CN111542338A - 含核酸脂质纳米粒子及其用途 - Google Patents

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桑江忍
松本悟
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种脂质纳米粒子，其含有以下组分(a)至(c)：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体(TCR)的核酸；(b)阳离子脂质；和(c)非阳离子脂质。本发明还提供了一种表达CAR或表达外源性TCR的免疫细胞，其通过将所述脂质纳米粒子引入体内或离体T细胞而产生；以及一种使用所述免疫细胞治疗包括癌症的疾病的体内或离体治疗手段。

Description

含核酸脂质纳米粒子及其用途
技术领域
本发明涉及含有编码嵌合抗原受体或T细胞受体的核酸的脂质纳米粒子；通过使用所述脂质纳米粒子在感兴趣的免疫细胞中表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的方法；其药物用途；等。
背景技术
使用引入了源自癌症抗原特异性杀伤T细胞的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的基因的CAR-T细胞或TCR-T细胞进行癌症免疫疗法的研究和发展进展迅速。当前的CAR-T细胞疗法，诸如在美国获得批准的Kymriah(商品名)和Yescarta(商品名)，通常包括通过使用病毒载体诸如慢病毒载体转染从具有CAR基因的患者收集的离体T细胞来制备CAR-T细胞，并向患者施用CAR-T细胞。然而，该方法的问题在于，由于细胞培养和病毒载体制备的成本，生产成本变高。如果可以将CAR或外源性TCR选择性地引入体内免疫细胞例如T细胞，那么无需离体制备，并且可以提供生产成本低的CAR-或TCR-免疫细胞疗法。另外，如果可以在不使用需要高生产成本的病毒载体的情况下将CAR或外源性TCR选择性地离体引入免疫细胞例如T细胞，那么消除了病毒残留检测等的成本，并且可以提供生产成本低的CAR-或TCR-免疫细胞疗法。
已经报道了CAR向T细胞的离体或体内转染，其使用含有编码CAR的质粒DNA和阳离子聚合物的聚集体的纳米粒子，所述聚集体被与抗CD3抗体片段缀合的非阳离子聚合物包被(专利文献1，非专利文献1)；或者使用含有介孔二氧化硅的纳米载体，所述介孔二氧化硅在孔中包封了编码CAR的DNA并包被有具有被抗CD3抗体修饰的表面的脂质(专利文献2)。
除此之外，已经报道了通过将靶siRNA包封在“脂质纳米粒子(LNP)”中将siRNA递送至靶细胞的技术，所述“脂质纳米粒子(LNP)”没有内部孔结构并且由阳离子脂质、非阳离子辅助脂质以及用于递送至靶细胞的配体组成。例如，已经报道了通过使用抗CD4抗体片段作为靶向配体将用于CD45的siRNA离体或体内转染到T细胞中(专利文献3，非专利文献2)。
然而，迄今为止，没有报道通过使用LNP将编码CAR或外源性TCR的核酸(例如，mRNA，DNA)选择性地引入免疫细胞例如T细胞中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：US 2017/0296676
专利文献2：US 2016/0145348
专利文献3：WO 2016/189532
非专利文献
非专利文献1：Nature Nanotechnology 12，813-820(2017)
非专利文献2：ACS Nano，2015，9(7)，6706-6716
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种新颖的转染技术，其能够有效地将CAR或外源性TCR选择性地引入体内或离体的免疫细胞诸如T细胞，从而以低生产成本提供CAR-或TCR-免疫细胞疗法。本发明的另一个目的是提供一种避免病毒蛋白抗原性问题的更安全的CAR-或TCR-免疫细胞疗法。
问题的解决方案
为了实现上述目的，本发明人进行了深入研究，并成功地通过使用LNP有效地将编码CAR或外源性TCR的核酸选择性地引入体内或离体的免疫细胞诸如T细胞中，从而完成了本发明。
因此，本发明提供以下内容。
[1]一种脂质纳米粒子，其包含以下(a)至(c)：
(a)编码嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的核酸；
(b)阳离子脂质；和
(c)非阳离子脂质。
[2][1]的脂质纳米粒子，其中前述阳离子脂质为式(I)表示的化合物或其盐：
Figure BDA0002557729670000031
其中
L1为C1-22亚烷基、C2-22亚烯基或C3-22亚二烯基，
n为0或1的整数，
R1为
(1)氢原子，
(2)直链C1-22烷基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
(3)直链C2-22烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，或
(4)直链C3-22二烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
R2为-CH2-O-CO-R5、-CH2-CO-O-R5或-R5，
R3为-CH2-O-CO-R6、-CH2-CO-O-R6或-R6，
R4为氢原子、-CH2-O-CO-R7、-CH2-CO-O-R7或-R7，
R5、R6和R7各自独立地为
(1)直链C1-22烷基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
(2)直链C2-22烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，或
(3)直链C3-22二烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
R8和R9各自独立地为C1-6烷基。
[3][1]或[2]的脂质纳米粒子，其中前述核酸为mRNA或DNA。
[4][1]至[3]中任一项的脂质纳米粒子，其中前述非阳离子脂质为磷脂、胆固醇和/或PEG脂质。
[5][1]至[4]中任一项的脂质纳米粒子，其中前述脂质纳米粒子在表面上具有可以靶向T细胞的配体。
[6][5]的脂质纳米粒子，其中前述配体是包含选自以下的一种或多种抗体的抗原结合结构域的配体：抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体和抗CD28的抗体。
[7][5]的脂质纳米粒子，其中前述配体是包含抗CD3的抗体和/或抗CD28的抗体的抗原结合结构域的配体。
[8][5]的脂质纳米粒子，其中前述配体是包含抗CD3的抗体和抗CD28的抗体的抗原结合结构域的配体。
[9]一种药物，其包含[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子。
[10][9]的药物，其中所述药物是用于癌症的预防或治疗药物。
[11][9]的药物，其中所述药物将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体基因引入体内免疫细胞以诱导其表达。
[12][9]的药物，其中所述药物将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体基因引入体内T细胞以诱导其表达。
[13]一种通过将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体引入哺乳动物的体内免疫细胞来表达所述受体的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子。
[14]一种通过将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体引入哺乳动物的体内T细胞来表达所述受体的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子。
[15]一种用于预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子。
[16][1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子，其用于预防或治疗癌症。
[17][1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子在制造用于预防或治疗癌症的药剂中的用途。
[18]一种用于诱导嵌合抗原受体或外源性T细胞受体表达的组合物，其包含[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子。
[19]一种离体免疫细胞，其表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
[20]一种离体T细胞，其表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
[21]一种包含离体免疫细胞的药物，所述离体免疫细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
[22]一种包含离体T细胞的药物，所述离体T细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
[23][21]或[22]的药物，其中所述药物是用于癌症的预防或治疗药物。
[24][21]或[22]的药物，其中所述药物是用于诱导细胞凋亡的药物。
[25]一种通过将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体引入离体免疫细胞来表达所述受体的方法，所述方法包含将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中。
[26]一种用于在离体T细胞中表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的方法，所述方法包含将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中。
[27]一种用于预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用离体免疫细胞，所述离体免疫细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
[28]一种用于预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用离体T细胞，所述离体T细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
[29]一种用于预防或治疗癌症的离体免疫细胞，其中所述离体免疫细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
[30]一种用于预防或治疗癌症的离体T细胞，其中所述离体T细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
[31]离体免疫细胞在制造用于预防或治疗癌症的药剂中的用途，其中所述离体免疫细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
[32]离体T细胞在制造用于预防或治疗癌症的药剂中的用途，其中所述离体T细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
[33]一种制备药物的方法，所述药物包含表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的离体免疫细胞，所述方法包含以下步骤：将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中。
[34]一种制备药物的方法，所述药物包含表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的离体T细胞，所述方法包含以下步骤：将[1]至[8]中任一项的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中。
发明的有利效果
根据本发明，CAR或外源性TCR不仅可以离体而且可以在体内有效地选择性地引入免疫细胞诸如T细胞中，并且可以提供生产成本低的CAR-或TCR-免疫细胞疗法。另外，由于不使用病毒载体，因此可以避免病毒蛋白的抗原性问题。
附图说明
图1显示了在用hCD3/hCD28-化合物12-pcDNA3.1-hCD19CAR转染的培养的人原代T细胞中CD19 CAR表达的流式细胞术分析结果。
图2显示了在用hCD3/hCD28-化合物21-pcDNA3.1-hCD19CAR和hCD3/hCD28-化合物35-pcDNA3.1-hCD19CAR转染的培养的人原代T细胞中CD19 CAR表达的流式细胞术分析结果。
图3显示了通过添加用CD19 CAR转染的培养的人原代T细胞，Nalm-6和Daudi的细胞毒性率。
具体实施方式
1.本发明的脂质纳米粒子(LNP)
本发明提供了含有以下(a)至(c)的脂质纳米粒子：
(a)编码嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体(TCR)的核酸；
(b)阳离子脂质；和
(c)非阳离子脂质
(在下文中也称为“本发明的脂质纳米粒子”，“本发明的LNP”)。
在本说明书中，“脂质纳米粒子(LNP)”是指由上述(b)和(c)构成的分子集合体中的平均直径小于1μm且没有小的多孔结构(例如，介孔材料)的粒子。
以下对本发明的脂质纳米粒子的构成要素(a)至(c)进行解释。
(a)编码嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体(TCR)的核酸
(a-1)编码CAR的核酸
CAR是人工构建的杂合蛋白，其含有与T细胞信号转导结构域偶联的抗体的抗原结合结构域(例如，scFv)。CAR的特征在于能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制的方式将T细胞的特异性和响应性重定向至选定的靶标。非MHC限制的抗原识别向表达CAR的T细胞赋予了独立于抗原加工而识别抗原的能力，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性TCR α链和β链二聚化。
用于本发明的脂质纳米粒子的CAR包括可以特异性识别靶免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)应识别的表面抗原(例如，癌症抗原肽、在癌细胞中显示出促进表达的表面受体等)的抗体的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号转导结构域。
被抗原结合结构域特异性识别的表面抗原的实例包括但不限于在各种癌症中显示出促进表达的表面受体，所述癌症例如急性淋巴细胞癌、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌(例如髓母细胞瘤)、乳腺癌、肛门、肛管或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、子宫颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性髓细胞癌、结肠癌、食道癌、子宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病(例如急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病)、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、大网膜癌和肠系膜癌；咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体肿瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌等，所述表面受体例如CD19、EGF受体、BCMA、CD30、Her2、ROR1、MUC16、CD20、间皮素、B细胞突变抗原(BCMA)、CD123、CD3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD33、MUC-1、CD138、CD22、GD2、PD-L1、CEA、硫酸软骨素蛋白聚糖-4、IL-13受体α链、IgG κ轻链和癌症抗原肽(例如源自WT1、GPC3、MART-1、gp100、NY-ESO-1、MAGE-A4等的肽)。
对本发明中使用的抗原结合结构域没有特别限制，只要它是可以特异性识别靶抗原的抗体片段即可。考虑到CAR的制备容易性，期望的是其中轻链可变区和重链可变区通过连接肽连接的单链抗体(scFv)。单链抗体中的轻链可变区和重链可变区的构型没有特别限制，只要它们可以重构功能性抗原结合结构域即可。从N末端侧开始，通常可以按照轻链可变区、连接肽和重链可变区的顺序设计它们。作为连接肽，可以使用通常用于制备单链抗体的已知的连接肽。例如，编码轻链可变区和重链可变区的DNA可以通过分别从产生抗体的细胞中克隆轻链基因和重链基因并使用它们作为模板进行PCR等，或者通过从现有抗体的序列信息化学合成它们来制备。通过以适当的方法将每个获得的DNA片段与编码连接肽的DNA连接，可以获得编码单链抗体的DNA。优选在抗原结合结构域的N-末端侧进一步添加阅读器序列以将CAR呈递至免疫细胞的表面。
作为细胞外铰链结构域和跨膜结构域，可以适当地使用在相关技术领域中通常使用的源自T细胞表面分子的结构域。例如，它们包括但不限于源自于CD8α和CD28的结构域。
细胞内信号转导结构域的实例包括但不限于具有CD3ζ链的那些，在跨膜结构域与CD3ζ链之间进一步具有共刺激基序例如CD28、CD134、CD137、Lck、DAP10、ICOS、4-1BB等的那些，以及具有两个或更多个共刺激基序的那些。在相关技术领域中通常使用的任何结构域都可以组合使用。
编码细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的核酸序列信息在相关技术领域中是众所周知的。基于这种信息，本领域普通技术人员可以容易地从T细胞获得编码每个结构域的DNA片段。
通过用常规方法将分别编码如此获得的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的DNA片段连接，可以获得编码CAR的DNA。
可以将获得的编码CAR的DNA按原样或在添加合适的连接子和/或核易位信号等之后插入到含有T细胞内的功能性启动子的表达载体，优选质粒载体中。T细胞内的功能性启动子的实例包括但不限于哺乳动物细胞中的组成型SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(鲁氏肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等。另外，还可以使用在T细胞中特异性表达的基因启动子，诸如CD3、CD4和CD8。
可以使用含有编码上述CAR的DNA的表达载体作为模板，通过在本身已知的体外转录系统中转录成mRNA来制备编码CAR的RNA，优选mRNA。
(a-2)编码外源性TCR的核酸
在本说明书中，“T细胞受体(TCR)”是指由TCR链(α链，β链)的二聚体组成并识别抗原或抗原-HLA(人类白细胞型抗原)(MHC；主要组织相容性复合物)复合物并向T细胞转导刺激信号的受体。每条TCR链都由可变区和恒定区组成，并且可变区含有三个互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)。用于本发明的TCR不仅包括其中TCR的α和β链构成异二聚体的那些，而且还包括其中它们构成同二聚体的那些。此外，TCR包括缺失了部分或全部恒定区的那些、具有重组的氨基酸序列的那些以及具有可溶性TCR的那些，等等。
“外源性TCR”是指对本发明的脂质纳米粒子的靶细胞即T细胞而言是外源的。外源性TCR的氨基酸序列可以与作为本发明脂质纳米粒子的靶细胞的T细胞表达的内源性TCR的氨基酸序列相同或不同。
在本发明的脂质纳米粒子中使用的编码TCR的核酸是编码TCR的α链和β链的核酸，所述TCR可以特异性地识别将被靶T细胞识别的表面抗原(例如，癌症抗原肽等)。
可以通过本身已知的方法制备核酸。当所需TCR的氨基酸序列或核酸序列已知时，可以基于所述序列，例如通过利用PCR方法或吉布森组装法化学合成DNA链或RNA链或连接合成的部分重叠的寡DNA短链，来构建编码本发明的TCR的全长或一部分的DNA。
当所需TCR的序列未知时，例如，从含有表达感兴趣的TCR的T细胞的细胞群中分离感兴趣的T细胞，并且可以从T细胞获得编码TCR的核酸。具体地，从生物体(例如人)收集含有T细胞的细胞群(例如PBMC)，在刺激细胞群的同时在靶TCR识别的细胞表面抗原的表位的存在下培养细胞群，并且可以通过已知方法并使用对表达细胞表面抗原的细胞和细胞表面抗原例如CD8和CD4的特异性作为指标，从细胞群中选择特异性识别表达细胞表面抗原的细胞的T细胞。对于表达T细胞的细胞表面抗原的细胞的特异性可以例如通过右旋体测定、ELISPOT测定、细胞毒性测定等来测量。前述含有T细胞的细胞群优选地从例如具有大量表达被感兴趣的TCR识别的细胞表面抗原的细胞的生物体中收集(例如，患有疾病例如癌症的患者，或与抗原表位或被表位脉冲化的树突状细胞接触的含T细胞的群体)。
本发明的核酸可通过以下方法获得：通过常规方法从上述分离的T细胞中提取DNA，并以该DNA为模板，基于TCR恒定区的核酸序列扩增和克隆TCR基因。它也可以通过以下方法制备：通过常规方法从细胞中提取RNA并合成cDNA，并使用与分别编码TCR α链和β链的恒定区的核酸互补的反义引物，以cDNA为模板进行5′-RACE(cDNA末端的快速扩增)。5’-RACE可以通过已知的方法进行，例如可以使用可商购的试剂盒例如SMART PCR cDNA合成试剂盒(clontech公司制)进行。可以以与编码上述CAR的DNA相同的方式，将编码获得的TCR的α链和β链的DNA插入适当的表达载体中。可以将编码α链的DNA和编码β链的DNA插入相同的载体或单独的载体中。当插入相同载体中时，表达载体可以多顺反子或单顺反子方式表达两条链。在前一种情况下，将允许多顺反子表达的插入序列例如IRES或FMV2A插入编码两条链的DNA之间。
另外，例如，可以使用表达载体作为模板，以与上述编码CAR的RNA相同的方式制备编码TCR的每条链的RNA，优选mRNA。
(b)阳离子脂质
在本说明书中，“阳离子脂质”是指在选定的pH诸如生理pH下具有净正电荷的脂质。对本发明的脂质纳米粒子中使用的阳离子脂质没有特别限制。例如，可以提及WO 2015/011633、WO 2016/021683、WO 2011/153493、WO 2013/126803、WO 2010/054401、WO 2010/042877、WO 2016/104580、WO 2015/005253、WO 2014/007398、WO 2017/117528、WO 2017/075531、WO 2017/00414、WO 2015/199952、US 2015/0239834等中描述的阳离子脂质等。
优选的阳离子脂质由以下结构式表示并描述于WO 2015/011633中。
Figure BDA0002557729670000131
Figure BDA0002557729670000141
Figure BDA0002557729670000151
Figure BDA0002557729670000161
及其盐。
在上述阳离子脂质中，更优选由以下结构式表示的阳离子脂质。
Figure BDA0002557729670000171
及其盐。
优选的阳离子脂质由以下结构式表示并描述于WO 2016/021683中。由下式表示的化合物：
Figure BDA0002557729670000181
其中
W为式-NR1R2或式-N+R3R4R5(Z-)，
R1和R2各自独立地为C1-4烷基或氢原子，
R3、R4和R5各自独立地为C1-4烷基，
Z-为阴离子，
X为任选取代的C1-6亚烷基，
YA、YB和YC各自独立地为任选取代的次甲基，
LA、LB和LC各自独立地为任选取代的亚甲基或键，并且
RA1、RA2、RB1、RB2、RC1和RC2各自独立地为任选取代的C4-10烷基，
或其盐。
更优选地，可以提及由以下结构式表示的阳离子脂质。
Figure BDA0002557729670000191
Figure BDA0002557729670000201
Figure BDA0002557729670000211
Figure BDA0002557729670000221
及其盐。
在上述阳离子脂质中，更优选的阳离子脂质由以下结构式表示。
Figure BDA0002557729670000222
Figure BDA0002557729670000231
及其盐。
在另一个优选实施方案中，可以提及由下式(II)表示的阳离子脂质(在下文中也称为“化合物(II)”)。由下式表示的化合物：
Figure BDA0002557729670000232
其中
n为2至5的整数，
R为直链C1-5烷基、直链C7-11烯基或直链C11二烯基，并且波浪线各自独立地显示顺式或反式键，
或其盐。
更优选地，可以提及由以下结构式表示的阳离子脂质。
Figure BDA0002557729670000241
Figure BDA0002557729670000251
Figure BDA0002557729670000261
及其盐。
在上述阳离子脂质中，更优选的阳离子脂质由以下结构式表示。
Figure BDA0002557729670000262
Figure BDA0002557729670000271
及其盐。
化合物(II)可以例如通过以下制备方法制备。在化合物(II)中，两个波浪线均为顺式键的化合物和一个或两个波浪线为反式键的化合物都可以通过与以下所示的制备方法类似的方法来制备。特别地，根据所需化合物(II)的结构，可以在酯化过程中使用适当的起始物质合成具有所需结构的化合物(II)。化合物(II)的盐可以通过与无机碱、有机碱、有机酸、碱性或酸性氨基酸适当混合而获得。
Figure BDA0002557729670000281
在上述制备方法的每个步骤中使用的起始物质或试剂以及所获得的化合物可以各自形成盐。
当在每个步骤中获得的化合物是游离化合物时，可以通过本领域本身已知的方法将该化合物转化为感兴趣的盐。相反，当在每个步骤中获得的化合物是盐时，可以通过本领域本身已知的方法将该盐转化为游离形式或另一类感兴趣的盐。
在每个步骤中获得的化合物可以以其反应溶液的形式直接用于下一反应或在以粗产物形式获得后用于下一反应。或者，可以根据常规方法，通过分离方法，诸如浓缩、结晶、重结晶、蒸馏、溶剂萃取、分馏或色谱法，从反应混合物中分离和/或纯化在每个步骤中获得的化合物。
如果用于每个步骤的起始物质或试剂化合物是可商购的，那么可以直接使用可商购的产品。
在每个步骤的反应中，反应时间可以根据所使用的试剂或溶剂而不同，除非另有说明，否则通常为1分钟至48小时，优选10分钟至8小时。
在每个步骤的反应中，反应温度可以根据所使用的试剂或溶剂而不同，除非另有说明，否则通常为-78℃至300℃，优选-78℃至150℃。
在每个步骤的反应中，压力可以根据所使用的试剂或溶剂而不同，除非另有说明，否则通常为1atm至20atm，优选1atm至3atm。
在每个步骤的反应中，例如，可以使用微波合成装置诸如BiotageInitiator。反应温度可以根据所使用的试剂或溶剂而不同，除非另有说明，否则通常为室温至300℃，优选室温至250℃，更优选50℃至250℃。反应时间可以根据所使用的试剂或溶剂而不同，除非另有说明，否则通常为1分钟至48小时，优选1分钟至8小时。
在每个步骤的反应中，除非另有说明，否则试剂相对于底物的使用量为0.5当量至20当量，优选0.8当量至5当量。在使用试剂作为催化剂的情况下，试剂相对于底物的使用量为0.001当量至1当量，优选0.01当量至0.2当量。当试剂还用作反应溶剂时，以溶剂的量使用试剂。
在反应的每个步骤中，除非另有说明，否则反应在没有溶剂的情况下进行或通过溶解或悬浮在适当的溶剂中进行。溶剂的具体实例包括以下。
醇：甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、2-甲氧基乙醇等；
醚：乙醚、二异丙醚、二苯醚、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷等；
芳烃：氯苯、甲苯、二甲苯等；
饱和烃：环己烷、己烷、庚烷等；
酰胺：N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；
卤代烃：二氯甲烷、四氯化碳等；
腈：乙腈等；
亚砜：二甲基亚砜等；
芳族有机碱：吡啶等；
酸酐：乙酸酐等；
有机酸：甲酸、乙酸、三氟乙酸等；
无机酸：盐酸、硫酸等；
酯：乙酸乙酯、乙酸异丙酯等；
酮：丙酮、甲乙酮等；
水。
这些溶剂中的两种或更多种可以以适当的比例混合使用。
在使用碱的每个反应步骤中，可以使用的碱的实例是下面列出的那些。
无机碱：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁等；
碱性盐：碳酸钠、碳酸钙、碳酸氢钠等；
有机碱：三乙胺、二乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二甲基苯胺、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯、咪唑、哌啶等；
金属醇盐：乙醇钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠等；
碱金属氢化物：氢化钠等；
金属酰胺：氨基钠、二异丙基氨基锂、六甲基二硅基叠氮化锂等；
有机锂：正丁基锂、仲丁基锂等。
在使用酸或酸催化剂的每个反应步骤中，使用以下酸或酸催化剂。
无机酸：盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、磷酸等；
有机酸：乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、10-樟脑磺酸等；
路易斯酸：三氟化硼二乙醚络合物、碘化锌、无水氯化铝、无水氯化锌、无水氯化铁等。
除非另有说明，否则每个反应步骤都可以根据本领域本身已知的标准方法进行，诸如实验化学百科全书(Encyclopedia of Experimental Chemistry)，第5版，第13卷至第19卷(日本化学会编)；新实验化学百科全书(New Encyclopedia of ExperimentalChemistry)，第14卷至第15卷(日本化学会编)；精密有机化学(Fine Organic Chemistry)，第2版修订版(L.F.Tietze，Th.Eicher，Nankodo)；有机人名反应(Organic NameReactions)；反应机理与实质(The Reaction Mechanism and Essence)，修订版(HideoTogo，Kodansha)；有机合成合订本I-VII(Organic Syntheses Collective Volume I-VII)(John Wiley&Sons，Inc.)；实验室的现代有机合成：标准实验程序的合集(Modern OrganicSynthesis in the Laboratory：A Collection of Standard Experimental Procedures)(Jie Jack Li，Oxford University Press)；综合杂环化学III(ComprehensiveHeterocyclic Chemistry III)，第1卷至第14卷(Elsevier Japan KK)；人名反应在有机合成中的战略应用(Strategic Applications of Named Reactions in OrganicSynthesis)(Kiyoshi Tomioka 译，Kagaku-Dojin Publishing)；综合有机转化(Comprehensive Organic Transformations)(VCH Publishers，Inc.)，1989等中描述的那些。
在每个步骤中，可以根据本领域本身已知的方法，例如“有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，第4版”(Theodora W.Greene，PeterG.M.Wuts)，Wiley-Interscience，2007；“保护基(Protecting Groups)，第3版”(P.J.Kocienski)Thieme，2004)等中描述的方法，进行官能团的保护或脱保护反应。
醇等中的羟基或酚羟基的保护基的实例包括：醚型保护基，诸如甲氧基甲基醚、苄基醚、对甲氧基苄基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、叔丁基二苯基甲硅烷基醚和四氢吡喃基醚；羧酸酯型保护基，诸如乙酸酯；磺酸酯型保护基，诸如甲磺酸酯；和碳酸酯型保护基，诸如碳酸叔丁酯。
醛中羰基的保护基的实例包括：缩醛型保护基，诸如二甲基缩醛；和环状缩醛型保护基，诸如环状1，3-二
Figure BDA0002557729670000321
烷。
酮中羰基的保护基的实例包括：缩酮型保护基，诸如二甲基缩酮；环状缩酮型保护基，诸如环状1，3-二
Figure BDA0002557729670000322
烷；肟型保护基，诸如O-甲基肟；腙型保护基，诸如N，N-二甲基腙。
羧基的保护基的实例包括：酯型保护基，诸如甲酯；和酰胺型保护基，诸如N，N-二甲基酰胺。
硫醇的保护基的实例包括：醚型保护基，诸如苄基硫醚；和酯型保护基，诸如硫代乙酸酯、硫代碳酸酯和硫代氨基甲酸酯。
氨基或芳族杂环诸如咪唑、吡咯或吲哚的保护基的实例包括：氨基甲酸酯型保护基，诸如氨基甲酸苄酯；和酰胺型保护基，诸如乙酰胺；烷基胺型保护基，诸如N-三苯基甲胺；和磺酰胺型保护基，诸如甲磺酰胺。
可以通过使用本领域本身已知的方法，例如使用酸、碱、紫外线、肼、苯肼、N-甲基二硫代氨基甲酸钠、氟化四丁基铵、乙酸钯或三烷基甲硅烷基卤(例如，三甲基甲硅烷基碘或三甲基甲硅烷基溴)的方法或还原方法，去除保护基。
在利用还原反应的每个步骤中，可以使用的还原剂的实例包括：金属氢化物，诸如氢化铝锂、三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝(DIBAL-H)、硼氢化钠和四甲基三乙酰氧基硼氢化铵；硼烷，诸如硼烷-四氢呋喃络合物；雷尼镍；雷尼钴；氢；和甲酸。例如，可以在氢或甲酸的存在下使用雷尼镍或雷尼钴。在还原碳-碳双键或三键的情况下，可以使用利用催化剂诸如钯-碳或林德拉催化剂的方法。
在利用氧化反应的每个步骤中，可以使用的氧化剂的实例包括：过酸，诸如间氯过苯甲酸(MCPBA)、过氧化氢和叔丁基过氧化氢；过氯酸盐，诸如过氯酸四丁铵；氯酸盐，诸如氯酸钠；亚氯酸盐，诸如亚氯酸钠；过碘酸盐，诸如过碘酸钠；高价碘试剂，诸如亚碘酰苯；锰试剂，诸如二氧化锰和高锰酸钾；铅试剂，诸如四乙酸铅；铬试剂，诸如氯铬酸吡啶鎓(PCC)、重铬酸吡啶鎓(PDC)和琼斯试剂；卤素化合物，诸如N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)；氧；臭氧；三氧化硫-吡啶络合物；四氧化锇；二氧化硒；和2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)。
在利用自由基环化反应的每个步骤中，可以使用的自由基引发剂的实例包括：偶氮化合物，诸如偶氮二异丁腈(AIBN)；水溶性自由基引发剂，诸如4-4′-偶氮双-4-氰基戊酸(ACPA)；在空气或氧气存在下的三乙基硼；和过氧化苯甲酰。所使用的自由基引发剂的实例包括三丁基锡烷、三三甲基甲硅烷基硅烷、1，1，2，2-四苯基二硅烷、二苯基硅烷和碘化钐。
在利用维蒂希反应的每个步骤中，可以使用的维蒂希试剂的实例包括亚烷基膦烷。可以通过本领域本身已知的方法，例如，磷鎓盐与强碱之间的反应来制备亚烷基膦烷。
在利用霍纳-埃蒙斯反应的每个步骤中，可以使用的试剂的实例包括膦酰基乙酸酯，诸如二甲基膦酰基乙酸甲酯和二乙基膦酰基乙酸乙酯，以及碱，诸如碱金属氢化物和有机锂。
在利用弗瑞德-克来福特反应的每个步骤中，可以使用的试剂的实例包括路易斯酸和酰氯或烷基化剂(例如烷基卤化物、醇和烯烃)。或者，可以使用有机或无机酸代替路易斯酸，并且可以使用酸酐诸如乙酸酐代替酰氯。
在利用芳族亲核取代反应的每个步骤中，亲核试剂(例如，胺或咪唑)和碱(例如，碱性盐或有机碱)可以用作试剂。
在使用利用碳负离子的亲核加成反应、利用碳负离子的亲核1，4-加成反应(迈克尔加成反应)或利用碳负离子的亲核取代反应的每个步骤中，可以用于产生碳负离子的碱的实例包括有机锂试剂、金属醇盐、无机碱和有机碱。
在利用格氏反应的每个步骤中，可以使用的格氏试剂的实例包括芳基卤化镁，诸如苯基溴化镁；和烷基卤化镁，诸如甲基溴化镁、异丙基溴化镁。格氏试剂可以通过本领域本身已知的方法，例如烷基卤化物或芳基卤化物与金属镁在作为溶剂的醚或四氢呋喃中的反应，来制备。
在利用Knoevenagel缩合反应的每个步骤中，侧接有两个吸电子基团的活性亚甲基化合物(例如丙二酸、丙二酸二乙酯或丙二腈)和碱(例如有机碱、金属醇盐或无机碱)可以用作试剂。
在利用Vilsmeier-Haack反应的每个步骤中，磷酰氯和酰胺衍生物(例如N，N-二甲基甲酰胺)可以用作试剂。
在利用醇、烷基卤化物或磺酸酯的叠氮化反应的每个步骤中，可以使用的叠氮化剂的实例包括二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、三甲基甲硅烷基叠氮化物和叠氮化钠。在例如醇的叠氮化的情况下，可以使用利用二苯基磷酰叠氮化物和1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一碳-7-烯(DBU)的方法、利用三甲基甲硅烷基叠氮化物和路易斯酸的方法等。
在利用还原性胺化反应的每个步骤中，可以使用的还原剂的实例包括三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氢和甲酸。当底物是胺化合物时，可以使用的羰基化合物的实例包括对甲醛以及诸如乙醛的醛和诸如环己酮的酮。当底物是羰基化合物时，可以使用的胺的实例包括伯胺，诸如氨和甲胺，以及仲胺，诸如二甲胺。
在利用Mitsunobu反应的每个步骤中，偶氮二羧酸酯(例如偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)和偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD))和三苯基膦可以用作试剂。
在利用酯化、酰胺化或脲化反应的每个步骤中，可以使用的试剂的实例包括酰卤，诸如酰氯或酰溴，以及活化的羧酸，诸如酸酐、活性酯或硫酸酯。羧酸活化剂的实例包括：碳二亚胺缩合剂，诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSCD)；三嗪缩合剂，诸如4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物-n-水合物(DMT-MM)；碳酸酯缩合剂，诸如1，1-羰基二咪唑(CDI)；二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)；苯并三唑-1-基氧基-三二甲基氨基磷鎓盐(BOP试剂)；2-氯-1-甲基-碘化吡啶鎓(Mukaiyama试剂)；亚硫酰氯；卤代甲酸低级烷基酯，诸如氯甲酸乙酯；O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)；硫酸；及其组合。在使用碳二亚胺缩合剂的情况下，向反应中添加添加剂诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)或二甲基氨基吡啶(DMAP)可能是有益的。
在利用偶联反应的每个步骤中，可以使用的金属催化剂的实例包括钯化合物，诸如乙酸钯(II)、四(三苯基膦)钯(0)、二氯双(三苯基膦)钯(II)、二氯双(三乙基膦)钯(II)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁氯化钯(II)和乙酸钯(II)；镍化合物，诸如四(三苯基膦)镍(0)；铑化合物，诸如三(三苯基膦)氯化铑(III)；钴化合物；铜化合物，诸如氧化铜和碘化亚铜(I)；和铂化合物。向反应中添加碱也可能是有益的。这种碱的实例包括无机碱和碱性盐。
在利用硫代羰基化反应的每个步骤中，通常将五硫化二磷用作硫代羰基化剂。可以使用具有1，3，2，4-二噻二磷杂丁环-2，4-二硫化物结构的试剂，诸如2，4-双(4-甲氧基苯基-1，3，2，4-二噻二磷杂丁环-2，4-二硫化物)(劳森试剂)代替五硫化二磷。
在利用Wohl-Ziegler反应的每个步骤中，可以使用的卤化剂的实例包括N-碘琥珀酰亚胺、N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-氯琥珀酰亚胺(NCS)、溴和硫酰氯。可以通过进一步加入自由基引发剂，诸如热、光、过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈来加速反应。
在利用羟基的卤化反应的每个步骤中，可以使用的卤化剂的实例包括氢卤酸或无机酸的酰卤；实例包括用于氯化的盐酸、亚硫酰氯和氧氯化磷，以及用于溴化的48％氢溴酸。另外，还可以使用通过三苯基膦和四氯化碳或四溴化碳等的作用从醇获得烷基卤化物的方法。或者，也可以使用通过两步反应合成烷基卤化物的方法，所述两步反应包括将醇转化为磺酸酯，然后与溴化锂、氯化锂或碘化钠反应。
在利用Arbuzov反应的每个步骤中，可以使用的试剂的实例包括烷基卤化物，诸如溴乙酸乙酯；亚磷酸酯，诸如亚磷酸三乙酯和亚磷酸三(异丙基酯)。
在利用砜酯化反应的每个步骤中，所使用的磺酰化剂的实例包括甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯、甲磺酸酐和对甲苯磺酸酐和三氟甲磺酸酐。
在利用水解反应的每个步骤中，可以将酸或碱用作试剂。在进行叔丁基酯的酸水解反应的情况下，可以添加诸如甲酸、三乙基硅烷等的试剂以还原性地捕集副产物叔丁基阳离子。
在利用脱水反应的每个步骤中，可以使用的脱水剂的实例包括硫酸、五氧化二磷、氧氯化磷、N，N′-二环己基碳二亚胺、氧化铝和多磷酸。
在另一个优选实施方案中，可以提及由下式(III)表示的阳离子脂质(在下文中也称为“化合物(III)”)。由下式表示的化合物：
Figure BDA0002557729670000381
其中
n1为2至6的整数，
n2为0至2的整数，
n3为0至2的整数，
L为-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra为直链C5-13烷基、直链C13-17烯基或直链C17二烯基，
Rb为直链C2-9烷基，
Rc为氢原子或直链C2-9烷基，
Rd为氢原子或直链C2-9烷基，
Re为直链C2-9烷基，并且
Rf为直链C2-9烷基，
或其盐。
更优选地，可以提及以下以阳离子脂质表示的结构式。
Figure BDA0002557729670000382
Figure BDA0002557729670000391
Figure BDA0002557729670000401
Figure BDA0002557729670000411
Figure BDA0002557729670000421
Figure BDA0002557729670000431
及其盐。
在上述阳离子脂质中，更优选由以下结构式表示的阳离子脂质。
Figure BDA0002557729670000432
及其盐。
化合物(III)可以例如通过以下制备方法来制造。特别地，根据所需化合物(III)的结构，可以在酯化过程中使用适当的起始物质合成具有所需结构的化合物(I)。化合物(III)的盐可以通过与无机碱、有机碱、有机酸、碱性或酸性氨基酸适当混合而获得。
Figure BDA0002557729670000441
Figure BDA0002557729670000451
Figure BDA0002557729670000461
在上式中，P1、P2、P3、P4、P5和P6各自独立地为保护基，化合物(A)为式：
Figure BDA0002557729670000471
化合物(B)为式：
Figure BDA0002557729670000472
R1为
Figure BDA0002557729670000473
化合物(C)为式：
Figure BDA0002557729670000474
R2为
Figure BDA0002557729670000475
并且其他符号各自如上所定义。
在上述制备方法的每个步骤的反应中使用的起始物质和试剂以及反应条件可以与上述化合物(II)的制备方法中所述的那些相同。
在另一个实施方案中，可以提及由以下结构式表示并描述于WO2011/153493中的阳离子脂质。
Figure BDA0002557729670000476
Figure BDA0002557729670000481
Figure BDA0002557729670000491
Figure BDA0002557729670000501
Figure BDA0002557729670000511
Figure BDA0002557729670000521
Figure BDA0002557729670000531
Figure BDA0002557729670000541
Figure BDA0002557729670000551
Figure BDA0002557729670000561
Figure BDA0002557729670000571
Figure BDA0002557729670000581
Figure BDA0002557729670000591
Figure BDA0002557729670000601
Figure BDA0002557729670000611
Figure BDA0002557729670000621
Figure BDA0002557729670000631
Figure BDA0002557729670000641
Figure BDA0002557729670000651
Figure BDA0002557729670000661
Figure BDA0002557729670000681
Figure BDA0002557729670000691
Figure BDA0002557729670000701
Figure BDA0002557729670000711
Figure BDA0002557729670000721
Figure BDA0002557729670000731
Figure BDA0002557729670000741
Figure BDA0002557729670000751
Figure BDA0002557729670000761
Figure BDA0002557729670000771
Figure BDA0002557729670000781
Figure BDA0002557729670000791
Figure BDA0002557729670000801
Figure BDA0002557729670000811
Figure BDA0002557729670000821
Figure BDA0002557729670000831
Figure BDA0002557729670000841
Figure BDA0002557729670000851
Figure BDA0002557729670000861
Figure BDA0002557729670000871
Figure BDA0002557729670000881
Figure BDA0002557729670000891
Figure BDA0002557729670000901
Figure BDA0002557729670000911
Figure BDA0002557729670000921
Figure BDA0002557729670000931
Figure BDA0002557729670000941
Figure BDA0002557729670000951
Figure BDA0002557729670000961
Figure BDA0002557729670000971
Figure BDA0002557729670000981
Figure BDA0002557729670000991
Figure BDA0002557729670001001
及其盐。
在上述阳离子脂质中，更优选由以下结构式表示的阳离子脂质。
Figure BDA0002557729670001011
及其盐。
在另一个实施方案中，可以提及由以下结构式表示并描述于WO 2013/126803中的阳离子脂质。
Figure BDA0002557729670001021
Figure BDA0002557729670001031
Figure BDA0002557729670001041
Figure BDA0002557729670001051
及其盐。
在上述阳离子脂质中，更优选由以下结构式表示的阳离子脂质。
Figure BDA0002557729670001052
及其盐。
在另一个实施方案中，可以提及通过Dong等人(Proc Natl Acad Sci U S A.2014年4月15日；111(15)：5753)中所述的以下方案合成的阳离子脂质K-E12、H-A12、Y-E12、G-O12、K-A12、R-A12、cKK-E12、cPK-E12、PK1K-E12、PK500-E12、cQK-E12、cKK-A12、KK-A12、PK-4K-E12、cWK-E12、PK500-O12、PK1K-O12、cYK-E12、cDK-E12、cSK-E12、cEK-E12、cMK-E12、cKK-O12、cIK-E12、cKK-E10、cKK-E14和cKK-E16。
Figure BDA0002557729670001061
在上述阳离子脂质中，更优选cKK-E12、cKK-E14。
在另一个实施方案中，可以提及通过Love KT等人(Proc Natl Acad Sci U SA.2010年5月25日；107(21)：9915)中所述的以下方案合成的阳离子脂质C14-98、C18-96、C14-113、C14-120、C14-120、C14-110、C16-96和C12-200。
Figure BDA0002557729670001071
在上述阳离子脂质中，更优选C14-110、C16-96和C12-200。
在一个特别优选的实施方案中，可以提及由下式(I)表示的阳离子脂质(在下文中也称为“化合物(I)”)。
Figure BDA0002557729670001081
其中
L1为C1-22亚烷基、C2-22亚烯基或C3-22亚二烯基，
n为0或1的整数，
R1为
(1)氢原子，
(2)直链C1-22烷基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
(3)直链C2-22烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，或
(4)直链C3-22二烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
R2为-CH2-O-CO-R5、-CH2-CO-O-R5或-R5，
R3为-CH2-O-CO-R6、-CH2-CO-O-R6或-R6，
R4为氢原子、-CH2-O-CO-R7、-CH2-CO-O-R7或-R7，
R5、R6和R7各自独立地为
(1)直链C1-22烷基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
(2)直链C2-22烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，或
(3)直链C3-22二烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，并且
R8和R9各自独立地为C1-6烷基，
或其盐。
L1为C1-22亚烷基、C2-22亚烯基或C3-22亚二烯基。
L1优选为C1-22亚烷基。
L1更优选为C1-12亚烷基。
L1进一步优选为C1-6亚烷基。
n为0或1的整数。
n优选为1的整数。
R1为
(1)氢原子，
(2)直链C1-22烷基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
(3)直链C2-22烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，或
(4)直链C3-22二烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代。
R1优选为
(1)氢原子，
(2)直链C1-22烷基(优选直链C6-12烷基)，其任选地被一个或两个直链C1-22烷基(优选直链C6-12烷基)取代，或
(3)直链C2-22烯基(优选直链C6-12烯基)，其任选地被一个或两个直链C2-22烯基(优选直链C6-12烯基)取代。
R1特别优选为氢原子。
R2为-CH2-O-CO-R5、-CH2-CO-O-R5或-R5。
R2优选为-CH2-O-CO-R5或-R5。
R2更优选为-CH2-O-CO-R5。
R3为-CH2-O-CO-R6、-CH2-CO-O-R6或-R6。
R3优选为-CH2-O-CO-R6或-R6。
R3更优选为-CH2-O-CO-R6。
R4为氢原子、-CH2-O-CO-R7、-CH2-CO-O-R7或-R7。
R4优选为氢原子或-CH2-O-CO-R7。
R4更优选为-CH2-O-CO-R7。
R5、R6和R7各自独立地为
(1)直链C1-22烷基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
(2)直链C2-22烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，或
(3)直链C3-22二烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代。
R5、R6和R7优选各自独立地为
(1)直链C1-22烷基(优选直链C4-18烷基)，其任选地被一个或两个直链C1-22烷基(优选直链C1-10烷基)取代，
(2)直链C2-22烯基(优选直链C4-18烯基)，或
(3)直链C3-22二烯基(优选直链C4-18二烯基)。
R5、R6和R7更优选各自独立地为
(1)直链C1-22烷基(优选直链C4-18烷基)，其任选地被一个或两个直链C1-22烷基(优选直链C1-10烷基)取代，或
(2)直链C2-22烯基(优选直链C4-18烯基)。
R8和R9各自独立地为C1-6烷基。
R8和R9各自独立地为C1-3烷基(优选甲基)。
优选地，化合物(I)为上述式(I)的化合物，其中
L1为C1-22亚烷基(优选C1-12亚烷基，更优选C1-6亚烷基)，
n为1的整数，
R1为
(1)氢原子，
(2)直链C1-22烷基(优选直链C6-12烷基)，其任选地被一个或两个直链C1-22烷基(优选直链C6-12烷基)取代，或
(3)直链C2-22烯基(优选直链C6-12烯基)，其任选地被一个或两个直链C2-22烯基(优选直链C6-12烯基)取代，
R2为-CH2-O-CO-R5或-R5，
R3为-CH2-O-CO-R6或-R6，
R4为氢原子或-CH2-O-CO-R7，
R5、R6和R7各自独立地为
(1)直链C1-22烷基(优选直链C4-18烷基)，其任选地被一个或两个直链C1-22烷基(优选直链C1-10烷基)取代，
(2)直链C2-22烯基(优选直链C4-18烯基)，或
(3)直链C3-22二烯基(优选直链C4-18二烯基)，并且
R8和R9各自独立地为C1-6烷基(优选C1-3烷基，特别优选甲基)。
更优选地，化合物(I)为上述式(I)的化合物，其中
L1为C1-12亚烷基(优选C1-6亚烷基)，
n为1的整数，
R1为氢原子，
R2为-CH2-O-CO-R5，
R3为-CH2-O-CO-R6，
R4为-CH2-O-CO-R7，
R5、R6和R7各自独立地为
(1)直链C1-22烷基(优选直链C4-18烷基)，其任选地被一个或两个直链C1-22烷基(优选直链C1-10烷基)取代，
(2)直链C2-22烯基(优选直链C4-18烯基)，或
(3)直链C3-22二烯基(优选直链C4-18二烯基)，并且
R8和R9各自独立地为C1-6烷基(优选C1-3烷基，特别优选甲基)。
更优选地，化合物(I)为上述式(I)的化合物，其中
L1为C1-6亚烷基，
n为1的整数，
R1为氢原子，
R2为-CH2-O-CO-R5，
R3为-CH2-O-CO-R6，
R4为-CH2-O-CO-R7，
R5、R6和R7各自独立地为
(1)直链C1-22烷基(优选直链C4-18烷基)，其任选地被一个或两个直链C1-22烷基(优选直链C1-10烷基)取代，或
(2)直链C2-22烯基(优选直链C4-18烯基)，并且
R8和R9各自独立地为C1-3烷基(优选甲基)。
上述每个结构式表示的化合物的盐优选为药理学上可接受的盐。其实例包括与无机碱的盐(例如，碱金属盐，诸如钠盐、钾盐等；碱土金属盐，诸如钙盐、镁盐等；铝盐，铵盐)；与有机碱的盐(例如，与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺[三(羟甲基)甲胺]、叔丁胺、环己胺、苄胺、二环己胺、N，N-二苄基乙二胺的盐)；与无机酸的盐(例如，与氢氟酸、盐酸、氢溴酸、碘化氢酸、硝酸、硫酸、磷酸的盐)；与有机酸的盐(与甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸的盐)；与碱性氨基酸的盐(与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸的盐)；或与酸性氨基酸的盐(与天冬氨酸、谷氨酸的盐)。
本发明脂质纳米粒子中存在的阳离子脂质与总脂质的比率(mol％)为例如约10％至约80％，优选约20％至约70％，更优选约40％至约60％；然而，该比率不限于这些。
也可以仅使用上述阳离子脂质中的一种，或者可以组合使用其两种或更多种。当使用多种阳离子脂质时，整个阳离子脂质的比率优选如上所述。
(c)非阳离子脂质
在本说明书中，“非阳离子脂质”是指除阳离子脂质之外的脂质，并且是在选定pH诸如生理pH等下不具有净正电荷的脂质。在本发明的脂质纳米粒子中使用的非阳离子脂质的实例包括磷脂、类固醇、PEG脂质等。
为了增强编码CAR或外源性TCR的核酸到靶免疫细胞中的递送，对磷脂没有特别限制，只要其稳定地维持核酸并且不抑制与细胞膜(质膜和细胞器膜)的融合即可。例如，可以提及磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二亚麻酰磷脂酰胆碱等。
优选的磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)，更优选DOPC、DPPC、POPC和DOPE。
本发明的脂质纳米粒子中存在的磷脂与总脂质的比率(mol％)可以是例如约0％至约90％，优选约5％至约30％，更优选约8％至约15％。
可以仅使用上述磷脂中的一种，或者可以组合使用其两种或更多种。当使用多种磷脂时，整个磷脂的比率优选如上所述。
作为类固醇，可以提及胆固醇、5α-胆甾烷醇、5β-粪甾醇、胆固醇基-(2’-羟基)-乙醚、胆固醇基-(4′-羟基)-丁醚、6-酮胆甾烷醇、5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5β-胆甾烷酮和癸酸胆固醇酯，优选胆固醇。
当存在类固醇时，本发明的脂质纳米粒子中存在的类固醇与总脂质的比率(mol％)可以是例如约10％至约60％，优选约12％至约58％，更优选约20％至约55％。
可以仅使用上述类固醇中的一种，或者可以组合使用其两种或更多种。当使用多种类固醇时，整个类固醇的比率优选如上所述。
在本说明书中，“PEG脂质”是指聚乙二醇(PEG)和脂质的任何复合物。PEG脂质没有特别限制，只要其具有抑制本发明的脂质纳米粒子的聚集的作用即可。例如，可以提及与二烷氧基丙基缀合的PEG(PEG-DAA)、与二酰基甘油缀合的PEG(PEG-DAG)(例如，SUNBRIGHTGM-020(NOF公司))、与磷脂诸如磷脂酰乙醇胺缀合的PEG(PEG-PE)、与神经酰胺缀合的PEG(PEG-Cer)、与胆固醇缀合的PEG(PEG-胆固醇)或其衍生物或其混合物，mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰基甘油酯(PEG-C-DOMG)、1-[8’-(1，2-二肉豆蔻酰基-3-丙氧基)-羧酰胺-3’，6-二氧辛烷]氨基甲酰基-ω-甲基-聚(乙二醇)(2KPEG-DMG)等。优选的PEG脂质包括PEG-DGA、PEG-DAA、PEG-PE、PEG-Cer及其混合物，更优选选自以下的PEG-DAA缀合物：PEG-二癸基氧基丙基缀合物、PEG-二月桂基氧基丙基缀合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基缀合物、PEG-二棕榈基氧基丙基缀合物、PEG-二硬脂基氧基丙基缀合物及其混合物。
除了甲氧基之外，用于结合稍后描述的T细胞靶向配体的马来酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基等可以用作PEG的自由端。例如，SUNBRIGHT DSPE-0201MA或SUNBRIGHT DSPE-0201MA(NOF)可以用作具有结合T细胞靶向配体的官能团的PEG脂质(在本说明书中有时称为“末端反应性PEG脂质”)。
本发明的脂质纳米粒子中存在的PEG脂质与总脂质的比率(mol％)可以是例如约0％至约20％，优选约0.1％至约5％，更优选约0.7％至约2％。
末端反应性PEG脂质在上述总PEG脂质中的比率(mol％)是例如约10％至约100％，优选约20％至约100％，更优选约30％至约100％。
可以仅使用一种上述的PEG脂质，或者可以组合使用其两种或更多种。当使用多种PEG脂质时，整个PEG脂质的比率优选如上所述。
本发明的脂质纳米粒子用于免疫细胞中的CAR或外源性TCR的基因转移和表达，所述免疫细胞特别是负责获得性免疫中的细胞免疫的T细胞；负责先天免疫的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等；以及作为具有NK细胞特性的T细胞的NKT细胞。因此，本发明的脂质纳米粒子可以进一步含有配体，所述配体可以将脂质纳米粒子靶向到免疫细胞，特别是T细胞，以有效地递送至靶向的免疫细胞，特别是在体内。
(d)能够将脂质纳米粒子靶向至T细胞的配体
能够将本发明的脂质纳米粒子靶向至T细胞的配体没有特别限制，只要其可以特异性识别在T细胞中特异性或高度表达的表面分子即可。优选地，它包括含有针对CD3、CD4、CD8或CD28的抗体的一个或多个抗原结合结构域的那些，并且更优选地，它包括含有抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的抗原结合结构域的那些。体内递送至T细胞的特别优选的实例是仅含有抗CD3抗体的抗原结合结构域的实例。在此，“抗原结合结构域”与构成上述CAR的抗原结合结构域同义。然而，由于需要将CAR制备为其编码核酸，因此存在限制，在许多情况下通常使用单链抗体。由于作为T细胞靶向配体的抗原结合结构域以蛋白质状态包含在本发明的脂质纳米粒子中，因此不仅可以使用单链抗体，而且也可以优选使用任何其他抗体片段，诸如完整的抗体分子，Fab、F(ab’)2、Fab′、Fv、还原抗体(rIgG)、dsFv、sFv、双抗体、三抗体等。可以优选使用不具有Fc部分的Fab’，尤其是用于体内递送至靶免疫细胞。这些抗体片段可以通过用还原剂(例如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇)或肽酶(例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶)处理完整抗体(例如IgG)或通过基因重组操作来制备。
当靶向T细胞的配体是完整的抗体分子时，可以使用可商购的抗CD3、CD4、CD8、CD28抗体等，或者可以从产生抗体的细胞的培养物中分离出配体。另一方面，当配体是上述抗原结合结构域(抗体片段)中的任一个时，按照与获得编码构成所述CAR的抗原结合结构域的核酸相同的方式，分离编码抗原结合结构域的核酸，诸如抗CD3、CD4、CD8、CD28抗体等，并且可以使用所述核酸来重组产生抗原结合结构域。
在本发明的脂质纳米粒子中，靶向T细胞的配体可以任何方式结合至外壳，只要其存在于脂质纳米粒子的表面上即可。例如，当含有末端反应性PEG脂质作为非阳离子脂质时，可以将配体添加至PEG的末端。例如，可以通过使有马来酰亚胺基引入到末端的PEG脂质(例如，SUNBRIGHT DSPE-0200MA)与上述还原抗体的硫醇基反应来制备标记有配体(抗体)的脂质纳米粒子(有时称为“抗体-LNP”)。
当本发明的脂质纳米粒子用于向除T细胞以外的免疫细胞诸如NK细胞和树突状细胞进行基因转移时，即使脂质纳米粒子表面上不存用于靶向至那些免疫细胞的配体，脂质纳米粒子也可以有效地递送。它在脂质纳米粒子的表面上还可以具有针对在每个免疫细胞表面上表达的分子的合适的靶向配体。例如，在NK细胞的情况下，可以提及含有抗CD16和CD56抗体的抗原结合结构域的那些，但为非限制性的。
2.制备本发明的脂质纳米粒子
本发明的脂质纳米粒子可以例如通过US9，404，127中描述的方法来制备。当脂质纳米粒子进一步含有靶向T细胞的配体时，可以通过在制备脂质纳米粒子之后化学结合靶向T细胞的配体来制备。如WO2016/021683中所述，例如，制备上述组分(b)和(c)的有机溶剂溶液，将该有机溶剂溶液与水或(a)的缓冲溶液混合以制备脂质纳米粒子，然后化学结合靶向T细胞的配体以制备其。阳离子脂质、磷脂、胆固醇和PEG脂质的混合比(摩尔比)为例如40至60：0至20：0至50：0至5，但该比率不限于此。当将PEG脂质作为非阳离子脂质混合并且将靶向T细胞的配体添加至PEG的末端时，PEG脂质与配体的混合比(摩尔比)可以为例如20：1至1：20。上述PEG脂质可以以约10％至约100％的比率(mol％)含有末端反应性PEG。可以使用移液管、微流体混合系统(例如，Asia微流体系统(Syrris))或Nanoassemblr(PrecisionNanosystems)进行上述混合。可以通过凝胶过滤、透析或无菌过滤对获得的脂质粒子进行纯化。
有机溶剂溶液中的总脂质组分的浓度优选为0.5至100mg/mL。
作为有机溶剂，例如，可以提及甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或其混合物。有机溶剂可以含有0至20％的水或缓冲溶液。作为缓冲溶液，可以提及酸性缓冲溶液(例如乙酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液)或中性缓冲溶液(例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸、(HEPE)缓冲溶液、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS))。
在使用微流体混合系统进行混合的情况下，优选将1体积份的有机溶剂溶液与1至5体积份的水或缓冲溶液混合。另外，在所述系统中，混合物(有机溶剂溶液与水或缓冲溶液的混合溶液)的流动速率优选为0.1至10mL/min，温度优选为4至45℃。
当如上所述制备脂质粒子分散液时，可以通过将编码CAR或外源性TCR的核酸添加至水或缓冲溶液中来制备含有组分(a)至(d)的分散液。优选以使其在水中或缓冲溶液中的活性成分浓度为0.05至2.0mg/mL的方式添加核酸。
另外，本发明的脂质纳米粒子还可以通过用本身已知的方法将脂质粒子分散液与核酸混合来制备。
在本发明的脂质纳米粒子中，核酸的含量优选为1-20wt％。可以使用Quant-iTTM
Figure BDA0002557729670001181
(Invitrogen)测量含量。在本发明的脂质纳米粒子中，可以基于在添加或不添加表面活性剂(例如Triton-X100)的情况下荧光强度的差异来计算核酸的包封率。
可以通过透析用水或缓冲溶液代替分散介质。对于透析，使用截留分子量为10至20K的超滤膜在4℃至室温下进行。透析可以重复进行。对于透析，可以使用切向流过滤。
如上所述获得的本发明的脂质纳米粒子中的核酸与脂质的比率(重量比)为约0.01至约0.2。
本发明的脂质纳米粒子的平均粒度优选为10至200nm。脂质粒子的平均粒度可以使用例如Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)在自相关函数的累积量分析中计算。
3.引入有本发明的脂质纳米粒子的离体免疫细胞
本发明提供了一种通过以下方式制备表达CAR或外源性TCR的离体免疫细胞的方法：使从活生物体收集的免疫细胞(在本说明书中也称为“离体免疫细胞”)与本发明的脂质纳米粒子接触，并将编码CAR或外源性TCR的核酸引入T细胞；以及通过该方法获得的离体免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”没有特别限制，只要它是能够通过某些作用机制破坏靶细胞(致病细胞)诸如癌细胞等的细胞(即，免疫效应细胞)即可。其实例包括负责获得性免疫中的细胞免疫的T细胞；负责先天免疫的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等；以及作为具有NK细胞特性的T细胞的NKT细胞。在一个优选实施方案中，免疫细胞可以是T细胞。从活生物体收集的T细胞在本说明书中也称为“离体T细胞”。在另一个优选实施方案中，免疫细胞可以负责先天免疫，诸如NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。即使HLA类型匹配，T细胞也被认为具有相当大的因同种异体(allo)移植引起GVHD的风险，而allo-NK细胞等被认为不会引起GVHD。因此，制备各种HLA型allo离体免疫细胞允许现成使用。CAR-NK细胞描述于例如US2016/0096892，Mol Ther.25(8)：1769-1781(2017)等中，CAR-树突状细胞、CAR-巨噬细胞等描述于例如WO 2017/019848，eLIFE.2018 e36688等中。
在另一方面，本发明提供了含有本发明的脂质纳米粒子的用于诱导CAR或外源性TCR的表达的组合物。
引入了本发明的脂质纳米粒子的免疫细胞(例如，T细胞)可以是分离的特定免疫细胞(例如，T细胞)，或者例如是不均匀的细胞群，诸如淋巴细胞和淋巴细胞的祖细胞，包括多能细胞，只要它是含有免疫细胞(例如，T细胞)或其祖细胞的细胞群即可。在本发明中，“淋巴细胞”是指脊椎动物的免疫系统中白细胞的一种亚型。淋巴细胞的实例包括T细胞、B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)，优选分离和纯化的T细胞。在本发明中，“T细胞”是在淋巴器官、外周血等中发现的白细胞的一种类型，并且是指以主要在胸腺中分化和成熟并且表达TCR为特征的一类淋巴细胞。可以用于本发明的T细胞的实例包括细胞毒性T细胞(CTL)，其是CD8阳性细胞；辅助T细胞，其是CD4阳性细胞；调节性T细胞；和效应T细胞，并且优选是细胞毒性T细胞。
前述淋巴细胞可以从例如人类或非人类哺乳动物的外周血、骨髓和脐带血中收集。当将引入有本发明的脂质纳米粒子的离体免疫细胞(例如离体T细胞)用于治疗疾病诸如癌症时，优选从待治疗者或HLA类型与待治疗受试者的类型匹配的供体中收获细胞群。
包括多能细胞在内的淋巴细胞祖细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、造血干细胞、失去自我更新潜能的多能祖细胞(多能祖细胞：MMP)、普通骨髓-淋巴祖细胞(MLP)、骨髓祖细胞(MP)、粒细胞单核祖细胞(GMP)、巨噬细胞-树突状细胞祖细胞(MDP)、树突状细胞祖细胞(DCP)等。可以通过本身已知的方法将未分化的细胞诸如多能细胞等分化为各种免疫细胞，例如T细胞。
使离体免疫细胞与本发明的脂质纳米粒子接触的方法没有特别限制，例如，可以将本发明的脂质纳米粒子添加至用于免疫细胞的典型培养基中。或者，为了提高引入效率，例如，可以组合使用磷酸钙共沉淀法、PEG法、电穿孔法、显微注射法、脂质转染法等。
当本发明的脂质纳米粒子特别地含有编码外源性TCR的核酸作为活性成分时，从增加外源性TCR的表达、抑制错配TCR的出现或抑制自身反应性的角度出发，可以通过siRNA抑制由T细胞固有表达的内源性TCR α链和TCR β链的表达。当将上述核酸应用于该方法时，为了避免siRNA对外源性TCR的影响，编码TCR的核酸的碱基序列优选为与对应于抑制内源性TCRα和TCRβ链的表达的siRNA所作用的RNA的碱基序列不同的序列(密码子转换型序列)。其方法描述于例如WO 2008/153029中。通过将沉默突变引入编码TCR的天然获得的核酸或化学合成人工设计的核酸，可以产生上述碱基序列。或者，为了避免与内源性TCR链错配，可以将编码外源性TCR的核酸的部分或全部恒定区替换为源自人以外的动物例如小鼠的恒定区。
4.含有本发明的脂质纳米粒子或引入有脂质纳米粒子的离体免疫细胞的药物
本发明提供了含有本发明的脂质纳米粒子或引入有脂质纳米粒子的离体免疫细胞(例如，离体T细胞)的药物(以下简称为“本发明的药物”)。
(4-1.含有引入有本发明的脂质纳米粒子的离体免疫细胞的药物)
通过表达CAR或外源性TCR，引入有本发明的脂质纳米粒子的免疫细胞(例如，T细胞)可以特异性识别表达由CAR或外源性TCR特异性识别的表面抗原的细胞，并杀死它们(例如，诱导细胞凋亡)。因此，通过含有作为表面抗原的识别在疾病细胞诸如癌细胞中特异性表达或显示出增强表达的表面分子的CAR或外源性TCR的编码核酸作为活性成分，引入有本发明的脂质纳米粒子的离体免疫细胞可以用于预防或治疗疾病，诸如癌症等，并且可以安全地施用于哺乳动物(人类或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴子，优选人类))。
(4-2.含有本发明的脂质纳米粒子的药物)
含有本发明的脂质纳米粒子的本发明药物优选通过将脂质纳米粒子与已知的药学上可接受的载体(包括赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、表面活性剂等)和常规添加剂等混合而制备为药物组合物。赋形剂是本领域普通技术人员众所周知的，并且包括例如磷酸盐缓冲生理盐水(例如0.01M磷酸盐、0.138M NaCl、0.0027M KCl，pH 7.4)；含有无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等的水溶液；生理盐水溶液；乙二醇、乙醇等的溶液；以及有机酸的盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，也可以使用佐剂，诸如润湿剂或乳化剂，以及pH缓冲剂。另外，也可以使用制备佐剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和分散剂。或者，上述药物组合物可以是干燥形式，其在使用前用合适的无菌液体复溶。取决于组合物的制备形式，药物组合物可以口服或肠胃外全身性或局部给药(口服剂，诸如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等；肠胃外剂，诸如注射剂、滴注剂、外用制剂、栓剂等)。对于肠胃外给药，可以使用静脉内给药、皮内给药、皮下给药、直肠给药、经皮给药等。当以注射形式使用时，也可以添加可接受的缓冲剂、增溶剂、等渗剂等。
含有本发明的脂质纳米粒子的本发明药物的剂量例如在每剂量每1kg体重0.001mg至10mg编码CAR或外源性TCR的核酸的量的范围内。例如，当施用于人类患者时，对于体重为60kg的患者，剂量在0.0001至50mg的范围内。上述剂量是一个实例，该剂量可以根据所用核酸的类型、给药途径、给药受试者或患者的年龄、体重、症状等适当选择。
通过施用于哺乳动物(例如，人类或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴)，优选人类)，含有本发明的脂质纳米粒子的本发明药物可以在动物体内的免疫细胞例如T细胞(在本说明书中也称为“体内免疫细胞”或“体内T细胞”)中诱导CAR或外源性TCR的表达。体内免疫细胞特异性识别表达由CAR或外源性TCR靶向的表面抗原的癌细胞等，并杀死患病细胞，从而显示出对该疾病的预防或治疗作用。
在含有引入有本发明的脂质纳米粒子的离体免疫细胞作为活性成分的药物的情况下，可以在施用于受试者之前使用适当的培养基和/或刺激分子来培养和/或刺激免疫细胞。刺激分子包括但不限于细胞因子、合适的蛋白质和其他组分。在T细胞的情况下，细胞因子的实例包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ等，并且优选地，可以使用IL-2。尽管培养基中的IL-2的浓度没有特别限制，但其例如优选为0.01至1×105U/mL，更优选为1至1×104U/mL。合适的蛋白质的实例包括CD3配体、CD28配体和抗IL-4抗体。也可以添加淋巴细胞刺激因子，诸如凝集素。另外，可以将血清或血浆添加至培养基中。尽管其添加至培养基的量没有特别限制，但可以列举0体积％至20体积％，并且可以根据培养阶段改变血清或血浆的使用量。例如，可以逐步地降低血清或血浆浓度。血清和血浆可以源自于自身或非自身，但是从安全性的角度出发，优选源自于自身的那些。
优选将含有引入有本发明脂质纳米粒子的离体免疫细胞作为活性成分的药物肠胃外施用于受试者。肠胃外给药方法包括静脉内、动脉、肌内、腹膜内和皮下给药。尽管根据受试者的病况、体重、年龄等选择剂量，但对60kg体重的受试者进行给药以一般获得每剂量1×106-1×1010个细胞，优选1×107-1×109个细胞，更优选5×107-5×108个细胞。药物可以单剂量或多剂量给药。含有引入有本发明的脂质纳米粒子的离体免疫细胞作为活性成分的本发明药物可以是适合于肠胃外给药的已知形式，诸如注射剂或输注剂。药物可以适当地含有药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂包括上述那些。药物可以含有生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、培养基等以稳定地维持细胞。培养基不受特别限制，并且其实例包括但不限于RPMI、AIM-V、X-VIVO10等。另外，出于稳定化的目的，可以将药学上可接受的载体(例如人血清白蛋白)、防腐剂等添加至药物。
本发明的药物可以是用于癌症的预防或治疗药物。对作为本发明药物的应用靶标的癌症没有特别限制。其实例包括但不限于急性淋巴细胞癌、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌(例如髓母细胞瘤)、乳腺癌、肛门、肛管或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、子宫颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性髓细胞癌、结肠癌、食道癌、子宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病(例如急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病)、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、大网膜癌和肠系膜癌；咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体肿瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌等。
下面通过参考实施例更详细地解释本发明，所述实施例仅仅是示例性的，并不限制本发明。
[实施例]
实施例1
(抗体的还原处理)
将9.21mg/ml抗CD3抗体(Bio X Cell)(111μl)与10mM DTT水溶液(12.3μl)混合。类似地，将6.73mg/ml IgG2a抗体(Bio X Cell)(149μl)与10mM DTT水溶液(16.6μl)混合。将每种抗体和DTT的混合物通过涡旋混合以在室温下进行反应30分钟。通过HPLC(柱：TSKgel G2000SWXL 7.8mm×30cm，TOSOH，流动相：PBS)分离反应混合物，得到含有还原抗体的级分溶液。使用Amicon 0.5ml-10K将级分溶液超离心。分别通过在230nm处的吸光度和与N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACM)的荧光比色反应，测量浓缩物中抗体蛋白和硫醇基的浓度。还原的抗CD3抗体的产量为176μl，蛋白质浓度为1.75mg/ml，硫醇基浓度为5.14μM，还原的IgG2a抗体的产量为86μl，蛋白质浓度为5.19mg/ml，硫醇基浓度为45.1μM。
实施例2
(制备马来酰亚胺-LNP)
将脂质混合物(阳离子脂质∶DPPC∶胆固醇∶SUNBRIGHTGM-020∶SUNBRIGHT DSPE-020MA＝60∶10.6∶28∶1.4∶1，摩尔比)溶解在90％EtOH、10％水中，得到7.0mg/ml脂质溶液。作为阳离子脂质，以59.1∶0.9(摩尔比)混合并使用WO 2016/021683中描述的3-戊基辛酸3-((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)-2，2-双(((3-戊基辛酰基)氧基)甲基)丙基酯(化合物7)，以及N，N，N-三甲基-5-氧代-5-(3-((3-戊基辛酰基)氧基)-2，2-双(((3-戊基辛酰基)氧基)甲基)丙氧基)戊烷-1-碘化铵(化合物8)。将编码具有4-1BB和CD3ζ作为细胞内信号转导结构域的靶向CD19的CAR的mRNA溶解在10mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 5.0)中，得到0.2mg/ml核酸溶液。在室温下，通过Nanoassemblr装置(Precision Nanosystems)以3ml/min：6ml/min的流动速率比混合所得的脂质溶液和核酸溶液，得到含有组合物的分散液。将所得的分散液使用Slyde-A-Lyzer(20k级分分子量，Thermo Scientific)在室温下对水透析1小时，并在4℃下对PBS透析48小时。接着，将透析液通过0.2μm注射过滤器(Iwaki)过滤并保存在4℃。
实施例3
(还原抗体与马来酰亚胺-LNP的结合反应)
将马来酰亚胺-LNP分散液与还原抗体溶液混合至1/20摩尔浓度的还原抗体比马来酰亚胺，并使其在室温下静置4小时。之后，将混合物在4℃下保存直至纯化步骤。
实施例4
(抗体-LNP的凝胶过滤纯化)
将还原抗体和马来酰亚胺-LNP的反应混合物装载在凝胶过滤柱Sepharose CL-4B(目录号17-0150-01/GE Healthcare)上，并用D-PBS(-)作为流动相进行分离。接着，测量每个级分的蛋白质浓度以鉴定含有感兴趣的抗体-LNP的级分。将抗体-LNP通过0.2μm注射过滤器过滤并保存在4℃。
实施例5
(CD8+T细胞的离体转染)
从C57BL/6J小鼠收集脾脏，并将其分散在ACK裂解缓冲液(Biosource)中，得到小鼠脾细胞。将获得的小鼠脾细胞在含有1ng/ml白介素7和2μg/ml伴刀豆球蛋白A的完全RPMI1640培养基中培养2天，并通过使用Ficoll密度梯度离心去除死细胞并使用CD8阴性分离试剂盒(Stemcell Technologies)处理来分离小鼠CD8+T细胞。将获得的小鼠CD8+T细胞分散并在含有10ng/ml白介素2和抗体-LNP的完全RPMI 1640培养基中培养，以用CAR或外源性TCR转染小鼠CD8+T细胞。
以相同的方式，将CD8+T细胞与购买的培养的人原代T细胞分离，并用CAR或外源性TCR转染人CD8+T细胞。
实施例6
(CAR-T细胞的体外细胞毒性评估)
将强力表达CD19的人慢性骨髓性白血病细胞系K562细胞(待评估细胞毒性的细胞)用膜染料PKH-26(Sigma-Aldrich)标记，用含有10％胎牛血清的RPMI培养基洗涤，以1×105个细胞/ml分散于培养基中并培养。将标记的细胞毒性评估细胞分散于96孔板中并进行培养。将细胞与CAR-T细胞混合，在37℃下培养3小时，用Annexin V-Brilliant Violet 421(BioLegend)染色，并进行流式细胞术以对凋亡细胞进行定量。
实施例7
(体内抗癌活性评估测试)
将稳定表达荧光素酶的K562-CD19细胞从尾静脉施用于6周龄的NOD-SCID小鼠，并且将其饲养1周以制备小鼠血液癌症模型。接着，通过尾静脉施用，每周一次施用1×106个通过使用抗体-LNP离体转染编码CAR的核酸而获得的人CAR-T细胞，持续3周。通过使用体内发光成像系统IVIS(PerkinElmer)的测量来评估CAR-T细胞对癌细胞的减少。
实施例8
(使用阳离子脂质制备马来酰亚胺-LNP)
将脂质混合物(阳离子脂质∶DPPC∶胆固醇∶SUNBRIGHTGM-020∶SUNBRIGHT DSPE-020MA＝60∶10.6∶28∶1.4∶1，摩尔比)溶解在90％EtOH、10％25mM醋酸盐缓冲液pH 4.0中，得到10mg/ml脂质溶液。作为阳离子脂质，使用(9Z)-十四-9-烯酸3-((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)-2，2-双(((9Z)-十四-9-烯酰氧基)甲基)丙酯(化合物12)、(9Z，9’Z)双-十四-9-烯酸2-(((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)-2-((十二烷酰基氧基)甲基)丙烷-1，3-二酯(化合物21)和双癸酸2-(((4，5-二丁基壬酰基)氧基)甲基)-2-(((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)甲基)丙烷-1，3-二酯(化合物35)。将编码靶向CD19的CAR的pcDNA3.1-hCD19CAR溶于10mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH 5.5)中，得到0.2mg/ml核酸溶液。通过将WO2013/126712中引用的CD19 IgG4 28z序列整合到pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific)的多克隆位点中来产生pcDNA3.1-hCD19CAR。在室温下，通过Nanoassemblr装置(PrecisionNanosystems)以3ml/min∶6ml/min的流动速率比混合所得的脂质溶液和核酸溶液，得到含有组合物的分散液。将所得的分散液使用Slyde-A-Lyzer(20k级分分子量，ThermoScientific)在室温下对水透析1小时，并在4℃下对PBS透析48小时。接着，将透析液通过0.2μm注射过滤器(Iwaki)过滤并保存在4℃。
(测量马来酰亚胺-LNP的核酸浓度，并计算假定的马来酰亚胺浓度)
将马来酰亚胺-LNP溶解在0.5％Triton X-100中，并使用Quant-iTTM PicoGreenTMdsDNA分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测量pDNA浓度。将在未添加Triton X-100的情况下测量的pDNA浓度作为未包封在LNP中的pDNA的浓度，计算出pDNA在LNP中的包封率。通过将测得的pDNA浓度乘以马来酰亚胺-PEG-脂质(DSPE-020MA)的装料比来计算假定的马来酰亚胺浓度。所得值示于表1。
[表1]
Figure BDA0002557729670001271
Figure BDA0002557729670001281
(两种混合的还原抗体与马来酰亚胺-LNP的结合反应)
将用DTT还原的等量的抗人CD3抗体(BE0001-2，BioXCell)和抗人/猴CD28抗体(BE0248，BioXCell)以与马来酰亚胺-LNP的马来酰亚胺为1/20的摩尔量混合。表2显示了马来酰亚胺-LNP和还原抗体的浓度和体积。使混合物在室温下静置4小时，然后在4℃下保存直至纯化步骤。
[表2]
Figure BDA0002557729670001282
(抗体-LNP的凝胶过滤纯化)
将还原抗体和马来酰亚胺-LNP的反应混合物装载在凝胶过滤柱Sepharose CL-4B(目录号17-0150-01/GE Healthcare)上，并用D-PBS(-)作为流动相进行分离。接着，测量每个级分的蛋白质浓度以鉴定含有感兴趣的抗体-LNP的级分。将抗体-LNP通过0.2μm注射过滤器过滤并保存在4℃。通过Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)测量获得的抗体-LNP的粒度。分别使用Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA分析试剂盒(Thermo FisherScientific)和ATTO-TAGTM FQ胺衍生试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测量核酸和抗体蛋白的浓度。每个分析结果的值示于表3。
[表3]
Figure BDA0002557729670001291
实施例9
(使用抗体-LNP对培养的人原代T细胞进行CD19 CAR转染测试)
用培养基以1.1×106个细胞/ml制备人Pan-T细胞(AccuCell人外周血Pan-T细胞，阴性选择)，并以90μl/孔接种在96孔板中。将补充有浓度为30ng/ml的重组IL-2(ThermoFisher Scientific)的X-VIVO10(Lonza)用作培养基。接着，将10μl用PBS稀释至30μg/mlpcDNA3.1-hCD19CAR浓度的抗体-LNP添加至培养基中，并将细胞在5％CO2培养箱中于37℃培养3天和6天。
(通过流式细胞术评估CD19CAR表达)
将在96孔板中培养的培养的人原代T细胞收集在1.5ml试管中，加入重组人CD19蛋白，Fc Chimera Active，Biotin(Abcam)(2μl)，将混合物在冰上静置30分钟。接着，加入添加有200μl 1％FBS的CellWash(BD)，通过以300×g离心5分钟将混合物洗涤两次，除去上清液，将细胞分散在100μl 1％FBS，Cell Wash中。向细胞分散液中加入0.2μl BrilliantViolet 421链霉亲和素，并在通过移液混合后，将分散液在冰上静置30分钟。将染色的细胞用200μl的1％FBS Cell Wash洗涤3次并离心，过滤，分散在200μl的1％FBS Cell Wash中，并通过LSRFortessa(BD)进行流式细胞术分析。
通过流式细胞术分析对经hCD3/hCD28-化合物12-pcDNA3.1-hCD19CAR转染的培养的人原代T细胞的CD19 CAR表达分析结果如图1所示。加入抗体-LNP后第3天和第6天的CD19CAR阳性率分别为51.9％和41.7％，与通过病毒载体进行基因转移相比，获得的CAR阳性细胞具有足够的效率。
通过流式细胞术分析对经hCD3/hCD28-化合物21-pcDNA3.1-hCD19CAR和hCD3/hCD28-化合物35-pcDNA3.1-hCD19CAR转染的培养的人原代T细胞的CD19 CAR表达分析结果如图2所示。加入抗体-LNP后第3天的CD19 CAR阳性率分别为5.12％和47.0％。
实施例10
(通过抗体-LNP对经CD19 CAR转染的培养的人原代T细胞的癌症细胞毒性评估)
将用DELFIA细胞毒性分析试剂盒(Perkin Elmer)标记的人前B细胞系NALM-6和人Burkitt淋巴瘤细胞系Daudi作为靶细胞以1×104个细胞/100μl/孔的细胞密度接种在96孔U底板中。作为培养基，使用含10％FBS的RPMI(不含酚红)。接着，通过分散在100μl培养基中使效应细胞与靶细胞的细胞数比为0比16，添加通过另一部分所述的方法通过hCD3/hCD28-化合物12-pcDNA3.1-hCD19CAR经CD19CAR转染的培养的人原代T细胞(添加抗体-LNP后3天的CD19CAR阳性率：19％)作为效应细胞。将靶细胞和效应细胞混合后3小时，收集20μl的培养上清液。将铕溶液(Eu)(20μl)添加至收集的培养上清液中，并根据从受损靶细胞释放的螯合剂TDA和Eu的复合物发射的荧光强度计算细胞毒性率。
图3显示了由于添加了用CD19 CAR转染的人原代T细胞而导致的Nalm-6和Daudi的细胞毒性率。
实施例11
(制备还原Fab’)
使用Pierce F(ab′)2制备试剂盒(Thermo Fisher Scientific)从抗小鼠CD3ε抗体(BE0001-1，BioXCell)和抗小鼠CD28抗体(BE0015-1，BioXCell)制备与马来酰亚胺-LNP缀合的还原Fab′。从7.86mg/ml抗小鼠CD3ε抗体(0.5ml)获得1ml1.75mg/ml F(ab’)2。从3.86mg/ml抗小鼠CD28抗体(0.5ml)获得0.62ml的0.97mg/ml F(ab’)2。将每种F(ab’)2与作为还原剂的2-氨基乙硫醇对甲苯磺酸盐以40mM的浓度混合，并将混合物在37℃下静置1小时。将所获得的Fab’通过ZebaSpin Desalting Columns.7K MWCO-0.5ml(Thermo FischerScientific)纯化，并保存在4℃下，直到与马来酰亚胺-LNP反应。分别通过在230nm处的吸光度和与N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACM)的荧光比色反应，测量Fab’蛋白和硫醇基的浓度。
实施例12
(还原Fab’与马来酰亚胺-LNP的结合反应)
将还原抗小鼠CD3εFab’和抗小鼠CD28 Fab’以与通过上述方法制备的马来酰亚胺-LNP的马来酰亚胺为1/20的摩尔量混合。使混合物在室温下静置4小时，然后在4℃下保存直至纯化步骤。
实施例13
(还原Fab’-LNP的凝胶过滤纯化)
将还原Fab’和马来酰亚胺-LNP的反应混合物装载在凝胶过滤柱Sepharose CL-4B(目录号17-0150-01/GE Healthcare)上，并用D-PBS(-)作为流动相进行分离。接着，测量每个级分的蛋白质浓度以鉴定含有感兴趣的Fab’-LNP的级分。将Fab’-LNP通过0.2μm注射过滤器过滤并保存在4℃。通过Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)测量获得的抗体-LNP的粒度。分别使用Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA分析试剂盒(Thermo FisherScientific)和ATTO-TAGTM FQ胺衍生试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测量核酸和抗体蛋白的浓度。
工业适用性
本发明的脂质纳米粒子可以有效地引入CAR或外源性TCR，并且不仅可以离体而且可以体内选择性地引入T细胞，因此可以以低的生产成本提供CAR-T或TCR-T细胞疗法。另外，由于不使用病毒载体，因此可以避免病毒蛋白的抗原性问题，作为癌症免疫疗法的新平台极为有用。
本申请是基于在日本提交的专利申请第2017-252616号(提交日：2017年12月27日)，其内容通过引用全部结合于此。

Claims (34)

1.一种脂质纳米粒子，其包含以下(a)至(c)：
(a)编码嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的核酸；
(b)阳离子脂质；和
(c)非阳离子脂质。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其中前述阳离子脂质为式(I)表示的化合物或其盐：
Figure FDA0002557729660000011
其中
L1为C1-22亚烷基、C2-22亚烯基或C3-22亚二烯基，
n为0或1的整数，
R1为
(1)氢原子，
(2)直链C1-22烷基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
(3)直链C2-22烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，或
(4)直链C3-22二烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
R2为-CH2-O-CO-R5、-CH2-CO-O-R5或-R5，
R3为-CH2-O-CO-R6、-CH2-CO-O-R6或-R6，
R4为氢原子、-CH2-O-CO-R7、-CH2-CO-O-R7或-R7，
R5、R6和R7各自独立地为
(1)直链C1-22烷基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
(2)直链C2-22烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，或
(3)直链C3-22二烯基，其任选地被一个或两个选自直链C1-22烷基和直链C2-22烯基的取代基取代，
R8和R9各自独立地为C1-6烷基。
3.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其中前述核酸为mRNA或DNA。
4.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其中前述非阳离子脂质为磷脂、胆固醇和/或PEG脂质。
5.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其中前述脂质纳米粒子在表面上具有能够靶向T细胞的配体。
6.根据权利要求5所述的脂质纳米粒子，其中前述配体是包含选自以下的一种或多种抗体的抗原结合结构域的配体：抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体和抗CD28的抗体。
7.根据权利要求5所述的脂质纳米粒子，其中前述配体是包含抗CD3的抗体和/或抗CD28的抗体的抗原结合结构域的配体。
8.根据权利要求5所述的脂质纳米粒子，其中前述配体是包含抗CD3的抗体和抗CD28的抗体的抗原结合结构域的配体。
9.一种药物，其包含根据权利要求1所述的脂质纳米粒子。
10.根据权利要求9所述的药物，其中所述药物是用于癌症的预防或治疗药物。
11.根据权利要求9所述的药物，其中所述药物将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体基因引入体内免疫细胞以诱导其表达。
12.根据权利要求9所述的药物，其中所述药物将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体基因引入体内T细胞以诱导其表达。
13.一种通过将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体引入哺乳动物的体内免疫细胞来表达所述受体的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用根据权利要求1所述的脂质纳米粒子。
14.一种通过将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体引入哺乳动物的体内T细胞来表达所述受体的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用根据权利要求1所述的脂质纳米粒子。
15.一种用于预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用根据权利要求1所述的脂质纳米粒子。
16.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其用于预防或治疗癌症。
17.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子在制造用于预防或治疗癌症的药剂中的用途。
18.一种用于诱导嵌合抗原受体或外源性T细胞受体表达的组合物，其包含根据权利要求1所述的脂质纳米粒子。
19.一种离体免疫细胞，其表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
20.一种离体T细胞，其表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
21.一种包含离体免疫细胞的药物，所述离体免疫细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
22.一种包含离体T细胞的药物，所述离体T细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
23.根据权利要求21所述的药物，其中所述药物是用于癌症的预防或治疗药物。
24.根据权利要求21所述的药物，其中所述药物是用于诱导细胞凋亡的药物。
25.一种通过将嵌合抗原受体或外源性T细胞受体引入离体免疫细胞来表达所述受体的方法，所述方法包含将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中。
26.一种用于在离体T细胞中表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的方法，所述方法包含将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中。
27.一种用于预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用离体免疫细胞，所述离体免疫细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
28.一种用于预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用离体T细胞，所述离体T细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
29.一种用于预防或治疗癌症的离体免疫细胞，其中所述离体免疫细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
30.一种用于预防或治疗癌症的离体T细胞，其中所述离体T细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
31.离体免疫细胞在制造用于预防或治疗癌症的药剂中的用途，其中所述离体免疫细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中获得。
32.离体T细胞在制造用于预防或治疗癌症的药剂中的用途，其中所述离体T细胞表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体，并且通过将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中获得。
33.一种制备药物的方法，所述药物包含表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的离体免疫细胞，所述方法包含以下步骤：将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体免疫细胞的培养物中。
34.一种制备药物的方法，所述药物包含表达嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的离体T细胞，所述方法包含以下步骤：将根据权利要求1所述的脂质纳米粒子添加到包含离体T细胞的培养物中。
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