CN108864310A

CN108864310A - 一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用

Info

Publication number: CN108864310A
Application number: CN201810856990.7A
Authority: CN
Inventors: 尚小云
Original assignee: Suzhou Mao Hang Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Mao Hang Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明涉及肿瘤免疫领域，具体涉及一种靶向间皮素并携带PD‑Ll阻断剂的CAR‑T细胞的构建及其应用。本发明的CAR‑T细胞是通过将靶向间皮素并携带PD‑Ll阻断剂的嵌合抗原受体(CAR)转染至T细胞构建而成，其中靶向间皮素并携带PD‑Ll阻断剂的嵌合型抗原受体由CD8抗原的前导肽、抗间皮素单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号域和抗PD‑L1抗体分泌区依次连接组成。本发明的CAR‑T细胞的间皮素SS1P scFv可以特异性的与表达间皮素糖蛋白的肿瘤细胞结合，促进抗肿瘤相关细胞因子的分泌，从而对这类肿瘤细胞产生杀伤效应；另外，本发明的CAR‑T细胞还能分泌PD‑L1抗体，特异性的与肿瘤细胞表达产生的PD‑L1相结合，阻断PD‑L1/PD‑1信号对T细胞活性的抑制效应，有利于CAR‑T长时间对肿瘤细胞生长产生有效的抑制。

Description

一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫领域，具体涉及一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用。

背景技术

间皮素(mesothelin，MSLN)是一种通过磷脂酰肌醇区(GPI)锚定在细胞质膜上的糖蛋白，其在实质性器官如心脏、肾脏、肝脏中几乎不表达，在正常情况下，其主要表达于腹膜、胸腹腔和心包上的间皮细胞中，而在上气管、卵巢、扁桃体和输卵管等上皮细胞表面低表达。最近对于实体瘤的研究发现，间皮素在肺癌、胃癌、食管癌胸腺癌中都处于过表达，从而改变细胞的生物学特征。间皮素在细胞内主要是通过两条途径来发挥调节细胞功能的作用，一是通过其GPI结构域直接激活细胞内信号通路，二是与其受体CA125/MUC16相互作用。当细胞内间皮素处于过表达的状态时，就会激活NFκB、MAPK和PI3K细胞内信号通路，促进细胞增殖，抵抗细胞凋亡。而且，通过对卵巢癌细胞系的研究发现，间皮素还可以通过与CA125相互作用而导致异常的细胞粘附，促进癌症细胞的转移。此外，通过间皮素基因敲除小鼠的研究发现，间皮素基因的缺失，并未影响小鼠的生长发育过程。因此，目前普遍认为。间皮素的表达与否，与人类的生长发育之间不存在关联性，但其高表达与肿瘤细胞的非锚定增殖、抗失巢凋亡、细胞耐药等密切相关，是癌症靶向治疗的理想靶点。

程序性死亡受体配体(PD-L1)广泛表达于非造血细胞和肿瘤细胞表面，在肿瘤微环境中发挥着关键作用，其作为一种负性因子与PD-1相互作用时，不仅阻断体内效应细胞活化第一、二信号，阻止效应性细胞活化增殖、并发挥其抗肿瘤效应，而且也能抑制过继转输的免疫效应性细胞的抗肿瘤效应，此外，还能辅助调节性细胞发挥抑制性功能，甚至诱导辅助性细胞向调节性细胞转化，严重影响实体瘤的免疫治疗。最新研究表明，阻断PD-L1/PD-1信号可削弱调节性细胞对效应性细胞的增殖抑制，促进抗肿瘤相关细胞因子的分泌，进而对肿瘤细胞生长产生有效的抑制，延长小鼠生存时间。

CAR-T细胞是经过遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)基因的外周血T细胞，能够特异性的识别肿瘤细胞表面的抗原，从而靶向杀死肿瘤细胞，CAR主要由三个部分组成：(1)胞外区：包含靶抗原单克隆抗体单链可变区(ScFv)，可以特异性识别肿瘤细胞表面抗原；(2)跨膜区；(3)胞内区：包含单细胞信号转导区域(CD3)和协同共刺激信号区，前者负责连接胞内信号转导通路和抗原识别受体，激活T细胞，后者可促使CAR-T细胞在体内不断增殖并持续存活，增强抗肿瘤活性。使用质粒转染，mRNA或病毒载体转导将CAR构建体转染到T细胞中，以将它们导向表面暴露的肿瘤相关抗原(TAA)。CAR结构已经从仅涉及scFv和CD3δ信号传导结构域(被称为“第一代CAR”)的初始组合物演变成其中已经添加协同共刺激信号结构域的更复杂形式，从而产生第二代(例如CD3δ加4-1BB或CD28信号结构域)和第三代(例如，CD3δ加4-1BB和CD28信号传导结构域)CAR，增强了T细胞的持续肿瘤杀伤效应和增殖能力，但这三种CAR-T在注射前需要对患者进行化疗或放疗等预处理，以使抗肿瘤效应达到最佳。第四代CAR-T引入细胞因子和共刺激配体，例如能够分泌IL-12且靶向CD19，在缺乏环磷酰胺预处理情况下仍具有很好的抗CD19+肿瘤细胞作用，到目前为止，已经发展到第五代的通用CAR-T。嵌合抗原受体较TCR改造更具优势：(1)特异性：抗体(配体)特异性识别抗原(受体)；(2)效率高：不会出现转基因TCR与患者内源性TCR发生错配；(3)非MHC-Ⅰ限制性：不需要与MHC-Ⅰ分子结合，可克服肿瘤细胞、肿瘤微环境下调MHC-Ⅰ分子造成的免疫逃逸；(4))抗原选择范围广：抗原可以是糖类、脂类、蛋白。

虽然CAR-T细胞疗法在血液系统肿瘤的治疗中取得了一定的成功，但其在实体瘤的治疗中遇到了极大的挑战。其主要原因是实体瘤的肿瘤所处的微环境十分复杂，肿瘤微环境(TME)对CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的作用造成了相当大的阻扰。TME主要由肿瘤周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎症细胞、淋巴细胞、信号分子和细胞外基质(ECM)等组成。肿瘤和TME联系紧密并且二者之间一直有着相互作用。肿瘤能够通过释放胞外信号促进肿瘤血管发生和外周的免疫耐受来影响TME，而TME也能影响肿瘤细胞的生长和进化。实体瘤中的TME主要以趋化因子(例如CXCL12)减少T细胞的募集(无形城墙)和ECM的屏障作用(有形城墙)来妨碍T细胞的肿瘤杀伤效应。

虽然通过CAR-T的免疫治疗在一些肿瘤获得较理想的疗效，但在很多实体瘤中，由于肿瘤微环境对肿瘤的保护作用，以及PD-L1对免疫效应细胞杀伤能力的抑制，使得免疫效应细胞在肿瘤组织中的存活率较低、活性不高，达不到预计的治疗效果。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，该嵌合型抗原受体能靶向识别间皮素并可分泌表达抗PD-Ll抗体。在此基础上，本发明还提供了一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞，该细胞可以特异性的与表达间皮素糖蛋白的肿瘤细胞结合，促进抗肿瘤相关细胞因子的分泌，从而对这类肿瘤细胞产生杀伤效应；还可以分泌PD-L1抗体，特异性的与肿瘤细胞表达产生的PD-L1相结合，阻断PD-L1/PD-1信号对T细胞活性的抑制相应，有利于CAR-T长时间对肿瘤细胞生长产生有效的抑制。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，该嵌合型抗原受体由CD8抗原的前导肽、抗间皮素单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号域和抗PD-L1抗体分泌区依次连接组成；所述抗间皮素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗PD-L1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述铰链区为人CD8α、或者TCRβ中的任一种，所述CD8α铰链区DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述跨膜区为CD4、CD8或CD28跨膜区中的任一种；所述CD28跨膜区DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述胞内信号域为CD3δ、4-1BB、CD137、CD134、CD28或CD86中的至少一种；所述CD3ζ胞内信号域DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述抗PD-L1抗体分泌区编码序列包括内部核糖体进入位点序列、抗PD-L1抗体序列和人IgG1序列。

肿瘤细胞表面的抗原(受体)与所述的嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。

本发明的第二个目的在于提出上述任一项靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体的应用，所述嵌合型抗原受体应用于制备抗肿瘤的药物，所述肿瘤细胞过表达间皮素或表达PD-L1。

本发明的第三个目的在于提供一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞能特异性的抑制、杀伤表达间皮素的肿瘤细胞，并阻断PD-L1/PD-1信号对T细胞活性的抑制效应。

上述的靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，具体方法为：

a、合成CD8抗原的前导肽、抗间皮素SS1P单链抗体基因片段、铰链区的基因片段、跨膜区基因片段、胞内信号区基因片段和抗PD-L1抗体分泌区基因片段；

b、基因融合所述CD8抗原的前导肽与所述抗间皮素SS1P单链抗体基因片段，从而形成引导链-间皮素SS1P scFv；

c、基因融合所述铰链区的基因片段、所述跨膜区基因片段、所述胞内信号区基因片段和所述抗PD-L1抗体分泌区基因片段，而形成铰链区-跨膜区-胞内信号区-anti PD-L1scFv-Fc IgG1；

d、基因融合所述引导链-间皮素SS1P scFv和所述铰链区-跨膜区-胞内信号区-anti PD-L1scFv-Fc IgG1，而形成引导链-间皮素scFv-铰链区-跨膜区-胞内信号区-antiPD-L1scFv-Fc IgG1；

(2)构建靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体的表达载体：

将引导链-间皮素scFv-铰链区-跨膜区-胞内信号区-anti PD-L1scFv-Fc IgG1接入载体，而获得嵌合型抗原受体(CAR)表达载体；

(3)将嵌合型抗原受体表达载体加入到保护液稀释的T细胞中进行电转，培养扩增后，通过筛选，获得可以特异性结合间皮素和分泌PD-L1的CAR-T细胞。

本发明最后还提供了靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的应用，所述CAR-T细胞应用于制备抗肿瘤的药物，所述肿瘤细胞过表达间皮素或表达PD-L1。

本发明的有益效果：

(1)本发明主要针对实体瘤中高表达间皮素和肿瘤微环境中PD-L1对效应细胞活性抑制的特点，通过嵌合抗原修饰免疫效应细胞，使其细胞膜外表达间皮素抗体并分泌PD-L1的抗体或可溶性受体或其他阻断剂，增强目的CAR-T细胞识别、杀伤肿瘤细胞的能力。并且本发明的CAR的是特定的功能基因片段通过特定的组合方式构建成面的，这些细胞共激活分子和信号传导分子，可以有效的刺激T细胞的活化增殖及肿瘤杀伤因子的分泌。

(2)胞内信号传导区整合了共刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤细胞作用。

(3)本发明中的能表达嵌合型抗原受体的基因修饰CAR-T细胞在体外实验和体内实验中均发现具有显著的抑制、杀灭肿瘤的活性，能够作为活性成份制备抗肿瘤药物。

附图说明

图1为实施例1中构建的靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的载体结构示意图。

图2为Western Blot检测本发明实施例2中CD3δ的表达含量结果示意图。

图3为流式检测本发明实施例2中meso-CAR-T细胞的阳性率结果示意图。

图4为本发明实施例2中anti-PD-L1抗体的检测结果直方图。

图5为ELISA法检测本发明实施例3中CAR-T细胞及未转化的T细胞分别与肿瘤细胞共培养后的IFN-γ分泌量的结果示意图。

图6为ELISA法检测本发明实施例3中CAR-T细胞及未转化的T细胞分别与肿瘤细胞共培养后的IL-2分泌量的结果示意图。

图7为ELISA法检测本发明实施例3中CAR-T细胞靶向间皮素特异性的统计图。

图8为51Cr释放试验检测实施例3中CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用的统计图。

图9为RT-PCR法检测本发明实施例4制备的CAR-T细胞CD3δ量的直方图

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

本发明人通过研究，提出一种能特异性的与高表达间皮素的肿瘤细胞相结合、并分泌PD-L1从而阻断PD-L1对效应细胞活性的抑制的CAR-T细胞。

该CAR-T细胞中嵌合型抗原受体(CAR)由CD8抗原的前导肽、抗间皮素单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号域和抗PD-L1抗体分泌区依次连接组成；所述抗间皮素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗PD-L1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。嵌合抗原受体的合成需要逾越两个技术障碍，一是寻找更稳定有效的靶向间皮素单克隆抗体(scFV)和抗PD-L1抗体，二是获得最佳的CAR的组合方式。通过实验筛选，铰链区为人CD8α或者TCRβ中的任一种，其中CD8α铰链区的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；跨膜区为CD4、CD8或CD28跨膜区中的任一种，其中CD28跨膜区的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；胞内信号域为CD3δ、4-1BB、CD137、CD134、CD28或CD86中的至少一种，其中CD3δ胞内信号域DNA序列如SEQ IDNO.5所示。抗PD-L1抗体分泌区编码序列包括内部核糖体进入位点序列、抗PD-L1抗体序列和人IgG1序列。肿瘤细胞表面的抗原(受体)与所述的嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。因此，针对过表达间皮素或表达PD-L1的肿瘤，该嵌合型抗原受体可应用于制备抗肿瘤的药物。

基于上述的嵌合抗原受体，发明人提出了一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞，该CAR-T细胞能特异性的抑制、杀伤表达间皮素的肿瘤细胞，并阻断PD-L1/PD-1信号对T细胞活性的抑制效应。

该靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：

a、合成CD8抗原的前导肽、抗间皮素SS1P单链抗体基因片段、铰链区的基因片段、跨膜区基因片段、胞内信号区基因片段和抗PD-L1抗体分泌区基因片段，所述CD28的基因片段、所述的CD3δ基因片段以及所述抗PD-L1抗体scFv的基因片段；

因此，针对过表达间皮素或表达PD-L1的肿瘤，该靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞可应用于制备抗肿瘤的药物。

实施例1：靶向Mesothelin且组合分泌anti-PD-Ll的CAR-T细胞

本实施例中构成嵌合型抗原受体(CAR)的铰链区为人CD8α铰链区、跨膜区为人CD28跨膜区基因片段、胞内信号域为人CD3δ胞内信号区。

搜索获得anti-Mesothelin的抗体的氨基酸序列，并按照人偏好的密码子进行优化，合成Mesothelin的scfv序列。

搜索获得anti-PD-L1的抗体的氨基酸序列，并按照人偏好的密码子进行优化，合成anti-PD-L1的scfv序列。

1.制备PBMCs的cDNA为模板

从外周血中分离PBMCs，提取RNA，反转为cDNA，将反转录后获得的cDNA保存在-80℃冰箱备用。

2.分别合成铰链区的基因片段、跨膜区基因片段、胞内信号区基因片段

(1)以PMBCs的cDNA为模板，PCR扩增CD8αhinge铰链区的基因片段

①CD8α铰链区(CD8αhinge)引物(Takara公司)：

SEQ ID NO.6:

CD8Hinge-F:5’-agctggagatcaaggcctccaccacgacgccagcgccgcg-3’

SEQ ID NO.7:

CD8Hinge-R：5’-atcacaggcgaagtccagccccc-3’

②CD28跨膜区引物(Takara公司)：

SEQ ID NO.8：

CD28TM+ICD-F：5-gggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttg-3

SEQ ID NO.9：

CD28TM+ICD-R：5-ggagcgataggctgcgaagtcgc-3

③CD3δ胞内信号域引物(Takara公司)：

SEQ ID NO.10：

CD3δ-F：5-gcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagc-3

SEQ ID NO.11：

CD3δ-R：5-gcggtcgacttagcgagggggcagggcctg-3(SalⅠ)

以PMBCs的cDNA为模板，PCR扩增人CD8α铰链区基因片段、CD28跨膜区基因片段、人CD3δ胞内信号区基因片段。

3.使用重叠PCR技术进行基因融合

(1)将CD8leader链与SS1P scFv融合

通过PCR的方法，将CD8leader链与SS1P scFv基因序列进行融合，从而获得CD8leader-SS1P scFv；

SEQ NO.12：CD8αleader sequence：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctcca cgccgccaggccg

SEQ NO.13：引物序列：

5’-gcggaattcatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccg-3’(EcoRⅠ)

将PCR反应产物进行凝胶电泳检测后，切取目的条带，利用QIAquick试剂盒进行胶回收纯化，以获取CD8leader-SS1P scFv序列；

(2)CD8αleader-SS1P scFv-CD8αhinge-CD28-CD3δ融合

将CD8αhinge与CD28融合，获取CD8αhinge-CD28基因序列；随后将CD8αhinge-CD28与CD3δ融合，以得到CD8αhinge-CD28-CD3δ融合基因；之后将CD8αleader-SS1P scFv与CD8αhinge-CD28-CD3δ融合，获得CD8αleader-SS1P scFv-CD8αhinge-CD28-CD3δ。

具体的实验操作方法与CD8leader链与SS1P scFv融合操作方法相同，其中CD8αhinge与CD28融合过程中所添加的引物为CD8αhinge上游引物和CD28下游引物；CD8αhinge-CD28与CD3δ融合过程中所添加的引物为CD8αhinge上游引物和CD3δ下游引物；CD8αleader-SS1P scFv与CD8αhinge-CD28-CD3δ融合过程中所添加的引物为CD8αleader上游引物和CD3δ下游引物。将PCR产物进行电泳，数码凝胶图像采集与分析系统进行扫描分析，最终回收PCR产物CD8αleader-SS1P scFv-CD8αhinge-CD28-CD3δ。

(3)酶切连接

将CD8αleader-SS1P scFv-CD8αhinge-CD28-CD3δ和PiggyBac转座子质粒进行(EcoR I和Sal I)酶切后，将CD8αleader-SS1P scFv-CD8αhinge-CD28-CD3δ基因序列用T4DNA连接酶连接到PiggyBac转座子表达质粒中，并转入大肠杆菌进行扩增后，提取质粒，将提取的质粒与anti PD-L1scFv-Fc IgG1基因序列进行酶切后相连，构成可以表达靶向间皮素并分泌抗PD-L1抗体的表达质粒，其结构如图1所示，其DNA序列如SEQ NO.14所示。随后将质粒转染进大肠杆菌感受态细胞中，挑取单菌落进行扩大培养。质粒进行酶切鉴定后，挑取正确的单克隆进行大量抽提质粒，以获得足够量的、用于电转的CAR表达质粒。

4.电转染获得靶向MSLN并分泌anti-PD-L1抗体的CAR-T细胞

(1)将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞；

(2)轻轻收集初始T细胞到15ml离心管中，300×g，离心3min；

(3)弃上清，4ml AIM-V培养基重悬细胞，并细胞计数；

(4)取两个1.5ml离心管，每管加入约5×10⁶个细胞，编号a、b，分别1200rpm，离心3min；

(5)弃上清，生理盐水洗涤一次；

(6)选择PB-MSLN CAR-IRES-anti-PD1和转座酶Transposase质粒各5μg，并按照Lonza Amaxa电转试剂盒说明书要求，加入82μL电转缓冲液和18μL supplement1混匀，其中原始质粒PB-MSLN-CAR和转座酶质粒作为对照。

(7)以配好的质粒电转缓冲液混合物重悬细胞，并转移至电转杯中，使用仪器Lonza 2B，U-014程序进行电转，电转后的细胞迅速转移至提前预热的培养基中，37摄氏度培养箱培养两个小时，以5μg/mL的DNase1消化、清除电转中死细胞释放的DNA；

(8)30分钟后，将细胞计数并换液，用含300IU/mL IL-2、10％FBS的AIM-V培养基(完全培养基)培养在24孔板中，其中每孔2mL，细胞培养密度为1.5×10⁶个/mL；

(9)电转24小时后加入CD3抗体至终浓度50ng/mL，继续培养，每隔一天补加300IU/mL IL-2，培养15天后即可得到靶向MSLN的且分泌anti-PD-L1的CAR-T细胞。

实施例2：CAR-T细胞中mesoCAR的表达检测

1、Western Blot检测

通过检测mesoCAR中CD3链，来看CAR-T细胞中CAR的表达情况。其中试验组为实施例1中加了CAR质粒和T细胞转染获得的CAR-T细胞，对照组为实施例1中未添加CAR质粒转染获得的T细胞。

(1)细胞总蛋白样品的提取与制备

①收集实施例1中的CAR-T细胞，用生理盐水洗涤两遍；

②加入160μl细胞裂解液，冰上放置10min；

③待细胞充分裂解后，12000rpm，4℃，离心10min；

④收集上清，-20℃保存。

(2)Western Blot检测

分别提取mesoCAR-T和control T细胞总蛋白，通过CD3δ链特异性抗体，westernblot检测mesoCAR-T细胞中CAR的表达情况。从检测结果(见图2)可以看出，mesoCAR-T中CD3δ的表达量要显著性高于对照组。

2、流式检测

实施例1中CAR-T细胞转染10天后，收集细胞，流式检测CAR-T细胞阳性率，以同型抗体和未转染的T细胞作为对照。以羊抗鼠IgG F(ab’)2-FITC作为流式抗体。

(1)收集转染了10天的CAR-T细胞，3000rpm离心3min，弃去上清以收集细胞；

(2)每管加入1ml生理盐水，3000rpm离心5min，重复一次，弃去上清；将收集到的细胞分别分装在两管中；

(3)其中一管加入5μl流式抗体Goat Anti-Mouse IgG,F(ab’)2-FITC，混匀，室温避光孵育30min，另一管不加抗体作为阴性对照；

(4)每管加入1ml生理盐水，3000rpm离心3min，洗去未结合抗体；

(5)上机检测。

检测结果如图3所示，结果表明mesoCAR-T细胞中阳性率约为50％左右。

3、mesoCAR-T细胞抗PD-L1抗体分泌检测

(1)将转染后的CAR-T细胞在含有IL-21(50U/ml)的RPMI 1640培养基中培养48小时；

(2)12000rpm，离心5min，收集上清备用；

(3)将上清中CAR-T细胞分泌的抗PD-L1抗体用蛋白A琼脂糖珠(GE Healthcare)纯化，并使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Thermo Scientifc)将其进行生物素化。

(4)生物素化的PD-L1抗体与预先固定在MaxiSorp板上的PD-L1人Fc蛋白共孵育2小时后，再与链霉亲和素HRP温育1小时，随后利用TMB过氧化物酶底物(SureBlue)和TMB终止溶液(KPL)显示，450nm处测吸光值，以检测生物素化的抗体的含量，并以未转化的T细胞作为对照。

检测结果如图4所示，从检测结果可以看出，CAR-T细胞培养液中PD-L1抗体的分泌量相对较高，而在对照中，几乎检测不到抗PD-L1抗体。

实施例3：mesoCAR-T细胞体外功能检测

1、复苏并培养细胞株BGC823、BEL-7404及H460、H1299

流式检测mesoCAR-T细胞表型

抗体CD28-PE购自Beckman公司，CD27-PE、CD134-FITC、CD137-PE、CD107α-PC、CD38-FITC购自BD公司。

①T细胞经过刺激剂和BGC823细胞刺激培养后，进行流式实验；

②1.5ml离心管收集CAR-T细胞，每管约1×10⁶个，3000rpm，离心5min；

③弃上清，每管加入1ml生理盐水洗涤细胞，3000rpm,离心5min，弃上清；

④100μl生理盐水重悬细胞，加抗体2μl，混匀，室温避光孵育30min；

⑤以未电转质粒的T细胞作为对照，进行相同处理；

⑥T细胞各表型抗体有：CD137，CD28，CD27，CD134，CD38，CD107α；

⑦上机检测。

分别通过流式细胞仪检测mesoCAR-T细胞中CD137、CD28、CD27、CD134、CD38、CD107α六种表型分子的表达，以未转染的T细胞(control T)作为对照。与对照相比，CAR-T细胞中这些因子的表达量都相对较高。

2、Elisa检测共培养条件下mesoCAR-T细胞IFN-γ的分泌能力

细胞因子IFN-γ检测采用Elisa的方法

(1)收集BGC823、BEL-7404、H460、H1299及mesoCAR-T细胞，并进行细胞计数；

(2)取一块24孔板，每孔加入2.5×105个肿瘤细胞和同等数量的mesoCAR-T细胞，共2ml液体，37℃，5％CO₂培养箱内共培养过夜；

(3)每种细胞收集1ml培液，12000rpm，离心5min，收集上清备用；

(4)取出Elisa试剂盒，将所有试剂充分混匀，部分试剂平衡至室温；

(5)根据实验孔(空白和标准品)数量，各做两个复孔，确定所需的板条数目；

(6)加样：将Cytokine standard进行梯度稀释，100μl/well加至标准孔，将各样品稀释五倍，100μl/well加至样品孔，空白对照孔加入100μl Dilution buffer R(1×)，标准品和样品的稀释都使用Dilution buffer R(1×)；

(7)加检测抗体：每孔加入50μl Biotinylated antibody工作液，混匀，盖上封板膜，室温孵育2小时；

(8)洗板：扣去孔内液体，每孔加入300μl washing buffer，停留1分钟后扣去孔内液体，在滤纸上扣干，重复3次；

(9)加酶：每孔加入100μl Streptavidin-HRP。盖上封板膜，室温孵育20分钟；

(10)洗板：同步骤8；

(11)显色：每孔加入100μl TMB，室温避光孵育10-20分钟，孔内颜色为深蓝色；

(12)终止反应：迅速100μl/well加入Stop solution终止反应。

(13)用酶标仪测定450nm的吸光度。

Elisa法检测在肿瘤细胞的刺激下，mesoCAR-T细胞中IFN-γ细胞因子的分泌情况，检测结果如图5所示，当mesoCAR-T与BGC823、BEL-7404细胞共培养时，可以检测到细胞内大量分泌IFN-γ细胞因子，而与H460、H1299细胞共培养时，细胞培养液上清中只能检测到微量的IFN-γ；但BGC823、BEL-7404、H460、H1299细胞与对照组T细胞共培养时，细胞培养液上清中均检测不到IFN-γ的分泌，表明mesoCAR-T细胞可以特异性的识别、杀伤间皮素阳性肿瘤细胞。

3、Elisa检测共培养条件下CAR-T细胞IL-2的分泌能力

检测步骤同IFN-γ因子检测。

检测结果如图6所示，Elisa法检测肿瘤细胞的刺激下，mesoCAR-T细胞中IL-2细胞因子的分泌情况，结果显示，当mesoCAR-T与BGC823、BEL-7404细胞共培养时，可以检测到细胞内大量分泌IL-2细胞因子，而与H460、H1299细胞共培养时，细胞培养液上清中只能检测到微量的IL-2；但BGC823、BEL-7404、H460、H1299细胞与对照组T细胞共培养时，细胞培养液上清中检测不到IL-2的分泌，表明mesoCAR-T细胞可以特异性的识别、杀伤间皮素阳性肿瘤细胞。

4、抗原特异性评价试验

(1)包被：分别用200ul 5ug/ml间皮素-Fc嵌合蛋白和CD20-Fc嵌合蛋白包96孔板，用塑料贴纸覆盖96孔板，4℃过夜。

(2)加入活化的T细胞：次日，PBS洗涤96孔板3次后，抛干；分别向包被有间皮素-Fc嵌合蛋白和CD20-Fc嵌合蛋白的96孔板中添加1×10⁵CAR-T细胞，37℃培养过夜。并且另取洗涤、抛干后的包被有间皮素-Fc嵌合蛋白和CD20-Fc嵌合蛋白的96孔板中，分别加入1×10⁵T细胞过夜培养作为对照实验；

(3)酶联免疫法检测IFN-γ的分泌。

检测结果如图7所示，对照T细胞对间皮素-FC嵌合蛋白和CD20-FC嵌合蛋白均无特殊结合反应，CAR-T细胞对CD20-Fc嵌合蛋白也无特殊反应，但是在间皮素-FC嵌合蛋白封闭的96孔板中，CAR-T细胞释放了大量的IFN-γ，表明本发明中设计的CAR-T可以特异性的识别间皮素抗原。

5、51Cr释放试验检测CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞能力

(1)收获处于对数生长期的靶细胞(靶细胞为BGC823、BEL-7404、H460、H1299细胞)，调整细胞浓度为2×106/ml；

(2)取1×10⁶细胞(0.5ml)，加Na₂51CrO₄100uCi，37度孵育2-3h，每15min轻轻振摇一次；

(3)用10％FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800rpm，5min；

(4)重悬细胞浓度1×10⁵/ml；

(5)96孔U型培养板中，每孔加100u1(1×10⁴细胞)，设3个复孔；

(6)按照CAR-T细胞与靶细胞为30:1、10:1、3:1和1:1的比例，每孔加入100u1不同细胞浓度的CAR-T细胞；设置最大释放组，向靶细胞加入100ul 1％TritonX-100；设置自然释放组，向靶细胞中加100ul RPMI 1640培养基；

(7)200g离心1min，放入37℃，5％CO₂孵箱培养4h；

(8)200g离心1min，每孔取出100ul上清，用Wizard2gamma计数仪(PerkinElmer)检测。

(9)计算：特异性杀伤率(％)＝(实验组cpm-自然释放cpm)/(最大释放组-自然释放cpm)。

我们通过51Cr释放实验评价了CAR-T细胞对阳性肿瘤细胞的裂解作用。从检测结果来看(如图8所示)CAR-T细胞可以特异性的裂解BGC823、BEL-7404这些间皮素高表达的肿瘤细胞，但是对于H460、H1299这些间皮素不表达的细胞却没有表现出裂解作用；而对照组T细胞对于上述细胞都表现出裂解作用。

实施例4：CAR-T细胞中在动物模型中的抗肿瘤效果验证

建立BGC823阳性肿瘤细胞系的小鼠移植瘤模型用于验证表达靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞在动物模型中的抗肿瘤效果。

1、肿瘤小鼠模型的建立

(1)细胞培养

BGC823细胞系培养方法同实施例3所述。

(2)建立肿瘤模型

①2组(每组10只)雌性、8-12周NOD/SCID小鼠，背部皮下接种2×106BGC823细胞。

②每2-3天观察小鼠肿瘤生长情况。获取小鼠体重，游标卡尺记录小鼠肿瘤长径与短径，计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：V＝1/2*a*b*b(V为体积，a为长径，b为横径)。

(3)人外周血单核细胞的激活与转染

观察小鼠移植肿瘤体积达到约100mm3时，开始激活人外周血单核细胞，激活约24小时后，转染抗间皮素的CAR(具体方法同前)。待转染的CAR-T细胞扩增14天后(观察小鼠肿瘤体积约200-300mm3时)，T细胞扩增至少100倍，使用流式细胞仪分析转染抗间皮素CAR-T细胞的转染率(方法同前)。

为了明确输入小鼠体内CAR-T细胞表达抗间皮素CAR的阳性率，我们进行了流式细胞仪检测，结果发现，激活的CD3+的CAR-T细胞在体外培养14天后，CAR的表达率为70％。

(4)小鼠肿瘤模型的治疗及肿瘤生物学检测

①观察小鼠肿瘤体积约200-300mm3时，开始治疗。

②通过小鼠尾静脉注射2×107个T细胞：对照组为未转染CAR的T细胞组；实验组为抗间皮素CAR-T细胞。

③接种T细胞后，观察小鼠有无皮疹、腹泻等移植物抗宿主反应的发生，体重有无变化，继续用用游标卡尺监测肿瘤生长情况。

④NOD/SCI D小鼠肿瘤体积达2000mm3后处死小鼠，切取肿瘤组织，称重，提取DNA。

结果表明，小鼠注射T细胞之后，体重无明显变化，无皮疹等移植物抗宿主反应的发生。未转化的T细胞组小鼠肿瘤生长迅速，但CAR-T治疗组中小鼠肿瘤消退明显，与对照组之间存在显著差异，小鼠处死后获得的肿瘤组织称重，也表明CAR-T细胞治疗能显著抑制肿瘤细胞的生长。

2、RT-PCR法检测瘤内T细胞CD3ζ的表达

(1)RT-PCR检测引物：

SEQ NO.15：CD3δ-F:ggcacagttgccgattacag

SEQ NO.16：CD3δ-R:ctgctgaacttcactctcagg

SEQ NO.17：β-Actin-F：gcatgggtcagaaggattcctat

SEQ NO.18：β-Actin-R：tgtagaaggtgtggtgccagatt

(2)探针：

探针名称	探针序列(5’-3’)	5'荧光基团	3'淬灭基团
				CAR probe	SEQ NO.19：actctcagttcacatcctc	FAM	MGB
β-Actin probe	SEQ NO.20：tcgagcacggcatcgtcaccaa	FAM	TAMRA

(3)实验方法

①PCR体系：总体积20μl

Taqman MixⅡ	1.10μl
		Primer-F	2.2μl
Primer-R	3.2μl
		Probe	4.2μl
DNA sample	5.1μl
		ddH2O	6.3μl

②PCR程序

反应程序：95℃，15s→95℃，5s→60℃，15s，40个循环。

(4)结论

RT-PCR检测瘤内T细胞CD3δ的表达，结果(见图9)所示，mesoCAR-T细胞治疗组的表达量好于对照T治疗组。这表明，mesoCAR-T细胞在体内比对照T细胞增殖能力更强。表明本发明的CAR-T细胞可以显著抑制模型动物体内肿瘤的生长，具有很好的肿瘤杀伤效应。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例1-4对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 苏州茂行生物科技有限公司

<120> 一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

Ala Ser

<210> 2

<211> 428

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

1 5 10 15

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

20 25 30

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

35 40 45

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

50 55 60

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

85 90 95

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

100 105 110

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

115 120 125

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

130 135 140

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

145 150 155 160

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

165 170 175

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

180 185 190

Ser Leu Gly Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

195 200 205

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

210 215 220

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

225 230 235 240

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

245 250 255

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

260 265 270

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

275 280 285

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

290 295 300

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

305 310 315 320

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

325 330 335

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

340 345 350

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

355 360 365

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

370 375 380

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

385 390 395 400

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

405 410 415

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420 425

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 4

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 5

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agctggagat caaggcctcc accacgacgc cagcgccgcg 40

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcacaggcg aagtccagcc ccc 23

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggggctgga cttcgcctgt gatttttggg tgctggtggt ggttg 45

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggagcgatag gctgcgaagt cgc 23

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagc 44

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcggtcgact tagcgagggg gcagggcctg 30

<210> 12

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcggaattca tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cg 42

<210> 14

<211> 8804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60

catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120

agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180

atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240

tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300

gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360

ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420

aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480

gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540

gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 720

cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780

gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840

ctcgacacgc tgcagaacac gcagctagat taaccctaga aagataatca tattgtgacg 900

tacgttaaag ataatcatgt gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960

gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020

ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaac aaaaactcaa 1080

aatttcttct ataaagtaac aaaactttta tgagggacag ccccccccca aagcccccag 1140

ggatgtaatt acgtccctcc cccgctaggg ggcagcagcg agccgcccgg ggctccgctc 1200

cggtccggcg ctccccccgc atccccgagc cggcagcgtg cggggacagc ccgggcacgg 1260

ggaaggtggc acgggatcgc tttcctctga acgcttctcg ctgctctttg agcctgcaga 1320

cacctggggg gatacgggga aaaggcctcc acggccaagg atctgcgatc gctccggtgc 1380

ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg 1440

caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta 1500

ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt 1560

gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg 1620

catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg 1680

cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt 1740

aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800

ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc 1860

tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct actctagagc caccatggcc 1920

ttaccagtga ccgccttgct cctgccgctg gccttgctgc tccacgccgc caggccgcag 1980

gtgcagctgc agcagtccgg accagagctg gagaagcctg gagcctccgt gaagatcagc 2040

tgcaaggcca gcggctactc cttcaccggc tatacaatga actgggtgaa gcagagccac 2100

ggcaagtccc tggagtggat cggcctgatc accccctaca acggcgccag ctcctataat 2160

cagaagtttc ggggcaaggc caccctgaca gtggacaagt ctagctccac cgcctatatg 2220

gacctgctgt ctctgacaag cgaggattcc gccgtgtact tctgcgcaag gggaggatat 2280

gacggaagag gctttgatta ctggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagcggagga 2340

ggaggaagcg gaggaggagg atcctctggc ggcggctctg acatcgagct gacacagtcc 2400

ccagcaatca tgtctgccag cccaggagag aaggtgacca tgacatgttc cgccagctcc 2460

agcgtgagct acatgcactg gtatcagcag aagtctggca ccagccctaa gaggtggatc 2520

tatgatacat ctaagctggc aagcggagtg ccaggccgct tctccggctc tggcagcggc 2580

aattcctact ctctgaccat cagctccgtg gaggccgagg acgatgccac atactattgt 2640

cagcagtgga gcaagcaccc tctgacctac ggcgccggca caaagctgga gatcaaggcc 2700

tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 2760

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 2820

ctggacttcg cctgtgattt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 2880

agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 2940

ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 3000

cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg 3060

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 3120

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 3180

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 3240

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 3300

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 3360

caggccctgc cccctcgcta agtcgaccgc cccctctccc tccccccccc ctaacgttac 3420

tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat 3480

attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat 3540

tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga 3600

agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca 3660

gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac 3720

acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt 3780

caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca 3840

ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt 3900

aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg 3960

ataaatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga 4020

ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 4080

gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca 4140

ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc 4200

ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac 4260

cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa 4320

aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 4380

ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct 4440

caccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga 4500

ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctctgggta aagagcccaa 4560

atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc 4620

gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga 4680

ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta 4740

cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 4800

cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga 4860

gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa 4920

agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat 4980

gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc 5040

cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 5100

ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca 5160

gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca 5220

gaagagcctc tccctgtccc cgggtaaact aggtcgacaa tcaacctctg gattacaaaa 5280

tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg 5340

ctgctttaat gcctttgtat catgcgttaa ctaaacttgt ttattgcagc ttataatggt 5400

tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 5460

agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggaattg actcaaatga 5520

tgtcaattag tctatcagaa gctcatctgg tctcccttcc gggggacaag acatccctgt 5580

ttaatattta aacagcagtg ttcccaaact gggttcttat atcccttgct ctggtcaacc 5640

aggttgcagg gtttcctgtc ctcacaggaa cgaagtccct aaagaaacag tggcagccag 5700

gtttagcccc ggaattgact ggattccttt tttagggccc attggtatgg ctttttcccc 5760

gtatcccccc aggtgtctgc aggctcaaag agcagcgaga agcgttcaga ggaaagcgat 5820

cccgtgccac cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc tgccggctcg gggatgcggg 5880

gggagcgccg gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg ctgcccccta gcgggggagg 5940

gacgtaatta catccctggg ggctttgggg gggggctgtc cctgatatct ataacaagaa 6000

aatatatata taataagtta tcacgtaagt agaacatgaa ataacaatat aattatcgta 6060

tgagttaaat cttaaaagtc acgtaaaaga taatcatgcg tcattttgac tcacgcggtc 6120

gttatagttc aaaatcagtg acacttaccg cattgacaag cacgcctcac gggagctcca 6180

agcggcgact gagatgtcct aaatgcacag cgacggattc gcgctattta gaaagagaga 6240

gcaatatttc aagaatgcat gcgtcaattt tacgcagact atctttctag ggttaatcta 6300

gctgcatcag gatcatatcg tcgggtcttt tttccggctc agtcatcgcc caagctggcg 6360

ctatctgggc atcggggagg aagaagcccg tgccttttcc cgcgaggttg aagcggcatg 6420

gaaagagttt gccgaggatg actgctgctg cattgacgtt gagcgaaaac gcacgtttac 6480

catgatgatt cgggaaggtg tggccatgca cgcctttaac ggtgaactgt tcgttcaggc 6540

cacctgggat accagttcgt cgcggctttt ccggacacag ttccggatgg tcagcccgaa 6600

gcgcatcagc aacccgaaca ataccggcga cagccggaac tgccgtgccg gtgtgcagat 6660

taatgacagc ggtgcggcgc tgggatatta cgtcagcgag gacgggtatc ctggctggat 6720

gccgcagaaa tggacatgga taccccgtga gttacccggc gggcgcgctt ggcgtaatca 6780

tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 6840

gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 6900

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 6960

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 7020

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 7080

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 7140

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 7200

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 7260

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 7320

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 7380

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 7440

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 7500

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 7560

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 7620

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 7680

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 7740

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 7800

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 7860

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 7920

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 7980

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 8040

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 8100

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 8160

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 8220

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 8280

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 8340

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 8400

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 8460

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 8520

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 8580

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 8640

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 8700

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 8760

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcat 8804

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggcacagttg ccgattacag 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgctgaact tcactctcag g 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcatgggtca gaaggattcc tat 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtagaaggt gtggtgccag att 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

actctcagtt cacatcctc 19

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcgagcacgg catcgtcacc aa 22

Claims

1.一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，该嵌合型抗原受体由CD8抗原的前导肽、抗间皮素单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号域和抗PD-L1抗体分泌区依次连接组成；所述抗间皮素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗PD-L1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述铰链区为人CD8α、或者TCRβ中的任一种，所述CD8α铰链区DNA序列如SEQ IDNO.3所示。

3.根据权利要求1所述的一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD4、CD8或CD28跨膜区中的任一种；所述CD28跨膜区DNA序列如SEQID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域为CD3δ、4-1BB、CD137、CD134、CD28或CD86中的至少一种；所述CD3ζ胞内信号域DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求1所述的一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述抗PD-L1抗体分泌区编码序列包括内部核糖体进入位点序列、抗PD-L1抗体序列和人IgG1序列。

6.权利要求1-5中任一项所述靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体的应用，其特征在于，所述嵌合型抗原受体应用于制备抗肿瘤的药物，所述肿瘤细胞过表达间皮素或表达PD-L1。

7.一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞能特异性的抑制、杀伤表达间皮素的肿瘤细胞，并阻断PD-L1/PD-1信号对T细胞活性的抑制效应。

8.权利要求7所述的靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、获取CD8抗原的前导肽、抗间皮素SS1P单链抗体基因片段、铰链区的基因片段、跨膜区基因片段、胞内信号区基因片段和抗PD-L1抗体分泌区基因片段；

b、基因融合CD8抗原的前导肽与抗间皮素SS1P单链抗体基因片段，从而形成引导链-间皮素SS1P scFv；

c、基因融合铰链区的基因片段、跨膜区基因片段、胞内信号区基因片段和抗PD-L1抗体分泌区基因片段，从而形成铰链区-跨膜区-胞内信号区-anti PD-L1 scFv-Fc IgG1；

d、基因融合所述引导链-间皮素SS1P scFv和所述铰链区-跨膜区-胞内信号区-antiPD-L1 scFv-Fc IgG1，从而形成引导链-间皮素scFv-铰链区-跨膜区-胞内信号区-antiPD-L1 scFv-Fc IgG1；

将引导链-间皮素scFv-铰链区-跨膜区-胞内信号区-anti PD-L1 scFv-Fc IgG1接入载体，而获得嵌合型抗原受体(CAR)表达载体；

9.权利要求7所述的CAR-T细胞的应用，所述CAR-T细胞应用于制备抗肿瘤的药物，所述肿瘤细胞过表达间皮素或表达PD-L1。