细胞白血病细胞的相应细胞毒性数据。此处，效应细胞与靶细胞的比率也为1:1。如所示，类似于对抗Nalm6细胞的工程化构建体活性，若干构建体允许Raji细胞计数增加。然而，NK19-13、NK19-4、NK19-2、NK19-3、NK19-1和NK19-9中的每一种都在很大程度上阻止了Raji细胞生长，其中若干构建体几乎没有导致Raji细胞的生长。在若干实施方案中，此类构建体因此在NK细胞中表达，并且用于治疗B细胞白血病(或其他肿瘤类型)。
图9C示出了来自供体1的NK细胞在转导后第14天对抗Nalm6细胞的数据。效应细胞与靶细胞的比率为1:1。如所示，甚至在转导后两周，表达NK19-13、NK19-4、NK19-3、NK19-2、NK19-1和NK19-9的NK细胞几乎阻止了所有Nalm6细胞生长，这指示它们对抗肿瘤细胞的高度细胞毒性作用。在若干实施方案中，此类构建体因此在NK细胞中表达，并且用于治疗B细胞白血病(或其他肿瘤类型)。如上文所讨论的，在若干实施方案中，生成采用两个、三个或更多个刺激域的组合的构建体，从而导致协同的NK细胞刺激和增强的细胞毒性。
图9D示出了来自供体2的NK细胞在转导后14天对抗Raji细胞的数据。效应细胞与靶细胞的比率为1:2。如所示，表达GFP的NK细胞仅允许Raji细胞生长，与未经处理的Raji细胞基本相同。与此相反，表达NK19-3、NK19-1、NK19-4、NK19-13、NK19-2和NK19-9中的每一种的NK细胞显著减缓了Raji细胞生长，其中若干构建体几乎不允许Raji细胞生长。在若干实施方案中，此类构建体因此在NK细胞中表达，并且用于治疗B细胞白血病(或其他肿瘤类型)。如上文所讨论的，在若干实施方案中，生成采用两个、三个或更多个刺激域的组合的构建体，从而导致协同的NK细胞刺激和增强的细胞毒性。
图9E示出了在转导后第7天，在1:1和1:2的E:T比率下对抗Nalm6细胞的细胞毒性的汇总数据。在1:2的E:T比率下，除了一种NK19构建体之外，其他所有构建体的细胞毒性都相当于或高于仅表达GFP的NK细胞。事实上，甚至在1:2的比率下，构建体中的六种实现了约50％或更高的细胞毒性。当在1:1的E:T下进行测试时，构建体中的七种构建体实现了约50％或更高的细胞毒性，然而，构建体中的五个(NK19-13、NK19-2、NK19-9、NK19-3和NK19-1)产生了超过70％的细胞毒性。图9F示出了Raji细胞的相应数据。在1:2和1:1二者的E:T比率下，所有测试的构建体都示出了比表达GFP的NK细胞增强的细胞毒性。在1:2的E:T下，构建体中的四种超过了40％的细胞毒性，而在1:1下，七种构建体超过了该杀伤率。此外，在1:1E:T下，三种构建体产生了60％或更高的细胞毒性，其中最有效的构建体实现了接近90％的细胞毒性。综上所述，这些数据展示，各种CD19定向性CAR构建体不仅可以得到表达，而且可以是稳定地表达的，并且还在多种癌细胞类型中有效地诱导细胞毒性，在一些情况下，超过80％的杀伤率。根据额外的实施方案，生成了采用两个、三个或更多个刺激域的组合的靶向CD19的构建体，这导致表达它们的NK细胞的细胞毒性进一步增强。在若干实施方案中，CD19定向性构建体可以与表达针对其他肿瘤标志物(如NKG2D的配体)的受体的NK细胞协同地相互作用(此种带有嵌合受体的NK细胞描述在PCT/US2018/024650中，该专利通过引用以其整体并入本文)。例如，包含结合NKG2D的配体的结合域、OX40刺激域和CD3ζ信号传导域的嵌合受体可以与本文公开的任何靶向CD19的构建体结合使用。在若干实施方案中，此种嵌合受体在序列上与SEQ ID NO:145的核酸序列至少90％相同。在若干实施方案中，此种嵌合受体在序列上与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少90％相同。
进行了进一步的实验以评价所选的CD19定向性CAR构建体的细胞毒性。将从三个不同供体(两个供体用于14天实验)分离出来的NK细胞用编码以下所指示构建体的载体转导：NK19-1(OX40共刺激域)；NK19-2(CD28共刺激区)；NK19-3(ICOS共刺激域)；NK19-4(CD28-41BB共刺激域)；NK19-9(CD27共刺激区)；NK19-13(CD44共刺激域)。在转导后七(n＝3)天或14(n＝2)天，将那些工程化NK细胞与Nalm6或Raji细胞在1:1的E:T比率下进行共培养。结果示出在图10A中(表示为相对于表达GFP的NK细胞的细胞毒性的百分比增强)。与来自图9的数据一致，所测试构建体中的每一种都产生了增强的对抗Nalm6细胞的细胞毒性作用，范围为从使用NK19-4的平均40％增加至使用其他5个构建体的平均约50％的总增加。图10B示出了对抗Raji细胞的相应数据。再者，每种构建体都优于仅表达GFP的NK细胞，其中相对于GFP NK细胞，细胞毒性平均增加的范围为从约40％增加至约50％增加。在转导后第14天，使用来自两个供体的细胞，针对Nalm6和Raji细胞测试NK19-1、NK19-9和NK19-13。图10C示出了计算出来的这些构建体相对于表达GFP的NK细胞的增强的细胞毒性，其中观察到，对于表达NK19-9的NK细胞，平均增加为接近80％，对于NK19-1表达细胞，平均增加为约75％，并且对于NK19-13表达细胞，平均增加为超过60％。对抗Raji细胞也获得了类似的结果——NK19-13表达细胞示出了超过20％的细胞毒性提高，NK19-1表达细胞表现出接近60％的活性增强，并且NK19-9表达细胞示出了几乎多70％的对抗Raji细胞的细胞毒性活性。这些结果进一步支持了本文公开的实施方案，其中提供表达CD19定向性CAR的工程化NK细胞，因为它们用于治疗癌症的方法是导致对抗靶肿瘤细胞的细胞毒性增强的免疫疗法。
图11A至11E描绘了与当与Nalm6一起培养细胞时NK细胞的细胞因子释放谱相关的数据，其与NK细胞通过释放细胞毒性颗粒和促炎性细胞因子来控制肿瘤和病毒感染细胞的机制密切相关。图11A示出，与对照或甚至表达GFP的NK细胞相比，表达NK19-1、NK19-9或NK19-13的NK细胞都表达更高浓度的丝氨酸蛋白酶粒酶B，其存在于由NK细胞释放的颗粒中。相比于表达GFP的对照NK细胞，表达这些CD19定向性CAR的NK细胞释放多约4倍的粒酶B。图11B示出了与工程化NK细胞增加的穿孔素释放相关的数据。有趣地，相对于由表达GFP的NK细胞产生的浓度，穿孔素水平并未大幅升高(然而穿孔素浓度高于对照。穿孔素与粒酶B(和其他粒酶)协作地工作，穿孔素的功能是生成通过细胞膜的孔隙，以允许粒酶穿过膜，然后对细胞内蛋白质靶标发挥其蛋白酶作用。该数据提出了如下可能性：穿孔素释放虽然大致相同，或就某些构建体而言会减少，但实际上在孔隙形成时更有效，从而允许相同程度的孔隙形成。替代地，如果从表达NK19的NK细胞释放的穿孔素在孔隙形成时不再有效，则这会被粒酶B(和/或其他粒酶)的升高性增加抵消。因此，仍然实现了增强的细胞毒性。
图11C示出，与对照或甚至表达GFP的NK细胞相比，表达NK19-1、NK19-9或NK19-13的NK细胞都释放更高浓度的炎性细胞因子TNFα。图11D示出了表达NK19的NK细胞的GM-CSF释放的类似数据，并且图11E示出了干扰素γ释放的类似数据。同样地，当对Raji细胞进行测试时，会产生类似的释放模式，如图12A至12E所示。这些数据指示，表达NK19的细胞至少部分地通过增加炎性细胞因子和/或细胞毒性颗粒的释放来发挥其细胞毒性作用。如上所述，在若干实施方案中，工程化CAR设计成具有两个、三个或更多个共刺激域的组合，具有协同增加的细胞因子/颗粒释放以及对抗靶标癌症的细胞毒性。
进一步证明NK19构建体对肿瘤进展的增强作用，在第0天对NSG小鼠静脉内注射1x105个Nalm6细胞(表达荧光报告基因)。在第3天，小鼠接受PBS对照注射、非转导NK细胞(“NTNK”，10M)、表达NK19-2的NK细胞(1000万个细胞)、NK19-9表达细胞(1000万个)、NK19-1表达细胞(1000万个)或NK19-1表达细胞(3000万个)。在第3、8、11、18和25天进行荧光成像以检测Nalm6细胞(成像数据未示出)。数据示出在图13中。如所示，注射表达任何NK19变异体的NK细胞导致了Nalm6生长的进展减少。表达NK19-2的NK细胞在第8天示出了轻微的Nalm6生长，到第11天有更多的Nalm6生长，并且到第18天大幅增长(然而少于NTNK细胞的情况)。表达NK19-9或NK19-1(以任一剂量)的NK细胞在第8天通过成像都未示出可检测到的肿瘤负担。接受表达NK19-9的NK细胞的小鼠到第11天确实示出了Nalm6细胞生长有所增加，到第18天具有进一步的进展。在第11天，接受任一剂量的NK19-1表达细胞的小鼠都未表现出Nalm6细胞生长。到第18天，接受1000万个NK19-9细胞的小鼠示出了一些肿瘤生长。然而，在3000万个细胞剂量下，那些接受表达NK19-9的NK细胞的小鼠仅示出了少量的Nalm6细胞生长。
图14A描绘了在小鼠中检测到的所示的生物发光强度(例如，图13中所示的荧光信号，注意图13未示出第25天的成像数据)的线形图。与图13的图像一致，图14A的线形图示出了所有组在第25天的增加的Nalm6细胞计数(如由增加的BLI所表示的)，其中在PBS和NTNK组中检测到显著的细胞数目，并且NK19-2、NK19-1(10M)和NK19-9组的细胞数略少。NK19-1(30M)示出了最小的增加，这表示了该构建体由于对Nalm6细胞的细胞毒性作用而降低Nalm6进展速率的能力。虽然每个构建体最终都允许一些Nalm6生长(即使是适度的)，但所测试的NK19构建体延迟了该生长的开始，如由NK19曲线的到第11天的平坦线所证明的。为了更好地示出该方面，在图14B中的对数刻度Y轴上重新绘制数据，这允许曲线分开。如所显示，NTNK和PBS曲线示出了在第3天后呈上升趋势，这指示了Nalm6几乎立即生长。与此相反，到第7天，NK19-9、NK19-2和两条NK19-1曲线呈下降或仅略微上升的趋势。在第11天，与图13中的图像一致，在NK19-9、NK19-2和NK19-1(10M)组中检测到Nalm6细胞生长。与此相反，NK19-1(30M)组仍然大概在基线处，这反映了缺乏任何显著的Nalm6细胞生长。在第18天，在NK19-9(30M组)中，细胞生长趋势向上。虽然肿瘤细胞数目增加，即使施用了NK19构建体也是如此，但在若干实施方案中延迟生长开始可以是有利的。例如，这提供了如此机会：将另一剂量的表达CD19定向性构建体的工程化NK细胞再次给药于患者。在若干实施方案中，例如通过基因编辑，后续剂量(初始剂量也是如此)可以任选地包含已被编辑以减少同种异体性(allogenicty)的NK细胞。因此，在若干实施方案中，施用两个、三个、四个或更多个剂量的表达CD19定向性CAR的NK细胞。肿瘤细胞生长的这种延迟提供了如此机会：连续地(或同时地)给药表达导向不同肿瘤标志物的嵌合构建体的NK细胞和/或一些其他种类的抗癌疗法(例如，检查点抑制剂、抗体疗法、化学疗法等)。图14C描绘了与取自处理的小鼠的血液样品内的用各种构建体转导的细胞的CD3表达有关的数据，如X轴所指示。CD3是T细胞标志物。如所指示，然而对于工程化改造成表达NK19-1构建体的T细胞以及NK细胞和T细胞的混合群体，CD3表达基本上可以忽略不计。图14D描绘了与CD56表达相关的数据，该CD56是人NK细胞的标志物。虽然存在少量的背景染色，但用表达所指示构建体的NK细胞治疗的小鼠的血液样品相对较低(如所预期的，考虑到(i)血液是鼠血液样品并且鼠细胞会占总数的大多数，以及(ii)CD56仅检测人NK细胞(例如，所施用的那些)。在这一点上，数据与比其他组支撑明显更高CD56表达的30M NK19-1处理组以及在背景水平下表达CD56的T细胞/NK+T细胞组一致。图14E示出了与肿瘤细胞的GFP表达相关的数据。在体内实验进行约3周时收集血样样品。如所示(与图像/BLI数据一致)，对照PBS和NTNK组表现出较高百分比的GFP表达(例如，样品中活血细胞总数的较大百分比是肿瘤细胞)。基于控制/减少肿瘤细胞生长的工程化构建体，每个工程化构建体都示出了显著更少的GFP表达。图14F示出了与图14D类似的数据，但测量给定鼠血液样品中所有活细胞的CD19表达。与GFP一样，PBS和NKNT组示出了大约10-12％的CD19表达，这意味着血液样品中10-12％的活细胞是肿瘤细胞，其余部分是鼠血细胞。如其它实验组所示，CD19表达要低得多，这反映了工程化CAR构建体限制肿瘤细胞的生长。这些数据是根据本文公开的实施方案，其中表达CD19定向性CAR的工程化NK细胞具有高度细胞毒性并且允许治疗癌性肿瘤。
人源化构建体的进一步评价
如上文所详细讨论的，在若干实施方案中，本文公开的CAR的若干实施方案涉及人源化序列如在细胞外结合部分中的用途。在若干实施方案中，该区域的一个或多个方面经受人源化改造。在若干实施方案中，抗体的重链和/或轻链中的一条或多条是人源化的，这(如上文所讨论的)可以提供许多优势，这些优势包括但不限于免疫原性降低、稳定性增加、功效延长、效力提高等。
实施例3
图15示出了根据本文公开的若干实施方案的一系列人源化构建体的示意图。此类构建体在其标识符中由“H”指定。作为解释，NK19H-1是人源化抗CD19 CAR，其采用由第一轻链和第一重链(‘L1H1’)组成的scFv，而NK19H-3采用由第三轻链和第一重链(‘L3H1’)组成的scFv。图15还示出了与293T细胞瞬时表达和分泌后重链和轻链的各种组合的稳定性和聚集性相关的数据。示出了在将每个抗体加热至70℃并然后冷却回室温(“加热”)时相对于在将相同的变异体保持在冰上(“未加热”)时与通过流式细胞术检测到的平均荧光强度相关的数据。热处理后，将ScFv变异体以各种浓度(0.4、0.25和0.125ug/mL)用于流式细胞术方案。荧光强度的损失指示，ScFv失去了结构完整性或通过加热过程聚集。根据一些实施方案，在这两种条件下具有如通过可比较MFI所指示的最佳热稳定性的ScFv有利于进一步开发。
在评估了构建体的稳定性之后，进一步评价了所选的抗CD19 CAR构建体。图16示出了3个供体(#140、#9和#20)的NK细胞对所指示构建体的表达的汇总数据。如图中所描绘的，通过检测CD19Flag来评价表达。数据呈现为表达CD19-Flag的NK细胞相对于所呈现的NK细胞的总数目的百分比。在用编码NK19H-“X”CAR的相关病毒转导后第4天收集数据。如通过表达数据所证明的，所选构建体中的每一种都由NK细胞在不同程度上表达。对于NK19H-2、NK19H-11和NK19H-12，表达水平的范围为由约20％的总NK细胞的表达。大多数其他构建体由约40％-60％的NK细胞成功地表达，这与非人源化NK19-1构建体的表达相当。NK19H-5构建体由超过80％的NK细胞表达。虽然某些构建体可以更有效地表达，但仍然评价那些具有较低表达水平的构建体，因为与若干实施方案一样，此类构建体仍然表现出显著的对抗靶细胞的细胞毒性。然而，根据若干实施方案，具有较高表达效率的那些可以是有利的，例如因为给定NK细胞制剂的较大部分在临床上是有用的(例如，生成临床相关的工程化NK细胞剂量所需的输入NK细胞较少)。
图17A至17E描绘了此类细胞毒性数据。图17A示出了来自供体20并用所指示构建体转导的NK细胞对抗CD19阳性Nalm6白血病细胞系(在1:1的E:T下；每孔20K个细胞)的细胞毒性。数据示出，尽管表达水平不同，但大多数NK19H构建体能够发挥对抗Nalm6靶细胞的细胞毒性作用。NK19H-11示出了最小的功效，从而允许Nalm6细胞以略低于对照的水平生长。与此相反，NK19H-1和NK19H-3示出了与非人源化NK19-1构建体相当的细胞毒性，从而允许在共培养的后期时间点进行一些细胞生长。尤其是，NK19H-4和NK19H-5示出了显著的细胞毒性，从而在整个实验过程中仅允许非常有限的Nalm6生长。
图17B示出了对抗CD19阳性伯基特淋巴瘤细胞系Raji所测试的来自供体20的NK细胞。与Nalm6细胞一样，各种人源化抗CD19构建体示出了不同的对抗靶细胞的细胞毒性。类似于图17A的数据，NK19H-11构建体示出了有限的细胞毒性，但所有其他构建体都示出了有希望的对抗靶细胞的细胞毒性，其中NK19H-1的表现与非人源化NK19-1构建体相当，并且NK19H-3、19H-4和19H-5构建体中的每一种都诱导较高水平的细胞毒性，限制Raji生长直至共培养的后期阶段(其中NK19H-5仅允许非常有限的Raji细胞生长)。图17C示出了来自供体140的相应Nalm6数据。此处，检测到类似的功效模式，其中NK19H-11允许Nalm6生长接近阴性对照。然而，NK19H-1、19H-3和19H-4中的每一种都诱导至少与非人源化NK19-1一样多的细胞毒性。再者，NK19H-5示出了显著的细胞毒性，从而在整个实验过程中限制Nalm6生长。图17D示出了对抗Raji细胞的来自供体9的数据。仅NK19H-11允许任何大幅的Raji细胞生长。与此相反，来自该供体的NK细胞表达非人源化NK19-1，或者人源化NK19H-1、19H-3、19H-4或19H-5构建体中的任何一种都通过诱导的细胞毒性作用抑制任何Raji细胞生长。图17E示出了来自供体9的NK细胞对抗Nalm6细胞的数据。在该实验中，三种人源化构建体(NK19H-11、19H-1和19H-3)的细胞毒性是有限的。供体与供体之间存在一些变化，因为在由其他供体的NK细胞表达时，这些构建体中的某些会诱导细胞毒性。NK19H-4和19H-5构建体表现出显著的细胞毒性作用，从而在实验过程中几乎将Nalm6生长限制至零。综上所述，这些数据补充了表达数据，并且示出，根据若干实施方案，靶向CD19的人源化CAR构建体有效杀死肿瘤细胞，即使它们具有不同的表达效率。另外，根据一些实施方案，表达效率与细胞毒性无关，并且甚至具有有限表达效率的构建体也可以展示显著的细胞毒性。
实施例4
使用来自额外供体的NK细胞进行与上文讨论的那些实验平行的进一步实验。图18示出了三个供体(#945、137和138)针对所指示构建体的构建体表达效率。与之前的实验一样，所呈现的数据表示所评估的NK细胞总数中CD19-Flag阳性细胞的数目。这些供体的数据示出，除了一种人源化构建体之外，所有其他构建体的总体表达效率都较高。仅NK19H-3的表达低于非人源化NK19-1构建体。对于这些供体NK细胞，在约70％至80％的NK细胞上检测到人源化构建体的表达。如上文，为进一步评价表达，评价了对抗CD19表达靶细胞的细胞毒性。图19A示出了与来自供体(#137)的NK细胞相关的数据，该NK细胞表达所指示构建体并与Raji细胞共培养。在该实验中，在两个时间点，在转导后第7天将表达所指示构建体的工程化NK细胞暴露于肿瘤细胞，并且在第14天添加额外的肿瘤细胞推注。箭头示出了肿瘤细胞的第二次施用。如所示，未经处理的Raji细胞在整个实验过程中扩增。表达GFP或非人源化NK19-1的NK细胞诱导了一些细胞毒性，如通过与对照相比减少的Raji细胞生长所示。表达NKH19-3(具有最低表达效率的人源化构建体)的NK细胞也能够减少Raji生长。与对照相比，其他人源化NK构建体中的每一种都能够减少Raji细胞生长，甚至在转导后第14天也是如此，这指示本文公开的工程化NK细胞的持久性增强。图19B示出了供体137NK细胞对抗Nalm6细胞的相应数据，其中在转导后第7天(实验第0天)和第14天(实验约第7天)再次添加工程化NK细胞。在该特定实验中，所指示构建体的细胞毒性变化更大。然而，与对照相比，若干人源化抗CD19构建体能够产生显著的细胞毒性并减少Nalm6细胞生长。这些数据表明，根据若干实施方案，更频繁的给药计划(例如，每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天等)对于某些受试者将是有益的。有利地，在若干实施方案中，如本文所公开的工程化NK细胞是同种异体的并且可以容易地用于更频繁的给药方案中。图19C示出了供体138对抗Raji细胞的相应数据。此处，许多人源化构建物仍然对Raji细胞具有显著的细胞毒性作用，甚至在转导后第14天使用第二剂量的Raji细胞时也是如此。7种人源化构建体中的六种示出了这种性质，并且优于非人源化NK19-1构建体。图19D示出了供体138对抗Nalm6细胞的相应数据。虽然额外的Nalm6推注导致Nalm6生长在实验后期阶段增加，但几乎所有人源化构建体的表现都好于对照。事实上，带有NK19H-5的NK细胞能够限制Nalm6生长，直至实验的最后几天(第二剂量后)。如上文，这些数据示出，人源化抗CD19 CAR构建体不仅可以由NK细胞表达，而且还可以发挥对抗靶细胞的细胞毒性活性，并且具有增强的持久性。在若干实施方案中，这允许以更长的时间段将多次给药分开，这对于治疗癌症可能是有利的，同时限制潜在的免疫原性(至少部分地由于人源化和/或因为给药频率减少)。
实施例5
收集了额外供体中各种人源化构建体的进一步数据。图20A至20B示出了来自两个额外供体的NK细胞中各种抗CD19 CAR构建体的表达数据。图20A示出了NK细胞在转导后第10天的平均荧光强度。如所指示，如根据本文公开的若干实施方案，与非人源化抗CD19 CAR相比，人源化抗CD19CAR构建体中的每一种都示出了增强的总体表达。图20B示出了CD19-Flag阳性NK细胞的表达数据占所分析NK细胞的总数目的百分比。如所示，人源化抗CD19CAR构建体中的每一种都比非人源化构建体(其已经由几乎80％的NK细胞表达)被更有效地表达。取决于构建体，人源化CAR由大约85％至95％的NK细胞表达。图21A示出了在转导后第7天并再次在转导后第14天针对与NK细胞共培养的Raji细胞的来自供体703(图20的两个供体之一)的工程化NK细胞的细胞毒性数据。如图所示，Raji细胞和仅表达GFP的NK细胞在第7天并再次在第14天稳健生长。非人源化抗CD19 CAR NK19-1能够抑制Raji细胞生长到7天，并且允许相对有限的生长到14天。人源化抗CD19 CAR构建体中的每一种都进一步抑制了Raji细胞生长，其中若干构建体几乎完全抑制了Raji细胞生长。图21B示出了从供体877分离出来的NK细胞对抗Raji细胞的细胞毒性的相应数据。这些数据示出了与之前供体的趋势类似的趋势。两个对照组允许显著的Raji细胞生长，而人源化抗CD19 CAR构建体中的每一种都产生了显著的细胞毒性作用。
图22A至22E示出了与表达所指示构建体的NK细胞共培养的Raji细胞的细胞因子释放谱。图22A示出了与Raji细胞共培养的NK细胞的IFNg释放。与非人源化NK19-1构建体相比，所指示的人源化构建体中的每一种都导致IFNg释放增加。类似地，如图22B所示，与对照NK细胞相比，人源化抗CD19构建体使NK细胞能够释放更大数量的GM-CSF。图22C示出，人源化抗CD19 CAR构建体诱导NK细胞的TNF释放升高。在所测试的构建体之间，穿孔素水平没有显著性差异，如图22D所示。同样地，在构建体之间，粒酶水平相对恒定。综上所述，这些数据指示，根据一些实施方案，在NK细胞上表达的人源化抗CD19 CAR构建体使得那些NK细胞释放更大数量的一种或多种细胞因子，该一种或多种细胞因子导致对靶细胞的细胞毒性作用。
实施例6
虽然上文呈现的数据示出人源化抗CD19 CAR可以由NK细胞表达并且对靶标肿瘤细胞具有细胞毒性作用，但还进行了额外的实验来确定工程化NK细胞的寿命。培养表达所指示抗CD19 CAR构建体的NK细胞，并且在不同时间点处测量细胞计数，直至转导后26天。图23A示出了来自供体137的NK细胞的存活数据。表达GFP的NK细胞的数据示出，第7天的细胞计数高于任何其他时间点处的细胞计数，这表明GFP没有为NK细胞提供额外的寿命诱导作用。同样地，表达非人源化NK19-1的NK细胞示出，细胞数目随时间下降。虽然人源化构建体中的每一种在细胞计数方面都示出了一些变化，但数据的趋势示出，随着时间的推移，人源化抗CD19构建体的表达导致更少的NK细胞死亡。类似的趋势示出在图23B的数据中，该图示出了来自供体138的NK细胞的细胞生存力。虽然修改了分析定时，但图23C示出了产生类似趋势的数据(针对供体703)，因为随着培养时间的推移，人源化构建体的表达导致更长的NK细胞存活。图23D示出了来自供体877的NK细胞的数据，其中随着培养时间的推移，人源化抗CD19 CAR构建体的表达允许NK细胞死亡减少。
各种抗CD19 CAR构建体的表达的汇总数据示出在图24中，该图显示了所指示构建体在转导后第11天的表达效率。如所预期，GFP转导的NK细胞没有表现出CD19-Flag表达，从而用作阴性对照。同样地，非人源化NK19-1构建体用作阳性对照。与NK19-1相比，所评估的人源化构建体中的每一种都示出了增强的表达效率，其中效率范围为约85％至约95％(例如，85％-95％的所有所测试NK细胞表达Flag标记的CAR构建体)。
图25A至25I示出了一个供体的原始流式细胞术数据，其中测量了CD19-Flag的表达(其指示CAR表达)。图25A示出了GFP对照，其中很少有Flag表达或无Flag表达。图25B示出了对于NK19-1阳性对照的Flag检测。图25C至25I示出了所指示人源化抗CD19 CAR构建体的Flag检测结果，其中表达构建体的细胞的百分比范围为约80％至约95％。与上文实验一样，这些数据证实，人源化抗CD19 CAR构建体可以由转导的NK细胞稳健地表达。
实施例7
类似于上文讨论的实验，将Raji细胞暴露于来自供体103的NK细胞，该NK细胞用所指示的各种构建体转导(参见图26A)。在NK细胞转导后第7天将Raji细胞进行共培养，并且再次在第14天对NK细胞进行再攻击。如所预期，Raji细胞单独表现出持续的生长，而GFP转导的NK细胞则少量地减少该细胞生长。与此相反，阳性对照非人源化NK19-1构建体减少了Raji细胞生长，直至实验的最后阶段。人源化抗CD19 CAR构建体中的每一种都产生了增强的对抗Raji细胞的细胞毒性。三种构建体(NK19H-2、H-3和H-4)在实验后期阶段允许轻微的Raji细胞生长，而其他人源化构建体有效地消除了Raji细胞生长，甚至在第14天再攻击时也是如此。图26B示出了与供体103NK细胞对抗Nalm6细胞的细胞毒性有关的相应数据。如图所示，在共培养7内，所有出现的抗CD19 CAR构建体(无论是否人源化)都表现出显著的对抗Nalm6细胞的细胞毒性。然而，在第14天再攻击时，所有组的Nalm6生长都增加。虽然生长曲线最初略微平坦，但Nlam6的生长速率后来有所增加。这些数据表明，根据一些实施方案，采用更频繁的给药策略来防止靶细胞达到阈值生长速率。在若干实施方案中，给予更大的剂量和/或更频繁地给予剂量，以在与“再攻击”等效的生理环境下阻止靶细胞生长。
图26C示出了与来自供体275的NK细胞一起的Raji细胞(与图26A一样)的数据。类似于图26A的那些，抗CD19 CAR构建体中的每一种都示出了显著的对抗Raji细胞的细胞毒性，并且允许靶细胞的有限生长，甚至再攻击时也是如此。图26D示出了与来自供体275的NK细胞一起的Nalm6细胞(与图26B一样)的数据。该实验的结果也类似于供体103的结果，其中到7天有效地控制了Nalm6细胞，但在再攻击之后减少了细胞毒性。这些数据指示，取决于实施方案，开发用于特定供体和/或用于特定靶标肿瘤类型的给药策略。例如，虽然Nalm6细胞是CD19阳性的，但它们可能比例如Raji细胞表达较少的CD19，从而解释了来自供体103和275的NK细胞对抗Nalm6细胞系的细胞毒性会减少。转导的NK细胞对抗Raji细胞的功效指示，NK细胞能够产生细胞毒性，甚至示出了持久性直至转导后几乎两周。因此，根据若干实施方案，NK细胞剂量和/或给药频率可以针对给定患者的肿瘤类型、天然NK细胞活性和/或癌症的攻击性/阶段进行定制，以允许对抗靶细胞的细胞毒性稳健并持续，并且允许实现对肿瘤负荷的控制。
图27A至27B示出了流式细胞术数据，其表征来自两个供体(图17A中的276和27B中的877)的用如本文所公开的抗CD19 CAR构建体的非限制性实例转导的NK细胞。图27A和27B二者示出，用GFP转导的NK细胞几乎不表达CD19-Flag。其他图中的每一个都展示，来自这些供体的NK细胞不仅可以表达阳性对照非人源化NK19-1构建体，而且可以有效地表达所选的人源化抗CD19 CAR构建体。这指示抗CD19结合剂的人源化对表达特征的影响有限。
图28A至28B示出了来自图27的那两个供体的NK细胞在1:1的E:T比率下对抗Raji细胞的细胞毒性的初始数据。与上文讨论的结果一致，所选的人源化抗CD19 CAR构建体中的每一种都赋予转导的NK细胞以显著的对抗靶标Raji细胞的细胞毒性潜力。抗CD19 CAR构建体的非限制性实例中的每一个都有效地控制了Raji细胞生长(相当于非人源化NK19-1构建体或与其相比增强)，其中甚至在实验开始后长达70小时，Raji细胞数目也呈现降低的趋势。类似地，图28B示出，来自供体877的转导的NK细胞也有效地控制Raji细胞生长，相当于非人源化NK19-1构建体或与其相比增强。这些数据与上文讨论的针对来自其他供体的NK细胞所呈现的数据一致，并且指示，根据本文公开的若干实施方案，用人源化抗CD19 CAR转导NK细胞，可以使工程化NK细胞能够发挥显著的对抗靶标肿瘤细胞的细胞毒性作用，并能有效地控制肿瘤细胞的生长。根据若干实施方案，此类工程化抗CD19Nk细胞(无论是同种异体的还是自体的)允许稳健且有效的细胞免疫疗法以治疗癌症。
实施例8
进行进一步的实验以评价如本文所公开的人源化的CD19 CAR构建体。图29A示出了实验方案的示意图。简而言之，在第0天对NSG小鼠静脉内注射1x105个Nalm6细胞(表达荧光报告基因)。在第1天，小鼠接受PBS对照注射、非转导K细胞(“NTNK”，10M)、1000万个表达非人源化NK19-1CAR的NK细胞或1000万个表达各种人源化CD19 CAR构建体中的一种的NK细胞。如所指示进行血液收集和荧光成像。生物发光数据示出在图29B中。如所示，注射表达任何CD19 CAR构建体的NK细胞导致了Nalm6生长的进展减少。与对照相比，所测试的人源化构建体(NK19-H2、NK19-H5和NK19H-9)各自示出了显著的Nalm6生长延迟。图29C是描绘31天内的所测得生物发光的线形图。如所示，与对照相比，该实验中所测试的每种人源化构建体都示出了减少的肿瘤进展，并且与非人源化NK19-1相比则略微减少。图29D示出了反映肿瘤进展减少的存活曲线，其中用NK19-1或任何所选人源化构建体治疗的小鼠比对照组存活更长时间。图29E示出了与对每种人源化构建体在NK细胞上的表达的评价相关的数据。如所示，人源化构建体中的每一种都比非人源化NK19-1构建体表达得更为稳健。根据本文公开的若干实施方案，人源化构建体的使用导致更有效的治疗，至少部分地是由于NK细胞的CAR表达(和/或活性)增强。
图30A至30F涉及在实验期间的不同时间点用所指示构建体处理的小鼠血液中细胞的特征。图30A示出了小鼠外周血液中人CD56+细胞的百分比，其表示所施用的NK细胞到实验的前十五天的存活率。实验组中的每一个都表现出较高的细胞百分比，其中在所测试的构建体中，NK19-H2构建体表现得最持久。图30B示出了类似的数据，其基于对用于这些构建体的flag表达标签的检测(然而在若干实施方案中，没有使用标签)。这些数据示出，人源化构建体的表达水平高于非人源化构建体。图30C示出了15天后对GFP阳性肿瘤细胞的检测。表达CAR的NK细胞示出了几乎零GFP表达，这反映了它们在第15天抑制Nalm6生长。图30D至30F示出了第32天的类似数据。这些数据示出，表达人源化CD19 CAR构建体的NK细胞在存在于所测试小鼠的外周血液中的细胞中占较大的百分比，这与这些构建体在后期时间点控制肿瘤生长方面的功效增加是一致的。图30F示出，在第32天，人源化CD19 CAR构建体之间的表达几乎没有差异。图32F反映了表达人源化CD19 CAR构建体的NK细胞在控制肿瘤生长方面的能力增强，其中人源化处理组中检测到的GFP阳性细胞较低，甚至与接受NK19-1的动物相比也是如此。在若干实施方案中，功效增强至少部分地是由于人源化CD19 CAR构建体的表达增强。
实施例9
如上文所讨论的，在一些实施方案中，CAR构建体包含检测标签。然而，在若干实施方案中，没有使用标签。进行实验以便评价非标记人源化CARS的表达。该实验采用NK19H-NK-2、-5和-9作为非标记人源化CAR的非限制性实例。图31A至31B示出了来自三个不同供体的NK细胞对所指示构建体的表达数据(31A中的表达百分比，31B中的平均荧光)，该数据每周测量，持续4周。这些数据展示，如本文所提供的CD19 CAR构建体的非标记版本彼此相对类似地表达，但比非人源化构建体更稳健。非标记人源化构建体中的每一种都在至少约70-80％的NK细胞上表达。
实施例10
进行实验以评价表达人源化非标记CD19 CAR构建体的NK细胞的细胞毒性。使用Raji细胞(图32A至32B)或Nalm6细胞(图32C至32D)作为靶细胞，如上所述进行体外再攻击测定。图32A示出了与所指示处理共培养的Raji细胞的百分比，其测量为实验第10天仅Raji对照组中所测得的细胞数目的百分比。如所示，CD19 CAR构建体中的每一种(无论是否人源化以及无论是否标记)到第10天基本上消除了Raji细胞生长。图32B示出了最后时间点，以及在每个使用CD19 CAR的实验组中仍然存在有限的Raji细胞生长，尽管数据示出了使用NK19H-NF-2和NK19H-NF-5组更大地阻止Raji生长的小趋势。图32C和32D示出了使用Nalm6细胞的相应数据。图32C示出，类似于Raji细胞，CD19 CAR构建体中的每一种(无论是否人源化以及无论是否标记)到第10天基本上消除了Nalm6细胞生长。在最后时间点，所有组都存在Nalm6细胞生长，尽管数据趋向于指出人源化构建体在阻止生长方面更有效。
图33A至33J涉及表达所指示构建体的NK细胞的检测到的细胞因子谱。如上文所讨论的，对每个处理组的培养基进行干扰素γ(33A/33F)、GM-CSF(33B/33G)、TNF-α(33C/33H)、穿孔素(33D/33I)和粒酶B(33E/33J)测定。图33A至33E示出了来自Raji细胞再攻击的数据，而图33F至33J示出了来自Nalm6再攻击的数据。如所示，表达非标记人源化CD19 CAR的NK细胞向培养基中释放类似水平、类似数量的IFN-γ，其中那些水平略微高于由表达非人源化NK19-1 CAR的NK细胞释放的数量。类似地，在带有人源化非标记CAR的NK细胞中，GM-CSF释放相当一致，并且处于略微接近NK19-1表达细胞的水平。TNF-α释放示出了类似的模式，而在所有表达CD19 CAR的NK细胞中，穿孔素释放是一致的，并且处于低于对照的水平。最后，在Raji细胞中，对于非标记人源化CD19 CAR，粒酶B示出了类似程度的释放，并且处于略微高于NK19-1表达细胞的水平。在大多数情况下，从Nalm6实验收集的数据示出了类似的模式。根据若干实施方案，介导细胞毒性的细胞因子的更大程度释放导致更有效的治疗剂。在一些实施方案中，更大程度的细胞因子释放至少部分地是由于NK细胞对非标记人源化CD19 CAR构建体的表达增强和/或至少部分地是由于表达非标记人源化CD19 CAR构建体的NK细胞的持久性增强。进一步支持这些概念，图34示出了与表达NK19-1的NK细胞相比较，与表达所指示的非标记人源化构建体的NK细胞在培养四周内的持久性相关的数据。虽然在表达人源化结构的NK细胞中，总体细胞计数似乎类似，但细胞计数示出与细胞因子相同的基本模式，即略微大于表达非人源化NK19-1的NK细胞。
实施例11
类似于上文实验，对非标记人源化构建体的功效进行体内评估。图35A示出了所使用的方案的示意图。图35B示出了体内生物发光测量，该测量示出，人源化非标记构建体似乎比表达NK19-1构建体的NK细胞在更大程度上减缓肿瘤进展。图35C将成像数据概括在线形图中，其中当小鼠接受表达任何非标记人源化CD19 CAR构建体的NK细胞时，可以清楚地看到对肿瘤细胞生长的抑制增强。图35D反映了NK细胞对非标记人源化构建体的表达增强。图36A至36F涉及表达所指示构建体的NK细胞在实验时间线内的持久性。图36A指示，表达非标记人源化CD19 CAR构建体的NK细胞在体内更持久，在第13天占外周血液中总体CD56+细胞的较大百分比。图36B展示，在第13天，表达任何CD19-CAR的NK细胞抑制肿瘤生长好于对照，其中表达非标记人源化CD19-CAR结构的NK细胞示出，在限制CD19+肿瘤细胞生长方面比表达NK19-1的NK细胞稍有优势。图36C示出了与36B类似的数据，使用GFP阳性肿瘤细胞计数作为基准。图36D示出了第27天的持久性数据，其中与其他组相比，表达NK19-NF-2和-9的NK细胞具有升高的群体数目，这指示在更长的时间段内持久性增强。类似于早期的时间点，图36E和36F示出，与对照相比，靶向CD19的CAR构建体在限制肿瘤细胞生长方面均有效。根据本文提供的若干实施方案，NK细胞对非标记人源化靶向CD19的CAR的表达产生那些具有增强的体内持久性和细胞毒性的NK细胞。
实施例11
如本文所讨论的，在若干实施方案中，制备工程化NK细胞以用于同种异体细胞疗法。因此，在若干实施方案中，制备要施用的工程化NK细胞，然后冷冻以供随后在受试者中使用。进行实验以确定冷冻保存然后进行解冻的过程是否会对工程化NK细胞产生不利影响，如降低其生存力、持久性或细胞毒性。图37A示出了所采用的示意性实验方案，以及所使用的实验组和其他条件。对于具有“IL12/IL18”名称的细胞，该细胞在可溶性IL12和/或IL18存在的情况下进行扩增，如在2019年7月31日提交的美国临时专利申请第62/881311号和2019年11月7日提交的申请第62/932342号中所描述的，这些申请中的每一个都通过引用以其整体并入本文。图37B和37C示出了所指示实验组的体内生物发光成像。图38A至38H示出了反映随时间推移的生物发光强度的线形图。这些数据概括在示出前30天的图38I和示出到56天的数据的图38J中。虽然图38I示出了表达CD19 CAR的NK细胞与对照之间的明显差别，但实验组之间存在名义上的分开。然而，图38J示出了到56天的数据，其中表达各种CAR构建体并在所指示条件下加工的NK细胞在抑制肿瘤细胞生长方面的能力存在较大差异。值得注意的是，“成对”组(相同的CAR构建体，新鲜对比冷冻)示出了相当类似的抗肿瘤活性。这指示，根据若干实施方案，表达抗CD19 CAR的工程化NK细胞不仅在制备时有效，而且在新鲜施用时有效。另外，根据若干实施方案，表达抗CD19CAR的工程化NK细胞不仅在制备、冷冻、然后解冻时有效，而且在施用时(例如，如在同种异体环境中)有效。
图39示出了实验56天内用所指示构建体处理的小鼠的体重的线形图。体重减少与肿瘤生长增加相关，例如，肿瘤的进展导致小鼠健康下降，以及相应的体重减轻(例如，消瘦)。如所示，对于大多数实验，对照组示出了体重到第30天大幅减轻，而实验组的体重都在增加。与上文讨论的生物发光数据一样，存在明显的趋势，即，许多新鲜制剂相对于冷冻制剂对体重表现出基本类似的影响。根据若干实施方案，表达抗CD19 CAR的工程化NK细胞不仅在制备时有效，而且在新鲜施用时有效。另外，根据若干实施方案，表达抗CD19 CAR的工程化NK细胞不仅在制备、冷冻、然后解冻时有效，而且在施用时(例如，如在同种异体环境中)有效。
考虑到了可以对上文公开实施方案的特定特征和方面进行各种组合或子组合，并且这些组合或子组合仍然落在本发明的一个或多个内。进一步地，本文中与实施方案有关的任何特定特性、方面、方法、性质、特征、质量、属性、原理等的公开内容可以用于本文中所列出的所有其他实施方案。因此，应当理解，所公开的实施方案的各种特征和方面可以彼此组合或替代，以便形成所公开的发明的不同模式。因此，意图是本文中公开的本发明范围不应被上述具体公开的实施方案限制。此外，尽管本发明易受各种修改和替代形式的影响，但其具体实例已在附图中示出并在本文中详细描述。然而，应当理解，本发明不限于所公开的具体形式或方法，相反，本发明将覆盖落在所描述的各种实施方案和所附权利要求的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。本文公开的任何方法不需要按所叙述的顺序进行。本文公开的方法包括从业人员所采取的某些行动；但是，它们也可以包括任何第三方对这些行动的指导，无论是明示的还是暗示的。另外，当按照马库什(Markush)组来描述本公开的特性或方面时，本领域技术人员将认识到，还由此按照马库什组成员的任何个体成员或亚组来描述本公开。
本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”、“之间”等语言包括所叙述的数字。前面带有“约”或“大约”等术语的数字包括所叙述的数字。例如，“约90％”包括“90％”。在一些实施方案中，至少95％序列同一性或同源性包括相对于参考序列的96％、97％、98％、99％和100％序列同一性或同源性。另外，当序列被公开为“包含”核苷酸或氨基酸序列时，除非另有指示，否则此种引用还应包括该序列“包含”所叙述的序列、“由”其“组成”或“基本上由”其“组成”。
在若干实施方案中，提供了对应于本文公开的任何核酸的氨基酸序列，同时考虑了核酸密码的简并性。此外，与本文明确公开的序列不同但具有功能类似性或等效性的那些序列(无论是核酸还是氨基酸)也被考虑在本公开的范围内。前述包括突变体、截短、替换或其他类型的修饰。
本文使用的任何标题或副标题用于组织目的，并且不应用于限制本文公开的实施方案的范围。
序列表
<110> Nkarta, Inc.
<120> CD19定向性嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途
<130> NKT.0033WO
<150> 62/814180
<151> 2019-03-05
<150> 62/895910
<151> 2019-09-04
<150> 62/932165
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<160> 207
<170> PatentIn version 3.5
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agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3zeta - 蛋白质
<400> 8
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> T2A - DNA
<400> 9
ggctctggcg agggaagggg ttccctgctt acttgcggcg acgtcgaaga gaatcccggt 60
ccg 63
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> T2A - 蛋白质
<400> 10
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 11
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> IL15 - DNA
<400> 11
aactgggtca acgtgattag cgatttgaag aaaatcgagg accttataca gtctatgcat 60
attgacgcta cactgtatac tgagagtgat gtacacccgt cctgtaaggt aacggccatg 120
aaatgctttc ttctggagct ccaggtcatc agcttggagt ctggggacgc aagcatccac 180
gatacggttg aaaacctcat catccttgcg aacaactctc tctcatctaa tggaaacgtt 240
acagagagtg ggtgtaagga gtgcgaagag ttggaagaaa aaaacatcaa agaatttctt 300
caatccttcg ttcacatagt gcaaatgttc attaacacgt cc 342
<210> 12
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> IL15 - 蛋白质
<400> 12
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 13
<211> 207
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD8铰链/TM - DNA
<400> 13
actaccacac ccgccccgag gccacctacg ccggcaccga ctatcgccag tcaacccctc 60
tctctgcgcc ccgaggcttg ccggcctgcg gctggtgggg cggtccacac ccggggcctg 120
gattttgcgt gcgatatata catctgggca cctcttgccg gcacctgcgg agtgctgctt 180
ctctcactcg ttattacgct gtactgc 207
<210> 14
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD8铰链/TM - 蛋白质
<400> 14
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr
65
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头1 (FLAG标签后使用) - DNA
<400> 15
ggcggtggtg gctctggtgg tggcggcagc 30
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 接头1 (FLAG标签后使用) - 蛋白质
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头2 - 阴性对照结合域后 - DNA
<400> 17
ggccaggccg gctccggagg aggaggatcc 30
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 接头2 - 阴性对照结合域后 - 蛋白质
<400> 18
Gly Gln Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 12
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头post scFv - DNA
<400> 19
ggccaggccg gc 12
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 接头post scFv - 蛋白质
<400> 20
Gly Gln Ala Gly
1
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头- DNA
<220>
<221> misc_feature
<223> Misc 接头- DNA
<400> 21
ggcggcggcg gtagcggtgg tggcggctcc gga 33
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Misc 接头- 蛋白质
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头- DNA
<400> 23
ggccaggccg gctccgga 18
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 接头- 蛋白质
<400> 24
Gly Gln Ala Gly Ser Gly
1 5
<210> 25
<211> 405
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NKG2D 胞外片段- DNA
<400> 25
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360
aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405
<210> 26
<211> 135
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKG2D 胞外片段- 蛋白质
<400> 26
Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly
1 5 10 15
Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe
20 25 30
Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser
35 40 45
Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu
50 55 60
Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro
65 70 75 80
Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn
85 90 95
Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr
115 120 125
Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135
<210> 27
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 完整人NKG2D - DNA
<400> 27
gggtggattc gtggtcggag gtctcgacac agctgggaga tgagtgaatt tcataattat 60
aacttggatc tgaagaagag tgatttttca acacgatggc aaaagcaaag atgtccagta 120
gtcaaaagca aatgtagaga aaatgcatct ccattttttt tctgctgctt catcgctgta 180
gccatgggaa tccgtttcat tattatggta acaatatgga gtgctgtatt cctaaactca 240
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 300
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 360
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 420
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 480
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 540
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 600
aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 645
<210> 28
<211> 405
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 密码子优化的 人NKG2D片段 - DNA
<400> 28
ctgttcaatc aggaagtcca gatccccctg acagagtctt actgcggccc atgtcccaag 60
aactggatct gctacaagaa caattgttat cagttctttg acgagagcaa gaactggtat 120
gagtcccagg cctcttgcat gagccagaat gcctctctgc tgaaggtgta cagcaaggag 180
gaccaggatc tgctgaagct ggtgaagtcc tatcactgga tgggcctggt gcacatccct 240
acaaacggct cttggcagtg ggaggacggc tccatcctgt ctccaaatct gctgaccatc 300
atcgagatgc agaagggcga ttgcgccctg tacgccagct ccttcaaggg ctatatcgag 360
aactgctcca cacccaatac ctacatctgt atgcagagga ccgtg 405
<210> 29
<211> 126
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 4-1BB
<400> 29
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 30
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 氨基酸序列CD28 跨膜域
<400> 30
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
20 25
<210> 31
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 氨基酸序列CD28 IC域
<400> 31
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
1 5 10 15
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
20 25 30
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35
<210> 32
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> VL Nicholson等
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> VH Nicholson等
<400> 33
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 634
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> PRT人工序列CD19R zeta 嵌合受体
<400> 34
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Val Glu Pro Lys Ser
260 265 270
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Pro Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu
500 505 510
Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Arg Val Lys Phe Ser Arg
515 520 525
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
530 535 540
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
545 550 555 560
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
565 570 575
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
580 585 590
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
595 600 605
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
610 615 620
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
625 630
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗CD19 scFv HCV
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗CD19 scFv HCV
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> LC CDR1
<400> 37
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> LC CDR2
<400> 38
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> LC CDR3
<400> 39
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HC CDR1
<400> 40
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HC CDR2
<400> 41
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HC CDR2 - 备选
<400> 42
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HC CDR2 - 备选 2
<400> 43
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HC CDR3
<400> 44
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 轻链可变区 1
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 轻链可变区 2
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 轻链可变区 3
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 轻链可变区 4
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 重链可变区 1
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 重链可变区 2
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 重链可变区 3
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 重链可变区 4
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> LC CDR1
<400> 53
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> LC CDR2
<400> 54
Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> LC CDR3
<400> 55
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 10
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HC CDR1
<400> 56
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HC CDR2
<400> 57
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu
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<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HC CDR3
<400> 58
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 2210
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NK19-1b DNA
<400> 59
ggatccgaat tcgccgccac catggcctta ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc 60
ttgctgctcc acgccgccag gccggactac aaagacgatg acgataaagg cggtggtggc 120
tctggtggtg gcggcagcga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 180
ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 240
tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 300
cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 360
attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 420
ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt 480
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaggtg aaactgcagg agtcaggacc tggcctggtg 540
gcgccctcac agagcctgtc cgtcacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 600
ggtgtaagct ggattcgcca gcctccacga aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 660
ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat catcaaggac 720
aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatt 780
tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa 840
ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 900
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 960
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 1020
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1080
cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1140
caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1200
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380
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gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500
caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1560
gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1620
ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1680
gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1740
ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1800
gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1860
tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1920
gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1980
acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 2040
cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2100
ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2160
ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2210
<210> 60
<211> 724
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NK19-1b 蛋白质
<400> 60
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser
35 40 45
Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala
50 55 60
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
65 70 75 80
Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
85 90 95
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu
100 105 110
Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln
115 120 125
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
130 135 140
Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser
165 170 175
Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp
180 185 190
Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu
210 215 220
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
225 230 235 240
Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
245 250 255
Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
260 265 270
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
275 280 285
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
290 295 300
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
305 310 315 320
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
325 330 335
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg
340 345 350
Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser
355 360 365
Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu
370 375 380
Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
385 390 395 400
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
405 410 415
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
420 425 430
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
435 440 445
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
450 455 460
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
465 470 475 480
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
485 490 495
Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly
500 505 510
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu
515 520 525
Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val
530 535 540
Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met
545 550 555 560
His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys
565 570 575
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser
580 585 590
Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile
595 600 605
Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser
610 615 620
Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe
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Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr
645 650 655
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
660 665 670
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
675 680 685
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
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Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
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Thr Leu Tyr Cys
<210> 61
<211> 2231
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NK19-2b DNA
<400> 61
ggatccgaat tcgccgccac catggcctta ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc 60
ttgctgctcc acgccgccag gccggactac aaagacgatg acgataaagg cggtggtggc 120
tctggtggtg gcggcagcga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 180
ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 240
tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 300
cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 360
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ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt 480
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aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatt 780
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<210> 62
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<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NK19-2b 蛋白质
<400> 62
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser
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Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala
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Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
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Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
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100 105 110
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115 120 125
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
130 135 140
Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser
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Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp
180 185 190
Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu
210 215 220
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
225 230 235 240
Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
245 250 255
Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
260 265 270
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
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Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
290 295 300
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
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Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
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Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
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Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
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Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
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420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
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450 455 460
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Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
755
<210> 85
<211> 6488
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NK19 DNA
<400> 85
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tggaaaatac ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gttaggaaca gagagacagc 120
agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag 180
aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt 240
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gtgtttctgt atttgtctga aaattagggc cagactgtta ccactccctt aagtttgacc 1020
ttaggtcact ggaaagatgt cgagcggatc gctcacaacc agtcggtaga tgtcaagaag 1080
agacgttggg ttaccttctg ctctgcagaa tggccaacct ttaacgtcgg atggccgcga 1140
gacggcacct ttaaccgaga cctcatcacc caggttaaga tcaaggtctt ttcacctggc 1200
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ccccctccct gggtcaagcc ctttgtacac cctaagcctc cgcctcctct tcctccatcc 1320
gccccgtctc tcccccttga acctcctcgt tcgaccccgc ctcgatcctc cctttatcca 1380
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cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt 1620
gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc 1680
gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc 1740
acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat 1800
agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc 1860
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ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 2100
gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 2160
tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 2220
gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 2280
tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 2340
agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 2400
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acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 2580
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atttaaagcg ctgatatcga taaaataaaa gattttattt agtctccaga aaaagggggg 2880
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atggaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa ggttaggaac agagagacag 3000
cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa 3060
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ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt 3180
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gaacaacatt ctgagggtag gagtcgaata ttaagtaatc ctgactcaat tagccactgt 3480
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tggggagaat tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 3600
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 3660
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 3720
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taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 4080
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tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 4200
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 4260
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 4320
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 4380
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tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 4800
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tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 4980
aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 5040
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gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 5220
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 5280
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 5340
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tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 5520
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 5580
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attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg 5760
cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 5820
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cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg 6300
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<210> 86
<211> 486
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NK19 蛋白质
<400> 86
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 87
<211> 6488
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> MSCV-IRES-GFP 表达质粒
<400> 87
atgaaagacc ccacctgtag gtttggcaag ctagcttaag taacgccatt ttgcaaggca 60
tggaaaatac ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gttaggaaca gagagacagc 120
agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag 180
aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt 240
tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt 300
cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc 360
cctcactcgg cgcgccagtc ctccgataga ctgcgtcgcc cgggtacccg tattcccaat 420
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acccctgccc agggaccacc gacccccccg ccgggaggta agctggccag cggtcgtttc 600
gtgtctgtct ctgtctttgt gcgtgtttgt gccggcatct aatgtttgcg cctgcgtctg 660
tactagttag ctaactagct ctgtatctgg cggacccgtg gtggaactga cgagttctga 720
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tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 2220
gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 2280
tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 2340
agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 2400
acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca 2460
tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 2520
acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 2580
tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg 2640
agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 2700
tggacgagct gtacaagtaa agcggccgcg actctagagt cgacctgcag gcatgcaagc 2760
ttcaggtagc cggctaacgt taacaaccgg tacctctaga actatagcta gcatgcgcaa 2820
atttaaagcg ctgatatcga taaaataaaa gattttattt agtctccaga aaaagggggg 2880
aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 2940
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gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt 3120
ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt 3180
tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc tcaataaaag agcccacaac 3240
ccctcactcg gcgcgccagt cctccgatag actgcgtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa 3300
taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc 3360
tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc tttcatgggt aacagtttct tgaagttgga 3420
gaacaacatt ctgagggtag gagtcgaata ttaagtaatc ctgactcaat tagccactgt 3480
tttgaatcca catactccaa tactcctgaa atagttcatt atggacagcg cagaaagagc 3540
tggggagaat tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 3600
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 3660
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 3720
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 3780
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 3840
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 3900
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 3960
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 4020
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 4080
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 4140
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 4200
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 4260
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 4320
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 4380
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 4440
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 4500
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 4560
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 4620
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 4680
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tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 4800
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 4860
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ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 5100
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 5160
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 5220
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 5280
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 5340
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ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 5580
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 5640
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 5700
attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg 5760
cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 5820
tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 5880
gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 5940
atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg 6000
ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 6060
cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 6120
cagtcacgac gttgtaaaac gacggcgcaa ggaatggtgc atgcaaggag atggcgccca 6180
acagtccccc ggccacgggg cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg ctcatgagcc 6240
cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg 6300
cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggcga ttagtccaat 6360
ttgttaaaga caggatatca gtggtccagg ctctagtttt gactcaacaa tatcaccagc 6420
tgaagcctat agagtacgag ccatagataa aataaaagat tttatttagt ctccagaaaa 6480
agggggga 6488
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗CLDN6 重链
<400> 88
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Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
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Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
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Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗CLDN6 轻链1
<400> 89
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Val Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ile Tyr Pro Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 智人
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<221> MISC_FEATURE
<223> 抗CLDN6 轻链2
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Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Gly Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr
35 40 45
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Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
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<221> MISC_FEATURE
<223> 抗CD19 轻链可变区
<400> 105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile
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Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗CD19 重链可变区
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗CD19 轻链可变区
<400> 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 115
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 116
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
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Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
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Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
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Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
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Ser Ser
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> huFMC63VLv1
<400> 117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
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<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 120
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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 121
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV2
<400> 121
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1 5 10 15
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV3
<400> 122
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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115 120
<210> 123
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV4
<400> 123
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> huFMC63VLv1 CDR1
<400> 124
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> huFMC63VLv1 CDR2
<400> 125
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 126
<400> 126
000
<210> 127
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VLV2 CDR1
<400> 127
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VLV2 CDR2
<400> 128
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VLV2 CDR3
<400> 129
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VLV3 CDR1
<400> 130
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VLV3 CDR2
<400> 131
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VLV3 CDR3
<400> 132
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV1 CDR1
<400> 133
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 134
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV1 CDR2
<400> 134
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV1 CDR3
<400> 135
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV2 CDR1
<400> 136
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 137
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV2 CDR2
<400> 137
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV2 CDR3
<400> 138
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 139
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV3 CDR1
<400> 139
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 140
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV3 CDR2
<400> 140
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV3 CDR3
<400> 141
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV4 CDR1
<400> 142
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 143
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV4 CDR2
<400> 143
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 144
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUFMC63VHV4 CDR3
<400> 144
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 1122
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA NKG2D-Ox40-CD3z
<400> 145
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 720
ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 780
aagatcagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1122
<210> 146
<211> 341
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 氨基酸NKG2D-OX40-CD3z
<400> 146
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
165 170 175
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
180 185 190
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
210 215 220
Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
225 230 235 240
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
245 250 255
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
260 265 270
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
275 280 285
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
290 295 300
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
305 310 315 320
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
325 330 335
Ala Leu Pro Pro Arg
340
<210> 147
<211> 1467
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA 序列FMC63_CD28_CAR
<400> 147
atgcttctcc tggtgacaag ccttctttac cacacccagc attcctcctg atcccagaca 60
tccagataca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga gtcaccgggc aagtcaggac 120
attagtaaat atttaaattg gtatcagctc tgtgagtgac acagacatca gttgcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840
gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900
cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467
<210> 148
<211> 331
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA 序列FCM63 Light Chain
<400> 148
gacatccaga tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc gggcaagtca 60
ggacattagt aaatatttaa attggtatca gctctgtgag tgacacagac atcagttgca 120
gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg 180
agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa 240
cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac 300
gttcggaggg gggactaagt tggaaataac a 331
<210> 149
<211> 54
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA 序列FMC63接头
<400> 149
ggctccacct ctggatccgg caagcccgga tctggcgagg gatccaccaa gggc 54
<210> 150
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA 序列FMC63 重链
<400> 150
gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60
acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120
ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180
tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300
tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 151
<211> 117
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA 序列CD28间隔物
<400> 151
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 152
<211> 81
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA 序列跨膜域
<400> 152
ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 153
<211> 123
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA 序列CD28 Co-stim
<400> 153
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 154
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD3zeta [重复]
<400> 154
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 155
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> mbIL15的编码序列
<400> 155
aactgggtca acgtgattag cgatttgaag aaaatcgagg accttataca gtctatgcat 60
attgacgcta cactgtatac tgagagtgat gtacacccgt cctgtaaggt aacggccatg 120
aaatgctttc ttctggagct ccaggtcatc agcttggagt ctggggacgc aagcatccac 180
gatacggttg aaaacctcat catccttgcg aacaactctc tctcatctaa tggaaacgtt 240
acagagagtg ggtgtaagga gtgcgaagag ttggaagaaa aaaacatcaa agaatttctt 300
caatccttcg ttcacatagt gcaaatgttc attaacacgt cc 342
<210> 156
<211> 135
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> No: 157的逆翻译的cd铰链的DNA序列
<400> 156
accaccaccc cggcgccgcg cccgccgacc ccggcgccga ccattgcgag ccagccgctg 60
agcctgcgcc cggaagcgtg ccgcccggcg gcgggcggcg cggtgcatac ccgcggcctg 120
gattttgcgt gcgat 135
<210> 157
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 氨基酸CD8铰链
<400> 157
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 158
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> No: 159的逆翻译的CD8 TM的DNA序列
<400> 158
atttatattt gggcgccgct ggcgggcacc tgcggcgtgc tgctgctgag cctggtgatt 60
accctgtatt gc 72
<210> 159
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> AA 序列CD8 TM
<400> 159
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 160
<211> 2204
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA NK19H-1
<400> 160
gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60
ctccacgccg ccaggccgga ctacaaagac gatgacgata aaggcggtgg tggctctggt 120
ggtggcggca gcgatattca gatgacccag agcccgagca gcctgagcgc gagcgtgggc 180
gatcgcgtga ccattacctg ccgcgcgagc caggatatta gcaaatatct gaactggtat 240
cagcagaaac cgggcggcac cgtgaaactg ctgatttatc ataccagccg cctgcatagc 300
ggcgtgccga gccgctttag cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaccattagc 360
agcctgcagc cggaagatat tgcgacctat tattgccagc agggcaacac cctgccgtat 420
acctttggcg gcggcaccaa actggaaatt accggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 480
tcgggtggcg gcggatctca ggtgcagctg caggaaagcg gcccgggcct ggtgaaaccg 540
agccagaccc tgagcctgac ctgcaccgtg agcggcgtga gcctgccgga ttatggcgtg 600
agctggattc gccagccgcc gggcaaaggc ctggaatgga ttggcgtgat ttggggcagc 660
gaaaccacct attataacag cgcgctgaaa agccgcctga ccattagcaa agataacagc 720
aaaaaccagg tgagcctgaa actgagcagc gtgaccgcgg cggataccgc ggtgtattat 780
tgcgcgaaac attattatta tggcggcagc tatgcgatgg attattgggg ccagggcacc 840
agcgtgaccg tgagcagcac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 900
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 960
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 1020
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgccggag ggaccagagg 1080
ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg ggaggcagtt tccggacccc catccaagag 1140
gagcaggccg acgcccactc caccctggcc aagatcagag tgaagttcag caggagcgca 1200
gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1260
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1320
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1380
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1440
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1500
ctgccccctc gcggctctgg cgagggaagg ggttccctgc ttacttgcgg cgacgtcgaa 1560
gagaatcccg gtccgatggc cctcccagta actgccctcc ttttgcccct cgcactcctt 1620
cttcatgccg ctcgccccaa ctgggtcaac gtgattagcg atttgaagaa aatcgaggac 1680
cttatacagt ctatgcatat tgacgctaca ctgtatactg agagtgatgt acacccgtcc 1740
tgtaaggtaa cggccatgaa atgctttctt ctggagctcc aggtcatcag cttggagtct 1800
ggggacgcaa gcatccacga tacggttgaa aacctcatca tccttgcgaa caactctctc 1860
tcatctaatg gaaacgttac agagagtggg tgtaaggagt gcgaagagtt ggaagaaaaa 1920
aacatcaaag aatttcttca atccttcgtt cacatagtgc aaatgttcat taacacgtcc 1980
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ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500
gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560
ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620
gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680
ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740
gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800
tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860
gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920
acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980
cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040
ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100
ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150
<210> 207
<211> 706
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> AA NK19H-NF-12
<400> 207
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys
210 215 220
Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln
325 330 335
Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg
340 345 350
Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys
355 360 365
Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
370 375 380
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
385 390 395 400
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
405 410 415
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
420 425 430
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
435 440 445
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
450 455 460
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
465 470 475 480
Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
485 490 495
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu
500 505 510
Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val
515 520 525
Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile
530 535 540
Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val
545 550 555 560
Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu
565 570 575
Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu
580 585 590
Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys
595 600 605
Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln
610 615 620
Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr
625 630 635 640
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
645 650 655
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
660 665 670
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
675 680 685
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
690 695 700
Tyr Cys
705

Claims (68)

1.一种多核苷酸，其编码CD19定向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：
细胞外抗CD19结合部分，其中所述抗CD19结合部分包含单链可变片段(scFv)的可变重(VH)域和scFv的可变轻(VL)域；
铰链，其中所述铰链是CD8α铰链；
跨膜域，其中所述跨膜域包含CD8α跨膜域；以及
细胞内信号传导域，其中所述细胞内信号传导域包含
OX40亚域，其中所述OX40亚域由与SEQ ID NO.5具有至少95％序列同一性的序列编码，
CD3ζ亚域，其中所述CD3ζ亚域由与SEQ ID NO.7具有至少95％序列同一性的序列编码，并且
其中所述多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)，其中所述mbIL15由与SEQ IDNO.11具有至少95％序列同一性的序列编码。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中编码的VH域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中编码的VL域包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含选自下组的至少一个重链互补决定区(CDR)的VH域，所述组由以下各项组成：SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134和SEQID NO:135，并且其中所述多核苷酸编码包含选自下组的至少一个轻链互补决定区(CDR)的VL域，所述组由以下各项组成：SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129。
5.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述VH域由SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列的人源化产生，并且其中所述VL域由SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列的人源化产生。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CD19定向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体与SEQ ID NO:187中所列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
7.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CD19定向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:187中所列出的氨基酸序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述OX40亚域由SEQ ID NO.5编码。
9.如权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中编码的OX40亚域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
10.如权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述CD3ζ亚域由SEQ ID NO.7编码。
11.如权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中编码的CD3ζ亚域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
12.如权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述mbIL15由SEQ ID NO.11编码。
13.如权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中编码的mbIL15包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
14.如权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述VH域包含选自SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123的VH域，并且其中所述VL域包含选自SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119的VL域。
15.如权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含选自下组的至少一个轻链互补决定区(CDR)的VL域，所述组由以下各项组成：SEQ ID NO:127、SEQ IDNO:128和SEQ ID NO:129。
16.一种用于治疗癌症的方法，其包括将包含自然杀伤(NK)细胞的组合物施用于患有癌症的受试者，所述自然杀伤细胞表达由如权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸编码的嵌合抗原受体。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述NK细胞是源自非所述受试者的供体的同种异体细胞。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述NK细胞是源自所述受试者的自体细胞。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其进一步包括将白介素2施用于所述受试者。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其进一步包括在施用所述NK细胞之前将化学疗法治疗施用于所述受试者。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述化学疗法治疗在所述受试者中诱导淋巴消减。
22.如权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸，其中所述CD8α铰链由SEQ ID NO:1编码。
23.如权利要求1至15或22中任一项所述的多核苷酸，其中所述CD8α跨膜域由SEQ IDNO:3编码。
24.如权利要求1至15或22至23中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸不编码DAP10域。
25.如权利要求1至15或22至24中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸不编码DAP12域。
26.如权利要求1至15或22至25中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步编码作为信号传导亚域的CD44和CD27中的一种或多种。
27.如权利要求1至15或22至26中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步编码检测标签。
28.一种多核苷酸，其编码CD19定向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：
细胞外抗CD19结合部分，其中所述抗CD19结合部分包含单链可变片段(scFv)的可变重(VH)域和scFv的可变轻(VL)域，
其中编码的VH域包含选自下组的至少一个重链互补决定区(CDR)，所述组由以下各项组成：SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135，
其中编码的VL域包含选自下组的至少一个轻链互补决定区(CDR)，所述组由以下各项组成：SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129；
铰链域；
跨膜域；
细胞内信号传导域，
其中所述细胞内信号传导域包含：
OX40亚域和CD3ζ亚域，并且
其中所述多核苷酸还编码膜结合的白介素-15(mbIL15)。
29.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述编码的VH域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。
30.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述编码的VL域包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列。
31.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述CD3ζ亚域由与SEQ ID NO.7具有至少95％序列同一性的序列编码，其中所述OX40亚域由与SEQ ID NO.5具有至少95％序列同一性的序列编码，并且其中所述mbIL15由与SEQ ID NO.11具有至少95％序列同一性的序列编码。
32.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述VH域由SEQ ID NO:33中所列出的VH域氨基酸序列的人源化产生，并且其中所述VL域由SEQ ID NO:32中所列出的VL域氨基酸序列的人源化产生。
33.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CD19定向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体与SEQ ID NO:187中所列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
34.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CD19定向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:187中所列出的氨基酸序列。
35.如权利要求28至34中任一项所述的多核苷酸，其中所述OX40亚域由SEQ ID NO.5编码。
36.如权利要求28至34中任一项所述的多核苷酸，其中编码的OX40亚域包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
37.如权利要求28至34中任一项所述的多核苷酸，其中所述CD3ζ亚域由SEQ ID NO.7编码。
38.如权利要求28至34中任一项所述的多核苷酸，其中编码的CD3ζ亚域包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列。
39.如权利要求28至34中任一项所述的多核苷酸，其中所述mbIL15由SEQ ID NO.11编码。
40.如权利要求28至34中任一项所述的多核苷酸，其中编码的mbIL15包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
41.一种用于治疗癌症的方法，其包括将包含自然杀伤(NK)细胞的组合物施用于患有癌症的受试者，所述自然杀伤细胞表达由如权利要求28至40中任一项所述的多核苷酸编码的嵌合抗原受体。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述NK细胞是源自非所述受试者的供体的同种异体细胞。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述NK细胞是源自所述受试者的自体细胞。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其进一步包括将白介素2施用于所述受试者。
45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其进一步包括在施用所述NK细胞之前将化学疗法治疗施用于所述受试者。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述化学疗法治疗在所述受试者中诱导淋巴消减。
47.如权利要求28至40中任一项所述的多核苷酸，其中所述CD8α铰链由SEQ ID NO:1编码。
48.如权利要求28至40或47中任一项所述的多核苷酸，其中所述CD8α跨膜域由SEQ IDNO:3编码。
49.如权利要求28至40或47至48中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸不编码DAP10域。
50.如权利要求28至40或47至49中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸不编码DAP12域。
51.如权利要求28至40或47至50中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步编码作为信号传导亚域的CD44和CD27中的一种或多种。
52.如权利要求28至40或47至51中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步编码检测标签。
53.一种免疫细胞，其表达CD19定向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由如权利要求1至15、22至40或47至52中任一项所述的多核苷酸编码。
54.如权利要求53所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是NK细胞。
55.根据权利要求53和54中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞相对于接受所述免疫细胞的受试者是同种异体的。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的免疫细胞用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的用途。
57.根据权利要求53至55中任一项所述的免疫细胞用于制造药物的用途，所述药物用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症。
58.根据权利要求1至15、22至40或47至52中任一项所述的多核苷酸在制造药物中的用途，所述药物用于在有此需要的哺乳动物中增强NK细胞细胞毒性。
59.根据权利要求1至15、22至40或47至52中任一项所述的多核苷酸在制造药物中的用途，所述药物用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症。
60.根据权利要求1至15、22至40或47至52中任一项所述的多核苷酸用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的用途。
61.一种用于使用细胞免疫疗法治疗癌症的方法，所述方法包括，
将表达CD19定向性嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞群体施用于受试者，所述CAR包含
细胞外抗CD19结合部分，其中所述抗CD19结合部分包含单链可变片段(scFv)的可变重(VH)域和scFv的可变轻(VL)域；
铰链，其中所述铰链是CD8α铰链；
跨膜域，其中所述跨膜域包含CD8α跨膜域；以及
细胞内信号传导域，其中所述细胞内信号传导域包含
OX40亚域，其中所述OX40亚域由与SEQ ID NO.5具有至少95％序列同一性的序列编码，
CD3ζ亚域，其中所述CD3ζ亚域由与SEQ ID NO.7具有至少95％序列同一性的序列编码，并且
其中所述细胞还表达膜结合的白介素-15(mbIL15)，其中所述mbIL15由与SEQ IDNO.11具有至少95％序列同一性的序列编码。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述免疫细胞群体包含自然杀伤(NK)细胞。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述免疫细胞群体相对于所述受试者是同种异体的。
64.如权利要求61所述的方法，其中编码的VH域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，其中编码的VL域包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，其中所述CD3ζ亚域由与SEQ ID NO.7具有至少95％序列同一性的序列编码，其中所述OX40亚域由与SEQ ID NO.5具有至少95％序列同一性的序列编码，并且其中所述mbIL15由与SEQ ID NO.11具有至少95％序列同一性的序列编码。
65.如权利要求61所述的方法，其中所述多核苷酸编码CD19定向性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体与SEQ ID NO:187中所列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
66.如权利要求61至65中任一项所述的方法，其中所施用的群体包含每千克所述受试者体重约2x106个细胞。
67.如权利要求61至66中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内的。
68.如权利要求61至67中任一项所述的方法，其中在所述施用之前进行至少一种在所述受试者中导致淋巴消减的治疗。
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