BR112020013201A2 - nanopartícula lipídica, medicamento, métodos para expressar um receptor, para prevenir ou tratar câncer e para produzir um medicamento, uso da nanopartícula lipídica e do imunócito ex vivo, composição, imunócito ex vivo, e, célula ex vivo - Google Patents

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BR
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vivo
lipid nanoparticle
receptor
group
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BR112020013201-2A
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Shinobu Kuwae
Satoru Matsumoto
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Abstract

A presente invenção provê uma nanopartícula lipídica contendo os seguintes componentes (a) a (c): (a) um ácido nucleico codificando um receptor antigênico quimérico (CAR) ou um receptor de célula T exógeno (TCR); (b) um lipídeo catiônico; e (c) um lipídeo não catiônico. A presente invenção também provê: um imunócito expressando CAR ou expressando TCR exógeno produzido por introdução da nanopartícula lipídica em uma célula T in vivo ou ex vivo, e um meio para o tratamento in vivo ou ex vivo de doenças, incluindo câncer, usando o imunócito.

Description

NANOPARTÍCULA LIPÍDICA, MEDICAMENTO, MÉTODOS PARA EXPRESSAR UM RECEPTOR, PARA PREVENIR OU TRATAR CÂNCER E PARA PRODUZIR UM MEDICAMENTO, USO DA NANOPARTÍCULA LIPÍDICA E DO IMUNÓCITO EX VIVO, COMPOSIÇÃO, IMUNÓCITO EX VIVO, E, CÉLULA EX VIVO [Campo Técnico]
[001] A presente invenção refere-se as nanopartículas lipídicas contendo um ácido nucleico codificando um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T, um método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno em um imunócito de interesse usando as nanopartículas lipídicas, um uso farmacêutico das mesmas, e similares. (Fundamentos da invenção)
[002] A pesquisa e desenvolvimento de imunoterapia de câncer usando células CAR-T ou células TCR-T introduzidas com um gene de receptor antigênico quimérico (CAR) ou receptor de célula T (TCR) derivado de célula T exterminadora específica de antígeno de câncer estão progredindo rapidamente. À terapia atual com célula CAR-T, tal como Kymriah (nome de comércio) e Yescarta (nome de comércio), que foram aprovados nos Estados Unidos, geralmente inclui produzir células CAR-T por transfecção de células T coletadas dos pacientes com genes de CAR ex vivo usando vetores virais tal como vetor lentiviral, e administrando as células CAR-T aos pacientes. No entanto, este método tem o problema de que o custo de produção se torna elevado devido ao custo da cultura de células e preparação de vetores virais. Se a introdução de CAR ou TCR exógeno seletivamente em imunócitos, tal como células T, é possível in vivo, a preparação ex vivo não é necessária e a terapia com imunocélulas CAR ou TCR, com custo baixo de produção, pode ser obtida. Além disso, se CAR ou TCR exógeno pode ser seletivamente introduzido nos imunócitos, tal como células T, em ex vivo sem usar vetores virais requerendo altos custos de produção, o custo de testar o resíduo viral, etc. será eliminado, e terapia com imunocélulas CAR ou TCR com custo baixo de produção pode ser obtida.
[003] A transfecção ex vivo ou in vivo de CAR em células T foi relatada que usa nanoparículas contendo agregados de DNA plasmídeo codificando CAR e um polímero catiônico que são revestidos com um polímero não catiônico conjugado com fragmentos de anticorpo anti-CD3 (documento patentário 1, documento não patentário 1), ou nanocarreador contendo silica mesoporosa encapsulando o DNA codificando CAR nos poros e revestido com um lipídeo tendo uma superfície modificada com um anticorpo anti-CD3 (documento patentário 2).
[004] Além do acima, técnicas foram relatadas para entregar siRNA para uma célula alvo por encapsulação do siRNA alvo em “nanopartículas lipídicas (LNP)”, que não têm uma estrutura de poro interna e são compostas de um lipídeo catiônico, um lipídeo auxiliar não catiônico, e um ligante para entrega para a célula alvo. Por exemplo, transfecção ex vivo ou in vivo de siRNA para CD45 em células T usando um fragmento de anticorpo anti-CD4 como um ligante dirigido foi relatada (documento patentário 3, documento não patentário 2).
[005] Até a presente data, no entanto, não se encontra um relato em que um ácido nucleico (por exemplo, mRNA, DNA) codificando CAR ou TCR exógeno tenha sido seletivamente introduzido em imunócitos, tal como células T usando LNP.
[Lista de Documentos] [Documentos patentários] documento patentário 1: US 2017/0296676 documento patentário 2: US 2016/0145348 documento patentário 3: WO 2016/189532 [Documentos não patentários] documento não patentário 1: Nature Nanotechnology 12, 813-820 (2017) documento não patentário 2: ACS Nano, 2015, 9(7), 6706-6716
3 /141 [Sumário da Invenção] [Problema Técnico]
[006] O objetivo da presente invenção é prover uma nova tecnologia de transfecção capaz de introduzir, de modo eficiente, CAR ou TCR exógeno seletivamente em imunócitos, tal como células T in vivo ou ex vivo, assim possibilitando terapia com imunocélulas CAR ou TCR com baixos custos de produção. Outro objetivo da presente invenção é prover uma terapia mais segura com imunocélulas CAR ou TCR que evita o problema de antigenicidade por proteínas virais.
[Solução para o Problema]
[007] Os presentes inventores conduziram estudos intensivos em uma tentativa para alcançar as finalidades acima mencionadas e alcançaram sucesso para introduzir, de modo eficiente, um ácido nucleico codificando CAR ou TCR exógeno seletivamente em imunócitos, tal como células T, in vivo e ex vivo, usando LNFP, o que resultou na conclusão da presente invenção.
[008] Consequentemente, a presente invenção provê o seguinte.
[009] [1] Uma nanopartícula lipídica compreendendo os seguintes (a) a (o): um ácido nucleico codificando um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno; um lipídeo catiônico; e um lipídeo não catiônico.
[0010] [2] A nanopartícula lipídica de [1], em que o lipídeo catiônico acima mencionado é um composto representado pela fórmula (D: Rô o R' | À R? RS AX: OD R$ em que
4 /141
L' é um grupo C1.22 alquileno, um grupo C222 alquenileno ou um grupo C3.77 alcadienileno,
n é um inteiro de O ou 1,
R'é
(1) um átomo de hidrogênio,
(2) um grupo C1.2> alquila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr», alquila linear e um grupo C>7.22 alquenila linear,
(3) um grupo C222 alquenila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.2> alquila linear e um grupo C7 2, alquenila linear, ou
(4) um grupo C3.72 alcadienila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.2> alquila linear e um grupo C7 27 alquenila linear,
R? é -CH7-O-CO-RS$, -CH7-CO-O-R” ou -R$,
R? é -CH7-O-CO-RS$, -CH7-CO-O-R ou -R$,
Rº é um átomo de hidrogênio, -CH3-O-CO-R, -CH3;-CO-O-R ou - R,
R, Rº e R7 são, cada, independentemente
(1) um grupo C1.»> alquila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr.» alquila linear e um grupo C2.22 alquenila linear,
(2) um grupo C777 alquenila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr.» alquila linear e um grupo C7 2, alquenila linear, ou
(3) um grupo C3.77 alcadienila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.22 alquila linear e um grupo C7 25 alquenila linear,
Rg e Ro são, cada, independentemente, um grupo C++ alquila,
/141 ou um sal dos mesmos.
[0011] [3] A nanopartícula lipídica de [1] ou [2], em que o ácido nucleico acima mencionado é mRNA ou DNA.
[0012] [4] A nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [3], em que o lipídeo não catiônico acima mencionado é fosfolipídeo, colesterol e/ou PEG-lipídeo.
[0013] [5] A nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [4], em que a nanopartícula lipídica acima mencionada tem um ligante que pode ser dirigido para células T sobre a superfície.
[0014] [6] A nanopartícula lipídica de [5], em que o ligante acima mencionado é um ligante compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um ou mais anticorpos selecionados dentre o grupo consistindo em um anticorpo contra CD3, um anticorpo contra CD4, um anticorpo contra CD8 e um anticorpo contra CD28.
[0015] [7] A nanopartícula lipídica de [5], em que o ligante acima mencionado é um ligante compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo contra CD3 e/ou um anticorpo contra CD28.
[0016] [8] A nanopartícula lipídica de [5], em que o ligante acima mencionado é um ligante compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo contra CD3 e um anticorpo contra CD28.
[0017] [9] Um medicamento compreendendo a nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8].
[0018] [10] O medicamento de [9], em que o medicamento é um fármaco profilático ou terapêutico para câncer.
[0019] [11] O medicamento de [9], em que o medicamento introduz um gene de receptor antigênico quimérico ou de um receptor de célula T exógeno em um imunócito in vivo para induzir uma expressão do mesmo.
[0020] [12] O medicamento de [9], em que o medicamento introduz um gene de receptor antigênico quimérico ou de um receptor de célula T exógeno em uma célula T in vivo para induzir uma expressão da mesma.
6 /141
[0021] [13] Um método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno por introdução do receptor em um imunócito in vivo de um mamífero, compreendendo a administração da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] ao mamífero.
[0022] [14] Um método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno por introdução do receptor em uma célula T in vivo de um mamífero, compreendendo a administração da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] ao mamífero.
[0023] [15] Um método para prevenir ou tratar câncer em um mamífero, compreendendo a administração da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a
[8] ao mamífero.
[0024] [16] A nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] para uso na profilaxia ou tratamento de câncer.
[0025] [17] Uso da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] na fabricação de um agente para a profilaxia ou tratamento de câncer.
[0026] [18] Uma composição para induzir expressão de um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno, compreendendo a nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8].
[0027] [19] Um imunócito ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
[0028] [20] Uma célula T ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
[0029] [21] Um medicamento compreendendo um imunócito ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
[0030] [22] Um medicamento compreendendo uma célula T ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
[0031] [23] O medicamento de [21] ou [22], em que o medicamento é um fármaco profilático ou terapêutico para câncer.
[0032] [24] O medicamento de [21] ou [22], em que o medicamento é um fármaco para induzir apoptose.
[0033] [25] Um método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno por introdução do receptor em um imunócito ex vivo, compreendendo adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a
[8] a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
[0034] [26] Um método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno em uma célula T in vivo, compreendendo adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
[0035] [27] Um método para prevenir ou tratar câncer em um mamífero, compreendendo a administração, ao mamífero, de um imunócito ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
[0036] [28] Um método para prevenir ou tratar câncer em um mamífero, compreendendo a administração, ao mamífero, de uma célula T ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
[0037] [29] Um imunócito ex vivo para uso na profilaxia ou tratamento de câncer, em que o imunócito ex vivo expressa um receptor antigênico quimérico ou
8 /141 um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
[0038] [30] Uma célula T ex vivo para uso na profilaxia ou tratamento de câncer, em que a célula T ex vivo expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
[0039] [31] Uso de um imunócito ex vivo na fabricação de um agente para a profilaxia ou tratamento de câncer, em que o imunócito ex vivo expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
[0040] [32] Uso de uma célula T ex vivo na fabricação de um agente para a profilaxia ou tratamento de câncer, em que a célula T ex vivo expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
[0041] [33] Um método para produzir um medicamento compreendendo um imunócito ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno, compreendendo uma etapa de adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
[0042] [34] Um método para produzir um medicamento compreendendo uma célula T ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno, compreendendo uma etapa de adição da nanopartícula lipídica de qualquer um de [1] a [8] a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
[Efeitos Vantajosos da Invenção]
[0043] De acordo com a presente invenção, CAR ou TCR exógeno pode ser introduzido de modo eficiente e seletivo em imunócitos, tal como células T, não
9 /141 somente ex vivo mas também in vivo, e terapia com CAR ou TCR com imunocélulas com baixo custo de produção pode ser provida. Além disso, uma vez que um vetor viral não é usado, o problema de antigenicidade por proteínas virais pode ser evitado.
[Breve Descrição dos Desenhos]
[0044] Figura 1 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo de expressão de CDI9-CAR em células T primárias humanas cultivadas transfectadas com hCD3/hCD28- composto 12 -pcDNA3.1-hCD19CAR.
[0045] Figura 2 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo de expressão de CDI9-CAR em células T primárias humanas cultivadas transfectadas com hCD3/hCD28- composto 21-pcDNA3.1-hCDI9ICAR e hCD3/hCD28- composto 35-pcDNA3.1-hCDI9CAR.
[0046] Figura 3 mostra a taxa de citotoxicidade de Nalm-6 e Daudi pela adição de células T primárias humanas cultivadas transfectadas com CD19 CAR.
(Descrição Detalhada da Invenção)
1. Nanopartícula lipídica da presente invenção (LNP'
[0047] A presente invenção fornece nanopartículas lipídicas contendo os seguintes (a) a (c): (a) um ácido nucleico codificanto um receptor antigênico quimérico (CAR) ou um receptor de célula T exógeno (TCR); (b) um lipídeo catiônico; e (c) um lipídeo não catiônico (aqui abaixo a ser também referido como “a nanopartícula lipídica da presente invenção”, “LNP da presente invenção”).
[0048] No presente relatório descritivo, a “nanopartícula lipídica (LNP)” refere-se a partículas com um diâmetro médio de menos do que 1 um e livre de uma estrutura porosa pequena (por exemplo, material mesoporoso) em um conjunto molecular constituído dos acima mencionados (b) e (c).
[0049] Os elementos constituintes (a) a (c) da nanopartícula lipídica da
/ 141 presente invenção são explicados abaixo.
(a) Ácido nucleico codificando receptor antigênico quimérico (CAR) ou receptor de célula T exógeno (TCR) (a-1) Ácido nucleico codificando CAR
[0050] CAR é uma proteína híbrida artificialmente construída contendo o domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) de um anticorpo acoplado a um domínio de transdução de sinal de célula T. CAR é caracterizada pela capacidade de utilizar a propriedade de ligação ao antígeno do anticorpo monoclonal para redirecionar a especificidade e responsividade de células T para um alvo selecionado em um modo não restrito a MHC. Reconhecimento de antígeno não restrito a MHC confere às células T expressando CAR a capacidade para reconhecer antígenos independentemente do processamento do antígeno, assim se desviando do mecanismo principal de escape do tumor. Ainda mais, quando expressada em células T, CAR com vantagem não dimeriza com a cadeia a e cadeia fº de TCR endógeno.
[0051] A CAR usada nas nanopartículas lipídicas da invenção inclui um domínio de ligação ao antígeno, um domínio de dobradiça extracelular, um domínio transmembrana, e um domínio de transdução de sinal de célula T intracelular de um anticorpo que pode especificamente reconhecer antígenos de superfície (por exemplo, peptídeo de antígeno de câncer, receptor de superfície mostrando expressão promovida em células de câncer, etc.) que o imunócito alvo (por exemplo, célula T, célula NK, célula T NK, monócito, macrófago, dendrítica célula, etc.) deveria reconhecer.
[0052] Exemplos dos antígenos de superfície especificamente reconhecidos por domínios de ligação ao antígeno incluem, mas não são limitados a, receptores de superfície mostrando expressão promovida em vários cânceres (por exemplo, câncer linfocítico agudo, rabdomiossarcoma alveolar, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral (por exemplo, meduloblastoma),, câncer de mama, câncer de ânus, canal anal ou anorretal, câncer do olho, câncer do ducto biliar inter-
11 /141 hepático, câncer nas articulações, câncer cervical, da vesícula biliar ou pleural, câncer do nariz, de cavidade nasal ou ouvido médio, câncer bucal, câncer vulvar, câncer do cólon, câncer esofageano, câncer cervical, fibrosarcoma, tumor carcinóide gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço), câncer de hipofaringe, câncer de rim, câncer de laringe, leucemia(por exemplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda), tumor líquido, câncer de fígado, câncer de pulmão(por exemplo, câncer de pulmão de célula não pequena), linfoma (por exemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin, linfoma de célula B grande difusa, linfoma folicular), mesotelioma maligno, mastocitoma, melanoma, mieloma múltiplo, câncer nasofaringeano, câncer ovariano, câncer pancreático; câncer peritoneal, omento e mesentérico; câncer faringeano, câncer da próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de pele, câncer de intestino delgado, câncer de tecido mole, tumor sólido, câncer gástrico, câncer testicular, câncer de tireóide, câncer ureteral e similares, por exemplo, CDI9, receptor de EGF, BCMA, CD30, Her2, RORI, MUCI6, CD20, mesotelina, antígeno de mutação de célula B (BCMA), CD123, CD3, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), CD33, MUC-1, CD138, CD22, GD2, PD-L1, CEA, sulfato de condroitina proteoglicano-4, cadeia a de receptor de IL-13, cadeia leve x de IgG, e peptídeos de antígeno de câncer (por exemplo, peptídeos derivados de WTI, GPC3, MART-I, gp100, NY-ESO-1, MAGE-AA, etc.).
[0053] O domínio de ligação ao antígeno usado na presente invenção não é particularmente limitado desde que seja um fragmento de anticorpo que possa especificamente reconhecer o antígeno alvo. Considerando a facilidade da preparação de CAR, um anticorpo de cadeia única (scFv) em que uma variável de cadeia leve região e uma região variável de cadeia pesada são ligadas via um ligador peptídeo é desejável. A configuração da região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada em anticorpo de cadeia única não é particularmente limitada, desde que ela possa reconstituir um domínio de ligação ao
12 /141 antígeno funcional. Elas podem ser geralmente designadas na ordem de região variável de cadeia leve, peptídeo ligador, e região variável de cadeia pesada a partir do lado N-termina. Como o peptídeo ligador, um peptídeo ligador conhecido tipicamente usado para a produção de anticorpos de cadeia única pode ser usado. Por exemplo, DNA codificando região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada pode ser preparado por clonagem do gene de cadeia leve e do gene de cadeia pesada, respectivamente, a partir de células produzindo anticorpos e realizando PCR usando as mesmas como gabaritos, ou similares, ou sintetizando quimicamente as mesmas a partir da informação de sequência de anticorpos existentes. DNA codificando um anticorpo de cadeia única pode ser obtido por ligada de cada fragmento de DNA obtido com um DNA codificando peptídeo ligador por um método apropriado. O lado N-terminal do domínio de ligação ao antígeno é preferivelmente adicionado ainda com uma sequência de leitor para apresentar CAR para a superfície do imunócito.
[0054] Como o domínio de dobradiça extracelular e domínio transmembrana, domínios derivados de molécula de superfície de célula T geralmente usados no campo técnico relevante podem ser usados como apropriado. Por exemplo, eles incluem, mas não são limitados a, domínios derivados de CD8a e CD28.
[0055] Exemplos do domínio de transdução de sinal intracelular incluem, mas não limitados a, os tendo uma cadeia CD36, os tendo adicionalmente um motivo co-estimulatório tal como CD28, CD134, CD137, Lck, DAPIO, ICOS, 4- 1BB, e similares entre o domínio transmembrana e a cadeia CD36, e os tendo dois ou mais motivos co-estimulatórios. Quaisquer domínios normalmente usados no campo técnico relevante podem ser usados em combinação.
[0056] Informação de sequência de ácido nucleico codificando domínio de dobradiça extracelular, domínio transmembrana, e domínio de sinalização intracelular é bem conhecida no campo técnico relevante. Os versados na técnica podem obter facilmente fragmentos de DNA codificando cada domínio a partir de
13 /141 células T com base em tal informação.
[0057] DNA codificando CAR pode ser obtido por ligação de fragmentos de DNA respectivamente codificando o antígeno domínio de ligação assim obtido, domínio de dobradiça extracelular, domínio transmembrana, e domínio de transdução de sinal intracelular, por um método convencional.
[0058] O DNA obtido codificando CAR pode ser inserido em um vetor de expressão, preferivelmente um vetor de plasmídeo contendo um promotor funcional em células T, como ele é ou após adicionar um ligador apropriado e/ou sinal de translocação nuclear e similares. Exemplos do promotor funcional em células T incluem, mas não são limitados a, promotor SRoa constitutivo em células de mamíferos, promotor de SV40, promotor de LTR, promotor de CMV (citomegalovírus), promotor de RSV (vírus do sarcoma de Rous), LTR de MoMuLV (vírus de leucemia de macaco Moloney), promotor de HSV-TK (timidina quinase do vírus de herpes simples) e similares. Além disso, promotores de genes, tal como CD3, CDA4, e CD8, que são especificamente expressados em células T, também podem ser usados.
[0059] RNA codificando CAR, preferivelmente mRNA, pode ser preparado por transcrição em mRNA em um sistema de transcrição in vitro conhecido per se usando um vetor de expressão contendo DNA codificando CAR acima mencionado como um gabarito.
(2-2) Ácido nucleico codificando TCR exógeno
[0060] No presente relatório descritivo, o “receptor de célula T (TCR)” significa um receptor que consiste de dímeros da cadeia de TCR (cadeia a, cadeia B) e reconhece um antígeno ou o complexo antígeno-HLA (antígeno de tipo de leucócito humano) (MHC; complexo histocompatibilidade principal) e transduz um sinal estimulatório para as células T. Cada uma das cadeias de TCR consiste em uma região variável e uma região constante, e a região variável contém três regiões de determinação de complementaridade (CDR1, CDR2, CDR3). O TCR usado na presente invenção inclui não somente os em que as cadeias a e B do TCR
14 /141 constituem um heterodímero, mas também os em que eles constituem um homodímero. Ainda mais, o TCR inclui os com uma parte ou todas as regiões constantes deletadas, os com sequência aminoácido recombinada, e os com TCR solúvel, e similares.
[0061] O “TCR exógeno” significa ser exógeno para célula T, que é a célula alvo da nanopartícula lipídica da presente invenção. A sequência de aminoácido do TCR exógeno pode ser igual como ou diferente da do TCR endógeno expressado por célula T, que é a célula alvo da nanopartícula lipídica da presente invenção.
[0062] O ácido nucleico codificando TCR usado na nanopartícula lipídica da invenção é um ácido nucleico codificando a cadeia a e a cadeia B de TCR que pode especificamente reconhecer antígenos de superfície (por exemplo, peptídeo de antígeno de câncer etc.) a serem reconhecidos pela célula T alvo.
[0063] O ácido nucleico pode ser preparado por um método conhecido per se. Quando a sequência de aminoácido ou sequência de ácido nucleico do TCR desejado é conhecida, um DNA codificando o comprimento completo ou uma parte do TCR da presente invenção pode ser construído com base na sequência por, por exemplo, quimicamente sintetizando uma fita de DNA ou uma fita de RNA, ou conectando uma fita curta de oligo-DNA sintetizada, se sobrepondo parcialmente, pelo método de PCR ou o método de montagem Gibson.
[0064] Quando a sequência do TCR desejado não é conhecida, por exemplo, a célula T de interesse é isolada de uma população de células contendo a célula T expressando um TCR de interesse, e um ácido nucleico codificando o TCR pode ser obtido a partir da célula T. Especificamente, uma população de células (por exemplo, PBMC) contendo células T é coletada a partir de um organismo (por exemplo, humano), a população de células é cultivada na presença de epítopos de antígenos de superfície de célula reconhecidos pelo TCR alvo enquanto estimulando a população de células, e célula T que especificamente reconhece células expressando o antígeno de superfície de célula pode ser
/141 selecionada a partir da população de células por um método conhecido e usando, como índices, especificidade para células expressando o antígeno de superfície de células e antígenos de superfície de célula tal como CD8 e CDA4. A especificidade para células expressando o antígeno de superfície de células de células T pode ser medida, por exemplo, por ensaio dextromer, ensaio ELISPOT, ensaio citotóxico, ou similares. A população de células acima mencionada contendo células T é preferivelmente coletada a partir de, por exemplo, um organismo tendo um número grande de células expressando um antígeno de superfície de células reconhecido por um TCR de interesse (por exemplo, paciente com uma doença tal como câncer, ou população contendo célula T contatada com um epítopo do antígeno ou células dendríticas pulsadas com o epítopo).
[0065] O ácido nucleico da presente invenção pode ser obtido por extração do DNA a partir da célula T isolada acima mencionada por um método convencional, amplificando e clonando o gene de TCR com base na sequência de ácido nucleico da região constante do TCR usando o DNA como um gabarito. Ele também pode ser preparado por extração do RNA a partir de uma célula e sintetizando o cDNA por um método convencional, e realizando 5”-RACE (amplificação rápida de extremidades de cCDNA) com o cDNA como gabaritos usando iniciadores antissenso complementares para os ácidos nucleicos respectivamente codificando as regiões constantes da cadeia a e cadeia 8 de TCR. 5"-RACE pode ser realizado por um método conhecido e pode ser realizado, por exemplo, usando um Kkit comercialmente disponível tal como o kit SMART PCR cDNA Synthesis Kit (fabricado por clontech). O DNA codificando a cadeia a e a cadeia B do TCR obtido pode ser inserido em um vetor de expressão apropriado do mesmo modo que o DNA codificando a CAR acima mencionada. O DNA codificando cadeia a e o DNA codificando cadeia B podem ser inseridos no mesmo vetor ou em vetores separados. Quando inserido no mesmo vetor, o vetor de expressão pode expressar ambas as fitas em um modo policistrônico ou monocistrônico. No primeiro caso, uma sequência interveniente que permite
16 /141 expressão policistrônica, tal como IRES ou FMV 2A, é inserida entre o DNA codificando ambas as fitas.
[0066] Além disso, RNA codificando cada fita do TCR, preferivelmente mMRNA, pode ser preparado do mesmo modo como o RNA acima mencionado codificando CAR, por exemplo, usando o vetor de expressão como um gabarito.
(b) Lipídeo catiônico
[0067] No presente relatório descritivo, o “lipídeo catiônico” significa um lipídeo que tem uma carga positiva líquida em um pH selecionado, tal como pH fisiológico. Os lipídeos catiônicos usados na nanopartícula lipídica da presente invenção não são particularmente limitados. Por exemplo, lipídeos catiônicos e similares descritos em WO 2015/011633, WO 2016/021683, WO 2011/153493, WO 2013/126803, WO 2010/054401, WO 2010/042877, WO 2016/104580, WO 2015/005253, WO 2014/007398, WO 2017/117528, WO 2017/075531, WO 2017/00414, WO 2015/199952, US 2015/0239834, e similares podem ser mencionados.
[0068] Os lipídeos catiônicos preferidos são representados pelas seguintes fórmulas estruturais e descritos em WO 2015/011633.
CODES rea
VT ACOOODQOS oa,
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18 /141 | q " MNsó do, — o — SS — | | ? = Ava A, mo | o e Mp, SRA o = SW NA, — | | o = SST - | H | o " Ao =
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AEE ea AFA =
/ 141 o x oo o SWOSDOOSO = | — | o -N RS, | o " -N Area o SS SN Ato = d e x“ N ACE ! e sais dos mesmos.
[0069] Dentre os lipídeos catiônicos acima mencionados, lipídeos catiônicos representados pelas seguintes fórmulas estruturais são mais preferidos.
21 /141 tendo anta ponto on anna ato, ' ' o | x“ —— Na ' — !
MATCEC ACE | o pata ! => ==.
O x 2H Ss
HAS SATOC AA MA SATA Ss o.
mo UC REEOOS | ARRSSS AI, pd penha ha e o Sarre, am. | e sais dos mesmos.
[0070] O lipídeo catiônico preferido é representado pela seguinte fórmula
22 /141 estrutural e descrito em WO 2016/021683. Um composto representado por RA v 2 Os e o XL O. oo É mea w Y su o o ne! FÊ ia Le x. Re? em que W é a fórmula -NR'Rº ou a fórmula -N'RRRÍi(Z), R' e R? são, cada, independentemente um grupo C14 alquila ou um átomo de hidrogênio, Rô, R e R são, cada, independentemente um grupo C14 alquila, Z é um ânion, X é um grupo C + alquileno opcionalmente substituído, Y4, YE e YC são, cada, independentemente um grupo metina opcionalmente substituído, L, 1º e Lº são, cada, independentemente um grupo metileno opcionalmente substituído ou uma ligação, e Rº!, Rº, RE!, REº, Rº! e RO são, cada, independentemente um grupo Ca109 alquila opcionalmente substituído, ou um sal dos mesmos.
[0071] Mais preferivelmente, lipídeos catiônicos representados pelas seguintes fórmulas estruturais podem ser mencionados.
23 /141 e o Í o
AAA o TS (composto 1) o
VE
AA OS | o q— (composto 2) apl o o
A AÃO E o CO (composto 3)
24 /141 o o o CO (composto 4) o d o. o o
ATOS (composto 5) dE Ó o
AO OOO | J í o CO (composto 6)
/141
AO : IL, | " : o o TOS (composto 7) o.
EA > SS
É DANA | LOCO. o (composto 8)
VOO o AA dd. | AA (composto 9) e
26 / 141 o Í o Ada o do (composto 10) e sais dos mesmos.
[0072] Dentre os lipídeos catiônicos acima mencionados, lipídeos catiônicos mais preferidos são representados pelas seguintes fórmulas estruturais. Ó o À o e a A
AACS o AOS (composto 1) : LLC, | O, o” TO. 7) e
O.
A > L O. o
FP OA | de o (composto 8) e sais dos mesmos.
[0073] Em outra modalidade preferível, um lipídeo catiônico representado para seguinte fórmula (II) (aqui abaixo a ser também referido como “composto (ID”) pode ser mencionado. Um composto representado por
PRI OS O O
MAINE Sae | O MDA R O (1) em que n é um inteiro de 2 a 5, R é um grupo C.5 alquila linear, um grupo C;.1, alquenila linear ou um grupo Cy, alcadienila linear, e linhas onduladas mostram, cada, independentemente, uma ligação de tipo cis ou tipo trans, ou um sal dos mesmos.
[0074] Mais preferivelmente, lipídeos catiônicos representados pelas seguintes fórmulas estruturais podem ser mencionados.
28 /141 O. —
YO “SN o Aeee | o: s TIA (composto 11) O. — Ty IOsOOS
N SL 2 O (composto 12) o. —
YZ OO “N Oo AA
A YJOOOFOSO (composto 13) o =——
YO “sp ST | OG s TOO posto 14) O. —
YO OAOS | Ann AA o OO Croso 1)
29 /141 o. — FF IOsOS AN ço Sae FO got " o —
TT r N — SG TIO ng o) o. =
TZ TOO E ú A LS FIA (composto 18) o — 3 TOO “N (o) LS
E TOA (composto 19) o — 3 TOO x Oo sola amena
DO TOO (composto 20) e
/ 141 o —
FIOS | TIO (composto 21) e sais dos mesmos.
[0075] Dentre os lipídeos catiônicos acima mencionados, lipídeos catiônicos mais preferidos são representados pelas seguintes fórmulas estruturais. o. a
FNAS OO “o o ke AE | AA s TIO (composto 11) o. —
TT OO N (9) Aa rea , ON (composto 12) e ( o. — DES ad “ ST
O TIO (composto 21) e sais dos mesmos.
[0076] O composto (II) pode ser produzido, por exemplo, pelo seguinte método de produção. Dentre os compostos (II), ambos um composto em que ambas as linhas onduladas são ligações de tipo cis e um composto em que uma ou ambas
31 /141 das linhas onduladas são ligações de tipo trans, podem ser produzidos por um método de produção similar para o mostrado abaixo.
Em particular, composto (ID) com uma estrutura desejada pode ser sintetizado usando materiais de partida apropriados, de acordo com a estrutura do composto (II) desejado no processo de esterificação.
O sal de composto (II) pode ser obtido por mistura apropriada com uma base inorgânica, uma base orgânica, um ácido orgânico, um aminoácido básico ou ácido.
32 /141 2 ED í ) S $ , ( ço 45 E 245 Ed dO bl ã, 3 1433 dE Soa J : 35 ado 4 $i job nb dá, BE o SS do (BE Ú h = É o” NX /* É 1) do , Vó 1 13) 2 sao ft. so E i to Edo, de H z : 2 a * cá z 2º ds ») Í, ir 3 co agN TS j VV CNA NNNOs! a queda ha dn, 5) 3 % ; º SÉ ) 24 IA TINA LL dada 54 NS Li E a: te À eso e | AS N / 1 ; t = /g MA 2 53 $ - ee 7, $ AIEA cubo) 1 EUA: da ARA ven 3; 4 Pia do O 8 k É DERSES ido & EO EN É So 7 * FA i i 2
33 /141
[0077] Um material de partida ou um reagente usado em cada etapa no método de produção acima mencionado, assim com o composto obtido, podem formar cada um sal.
[0078] Quando o composto obtido em cada etapa é um composto livre, este composto pode ser convertido em um sal de interesse por um método conhecido per se na técnica. Ao contrário, quando o composto obtido em cada etapa é um sal, este sal pode ser convertido em uma forma livre ou outro tipo de sal de interesse por um método conhecido per se na técnica.
[0079] O composto obtido em cada etapa pode ser usado na próxima reação diretamente na forma de sua solução de reação solução ou após ser obtido como um produto bruto. Alternativamente, o composto obtido em cada etapa pode ser isolado e/ou purificado a partir da mistura de reação por uma abordagem de separação tal como concentração, cristalização, recristalização, destilação, extração com solvente, fracionamento, ou cromatografia de acordo com um método de rotina.
[0080] Se um material de partida ou um composto reagente para cada etapa é comercialmente disponível, o produto comercialmente disponível pode ser usado diretamente.
[0081] Na reação de cada etapa, o tempo de reação pode diferir dependendo do reagente ou do solvente usado e é geralmente de 1 min a 48 h, preferivelmente 10 min a 8 h, salvo especificado ao contrário.
[0082] Na reação de cada etapa, a temperatura de reação pode diferir dependendo do reagente ou do solvente usado e é geralmente -78ºC a 300ºC, preferivelmente -78ºC a 150ºC, salvo especificado ao contrário.
[0083] Na reação de cada etapa, a pressão pode diferir dependendo do reagente ou do solvente usado e é geralmente 1 atm a 20 atm, preferivelmente 1 atma3
[0084] Na reação de cada etapa, por exemplo, um aparelho de síntese de micro-ondas, tal como um Biotage Initiator pode ser usado. A temperatura de
34 /141 reação pode diferir dependendo do reagente ou do solvente usado e é geralmente de temperatura ambiente a 300ºC, preferivelmente de temperatura ambiente a 250ºC, mais preferivelmente 50ºC a 250ºC, salvo especificado ao contrário. O tempo de reação pode diferir dependendo do reagente ou do solvente usado e é geralmente 1 min a 48 h, preferivelmente 1 min a 8 h, salvo especificado ao contrário.
[0085] Na reação de cada etapa, o reagente é usado a 0,5 equivalentes a 20 equivalentes, preferivelmente 0,8 equivalentes a 5 equivalentes, com relação ao substrato, salvo especificado ao contrário. No caso de usar o reagente como um catalisador, o reagente é usado a 0,001 equivalentes a 1 equivalente, preferivelmente 0,01 equivalentes a 0,2 equivalentes, com relação ao substrato. Quando o reagente também serve como um solvente de reação, o reagente é usado na quantidade do solvente.
[0086] Em cada etapa de uma reação, a reação é realizada sem um solvente ou por dissolução ou suspensão em um solvente apropriado, salvo especificado ao contrário. Os exemplos específicos do solvente incluem os seguintes.
álcoois: metanol, etanol, isopropanol, isobutanol, álcool terc- butilico, 2-metoxietanol e similares; éteres: éter dietílico, éter di-isopropílico, éter difenílico, tetrahidrofurano, 1,2-dimetoxietano e similares; hidrocarbonoetos aromáticos: clorobenzeno tolueno xileno e similares; hidrocarbonoetos saturados: ciclohexano, hexano, heptano e similares; amidas: N N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona e similares; hidrocarbonoetos halogenados: diclorometano, tetracloreto de carbonoo e similares; nitrilas: acetonitrila e similares; sulfóxido: dimetil sulfóxido e similares;
/141 bases orgânicoas aromáticas: piridina e similares; anidridos de ácido: anidrido acético e similares; ácidos — orgânicos: ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético e similares; ácidos inorgânicos: ácido clorídrico, ácido sulfúrico e similares; ésteres: acetato de etila, éster de acetato de isopropila e similares; cetonas: acetona, metiletil cetona e similares; água.
[0087] Dois ou mais destes solventes podem ser usados como uma mistura em uma razão apropriada.
[0088] Em cada etapa de reação fazendo uso de uma base, exemplos de bases que podem ser usadas são as listadas abaixo.
bases inorgânicas: hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de magnésio e similares; sais básicos: carbonoato de sódio, carbonoato de cálcio, hidrogênico carbonoato de sódio e similares; bases — orgânicas: trietilamina, dietilamina, piridinay 4 dimetilaminopiridina, N,N-dimetilanilina, 1,4-diazabiciclo [2.2.2]octano, 1,8- diazabiciclo [5.4.0]-7-undeceno, imidazol, piperidina e similares; alcóxidos de metal: etóxido de sódio, terc-butóxido de potássio, terc-butóxido de sódio e similares; hidretos de metal alcalino: hidreto de sódio e similares; amidas de metal: amida de sódio, di-isopropilamida de lítio, hexametildisilazida de lítio e similares; lítios orgânicos: n-butil lítio, sec-butil lítio e similares.
[0089] Em cada etapa de reação fazendo uso de um ácido ou catalisador de ácido, os seguintes ácidos ou catalisadores de ácido são usados.
ácidos inorgânicos: ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico e similares;
36 /141 ácidos orgânicos: ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido p-toluenossulfônico, ácido 10-camphor sulfônico e similares; ácido de Lewis: complexo trifluoreto de boro éter dietílico, iodeto de zinco, cloreto de alumínio anidro, cloreto de zinco anidro, cloreto de ferro anidro e similares.
[0090] Salvo especificado ao contrário, cada etapa de reação pode ser realizada de acordo com um método padrão conhecido per se na técnica, tal como os descritos em Jikken Kagaku Koza (Enciclopedia of Experimental Chemistry in English), 5a. Ed., Vol. 13 to Vol. 19 (editada pela Chemical Society of Japan); Shin Jikken Kagaku Koza (New Enciclopedia of Experimental Chemistry in English), Vol. 14 a Vol. 15 (editada pela Chemical Society of Japan); Fine Organic Chemistry, 2a. Ed. Revista (L. F. Tietze, Th. Eicher, Nankodo); Organic Name Reactions; A reaction Mechanism and Essence, Revista (Hideo Togo, Kodansha); Organic Syntheses Collective Volume I-VII (John Wiley & Sons, Inc.); Modem Organic Synthesis in the Laboratory: A Collection of Standard Experimental Procedures (Jie Jack Li, Oxford University Press); Comprehensive Heterocyclic Chemistry III, Vol. 1 a Vol. 14 (Elsevier Japan KK); Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis (traduzido por Kiyoshi Tomioka, Kagaku- Dojin Publishing); Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers, Inc.), 1989; etc.
[0091] Em cada estapa, a reação de proteção ou desproteção de um grupo funcional pode ser realizada de acordo com um método conhecido per se na técnica, por exemplo, um método descrito em “Protective Groups in Organic Synthesis, 4º. Ed.” (Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts), Wiley-Interscience, 2007; “Protecting Groups, 3a. Ed.” (P.J. Kocienski) Thieme, 2004); etc.
[0092] Exemplos de um grupo protetor para um grupo hidróxi ou um grupo hidróxi fenólico em álcoois ou similares incluem: grupos protetores de tipo éter, tal como metoximetil éter, benzil éter, p-metoxibenzil éter, t-butildimetilsilil éter, t-butildifenilsilil éter, e tetrahidropiranil éter; grupos protetores de tipo de éster
37 /141 de ácido carboxílico, tal como éster de ácido acético; grupos protetores de tipo de éster de ácido sulfônico tal como éster de ácido metanossulfônico; e grupos protetores de tipo de éster de ácido carbônico, tal como carbonato de t-butila.
[0093] Exemplos de um grupo protetor para um grupo carbonila em aldeídos incluem: grupos protetores de tipo acetal tal como dimetilacetal; e grupos protetores de tipo acetal cíclico tal como 1,3-dioxano cíclico.
[0094] Exemplos de um grupo protetor para um grupo carbonila em cetonas incluem: grupos protetores de tipo cetal, tal como dimetilcetal; grupos protetores de tipo cetal cíclico, tal como 1,3-dioxano cíclico; grupos protetores de tipo oxima, tal como O-metiloxima; e grupos protetores de tipo hidrazona, tal como N,N-dimetilhidrazona.
[0095] Exemplos de um grupo protetor para um grupo carboxila incluem: grupos protetores de tipo éster, tal como metil éster; e grupos protetores de tipo amida, tal como N,N-dimetilamida.
[0096] Exemplos de um grupo protetor para tiol incluem: grupos protetores de tipo éter tal como benzil tivéter; e grupos protetores de tipo éster, tal como éster de ácido tioacético, tiocarbonato e tiocarbamato.
[0097] Exemplos de um grupo protetor para um grupo amino ou heterociclo aromático, tal como imidazol, pirrol ou indol incluem: grupos protetores de tipo carbamato, tal como benzil carbamato; grupos protetores de tipo amida tal como acetamida; grupos protetores de tipo alquilamina, tal como N- trifenilmetilamina; e grupos protetores de tipo sulfonamida, tal como metanossulfonamida.
[0098] Os grupos protetores pode ser removidos para uso de um método conhecido per se na técnica, por exemplo, um método usando um ácido, uma base, luz ultravioleta, hidrazina, fenilhidrazina, N-metilditiocarbamato de sódio, fluoreto de tetrabutilamônio, acetato de paládio ou haleto trialquilsilila (por exemplo, iodeto de trimetilsilila ou brometo de trimetilsilila), ou um método de redução.
[0099] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de redução, exemplos
38 /141 de agentes redutores que podem ser usados incluem: hidretos de metal tal como hidreto de lítio alumínio, triacetoxiboroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio, hidreto de diisobutil! alumínio (DIBAL-H), Dboroidreto de sódio e triacetoxiboroidreto de tetrametilamônio; boranos tal como complexo borano- tetraidrofurano; níquel de Raney; cobalto de Raney; hidrogênio; e ácido fórmico. Por exemplo, níquel de Raney ou cobalto de Raney podem ser usados na presença de hidrogênio ou ácido fórmico. No caso de reduzir uma dupla ligação carbono- carbono ou tripla ligação, um método usando um catalisador tal como paládio- carbono ou catalisador de Lindlar pode ser usado.
[00100] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de oxidação, exemplos de agentes oxidantes, que podem ser usados, incluem: perácidos tal como ácido m- cloroperbenzóico (MCPBA), peróxido de hidrogênio e hidroperóxido de t-butila; percloratos tal como perclorato de tetrabutilamônio; cloratos tal como clorato de sódio; cloritos tal como clorito de sódio; periodatos tal como periodato de sódio; reagentes de iodo de alta valência, tal como iodosilbenzeno; reagentes de mangânes, tal como dióxido de manganês e permanganato de potássio; reagentes de chumbo, tal como tetraacetato de chumbo; reagentes de cromo, tal como piridinium clorocromato de piridínio (PCC), dicromato de piridínio (PDC) e reagente de Jones; compostos de halogênio, tal como N-bromossuccinimida (NBS); oxigênio; ozônio; complexo trióxido de enxofre-piridina; tetróxido de ósmio; dióxido de selênio; e 2,3-dicloro-5,6-diciano-1 4-benzoquinona (DDQ).
[00101] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de ciclização de radical, exemplos de iniciadores de radical que podem ser usados incluem: compostos azo tal como azobisisobutironitrila (AIBN); iniciadores de radical solúveis em água, tal como ácido 4-4º-azobis-4-cianopentanóico (ACPA); trietilboro na presença de ar ou oxigênio; e peróxido de benzoíla. Exemplos de iniciadores de radical a serem usados incluem tributilestanano, tristrimetilsililsilano, 1,1,2,2-tetrafenildissilano, difenilsilano e iodeto de samário.
[00102] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de Wittig, exemplos de
39 /141 reagentes de Wittig que podem ser usados incluem alquilidenofosforanos. Os alquilidenofosforanos podem ser preparados por um método conhecido per se na técnica, por exemplo, a reação entre um sal de fosfônio e uma base forte.
[00103] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de Horner-Emmons, exemplos de reagentes que podem ser usados incluem ésteres de ácido fosfonoacético, ésteres de ácido tal como dimetilfosfonoacetato e metila edietilfosfonoacetato de etila, e bases tal como de hidretos de metal alcalino e lítios orgânicos.
[00104] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de Friedel-Crafts, exemplos de reagentes que podem ser usados incluem um ácido de Lewis e um cloreto de ácido ou agente alquilante (por exemplo, haletos de alquila, álcoois e olefinas). Alternativamente, um ácido orgânico ou inorgânico pode ser usado em vez do ácido de Lewis, e anidridos de ácido tal como anidrido acético pode ser usado em vez do cloreto de ácido.
[00105] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de substituição nucleofílica aromática, um nucleófilo (por exemplo, amina ou imidazol) e uma base (por exemplo, sal básico ou base orgânica) pode ser usada como reagentes.
[00106] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de adição nucleofílica usando um carbânion, reação de adição 1,4-nucleofílica (reação de adição de Michael) usando um carbânion, ou reação de substituição nucleofílica usando um carbânion, exemplos de bases que podem ser usados para gerar o carbânion incluem reagentes de organolítio, alcóxidos de metal, bases inorgânicas e bases orgânicas.
[00107] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de Grignard, exemplos de reagentes de Grignard que podem ser usados incluem haletos de aril magnésio tal como brometo de fenil magnésio, e haletos de alquil magnésio tal como brometo de metil magnésio, brometo de isopropilmagnésio. O reagente de Grignard pode ser preparado por um método conhecido per se na técnica, por exemplo, a reação entre um haleto de alquila ou haleto de arila e metal magnésio em éter ou tetraidrofurano
40 / 141 como um solvente.
[00108] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de condensação de Knoevenagel, um composto metileno ativo flanqueado por dois grupos de atração de elétrons (por exemplo, ácido malônico, malonato de dietila ou malononitrila) e uma base (por exemplo, bases orgânicas, alcóxidos de metal ou bases inorgânicas) podem ser usados como reagentes.
[00109] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de Vilsmeier-Haack, cloreto de fosforila e um derivado de amida (por exemplo N,N-dimetilformamida) podem ser usados como reagentes.
[00110] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de azidação de álcoois, haletos de alquila ou ésteres de ácido sulfônico, exemplos de agentes azidatantes que podem ser usados incluem difenilfosforolazida (DPPA), trimetilsililazida e sódio azida. No caso de azidação, por exemplo, álcoois, um método usando difenilfosforilazida e 1,8-diazabiciclo[5,4,0]Jundec-7-eno (DBU), um método usando trimetilsililazida e ácidos de Lewis, ou similares podem ser usados.
[00111] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de aminação redutora, exemplos de agentes redutores que podem ser usados incluem triacetoxiboroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio, hidrogênio e ácido fórmico. Quando o substrato é um composto amina, exemplos de compostos carbonila que podem ser usados incluem p-formaldeído assim como aldeídos tal como acetaldeído e cetonas, tal como ciclohexanona. Quando o substrato é um composto carbonila, exemplos de aminas que podem ser usados incluem aminas primárias, tal como amônia e metilamina, e aminas secundárias, tal como dimetilamina.
[00112] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de Mitsunobu, ésteres de ácido azodicarboxílico (por exemplo azodicarboxilato de dietila (DEAD) e azodicarboxilato de di-isopropila (DIAD)) e trifenilfosfino podem ser usados como reagentes.
[00113] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de esterificação, amidação ou ureiação, exemplos de reagentes que podem ser usados incluem
41 /141 haletos de acila, tal como cloretos de ácido ou brometos de ácido e ácidos carboxílicos ativados, tal como anidridos de ácido, ésteres ativos ou ésteres de sulfato. Exemplos dos agentes ativantes para ácidos carboxílicos incluem: agentes de condensação de carbodi-imida tal como hidrocloreto de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodi-imida (WSCD); agentes de condensação de triazina, tal como n-hidrato de cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-11)-4- metilmorfolínio (DMT-MM); agentes de condensação de éster de ácido carbônico, tal como 1,1I-carbonoildi-imidazol (CDD; difenilfosforilazida (DPPA); sal de benzotriazol-1-iloxi-trisdimetilaminofosfônio (reagente de BOP); iodeto de 2-cloro- I1-metil-piridínio (reagente de Mukaiiama); cloreto de tionila; haloformato de alquila inferior, tal como cloroformato de etila, hexafluorofosfato de O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N' N -tetrametilurônio (HATU); ácido sulfúrico; e combinações dos mesmos. No caso de usar um agente de condensação de carbodi- imida, a adição de um aditivo tal como I-hidroxibenzotriazol (HOBt), N- hidroxissucinimida (HOSu) ou dimetilaminopiridina (DMAP) para a reação pode ser benéfica.
[00114] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de copulação, exemplos de catalisadores de metal que podem ser usados incluem compostos de paládio tal como acetao de paládio (ID, tetraquis(trifenilfosfino)paládio — (O), diclorobis(trifenilfosfino) paládio (ID, diclorobis(trietilfosfino) paládio (ID, tris(dibenzilidenoacetona) dipaládio(O), cloreto de 1,1 -bis(difenilfosfino) ferroceno paládio (ID) e acetato de paládio(ID; compostos de níquel, tal como tetraquis(trifenilfosfino)níquel (0); compostos de ródio tal como cloreto de tris(trifenilfosfino)ródio(IID); compostos de cobalto; compostos de cobre tal como óxido de cobre e iodeto de cobre (1); e compostos de platina. Adição de uma base para a reação também pode ser benéfica. Exemplos de tais bases incluem bases inorgânicas e sais básicos.
[00115] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de tiocarbonilação, pentassulfeto é tipicamente usado como um agente de tiocarbonilação. Um
42 /141 reagente tendo uma estrutura de 1,3,2,4-ditiadifosfetano-2 4-dissulfeto tal como 2 4-bis(4-metoxifenil-1,3,2,4-ditiadifosfetano-2,4-dissulfeto (reagente de Lawesson) pode ser usado em vez de pentassulfeto de difósforo.
[00116] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de Wohl-Ziegler, exemplos de agentes halogenantes que podem ser usados incluem N- iodosuccinimida, N-bromosuccinimida (NBS), N- clorosuccinimida (NCS), bromo e cloreto de sulfurila. A reação pode ser acelerada pela outra adição de um iniciador de radical tal como calor, luz, peróxido de benzoila ou azobisisobutironitrila.
[00117] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de halogenação de um grupo hidroxi, exemplos de agentes halogenantes que podem ser usados incluem um ácido hidroálico ou o haleto de ácido de um ácido inorgânico; exemplos incluem ácido clorídrico, cloreto de tionila, e oxicloreto de fósforo para a cloração e 48% ácido bromídrico para bromação. Além disso, um método para obter um haleto de alquila a partir de um álcool pela ação de trifenilfosfino e tetracloreto de carbono ou tetrabrometo de carbono, etc, também pode ser usado. Alternativamente, um método para sintetizar um haleto de alquila através de uma reação de duas etapas envolvendo a conversão de um álcool em um éster de ácido sulfônico e subsequente reação com brometo de lítio, cloreto de lítio ou iodeto de sódio também pode ser usado.
[00118] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de Arbuzov, exemplos de reagentes que podem ser usados incluem haletos de alquila tal como acetato de bromoetila, e fosfitos tal como trietilfosfito e trif(isopropil)fosfito.
[00119] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de esterificação de sulfona, exemplos do agente sulfonilante usado incluem cloreto de metanossulfonila, cloreto de p-toluenossulfonila, anidrido metanossulfônico e anidrido p-toluenossulfônico e anidrido trifluorometanossulfônico.
[00120] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de hidrólise, um ácido ou uma base pode ser usado como um reagente. No caso de realizar a reação de hidrólise ácida de um éster de t-butila, reagentes tal como ácido fórmico,
43 / 141 trietilsilano ou similares podem ser adicionados para coletar de modo redutivo o sub-produto cátion de t-butila.
[00121] Em cada etapa fazendo uso de uma reação de desidratação, exemplos de agentes desidratantes que podem ser usados incluem ácido sulfúrico, pentaóxido de difósforo, oxicloreto de fósforo, N,N'-diciclohexilcarbodi-imida, alumina e ácido polifosfórico.
[00122] Em outra modalidade preferível, um lipídeo catiônico representado pela seguinte fórmula (III) (aqui abaixo a ser também referido como “composto (IID”) pode ser mencionado. Um composto representado por Re Rf Rd | o O Re
AA dO ha "Rb o Are (Im) em que nl é um inteiro de 2 a 6, n2 é um inteiro de 0 a 2, n3 é um inteiro de 0 a 2, L é -C(0)O- ou -NHC(0)O-, Ra é um linear Cs.13 alquila grupo, um grupo C13.17 alquenila linear ou um grupo Ci; alcadienila linear, Rb é um grupo C>.9 alquila linear, Rc é um átomo de hidrogênio ou um grupo C>.º alquila linear, Rd é um átomo de hidrogênio ou um grupo C>.+ alquila linear, Re é um grupo C>. alquila linear, e
44 /141 Rf é um grupo C>. alquila linear, ou um sal dos mesmos.
[00123] Mais preferivelmente, a seguinte fórmula estrutural representada pelo lipídeo catiônico pode ser mencionada. CH; qo Ju Hs eo A So CH; CHz3 FO (composto 22) CH; Se o HC o Set Es CH; TOO (composto 23) CH;z
LS e Ae Hs e sm doe CH; CH; LIT (composto 24) CH; Sor o HC, Oo de o de, es AH (composto 25)
45 / 141 CH; O. CHz3 o qo CH N o. o : H3C' ON CH A EH (composto 26) CcH3 o SAO, CH3 ANNA eta (composto 27) CcH3
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S net a lo as CHz Ae, (composto 28) CH3 o Pa A AA EH; CHz3 A TO (composto 29) CH;
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46 / 141 CcH3 Ae : A A o CHz3 CH; UE (composto 31) CcH;3
AC HC. e CcHz3 E CH3 pe (composto 32) CH; o CHz di e ETA à ' ee ação E CcH;3 Daliaiihaeei (composto 33) CcH3 o. CH; CHs o CH;
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V set ços CH; sara (composto 35)
47 [141 CH;
AC q Le ' et ço CH; Wo (composto 36) CH; o. CH; o A EA, ' Bo aço E CHz CH; FO (composto 37) CH; o. CH;
V set ços CH; CH; A (composto 38) e CH;
FAC Hey No o CH; CH; vs CH; FO (composto 39) e sais dos mesmos.
[00124] Dentre os lipídeos catiônicos acima mencionados, um lipídeo catiônico representado pela seguinte fórmula estrutural é mais preferível. CcH3
ÍT Hs As CH CcH3 Em (composto 31) e
48 / 141 CH3 o" N era o CH; O rr Ha Ó (composto 35) e sais dos mesmos.
[00125] O composto (III) pode ser fabricado, por exemplo, pelos seguintes métodos de produção. Particularmente, composto (1) com a estrutura desejada pode ser sintetizado usando materiais de partida apropriados, de acordo com a estrutura do composto desejado (III) no processo de esterificação. O sal de composto (III) pode ser obtido por mistura apropriada com uma base inorgânica, uma base orgânica, um ácido orgânico, ou um aminoácido básico ou ácido.
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52 /141 nas fórmulas acima, P!, P?, P?, P%, Pº e Pº são cada independentemente grupos protetores, composto (A) é HO. -R 4 a fórmula: Ã * , composto (B) é o Ho Ri Re a fórmula: YO RÉ E , composto (C) é o Rb Rd Rd a fórmula: OA Re , Ré A e o os outros símbolos são como definidos acima.
[00126] Os materiais de partida e reagentes usados nas reações de cada etapa no método de produção acima mencionado, assim como as condições de reação, podem ser iguais que os descritos acima no método de produção para composto (II).
[00127] Em outra modalidade, podem ser mencionados lipídeos catiônicos representados pelas seguintes fórmulas estruturais e descritos em WO 2011/153493. Io O “w ONO OOOOOOÇ O " o O 1 o TOA o o OATCOOGOSS Ad A Ao, ' o o aCOOOOSOSOS:. ADA 5
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A o AR ag a IR a e sais dos mesmos.
[00128] Dentre os lipídeos catiônicos acima mencionados, lipídeos catiônicos representados pelas seguintes fórmulas estruturais são mais preferíveis..
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A ã o O Sas/A ADA
ACERTE ão COOEt q TOA OCO aa ! ASA DSADSAFASADÔADN AS AC 00Me e sais dos mesmos.
[00129] Em outra modalidade, lipídeos catiônicos representados pelas seguintes fórmulas estruturais e descritos em WO 2013/126803 podem ser mencionados.
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[00130] Dentre os lipídeos catiônicos acima mencionados, um lipídeo catiônico representado pela seguinte fórmula estrutura é mais preferível. o E— seo o — e um sal dos mesmos.
[00131] Em outra modalidade, lipídeos catiônicos K-E12, H-A1l2, Y-E1l2, G-O12, K-Al2, R-Al2, cKK-E1l2, cPK-El12, PKIK-E12, PK500-E12, cQK- E12, cKK-Al2, KK-Al2, PK-4K-E12, cWK-E12, PK500-012, PKIK-OL2, CY K-E12, cDK-E12, cSK-E12, cEK-E12, cMK-E12, cKK-O12, cIK-El2, cKK- E10, cKK-El4, e cKK-El6 sintetizados pelo seguinte esquema descrito em
109 / 141 Dong et al. (Proc Natl Acad Sci US A. 2014 Apr 15; 111(15):5753) podem ser mencionados. Aminoácido 2 À NaHBIOAC) 1 nº o neta o IaHBLOROa. o ÇÃ on Ar At Kia THE, A . e. K Cut Píer At2 1 ? o12 R TEA, IPA o R oH o., no TELPÉY Cutg——— Cute. AA, OH O esa Y di Y som 2Has-o a.
H E Aminoácido o12 : 2 o ” o Po o. EtoH R o x E (epóxido)10 PC igHa —— CroHar . E je OR MW, 150 ºC no NA ta, G R EM E12 3 E16 o vou
Y dt Sei on nose e Ne Ao teta ao Dow AAA) O Ênsam O (CHINA Md notes, Ae DK EK ' Tod ae s om NH, o nã, Oo au cíclico KK-E12 (cKK-E12) me AAA ane rios £ A nº É ás É rar nAeto e. K KK x seo, Rn em o o No, Oo CEA estam A TO io Mes Neon " Neon ATT AS Cuneo do O (CHANH O (CH)NH, CKK-A12 * eKK-012
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YK PK 500 (Bromidrato de poli-L-lisina 500-2000) PKIK (Bromidrato de poli-L-lisina 1000-5000)
110 /141
[00132] Dentre os lipídeos catiônicos acima mencionados, cKK-E12, cKK- E1l4 são mais preferíveis.
[00133] Em outra modalidade, lipídeos catiônicos C14-98, C18-96, C14- 113, C14-120, C14-120, C14-110, C16-96, e C12-200 sintetizados pelo seguinte esquema descrito em Love KT et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 May 25; 107(21):9915) podem ser mencionados. Cio Do 96 DNOXONH. Ou Pr ' ce o 98 io go 16 PO OIOOO 1100 PN NH2 113 q HNTA "O NH, 120 HanDVA DNA NHa 200 EN N
R R soe Ps os HNTIONH + 77 — Nº NH o 1eq. 3eq. 7
R
[00134] Dentre os lipídeos catiônicos acima mencionados, C14-110, C16- 96 e C12-200 são mais preferíveis.
[00135] Em uma modalidade particularmente preferível, um lipídeo catiônico representado pela seguinte fórmula (1) (aqui abaixo a ser também referido como “composto (1) pode ser mencionado.
111 /141 Rº o Ri | À R? 9 Ns 1 E 3 O R L Oo n R Rº em que
L' é um grupo C1.º2 alquileno, um grupo C222 alquenileno ou um grupo C3 77 alcadienileno,
n é um inteiro de O ou 1,
R'é
(1) um átomo de hidrogênio,
(2) um grupo C1.»> alquila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr», alquila linear e um grupo C7.22 alquenila linear,
(3) um grupo C7.72 alquenila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.22 alquila linear e um grupo C7 25 alquenila linear, ou
(4) um grupo C3.22 alcadienila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.2> alquila linear e um grupo C7 27 alquenila linear,
Rº é -CH7-O-CO-RS, -CH;-CO-O-R' ou -R$,
Rô é -CH;-O-CO-RS$, -CH3-CO-O-Rº ou -R$,
Rº é um átomo de hidrogênio, -CH3-O-CO-R, -CH3-CO-O-R ou - R,
Ró, Rº e R7 são, cada, independentemente
(1) um grupo C1.2> alquila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr», alquila linear e um grupo C7.22 alquenila linear,
(2) um grupo C>27 alquenila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.22 alquila linear e um
112 /141 grupo C7 27 alquenila linear, ou (3) um grupo C3.27 alcadienila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr», alquila linear e um grupo C7.77 alquenila linear, e Rg e Ro são, cada, independentemente um grupo C++ alquila, ou um sal dos mesmos.
L' é um grupo C1 7, alquileno, um grupo C727 alquenileno ou um grupo C377 alcadienileno.
L' é preferivelmente um grupo C 2, alquileno.
L' é mais preferivelmente um grupo C1.1º alquileno.
L' é ainda preferivelmente um grupo C.« alquileno.
n é um inteiro de O ou 1.
n é preferivelmente um inteiro de 1.
Ré (1) um átomo de hidrogênio, (2) um grupo C1.»> alquila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.»> alquila linear e um grupo C72.22 alquenila linear, (3) um grupo OC», alquenila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr.» alquila linear e um grupo C7 7 alquenila linear, ou (4) um grupo C3.77 alcadienila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr, alquila linear e um grupo C7 >, alquenila linear.
R' é preferivelmente (1) um átomo de hidrogênio, (2) um grupo Ci alquila linear (preferivelmente grupo Cç12 alquila linear) opcionalmente substituído pode um ou dois grupos C122> alquila linear (preferivelmente grupos Cçs.12 alquila linear), ou
113 /141 (3) um grupo C;2» alquenila linear (preferivelmente grupo Cç12 alquenila linear) opcionalmente substituído por um ou dois grupos C;2> alquenila linear (preferivelmente grupos Cçs.12 alquenila linear).
R' é particularmente preferivelmente um átomo de hidrogênio.
Rº é -CH7-O0-CO-R$, -CH;-CO-O-Ri ou -R$.
Rº? é preferivelmente -CH7-O-CO-R' ou -R$.
Rº? é mais preferivelmente -CH7-O-CO-R$.
R? é -CH7-O0-CO-R$, -CH7-CO-O-Rº ou -Rº.
R? é preferivelmente -CH;-O-CO-R” ou -R:.
R? é mais preferivelmente -CH;-O-CO-R$.
Rº é um átomo de hidrogênio, -CH3-O-CO-R7, -CH3-CO-O-R ou - R.
Rº é preferivelmente um átomo de hidrogênio ou -CH3-O-CO-R.
Ri é mais preferivelmente -CH3-O-CO-R.
R, Rº e R são, cada, independentemente (1) um grupo C1.»> alquila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.»> alquila linear e um grupo C72.22 alquenila linear, (2) um grupo CO», alquenila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr.» alquila linear e um grupo C7 7 alquenila linear, ou (3) um grupo C3.77 alcadienila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr, alquila linear e um grupo C7 >, alquenila linear.
R”, Rº e R são, cada, independentemente preferivelmente (1) um grupo Ci alquila linear (preferivelmente grupo Cais alquila linear) opcionalmente substituído por um ou dois grupos C1.»º alquila linear (preferivelmente grupos C1.10 alquila linear), (2) um grupo C;2» alquenila linear (preferivelmente grupo Ca18
114 /141 alquenila linear), ou (3) um grupo C3.2, alcadienila linear (preferivelmente grupo Ca18 alcadienila linear).
[00136] R$, Rº e R? são, cada, independentemente mais preferivelmente (1) um grupo Cr.» alquila linear (preferivelmente grupo Cais alquila linear) opcionalmente substituído por um ou dois grupos C 27 alquila linear (preferivelmente grupos C 10 alquila linear), ou (2) um grupo C>>> alquenila linear (preferivelmente grupo Cais alquenila linear).
[00137] Rg e Ryo são, cada, independentemente um grupo Ci alquila.
[00138] Rg e Ro são, cada, independentemente um grupo C13 alquila (preferivelmente metila).
[00139] Preferivelmente, composto (1) é um composto da fórmula (1) acima mencionada em que L' é um grupo Ci» alquileno (preferivelmente grupo Cri2 alquileno, mais preferivelmente grupo C« alquileno), n é um inteiro de 1, R'é (1) um átomo de hidrogênio, (2) um grupo Cr.» alquila linear (preferivelmente grupo Cç12 alquila linear) opcionalmente substituído por um ou dois grupos C1.> alquila linear (preferivelmente grupos Cç.12 alquila linear), ou (3) um grupo C77>, alquenila linear (preferivelmente grupo Cç12 alquenila linear) opcionalmente substituído por um ou dois grupos C2.22 alquenila linear (preferivelmente grupos Cs 12 alquenila linear), Rº é -CH;-O-CO-R' ou -R$, Rô é -CH;-O-CO-R" ou -R$, Ri é um átomo de hidrogênio ou -CH3-O0-CO-R”, R, Rº e R são, cada, independentemente
115 /141 (1) um grupo Cr2 alquila linear (preferivelmente grupo Cais alquila linear) opcionalmente substituído por um ou dois grupos C1.»> alquila linear (preferivelmente grupos C.10 alquila linear), (2) um grupo C;>» alquenila linear (preferivelmente grupo Ca18 alquenila linear), ou (3) um grupo C327 alcadienila linear (preferivelmente grupo Ca18 alcadienila linear), e Rg e Ro são, cada, independentemente um grupo Ci.« alquila (preferivelmente grupo C,3 alquila, particularmente preferivelmente metila).
[00140] Mais preferivelmente, composto (1) é um composto da fórmula acima mencionada (1) em que L' é um grupo Ci12 alquileno (preferivelmente grupo C16 alquileno), n é um inteiro de 1, R' é um átomo de hidrogênio, R?º é -CH7-O-CO-RS$, Rô é -CH;-O-CO-RS, R$ é -CH;-O0-CO-R”, R, Rº e R7 são, cada, independentemente (1) um grupo Cr». alquila linear (preferivelmente grupo Cais alquila linear) opcionalmente substituído por um ou dois grupos C1.> alquila linear (preferivelmente grupos C 10 alquila linear), (2) um grupo C7> alquenila linear (preferivelmente grupo Cais alquenila linear), ou (3) um grupo C3.27 alcadienila linear (preferivelmente grupo Ca1g alcadienila linear), e Rg e Ro são, cada, independentemente um grupo Ci+ alquila (preferivelmente grupo C13 alquila, particularmente preferivelmente metila).
[00141] Mais preferivelmente, composto (1) é um composto da fórmula
116 /141 acima mencionada (1) em que L' é um grupo Ci. alquileno, n é um inteiro de 1, R' é um átomo de hidrogênio, Rº é -CH7-O0-CO-RS, Rô é -CH7-O0-CO-R$, Ri é -CH7-0-CO-R, Ró, Rº e R7 são, cada, independentemente (1) um grupo Cr» alquila linear (preferivelmente grupo Cas alquila linear) opcionalmente substituído por um ou dois grupos C1.»2 alquila linear (preferivelmente grupos C1.10 alquila linear), ou (2) um grupo C>>> alquenila linear (preferivelmente grupo Cais alquenila linear), e Rg e Ro são, cada, independentemente um grupo Ci3 alquila (preferivelmente metila).
[00142] Um sal do composto representado por cada fórmula estrutural acima mencionada é preferivelmente um sal farmacologicamente aceitável. Exemplos dos mesmos incluem sais com bases inorgânicas (por exemplo, sais de metal alcalino tal como sal de sódio, sal de potássio e similares; sais de metal alcalino-terroso tal como sal de cálcio, sal de magnésio e similares; sal de alumínio, sal de amônio), sais com bases orgânicas (por exemplo, sais com trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina [tris(hidroximetil) metilaminal], terc-butilamina, ciclohexilamina, benzilamina, diciclohexilamina, N N-dibenzil etilenodiamina), sais com ácidos inorgânicos (por exemplo, sais com ácido fluorídico, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodeto de hidrogênio, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico), sais com ácidos orgânicos (sais com ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido ftálico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido sucínico, ácido málico, ácido metanossulfônico, ácido
117 /141 benzenossulfônico, ácido p-toluenossulfônico), sais com aminoácidos básicos (sais com arginina, lisina, ornitina) ou sais com aminoácidos ácidos (sais com ácido aspártico, ácido glutâmico).
[00143] A razão (% em mols) do lipídeo catiônico para os lipídeos totais presentes na nanopartícula lipídica da presente invenção é, por exemplo, cerca de 10% a cerca de 80%, preferivelmente cerca de 20% a cerca de 70%, mais preferivelmente cerca de 40% a cerca de 60%; no entanto, a razão não é limitada a estas.
[00144] Somente um tipo do lipídeo catiônico acima mencionado pode ser também usado, ou dois ou mais tipos do mesmo podem ser usados em combinação. Quando lipídeos catiônicos múltiplos são usados, a razão do lipídeo catiônico completo é preferivelmente como mencionado acima.
(c) Lipídeo não catiônico
[00145] No presente relatório descritivo, o “lipídeo não catiônico” significa um lipídeo diferente do lipídeo catiônico, e é um lipídeo que não tem uma carga elétrica positiva líquida em um pH selecionado, tal como pH fisiológico e similares. Exemplos do lipídeo não catiônico usado na nanopartícula lipídica da presente invenção incluem fosfolipídeo, esteroides, PEG-lipídeo e similares.
[00146] Para intensificar a entrega de ácido nucleico codificando CAR ou TCR exógeno no imunócito alvo, o fosfolipídeo não é particularmente limitado desde que ele mantenha estavelmente ácido nucleico e não iniba a fusão com membranas de célula (membrana de plasma e membrana de organela). Por exemplo, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil serina, fosfatidil inositol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoilfosfatidil colina, lisofosfatidil colina, lisofosfatidil etanolamina, dipalmitoilfosfatidil colina, dioleoilfosfatidil colina, distearoilfosfatidil colina, dilinolenoilfosfatidil colina e similares podem ser mencionados.
[00147] Os fosfolipídeos preferidos incluem distearoilfosfatidil colina (DSPC), dioleoilfosfatidil colina (DOPC), dipalmitoilfosfatidil colina (DPPC), dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), palmitoiloleoilfosfatidil glicerol (POPG),
118 /141 dipalmitoilfosfatidil glicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidil etanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidil colina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidil etanolamina (POPE), e dioleoilfosfatidil etanolamina 4-(N-maleimida metil)-ciclo hexano-1- carboxilato (DOPE-mal), mais preferivelmente DOPC, DPPC, POPC, e DOPE.
[00148] A razão (% em mols) do fosfolipídeo para os lipídeos totais presentes na nanopartícula lipídica da presente invenção pode ser, por exemplo, cerca de 0% a cerca de 90%, preferivelmente cerca de 5% a cerca de 30%, mais preferivelmente cerca de 8% a cerca de 15%.
[00149] Somente um tipo do acima mencionado fosfolipídeo pode ser usado ou dois ou mais tipos do mesmo podem ser usados em combinação. Quando fosfolipídeos múltiplos são usados, a razão do fosfolipídeo completo é preferivelmente como mencionado acima.
[00150] Como os esteroides, colesterol, Sa-colestanol, 5B-coprostanol, colesteril-(2' -hidroxi)-etiléter, colesteril-(4' -hidroxi)-butiléter, 6-ketocolestanol, 5a- colestana, colestenona, Sa-colestanona, 5B-colestanona, e colesteril decanoato podem ser mencionados, preferivelmente colesterol.
[00151] A razão (% em mols) do esteróide para os lipídeos totais presentes na nanopartícula lipídica da presente invenção quando esteróides estão presentes, pode ser, por exemplo, cerca de 10% a cerca de 60%, preferivelmente cerca de 12% a cerca de 58%, mais preferivelmente cerca de 20% a cerca de 55%.
[00152] Somente um tipo do esteróide acima mencionados pode ser usado ou dois ou mais tipos do mesmo podem ser usados em combinação. Quando esteróides múltiplos são usados, a razão do esteróide completo é preferivelmente como mencionado acima.
[00153] No presente relatório descritivo, o “PEG-lipídeo” significa qualquer complexo de polietileno glicol (PEG) e lipídeo. O PEG-lipídeo não é particularmente limitado desde que tenha um efeito na supressão da agregação da nanopartícula lipídica da presente invenção. Por exemplo, PEG conjugado com dialquiloxipropil (PEG-DAA), PEG conjugado com diacilglicerol (PEG-DAG)
119 /141 (por exemplo, SUNBRIGHT GM-020 (NOF CORPORATION)), PEG conjugado com fosfolipídeos tal como fosfatidiletanolamina (PEG-PE), PEG conjugado com ceramida (PEG-Cer), PEG conjugado com colesterol (PEG-colesterol), ou derivados dos mesmos, ou misturas dos mesmos, mPEG2000-1,2-Di-O-alquil-sn3- carbomoilglicerídeo (PEG-C-DOMG), 1-[8'-(1,2-dimiristoil-3-propanoxi)- carboxamida-3' 6-dioxaoctanil |carbamoil-w-metil-poli(etileno glico)º (2KPEG- DMG) e similares podem ser mencionados. Preferidos PEG-lipídeo incluem PEG- DGA, PEG-DAA, PEG-PE, PEG-Cer, e uma mistura destes, mais preferivelmente, um conjugado PEG-DAA selecionado dentre o grupo consistindo em um conjugado PEG-didecil oxipropil, um conjugado PEG-dilauril oxipropil, um conjugado PEG-dimiristil oxipropil, um conjugado PEG-dipalmitil oxipropil, um conjugado PEG-distearil oxipropil, e misturas dos mesmos.
[00154] Além do grupo metóxi, o grupo maleimida, grupo N- hidroxissucinimidila e similares, para ligação do ligante tendo como alvo célula T descrito abaixo, podem ser usados como a extremidade livre de PEG. Por exemplo, SUNBRIGHT DSPE-0201MA ou SUNBRIGHT DSPE-0201MA (NOF) podem ser usados como um PEG-lipídeo tendo um grupo funcional para ligação a um ligante tendo como alvo célula T (às vezes a ser referido como “PEG-lipídeo reativo terminal” no presente relatório descritivo).
[00155] A razão (% em mols) do PEG-lipídeo para os lipídeos totais presentes na nanopartícula lipídica da presente invenção pode ser, por exemplo, cerca de 0% a cerca de 20%, preferivelmente cerca de 0,1% a cerca de 5%, mais preferivelmente cerca de 0,7% a cerca de 2%.
[00156] A razão (% em mols) do PEG-lipídeo reativo terminal nos lipídeos- PEGs totais acima mencionados é, por exemplo, cerca de 10% a cerca de 100%, preferivelmente cerca de 20% a cerca de 100%, mais preferivelmente cerca de 30% a cerca de 100%.
[00157] Somente um tipo do PEG-lipídeo acima mencionado pode ser usado ou dois ou mais tipos do mesmo podem ser usados em combinação. Quando
120 / 141 lipídeos-PEGs múltiplos são usados, a razão do PEG-lipídeo completo é preferivelmente como mencionado acima.
[00158] A nanopartícula lipídica da invenção é usada para transferência de genes e expressão de CAR ou TCR exógeno em células imunes, particularmente em células T que são responsáveis pela imunidade celular dentre a imunidade adquirida, células NK, monócitos, macrófagos, células dendríticas, e similares que são responsáveis pela imunidade inata, e células T NK que são células T tendo as propriedades de célula NK. Assim, a nanopartícula lipídica da presente invenção pode conter adicionalmente um ligante que pode alvo-dirigir a nanopartícula lipídica para imunócitos, particularmente células T, para entrega eficiente para os imunócitos alvo-dirigidos, particularmente in vivo.
(d) Ligante capaz de dirigir a nanopartícula lipídica para a célula T
[00159] O ligante capaz de dirigir a nanopartícula lipídica da presente invenção para as células T não é particularmente limitado desde que ele possa reconhecer especificamente as moléculas de superfície que são especificamente ou altamente expressadas em células T. Preferivelmente, ele inclui os contendo um ou mais domínios de ligação ao antígeno de anticorpos contra CD3, CD4, CD8 ou CD28 e, mais preferivelmente, ele inclui os contendo domínios de ligação ao antígeno de anticorpo anti-CD3 e/ou anticorpo anti-CD28. Um exemplo particularmente preferível para a entrega in vivo para as células T é um contendo somente o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-CD3. Aqui, o “domínio de ligação ao antígeno” é sinônimo do domínio de ligação ao antígeno que constitui a CAR acima mencionada. No entanto, porque a CAR precisa ser preparada como um ácido nucleico codificando a mesma, restrições ocorrem e os anticorpos de cadeia única são geralmente usados em muitos casos. Porque o domínio de ligação ao antígeno como um ligante tendo como alvo célula T está contido em um estado de proteína na nanopartícula lipídica da presente invenção, não somente os anticorpos de cadeia única, mas também quaisquer outros fragmentos de anticorpos, tais como moléculas completas de anticorpo, Fab,
121 /141 F(ab'),, Fab', Fv, anticorpo reduzido (rIgG), dsFv, sFv, diabody, triabody, e similares, também podem ser usados preferivelmente. Fab' sem uma porção Fc pode ser preferivelmente usado, especialmente para a entrega para o imunócito alvo in vivo. Estes fragmentos de anticorpo podem ser preparados por tratamento do anticorpo completo (por exemplo, IZG) com um agente de redução (por exemplo, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol) ou peptidase (por exemplo, papaína, pepsina, ficina), ou por usando uma operação de recombinação genética.
[00160] Quando o ligante tendo como alvo célula T é uma molécula de anticorpo completa, os anticorpos anti-CD3, CD4, CD8, CD28 comercialmente disponíveis, etc. podem ser usados, ou o ligante pode ser isolado da cultura das células produzindo o anticorpo. Por outro lado, quando o ligante é qualquer um do domínio de ligação ao antígeno acima mencionado (fragmento de anticorpo), o ácido nucleico codificando o domínio de ligação ao antígeno, tal como anticorpos anti-CD3, CD4, CD8, CD28, etc., é isolado do mesmo modo como no ácido nucleico codificando o domínio de ligação ao antígeno constituindo a referida CAR é obtido, e o domínio de ligação ao antígeno pode ser recombinantemente produzido usando o mesmo.
[00161] Na nanopartícula lipídica da presente invenção, o ligante tendo como alvo célula T pode se ligar para o envoltório externo de qualquer modo, desde que ele esteja presente sobre a superfície da nanopartícula lipídica. Por exemplo, quando um PEG-lipídeo terminalmente reativo está contido como um lipídeo não catiônico, o ligante pode ser adicionado para o terminal de PEG. Por exemplo, nanopartículas lipídicas marcadas com um ligante (anticorpo) podem ser preparadas por reação de um PEG-lipídeo (por exemplo, SUNBRIGHT DSPE- 0200MA) com um grupo maleimida introduzido no terminal com o grupo tiol do anticorpo redutor acima mencionados (às vezes referido como “anticorpo-LNP”).
[00162] Quando a nanopartícula lipídica da presente invenção é usada para a transferência de genes para imunócitos diferentes de células T, tal como células NK e células dendríticas, a nanopartícula lipídica pode ser entregue de modo
122 / 141 eficiente mesmo na ausência de um ligante para a alvo-marcação para as células imunes sobre a superfície da nanopartícula lipídica. Também pode existir, sobre a superfície da nanopartícula lipídica, um ligante tendo como alvo moléculas apropriadas expressadas sobre a superfície de cada célula imune. Por exemplo, no caso de células NK, as contendo domínios de ligação ao antígeno de anticorpos contra CDI6 e CD56 podem ser mencionados, mas sem limitação.
2. Produção de nanopartícula lipídica da presente invenção
[00163] A nanopartícula lipídica da presente invenção pode ser produzida, por exemplo, pelo método descrito em US9.404.127. Quando a nanopartícula lipídica contém adicionalmente um ligante tendo como alvo célula T, ela pode ser produzida ligante quimicamente o ligante tendo como alvo a célula T após a preparação das nanopartículas lipídicas. Como descrito em WO 2016/021683, por exemplo, uma solução de solvente orgânico dos componentes acima mencionados (b) e (c) é preparada, a solução de solvente orgânico é misturada com água ou uma solução tampão de (a) parar preparar nanopartículas lipídicas e, então, o ligante tendo como alvo célula T é quimicamente ligado para produzir as mesmas. A razão de mistura (razão molar) de lipídeo catiônico, fosfolipídeo, colesterol, e PEG- lipídeo é, por exemplo, 40 a 60:0 a 20:0 a 50:0 a 5, mas a razão não é limitada a isto. Quando PEG-lipídeo é misturado como um lipídeo não catiônico e um ligante tendo como alvo célula T é adicionado para o terminal de PEG, a razão de mistura (razão molar) de PEG-lipídeo e de ligante pode ser, por exemplo, 20:1 a 1:20. O PEG-lipídeo acima mencionado pode conter PEG terminal reativo a uma razão (% em mols) de cerca de 10% a cerca de 100%. A mistura acima mencionada pode ser conduzida usando uma pipeta, um sistema de mistura de micro fluido (por exemplo, sistema microfluídico Asia (Syrris)) ou Nanoassemblr (Precision Nanosystems)). As partículas lipídicas obtidas podem ser submetidas à purificação por filtração em gel, diálise ou filtração estéril.
[00164] A concentração do componente de lipídeo total na solução de solvente orgânico é preferivelmente 0,5 a 100 mg/mL.
123 / 141
[00165] Como o solvente orgânico, por exemplo, metanol, etanol, 1- propanol, 2-propanol, 1- butanol, terc-butanol, acetona, acetonitrila, N,N- dimetilformamida, dimetilsulfóxido, ou uma mistura dos mesmos, podem ser enumerados. O solvente orgânico pode conter O a 20% de água ou uma solução tampão. Como a solução tampão, soluções tampão ácidas (por exemplo, solução tampão de acetato, solução tampão de citrato ou soluções tampão neutras (por exemplo, solução tampão de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico, solução tampão de ácido (HEPE), tris(hidroximetil)aminometano (Tris), uma solução tampão de fosfato, solução salina tamponada com fosfato (PBS)) podem ser enumeradas.
[00166] No caso em que um sistema de mistura microfluídico é usado para mistura, preferência é dada para a mistura de 1 parte por volume de uma solução de solvente orgânico com 1 a 5 partes por volume de água ou uma solução tampão. Além disso, no referido sistema, a taxa de fluxo da mistura (a solução de mistura de uma solução de solvente orgânico e água ou uma solução tampão) é preferivelmente 0,1 a 10 mL/min, e a temperatura preferivelmente é de 4 a 45ºC.
[00167] Quando uma dispersão de partícula lipídica é produzida, como descrito acima, a dispersão contendo componentes (a) a (d) pode ser produzida por adição de um ácido nucleico codificando CAR ou TCR exógeno à água ou solução tampão. Adição do ácido nucleico em um modo para tornar a concentração do mesmo no ingrediente ativo em água ou uma solução tampão de 0,05 a 2,0 mg/mL, é preferível.
[00168] Além disso, a nanopartícula lipídica da presente invenção também pode ser produzida por mistura de uma dispersão de partícula lipídica com o ácido nucleico por um método conhecido per se.
[00169] Na nanopartícula lipídica da presente invenção, o teor do ácido nucleico é preferivelmente 1 - 20 % em peso. O teor pode ser medido usando Quant-iT"MRibogreen& (Invitrogen). Na nanopartícula lipídica da presente invenção, a razão de encapsulação do ácido nucleico pode ser calculada com base
124 / 141 na diferença na intensidade de fluorescência na presença ou ausência da adição de um tensoativo (por exemplo, Triton-X100).
[00170] Um meio de dispersão pode ser substituído com água ou uma solução tampão por diálise. Para a diálise, membrana de ultrafiltração de corte de peso molecular de 10 a 20K é usada para realizar a 4ºC em temperatura ambiente. A diálise pode ser realizada de modo repetido. Para a diálise, filtração de fluxo tangential pode ser usada.
[00171] A razão (razão em peso) do ácido nucleico e do lipídeo na nanopartícula lipídica da presente invenção obtida como mencionado acima é cerca de 0,01 a cerca de 0,2.
[00172] O tamanho médio de partícula da nanopartícula lipídica da presente invenção é preferivelmente 10 a 200 nm. O tamanho médio de partícula das partículas lipídicas pode ser calculado usando, por exemplo, Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments) em análise cumulante de uma função de autocorrelação.
3. Imunócito ex vivo introduzido com a nanopartícula lipídica da presente invenção
[00173] A presente invenção provê um método para produzir um imunócito ex vivo expressando CAR ou TCR exógeno por contato dos imunócitos coletadas a partir de organismos vivos (a ser também referido como “imunócito ex vivo” no presente relatório descritivo) com a nanopartícula lipídica da presente invenção e introduzindo um ácido nucleico codificando a CAR ou TCR exógeno nas células T, e imunócitos ex vivo obtidos pelo método. Como usado aqui, o “imunócito” não é particularmente limitado desde que ele seja uma célula capaz de danificar a célula alvo (célula patogênica) tal como célula de câncer e similares por algum mecanismo de ação (isto é, célula efetora imune). Exemplos das mesmas incluem células T que são responsáveis para imunidade celular dentre as imunidades adquiridas, célula NK, monócito, macrófago, célula dendrítica, etc. que são responsáveis por imunidade inata, e células T NK que são células T com propriedades de células NK. Em uma modalidade preferida, o imunócito pode ser
125 / 141 uma célula T. Célula T coletada de um organismo vivo é também referida como “célula T ex vivo” no presente relatório descritivo. Em outra modalidade preferida, o imunócito pode ser responsável pela imunidade inata, tal como célula NK, macrófago, célula dendrítica, e similares. Células T são consideradas como estando em risco considerável de causar GVHD por transplante alogenêico (allo) mesmo se o tipo HLA for compatível, enquanto que células allo- NK, etc. são consideradas como não causando GVHD. Assim, a preparação de vários imunócitos ex vivo allo tipo HLA permite o uso “fora da prateleira”. CAR-célula NK é descrita em, por exemplo, US2016/0096892, Mol Ther. 25(8): 1769-1781 (2017) e similares, e CAR- célula dendrítica, CAR-macrófago e similares são descritos em, por exemplo, WO 2017/019848, eLIFE. 2018 e36688 e similares.
[00174] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição para induzir a expressão de uma CAR ou TCR exógeno contendo a nanopartícula lipídica da presente invenção.
[00175] O imunócito (por exemplo, célula T), em que a nanopartícula lipídica da presente invenção é introduzida, pode ser um imunócito isolado particular (por exemplo, célula T), ou, por exemplo, uma população de célula não uniforme, tal como, linfócitos e células progenitoras de linfócitos incluindo células pluripotentes desde que seja uma população de células contendo imunócitos (por exemplo, célula T) ou uma célula progenitora do mesmo. Na presente invenção, o “linfócito” significa um dos subtipos de leucócitos no sistema imune de vertebrados. Exemplos do linfócito incluem célula T, célula B, e célula exterminadora natural (célula NK), preferivelmente, célula T isolada e purificada. Na presente invenção, a “célula T" é um tipo de leucócito encontrado em órgãos linfáticos, sangue periférico, e similares, e refere-se a uma categoria de linfócitos caracterizada por diferenciação e maturação principalmente na glândula do timo e expressão de TCR. Exemplos da célula T que pode ser usada na presente invenção incluem célula T citotóxica (CTL), que é uma célula positiva para CD8, célula T auxiliar, que é uma célula positiva para CDA, célula T regulatória, e célula T efetora e, preferivelmente,
126 / 141 célula T citotóxica.
[00176] O linfócito acima mencionado pode ser coletado de, por exemplo, sangue periférico, medula óssea, e sangue do cordão umbilical de um mamífero humano ou não humano. Quando imunócito ex vivo (por exemplo, célula T ex vivo) introduzido com a nanopartícula lipídica da presente invenção é usado para o tratamento de doenças, tal como câncer, a população de células é preferivelmente colhida a partir da pessoa a ser tratada ou de um doador com a compatibilidade de tipo HLA com a do indivíduo a ser tratado.
[00177] Exemplos da célula progenitora de linfócitos, incluindo célula pluripotente, incluem célula-tronco embrionária (célula ES), célula-tronco pluripotente induzida (célula iPS), célula de câncer embrionário (célula EC), célula germinal embrionária (EG célula), célula-tronco hematopoiética, célula progenitora pluripotente que tenha perdido o potencial de auto-renovação (progenitora multipotente: MMP), célula progenitora mielo-linfóide comum (MLP), célula progenitora mielóide (MP), célula progenitora mononuclear granulócida (GMP), célula progenitora de macrófago - célula dendrítica (MDP), célula progenitora de célula dendrítica (DCP) e similares. As células não diferenciadas tal como célula pluripotente e similares podem ser diferenciadas em vários imunócitos, por exemplo, célula T, por um método conhecido per se.
[00178] Não existe limitação particular no método de contactar imunócitos ex vivo com a nanopartícula lipídica da presente invenção e, por exemplo, a nanopartícula lipídica da presente invenção pode ser adicionada a um meio típico para imunócitos. Alternativamente, para aumentar a eficiência da introdução, por exemplo, o método de co-precipitação de fosfato de cálcio, método PEG, método de eletroporação, método de microinjeção, método de lipofecção e similares podem ser usados em combinação.
[00179] Quando a nanopartícula lipídica da presente invenção contém particularmente um ácido nucleico codificando TCR exógeno como um ingrediente ativo, a expressão de cadeia a de TCR endógeno e cadeia (8 de TCR, que são
127 /141 inerentemente expressadas pela célula T, pode ser suprimida por siRNA do ponto de vista de um aumento na expressão de TCR exógeno, inibição do aparecimento de TCR mal pareado, ou inibição de auto-reatividade. Quando o ácido nucleico acima mencionado é aplicado para o método, para evitar o efeito de siRNA em TCR exógeno, a sequência de base de um ácido nucleico codificando TCR é preferivelmente uma sequência (sequência de tipo de conversão de códon) diferente da sequência de base correspondendo a RNA em que siRNA, que suprime a expressão de cadeias a de TCR endógeno e à de TCR, atua. O método para isto é descrito, por exemplo, em WO 2008/153029. A sequência de base acima mencionada pode ser produzida por introdução de uma mutação silente em um ácido nucleico naturalmente adquirido codificandto TCR ou quimicamente sintetizando um ácido nucleico artificialmente projetado. Alternativamente, para evitar o mal pareamento com a cadeia de TCR endógeno, uma parte ou todas as regiões constantes do ácido nucleico codificando o TCR exógeno pode ser substituída com uma região constante derivada de um animal diferente de um humano, por exemplo, um camundongo.
4. Medicamento contendo a nanopartícula lipídica da presente invenção, ou imunócito ex vivo introduzido com a nanopartícula lipídica
[00180] A presente invenção provê um medicamento contendo a nanopartícula lipídica da presente invenção, ou imunócito ex vivo (por exemplo, célula T ex vivo), introduzido com a nanopartícula lipídica (aqui abaixo a ser abreviado como “o medicamento da presente invenção”).
(4-1. Medicamento contendo imunócito ex vivo introduzido com a nanopartícula lipídica da presente invenção)
[00181] Expressando CAR ou TCR exógeno, um imunócito (por exemplo, célula T) introduzido com a nanopartícula lipídica da presente invenção pode especificamente — reconhecer células expressando antígeno na superfície especificamente reconhecido por CAR ou TCR exógeno e matar as mesmas (por exemplo, indução de apoptose). Assim, contendo, como um antígeno de superfície,
128 / 141 um ácido nucleico codificando CAR ou TCR exógeno que reconhece uma molécula na superfície especificamente expressada ou mostrando expressão intensificada em uma célula doente, tal como uma célula de câncer, como um ingrediente ativo, imunócito ex vivo introduzido com a nanopartícula lipídica da presente invenção pode ser usado para a profilaxia ou tratamento de doenças, tais como câncer e similares, e pode ser administrado com segurança a mamíferos (humano ou outros mamíferos (por exemplo, camundongo, rato, hamster, coelho, gato, cachorro, bovino, ovelha, macaco, preferivelmente humano)).
(4-2. Medicamento contendo a nanopartícula lipídica da presente invenção)
[00182] O medicamento da presente invenção contendo a nanopartícula lipídica da presente invenção é preferivelmente preparado como uma composição farmacêutica por mistura da nanopartícula lipídica com carreadores conhecidos farmaceuticamente aceitáveis (incluindo excipiente, diluente, agente de volume, ligante, lubrificante, auxiliar de fluxo, desintegrante, tensoativo e similares) e aditivos convencionais, e similares. Os excipientes são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (por exemplo, 0,01M fosfato, 0,138M NaCl, 0,0027M KCl, pH 7.4), soluções aquosas contendo sais de ácido mineral, tal como hidrocloreto, hidrobrometo, fosfato, sulfato, e similares, soluções salinas, soluções de glicol, etanol, e similares, e sais de ácidos orgânicos, tais como acetato, propionato, malonato, benzoato e similares. Além disso, adjuvantes, tais como agente umectante ou emulsificador, e agentes tamponantes de pH também podem ser usados. Além disso, adjuvantes de preparação, tais como agente de colocação em suspensão, conservante, agente estabilizante e dispersante também podem ser usados. Alternativamente, a composição farmacêutica acima mencionada pode estar em forma seca, que é reconstituída com um líquido estéril apropriado antes do uso. À composição farmacêutica pode ser administrada por via oral ou parenteral, sistêmica ou tópica, dependendo da forma em que é preparada (agentes orais, como comprimido, pílula,
129 / 141 cápsula, pó, grânulo, xarope, emulsão, suspensão e similares; agentes parenterais, como injeção, transfusão por gotejamento, preparação externa, supositório e similares). Para administração parenteral, estão disponíveis administração intravenosa, administração intradérmica, administração subcutânea, administração retal, administração transdérmica e similares. Quando usada sob uma forma injetável, agente tamponante, agente solubilizante, agente isotônico e similares também podem ser adicionados.
[00183] A dosagem do medicamento da presente invenção contendo a nanopartícula lipídica da presente invenção está, por exemplo, na faixa de 0,001 mg a 10 mg como a quantidade de um ácido nucleico codificando CAR ou TCR exógeno, por 1 kg peso corporal por dose. Por exemplo, quando administrado para um paciente humano, a dosagem está na faixa de 0,0001 a 50 mg para um paciente pesando 60 kg. A dosagem acima mencionada é um exemplo, e a dosagem pode ser selecionada de modo apropriado de acordo com o tipo de ácido nucleico a ser usado, via de administração, idade, peso, sintomas, etc. do indivíduo de administração ou paciente.
[00184] Por administração a um mamífero (por exemplo, humano ou outro mamífero (por exemplo, camundongo, rato, hamster, coelho, gato, cachorro, bovino, ovelha, macaco), preferivelmente, humano), o medicamento da presente invenção contendo a nanopartícula lipídica da presente invenção pode induzir a expressão de CAR ou TCR exógeno em imunócitos, por exemplo, célula T (a ser também referido como “imunócito in vivo” ou “célula T in vivo” no presente relatório descritivo) no corpo do animal. O imunócito in vivo especificamente reconhece células de câncer e similares expressando antígeno na superfície alvo-dirigido por CAR ou TCR exógeno e mata as células doentes, assim demonstrando um efeito profilático ou terapêutico contra a doença.
[00185] No caso de um medicamento contendo, como um ingrediente ativo, imunócito ex vivo introduzido com a nanopartícula lipídica da presente invenção, o imunócito pode ser cultivado e/ou estimulado usando um meio e/ou molécula
130 / 141 estimulante apropriados antes da administração ao indivíduo. A molécula estimulante inclui, mas não é limitada a, citocinas, proteínas apropriadas, e outros componentes. No caso de célula T, exemplos de citocinas incluem IL-2, IL-7, IL- 12, IL-15, IFN-y e similares e, preferivelmente, IL-2 pode ser usada. Embora a concentração de IL-2 em um meio não seja particularmente limitada, ela é, por exemplo, preferivelmente 0,01 a 1x10ºU/mL, mais preferivelmente 1 a 1x10ºU/mL. Exemplos da proteína apropriada incluem ligante CD3, ligante CD28, e anticorpo anti-IL-4. Os fatores estimulantes de linfócitos, tal como lectinas, também podem ser adicionados. Além disso, soro ou plasma pode ser adicionado para o meio. Embora as quantidades dos mesmos a serem adicionados para o meio não sejam particularmente limitadas, 0% por volume a 20% por volume são exemplificados, e as quantidades de soro ou plasma a serem usadas podem ser mudadas de acordo com o estágio da cultura. Por exemplo, a concentração de soro ou plasma pode ser reduzida em um modo em etapas. O soro e o plasma podem ser derivados ou da própria pessoa ou não da própria pessoa, mas os derivados da própria pessoa são preferíveis devido ao aspecto de segurança.
[00186] Um medicamento contendo imunócito ex vivo introduzido com a nanopartícula lipídica da presente invenção como um ingrediente ativo é preferivelmente administrado parenteralmente para o indivíduo. Os métodos de administração — parenteral! incluem — administrações intravenosa, arterial, intramuscular, intraperitoneal, e subcutânea. Embora a dosagem seja selecionada de acordo com a condição, peso corporal, idade, etc. do indivíduo, administração é realizada para um indivíduo de 60 kg peso corporal para alcançar geralmente 1x10º - 1x10'º células, preferivelmente 1x10 - 1x10º células, mais preferivelmente 5x107 - 5x10º células, por dose. O medicamento pode ser administrado como uma dose única ou em doses múltiplas. O medicamento inventivo contendo imunócito ex vivo introduzido com a nanopartícula lipídica da presente invenção como um ingrediente ativo pode estar em uma forma conhecida apropriada para administração parenteral, tal como injeção ou agente de infusão. O medicamento
131 /141 pode conter um excipiente farmaceuticamente aceitável, como apropriado. O excipiente farmaceuticamente aceitável inclui os descritos acima. O medicamento pode conter solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS), meio, etc. para manter estavelmente as células. O meio não é particularmente limitado, e exemplos do mesmo incluem, mas não são limitados a, RPMI, AIM-V, X-VIVOI1O, e similares. Além disso, um carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, albumina de soro humano), conservante, e similares podem ser adicionados ao medicamento com a finalidade de estabilização.
[00187] O medicamento da presente invenção pode ser um fármaco profilático ou terapêutico para câncer. O câncer a ser o alvo de aplicação do medicamento da presente invenção não é particularmente limitado. Exemplos dos mesmos incluem, mas não são limitados a, câncer linfocítico agudo, rabdomiossarcoma alveolar, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral (por exemplo, meduloblastoma), câncer de mama, câncer de ânus, canal anal ou anorretal, câncer do olho, câncer do ducto biliar inter-hepático, câncer nas articulações, câncer cervical, da vesícula biliar ou pleural, câncer de nariz, da cavidade nasal ou ouvido médio, câncer bucal, câncer vulvar, câncer do cólon, câncer esofageano, câncer cervical, fibrosarcoma, tumor carcinóide gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço), câncer de hipofaringe, câncer de rim, câncer de laringe, leucemia (por exemplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda), tumor líquido, câncer de fígado, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de célula não pequena), linfoma (por exemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin, linfoma de célula B grande difusa, linfoma folicular), mesotelioma maligno, mastomieloma múltiplo, melanoma, mieloma múltiplo, câncer nasofaringeano, câncer ovariano, câncer pancreático; câncer peritoneal, omento e mesentérico; câncer faringeano, câncer da próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de pele, câncer de intestino delgado, câncer de tecido mole, tumor sólido, câncer gástrico, câncer testicular, câncer de
132 / 141 tireóide, câncer uretral similares.
[00188] A presente invenção é explicada em maiores detalhes a seguir por referência aos Exemplos que são meras exemplificações e não devem limitar a presente invenção.
[Exemplo] Exemplo 1 (Tratamento de redução de anticorpos)
[00189] 9,21 mg/ml anticorpo anti-CD3 (Bio X célula) (111 ul) foram misturados com solução aquosa 10 mM DTT (12,3 ul). Similarmente, 6,73 mg/ml anticorpo IgG2a (Bio X célula) (149 ul) foram misturados com solução aquosa 10 mM DTT (16,6 ul). A mistura de cada anticorpo e DTT foi misturada por vórtice para realizar a reação em temperatura ambiente durante 30 min. A mistura de reação foi fracionada por HPLC (coluna: TSKgel G2000SWXL 7,8 mmx30 cm, TOSOH, fase móvel: PBS) para dar uma solução em fração contendo o anticorpo reduzido. A solução em fração foi ultracentrifugada usando Amicon 0,5 ml-10K. As concentrações da proteína de anticorpo e grupo tiol nos concentrados foram medidas por absorbância a 230 nm e uma reação colorimétrica de fluorescência com N-(7-dimetilamino-4-metilcoumarin-3-il) naleimida (DACM), respectivamente. O rendimento do anticorpo anti-CD3 reduzido foi 176 ul com concentração de proteína de 1,75 mg/ml, concentração de grupo tiol 5,14 UM, e o rendimento do anticorpo de IgG2a reduzido foi 86 ul com concentração de proteína de 5,19 mg/ml, concentração de grupo tiol 45,1 uM.
Exemplo 2 (Preparação de Maleimida-LNP)
[00190] A mistura de lipídeos (lipídeo catiônico: DPPC: Colesterol: SUNBRIGHT GM-020:SUNBRIGHT DSPE-020 MA= 60:10.6:28:1.4:1, razão molar) foi dissolvida em 90% EtOH, água a 10% para dar uma solução lipídica de 7,0 mg/ml lipídeo. Como um lipídeo catiônico, 3-pentiloctanoato de 3-((5- (dimetilamino)pentanoil)oxi)-2,2-bis (((3-pentiloctanoil) oxi)metil)propila
133 /141 (composto 7) descrito em WO 2016/021683 e iodeto de N,N,N-trimetil-5-0x0-5-(3- ((3-pentiloctanoil)ox1)-2,2-bis(((3-pentiloctanoil)Joxi)metil) propoxi)pentano-1- amínio (composto 8) foram misturados a 59,1:0,9 (razão molar) e usados. NnRNAs codificando CAR dirigida para CDI9, tendo 4-1BB e CD36 como domínios de transdução de sinal intracelular, foram dissolvidos em tampão 10 mM de ácido 2- morfolinoetanossulfônico (MES) (pH 5,0) para dar uma solução de 0,2 mg/ml de ácido nucleico. A solução de lipídeo e a solução de ácido nucleico obtidas foram misturadas temperatura ambiente por um Aparelho Nanoassemblr (Precision Nanosystems) a uma razão de taxa de fluxo de 3 ml/min:6 ml/min para dar uma dispersão contendo a composição. A dispersão obtida foi dialisada usando Slyde-A- Lyzer (peso da fração molecular 20k, Thermo Scientific) contra água a temperatura ambiente durante 1 h, e contra PBS a 4ºC durante 48 h. Sucessivamente, o dialisado foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 um (Iwaki) e conservado a4ºC.
Exemplo 3 (Reação de ligação de anticorpo reduzido e Maleimida-LNP)
[00191] A dispersão de Maleimida-LNP foi misturada com solução de anticorpo reduzido a uma concentração molar de 1/20 de anticorpo reduzido para maleimida, e deixada permanecer a temperatura ambiente durante 4 h. À seguir, a mistura foi armazenada a 4ºC até a etapa de purificação.
Exemplo 4 (Purificação com filtração em gel de anticorpo-LNP)
[00192] A mistura de reação de um anticorpo reduzido e Maleimida-LNP foi carregada em uma coluna de filtração com gel Sepharose CL-4B (Número de catálogo 17-0150-01/GE Healthcare), e fracionada com D-PBS(-) como uma fase móvel. Sucessivamente, a concentração de proteína de cada fração foi medida para identificar a fração contendo anticorpo-LNP de interesse. Anticorpo-LNP foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 um e armazenado a 4ºC.
Exemplo 5
134 / 141 (Transfecção ex vivo de célula T CD8+)
[00193] Baço é coletado de camundongo C57BL/6J e disperso em tampão de lise ACK (Biosource) para dar um esplenócito de camundongo. O obtido esplenócito de camundongo é cultivado em meio completo RPMI 1640 contendo 1 ng/ml interleucina 7 e 2 ug/ml concavalina A durante 2 dias, e as células T CD8+ de camundongo são separadas por remoção de células mortas usando centrifugação com gradiente de densidade Ficoll e tratamento usando kit de isolamento negativo para CD8 (Stemcell Technologies). As células T CD8+ de camundongo obtidas são dispersas e cultivadas em meio completo RPMI 1640 contendo 10 ng/ml interleucina 2 e anticorpo-LNP para transfectar as células T CD8+ de camundongo com CAR ou TCR exógeno.
[00194] Do mesmo modo, células T CD8+ são separadas das células T primárias humanas cultivadas adquiridas e células T CD8+ humanas são transfectadas com CAR ou TCR exógeno.
Exemplo 6 (Avaliação de citotoxicidade in vitro de CAR-célula T)
[00195] As células K562 da linhagem de células de leucemia mielóide crônica humana expressando forçosamente CDI9, que são células a serem avaliadas para citotoxicidade, são marcadas com um corante PKH-26 de membrana (Sigma-Aldrich), lavadas com meio RPMI contendo 10% soro de bezerro fetal, dispersas a 1 x 1095 células/ml no meio e cultivadas. As células marcadas em avaliação de citotoxicidade são distribuídas em placa de 96 cavidades e cultivadas. As células são misturadas com células CAR-T, cultivadas a 37ºC durante 3 h, coloridas com Annexin V-Brilliant Violet 421 (BioLegend), e citometria de fluxo é realizada para quantificar as células apoptóticas.
Exemplo 7 (Teste de avaliação de atividade anticâncer in vivo)
[00196] Células K562-CD19 estavelmente expressando luciferase são administradas a camundongos NOD-SCID com seis semanas de idade a partir da
135 / 141 veia do rabo, e os camundongos são criados por um período de 1 semana para preparar um modelo de câncer hematológico de camundongo. Sucessivamente, 1x10%6 células CAR-T humanas, obtidas por transfecção de um ácido nucleico codificando CAR ex vivo usando anticorpo-LNP, são administradas uma vez por semana, durante 3 semanas, por administração via veia do rabo. Uma diminuição nas células de câncer por células CAR-T é avaliada por uma medição usando sistema de formação de imagem por luminescência in vivo IVIS (PerkinElmer). Exemplo 8 (Preparação de Maleimida-LNP usando lipídeo catiônico)
[00197] Uma mistura de lipídeos (lipídeo catiônico: DPPC: Colesterol: SUNBRIGHT GM-020:SUNBRIGHT DSPE-020 MAZ=60:10.6:28:1.4:1, razão molar) foi dissolvida em 90% EtOH, 10% tampão acetato 25 mM pH 4,0 para dar uma solução de lipídeo de 10 mg/ml. Como um lipídeo catiônico, (97Z)-tetradeca-9- enoato de 3-((5-(dimetilamino)pentanoil)oxi)-2,2-bis(((97Z)-tetradeca-9-enoil oxi) metil)propila = (composto — 12), (9Z,9'Z)bis-tetradeca-9-enoato “de 2-(((4- (dimetilamino)butanoil)Joxi) — metil)-2-((dodecanoiloxi) — metil)propano-1,3-di-ila (composto 21), e didecanoato de 2-(((4,5-dibutil nonanoil)oxi)metil)-2-(((5- (dimetilamino) pentanoil)oxi) metil)propano-1,3-di-ila (composto 35) foram usados. PpceDNA3.1-hCDI9CAR codificando CAR dirigido para CD19 foi dissolvido em tampão 10 mM de ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES) (pH 5.5) para dar uma solução de ácido nucleico de 0,2 mg/ml. pcDNA3.1-hCDI9CAR foi produzido por integração da sequência de CD19 IgG4 28z citada a partir de WO 2013/126712 no sítio de multi-clonagem de pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific). A solução de lipídeo e solução de ácido nucleico obtidas foram misturadas a temperatura ambiente por um Aparelho Nanoassemblr (Precision Nanosystems) a uma razão de taxa de fluxo de 3 ml/min:6 ml/min para dar uma dispersão contendo a composição. A dispersão obtida foi dialisada usando Slyde-A-Lyzer (peso de fração molecular 20k, Thermo Scientific) contra água a temperatura ambiente durante 1 h, e contra PBS a 4ºC durante 48 h. Sucessivamente, o dialisado foi filtrado através de um
136 / 141 filtro de seringa de 0,2 um (Twaki) e armazenado a 4ºC.
(Medição de concentração de ácido nucleico de Maleimida-LNP, e cálculo da concentração assumida de maleimida)
[00198] Maleimida-LNP foi dissolvido em 0,5% Triton X-100, e a concentração de pDNA foi medida usando kit Quant-iT"Y PicoGreen'M dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). A concentração de pDNA medida sem adição de Triton X-100 foi tomada como a concentração de pDNA não encapsulado em LNP, e a razão de encapsulação de pDNA em LNP foi calculada. A concentração assumida de maleimida foi calculada por multiplicação da concentração medida de pDNA pela razão de carga de maleimida-PEG-lipídeo (DSPE-020MA). Os valores obtidos são mostrados em Tabela 1. [Tabela 1] Concentração |Concentração pDNA [Razão de — assumida de (UM) composto 12-pcDNA3.1-hCDI9CAR 193 composto 21-peDNA3.1-hCDI9CAR 253 (Reação de ligação de dois tipos de anticorpos reduzidos misturados e Maleimida-LNP)
[00199] Quantidades iguais de um anticorpo CD3 anti-humano (BEN001-2, BioXCell) e um anticorpo CD28 anti-humano/macaco (BE0248, BioXCell) reduzido com DTT foram misturadas a quantidade molar 1/20 para maleimida de maleimida-LNP. As concentrações e volumes de maleimida-LNP e anticorpos reduzidos são mostradas em Tabela 2. A mistura foi deixada permanecer a temperatura ambiente durante 4 h e então armazenada a 4ºC até a etapa de purificação.
137 /141 [Tabela 2] Volume de Concentração assumida de Peso anticorpo | — solução Volume LNP Maleimida-LNP maleimida misturado anticorpo (ml) (UM) Uns) misturado [ED composto 12-pcDNA3.1- 742 176 hCDISCAR composto 21-pcDNA3.1- 86,2 027 175 4s hCDISCAR 577 o3 130 32 hCDISCAR (Purificação por filtração em gel de anticorpo-LNP)
[00200] A mistura de reação de um anticorpo reduzido e Maleimida-LNP foi carregada em uma coluna de filtração com gel Sepharose CL-4B (Número de catálogo 17-0150-01/GE Healthcare), e fracionada com D-PBS(-) como uma fase móvel. Sucessivamente, a concentração de proteína de cada fração foi medida para identificar a fração contendo o anticorpo-LNP de interesse. O anticorpo-LNP foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 um e armazenado a 4ºC. O tamanho de partícula do anticorpo-LNP obtido foi medido por Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical). As concentrações do ácido nucleico e anticorpo de proteína foram medidas usando o kit Quant-ITTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) e kit de Derivatização de Amina FQ ATTO-TAGTM (Thermo Fisher Scientific), respectivamente. Os valores de cada resultado de análise são mostrados em Tabela 3. [Tabela 3] tamanho | Concentração | Concentração Exemplo de anticorpo-LNP partícula | ácido nucleico anticorpo (nm) (gm) (ugm) hCD3/hCD28-composto 12-pcDNA3.1- 19 94 hCDI9ICAR
138 / 141 tamanho | Concentração | Concentração Exemplo de anticorpo-LNP partícula | ácido nucleico anticorpo hCD3/hCD28-composto 21-pecDNA3. 1- hCD3/hCD28-composto 35-pcDNA3,. 1- Exemplo 9 (Teste de transfecção CDI9 CAR para célula T primária humana cultivada usando anticorpo-LNP)
[00201] Células Pan-T humanas (células pan-T de sangue periférico humano AccuCell, seleção Negativa) foram preparadas a 1,1x10º células/ml com um meio e semeadas em uma placa de 96 cavidades a 90 ul/cavidade. X-VIVO1O (Lonza) suplementado com IL-2 recombinante (Thermo Fisher Scientific) a uma concentração de 30 ng/ml foi usado como o meio. Sucessivamente, 10 ul de anticorpo-LNP diluídos com PBS a uma concentração de 30 ug/ml pcDNA3.1- hCDI9CAR foram adicionados para o meio, e as células foram cultivadas a 37ºC em um incubador a 5% CO, durante 3 dias e 6 dias.
(Avaliação da expressão de CDI9CAR por citometria de fluxo)
[00202] Células T primárias humanas cultivadas, cultivadas em uma placa de 96 cavidades foram coletadas em um tubo de 1,5 ml. Proteína CDI9 recombinante humana, quimera ativa de Fc, Biotina (Abcam) (2 ul) foram adicionados, e a mistura foi deixada permanecer em gelo durante 30 min. Sucessivamente, a lavagem de célula (BD), adicionada com 200 ul de soro FBS a 1%, foi adicionada, a mistura foi lavada duas vezes por centrifugação a 300xg durante 5 min, o sobrenadante foi removido e as células foram dispersas em 100 ul de soro FBS a 1% para lavagem de células. Para as dispersões de células foi adicionado 0,2 ul de Estreptavidina Violeta brilhante 421 e, após mistura por pipeta, as dispersões foram deixadas em gelo durante 30 min. As células coloridas foram lavadas três vezes com 200 ul de soro FBS a 1% para lavagem de células e
139 / 141 centrifugadas, filtradas, dispersas em 200 ul de soro FBS a 1% para lavagem de células, e análise de citometria de fluxo foi realizada por LSRFortessa (BD).
[00203] Os resultados de análise de expressão de CDI9-CAR por análise de citometria de fluxo em células T primárias humanas cultivadas transfectadas com hCD3/hCD28-composto 12-pcDNA3.1-hCD19CAR são mostrados em Figura 1. À taxa de CDI9 CAR-positiva em 3 e 6 dias após a adição de anticorpo-LNP foi 51,9% e 41,7%, respectivamente, e células CAR-positivas foram obtidas com eficácia suficiente comparado com transferência de genes por vetor viral.
[00204] Os resultados de análise de expressão de CDI9-CAR por análise de citometria de fluxo em células T primárias humanas cultivadas transfectadas com hCD3/hCD28-composto 21-pcDNA3.1-hCDIICAR e hCD3/hCD28-composto 35-pcDNA3.1-hCD19CAR são mostrados em Figura 2. As taxas de CDI9 CAR- positivas em 3 dias após a adição de anticorpo-LNP foram 5,12% e 47,0%, respectivamente.
Exemplo 10 (Avaliação de citotoxicidade de câncer por células T primárias humanas cultivadas transfectadas com CD19 CAR por anticorpo-LNP)
[00205] Linhagem de células pré-B humanas NALM-6 e linhagem de células de linfoma de Burkitt humanas Daudi marcadas com o kit de teste de citotoxicidade DELFIA (Perkin Elmer) como células alvos foram semeadas em uma densidade de células de 1x10º célula/100 ul/cavidade em uma placa de fundo em U de 96 cavidades. Como o meio, RPMI contendo FBS a 10% (livre de vermelho fenol) foi usado. Sucessivamente, células T primárias humanas cultivadas transfectadas com CDI9CAR por hCD3/hCD28-composto 12-pcDNA3.1- hCDI9CAR pelo método descrito em outra seção (taxa de CDI9CAR positivo 3 dias após a adição de anticorpo-LNP: 19%) foram adicionadas como uma célula efetora por dispersão em 100 ul de meio tal que a razão de número de células com célula salvos foi O a 16. Três horas após a mistura da célula alvo e da célula efetora, ul do sobrenadante de cultura foi coletado. Solução de Európio (Eu) (20 ul) foi
140 / 141 adicionada para o sobrenadante de cultura coletado, e a taxa de citotoxicidade foi calculada a partir da intensidade de fluorescência emitida pelo complexo do agente quelante TDA e Eu liberados da célula alvo danificada.
[00206] A taxa de citotoxicidade de Nalm-6 e Daudi devido à adição de células T primárias humanas transfectadas com CDI9 CAR é mostrada em Figura 3.
Exemplo 11 (Preparação de Fab' reduzido)
[00207] Fab' reduzido a ser conjugado para Maleimida-LNP foi preparado a partir de anticorpo CD3e anti-camundongo (BEOO01-1, BioXCell) e anticorpo CD28 anti-camundongo (BEO015-1, BioXCell) usando kit de Preparação de F(ab')2 Pierce (Thermo Fisher Scientific). 1 ml de 1,75 mg/ml F(ab')2 foi obtido a partir de 7,86 mg/ml de anticorpo CD3e anti-camundongo (0,5 ml). 0,62 ml de F(ab')2 0,97 mg/ml foi obtido a partir de 3,86 mg/ml de anticorpo CD28 anti- camundongo (0,5 ml). Cada F(ab')2 foi misturado com p-toluenossulfonato de 2- aminoetanotiol como um agente redutor a uma concentração de 40 mM e a mistura foi deixada permanecer a 37ºC durante 1 h. O Fab” obtido foi purificado por colunas de dessalinização Zeba Spin, 7K MWCO-0.5 ml (Thermo Fischer Scientific) e armazenado a 4ºC até reação com Maleimida-LNP. As concentrações da proteína Fab' e grupo tiol foram medidas por absorbância a 230 nm e uma reação colorimétrica de fluorescência com N-(7-dimetilamino-4-metilcoumarin-3- il)maleimida (DACM), respectivamente.
Exemplo 12 (Reação de ligação de Fab' reduzido e Maleimida-LNP)
[00208] CD3eFab' anti-ccamundongo e CD28 Fab' anti-camundongo reduzidos foram misturados a 1/20 quantidade molar para maleimida de maleimida-LNP preparado pelo método acima mencionado. A mistura foi deixada permanecer a temperatura ambiente durante 4 h e então armazenado a 4ºC até a etapa de purificação.
141 /141 Exemplo 13 (Purificação por filtração com gel de Fab'-LNP reduzido)
[00209] Uma mistura de reação de Fab' e Maleimida-LNP reduzidos foi carregada em uma coluna de filtração com gel Sepharose CL4B (Número de catálogo 17-0150-01/GE Healthcare), e fracionada com D-PBS(-) como uma fase móvel. Sucessivamente, a concentração de proteína de cada fração foi medida para identificar a fração contendo o Fab'-LNP de interesse. O Fab'-LNP foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 um e armazenado a 4ºC. O tamanho de partícula do anticorpo-LNP obtido foi medida por Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical). As concentrações da proteína de ácido nucleico e anticorpo foram medidas usando o kit de teste de dsDNA Quant-iT"M PicoGreen'"Y (Thermo Fisher Scientific) e o kit de Derivatização de Amina FQ ATTO-TAG"Y (Thermo Fisher Scientific), respectivamente.
[Aplicabilidade Industrial]
[00210] A nanopartícula lipídica da presente invenção pode introduzir CAR ou TCR exógeno eficientemente e célula T seletivamente, não apenas ex vivo, mas também in vivo e, assim, pode prover terapia com células CAR-T ou TCR-T com baixos custos de produção. Além disso, porque um vetor viral não é usado, o problema de antigenicidade por proteínas virais pode ser evitado, e isto é extremamente útil como uma nova plataforma para a imunoterapia de câncer.
[00211] Este pedido é baseado em um pedido de patente No. 2017-252616 depositado no Japão (data de depósito: 27 de dezembro de 2017), cujo conteúdo é aqui incorporado por completo por referência.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES
1. Nanopartícula lipídica, caracterizada pelo fato de que compreende os seguintes (a) a (c): (a) um ácido nucleico codificanto um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno; (b) um lipídeo catiônico; e (c) um lipídeo não catiônico.
2. Nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o lipídeo catiônico acima mencionado é um composto representado pela fórmula (D: nº o R' LA dy Rn Ds L O n R3: (OD) Rº em que L' é um grupo C1.22 alquileno, um grupo C222 alquenileno ou um grupo C3.25 alcadienileno, n é um inteiro de O ou 1, R' é (1) um átomo de hidrogênio, (2) um grupo C 2, alquila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C.»> alquila linear e um grupo C2.22 alquenila linear, (3) um grupo C77> alquenila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr, alquila linear e um grupo OC 2, alquenila linear, ou (4) um grupo C3.22 alcadienila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.2> alquila linear e um grupo C7 27 alquenila linear, R? é -CH7-O-CO-RS$, -CH7-CO-O-R” ou -R$, Rô é -CH;-O-CO-RS$, -CH3-CO-O-Rº ou -R$, Rº é um átomo de hidrogênio, -CH3-O-CO-R, -CH;-CO-O-R ou - R, Ró, Rº e R são, cada, independentemente (1) um grupo C1.22 alquila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo Cr», alquila linear e um grupo C7.22 alquenila linear, (2) um grupo C>27 alquenila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.2> alquila linear e um grupo C7 2, alquenila linear, ou (3) um grupo C3.72 alcadienila linear opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados dentre um grupo C1.2> alquila linear e um grupo C7.27 alquenila linear, Rg e Ro são, cada, independentemente, um grupo C1.« alquila, ou um sal dos mesmos.
3. Nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico acima mencionado é mRNA ou DNA.
4. Nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação |, caracterizada pelo fato de que o lipídeo não catiônico acima mencionado é fosfolipídeo, colesterol e/ou PEG-lipídeo.
5. Nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula lipídica acima mencionada tem um ligante que pode ser dirigido para células T sobre a superfície.
6. Nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ligante acima mencionado é um ligante compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um ou mais anticorpos selecionados dentre o grupo consistindo em um anticorpo contra CD3, um anticorpo contra CDA, um anticorpo contra CD8 e um anticorpo contra CD28.
7. Nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ligante acima mencionado é um ligante compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo contra CD3 e/ou um anticorpo contra CD28.
8. Nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ligante acima mencionado é um ligante compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo contra CD3 e um anticorpo contra CD28.
9. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende a nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1.
10. Medicamento de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento é um fármaco profilático ou terapêutico para câncer.
11. Medicamento de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento introduz um gene de receptor antigênico quimérico ou de um receptor de célula T exógeno em um imunócito in vivo para induzir uma expressão do mesmo.
12. Medicamento de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento introduz um gene de receptor antigênico quimérico ou de um receptor de célula T exógeno em uma célula T in vivo para induzir uma expressão do mesmo.
13. Método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno por introdução do receptor em um imunócito in vivo de um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1, ao mamífero.
14. Método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno por introdução do receptor em uma célula T in vivo de um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1, ao mamífero.
15. Método para prevenir ou tratar câncer em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1, ao mamífero.
16. Nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para uso na profilaxia ou tratamento de câncer.
17. Uso da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um agente para a profilaxia ou tratamento de câncer.
18. Composição para induzir expressão de um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno, caracterizada pelo fato de que compreende a nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1.
19. Imunócito ex vivo, caracterizado pelo fato de que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
20. Célula T ex vivo, caracterizada pelo fato de que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
21. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende um imunócito ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
22. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende uma célula T ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação | a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
23. Medicamento de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o medicamento é um fármaco profilático ou terapêutico para câncer.
24. Medicamento de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o medicamento é um fármaco para induzir apoptose.
25. Método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno, caracterizado pelo fato de ser por introdução do receptor em um imunócito in vivo, compreendendo a adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
26. Método para expressar um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno em uma célula T in vivo, caracterizado pelo fato de que compreende a adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação | a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
27. Método para prevenir ou tratar câncer em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao mamífero, de um imunócito ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica como definida com a reivindicação 1 a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
28. Método para prevenir ou tratar câncer em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao mamífero, de uma célula T ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
29. Imunócito ex vivo para uso na profilaxia ou tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que o imunócito ex vivo expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
30. Célula T ex vivo para uso na profilaxia ou tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que a célula T ex vivo expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica de acordo com a reivindicação 1 a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
31. Uso do imunócito ex vivo, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um agente para a profilaxia ou tratamento de câncer, em que o imunócito ex vivo expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtido por adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
32. Uso de uma célula T ex vivo, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um agente para a profilaxia ou tratamento de câncer, em que a célula T ex vivo expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno e é obtida por adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
33. Método para produzir um medicamento, compreendendo um imunócito ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo um imunócito ex vivo.
34. Método para produzir um medicamento, compreendendo uma célula T ex vivo que expressa um receptor antigênico quimérico ou um receptor de célula T exógeno, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de adição da nanopartícula lipídica como definida na reivindicação 1 a uma cultura compreendendo uma célula T ex vivo.
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