CN114939109A - 一种用于体内产生car-m的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于体内产生car-m的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于体内产生CAR‑巨噬细胞(CAR‑M)的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。所述脂质纳米颗粒包含脂质膜和由所述脂质膜包裹的带有CAR的质粒；所述脂质膜包含DlinMC3、DOPE、Chol、PEG‑DMG、DOTAP和DSPE‑MTAS‑NLS。本发明利用此脂质纳米颗粒在体内直接产生CAR‑M细胞，为CAR‑M疗法治疗实体瘤提供了一种新颖、便捷、通用的实施方案。

Description

一种用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，细胞免疫疗法发展迅速，发展最快的为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法，从2017年至今已有4款CAR-T疗法获得FDA批准上市。CAR-T疗法的成功激发科学家们开展了对其他免疫细胞的基因工程改造研究。例如基于巨噬细胞能够浸润到实体瘤中的先天能力及其能够激活适应性免疫系统的能力，美国宾州大学研究者利用基因工程的方法将巨噬细胞改造成为嵌合抗原受体-巨噬细胞(CAR-M)，对实体瘤表现出了优异的治疗效果。该研发团队开发的HER2 CAR-M进展迅速，目前已进入I期临床试验。
虽然CAR-M疗法在治疗实体瘤上取得了这样令人鼓舞的成绩，但其临床应用仍面临如下三个技术瓶颈。首先，CAR-M的获得和CAR-T细胞的制备相似，也需要复杂的体外制备过程。目前CAR-M的制备需要用腺病毒载体将CAR基因转导入巨噬细胞，接着是体外培养扩增、质量控制、包装运输，最后把CAR-M细胞回输到病人体内。这一系列的操作过程带来了高昂的成本和高技术壁垒。第二，巨噬细胞在体内、外都几乎是不增殖的。一个病人一次能获得的巨噬细胞数量很有限，这会严重限制其治疗效果，若想达到治疗效果需多次制备CAR-M细胞并反复输注，进一步增加了治疗成本。第三，由于腺病毒载体抗原性极强，作为异己抗原容易引发机体的特异性免疫反应，促使B细胞产生针对腺病毒载体的各种中和抗体，这使得腺病毒载体转导的细胞反复输注成为了困难。
发明内容
为解决针对CAR-M疗法中体外制备存在的生产工艺复杂、周期长、质量控制要求严苛、成本高等一系列问题，本发明提出通过构建一种脂质纳米颗粒(LNP)包载CAR基因质粒，进入荷瘤动物体内后被巨噬细胞摄取，进行巨噬细胞的体内直接编程，使其表面表达CAR靶向杀伤肿瘤细胞，达到治疗实体瘤的目的。
本发明通过制备一种用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒使得CAR-M的最终合成在体内完成，从而避免了上述一系列问题。脂质纳米颗粒的组成成分的合理化设计是本发明能够成功的关键。本发明制备的包载靶蛋白(如Trop)-CAR基因质粒的LNP，需要完成被巨噬细胞摄取、在巨噬细胞内从溶酶体中逃逸、质粒DNA有效进入细胞核、质粒DNA稳定转染巨噬细胞等一系列过程，才能实现巨噬细胞表面CAR分子的表达。本发明制备过程中克服以下技术难点：1.为实现脂质纳米粒从内涵体逃逸，本发明需筛选各脂质DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS的配比；2.为了将脂质纳米粒靶向运送到细胞核，本发明添加核定位肽；3.为了使LNP的整体电荷维持在中性，本发明增加DOTAP脂质。
本发明提供了一种用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒，包含脂质膜和由所述脂质膜包裹的带有CAR的质粒；所述脂质膜包含DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS等。
在一些实施方案中，本发明所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS的摩尔比为(20-50)：(5-15)：(20-45)：(1-2)：(10-20)：2。
在另一个实施方案中，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS的摩尔比为(30-50)：10：(30-38)：(1-2)：(15-20)：2。
在另一个实施方案中，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS的摩尔比为(30-35)：(10-15)：(20-38)：(1.5-2)：(10-15)：2。
在一些实施方案中，所述带有CAR的质粒包含CD8 leader、抗靶蛋白的抗体相关区域、CD8 Hinge&TM、共刺激分子、CD3ζ；其中，所述抗靶蛋白的抗体相关区域选自全抗体、抗体的F(ab)2段、scFv等中的一种或多种；所述共刺激分子选自CD28、4-1BB、OX40等中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述带有CAR的质粒的CAR的靶蛋白选自Trop2、Her2、GPC3、Claudin 18.2、MSLN、EGFR等中的一种或者多种。
在一些实施方案中，所述靶蛋白为Trop2；所述带有CAR的质粒的核酸序列如SEQID NO.1所示。进一步地，抗靶蛋白的抗体相关区域为Trop2 scfv。所述Trop2 scfv的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒还包含乙酸钠溶液；所述带有CAR的质粒为溶质溶于所述乙酸钠溶液。
本发明还提供了一种如上所述的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建所述带有CAR的质粒；
S2、合成DSPE-MTAS-NLS；
S3、制备脂质体悬液：称取DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP、DSPE-MTAS-NLS作为溶质溶于第一溶剂作为油相溶液，用蒸发仪除去第一溶剂，得到脂质膜；以第二溶剂作为水相溶剂，溶解所述步骤S1得到的带有CAR的质粒作为水相溶液，使得所述带有CAR的质粒与所述油相溶液的溶质的质量比为1:(10-20)；在所述脂质膜中加入所述水相溶液进行水化得到脂质体，使用微型挤出器将所述脂质体依次挤压通过核孔膜，得到脂质体悬液；
S4、将所述步骤S3得到的脂质体悬液装入超滤离心管中，加入PBS溶液，离心，将所述脂质体悬液的外液替换为PBS，收集悬液得到脂质体悬液。
在一些实施方案中，所述S2的具体步骤为：用固相合成技术合成巯基化微管相关-核定位肽Cys-MTAS-NLS，将核定位肽Cys-MTAS-NLS溶于缓冲液中得到溶液一；取Mal-PEG6-DSPE溶于二甲基甲酰胺得到溶液二；将所述溶液一与所述溶液二加到磁力搅拌器中反应得到反应液；取出所述反应液，将过量的多肽和二甲基甲酰胺通过透析除去，再冷冻干燥得到所述DSPE-MTAS-NLS；所述透析的截止分子量为3.5kDa-8kDa。
在一些实施方案中，所述S3中，所述第一溶剂为三氯甲烷、乙醇、甲醇等中的一种或几种；优选地，为三氯甲烷。
在一些实施方案中，所述S3中，所述第二溶剂为乙酸钠溶液、柠檬酸溶液等中的一种或几种；优选地，为乙酸钠溶液。
在一些实施方案中，所述S3中，所述带有CAR的质粒与所述油相溶液的溶质的质量比为1:10。
在一些实施方案中，所述S4中，离心的条件为6000rpm/min。
本发明还提供了如上所述的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
在一个实施方案中，所述肿瘤选自乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、食管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征等血液肿瘤和实体瘤等。
如本发明中所用，术语“抗体”通常是指包含一个或多个基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。免疫球蛋白基因可以包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。如本发明所用，轻链可被分类为κ或λ。重链可被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。本发明中使用的抗体可具有包含四聚体的结构单元。每个四聚体可由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每个成员的N末端可以界定约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。如本发明中所用，术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通常分别指轻链和重链的这些区域。抗体可作为完整免疫球蛋白存在或作为通过用各种肽酶消化或从头表达产生的许多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶可以消化铰链区中二硫键以下的抗体以产生F(ab)2段(Fab的二聚体，所述Fab本身是通过二硫键连接至VH-CH1的轻链)。F(ab)2段可在温和条件下被还原以断裂铰链区中的二硫键，从而将(Fab)2段二聚体转化为Fab单体。Fab单体基本上是具有铰链区的部分的Fab(关于其它抗体片段的更详细描述，参见Fundamental Immunology，W.E.Paul编辑，Raven Press,N.Y.(1993))。虽然根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是本领域普通技术人员将理解，可以化学地或通过利用重组DNA方法从头合成这样的Fab片段。因此，如本发明中所用，术语抗体还可包括通过修饰整个抗体或使用重组DNA方法从头合成产生的抗体片段，包括但不限于F(ab)2段、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dAb、纳米抗体、单抗体和双链抗体。在一些实施方案中，抗体包括但不限于F(ab)2段、IgG、IgM、IgA、IgE和单链抗体，例如单链Fv(scFv)抗体，其中重链可变区和轻链可变区(直接地或通过肽接头)连接在一起以形成连续的多肽。
如本发明所用，术语“Fc区”(fragment crystallizable，Fc)由IgG恒定区CH2和CH3结构域及铰链区组成。
如本发明所用，术语“抗原结合片段”或“fab段”或“fab”由轻链的可变区(VL)、轻链的恒定区(CL)、重链的可变区(VH)、重链的恒定区1(CH1)结构域组成，可与抗原结合。
术语“抗原特异性”是指被抗原结合分子选择性地识别的特定抗原或其表位。
如本发明所用，术语“取代”在用于氨基酸残基时是指在肽、多肽或蛋白中将天然存在的或引入的一个或多个氨基酸用另一个取代，形成新的肽、多肽或蛋白(如本发明术语“突变体”或“突变型”)。多肽或蛋白中的取代可导致多肽或蛋白功能的减弱或不变。取代还可以是“保守取代”，其针对氨基酸序列时是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的不同氨基酸残基取代，或者对那些对多肽的活性并非至关重要的氨基酸的取代。例如，可以在非极性侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile、Pro、Phe、Trp)、不带电的极性侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn、Gly和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)、β分支侧链氨基酸间(例如Thr、Val和Ile)、含硫侧链氨基酸间(例如Cys和Met)或芳香侧链残基间(例如Trp、Tyr、His和Phe)进行保守取代。在某些实施方式中，取代、删除或添加也可以认为是“保守取代”。插入或删除的氨基酸的数量的范围可以为约1至5。保守取代通常不引起蛋白构象结构上的显著变化，并且因此能保持蛋白的生物学活性。
如本发明所使用的术语“宿主细胞”通常包括可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包含本发明公开的多核苷酸，或表达本发明的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)。宿主细胞可以包括单个宿主细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组总DNA互补体上)。宿主细胞可包括用本发明公开的载体在体外转染的细胞。宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、酵母细胞或其它真核细胞，例如HEK293细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞或骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
如在本发明中所用，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。该术语可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞的载体，主要用于DNA或RNA的复制的载体，以及用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。还包括提供不止一种上述功能的载体。“表达载体”是当被引入合适的宿主细胞时可被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常意味着合适的宿主细胞，其包含能够产生期望的表达产量的表达载体。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现预期应用(包括但不限于疾病治疗)的组合物(例如，本发明所述的双特异性重组蛋白)的量。治疗有效量可根据预期的应用(例如，体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况，例如受试者的体重和年龄、疾病状况的严重性、施用方式等而变化，其可以容易地由本领域普通技术人员来确定。该术语还可应用于在靶细胞中诱导特定应答(例如，靶基因诱导、增殖和/或凋亡)的剂量。具体剂量将根据所选择的具体化合物、所遵循的给药方案、其是否与其它化合物组合施用、施用的时间安排、其所施用至的组织以及其所处的物理递送系统而变化。
术语“治疗”或“医治”或“缓解”或“改善”在本发明中可互换使用，并且是指获得有益或所需的结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。如本发明中所用，治疗益处通常是指根除或减轻所治疗的潜在病症的严重性。此外，通过根除、减轻严重性或减少与潜在病症相关的一种或多种生理症状的发生率，以使得在受试者中观察到改善(尽管受试者仍然可能受到潜在病症折磨)来实现治疗益处。对于预防益处，可向处于发展特定疾病的风险中的受试者，或报告疾病的一种或多种生理症状的受试者施用组合物，即使可能尚未进行该疾病的诊断。
如本发明中所用，术语“治疗作用”通常包括如上所述的治疗益处和/或预防益处。预防作用包括延迟或消除疾病或病况的出现，延迟或消除疾病或病况的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病况的进展，或其任何组合。
如本发明中所用，术语“共施用”、“与……组合施用”及其语法上等同物通常包括指向动物施用两种或更多种试剂，以使得试剂和/或其代谢物同时存在于受试者中。共施用包括在单独的组合物中同时施用，在单独的组合物中在不同时间施用，或在其中两种试剂均存在的组合物中施用。
如本发明中所用，术语“细胞增殖”通常是指细胞数目由于分裂而改变的现象。例如，细胞增殖可导致细胞数目的增加。该术语还包括细胞形态通过其已发生改变(例如，尺寸增加)的细胞生长，其与增殖信号一致。
如本发明中所用，术语“增殖抑制”或“抑制细胞增殖”通常是指癌细胞的生长速率和/或增殖速率的降低。例如，这可包括癌细胞的死亡(例如通过凋亡)。在一些实施方案中，该术语还可指抑制实体瘤的生长和/或增殖和/或诱导肿瘤的尺寸减小或消除。
本发明使用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、缓解、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包含哺乳动物或灵长类。哺乳类受试者包含人、畜养动物、农场动物，以及动物园、体育或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等等。
如本发明中所用，术语“体内”通常是指在受试者体内发生的事件。
如本发明中所用，术语“体外”通常是指发生在受试者体外的事件。例如，体外测定包括在受试者外进行的任何测定。体外测定包括其中使用死细胞或活细胞的基于细胞的测定。体外测定还包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。
如本发明所用，术语“施用”是指将治疗有效量的包含本发明的重组蛋白或融合蛋白的药物组合物递送至受试者。施用可以全身施用也可以局部施用。施用可以通过施用装置进行，例如注射器。施用方式包括但不限于包埋、鼻吸、喷雾、注射等。施用途径包括吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌内施用等。
本发明首先设计并构建CAR基因质粒(如Trop2-CAR基因质粒)；接着制备脂质纳米颗粒(比如LNP/CAR trop2)并进行结构表征；然后进行体外细胞水平的功能验证，以探究其转导成为CAR-M细胞的能力。最后构建小鼠皮下肿瘤模型，评估脂质纳米颗粒(以LNP/CARtrop2为例)的体内效果，主要评价指标有小鼠外周血CAR-M定量、肿瘤生长大小、小鼠生存期等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
(1)本发明提出制备一种包载抗靶蛋白的CAR(以Trop2-CAR为例)组合基因质粒的脂质纳米颗粒的方法，由该方法制备的脂质纳米颗粒在体内直接产生CAR-M细胞，其静脉注射后可在体内直接将巨噬细胞改造成CAR-M细胞，为CAR-M疗法提供了一种新颖、便捷、通用的实施方案。
(2)动物试验的结果显示经过本发明所涉及的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒治疗的肿瘤模型小鼠的主要脏器未发生病变，表明本发明所涉及的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒本身具有良好的生物安全性。为其开展临床研究提供了有利支持。
附图说明
图1是DSPE-PEG6-Mal和DSPE-MTAS-NLS的H1-NMR图谱。
图2是DSPE-PEG6-Mal和DSPE-MTAS-NLS的红外图谱。
图3是本发明实施例3中LNP/CAR trop2的粒径和Zeta电位图。
图4是本发明实施例4中LNP/CAR trop2的粒径和Zeta电位图。
图5是本发明实施例5中LNP/CAR trop2的粒径和Zeta电位。
图6是LNP/CAR trop2纳米粒转导巨噬细胞的效率。
图7是LNP/CAR trop2体外对巨噬细胞的毒性。
图8是LNP/CAR trop2在荷瘤小鼠的体内组织分布图。
图9是静脉注射LNP/CAR trop2在荷瘤小鼠体内产生CAR-M细胞的数目。
图10是静脉注射LNP/CAR trop2后肿瘤大小变化和TUNEL染色切片图。
图11是瘤内注射LNP/CARtrop2在荷瘤小鼠体内产生CAR-M细胞的数目。
图12是瘤内注射LNP/CAR trop2后肿瘤大小变化和TUNEL染色切片图。
图13是静脉注射LNP/CAR trop2的主要脏器的HE染色切片图。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
实施例1Trop2-CAR基因质粒的构建
Trop2特异性scFv(2F11)序列与人Fc Tag融合，并克隆到PUTAM003载体(从Unicar获得)中。采用EcoRV/BspEI双酶切克隆法，将抗Trop2单链抗体序列克隆到哺乳动物细胞表达载体中。重组质粒经测序(青岛科生物技术)鉴定后转染DMEM培养的293T细胞。将Trop2特异性scFv插入含有EF1a启动子的CAR构建体中形成CAR质粒。质粒的序列鉴定如SEQ IDNO.1所示。
实施例2DSPE-MTAS-NLS的合成与表征
将10mg核定位肽Cys-MTAS-NLS(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)溶于0.5ml的1XPBS溶液中(pH7.0)，取15.8mg的Mal-PEG6-DSPE溶于1ml的二甲基甲酰胺(DMF)，两者混合后加到磁力搅拌器中反应，反应完全后取出反应液，将过量的多肽和DMF通过超纯水透析2天(截止分子量3.5kDa)除去。透析3天之后进行冷冻干燥，得到目标化合物DSPE-MTAS-NLS。
采用H1-核磁共振(H1-NMR)对DSPE-PEG-MTAS-NLS进行表征，结果显示(图1)DSPE-PEG6-Mal中的Mal在6.7ppm有峰(见图1箭头处)，与核定位肽MTAS-NLS结合之后，6.7ppm处的峰消失，显示合成成功。
采用红外光谱分析(图2)，结果DSPE-PEG6-Mal红外图谱上显示出较弱的N-H(3200-3600cm-1)和C＝O(1666.8cm-1)伸缩振动峰，而在DSPE-MTAS-NLS图谱上，这两个峰的信号强度均有显著增强，而在核定位肽MTAS-NLS的结构中含有大量N-H和C＝O结构，表明核定位肽已与DSPE-PEG6-Mal发生成功连接。
实施例3制备LNP/CAR trop2
用分析天平精密称取DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP、本发明实施例2制备的DSPE-MTAS-NLS(摩尔比为25：10：35：1：20：2)以上材料溶于2ml的三氯甲烷作为脂类油相溶液，用旋转蒸发仪逐渐除去三氯甲烷，得到均匀的膜。配制pH4，浓度为25mM的乙酸钠溶液作为水相溶剂，溶解标记CAR质粒作为水相溶液，质粒与磷脂材料的质量比为1：10。在除去三氯甲烷的脂质薄膜中加入配好的水相溶液进行水化1小时，使用微型挤出器将脂质体依次挤压通过400、200的核孔膜，得到LNP/CAR trop2的悬液。将LNP/CAR trop2的悬液装入超滤离心管中(Mw＝10000)，加入4倍量体积的PBS溶液，并离心1h，将LNP/CAR trop2外液替换为PBS。对本实施例制备得到的LNP/CAR trop2进行表征，结果(见图3)：LNP/CAR trop2的粒径为212nm，PDI为0.227，Zeta电位为-0.073mV。
实施例4制备LNP/CAR trop2
用分析天平精密称取DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP、本发明实施例2制备的DSPE-MTAS-NLS(摩尔比为35：15：20：1.5：10：3)以上材料溶于2ml的三氯甲烷作为脂类油相溶液，用旋转蒸发仪逐渐除去三氯甲烷，得到均匀的膜。配制pH4，浓度为25mM的乙酸钠溶液作为水相溶剂，溶解CAR质粒作为水相溶液，质粒与磷脂材料的质量比为1：10。在除去三氯甲烷的脂质薄膜中加入配好的水相溶液进行水化1小时，使用微型挤出器将脂质体依次挤压通过400、200的核孔膜，得到LNP/CAR trop2的悬液。将LNP/CAR trop2的悬液装入超滤离心管中(Mw＝10000)，加入4倍量体积的PBS溶液，并离心1h，将NP/IL-6外液替换为PBS。
对本实施例制备得到的LNP/CAR trop2进行表征，结果(见图4)：LNP/CAR trop2的粒径为275nm，PDI为0.206，Zeta电位为-0.711mV。
实施例5制备LNP/CAR trop2
用分析天平精密称取DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP、本发明实施例2制备的DSPE-MTAS-NLS(摩尔比为30：10：40：2：15：2)以上材料溶于2ml的三氯甲烷作为脂类油相溶液，用旋转蒸发仪逐渐除去三氯甲烷，得到均匀的膜。配制pH4，浓度为25mM的乙酸钠溶液作为水相溶剂，溶解CAR质粒作为水相溶液，质粒与磷脂材料的质量比为1：10。在除去三氯甲烷的脂质薄膜中加入配好的水相溶液进行水化1小时，使用微型挤出器将脂质体依次挤压通过400、200的核孔膜，得到LNP/CAR trop2的悬液。将LNP/CAR trop2的悬液装入超滤离心管中(Mw＝10000)，加入4倍量体积的PBS溶液，并离心1h，将NP/IL-6外液替换为PBS。
对本实施例制备得到的LNP/CAR trop2进行表征，结果(见图5)：LNP/CAR trop2的粒径为295nm，多分散系数(PDI)为0.183，Zeta电位为-2.32mV。
试验例1LNP/CAR trop2体外转染巨噬细胞效果评价
将带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的CAR质粒用本发明实施例3制备的LNP/CARtrop2包裹后与诱导的巨噬细胞THP-1共同孵育48小时，用流式细胞仪观察其表达GFP的细胞数量，证明体外转导效率。从图6可以看出LNP/CAR trop2在巨噬细胞上表达CAR的效率为13.89％。
试验例2LNP/CAR trop2体外对巨噬细胞的毒性
LNP/CAR trop2转染后的巨噬细胞使用(CCK-8)测定法测定细胞活性。将经过诱导的巨噬细胞THP-1在96孔培养板上培养24小时，然后将本发明实施例3制备的LNP/CARtrop2加入培养孔中孵育48小时，将CCK-8溶液加入每个孔后，将溶液温育2小时。使用酶标仪测定吸光度值。从图7可以看出，LNP/CAR trop2对巨噬细胞无细胞毒性。
试验例3LNP/CAR trop2的体内组织分布评价
将CB17-SCID小鼠皮下接种H1975肿瘤细胞，7天之后小鼠腋下长出肿瘤。利用近红外染料DiR标记本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2，然后通过尾静脉注射，利用活体成像仪检测LNP/CAR trop2的体内组织分布(图8)。其结果表明LNP/CAR trop2能够有效分布于体内的肿瘤中，在4小时荧光强度达到最大。
试验例4静脉注射LNP/CAR trop2在荷瘤小鼠体内产生CAR-M细胞的数目
将CB17-SCID小鼠通过皮下接种H1975肿瘤细胞，在第7天分别尾静脉注射本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2、PBS，每组5只。分别于第7天、第11天取小鼠外周血0.1mL，采集的外周血使用单核细胞分离液进行分离，通过流式细胞仪检测CAR-M细胞数目(图9a)，并计算外周血中CAR-M细胞的总数量。在给药后的第3天使用抗F4/80抗体(Abcam)对肿瘤组织进行免疫染色，以检测巨噬细胞和CAR的共定位，评价巨噬细胞被转导的效果(图9b)。结果：LNP/CAR trop2实现了在荷瘤小鼠体内稳定转染巨噬细胞并改造成为CAR-M细胞。
将CB17-SCID小鼠通过皮下接种BXPC3肿瘤细胞，在第28天分别尾静脉注射本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2、PBS，每组5只。分别于第7天、第11天取小鼠外周血0.1mL，采集的外周血使用单核细胞分离液进行分离，通过流式细胞仪检测CAR-M细胞数目(图9c)，并计算外周血中CAR-M细胞的总数量。在给药后的第3天使用抗F4/80抗体(Abcam)对肿瘤组织进行免疫染色，以检测巨噬细胞和CAR的共定位，评价巨噬细胞被转导的效果(图9d)。结果：LNP/CAR trop2实现了在荷瘤小鼠体内稳定转染巨噬细胞并改造成为CAR-M细胞。
试验例5静脉注射LNP/CAR trop2产生CAR-M的体内肿瘤杀伤效果
将CB17-SCID小鼠通过皮下接种H1975肿瘤细胞，在第7、11、15和19天分别尾静脉注射本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2、PBS，每组5只，给药剂量为4μg/g(以CAR质粒的质量计算)。每周监测肿瘤大小和小鼠体重2次。使用电子测径器测量肿瘤大小，并根据公式“肿瘤体积＝长度×宽度2/2”进行计算。对肿瘤组织切片进行TUNEL染色，使用ImageJ软件对图像进行量化。结果如图10a，与PBS组相比，LNP/CAR trop2治疗组表现出优异的抗肿瘤疗效。LNP/CAR trop2治疗组肿瘤细胞凋亡比PBS组更多。(图10b)
将CB17-SCID小鼠通过皮下接种BXPC3肿瘤细胞，在第28、32、36和40天分别尾静脉注射本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2、PBS，每组5只，给药剂量为4μg/g(以CAR质粒的质量计算)。每周监测肿瘤大小和小鼠体重2次。使用电子测径器测量肿瘤大小，并根据公式“肿瘤体积＝长度×宽度2/2”进行计算。对肿瘤组织切片进行TUNEL染色，使用ImageJ软件对图像进行量化。结果如图10c，与PBS组相比，LNP/CAR trop2治疗组表现出优异的抗肿瘤疗效。LNP/CAR trop2治疗组肿瘤细胞凋亡比PBS组更多。(图10d)
试验例6瘤内注射LNP/CAR trop2在荷瘤小鼠体内产生CAR-M细胞的数目
将CB17-SCID小鼠通过皮下接种H1975肿瘤细胞，在第7天分别瘤内注射本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2、PBS，每组5只。分别于第3天取小鼠外周血0.1mL，采集的外周血使用单核细胞分离液进行分离，通过流式细胞仪检测CAR-M细胞数目(图11a)，在给药后的第3天使用抗F4/80抗体(Abcam)对肿瘤组织进行免疫染色，以检测巨噬细胞和CAR的共定位，评价巨噬细胞被转导的效果(图11b)。并计算外周血中CAR-M细胞的总数量。结果：LNP/CAR trop2实现了在荷瘤小鼠体内稳定转染巨噬细胞并改造成为CAR-M细胞。
将CB17-SCID小鼠通过皮下接种BXPC3肿瘤细胞,在第28天分别瘤内注射本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2、PBS，每组5只。分别于第2天取小鼠外周血0.1mL，采集的外周血使用单核细胞分离液进行分离，通过流式细胞仪检测CAR-M细胞数目(图11c)，并计算外周血中CAR-M细胞的总数量。在给药后的第3天使用抗F4/80抗体(Abcam)对肿瘤组织进行免疫染色，以检测巨噬细胞和CAR的共定位，评价巨噬细胞被转导的效果(图11d)。结果：LNP/CAR trop2实现了在荷瘤小鼠体内稳定转染巨噬细胞并改造成为CAR-M细胞。
试验例7瘤内注射LNP/CAR trop2产生CAR-M的体内肿瘤杀伤效果
将CB17-SCID小鼠通过皮下接种H1975肿瘤细胞，在第7、11、15和19天分别瘤内注射本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2、PBS，每组5只，给药剂量为4μg/g(以CAR质粒的质量计算)。每周监测肿瘤大小和小鼠体重2次。使用电子测径器测量肿瘤大小，并根据公式“肿瘤体积＝长度×宽度2/2”进行计算。对肿瘤组织切片进行TUNEL染色，使用ImageJ软件对图像进行量化。结果如图12a，与PBS组相比，LNP/CAR trop2治疗组表现出优异的抗肿瘤疗效。LNP/CAR trop2治疗组肿瘤细胞凋亡比PBS组更多。(图12b)
将CB17-SCID小鼠通过皮下接种BXPC3肿瘤细胞，在第28、32、36和40天分别瘤内注射本发明实施例4制备的LNP/CAR trop2、PBS，每组5只，给药剂量为4μg/g(以CAR质粒的质量计算)。每周监测肿瘤大小和小鼠体重2次。使用电子测径器测量肿瘤大小，并根据公式“肿瘤体积＝长度×宽度2/2”进行计算。对肿瘤组织切片进行TUNEL染色，使用ImageJ软件对图像进行量化。结果如图12c，与PBS组相比，LNP/CAR trop2治疗组表现出优异的抗肿瘤疗效。LNP/CAR trop2治疗组肿瘤细胞凋亡比PBS组更多。(图12d)
试验例8LNP/CAR trop2在体内产生CAR-M的安全性
在给药治疗的30天后，对治疗的小鼠进行解剖，并取小鼠的主要器官心、肝、脾、肺和肾进行HE染色，观察其是否有病变。结果如图13所示，本发明实施例4制备的LNP/CARtrop2未导致主要脏器发生病变，证明了本发明所涉及的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒具有良好的生物安全性。
英文缩写：
DlinMC3:4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯
DSPE-PEG:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇
PEG-DMG:二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000
DOTAP：(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐；(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵
DOTMA：1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)
DODMA：1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷
DSPE-MTAS-NLS：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-微管相关-核定位肽
DOPE：二油酰磷脂酰乙醇胺
Chol：胆固醇
本发明提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元件对于实施本发明是必要的。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本发明所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8498
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240
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gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360
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atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
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gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
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atctgaggtg cagctggtgc agtctggggg aggcttggtc cagcccgggg ggtccctgag 3600
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ggctccaggg aaggggctgg agtgggtctc atccattagt agtagtagta gttacatata 3720
ctacgcagac tcagtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgcca agaactcact 3780
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cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc 3960
cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga 4020
cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct 4080
gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa 4140
acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt 4200
tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc 4260
ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga 4320
ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag 4380
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ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc 4560
ccctcgctaa gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 4620
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tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc 4800
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cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 4920
gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc 4980
ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 5040
cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 5100
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cccgcctggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 5220
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ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 5340
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gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 5640
tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc 5700
gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 5760
tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 5820
aggaggcttt tttggataga cttttgcaga gacggcccaa attcgtaatc atgtcatagc 5880
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 5940
taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 6000
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 6060
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 6120
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 6180
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 6240
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 6300
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 6360
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 6420
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 6480
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 6540
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 6600
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 6660
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 6720
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 6780
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 6840
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 6900
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 6960
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 7020
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 7080
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 7140
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 7200
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 7260
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 7320
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 7380
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 7440
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 7500
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 7560
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 7620
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 7680
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 7740
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 7800
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 7860
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 7920
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 7980
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 8040
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc 8100
gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 8160
gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 8220
ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 8280
tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc 8340
cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 8400
agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 8460
agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctg 8498
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacgtgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccacca 180
aggttcagcg gcagtggatc tggggcagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt atccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggaggtcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360
ggatctgagg tgcagctggt gcagtctggg ggaggcttgg tccagcccgg ggggtccctg 420
agactctcct gtgaagactc tggattcacc ttcagtagct attggatgag ctgggtccgc 480
caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcatccatta gtagtagtag tagttacata 540
tactacgcag actcagtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaactca 600
ctgtatctac agatgaacag cctgagaggc gaggacacgg ctgtttatta ctgtgcgagg 660
gaacagtcta gcagtggctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 720
<210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Cys Gly Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Glu Thr Tyr Lys
1 5 10 15
Glu Gln Pro Leu Lys Thr Pro Gly Lys Lys Lys Lys Gly Lys Pro Gly
20 25 30
Lys Arg Lys Glu Gln Glu Lys Lys Lys Arg Arg Thr Arg
35 40 45

Claims (11)

1.一种用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒，其特征在于，包含脂质膜和由所述脂质膜包裹的带有CAR的质粒；所述脂质膜包含DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS。
2.如权利要求1所述的用于体内产生CAR-T的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS的摩尔比为(20-50)：(5-15)：(20-45)：(1-2)：(10-20)：2。
3.如权利要求1所述的用于体内产生CAR-T的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS的摩尔比为(30-50)：10：(30-38)：(1-2)：(15-20)：2。
4.如权利要求1所述的用于体内产生CAR-T的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP和DSPE-MTAS-NLS的摩尔比为(30-35)：(10-15)：(20-38)：(1.5-2)：(10-15)：2。
5.如权利要求1所述的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述带有CAR的质粒包含CD8 leader、抗靶蛋白的抗体相关区域、CD8 Hinge&TM、共刺激分子、CD3ζ；其中，所述抗靶蛋白的抗体相关区域选自全抗体、抗体的F(ab)2段、scFv中的一种或多种；所述共刺激分子选自CD28、4-1BB、OX40中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述带有CAR的质粒的CAR的靶蛋白选自Trop2、Her2、GPC3、Claudin 18.2、MSLN、EGFR中的一种或者多种。
7.如权利要求6所述的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述靶蛋白为Trop2；所述带有CAR的质粒的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.如权利要求1所述的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒，其特征在于，还包含乙酸钠溶液；所述带有CAR的质粒为溶质溶于所述乙酸钠溶液中形成。
9.一种如权利要求1所述的用于体内产生CAR-T的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建如权利要求1中所述的带有CAR的质粒；
S2、合成DSPE-MTAS-NLS；
S3、制备脂质体悬液：称取DlinMC3、DOPE、Chol、PEG-DMG、DOTAP、所述S2合成的DSPE-MTAS-NLS作为溶质溶于第一溶剂作为油相溶液，用蒸发仪除去第一溶剂，得到脂质膜；以第二溶剂作为水相溶剂，溶解所述步骤S1得到的带有CAR的质粒作为水相溶液，使得所述带有CAR的质粒与所述油相溶液的溶质的质量比为1:(10-20)；在所述脂质膜中加入所述水相溶液进行水化得到脂质体，使用微型挤出器将所述脂质体依次挤压通过核孔膜，得到脂质体悬液；
S4、将所述步骤S3得到的脂质体悬液装入超滤离心管中，加入PBS溶液，离心，将所述脂质体悬液的外液替换为PBS，收集悬液得到脂质体悬液。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：将核定位肽Cys-MTAS-NLS溶于缓冲液中得到溶液一；取Mal-PEG6-DSPE溶于二甲基甲酰胺得到溶液二；将所述溶液一与所述溶液二加到磁力搅拌器中反应得到反应液；取出所述反应液，将过量的多肽和二甲基甲酰胺通过透析除去，再冷冻干燥得到所述DSPE-MTAS-NLS；所述透析的截止分子量为3.5kDa-8kDa；
和/或，所述S3中，所述第一溶剂为三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或几种；
和/或，所述S3中，所述第二溶剂为乙酸钠溶液、柠檬酸溶液中的一种或两种。
11.如权利要求1-8之任一项所述的用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
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