CN106350533B

CN106350533B - Anti-PD-L1-CAR-T及其制备方法和应用

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Publication number: CN106350533B
Application number: CN201610881376.7A
Authority: CN
Inventors: 施炜星; 杨春霞; 杜盈; 房永生
Original assignee: Shanghai Yuyan Biotech Co ltd
Current assignee: Shanghai Yuyan Biotech Co ltd
Priority date: 2015-10-09
Filing date: 2016-10-09
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2036-10-09
Also published as: CN106350533A

Abstract

本发明涉及Anti‑PD‑L1‑CAR‑T及其制备方法和应用，将PD‑L1抗体基因与CAR‑T的铰链区、跨膜区及胞内信号区基因片段合成，其构建载体为PCDH慢性病毒载体：pcDH‑CNV‑MCS‑EF1‑copGFP，本发明首次将抗PD‑L1基因构建至CAR基因中，为治疗肿瘤提供了一种新的思路。

Description

Anti-PD-L1-CAR-T及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及Anti-PD-L1-CAR-T及其制备方法和应用。

背景技术

利用人体自身的免疫系统治疗肿瘤，即肿瘤免疫治疗，近年来发展迅速，它的临床试验进展令人瞩目，被《科学》杂志评为2013年十大科学突破第一位。肿瘤免疫治疗主要包括非特异性的免疫刺激，免疫检验点抗体，过继细胞治疗，单克隆T细胞受体治疗和肿瘤治疗性疫苗等。过继T细胞治疗是肿瘤免疫疗法的一种，已成为继手术，放疗，化疗外的第四种治疗肿瘤的方法。肿瘤的过继免疫细胞治疗，经历了从早期的淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）治疗，细胞因子诱导的杀伤性细胞（CIK，DC-CIK）治疗，NK细胞治疗，到肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）治疗，抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）治疗，嵌合抗原受体T细胞（CART）治疗。前面三者LAK和CIK细胞治疗是非特异性的过继免疫细胞治疗，后三者为特异性的过继免疫细胞治疗。特异性的过继免疫细胞治疗杀伤肿瘤机制明确，肿瘤杀伤的专一性强，优势显而易见。

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptors，CARs）T细胞技术（CAR-T）主要是通过构建嵌合抗原受体基因转染患者的T细胞，使T细胞表面能表达嵌合抗原受体而成为CAR-T细胞。CARs基因包括能识别某种肿瘤抗原的单链抗体的胞外区、跨膜区（一般是引入多个共刺激信号分子，如CD28、CD134和CD137等），以及T细胞信号分子CD3-ζ链的胞内区。因此CAR-T细胞既能识别肿瘤细胞上的抗原，又因带有T细胞的信号分子CD3-ζ和共刺激分子区域，使得T细胞在体外能大量增殖，回输到患者体内后也能存活相当一段时间，能靶向性地有效杀伤肿瘤细胞。

与其它的免疫细胞治疗相比，CAR-T细胞技术有更多的优势。首先，CAR-T细胞拉近了与肿瘤细胞的距离，犹如生物导弹，直接精确地攻击肿瘤细胞。其次，由于CAR-T细胞杀伤肿瘤不依赖于MHC，不需要抗原提呈机制来识别肿瘤抗原，这样就克服了肿瘤细胞通过MHC的下调和抗原提呈的降低而介导的免疫逃脱，更有效地杀伤肿瘤细胞。再次，CAR基因的构建是基于肿瘤细胞表达的肿瘤抗原，但这个肿瘤抗原不一定具有肿瘤的特异性。鉴于多种肿瘤细胞可能表达同一个肿瘤抗原，以此抗原建立的CAR-T细胞可以在多种肿瘤的治疗中被应用。最后，CAR-T细胞治疗肿瘤的效果更好，尤其是新一代的CAR结构中引入了促进T细胞增殖和活化的共刺激分子序列，T细胞进入体内不但能继续增殖，而且能长期存活。

另外一种肿瘤的免疫治疗方法是免疫检验点抗体的治疗，免疫检验点抗体可以抑制病人T细胞上的免疫检验点，从而来激活自身的T细胞。目前正在研究的免疫检验点主要有3个，细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxicT-lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4）、程序性细胞死亡蛋白1 (programmed cell death protein 1, PD-1)、程序性死亡配体-1 (PD-1 ligand, PD-L1)。PD-1在2000年被发现，去年上市的抗PD-1明星药物Nivolumab，其作用原理是通过结合细胞PD-1分子，干扰PD-1和受体的结合，阻断其信号通路，唤醒免疫系统继续攻击黑色素瘤细胞。PD1是一种免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，与其配体PD-L1、PD-L2相结合而对淋巴细胞的活化产生抑制作用，从而抑制免疫细胞的免疫应答反应。其中PD-L1主要表达在多种肿瘤细胞表面，因此与肿瘤细胞躲避免疫应答的机制有关。

目前，已有超过20项的CAR-T细胞疗法的临床试验正在进行，主要是通过肿瘤细胞表面的CD19抗原识别，用于成人急性B淋巴细胞白血病。本发明将免疫检验点PD-L1的抗体用于CAR-T技术中，使T细胞表面表达抗PD-L1的嵌合抗原受体，一方面抑制了由PD-L1介导的抑制型T细胞激活通路，一方面可使T细胞与肿瘤细胞表面的PD-L1相结合，使T细胞直接作用于肿瘤细胞。由于PD-1是广泛存在于T细胞表面的免疫检验点，因此抗PD-L1-CAR-T突破了传统的CAR-T技术中肿瘤抗原的限制。虽然已经有学者将CAR-T技术（如anti Her-2CAR-T）与免疫检验点技术（PD-1抗体）联合使用来对比单一使用时对肿瘤的效果，但是到目前为止，还没有将抗PD-L1基因构建至CAR基因中的先例。另外，PD-L1除表达在肿瘤细胞表面外，在一些正常组织中也有表达。为了阻止CAR-T细胞的脱靶效应，我们在构建的CAR基因中插入了自杀基因。本发明就抗PD-L1-CAR-T技术做详细阐述。

发明内容

本发明的目的在于将抗PD-L1基因构建至CAR基因中。

为了实现上述目的，提供一种Anti-PD-L1-CAR-T分子，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还包括该anti-PD-L1-CAR-T基因的制备方法，包括以下步骤：

将PD-L1抗体基因与CAR-T的铰链区、跨膜区及胞内信号区基因片段合成，其构建载体为PCDH慢性病毒载体：pcDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。

还包括制备PD-L1的抗体基因的步骤。

还包括PD-L1的抗体基因的活性检测步骤。

所述的PD-L1抗体的VH区碱基序列如SEQ ID NO：2，VK区碱基序列如SEQ ID NO：3。

该anti-PD-L1-CAR-T基因可以用于制备肿瘤药物。

本发明首次将抗PD-L1基因构建至CAR基因中，为治疗肿瘤提供了一种新的思路。

附图说明

图1为实施例中的发明流程示意图。

图2为ELISA测定上清中PD-L1活性。

图3为ELISA测定上清中单链PD-L1抗体活性。

具体实施方式

以下，结合实施例和附图对于本发明做进一步说明，实施例仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围。

本实用新型的设计思路如图1所示，其具体步骤如下：

第一部分：PD-L1基因构建

PD-L1分泌蛋白基因合成在此基因在苏州金唯智公司完成。该基因在已报道的PD-L1基因（Gene ID: 29126）的基础上加入CD33序列，以促进PD-L1分泌型蛋白的表达。其基因序列如SEQ ID NO：4所示。

第二部分：PD-L1蛋白的表达及纯化

一. COS细胞的PD-L1基因转染（转染共分为3个小组，一为转染组；一为阴性对照组；一为空白对照组）

1.转染前一天，取2ml，0.7×10⁶cos细胞于6孔细胞培养板中。培养液为：DMEM+10%FCS；

2.第一天，稀释10μl lipofectamin 2000于0.1ml opti-EME培养基中，吹打混匀。

3.稀释2.5ugDNA(PD-L1 in pcDNA3, 浓度为：0.5μg/μl, 5μl) 于0.1ml opti-EME培养基中,吹打混匀，并与1 在室温下混匀放置20min后添加1ml的opti-EME培养基。

4.用1毫升opti-EME培养基在细胞板中洗涤COS细胞3遍。

5.2 中得到的含有PD-L1 cDNA 的培养液重悬洗涤过后的COS细胞并在37℃下培养2h。

6.加入1 毫升的含20%FBS（no p/s）的opti-EME，并在37℃下培养24h。

7.第3天，观察细胞生长情况，细胞换液，每板中加入2ml的10%FBS的DMEM血清培养基(no /P/S)，

8.第5天，吸取2 毫升上情液（储存在冰箱留用），用0.5 毫升胰蛋白酶消化细胞，洗涤，离心除去过量胰蛋白酶后，取一半细胞悬浮于10毫升含另加入50ug/ml的G418的细胞培养液中筛选，置于10cm的细胞培养皿中，另一半细胞用1 毫升细胞冻存液悬浮，转至冻存管，储存在-80C。

9.后期定期换液处理，观察细胞克隆株的形成。用带有1毫升墙头的移液枪在超净台里挑取6个培养皿中的细胞克隆至12孔的细胞培养板中，每孔加入3毫升含50ug/ml的G418的细胞培养液中继续培养。

二．双抗体夹心法检测PD-L1的表达

1.包被：在所需ELISA板孔中加入2μg/ml的puried antibody PD-L1，添加时小心加入，避免接触孔壁，加入后封板膜包被于4度放置过夜待用。

2.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液(≥0.4ml)，静置5min后弃去，拍干。

3.封闭：加入300 μl封闭液，室温下放置1小时。

4.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液(≥0.4ml)，静置5min后弃去，拍干。

5.样品加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。加入各稀释浓度（具体情况具体分析）的上清液在酶标包被板上待测样品孔中。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

6.试剂加样：加入50μl 0.16 μg/ml的Biotin-antibody PD-L1，轻轻晃匀。

7.温育：用封板膜封板后置37℃温育2h。

8.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用.

9.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液(≥0.4ml)，静置2min后弃去，如此重复5次，拍干。

10.加酶：每孔加入酶标试剂HRP-streptavidin(1/5000稀释) 100μl。

11.温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

12.洗涤：操作同6。

13.显色：每孔先加入显色剂sbustrate TMB solution 100μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15-30min。

14.终止：每孔加终止液stop solution 100μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

15.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。检测待测孔是否有阳性颜色反应。

三． PD-L1蛋白浓缩及纯化

1.选择阳性表达细胞株，大量培养后收集细胞上清。准备透析以及浓缩；

2.层析柱准备：将2 mL的Protino Ni-IDA Resin加到空的Protino层析柱中；

3.层析柱清洗：加5个层析柱体积的ddH2O清洗，速度：2mL/min；

4.层析柱平衡：加5个层析柱体积的上样缓冲液平衡，1mL/min；

5.上样：将破碎后上清缓缓上样至平衡后的层析柱，速度0.5mL/min；

6.洗涤：加5个层析柱体积的上样缓冲液，速度1mL/min；

7.洗脱：10个层析柱体积的洗脱缓冲液进行，2mL/管收集，速度ImL/min；

8.层析柱存放：加10个层析柱体积的上样缓冲液和10个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱。加2个层析柱体积20%的乙醇冲洗后加入20%的乙醇，将Protino Ni-IDA Resin存放于 4度；

9.洗脱液透析浓缩：在5kD孔径的透析管中加入PBS进行透析，共加入5倍冼脱液体积的PBS，最终浓缩至0.5-1ml.待用

第三部分： PD-L1抗体的制备及抗体基因获得

一．动物免疫

1.试验计划对3只6周龄的雄性小鼠作为免疫对象。共经过3次免疫及一次加强免疫，采用腹腔免疫法和背部多点免疫法。

2.免疫前准备：取20ug抗原于适量的PBS混合，加入等量的完全弗氏佐剂（增强抗原的免疫原性并通过乳化抗原以缓慢释放）。

3.免疫：剔除动物毛发，酒精擦拭消毒。

4.第一次免疫：将乳化好的抗原注射到小部皮下股腔中，采用多点免疫法并尽量防止乳化的抗原在皮下形成肿包。免疫结束后几个小时内要密切观察小鼠状态，以免发生过敏性休克或伤n出血等症状。

5.第二次免疫：第一次免疫免疫两星期后进行二次免疫，用不完全弗氏佐剂取代完全弗氏佐剂，其他遵照第一次免疫方法。

6.第三次免疫：第二次免疫两星期后进行第三次免疫，方法同上。

7.加强免疫：细胞融合的前3天为增强免疫效果进行，无需添加佐剂，将抗原与PBS混合后直接进行腹腔免疫。

二．ELISA检测免疫小鼠血清中的抗体效价

1.免疫后10天，尾部取血，约100 μl/只。高速离心收集血清，5000r/min，20min。甘油1:1稀释，-20度保存。

2.抗原包被：用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原,将抗原稀释成浓度2.0ug/mL，在96孔的酶标反应板中以100 μl/孔包被酶标板，放置于湿盒中室温包被过夜；

3.洗涤：用PBST洗涤96孔酶标板2次；

4.封闭：每孔加入150 μl封闭液，室温封闭1h，封闭后甩干；

5.加待测血清:小鼠阳性及阴性血清(免疫前血清)进行有限梯度稀释，稀释比例如下，1:100、1:700、1:4900、1:34300等各稀释梯度分别取 100 μl/孔，37度温育1h。洗涤四次。

6.加入二抗：羊抗鼠二抗IgG-HRP按照1:4,000比例稀释，每孔100 μl，设置空白对照。37度温育1h；洗涤四次。

7.显色反应：显色液每孔加入150 μl，室温避光反应15-20min。

8.终止显色反应：加入50μl 2M H₂SO₄终止显色反应。

9.酶标测定：以底物溶液加在空白对照孔内的结果做为零点校酶标仪，以450nm和590nm双波长测定0D值。

三．细胞融合及杂交瘤细胞筛选克隆

1.取生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞核小鼠脾细胞按1:1的比例混合

2.1400r/min离心3min，弃上清，轻轻弹击离心管底部使两种细胞混匀；

3.沿管壁缓慢加入聚乙二醇融剂，边加边缓慢的转动离心管，45 s内加完；

4.立即加入50mL 37°C预热的培养基终止融合剂的作用，颠倒50 mL离心管3-4次，静置10 min；

5.1400 r/min离心3 min，弃上清，用手轻弹重悬细胞,加入35 mL培养基并混匀摇混匀，将重悬细胞加入到1000mL培养基中，充分混匀后将细胞铺到96孔细胞培养板中,280μl/孔。37°C、5% CO2的培养箱中培养。

6.融合7-8天后，可以观察细胞的生长状态，确定筛选时间。

7.用PD-L1抗原以0.1 ng/mL的浓度进行包被，50μl/孔。取细胞培养上清液进行效价检测,

8.用有限稀释法进行杂交瘤细胞亚克隆。

四．Protein A亲和层析法纯化抗体及浓度和效价测定

1.装柱：用10mLProtein Abeads灌柱，确保柱面水平，无气泡产生。

2.洗柱：用5-10个柱体积的PBS缓冲液清洗层析柱，然后再用Binding Buffer平衡层析柱，使pH值约为8.6。

3.加样：将预处理的杂交瘤细胞培养上清与Binding Buffer按1:1混合，过柱，洗涤样品过柱之后再用10-20个柱体积的Binding Buffer除去杂蛋白。

4.启动AKTA，预热30min，在收集管内加入收集体积1/10的K2HP04溶液。

5.冼脱：用pH3.7的Elution Buffer洗脱目的蛋白，密切观察检测软件的峰值。

6.洗脱完全后，用PBS缓冲液洗柱，使其pH恢复到中性。用大约3-5个柱体积的Guanidine-HCl溶液对柱子进行再生。用PBS缓冲液洗涤层析注，大约10-20个柱体积，至pH恢复到中性。

7.用蛋白定量仪测定个样品浓度。

8.用ELISA方法检测纯化抗体效价。

五．根据获得的PD-L1抗体蛋白，其VH区如SEQ ID No:2所示，VK区如SEQ ID NO：3所示。

第四部分：抗PD-L1基因活性检测

一．Anti-PD-L1的转染

1.转染前一天，取10ml，5×10⁶Cos细胞于10cm的培养板中，共6组。

2.转染当天，Anti PD-L1的转染共分为2个小组，一Anti PD-L1组；一为空白对照组，每组3个重复。同时进行。

3.稀释50μl lipofectamin 2000于1ml opti-EME培养基中。

4.稀释25μg DNA于1ml opti-EME培养基中。并与2在室温下混匀放置20min后添加4ml的opti-EME培养基。

5.用opti-EME培养基在细胞板中洗涤COS细胞3遍。

6.3中得到的培养液重悬洗涤过后的COS细胞并在37℃下培养2h。

7.加入6ml的含20%FBS（no p/s）的opti-EME，并在37℃下培养24h。

8.第3天，观察细胞生长情况，细胞换液，每板中加入14ml的opti-EME培养基(noFBS/P/S)。

9.第5天，对AntiPD-L1转染组的细胞生长液取上清保存于-20℃待用。

10.对细胞上清液进行蛋白浓缩（超滤），细胞上清液体积浓缩到3ml待用（10000rpm，4℃）。

二．ELISA检测

1.调整肺癌细胞5853，5853-A2(均表达PD-L1)，浓度为5×105铺于96孔板中，37℃过夜。

2.洗涤：对孵有细胞的96孔板离心，去上清，并在各孔中加入200μl的PBST洗涤，静置5min，去除上清。重复2遍。

3.固定：在96板各试验孔中计入200μl 10% folmanin的PBST，室温下静置10min。

4.洗涤：在各孔中加入200μl的PBST洗涤，静置5min，去除上清。重复3遍。

5.封闭：去除上清，各孔中加入200 μl封闭液(含3%BSA的PBST)，室温下静置30min。

6.抗体：去除上清，在各孔中加入相应量的抗PD-L1转染Cos细胞的上清液,室温下孵育2h。

7.洗涤：对孵有细胞的96孔板，去除上清，并加入200μl PBST，静置5分钟，重复3遍

8.二抗-HRP: 在各试验孔加入对应的二抗-HRP试剂，试剂均用封闭液稀释1000倍后使用，室温下孵育1h。

9.洗涤：在各孔中加入200μl的PBST洗涤，静置5min，去除上清。重复3遍。

10.TMB: 在各试验孔中加入100μlTMB Substrate solution。避光显色15min。

11.终止：在显色后加入等量的终止液，观察颜色变化。

12.测定：在630nm处酶标检测各孔OD.值。

三．结果如图2和图3所示。

图2与图3中，96孔板上孵育5853、5853A2细胞（均表达PD-L1），用PD-L1基因转染Cos细胞的上清（浓缩后）检测Cos细胞分泌的PD-L1抗体的活性。其中实验组为PD-L1抗体基因转染Cos细胞上清，对照组为不加质粒转染Cos细胞上清，培养基阴性对照组则只用培养基作为上清。

第五部分：Anti-PD-L1-CAR-T的制备

一． Anti-PD-L1-CAR-T的基因合成和载体构建

将获得的PD-L1抗体基因与相关的铰链区、跨膜区及胞内信号区基因片段合成Anti-PD-L1-CART-CD28-41BB-CD3-IRES-HSV-TK基因序列，如SEQ ID NO：1所示。并选定构建载体为PCDH慢病毒载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP)。包装载体和包膜载体来自Invitrogen的三包被系列（通用载体），此慢病毒系统属于第三代病毒。

二．慢病毒包装及收集浓缩检测

1. 293T 细胞的培养

1)首先复苏293T细胞，提前30分钟打开超净工作台的紫外线灯和 37℃水浴锅，预热PBS及含10%FBS的DMEM培养基。

2)从-100℃冰箱取出一只293T细胞的冻存管，37℃水浴中快速融化。

3)将冻存管移入超净工作台中，酒精消毒，用1ml 移液管吸取细胞悬液（约 1ml）移至盛有5ml DMEM培养基的15ml离心管中，1200r/min离心5min，弃上清。

4)加入6ml PBS清洗一次，1200r/min离心5min弃上清。

5)加5ml含10%FBS的DMEM培养基，轻轻吹打细胞悬液，使细胞分散均匀，然后移入T25瓶中，将其置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

6)用倒置显微镜观察细胞生长，当汇合度达到 80%左右进行传代。

7)实验准备同上，将培养瓶中的旧培养基吸出，用预热的 PBS 冲洗一次，弃去。

8)加入0.25%胰酶1ml消化，至显微镜下观察，消化程度适宜时，立即加入2ml含10%FBS的DMEM培养基终止消化。将细胞悬液移入15ml离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。

2. 慢病毒包装(采用HET高效转染包装试剂盒)

1)转染前24h，用0.25%胰酶消化对数生长期的293T细胞，用10ml含10%FBS的DMEM培养基重悬5×10⁶个293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，37℃，5%CO培养过夜使细胞密度达到70% ~ 80%，此时细胞达到最佳转染状态。

2)转染当天检查 293T 细胞，如果培养基看起来发黄或有许多漂浮的细胞，则更换培养基（培养基需提前37℃预热），动作要轻柔，避免细胞从培养板上分离下来。

3)使用前预热试剂至常温。

4)次日，吸去细胞培养液，加入新鲜培养液（不含青霉素-链霉素）。

5)取两根无菌1.5ml eppendorf管，分别记为A、B。按下表，

在100-mm 培养皿包装体系，

A管：500μl Buffer A

B管：50μl Buffer B + 40ug的无菌水补足体系至500μl

(50ug PCDH + 35ug plp1+ 35ug plp2 + 25ug pvsvg)

6)用移液管混匀B管中溶液并将B管中溶液轻轻逐滴加入到A管中。用气泡法混匀转染混合物,竖直震荡10s，这一步尽量在2分钟内完成，室温孵育30分钟。

7)将混合物逐滴加入到细胞中，轻轻摇晃培养皿使混合物均匀分布在细胞表面。

8)放置到潮湿37°C、5%CO₂培养箱中培养。

9)转染6h后用新鲜培养基更换细胞培养液，于37℃ 5%CO₂培养箱中继续培养24-48h。

3. 慢病毒上清液的收集及浓缩

1)病毒的收集: 转染48h后，用荧光显微镜观察对照组LV-GFP绿色荧光细胞的情况。用20ml注射器吸取培养皿中的病毒上清至15ml离心管中，2500r/min离心5min以除去细胞碎片，再将上清通过0.45µm滤膜出去杂质。

2)病毒的浓缩: 配制20%蔗糖溶液，将10g蔗糖溶于50ml超纯水中，经0.22µm过滤除菌。取4个Ultra-clear SW28离心管，用乙醇和紫外线消毒。

3)向每个离心管中加入约 20ml 的病毒上清。

4)用移液管吸取4 ml蔗糖溶液，插入到管底，慢慢打出。

5)用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。

6)将4个离心管放入超速离心转头中，4℃，25000 r/min离心2 h。

7)取出离心管，弃液，倒扣在洁净的吸水纸上约10 min，管底可见沉淀。

8)每管中加入200 μl PBS溶解沉淀。4℃溶解2 h，每隔20 min轻轻震荡。

9)4℃，800r/min离心1 min，使溶液集中于管底。用200 μl移液枪将所有管中的液体吸出，按500 μl/管分装至EP管中。

10)所获得的病毒应立即使用，若短时间不用则保存于-80℃冰箱。获得的慢病毒命名为LV-CD19/CAR。

4. 病毒感染293T细胞效率测定

1)感染前一天，用胰酶消化细胞并计数，准备5×10⁵细胞/ml 的293T细胞接种24孔板，每孔0.5ml。

2)细胞接种后第二天，根据病毒的预期滴度，准备3个无菌的EP管，以1：10，1：100，1：1000倍稀释慢病毒浓缩液。

3)各感染孔内分别加入相应稀释度的病毒液及病毒原液100ul，放入37℃、5% CO2的培养箱内。

4)感染24小时后，换液，每孔内加入500ul DMEM+10% FBS+1%P/S继续放回培养箱内进行孵育。

5)感染72h后观察荧光情况，用胰酶消化细胞，PBS重悬后流式上机检测GFP阳性细胞数，并依此计算待测慢病毒的滴度。

6)计算公式为：Titer=[F×C/V]×D，其中，F=GFP阳性细胞百分比，C=感染时每孔细胞总数，V=接种体积（ml），D=慢病毒稀释度。

三． T细胞的准备

1.PBMC的分离

1)抽取健康人新鲜外周血（按0.1 ml肝素/ml全血加入肝素抗凝），与等体积PBS混匀。

2)加入1/3的Ficoll淋巴细胞分离液，用移液管将血样沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液的液面上，注意保持界面清楚，2500r/min，离心30min。

3)小心吸出血浆层和分离液之间的淋巴细胞层，加入10倍体积的PBS，充分混匀，1200 r/min离心10 min。

4)再用10倍体积的PBS洗一次，1200 r/min 离心10min。

5)用培养基重悬并计数，获得分离的人外周血单个核细胞（PBMCs）。

2.CD8/CD3细胞磁珠分离

1)PBMC洗涤：将PBMC转移至离心管中，并于离心机中1500rpm离心5min。将离心管取出，去除上清，并用移液枪吸取8ml的RPMI1640+10%FBS于离心管中，轻轻吹打5-10次悬浮细胞。

2)计数PBMC，置于离心机中1500rpm离心5min，将离心管取出，去除上清液。

3)在每10⁷PBMC中用移液器添加分离缓冲液80µl并重悬，同时在细胞液中添加20µl磁珠液并用移液枪吹打5-10次混匀。

4)将细胞液置于4冰箱摇晃培养15min。

5)在PBMC和磁珠孵育过程中，将过滤柱安放在磁体上，并以15ml离心管接取废液。

6)用移液器吸取500µl的分离缓冲液，经过过滤网，轻轻注入过滤柱的中央位置，注入期间注意避免气泡的产生。重复2-3次。

7)在PBMC和磁珠孵育结束后，移去接取废液的离心管，换一新15ml离心管于过滤柱下端接取NON-CD8细胞液。

8)用移液器将孵育结束的PBMC液经过过滤柱，逐滴加入经过洗涤的过滤柱中，注入期间注意避免气泡的产生。

9)待PBMC液过滤完全后，用移液器吸取500µl的分离缓冲液经过过滤网，轻轻注入过滤柱中，注入期间注意避免气泡的产生。重复3次。

10)在洗涤结束后，从磁体中移出过滤柱并安置于一新的15ml离心管中，用移液枪吸取500ml的RPMI1640培养液添加在过滤柱中，用力挤压过滤柱柱头，将培养液滤置离心管中。用移液器吸取500µl的RPMI1640培养液重复上述过程并收集CD8细胞液。

四．慢病毒感染T细胞

T细胞的生长情况可以用倒置显微镜观察，当细胞生长状态良好时可进行感染。按适当比例加入LV- PD-L1-CAR的量，将病毒悬液加入T细胞培养基中，LV-GFP 为阴性对照、未感染细胞为空白对照。过夜培养，约16-18h后换液。

1. CD3/CD8 T细胞感染

1)将分离好的CD3/CD8细胞在24孔板中培养，每孔中1×10⁶细胞/2mlPRMI+10%FBS培养基。

2)在每孔细胞中添加30U/ml的IL-2和20U/ml的IL-7，移入5%C02，37度培养箱中培养，每3天更换培养基和细胞因子。

3)当细胞浓度达到3×10⁶/ml时，转移细胞与6孔板中1×10⁶/孔。

4)按照病毒感染复苏在T细胞培养液中滴加病毒浓缩液。

5)6h左右感染后，更换培养基，IL-2为60U/ml。

6)观察细胞培养状态，感染T细胞5天左右后，可利用流式细胞仪检测T细胞表面CAR的表达。设置阴性对照和同型对照。

2. PBMC感染

1)抗体包被：将24孔板用1ug/ml anti CD3和5ug/ml antiCD28包被待用。

2)将分离得到的PBMC在培养预包被的细胞板中激活3天，细胞培养过程中添加100U/ml的IL-2；在细胞培养第2天，添加20U/ml的IL-7；

3)T细胞激活后，观察细胞生长状态，将浓缩纯化好的病毒悬液按照适当比例滴加在T细胞液中，感染约18h后更换培养基于培养。

4)培养过程中观察细胞状态，每隔3天更换细胞培养液，加入100u/ml的IL-2，使细胞浓度维持在1-2×10⁶/ml，37度，5%CO2培养。

5)待细胞量达到50×10⁶后，对细胞毒性检测。

第五部分CAR-T的体内外检测

一．T细胞中CAR的检测（流式法）

1.慢病毒LV感染目的T细胞5天后，收集各组细胞1×10⁶于离心管中；

2.1200rpm离心5min，去上清；

3.各管细胞加入1ml的PBS洗涤细胞，1200rpm离心5min后去上清。

4.各管加入0.1ml的PBS，对抗体FC端用anti mouse IgG封闭后，加入anti humanIgG F(ab)2 PE（具体量需参考说明书）。

5.置于4度孵育20min后用PBS洗涤两次，流式检测。

二．T细胞中CAR的检测（Western blot法）

1.培养细胞蛋白质样品的制备：在感染CAR后的T细胞培养之一定密度（80%左右），取一定量的细胞于离心管中，5000rpm离心5min，用预冷的PBS洗涤3次，离心收集，加入0.2ml左右的裂解液反复吹打，获得细胞蛋白样品。

2.SDS-PAGE电泳：按照常规方法配制12%的分离胶和5%的浓缩胶；细胞蛋白样品与SDS的loading buffer混匀后在100度水浴加热5min，待上样检测；一般采用恒压浓缩胶85V，分离胶120V，时间2小时左右后停止电泳。

3.免疫印迹：SDS-PAGE胶转移，以3层滤纸—PVDF膜—凝胶—3层滤纸的方式装置转印槽，同时出去各层夹带的气泡；25V电转印30min左右后放入封闭液中室温摇床封闭2小时；

4.抗体杂交：一抗孵育：anti human CD3/CD8；洗膜；二抗孵育：HRP的antimouse-IgG；洗膜；显色检测

三．CAR-T细胞的细胞毒性检测（非放射性细胞毒性杀伤cyto96检测）

1.靶细胞：稳定表达PD-L1的COS细胞作为阳性靶细胞，未转染的COS作为对照细胞。两种细胞用含 10%FBS 的DMEM 培养基在 37℃、5%CO2培养箱中。

2. 效应细胞：CAR+T 细胞，GFP+T 细胞和未感染 T 细胞

3.用细胞培养液对效应细胞洗涤并确保单细胞个体存在，调至浓度为2×10⁶/ml。

4. 效应细胞设置：分别取50µl效应细胞细胞液于对应10:1效靶细胞孔中（每组3个重复）。添加细胞培养液，对剩余细胞液稀释5倍后分别取50µl于2.5:1效靶细胞孔中（每组3个重复）。同样稀释剩余细胞液5倍后分别吸取50µl于0.625:1效靶细胞孔中（每组2个重复）。

5. 靶细胞的设置：用细胞培养液对靶细胞洗涤并确保单细胞个体存在，调至浓度为2×10⁵/ml。吸取50µl细胞液于对应已添加效应细胞孔中。

6.靶细胞自发和最大释放孔：取400-500µl靶细胞液稀释2倍后分别取50µ肿瘤细胞于相应孔中（每组3个重复）。

7. 吸取100µl细胞培养基于培养基背景孔和体积校正对照孔中做空白对照（共3×2孔）。

8.向体积校正对照孔中添加10µl裂解液（10×）完成体积校正。

9. 将设置好的培养板250g离心4min，确保效应细胞核靶细胞的充分接触。

10.培养板置于37℃，5%CO2湿润培养箱中孵育至少4小时。

11. 孵育完成前45min，分别向靶细胞最大释放孔中加入10µl裂解液（10×）（共4×3孔）。（注：如镜下观察靶细胞未完全理解，可加入5µl裂解液（10×），同时在体积校正孔中同量添加。）

12.孵育完成后，250g离心4min。

13.用排枪从每孔中转移50µl上清液至一个新的平底96孔板中。

14.37℃融化检测缓冲液Assay buffer，取出12ml（剩余迅速储存于-20℃中）避光平衡至室温后加入到一瓶底物混合液Substrate mix中，轻轻颠倒摇晃使底物溶解（避光直射，立即使用）。

15.向有上清分析板中每孔加入50µl配置好的底物，锡箔纸避光室温孵育30min。剩余储存于-20℃中待用。

16.孵育结束后每孔添加50µl终止液。并用注射器针头戳破大气泡，1小时内在490nm或492nm测量吸光值。

17.数据分析

实验值（均值）=实验孔吸光值—培养基背景吸光值

靶细胞自发释放值（均值）=靶细胞自发释放孔吸光值-培养基背景吸光值

效应细胞自发释放值（均值）=效应细胞自发释放吸光值-培养基背景吸光值

细胞毒性%=（实验值-靶细胞自发释放值-效应细胞自发释放值）/（靶细胞最大释放值-细胞自发释放值）×%

三．ELISA法检测IFN-γ的分泌

1.稳定表达PD-L1的COS细胞作为阳性靶细胞，未转染的COS作为对照细胞。两种细胞用含10%FBS的DMEM培养基在 37℃、5%CO2培养箱中。

2.计数靶细胞，将细胞浓度调至1x10⁶/ml。

3.CAR-T 细胞为效应细胞，GFP+T 细胞和未感染T细胞做为对照。

4.计数Anti PD-L1-CAR-T细胞，将细胞浓度调至1x10⁶/ml。

5.将效应细胞和靶细胞以1:1、2:1、4:1、8:1放入圆底96孔板中。（实验设3组重复）

6.将细胞在37C孵育18~20小时，离心96孔板。

7.吸取100μl上清液至新的平底96孔板中。

8.用IFN-γELISA试剂盒检测IFN-γ的分泌。

五．动物实验

1. 裸小鼠肿瘤模型建立

1)PD-L1-COS细胞用DMEM培养基（含10%FBS）、37℃、5%CO2培养箱中培养。

2)0.25%胰蛋白酶消化，DMEM培养基洗涤细胞，弃上清液。

3)用无菌 PBS 重悬制成细胞密度为5×10⁷/ml的单细胞悬液备用。

4)100μl 细胞悬液接种于裸小鼠背部皮下，每天观察小鼠饮食、排便及精神等状况，称量体重。用游标卡尺测量肿块的长度和宽度。

2.CAR-T 细胞输注

1)当肿瘤体积达到一定程度时，将裸小鼠按每组5只随机分为3组。

2)按如下将细胞溶于1ml PBS通过尾静脉注射小鼠体内。A组：1x10⁷ CAR+T 细胞；B 组：1x10⁷ GFP+T 细胞；C 组：空白对照只加1ml PBS。

输注后，继续按如上方法观察，观察小鼠状况，称量。共观察60d。

Claims

1.一种anti-PD-L1-CAR-T基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1的anti-PD-L1-CAR-T基因的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将获得的PD-L1抗体基因与相关的铰链区、跨膜区及胞内信号区基因片段合成Anti-PD-L1-CART-CD28-41BB-CD3-IRES-HSV-TK基因序列，如SEQ ID NO：1所示，并选定构建载体为PCDH慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。

3.如权利要求2的anti-PD-L1-CAR-T基因的制备方法，其特征在于还包括制备PD-L1的抗体基因的步骤。

4.如权利要求2的anti-PD-L1-CAR-T基因的制备方法，其特征在于还包括PD-L1的抗体基因的活性检测步骤。

5.如权利要求2的anti-PD-L1-CAR-T基因的制备方法，其特征在于所述的PD-L1抗体的VH区碱基序列如SEQ ID NO：2，VK区碱基序列如SEQ ID NO：3。

6.权利要求1所述anti-PD-L1-CAR-T基因在制备肿瘤药物中的应用。