CN111088231A - Pd-l1抗体分泌的抗间皮素car-t细胞肿瘤免疫治疗 - Google Patents

Pd-l1抗体分泌的抗间皮素car-t细胞肿瘤免疫治疗 Download PDF

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Abstract

本发明提出了PD‑L1抗体分泌的抗间皮素CAR‑T细胞肿瘤免疫治疗，该CAR‑T细胞共表达抗PD‑L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，其中，所述抗PD‑L1融合抗体由抗PD‑L1单链抗体连接到含有氨基酸突变的IgG1Fc片段形成。该转基因淋巴细胞分泌抗PD‑L1单链抗体与IgG Fc融合抗体，具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达间皮素及PD‑L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，且安全性高。

Description

PD-L1抗体分泌的抗间皮素CAR-T细胞肿瘤免疫治疗
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及T淋巴细胞、慢病毒、转基因淋巴细胞、构建体、用于治疗癌症的治疗组合物和提高淋巴细胞活性和治疗安全性的方法。
背景技术
间皮素(mesothelin，MSLN)是一种分化抗原，它在人类正常组织的表达仅限于的胸膜、心包膜和腹膜衬里的间皮细胞。然而，间皮素却在多种人类癌症组织中高表达，包括几乎所有的间皮瘤和胰腺癌和约70％的卵巢癌和约50％的肺腺癌以及其他癌症，例如胆管癌，胃癌，肠癌，食管癌，乳腺癌。间皮素基因编码71KDa的前体蛋白，前体蛋白继而被加工成31KDa的脱落片段和40KDa的蛋白片段，31KDa的脱落片段被称为巨核细胞促进因子(MPF)，而40KDa的蛋白片段即被称为间皮素，间皮素通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)的锚定作用固定在细胞膜上。
以间皮瘤为例，间皮瘤有胸膜间皮瘤和腹膜间皮瘤之分，胸膜间皮瘤是胸膜原发肿瘤，有局限型(多为良性)和弥漫型(都是恶性)之分，其中弥漫型恶性间皮瘤是胸部预后最坏的肿瘤之一。腹膜间皮瘤是指原发于腹膜间皮细胞的肿瘤。临床表现不具有特征性，常见的症状和体征有：腹痛、腹水、腹胀及腹部包块等。恶性胸膜间皮瘤的治疗，目前仍然没有有效的根治方法。治疗方法上，有姑息性治疗、外科治疗、化学治疗及放射治疗等，一般认为对于肿瘤相对局限的I期病人，主张做根治的胸膜肺切除术。对于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期病人，根治性手术已经没有意义了，只有施行姑息性手术。事实上，多数病人到疾病明确诊断时，已处于II期以上。迅速增长的胸水常导致患者严重的呼吸困难，姑息性手术只能暂时提高这些晚期病人的生活质量，而无法根治。
由此可见，开发针对间皮素高表达肿瘤的治疗方法尤为迫切。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
间皮素却在多种人类癌症组织中高表达，包括几乎所有的间皮瘤和胰腺癌和约70％的卵巢癌和约50％的肺腺癌以及其他癌症，例如胆管癌，胃癌，肠癌，食管癌，乳腺癌。因此，间皮素代表着肿瘤免疫治疗领域中一个有着巨大吸引力的靶点。
但是在肿瘤的免疫治疗中，作为免疫负调节机制，激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)可以表达负调控的监管结构，即在细胞表面或细胞内表达免疫检查点分子，如程序性细胞死亡1受体(PD-1)可以表达在活化CTLs上，其与肿瘤细胞上表达的程序性死亡配体1(PD-L1)相互作用，可以抑制抗肿瘤T细胞反应。而恰恰许多肿瘤细胞，包括间皮素高表达肿瘤细胞均高表达PD-L1，PD-L1与PD-1的结合，导致CTLs增生性反应的下调，细胞因子的分泌减少和T细胞的无能或凋亡。进而导致肿瘤免疫治疗的效果大打折扣。
为了解决上述问题，发明人提出了一种可以表达和分泌抗PD-L1抗体、表达具有识别MSLN的嵌合抗原受体以及无功能EGFR的转基因淋巴细胞，在本申请中，称之为PD-L1抗体分泌的抗间皮素CAR-T细胞。发明人在实验中发现，本发明所提出的抗间皮素CAR-T细胞可以抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，对高表达间皮素肿瘤的特异杀伤能力强，而对正常MSLN表达水平的间皮细胞没有杀伤，且本申请所提出的抗间皮素CAR-T细胞可表达无功能EGFR，显著增加了该CAR-T细胞治疗的安全性。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种T淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述T淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别肿瘤抗原间皮素；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，所述跨膜区包括CD8的跨膜段，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括4-1BB的胞内段以及CD3ζ链；所述抗PD-L1融合抗体包括：PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1 Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1 Fc区相连，所述IgG1 Fc区具有T250Q和M248L突变。根据本发明的实施例的T淋巴细胞可以分泌抗PD-L1抗体，具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，在体外的增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力显著提高，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，安全性高。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带下列核酸分子：(a)编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子，所述抗PD-L1抗体包括：PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1 Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1 Fc区相连，所述IgG Fc区具有T250Q和M248L突变；(b)编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体的胞外区识别肿瘤抗原间皮素；以及(c)编码无功能EGFR的核酸分子。将根据本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其可以表达和分泌抗PD-L1抗体，具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，在体外的增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力显著增强，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，安全性高。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的核酸分子。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的核酸分子。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的核酸分子。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的核酸分子。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的核酸分子。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的核酸分子。
将根据本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其可以表达和分泌抗PD-L1抗体，具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，在体外的增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力显著增强，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，且安全性更高。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述转基因淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素，其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述转基因淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段；所述抗PD-L1融合抗体包括：PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1 Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1 Fc区具有T250Q和M248L突变。根据本发明实施例的转基因淋巴细胞的体外增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力以及在肿瘤病人体内的对肿瘤细胞的特异性杀伤能力大大提高，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，安全性高。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码抗PD-L1融合抗体，所述抗PD-L1融合抗体包括：PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1 Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1 Fc区相连，所述IgG Fc区具有T250Q和M248L突变；第二核酸分子，所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素；以及第三核酸分子，所述第三核酸分子编码无功能EGFR，其中，所述抗PD-L1融合抗体、所述嵌合抗原受体、所述无功能EGFR如前面所描述的。根据本发明的实施例构建体成功导入本发明实施例的淋巴细胞后，可有效表达和分泌抗PD-L1抗体，表达无功能EGFR以及表达特异性识别MSLN的嵌合抗原受体，从而所获得的淋巴细胞对肿瘤细胞，尤其是高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤细胞的定向杀伤作用更加显著，安全性高。
在本发明的第十一方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述治疗组合物包括：上述构建体、慢病毒、T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现转基因淋巴细胞或T淋巴细胞抗PD-L1抗体的表达和分泌和无功能EGFR和特异性识别MSLN的嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞具有显著的抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制，在肿瘤病人体外和体内的增殖及肿瘤病人体内存活能力大大提高，转基因淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。根据本发明实施例的治疗癌症的治疗组合物对肿瘤细胞的靶向杀伤作用显著增强，尤其是对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤细胞的靶向杀伤作用显著增强、安全性进一步提高。
在本发明的第十二方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞活性和治疗安全性的方法，所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素，根据本发明的实施例，所述方法包括：使所述淋巴细胞表达抗PD-L1融合抗体，以及使所述淋巴细胞表达无功能EGFR。所述抗PD-L1融合抗体、所述淋巴细胞、所述嵌合抗原受体、所述无功能EGFR如是如前所定义的，所述淋巴细胞活性包括所述淋巴细胞体外增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力以及所述淋巴细胞在肿瘤病人体内的定向杀伤能力的至少一种。根据本发明的实施例淋巴细胞表达和分泌抗PD-L1抗体，淋巴细胞活化、增生性反应上调、细胞因子分泌增多、抗调亡能力增强，淋巴细胞在体外扩增、在肿瘤病人体内的增殖及肿瘤病人体内存活能力大大提高。上述抗PD-L1抗体的分泌配合淋巴细胞嵌合抗原受体的抗原特异性功效，从而实现了有效抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制，对高表达MSLN的肿瘤细胞的靶向杀伤作用显著增强。无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明是实施例的淋巴细胞在用于治疗治疗高表达MSLN的肿瘤细胞时，如果病人出现严重不良反应，本发明实施例的淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可提高本发明实施例的淋巴细胞治疗高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤病人的安全性。
附图说明
图1是根据本发明实施例的共表达抗PD-L1scFv-Fc融合抗体，抗MSLN抗原特异性的嵌合抗原受体和无功能EGFR的慢病毒载体的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的共表达抗PD-L1 scFv-Fc融合抗体，抗MSLN抗原特异性的嵌合抗原受体和无功能EGFR的淋巴细胞体外分泌抗PD-L1 scFv-Fc融合抗体及抑制PD-1与PD-L1相互作用的结果图；
图3是根据本发明实施例的共表达抗PD-L1 scFv-Fc融合抗体，抗MSLN抗原特异性的嵌合抗原受体和无功能EGFR的淋巴细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的结果图；
图4是根据本发明实施例的共表达抗PD-L1 scFv-Fc融合抗体，抗MSLN抗原特异性的嵌合抗原受体和无功能EGFR的淋巴细胞体内杀伤肿瘤细胞能力的结果图；以及
图5是根据本发明实施例的共表达抗PD-L1 scFv-Fc融合抗体，抗MSLN抗原特异性的嵌合抗原受体和无功能EGFR淋巴细胞注射小鼠血清中，分泌的抗PD-L1 scFv-Fc融合蛋白抗体抑制PD-1与PD-L1相互作用的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，如无特别说明，本申请所述的“抗PD-L1融合抗体”是指PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区的融合蛋白，其中IgG1 Fc区具有T250Q和M248L突变，该融合抗体具有抗PD-L1活性，可以与PD-L1特异性结合。
转基因淋巴细胞
一方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述转基因淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素，其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区；跨膜区，所述跨膜区包括CD8的跨膜段，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述转基因淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段；所述抗PD-L1融合抗体包括：PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1 Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1 Fc区相连，所述IgG1 Fc区具有T250Q和M248L突变。
根据本发明的实施例，所述抗PD-L1融合抗体是一种分泌型抗体。由此，抗PD-L1融合抗体分泌到细胞外，并且与细胞表面的PD-L1特异性结合，进而有效阻遏PD-1：PD-L1介导的免疫逃逸机制。
人类抗体包括两个免疫球蛋白轻链和两个免疫球蛋白重链，重链和轻链间以共价键或非共价键连接，进而导致形成三个独立的蛋白区-两个Fab区和一个Fc区。Fab区和Fc区通过作为铰链区的有弹性的连接部连接的。抗体中的Fab区是一样的结构，Fab区有一个特异性的抗原结合位点，Fc区与配体的相互作用位点，该位点能够诱导效应器功能，包括细胞Fc受体和C1q补体成份。治疗性抗体的生理学活性由两个独立的天然免疫球蛋白机制介导：治疗性抗体的效力由它的特异性和与目标抗原的二价结合引起(如，阻断或中和靶抗原或诱导细胞凋亡)，也可由Fc和效应器配体(Fc受体和C1q部件)形成的免疫复合体激活的效应器功能引起。
单链抗体(scFv)是一种基因工程抗体，其中VH和VL域与柔性多肽连接体相连。与整体抗体的Fab区相比，单链抗体表现出更好的组织渗透药动学，并且由于抗原结合表面未被改变而具有完全的抗原结合特异性。然而，单链抗体在血液中的半衰期短，因为单链抗体中没有Fc分子片段，缺少没有Fc片段效应功能。根据本发明实施例的抗PD-L1融合抗体中的PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1 Fc区相连，因此，所述PD-L1融合抗体在血液中的半衰期相较于单独的PD-L1单链抗体，显著延长。
抗体的Fc区介导其血清半衰期和效应功能，如补体依赖的细胞毒(CDC)，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。Fc片段用于与单链抗体连接，以增加单链抗体在血液中的半衰期，并具有Fc效应功能。五类免疫球蛋白(IgM、IgD和IgE，IgG，IgA，IgG亚类)和四个IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)是存在于人类。人血清中IgG含量最高。四亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4是高度保守的，在他们的恒定区不同，尤其是在铰链上CH2域。这些地区的参与结合IgG Fc受体(FcγR)和补体C1q。结果，不同的子类有不同的效应功能，在触发FCγr表达细胞，从而引起吞噬或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，并激活补体。IgG1和IgG3能有效触发这一经典途径补体，但IgG2和IgG4并不那么有效。
PD-L1免疫检查点分子往往是在肿瘤细胞中高表达。根据本发明的实施例，针对肿瘤细胞表达PD-L1的单链抗体融合了IgG1 Fc，此单链抗体的半衰期延长，并且此单链抗体与PD-L1结合能力增强，从而阻断PD-1和PD-L1相互作用，增强CTL杀伤肿瘤细胞。IgG1 Fc能够有效的触发效应功能，如补体依赖的细胞毒(CDC)，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)，来进一步杀伤肿瘤细胞。
现在很多基因工程方法瞄准改建抗体的药动学/药效学性质。改进抗体的药代动力学性质，一个比较深入的研究领域是涉及研究Fc区与新生Fc受体(FcRn)的相互作用。FcRn在内涵体酸性(pH～6)环境下与免疫球蛋白(IgG)结合，当暴露在生理pH环境下，又将IgG释放如循环系统。在内涵体内不与IgG结合的FcRn，会在溶酶体中经历蛋白质降解。IgG进入循环系统和进入降解途径的比例，对决定IgG在循环系统中半衰期至关重要。已经有研究证据表明，通过使CH2和CH3FC区中的残基突变以提高IgG与FcRn结合特性，可显著提高抗体的半衰期。发明人发现，将IgG1,IgG4或IgG2抗体的Fc区428位的Met突变为Leu(M428L)，250位的Thr突变为Gln(T250Q)，可显著提高IgG在体内的半衰期。
本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞在肿瘤病人体内和体外的增殖和生存能力以及在肿瘤病人体内的对特意性肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤细胞的特异性杀伤效果大大提高，并且安全性也显著提高。
根据本发明的实施例，本发明实施例的无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR可作为淋巴细胞的自杀标记。无功能EGFR表达淋巴细胞可被抗EGFR抗体在体内清除。从而，本发明实施例的T淋巴细胞表达无功能EGFR，在保证转基因淋巴细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，转基因淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可进一步提高本发明实施例的转基因淋巴细胞或T淋巴细胞治疗高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤病人的安全性。
根据本发明的实施例，所述PD-L1单链抗体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIVLTQSPASLALSPGERATLSCRATESVEYYGTSLVQWYQQKPGQPPKLLIYAASSVDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEEEDAAMYFCQQSRRVPYTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQAPGQRLEWIGYVNPFNDGTKYNEMFKGRATLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQAWGYPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)。
根据本发明的实施例，所述IgG1 Fc区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:2)。
根据本发明的实施例，所述抗PD-L1融合抗体具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIVLTQSPASLALSPGERATLSCRATESVEYYGTSLVQWYQQKPGQPPKLLIYAASSVDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEEEDAAMYFCQQSRRVPYTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQAPGQRLEWIGYVNPFNDGTKYNEMFKGRATLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQAWGYPWGQGTLVTVSSAAADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:3)。
根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28、CD3以及他们的衍生物的至少一种。本发明实施例的免疫共刺激分子胞内段的表达以及抗PD-L1抗体表达的联合具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用，本发明实施例的免疫共刺激分子胞内段的表达、无功能EGFR的表达以及抗PD-L1抗体表达的联合，使得本发明实施例的转基因淋巴细胞增殖对肿瘤的定向杀伤作用更加显著和安全。
根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB或CD3的胞内段；
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。CD3+淋巴细胞是总T细胞，自然杀伤细胞是免疫细胞的一种，非特异性识别靶细胞，自然杀伤T细胞是具有T细胞和自然杀伤细胞受体的T细胞亚群。上述淋巴细胞中表达抗PD-L1抗体和表达嵌合抗原受体，使得上述淋巴细胞的细胞免疫的靶向杀伤性更强，对肿瘤细胞的杀伤作用效果更加显著；上述淋巴细胞表达无功能EGFR和表达嵌合抗原受体，使得上述淋巴细胞的细胞免疫杀伤作用更加安全有效。
构建体
在本发明的另一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码抗PD-L1融合抗体，所述抗PD-L1融合抗体包括：PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1 Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1 Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L突变；第二核酸分子，所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素；以及第三核酸分子，所述第三核酸分子编码无功能EGFR。根据本发明实施例的构建体导入淋巴细胞后，获得的转基因淋巴细胞能够表达和分泌抗PD-L1抗体，具有了显著的抵抗肿瘤介导的免疫抑制的功效，抗调亡能力和增殖能力增强、定向杀伤能力显著提高，免疫杀伤安全性显著提高，在肿瘤病人体内和体外的增殖和生存能力以及在肿瘤病人体内的杀伤能力大大提高，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤细胞特异性杀伤效果尤为显著。
根据本发明的实施例，所述抗PD-L1融合抗体具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:4或5所示的氨基酸序列。
MVLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQAQVQLVQSGAEVKRPGASVQVSCRASGYSINTYYMQWVRQAPGAGLEWMGVINPSGVTSYAQKFQGRVTLTNDTSTNTVYMQLNSLTSADTAVYYCARWALWGDFGMDVWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASIGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTKLEIKRASTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:4)。
MVLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQAQVQLVQSGAEVKRPGASVQVSCRASGYSINTYYMQWVRQAPGAGLEWMGVINPSGVTSYAQKFQGRVTLTNDTSTNTVYMQLNSLTSADTAVYYCARWALWGDFGMDVWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASIGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTKLEIKRASFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:5)。
具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的嵌合抗原受体相比具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的嵌合抗原受体在CD8分子区段的胞外段和胞内段更长。CD8铰链区、跨膜区和胞内区氨基酸序列将影响CAR蛋白分子空间构型，双聚体和多聚体形成，进而影响与下游信号传导分子的结合，从而影响淋巴细胞激活程度和细胞因子产生水平。具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和铰链区，所述单链抗体包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原人MSLN，所述铰链区包括含人CD8分子胞外段和3个附加氨基酸残基AAA，所述AAA位于所述人CD8分子胞外段的N端，所述人CD8分子胞外段具有55个氨基酸残基；跨膜区，所述跨膜区包括人CD8分子跨膜段，所述人CD8分子跨膜段与所述胞外区的铰链区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区包括人CD8分子胞内段和4-1BB分子胞内段以及CD3ζ链胞内段，所述人CD8分子胞内段具有7个氨基酸残基，所述人CD8分子胞内段与所述人CD8分子跨膜段相连。相比于SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5嵌合抗原受体的空间构型不同，表达该嵌合抗原受体的淋巴细胞具有细胞增殖更加温和，细胞因子分泌更少，细胞因子释放综合征和神经毒性副作用更少的优势。
根据本发明的实施例，所述无功能EGFR具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRR(SEQ ID NO:6)。
根据本发明的实施例，所述编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子具有SEQ ID NO:7～9所示的核苷酸序列。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATTGTGCTCACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTCTGTCTCCCGGGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGCAGAGCCACTGAAAGTGTTGAATACTATGGCACAAGTTTAGTGCAGTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAGCGTAGATTCTGGGGTCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAATTCTCTGGAGGAGGAGGATGCTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAGGAGGGTTCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGGCCCCTGGGCAGCGCCTTGAGTGGATTGGATATGTTAATCCTTTCAATGATGGTACTAAGTACAATGAGATGTTCAAAGGCAGGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACAGGCTTGGGGTTACCCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCTGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:7)。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGAAATCGTCCTGACTCAAAGCCCAGCGACTTTGTCCCTCTCCCCAGGCGAGCGGGCCACGCTGTCTTGCAGGGCCACCGAGTCTGTGGAGTATTATGGTACAAGCCTGGTGCAATGGTATCAACAAAAGCCTGGTCAGCCGCCTAAACTCCTCATCTACGCTGCCTCTTCAGTAGATTCAGGCGTTCCATCTCGATTCTCTGGCAGCGGAAGCGGAACAGACTTCACCCTCACGATTAATAGCCTGGAAGCAGAAGACGCTGCAACCTATTATTGCCAGCAGTCAAGAAGGGTTCCATATACGTTTGGCGGCGGAACCAAACTTGAGATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAAGTACAACTGGTGCAGAGTGGAGCGGAGGTTAAGAAACCGGGGGCAACAGTGAAAATATCTTGCAAGGTTTCTGGTTATACGTTTACGAGTTATGTCATGCATTGGGTCCGACAGGCCCCTGGGCAGGGCCTGGAATGGATGGGTTATGTGAACCCCTTCAATGATGGGACGAAATACAATGAAATGTTCAAAGGTAGAGTGACAATTACACGGGATACGTCCGCAAGCACGGCATATATGGAGCTTAGTTCACTCCGCAGTGAAGATACTGCTGTCTACTATTGTGCGAGACAAGCCTGGGGGTATCCATGGGGGCAAGGCACGCTTGTAACGGTGAGTGCGGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:8)。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGATATAGTGCTCACACAAAGCCCGGCCTCTCTCGCCGTAAGTCTGGGGCAACGAGCTACTATCAGTTGCCGCGCTACGGAGAGCGTGGAATACTATGGAACGAGTCTGGTGCAGTGGTATCAGCAAAAACCGGGGCAACCACCGAAACTGCTGATATACGCCGCTTCATCTGTTGACTCTGGAGTGCCAGCAAGGTTTAGTGGTAGCGGCTCTGGCACTGACTTCTCACTTACAATACATCCTGTGGAGGAGGATGACATAGCCATGTACTTCTGTCAGCAATCCAGGCGAGTCCCATACACGTTTGGTGGGGGGACGAAGTTGGAAATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAAGTTCAGTTGCAACAGTCTGGTCCAGAGCTTGTTAAACCGGGGGCAAGCGTTAAAATGAGCTGCAAAGCCTCAGGGTACACCTTTACAAGTTATGTAATGCACTGGGTTAAACAGAAACCCGGCCAGGGTCTGGAGTGGATTGGCTACGTCAACCCCTTTAATGACGGTACCAAGTACAATGAGATGTTCAAGGGCAAAGCCACACTTACGTCCGATAAGAGTAGTAGCACCGCCTACATGGAACTTTCTAGCTTGACTTCCGAAGACAGTGCATGGTACTATTGTGCGAGACAAGCGTGGGGTTATCCTTGGGGCCAAGGTACTCTTGTGACGGTATCAGCGGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQID NO:9)。
根据本发明的实施例，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO:10或11所示的核苷酸序列。
ATGGTTCTGCTGGTGACATCTCTCCTGCTCTGTGAACTGCCTCATCCCGCTTTTCTGCTCATTCCCGACATTCAGGCTCAAGTCCAACTGGTCCAAAGTGGTGCTGAAGTCAAACGCCCGGGTGCCTCCGTCCAAGTCTCCTGCCGTGCCTCTGGCTACTCGATTAACACCTATTACATGCAGTGGGTCCGTCAAGCACCGGGTGCAGGTCTGGAATGGATGGGTGTCATCAATCCGTCCGGCGTGACCTCATATGCGCAGAAATTTCAAGGTCGCGTTACCCTGACGAACGATACCAGCACGAATACCGTCTACATGCAGCTGAACTCTCTGACGAGTGCAGACACCGCGGTGTATTACTGCGCACGTTGGGCACTGTGGGGCGATTTCGGCATGGATGTTTGGGGCAAAGGTACGCTGGTGACCGTTAGCTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTTCTGATATTCAGATGACGCAAAGCCCGTCTACCCTGAGTGCCTCCATTGGTGACCGTGTTACGATCACCTGTCGCGCATCCGAAGGCATCTATCATTGGCTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTATAAAGCAAGTTCCCTGGCATCGGGTGCTCCGAGCCGCTTTTCAGGTTCGGGTAGCGGCACCGATTTCACGCTGACCATCTCATCGCTGCAGCCGGACGATTTCGCTACCTACTACTGCCAACAATACTCAAACTACCCGCTGACCTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGCTAGCACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTAA(SEQ ID NO:10)。
ATGGTTCTGCTGGTGACATCTCTCCTGCTCTGTGAACTGCCTCATCCCGCTTTTCTGCTCATTCCCGACATTCAGGCTCAAGTCCAACTGGTCCAAAGTGGTGCTGAAGTCAAACGCCCGGGTGCCTCCGTCCAAGTCTCCTGCCGTGCCTCTGGCTACTCGATTAACACCTATTACATGCAGTGGGTCCGTCAAGCACCGGGTGCAGGTCTGGAATGGATGGGTGTCATCAATCCGTCCGGCGTGACCTCATATGCGCAGAAATTTCAAGGTCGCGTTACCCTGACGAACGATACCAGCACGAATACCGTCTACATGCAGCTGAACTCTCTGACGAGTGCAGACACCGCGGTGTATTACTGCGCACGTTGGGCACTGTGGGGCGATTTCGGCATGGATGTTTGGGGCAAAGGTACGCTGGTGACCGTTAGCTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTTCTGATATTCAGATGACGCAAAGCCCGTCTACCCTGAGTGCCTCCATTGGTGACCGTGTTACGATCACCTGTCGCGCATCCGAAGGCATCTATCATTGGCTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTATAAAGCAAGTTCCCTGGCATCGGGTGCTCCGAGCCGCTTTTCAGGTTCGGGTAGCGGCACCGATTTCACGCTGACCATCTCATCGCTGCAGCCGGACGATTTCGCTACCTACTACTGCCAACAATACTCAAACTACCCGCTGACCTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGCTAGCTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:11)。
根据本发明的实施例，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
ATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO:12)。
根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：13～18任一所示核苷酸序列的核酸分子。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATTGTGCTCACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTCTGTCTCCCGGGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGCAGAGCCACTGAAAGTGTTGAATACTATGGCACAAGTTTAGTGCAGTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAGCGTAGATTCTGGGGTCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAATTCTCTGGAGGAGGAGGATGCTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAGGAGGGTTCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGGCCCCTGGGCAGCGCCTTGAGTGGATTGGATATGTTAATCCTTTCAATGATGGTACTAAGTACAATGAGATGTTCAAAGGCAGGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACAGGCTTGGGGTTACCCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCTGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGTTCTGCTGGTGACATCTCTCCTGCTCTGTGAACTGCCTCATCCCGCTTTTCTGCTCATTCCCGACATTCAGGCTCAAGTCCAACTGGTCCAAAGTGGTGCTGAAGTCAAACGCCCGGGTGCCTCCGTCCAAGTCTCCTGCCGTGCCTCTGGCTACTCGATTAACACCTATTACATGCAGTGGGTCCGTCAAGCACCGGGTGCAGGTCTGGAATGGATGGGTGTCATCAATCCGTCCGGCGTGACCTCATATGCGCAGAAATTTCAAGGTCGCGTTACCCTGACGAACGATACCAGCACGAATACCGTCTACATGCAGCTGAACTCTCTGACGAGTGCAGACACCGCGGTGTATTACTGCGCACGTTGGGCACTGTGGGGCGATTTCGGCATGGATGTTTGGGGCAAAGGTACGCTGGTGACCGTTAGCTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTTCTGATATTCAGATGACGCAAAGCCCGTCTACCCTGAGTGCCTCCATTGGTGACCGTGTTACGATCACCTGTCGCGCATCCGAAGGCATCTATCATTGGCTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTATAAAGCAAGTTCCCTGGCATCGGGTGCTCCGAGCCGCTTTTCAGGTTCGGGTAGCGGCACCGATTTCACGCTGACCATCTCATCGCTGCAGCCGGACGATTTCGCTACCTACTACTGCCAACAATACTCAAACTACCCGCTGACCTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGCTAGCACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTAATCCTACTGCGTCGACACTAGTGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGATCTAGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ IDNO:13)。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATTGTGCTCACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTCTGTCTCCCGGGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGCAGAGCCACTGAAAGTGTTGAATACTATGGCACAAGTTTAGTGCAGTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAGCGTAGATTCTGGGGTCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAATTCTCTGGAGGAGGAGGATGCTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAGGAGGGTTCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGGCCCCTGGGCAGCGCCTTGAGTGGATTGGATATGTTAATCCTTTCAATGATGGTACTAAGTACAATGAGATGTTCAAAGGCAGGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACAGGCTTGGGGTTACCCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCTGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGTTCTGCTGGTGACATCTCTCCTGCTCTGTGAACTGCCTCATCCCGCTTTTCTGCTCATTCCCGACATTCAGGCTCAAGTCCAACTGGTCCAAAGTGGTGCTGAAGTCAAACGCCCGGGTGCCTCCGTCCAAGTCTCCTGCCGTGCCTCTGGCTACTCGATTAACACCTATTACATGCAGTGGGTCCGTCAAGCACCGGGTGCAGGTCTGGAATGGATGGGTGTCATCAATCCGTCCGGCGTGACCTCATATGCGCAGAAATTTCAAGGTCGCGTTACCCTGACGAACGATACCAGCACGAATACCGTCTACATGCAGCTGAACTCTCTGACGAGTGCAGACACCGCGGTGTATTACTGCGCACGTTGGGCACTGTGGGGCGATTTCGGCATGGATGTTTGGGGCAAAGGTACGCTGGTGACCGTTAGCTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTTCTGATATTCAGATGACGCAAAGCCCGTCTACCCTGAGTGCCTCCATTGGTGACCGTGTTACGATCACCTGTCGCGCATCCGAAGGCATCTATCATTGGCTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTATAAAGCAAGTTCCCTGGCATCGGGTGCTCCGAGCCGCTTTTCAGGTTCGGGTAGCGGCACCGATTTCACGCTGACCATCTCATCGCTGCAGCCGGACGATTTCGCTACCTACTACTGCCAACAATACTCAAACTACCCGCTGACCTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGCTAGCTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATCCTACTGCGTCGACACTAGTGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGATCTAGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO:14)。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGAAATCGTCCTGACTCAAAGCCCAGCGACTTTGTCCCTCTCCCCAGGCGAGCGGGCCACGCTGTCTTGCAGGGCCACCGAGTCTGTGGAGTATTATGGTACAAGCCTGGTGCAATGGTATCAACAAAAGCCTGGTCAGCCGCCTAAACTCCTCATCTACGCTGCCTCTTCAGTAGATTCAGGCGTTCCATCTCGATTCTCTGGCAGCGGAAGCGGAACAGACTTCACCCTCACGATTAATAGCCTGGAAGCAGAAGACGCTGCAACCTATTATTGCCAGCAGTCAAGAAGGGTTCCATATACGTTTGGCGGCGGAACCAAACTTGAGATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAAGTACAACTGGTGCAGAGTGGAGCGGAGGTTAAGAAACCGGGGGCAACAGTGAAAATATCTTGCAAGGTTTCTGGTTATACGTTTACGAGTTATGTCATGCATTGGGTCCGACAGGCCCCTGGGCAGGGCCTGGAATGGATGGGTTATGTGAACCCCTTCAATGATGGGACGAAATACAATGAAATGTTCAAAGGTAGAGTGACAATTACACGGGATACGTCCGCAAGCACGGCATATATGGAGCTTAGTTCACTCCGCAGTGAAGATACTGCTGTCTACTATTGTGCGAGACAAGCCTGGGGGTATCCATGGGGGCAAGGCACGCTTGTAACGGTGAGTGCGGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCT 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GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGTTCTGCTGGTGACATCTCTCCTGCTCTGTGAACTGCCTCATCCCGCTTTTCTGCTCATTCCCGACATTCAGGCTCAAGTCCAACTGGTCCAAAGTGGTGCTGAAGTCAAACGCCCGGGTGCCTCCGTCCAAGTCTCCTGCCGTGCCTCTGGCTACTCGATTAACACCTATTACATGCAGTGGGTCCGTCAAGCACCGGGTGCAGGTCTGGAATGGATGGGTGTCATCAATCCGTCCGGCGTGACCTCATATGCGCAGAAATTTCAAGGTCGCGTTACCCTGACGAACGATACCAGCACGAATACCGTCTACATGCAGCTGAACTCTCTGACGAGTGCAGACACCGCGGTGTATTACTGCGCACGTTGGGCACTGTGGGGCGATTTCGGCATGGATGTTTGGGGCAAAGGTACGCTGGTGACCGTTAGCTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTTCTGATATTCAGATGACGCAAAGCCCGTCTACCCTGAGTGCCTCCATTGGTGACCGTGTTACGATCACCTGTCGCGCATCCGAAGGCATCTATCATTGGCTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTATAAAGCAAGTTCCCTGGCATCGGGTGCTCCGAGCCGCTTTTCAGGTTCGGGTAGCGGCACCGATTTCACGCTGACCATCTCATCGCTGCAGCCGGACGATTTCGCTACCTACTACTGCCAACAATACTCAAACTACCCGCTGACCTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGCTAGCTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATCCTACTGCGTCGACACTAGTGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGATCTAGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO:16)。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGATATAGTGCTCACACAAAGCCCGGCCTCTCTCGCCGTAAGTCTGGGGCAACGAGCTACTATCAGTTGCCGCGCTACGGAGAGCGTGGAATACTATGGAACGAGTCTGGTGCAGTGGTATCAGCAAAAACCGGGGCAACCACCGAAACTGCTGATATACGCCGCTTCATCTGTTGACTCTGGAGTGCCAGCAAGGTTTAGTGGTAGCGGCTCTGGCACTGACTTCTCACTTACAATACATCCTGTGGAGGAGGATGACATAGCCATGTACTTCTGTCAGCAATCCAGGCGAGTCCCATACACGTTTGGTGGGGGGACGAAGTTGGAAATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAAGTTCAGTTGCAACAGTCTGGTCCAGAGCTTGTTAAACCGGGGGCAAGCGTTAAAATGAGCTGCAAAGCCTCAGGGTACACCTTTACAAGTTATGTAATGCACTGGGTTAAACAGAAACCCGGCCAGGGTCTGGAGTGGATTGGCTACGTCAACCCCTTTAATGACGGTACCAAGTACAATGAGATGTTCAAGGGCAAAGCCACACTTACGTCCGATAAGAGTAGTAGCACCGCCTACATGGAACTTTCTAGCTTGACTTCCGAAGACAGTGCATGGTACTATTGTGCGAGACAAGCGTGGGGTTATCCTTGGGGCCAAGGTACTCTTGTGACGGTATCAGCGGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGTTCTGCTGGTGACATCTCTCCTGCTCTGTGAACTGCCTCATCCCGCTTTTCTGCTCATTCCCGACATTCAGGCTCAAGTCCAACTGGTCCAAAGTGGTGCTGAAGTCAAACGCCCGGGTGCCTCCGTCCAAGTCTCCTGCCGTGCCTCTGGCTACTCGATTAACACCTATTACATGCAGTGGGTCCGTCAAGCACCGGGTGCAGGTCTGGAATGGATGGGTGTCATCAATCCGTCCGGCGTGACCTCATATGCGCAGAAATTTCAAGGTCGCGTTACCCTGACGAACGATACCAGCACGAATACCGTCTACATGCAGCTGAACTCTCTGACGAGTGCAGACACCGCGGTGTATTACTGCGCACGTTGGGCACTGTGGGGCGATTTCGGCATGGATGTTTGGGGCAAAGGTACGCTGGTGACCGTTAGCTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTTCTGATATTCAGATGACGCAAAGCCCGTCTACCCTGAGTGCCTCCATTGGTGACCGTGTTACGATCACCTGTCGCGCATCCGAAGGCATCTATCATTGGCTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTATAAAGCAAGTTCCCTGGCATCGGGTGCTCCGAGCCGCTTTTCAGGTTCGGGTAGCGGCACCGATTTCACGCTGACCATCTCATCGCTGCAGCCGGACGATTTCGCTACCTACTACTGCCAACAATACTCAAACTACCCGCTGACCTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGCTAGCACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTAATCCTACTGCGTCGACACTAGTGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGATCTAGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ IDNO:17)。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGATATAGTGCTCACACAAAGCCCGGCCTCTCTCGCCGTAAGTCTGGGGCAACGAGCTACTATCAGTTGCCGCGCTACGGAGAGCGTGGAATACTATGGAACGAGTCTGGTGCAGTGGTATCAGCAAAAACCGGGGCAACCACCGAAACTGCTGATATACGCCGCTTCATCTGTTGACTCTGGAGTGCCAGCAAGGTTTAGTGGTAGCGGCTCTGGCACTGACTTCTCACTTACAATACATCCTGTGGAGGAGGATGACATAGCCATGTACTTCTGTCAGCAATCCAGGCGAGTCCCATACACGTTTGGTGGGGGGACGAAGTTGGAAATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAAGTTCAGTTGCAACAGTCTGGTCCAGAGCTTGTTAAACCGGGGGCAAGCGTTAAAATGAGCTGCAAAGCCTCAGGGTACACCTTTACAAGTTATGTAATGCACTGGGTTAAACAGAAACCCGGCCAGGGTCTGGAGTGGATTGGCTACGTCAACCCCTTTAATGACGGTACCAAGTACAATGAGATGTTCAAGGGCAAAGCCACACTTACGTCCGATAAGAGTAGTAGCACCGCCTACATGGAACTTTCTAGCTTGACTTCCGAAGACAGTGCATGGTACTATTGTGCGAGACAAGCGTGGGGTTATCCTTGGGGCCAAGGTACTCTTGTGACGGTATCAGCGGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGTTCTGCTGGTGACATCTCTCCTGCTCTGTGAACTGCCTCATCCCGCTTTTCTGCTCATTCCCGACATTCAGGCTCAAGTCCAACTGGTCCAAAGTGGTGCTGAAGTCAAACGCCCGGGTGCCTCCGTCCAAGTCTCCTGCCGTGCCTCTGGCTACTCGATTAACACCTATTACATGCAGTGGGTCCGTCAAGCACCGGGTGCAGGTCTGGAATGGATGGGTGTCATCAATCCGTCCGGCGTGACCTCATATGCGCAGAAATTTCAAGGTCGCGTTACCCTGACGAACGATACCAGCACGAATACCGTCTACATGCAGCTGAACTCTCTGACGAGTGCAGACACCGCGGTGTATTACTGCGCACGTTGGGCACTGTGGGGCGATTTCGGCATGGATGTTTGGGGCAAAGGTACGCTGGTGACCGTTAGCTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTTCTGATATTCAGATGACGCAAAGCCCGTCTACCCTGAGTGCCTCCATTGGTGACCGTGTTACGATCACCTGTCGCGCATCCGAAGGCATCTATCATTGGCTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTATAAAGCAAGTTCCCTGGCATCGGGTGCTCCGAGCCGCTTTTCAGGTTCGGGTAGCGGCACCGATTTCACGCTGACCATCTCATCGCTGCAGCCGGACGATTTCGCTACCTACTACTGCCAACAATACTCAAACTACCCGCTGACCTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGCTAGCTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATCCTACTGCGTCGACACTAGTGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGATCTAGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO:18)。
根据本发明的实施例，上述SEQ ID NO:13～18所示核苷酸序列的结构可表示为S-VL(LS1)LVH(LS1)-IgG1HC(T250Q/M248L)-2A-MSLN CAR-(ires)-tEGFR，其中，S:信号肽signal leader,L表示连接肽Linker，LS1表示抗PD-L1Mab clone#LS1，VL表示轻链可变区light chain variable region，VH表示重链可变区heavy chain variable region，H表示IgG1 Fc铰链区hinge region，C表示IgG1重链稳定区heavy chain constant region，T250Q/M248L:IgG Fc T250Q和M248L氨基酸突变，2A:2A连接肽。其中，SEQ ID NO:13、15、17所示核苷酸序列中编码的MSLN CAR短于SEQ ID NO:14、16、18所示核苷酸序列中编码的MSLN CAR，SEQ ID NO:13、15、17所示核苷酸序列中编码的MSLN CAR在本文中简写为MSLNCAR(short)，SEQ ID NO:14、16、18所示核苷酸序列中编码的MSLN CAR在本文中简写为MSLNCAR(86)。
根据本发明的实施例，发明人是通过如下方式的至少之一实现上述抗PD-L1抗体、嵌合抗原受体以及无功能EGFR分别独立地表达的，其中，需要说明的是，此处的表达既指蛋白的表达又指RNA转录。
内部核糖体进入位点序列(IRES)，本发明实施例的内部核糖体进入位点序列设置在编码嵌合抗原受体的核酸分子与表达无功能EGFR的核酸分子之间，内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。
GCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC(SEQ ID NO：19)。
内部核糖体进入位点通常位于RNA病毒基因组的5’非翻译区(UTR)，这样一个病毒蛋白的翻译就可以不依赖于5‘帽子结构，另一个蛋白通常靠5’帽子结构起始翻译，IRES前后的两个基因的表达通常是成比例的。内部核糖体进入位点序列的引入使得编码抗PD-L1抗体的核酸分子、编码嵌合抗原受体的核酸分子与编码无功能EGFR的核酸分子分别独立的表达。根据本发明的实施例，本发明实施例采用内部核糖体进入位点序列有效保证了嵌合抗原受体和无功能EGFR的高效表达，使得淋巴细胞对高表达MSLN肿瘤的特异性杀伤效果更加显著，免疫杀伤安全性进一步提高。
启动子：第一启动子，第一启动子与编码嵌合抗原受体的核酸分子可操作地连接；第二启动子，第二启动子与沉默免疫检查点的核酸分子可操作地连接；以及第三启动子，第三启动子与表达无功能EGFR的核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例，所采用的第一启动子、第二启动子和第三启动子分别独立地选自U6，CMV,H1，EF-1,LTR,RSV启动子，第一以及第二启动子和第三启动子的引入，使得编码抗PD-L1抗体的核酸分子、编码嵌合抗原受体的核酸分子和表达无功能EGFR的核酸分子分别独立的表达，从而有效抑制了PD1/PD-L1介导的肿瘤免疫逃逸或高效表达了无功能EGFR，并且保证了嵌合抗原受体的高效表达，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤的特异性杀伤作用更加显著，免疫杀伤的安全性进一步提高。
第四核酸分子:第四核酸分子设置在所述第一核酸分子与第二核酸分子或第二核酸分子与所述第三核酸分子之间，并且所述第四核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。2A连接肽具有SEQ ID NO：20～23所示的氨基酸序列。
E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO：20)。
A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO：21)。
Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO：22)。
V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO：23)。
第四核酸分子及其相应表达的连接肽的引入使得无功能EGFR、嵌合抗原受体、抗PD-L1抗体成非融合状态表达在淋巴细胞中。根据本发明的实施例，本发明实施例连接肽的引入保证了无功能EGFR、嵌合抗原受体以及抗PD-L1抗体的生物学作用，其具特异性更强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
通过上述内部核糖体进入位点序列、或第一、第二、第三启动子或第三核酸分子的引入，使得细胞表达和分泌抗PD-L1抗体、表达无功能EGFR以及表达嵌合抗原受体，并且无功能EGFR和嵌合抗原受体呈非融合状态表达在淋巴细胞膜上，从而高效抑制了免疫负调控和保证了嵌合抗原受体的生物学作用，有效实现了转基因淋巴细胞的及时清除，从而使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向杀伤作用更加显著，免疫杀伤的安全性进一步提高。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体的载体是非致病性病毒载体。非致病性病毒载体大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率，进而本发明实施例的淋巴细胞在肿瘤病人体内的增殖和生存能力大大提高，淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著，免疫杀伤安全性进一步提高。
根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体的载体是病毒载体，病毒载体选自反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺病毒关联病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例，本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，实现广谱而高效的感染效率，从而细胞表面或细胞内免疫检查点被高效沉默和无功能EGFR被高效表达以及嵌合抗原受体在淋巴细胞中高效表达，本发明实施例的淋巴细胞的在肿瘤病人体内的增殖和生存能力大大提高，淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著，淋巴细胞的免疫杀伤安全性进一步提高。
根据本发明的具体实施例，以构建一个慢病毒载体为例，发明人为了构建一个慢病毒载体，在某些病毒序列的位置，将目的核酸插入到病毒基因组中，从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，发明人进而构建包装细胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括LTR和包装成分)。发明人将含有目的基因的重组质粒，连同慢病毒LTR和包装序列，一起引入包装细胞系中。包装序列允许重组质粒RNA转录产物被包装到病毒颗粒中，然后被分泌到培养基中。进而发明人收集包含重组慢病毒的基质，有选择性地浓缩，并用于基因转移。慢载体可以感染多种细胞类型，包括可分裂细胞和不可分裂细胞。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的慢病毒是复合慢病毒，除了常见的慢病毒基因gag，pol和env，还包含有调控和结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域技术人员所熟知的，慢病毒包括：人类免疫缺陷病毒HIV–1，HIV–2和猿猴免疫缺陷病毒SIV。慢病毒载体通过多重衰减艾滋病毒致病基因产生，例如全部删除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒载体形成生物安全型载体。重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，同时可用于体内和体外基因转移和核酸序列表达。例如：在合适的宿主细胞中，和带有包装功能(gag，pol，env，rev和tat)的两个或更多的载体一起，能够感染非分裂细胞。重组病毒的靶向性，是通过抗体或特定配体(靶向特定细胞类型受体)与膜蛋白的结合来实现的。同时，重组病毒的靶向性通过插入一个有效序列(包括调控区域)到病毒载体中，连同另一个编码了特定靶细胞上的受体的配体的基因，使载体具有了特定的靶向。各种有用的慢病毒载体，以及各种方法和操作等产生的载体，用于改变细胞的表达。
根据本发明的实施例，本发明实施例的腺关联病毒载体(AAV)可使用一种或多种为人熟知的血清类型腺关联病毒载体的DNA构建。另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的也包含微基因。微基因意味着用组合(选定的核苷酸序列和可操作的必要的相关连接序列)来指导转化、转录和/或基因产物在体内或体外的宿主细胞中的表达。应用“可操作的连接”序列包含连续目的基因的表达控制序列，和作用于反式或远距离控制目的基因的表达控制序列。
另外，本发明实施例的载体还包括常规控制元素，在和质粒载体一起的细胞转染或/和病毒载体一起的细胞感染中。大量的表达控制序列(包括天然的，可诱导和/或特定组织的启动子)可能被使用。根据本发明的实施例，启动子为选自U6,H1,pol I,pol II andpol III的RNA聚合酶启动子。根据本发明的实施例，启动子为组织特异型启动子。根据本发明的实施例，启动子为诱导型启动子。根据本发明的实施例，启动子为选自基于所选载体的启动子。根据本发明的实施例，当选择慢病毒载体时，启动子为U6,H1,CMV IE基因，EF-1α，泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。其他常规表达控制序列包括可选标记或报告基因，包括编码遗传霉素，潮霉素，氨苄青霉素或嘌呤霉素耐药性等的核苷酸序列。载体的其他组件包括复制起点。
构建载体的技术为本领域技术人员所熟知的，这些技术包括常规克隆技术，
制备转基因淋巴细胞的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。引入方式可以选自电转或病毒感染宿主细胞的方式引入。本发明实施例的构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中，实现了针对抗原MSLN的嵌合抗原受体的表达和抗PD-L1抗体的表达和分泌以及无功能EGFR的表达，从而使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞具有显著的抵抗肿瘤介导的免疫抑制的功效，在肿瘤病人体内和体外的增殖及肿瘤病人体内存活能力大大提高，淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞，尤其是高表达MSLN及PD-L1的肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强，免疫杀伤的安全性高。
治疗癌症的治疗组合物
在本发明的另一方面，本发明的提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，该治疗组合物包括：上述构建体、上述慢病毒、上述T淋巴细胞或者上述转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现针对抗原MSLN嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达和转基因淋巴细胞或T淋巴细胞细胞表达和分泌抗PD-L1抗体；以及无功能EGFR在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞表面的表达，从而使得所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞在体外扩增、在肿瘤病人体内的增殖及肿瘤病人体内存活能力大大提高，转基因淋巴细胞或T淋巴细胞对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强，免疫杀伤的安全性更高。
根据本发明的实施例，提供给患者的本发明实施例的治疗组合物,较好的应用于生物兼容溶液或可接受的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体，如生理盐水；等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液，是医药上可接受的载体。
根据本发明的实施例，足够数量的病毒载体被转导入靶向T细胞中，并提供足够强度的转基因，表达和分泌抗PD-L1抗体和表达无功能EGFR以及表达特有的MSLN嵌合抗原受体。治疗试剂的剂量主要取决于治疗状况，年龄，体重，病人的健康程度，从而可能造成病人的变异性。
表达和分泌抗PD-L1抗体和表达无功能EGFR以及表达特有的针对抗原MSLN嵌合抗原受体的这些方法是联合治疗的一部分。这些病毒载体和用于过继免疫治疗的抗肿瘤T细胞，可以被单独或结合其他治疗癌症的方法一起执行。在合适的条件下，一个治疗方法的包括使用一个或多个药物疗法。
根据本发明的实施例，所述癌症包括间皮瘤。表达和分泌抗PD-L1抗体和无功能EGFR的表达，联合嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞在间皮瘤的环境中的存活能力大大提高，淋巴细胞或T淋巴细胞对高表达MSLN的肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤细胞的杀伤作用更加显著，对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤细胞的免疫杀伤作用更加安全有效。
提高淋巴细胞活性和治疗安全性的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞活性和治疗安全性的方法，本发明实施例的淋巴细胞携带嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素，根据本发明的实施例，该方法包括：使所述淋巴细胞表达抗PD-L1融合抗体；以及使所述淋巴细胞表达无功能EGFR，所述抗PD-L1融合抗体、淋巴细胞、嵌合抗原受体、无功能EGFR是如前所定义的。根据本发明的实施例，本发明实施例的淋巴细胞活性包括淋巴细胞体外增殖能力，在肿瘤病人体内的增殖和生存能力以及淋巴细胞在肿瘤病人体内的杀伤能力的至少一种。根据本发明的实施例，本发明实施例的淋巴细胞的细胞表面或细胞内免疫检查点被沉默，淋巴细胞被活化、增生性反应上调、细胞因子分泌增多、抗调亡能力增强。本发明实施例的淋巴细胞在体外扩增和增殖、对肿瘤细胞的靶向杀伤作用显著增强。
无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明是实施例的淋巴细胞在用于治疗高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤细胞时，如果病人出现严重不良反应，本发明实施例的淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可提高本发明实施例的淋巴细胞治疗高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤病人的安全性。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本发明实施例中所用到的细胞系和基本实验技术如下所述：
慢病毒的产生和人T淋巴细胞的转导
产生复制缺陷的慢病毒载体，并将慢病毒载体离心收集用于人T淋巴细胞的转导。下面简要介绍慢病毒载体的产生、收集的实验过程：将293T细胞铺在底面积为150-平方厘米的细胞培养皿中，并根据说明书，使用Express-In(购自Open Biosystems/ThermoScientific，Waltham，MA)对293T细胞进行病毒转导。每盘细胞加入15微克的慢病毒转基因质粒、5微克的pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒)、10微克的pCMVR8.74质粒(Gag/Pol/Tat/Rev表达质粒)和174微升的Express-In(浓度为1微克/微升)。分别于24小时和48小时收集上清，并使用超速离心机在28，000rpm(离心机转子为Beckman SW 32Ti，购自Beckman Coulter，Brea，CA)的条件下离心2小时。最后用0.75ml的RPMI-1640培养基对病毒质粒沉淀进行重悬。
从健康志愿者供体上分离人原代T淋巴细胞。人T淋巴细胞培养在RPMI-1640培养基中并使用抗CD3和CD28的单克隆抗体包被的珠(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)进行刺激激活。人T淋巴细胞激活后的18～24小时，采用自旋-接种的方法对T淋巴细胞进行转导，转导过程如下所述：在24-孔板中，每孔铺有0.5×106T淋巴细胞，向每孔细胞中加入0.75ml的上述重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8微克/ml)。细胞和病毒质粒的混合液在台式离心机(购自Sorvall ST 40；Thermo Scientific)中离心，离心条件是室温，2500rpm，时间为90分钟。人重组白细胞介素-2(IL-2；购自Novartis，Basel，Switzerland)每隔2～3天加入T淋巴细胞培养液中，IL-2的终浓度为100-IU/ml，在T淋巴细胞培养过程中，保持细胞的密度为0.5×106～1×106/ml。一旦被转导的T淋巴细胞出现休眠，例如细胞生长速度变慢和细胞变小，其中，细胞生长速度和大小是通过Coulter Counter(购自Beckman Coulter)评估的，或被转导的T淋巴细胞在某个计划的时间点上，T淋巴细胞即可用来做功能分析。
本申请的实施例中所用的流式细胞仪为BD FACSCanto II(购自BDBiosciences)，并且流式细胞分析数据使用FlowJo version 7.2.5软件(购自Tree Star，Ashland，OR)进行分析。
铬释放实验
实施例中应用4–小时51铬释放法分析评估抗MSLN嵌合抗原受体T细胞(抗MSLNCAR T淋巴细胞)的细胞毒活性。具体步骤如下：目标测试细胞用51Cr在37摄氏度下标记1小时。标记后，用含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基润洗细胞。润洗后，将细胞重悬在相同的培养基中，重悬细胞的浓度是1×105/ml。转导后T细胞以不同的靶效细胞比值(T：E)加入目标测试细胞悬浮液中，并将细胞种在96-孔中，每孔体积是200微升。将细胞在37度培养箱中培养4小时。4小时后，从每孔中取出30微升的上清放于计数器的96-微孔板进行计数分析。分析仪器是顶级计数NXT微闪烁计数器(购自Packard Bioscience)。所有计数孔中效应细胞的数目是基于T细胞总数来计算的。被标记的目标测试细胞是MSLN+PD-L1+H226cells或MSLN+PD-L1+Panc1靶细胞。
实施例2构建共表达抗PD-L1单链抗体和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白和抗MSLN嵌合抗原受体的载体
本实施例中，发明人将编码有抗人MSLN的单链抗体的序列、4-1BB胞内段和T细胞受体组合的ζ-链序列克隆到含有EF-1启动子的慢病毒载体(lentiviral vector)上，克隆过程中，选择的限制性酶切是XbaI和NotI双酶切，以及NotI和XhoI双酶切，通过酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，生成表达抗MSLN嵌合抗原受体的慢病毒质粒(LV-MSLN CAR)。抗PD-L1单链抗体(LS1clone)和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白的序列被克隆进LV-MSLNCAR载体质粒，构建成慢病毒载体αLS1-QL/M-CAR。图1是慢病毒载体的示意图，包含编码抗PD-L1单链抗体(LS1clone)和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白序列，2A肽序列，抗MSLN嵌合抗原受体的序列，IRES序列及tEGFR序列。慢病毒载体αLS1/M-CAR包含编码抗PD-L1单链抗体(LS1clone)序列，2A肽序列，抗MSLN嵌合抗原受体的序列，IRES序列及tEGFR序列。慢病毒载体αLS1-QL包含编码抗PD-L1单链抗体(LS1clone)序列，IRES序列及tEGFR序列。慢病毒载体M-CAR包含编码MSLN嵌合抗原受体的序列，IRES序列及tEGFR序列。
实施例3载体αLS1-QL/M-CAR转导T淋巴细胞分泌抗PD-L1单链抗体和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白来抑制PD-1:PD-L1作用
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。在T淋巴细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)存在下，被激活的T淋巴细胞经过慢病毒载体转导、体外扩增培养，方法如实施例1所述。在慢病毒载体转导后的3-7天，收获转导的T细胞(细胞个数是2×106/孔)培养上清，用于PD-1:PD-L1作用抑制实验。100ng/孔的PD-L1蛋白(Aerobiosystems,Boston,MA)被用于包被96-孔ELISA板。10ng生物素标记的PD1(Aerobiosystems,Boston,MA)与100ul各种CAR-T上清液混合或与50ng的商业购买的anti-hPD-L1(Aerobiosystems,Boston,MA)混合，补充体积至200uL，并将混合液加至包被好的96-孔板中。将加有混合液的96-孔板在室温下放置2小时，之后进行充分洗涤。将稀释的streptavidin-HRP加入孔板中，并在室温条件下放置1小时，同时进行缓慢震荡。1小时后，对孔板进行6-次洗涤，并将100μL TMB HRP底物加入，当蓝色在阳性对照孔中出现的时候，加入100uL 1N硫磺酸去终止反应。测量孔板在450nm处的OD值。抑制活性(The inhibitionactivity(％))＝(OD450of Mock-OD450of sample)/(OD450of Mock-OD450of background)x100％.
实验结果如图2所示。图2结果表明，转导了慢病毒载体αLS1-QL/M-CAR或αLS1-QLT淋巴细胞的培养液能显著抑制PD-1:PD-L1作用，而转导了慢病毒载体M-CAR T淋巴细胞的培养液没有抑制PD-1:PD-L1作用(*P<0.01；αLS1-QL/M-CAR vs.M-CAR)。这说明转导了αLS1-QL/M-CAR的T淋巴细胞能分泌抗PD-L1单链抗体和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白来抑制PD-1:PD-L1作用。
实施例4共表达抗PD-L1单链抗体和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白和抗MSLN嵌合抗原受体的T淋巴细胞有增强溶解肿瘤细胞能力(体外实验)
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺，10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FNch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导，转导慢病毒分别为αLS1-QL/M-CAR,αLS1/M-CAR,αLS1-QL,M-CAR或空载(Control)转导过程如实施例1所述。转导后的T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后进行功能测试实验。发明人测量转导了不同慢病毒的T细胞(效应细胞)对MSLN+PD-L1+H226cells或MSLN+PD-L1+Panc1靶细胞的杀伤作用，用不同靶效细胞比例，测量方法采用标准4–小时51铬释放法，4–小时51铬释放法如实施例1所述。
结果如图3所示。如图3所示，转导了慢病毒载体αLS1-QL/M-CAR T淋巴细胞比转导了慢病毒载体M-CAR的T淋巴细胞，可更为有效的杀死MSLN+PD-L1+H226cells或MSLN+PD-L1+Panc1靶细胞。转导了慢病毒载体αLS1-QL/M-CAR T淋巴细胞比转导了慢病毒载体αLS1/M-CAR的T淋巴细胞，也可更为有效的杀死MSLN+PD-L1+H226cells或MSLN+PD-L1+Panc1靶细胞。空载慢病毒转导的T淋巴细胞(Control T淋巴细胞)对MSLN+PD-L1+H226cells或MSLN+PD-L1+Panc1靶细胞无明显杀伤作用。统计数据代表三个孔的平均值±SEM。*P<0.01；αLS1-QL/M-CAR vs.αLS1/M-CAR或M-CAR。这说明转导了αLS1-QL/M-CAR的T淋巴细胞能分泌抗PD-L1单链抗体和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白有更强体外杀伤MSLN+PD-L1+靶细胞能力。
实施例5共表达抗PD-L1单链抗体和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白和抗MSLN嵌合抗原受体的T淋巴细胞有增强抗肿瘤能力(体内鼠肿瘤模型实验)
免疫缺陷型非肥胖糖尿病(NOD)-scidγ小鼠(NSG)(SCID小鼠背景，并且具有IL-2受体γ链缺陷)被用来测试各种转导T细胞的抗肿瘤活性。NSG小鼠(5只/每组)被注射5x105个MSLN+PD-L1+H226(左图)或者MSLN+PD-L1+Panc1肿瘤细胞。在注射后的6～9天，肿瘤细胞直径达到4-5mm时，小鼠静脉注射1x107不同的转导T细胞。在指定时间用卡尺测量肿瘤的体积。肿瘤体积(Tumor volume)＝W2L(宽2长).
结果如图4所示。如图4所示，转导了慢病毒载体αLS1-QL/M-CAR T淋巴细胞比转导了慢病毒载体M-CAR的T淋巴细胞，可更为有效的杀死MSLN+PD-L1+H226细胞或MSLN+PD-L1+Panc1肿瘤细胞。转导了慢病毒载体αLS1-QL/M-CAR T淋巴细胞比转导了慢病毒载体αLS1/M-CAR的T淋巴细胞，也可更为有效的杀死MSLN+PD-L1+H226cells或MSLN+PD-L1+Panc1肿瘤细胞。空载慢病毒转导的T淋巴细胞(Control T淋巴细胞)对MSLN+PD-L1+H226cells或MSLN+PD-L1+Panc1肿瘤细胞无明显杀伤作用。*P<0.01；αLS1-QL/M-CAR vs.αLS1/M-CAR或M-CAR。这说明转导了αLS1-QL/M-CAR的T淋巴细胞能分泌抗PD-L1单链抗体和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白有更强体内杀伤MSLN+PD-L1+肿瘤细胞能力。
实施例6载体αLS1-QL/M-CAR转导T淋巴细胞治疗鼠的血清有抑制PD-1:PD-L1作用。
实施例5中所用到的NSG小鼠在注射了转导T细胞后，饲养48小时。将血清分离，并从每组4只小鼠中均等地混合。100ng/孔的商业购买的PD-L1蛋白(Aerobiosystems,Boston,MA)包被96-孔ELISA板。10ng生物素标记的PD1(Aerobiosystems,Boston,MA)与100ul各种CAR-T上清混合或与50ng的商业购买的抗-hPD-L1(Aerobiosystems,Boston,MA)混合，混合后补充体积至200uL，并加入到包被好的板子李。板子在室温条件下孵育2小时，并进行充分洗涤。之后将稀释的streptavidin-HRP加入到板子里，并在室温条件下孵育1小时，同时进行缓慢震荡。之后，将板子洗涤5次并加入100uL TMB HRP底物，当阳性对照孔转变为蓝色时加入100μL的1N硫酸终止反应。测量板子在450nm处的OD值。抑制率(Theinhibition activity(％))＝(OD450of Mock-OD450of sample)/(OD450of Mock-OD450ofbackground)x 100％.
实验结果如图5所示。图5结果表明，载体αLS1-QL/M-CAR转导T淋巴细胞治疗鼠的血清能显著抑制PD-1:PD-L1作用，而转导了慢病毒载体M-CAR T淋巴细胞的培养液没有抑制PD-1:PD-L1作用(*P<0.01；αLS1-QL/M-CAR vs.M-CAR).载体αLS1/M-CAR转导T淋巴细胞治疗鼠的血清仅有弱的抑制PD-1:PD-L1作用(*P<0.01；αLS1/M-CAR)。这说明转导了αLS1-QL/M-CAR的T淋巴细胞能分泌抗PD-L1单链抗体和含有氨基酸突变的IgG Fc融合蛋白有明显体内抑制PD-1:PD-L1作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 艾生命序公司
<120> PD-L1抗体分泌的抗间皮素CAR-T细胞肿瘤免疫治疗
<130> PIDC3184934
<160> 23
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> PD-L1单链抗体的氨基酸序列
<400> 1
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Thr
35 40 45
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Val Gln Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Val
65 70 75 80
Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Glu Glu Asp Ala Ala Met Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln Ser Arg Arg Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro
180 185 190
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Val Asn Pro Phe Asn Asp Gly
195 200 205
Thr Lys Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp
210 215 220
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Pro Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IgG1 Fc区的氨基酸序列
<400> 2
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 3
<211> 496
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗PD-L1融合抗体的氨基酸序列
<400> 3
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Thr
35 40 45
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Val Gln Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Val
65 70 75 80
Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Glu Glu Asp Ala Ala Met Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln Ser Arg Arg Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro
180 185 190
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Val Asn Pro Phe Asn Asp Gly
195 200 205
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210 215 220
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Pro Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg
290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
340 345 350
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
405 410 415
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
420 425 430
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
435 440 445
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
450 455 460
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 嵌合抗原受体的氨基酸序列
<400> 4
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1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Gln
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Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala Ser Val Gln Val Ser Cys
35 40 45
Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Asn Thr Tyr Tyr Met Gln Trp Val Arg
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
225 230 235 240
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 嵌合抗原受体的氨基酸序列
<400> 5
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Asp Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly
165 170 175
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp
180 185 190
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ser Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325 330 335
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
340 345 350
Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
355 360 365
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
370 375 380
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
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Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
420 425 430
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
435 440 445
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450 455 460
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
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<213> Artificial
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<223> 无功能EGFR的氨基酸序列
<400> 6
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Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly
275 280 285
Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly
290 295 300
His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly
305 310 315 320
Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile
325 330 335
Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu
340 345 350
Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg
355 360
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子的核苷酸序列
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cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1080
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ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1488
<210> 8
<211> 1488
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子的核苷酸序列
<400> 8
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
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aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaagtac aactggtgca gagtggagcg 480
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cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggaccaactg 900
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gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1020
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1080
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1140
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aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1380
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgct gcatgaggct 1440
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1488
<210> 9
<211> 1488
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子的核苷酸序列
<400> 9
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagata tagtgctcac acaaagcccg gcctctctcg ccgtaagtct ggggcaacga 120
gctactatca gttgccgcgc tacggagagc gtggaatact atggaacgag tctggtgcag 180
tggtatcagc aaaaaccggg gcaaccaccg aaactgctga tatacgccgc ttcatctgtt 240
gactctggag tgccagcaag gtttagtggt agcggctctg gcactgactt ctcacttaca 300
atacatcctg tggaggagga tgacatagcc atgtacttct gtcagcaatc caggcgagtc 360
ccatacacgt ttggtggggg gacgaagttg gaaataaaag gctccacctc tggatccggc 420
aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaagttc agttgcaaca gtctggtcca 480
gagcttgtta aaccgggggc aagcgttaaa atgagctgca aagcctcagg gtacaccttt 540
acaagttatg taatgcactg ggttaaacag aaacccggcc agggtctgga gtggattggc 600
tacgtcaacc cctttaatga cggtaccaag tacaatgaga tgttcaaggg caaagccaca 660
cttacgtccg ataagagtag tagcaccgcc tacatggaac tttctagctt gacttccgaa 720
gacagtgcat ggtactattg tgcgagacaa gcgtggggtt atccttgggg ccaaggtact 780
cttgtgacgg tatcagcggc ggccgcagac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 840
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggaccaactg 900
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 960
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1020
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1080
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1140
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1200
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1260
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1320
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1380
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgct gcatgaggct 1440
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1488
<210> 10
<211> 1482
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 编码嵌合抗原受体的核酸分子的的核苷酸序列
<400> 10
Ala Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala
1 5 10 15
Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly
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Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Cys Cys
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Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Thr Thr Cys
50 55 60
Cys Cys Gly Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Ala
65 70 75 80
Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala
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Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala
100 105 110
Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys Thr Cys
115 120 125
Cys Gly Thr Cys Cys Ala Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys
130 135 140
Cys Gly Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Thr
145 150 155 160
Cys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr Ala
165 170 175
Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Thr
180 185 190
Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly
195 200 205
Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly
210 215 220
Thr Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Thr Cys Cys Gly Thr Cys Cys
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Ala Thr Gly
245 250 255
Cys Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly
260 265 270
Thr Cys Gly Cys Gly Thr Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly
275 280 285
Ala Ala Cys Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala
290 295 300
Ala Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala
305 310 315 320
Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Gly
325 330 335
Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Cys Gly Gly
340 345 350
Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys Gly Cys Ala Cys Gly
355 360 365
Thr Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Cys
370 375 380
Gly Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly
385 390 395 400
Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys
405 410 415
Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Thr Ala Gly Cys
420 425 430
Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr
435 440 445
Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gly
450 455 460
Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr
465 470 475 480
Gly Ala Thr Ala Thr Thr Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Gly Cys
485 490 495
Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr
500 505 510
Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Thr Gly Gly Thr
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Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Ala Cys Gly Ala Thr Cys Ala
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Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Cys Gly Ala
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Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Cys Ala Thr Thr Gly Gly
565 570 575
Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys
580 585 590
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Gly Cys Cys Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys
610 615 620
Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys
625 630 635 640
Thr Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr Cys Cys
645 650 655
Gly Ala Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr
660 665 670
Thr Cys Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly
675 680 685
Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr
690 695 700
Cys Thr Cys Ala Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly
705 710 715 720
Gly Ala Cys Gly Ala Thr Thr Thr Cys Gly Cys Thr Ala Cys Cys Thr
725 730 735
Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala
740 745 750
Cys Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Gly Cys Thr Gly
755 760 765
Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala
770 775 780
Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala
785 790 795 800
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Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly Cys
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<223> 慢病毒携带核酸分子的核苷酸序列
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ggtgtggaag tacgcagacg caggacacgt gtgccacctg tgccacccca attgcaccta 4680
tggctgtaca ggaccaggcc tggagggatg cccaaccaac ggccctaaga tcccaagcat 4740
cgccacaggc atggtggggg cactgctgct gctgctggtg gtggctctgg ggattgggct 4800
gtttatgaga aggtaa 4816
<210> 19
<211> 588
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 内部核糖体进入位点的核苷酸序列
<400> 19
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaacc 588
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 2A连接肽的氨基酸序列
<400> 20
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 2A连接肽的氨基酸序列
<400> 21
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 2A连接肽的氨基酸序列
<400> 22
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 23
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 2A连接肽的氨基酸序列
<400> 23
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20

Claims (23)

1.一种T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，
其中，
所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别肿瘤抗原间皮素；
跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，所述跨膜区包括CD8的跨膜段，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；
胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括4-1BB的胞内段以及CD3ζ链；
所述抗PD-L1融合抗体包括：
PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L氨基酸突变。
2.根据权利要求1所述的T淋巴细胞，其特征在于，所述抗PD-L1单链抗体具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的T淋巴细胞，其特征在于，所述IgG1Fc区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的T淋巴细胞，其特征在于，所述抗PD-L1融合抗体具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。
5.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带下列核酸分子：
(a)编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子，所述抗PD-L1融合抗体包括：
PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L氨基酸突变；
(b)编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体的胞外区识别肿瘤抗原间皮素；以及
(c)编码无功能EGFR的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的慢病毒，其特征在于，所述抗PD-L1融合抗体具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
任选地，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:4或5所示的氨基酸序列；
任选地，所述无功能EGFR具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的慢病毒，其特征在于，所述编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子具有SEQ ID NO:7～9任一所示的核苷酸序列；
任选地，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO:10或11所示的核苷酸序列；
任选地，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
8.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的核酸分子。
9.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的核酸分子。
10.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的核酸分子。
11.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：16所示核苷酸序列的核酸分子。
12.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的核酸分子。
13.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的核酸分子。
14.一种转基因淋巴细胞，其特征在于，所述转基因淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素，
其中，
所述嵌合抗原受体包括：
胞外区；
跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述转基因淋巴细胞的细胞膜中；
胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段；
所述抗PD-L1融合抗体包括：
PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L氨基酸突变。
15.根据权利要求14所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28、CD3以及他们的衍生物的至少一种；
优选地，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB、CD3的胞内段；
任选地，所述淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞；
任选地，所述淋巴细胞是CD8+T淋巴细胞；
任选地，所述淋巴细胞是自然杀伤细胞；
任选地，所述淋巴细胞是自然杀伤T细胞。
16.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括：
第一核酸分子，所述第一核酸分子编码抗PD-L1融合抗体，所述抗PD-L1融合抗体包括：
PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L氨基酸突变；
第二核酸分子，所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素；以及
第三核酸分子，所述第三核酸分子编码无功能EGFR，
其中，所述抗PD-L1融合抗体、所述嵌合抗原受体、所述无功能EGFR是如权利要求1～7、14～15任一项中所定义的。
17.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，所述第一核酸分子、所述第二核酸分子和所述第三核酸分子被设置为在权利要求15～16任一项所述的淋巴细胞中表达所述抗PD-L1融合抗体、嵌合抗原受体和无功能EGFR，并且所述抗PD-L1融合抗体、嵌合抗原受体与所述无功能EGFR呈非融合形式。
18.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；
第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接；以及
第三启动子，所述第三启动子与所述第三核酸分子可操作地连接；
任选地，所述第一启动子、所述第二启动子、所述第三启动子分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子；
任选地，进一步包括：
内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间或所述第二核酸分子与所述第三核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；
任选地，进一步包括:
第四核酸分子，所述第四核酸分子设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间或所述第二核酸分子与所述第三核酸分子之间，并且所述第四核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割；
任选地，所述连接肽具有SEQ ID NO：20～23所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，所述构建体的载体是非致病性病毒载体；
任选地，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。
20.一种制备权利要求1～4任一项所述的T淋巴细胞或者权利要求14～15任一项所述的转基因淋巴细胞的方法，其特征在于，包括：
将权利要求16～19任一项所述的构建体或者权利要求5～13任一项所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。
21.一种用于治疗癌症的治疗组合物，其特征在于，包括：
权利要求16～19任一项所述的构建体、权利要求5～13任一项所述的慢病毒、权利要求1～4任一项所述的T淋巴细胞或者权利要求14～15任一项所述的转基因淋巴细胞。
22.根据权利要求21所述的治疗组合物，其特征在于，所述癌症包括选自间皮瘤，胰腺癌，卵巢癌，胆管癌，肺癌，胃癌，肠癌，食管癌和乳腺癌的至少之一。
23.一种提高淋巴细胞活性和治疗安全性的方法，所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素，其特征在于，所述方法包括：
使所述淋巴细胞表达抗PD-L1融合抗体，以及
使所述淋巴细胞表达无功能EGFR，
所述抗PD-L1融合抗体、所述淋巴细胞、所述嵌合抗原受体、所述无功能EGFR如权利要求1～7、14～15任一项中所定义的，
所述淋巴细胞活性包括所述淋巴细胞在体外的增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力以及所述淋巴细胞在肿瘤病人体内的定向杀伤能力的至少一种。
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