KR20230107247A - mRNA 치료를 위한 CD4+-T 세포의 생체 내 표적화 - Google Patents

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KR20230107247A
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하미데 파르히즈
드류 와이즈만
이쉬트반 톰바츠
노버트 파르디
블라디미르 무지칸토브
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 표적화 도메인에 접합된 전달 비히클을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 전달 비히클은 적어도 하나의 제제를 포함하고, 표적화 도메인은 CD4+ T 세포 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 기재된 조성물을 사용하여 암, 감염성 질환 및 면역학적 장애를 포함하는 질환 및 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

mRNA 치료제를 위한 CD4+-T 세포의 생체 내 표적화
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 13일에 출원된 미국 가출원 제63/091,010호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 NIH(National Institute of Health)에서 수여한 AI045008 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
면역 세포의 특성을 변경하기 위한 활성화, 억제 또는 변형을 통한 면역 세포의 조절은 면역치료제라고 하는 대중적이고 수요가 높은 치료법이 되었다. 오늘날의 면역치료제는 비싸고 제조하기 어려운 생물학적 단백질 기반 제제에 크게 의존하거나(Pranchevicius 등, 2013, Bioengineered, 4:305-312; Liu 등, 2018, Precision Clinical Medicine, 1:65-74), 또는 면역 세포의 생체외 변형을 필요로 한다 (Schultz 등, 2018, Immunotherapy in Translational Cancer Research; Maugeri 등, 2019, Nature Communications, 10:4333). 일부 예는 면역 세포 기능을 조절하기 위한 항체 또는 사이토카인, 면역 기능을 방향 전환하기 위한 단클론성 항체, 바이러스 감염을 예방하기 위한 T 세포의 유전자 편집, 및 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법을 포함한다 (Schlake 등, 2019, Cellular and Molecular Life Sciences, 76:301-328; Wraith, 2017, Frontiers in immunology 8, 1668-1668; Whilding 등, 2015, Mol Oncol, 9:1994-2018).
암 면역 치료제의 가장 관련성이 높은 적용 중 하나는 CAR T 세포 요법이다. 현재, CAR T 세포는 생체 외에서 생성되며 GMP 세포 처리 시설에서 확장된 세포 배양이 필요하기 때문에 비용이 많이 든다. 또한 악성도가 매우 높은 암을 가지거나 T 세포 수가 매우 적거나 대규모 사용이 필요한 환경을 가진 환자를 위한 치료 옵션이 아니다(Schmidts 등, 2018, Frontiers in immunology, 9:2593-2593; Zhao 등, 2019, Front. Immunol, 10:2250; Junghans, 2017, Cancer Gene Therapy, 24:89-99). CAR T 세포의 강력하고 신속한 생성을 위한 생체 내 T 세포 표적화 mRNA 전달 시스템의 개발이 절실히 필요하다. mRNA 기반 CAR T 세포 치료제는 또한 그렇게 원할 때 일시적인 특성으로 인해 CAR T 세포 유발 독성의 위험을 줄이고 게놈 통합의 위험을 피함으로써 더 안전한 플랫폼을 제공할 수 있다 (Foster 등, 2019, Molecular Therapy, 27:747-756; Foster 등, 2019, Hum Gene Ther, 30:168-178; Kowalski 등, 2019, Molecular Therapy, 27:710-728; Pardi 등, 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:261-279). 더욱이, 또한 mRNA 기반 치료제는 T 세포의 HIV 감염을 예방하기 위한 C-C 케모카인 수용체 5(CCR5) 유전자 녹아웃하거나(Didigu 등, 2014, Blood, 123:61-69; Liu 등, 2017, Cell Biosci, 7:47), 또는 우수한 종양 침윤 림프구(TIL)를 조작하기 위한 프로그래밍된 세포 사멸-1(PD-1) 유전자를 녹아웃하는 것(Bailet 등, 2019, Nature Biotechnology, 37:1425-1434)과 같이 바이러스 감염 및 암을 치료하거나 유전적 결함을 교정하기 위한 유전자 편집 도구를 제공할 수 있다. mRNA 기반 면역치료제 개발의 주요 장애물 중 하나는 효율적인 생체 내 전달이다.
따라서, 현재의 강력한 mRNA 기반 면역치료제의 새로운 부류의 생성 및 도입 및 광범위한 사용을 위한 효율적이고 안전하며 면역 세포 특이적 mRNA 전달 시스템이 당업계에 필요하다. 본 발명은 이러한 미충족 요구를 만족시킨다.
본 발명의 구현예 대한 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 도시된 구현예의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1a 내지 도 1c는 시험관 내에서 CD4 표적화 입자의 결합 및 기능적 활성을 도시한다. 도 1a는 실온(RT)에서 1시간 인큐베이션 후 인간 CD4+ T 세포에 대한 항-인간 CD4/125I 표지된 mRNA-LNP의 특이적 시험관 내 결합을 도시한다. 도 1b는 증가하는 mRNA-LNP 용량 및 이들의 상응하는 평균 형광 강도(MFI)와 함께 인간 CD4+ T 세포에 대한 항-CD4/mRNA-LNP 및 대조군 IgG/mRNA-LNP의 결합을 도시한다. 도 1c는 항-인간 CD4/mRNA-LNP 또는 대조군 IgG/mRNA-LNP로 처리된 인간 CD4+ T 세포에서 측정된 Luc 활성을 도시한다.
도 2a 및 도 2b는 시험관 내에서 Cre mRNA 매개 유전자 재조합을 보여주는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. 도 2a는 CD3+CD8- 세포 중 ZsGreen1+ 세포의 %로 표시되는 Cre mRNA 유도 유전적 재조합 및 결과적인 리포터 유전자 발현을 도시한다. 비장 세포를 Ai6 마우스에서 채취하고 2백만 개의 세포당 1, 3, 6 또는 9μg의 용량으로 Cre mRNA-LNP와 함께 인큐베이션하였다. 항-CD4/mRNA-LNP 투여 시 %ZsGreen1+ 세포를 대조군 IgG/mRNA-LNP 및 비접합된 mRNA-LNP 투여와 비교하였다(****P < 0.0001, 본페로니(Bonferroni) 보정을 사용한 2-원 ANOVA(two-way ANOVA)). 도 2b는 CD3+CD8- 세포 중에서 ZsGreen1 양성 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략을 도시한다.
도 3은 mRNA-LNP 처리된 CD3/CD4 세포 집단의 유동 세포측정 분석을 보여주는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. 비장세포를 Ai6 마우스에서 채취하고 6-웰 플레이트에서 웰당 2백만 개의 세포당 3 μg의 용량으로 Cre mRNA-LNP와 함께 밤새 인큐베이션하였다. CD4 염색의 일시적인 소멸은 항-CD4/mRNA-LNP의 투여 시 관찰되는 반면, 비-표적화 LNP 처리된 세포는 영향을 받지 않는다.
도 4a 내지 도 4d는 생체 내에서 mRNA-LNP를 CD4+ T 세포로 표적화하는 것을 입증하는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. 도 4a는 마우스에서 0.5시간에 125I 표지된 항-CD4/ 및 대조군 IgG/폴리(C) mRNA-LNP의 생체분포를 도시한다. 조직 흡수는 평균 ± SEM으로 표시된다(****P < 0.0001). 도 4b는 주사 후 30분에 125I 표지된 항 CD4/ 또는 대조군 IgG/mRNA-LNP로 처리된 마우스의 혈액에서의 것에 대한 주어진 장기의 %ID/g의 비율로 계산된 국소화 비율을 도시한다. 평균 ± SEM이 표시된다. mRNA-LNP의 정맥 주사 후, 선택된 장기(도 4c)과 비장(도 4d)의 국소화 비율에서 방사성 표지된 항-CD4/mRNA-LNP의 백분율을 정량적으로 측정한 생체 내 mRNA-LNP-결합. 그룹 크기는 3마리의 동물이다. 본페로니 보정을 사용한 2-원 ANOVA(two-way ANOVA)로 통계적 분석을 수행하였다(****P < 0.0001).
도 5a 및 도 5b는 생체 내에서 폴리(C) RNA-LNP를 CD4로 표적화하는 것을 보여주는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. 도 5a는 비장 및 간에서 항-CD4/mRNA-LNP 결합의 생체내 동역학을 면역특이성 지수로서 도시한다. 면역특이성 지수는 항-CD4/ 대 대조군 IgG/mRNA-LNP로 처리된 마우스에서 선택된 장기의 %ID/g의 비율로 계산되었으며, 혈중 수준으로 정규화되었다. 도 5b는 mRNA-LNP의 정맥내 주사 후 선택된 장기에서 방사성 표지된 mRNA-LNP의 백분율의 정량적 측정으로서 대조군 IgG/mRNA-LNP-결합의 생체내 동역학을 도시한다. 그룹 크기는 3마리의 동물이다.
도 6a 내지 도 6d는 생체 내 표적화 mRNA-LNP 발현의 생체분포를 입증하는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. 마우스에 8 μg의 mRNA-LNP를 IV 주사하였다. 항-CD4/ 및 대조군 IgG/Luc mRNA-LNP의 투여 5시간 후 Luc mRNA 발현의 장기 분포는 용해된 조직(도 6a) 및 발광 이미징(도 6b 및 도 6c)에서 Luc 활성을 측정함으로써 평가되었다. 도 6a는 광 단위(LU)/mg 단백질로서 Luc의 정량적 발현을 도시한다. 절개된 마우스 장기(도 6b) 및 (발광성 림프절을 보여주는) 장기 제거 후 전체 시체(도 6c)의 대표적인 샘플 세트는 D-루시페린 투여 후 5분 후에 분석되었다. 도 6d는 mRNA-LNP가 주사된 마우스의 비장으로부터 얻은 CD3+ 세포 제제에서 LU/mg 단백질 값으로서 Luc의 정량적 발현을 도시한다. 도 6a 및 도 6d의 경우 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 그룹 크기는 3마리의 동물이다. 본페로니 보정을 사용한 2-원 ANOVA(two-way ANOVA)로 통계적 분석을 수행하였다(*P < 0.05, ** P < 0.01 및 *** P < 0.001).
도 7a 내지 도 7e는 CD4-표적화 Cre mRNA-LNP의 생체내 투여 시 Cre-매개 유전자 재조합을 입증하는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. 도 7a는 CD4+ T 세포에서의 선택적 유전자 재조합을 위한 항-CD4/mRNA-LNP의 표적화된 전달 및 Ai6 리포터 대립유전자의 원리를 도시하는 개략도를 도시한다: loxP 측접 STOP 카세트의 Cre 매개 절제는 형광 단백질인 ZsGreen1의 강력한 발현을 허용한다. Ai6 마우스는 IV 투여를 통해 Cre mRNA-LNP를 3, 10 및 30 μg의 용량으로 받았다. 비장 및 림프절은 처리 후 24시간에 채취되었고 CD3+CD8- 세포 집단에서 ZsGreen1+ 세포의 %는 유동 세포측정을 사용하여 비장(도 7b) 및 림프절(도 7c) 단일 세포 현탁액에서 결정되었다. 비장(도 7d) 및 림프절(도 7e)에서 시간 경과에 따른 ZsGreen1 발현 CD4+ T 세포 수의 변화는 10 μg의 mRNA-LNP를 IV 주사한 후 모니터링되었다. 그룹 크기는 총 3개의 독립적인 실험에서 8 또는 9마리 (도 7b 및 도 7c) 또는 6 마리 (도 7d 및 도 7e) 동물이다. 각 기호는 한 마리의 동물을 나타내고 수평선은 SEM으로 평균을 나타낸다. 본페로니 보정과 함께 2-원 ANOVA(two-way ANOVA)로 통계적 분석을 수행하였다. 서로 다른 용량의 항-CD4/mRNA-LNP [*P < 0.05, ****P< 0.0001] 및 비접합 mRNA-LNP [####P< 0.0001]를 주사한 후 %ZsGreen1+ 세포를 비교하였다.
도 8a 및 도 8b는 Cre mRNA-LNP의 생체 내 투여 시 비-T 세포에서 Cre 매개 유전자 재조합을 입증하는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. Ai6 마우스는 IV 투여를 통해 Cre mRNA-LNP를 3, 10 및 30 μg의 용량으로 받았다. 처리 24시간 후, 비장의 수지상 세포(MHCII+CD11c+)(도 8a) 및 대식세포(MHCII+F4/80+)(도 8b)의 %ZsGreen1+ 세포를 유동 세포측정을 사용하여 비장 단일 세포 현탁액에서 측정하였다. 그룹 크기는 총 3개의 독립적인 실험에서 8 내지 9마리의 동물이다. 각 기호는 한 마리의 동물을 나타내고 수평선은 SEM으로 평균을 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 다른 T 세포 하위유형에 의한 Cre mRNA-LNP의 생체 내 흡수를 입증하는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. 10 μg의 Cre mRNA-LNP로 처리 후 24시간에 비장을 채취하고, CD4+ T 세포 하위집단(도 9a) 대 CD25 마커(도 9b)에서 ZsGreen1+ 세포의 %를 유동 세포측정을 사용하여 결정하였다. 나이브 CD4+ T 세포는 CD44-CD62L-로, 중심 기억 T 세포는 CD44+CD62L+로, 이펙터 기억 T 세포는 CD44+CD62L-로 간주된다. 그룹 크기는 3 내지 11 마리의 동물이다. 각 기호는 한 마리의 동물을 나타내고 수평선은 SEM으로 평균을 나타낸다. 통계적 분석은 T 세포 하위유형을 비교하는 본페로니 보정과 함께 2-원 ANOVA(two-way ANOVA)에 의해 수행되었다. 도 9c는 서로 다른 CD4+ T 세포 하위유형 중에서 ZsGreen1 양성 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략을 도시한다.
도 10a 및 도 10b는 다중 투여를 사용하여 mRNA-LNP 표적화 효율을 입증하는 예시적인 실험의 결과를 도시한다. Ai6 마우스에는 3일 또는 5일 동안 매일 주사로 IV 투여를 통해 10 μg(0.4 mg/kg)의 항-CD4/, 대조군 IgG/ 또는 비접합된 Cre mRNA-LNP를 투여하였다. 비장 및 림프절은 3회 또는 5회의 순차적 주사 후 채취되었고, CD3+CD8- 세포 집단에서 ZsGreen1+ 세포의 %는 유동 세포측정을 사용하여 비장(도 10a) 및 림프절(도 10b) 단일 세포 현탁액에서 결정되었다. 그룹 크기는 9마리의 동물이다. 각 기호는 한 마리의 동물을 나타내고 수평선은 평균을 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 본페로니 보정과 함께 2-원 ANOVA(two-way ANOVA)로 통계적 분석을 수행하였다. 항-CD4/mRNA-LNP[**P < 0.01, ****P< 0.0001]의 다양한 주사 후 %ZsGreen1+ 세포를 비교하였다.
본 발명은 CD4+ T 세포 표적화 도메인에 접합된 전달 비히클을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 전달 비히클은 적어도 하나의 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 표적화 도메인은 CD4에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 전달 비히클은 표적화 도메인에 접합된 PEG-지질을 포함하는 지질 나노입자이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제제는 핵산이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제제는 mRNA 분자이다. 한 구현예에서, mRNA 분자는 뉴클레오시드 변형된 mRNA이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 다음 용어 각각은 이 섹션에서 연관된 의미를 갖는다.
관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
양, 시간적 지속시간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약"은 명시된 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, 또는 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것을 의미하며, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하는 데 적합하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 항원 또는 에피토프와 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 다클론성 항체, 단클론성 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2, 뿐만 아니라 단일 사슬 항체 및 인간화 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow 등, 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow 등, 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird 등, 1988, Science 242:423-426).
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭하고 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 중쇄"라는 용어는 모든 항체 분자에 자연 발생 형태로 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 경쇄"라는 용어는 모든 항체 분자에 자연 발생 형태로 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. k 및 l 경쇄는 두 가지 주요 항체 경쇄 아이소타입을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "합성 항체"란 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예를 들어 박테리오파지에 의해 발현되는 항체를 의미한다. 이 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용가능하고 당업계에 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다. 상기 용어는 또한 항체를 인코딩하는 RNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 한다. RNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 지정하는 아미노산 서열을 발현하며, 여기서 RNA는 DNA(합성 또는 클로닝)을 전사하거나 이용가능하고 당업계에 잘 알려진 다른 기술에 의해 얻어진다.
"질환"은 동물의 항상성을 유지할 수 없는 동물의 건강 상태이며, 여기서 질환이 개선되지 않으면 동물의 건강이 계속 악화된다. 대조적으로, 동물의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만 동물의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 유리한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하면 장애가 반드시 동물의 건강 상태를 추가로 감소시키는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이점을 제공하는 양을 의미한다.
"인코딩(encoding)"는 뉴클레오티드의 한정된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 한정된 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 유전자는 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 단백질 또는 그 유전자의 다른 생성물 또는 cDNA를 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관 내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합체 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 함유됨) RNA, 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스)과 같은 모든 당해 분야에서 알려진 것들을 포함한다.
"상동성"은 2개의 폴리펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 서열 모두에서 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 두 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되면 분자는 그 위치에서 상동이다. 2개의 서열 사이의 상동성 백분율은 2개의 서열이 공유하는 매칭 또는 상동 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100으로 곱한 함수이다. 예를 들어, 두 서열의 위치 중 10개 중 6개가 일치하거나 상동인 경우 두 서열은 60% 상동이다. 예를 들어, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로 최대 상동성을 제공하도록 2개의 서열이 정렬될 때 비교가 이루어진다.
"단리된"은 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"되지 않지만, 동일한 핵산 또는 펩티드는 자연적 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 단리되어 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 일반적으로 발생하는 뉴클레오시드(N-글리코시드 연결을 통해 리보스 또는 데옥시리보스 당에 결합된 핵염기)에 대한 다음 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시티딘을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, 그리고 "U"는 우리딘을 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조절하는"은 치료 또는 화합물이 없는 대상체의 반응 수준과 비교하고/하거나 달리 동일하지만 치료받지 않은 대상체의 반응 수준과 비교하여 대상체에서 반응 수준의 검출가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 이 용어는 자연 신호 또는 반응을 교란 및/또는 영향을 미침으로써 대상체, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포괄한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질과 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에는 인트론이 포함될 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열은 세포에서 번역 기구에 의해 번역될 수 있는 변형된 뉴클레오시드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 일부 또는 모든 우리딘이 슈도우리딘, 1-메틸 슈도우리딘 또는 다른 변형된 뉴클레오시드로 대체된 mRNA를 포함한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종성 핵산 서열의 발현을 초래하는 이종성 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로 작동 가능하게 연결된 DNA 또는 RNA 서열은 인접하고, 동일한 해독틀에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결해야 한다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 시험관 내 또는 인시투(in situ) 임의의 동물 또는 그의 세포를 지칭한다. 특정 비제한적 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 사슬로 정의된다. 또한 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환가능하다. 당업자는 핵산이 단량체 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에 사용된 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 재조합 수단, 즉 통상의 클로닝 기술 및 PCRTM 등을 사용한 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝, 및 합성 수단을 포함한 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다.
특정 사례에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 핵산을 지칭하는 "뉴클레오시드 변형 핵산"이다. "변형된 뉴클레오시드"는 변형이 있는 뉴클레오시드를 지칭한다. 예를 들어, RNA에서 100개 이상의 다른 뉴클레오시드 변형이 확인되었다(Rozenski, 등, 1999, The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197).
특정 구현예에서, "슈도우리딘"은 또 다른 구현예에서 m1acp3Y(1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필) 슈도우리딘을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 m1Y(1-메틸슈도우리딘)을 지칭한다. 다른 구현예에서, 상기 용어는 Ym(2'-O-메틸슈도우리딘을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 m5D(5-메틸디하이드로우리딘)를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 m3Y(3-메틸슈도우리딘)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 추가로 변형되지 않은 슈도우리딘 모이어티를 지칭한다. 다른 구현예에서, 상기 용어는 임의의 상기 슈도우리딘의 모노포스페이트, 디포스페이트, 또는 트리포스페이트를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 당업계에 공지된 임의의 다른 슈도우리딘을 지칭한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 예를 들어 당업계에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 지칭되는 단쇄 및 당업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 보다 긴 사슬을 지칭하며, 이들 중 많은 유형이 있다. "폴리펩티드"는 그 중에서도 예를 들어, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열로 정의된다. 예를 들어, 박테리오파아지 RNA 중합효소에 의해 인식되고 시험관 내 전사에 의해 mRNA를 생성하는데 사용되는 프로모터.
친화성 리간드, 특히 항체와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다"는 특정 항원을 인식하지만 샘플 내의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 한 종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 하나 이상의 다른 종의 항원에도 결합할 수 있다. 그러나 이러한 교차종 반응성 자체가 항체의 분류를 특이적으로 변경하지는 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 다른 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나 이러한 교차 반응성 자체가 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경하지는 않는다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 상호작용이 화학종에 대한 특정 구조(예를 들어 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미하기 위해 항체, 단백질 또는 펩티드와 제2의 화학종과의 상호작용과 관련하여 사용될 수 있고; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A를 함유하는 분자(또는 유리, 표지되지 않은 A)의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 억제, 축소, 관해 또는 박멸에 의해 얻어진다.
용어 "치료 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 찾고 있는 조직, 시스템 또는 대상체의 생물학적 또는 의료 반응을 유도할 대상 화합물의 양을 지칭한다. 용어 "치료 유효량"이 투여될 때 치료되는 장애 또는 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발생을 예방하거나 어느 정도 완화시키기에 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료 유효량은 화합물, 치료 대상체의 질환 및 이의 중증도 및 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어로서 질환을 "치료한다"는 것은 대상체가 경험하는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상 세포 및 그 자손을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "전사 조절하에 있는" 또는 "작동적으로 연결된"이라는 어구는 프로모터가 RNA 중합효소에 의한 전사 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 배향에 있음을 의미한다.
용어 "벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서, "벡터"라는 용어는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 예를 들어 폴리라이신 화합물, 리포솜 등과 같이 핵산을 세포로 전달하는 것을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"알킬"은 탄소 및 수소 원자만으로 구성된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬 라디칼을 지칭하고, 이 라디칼은, 이 라디칼은 포화 또는 불포화되고 (즉, 하나 이상의 이중 및/또는 삼중 결합을 함유함), 1 내지 24개의 탄소 원자 (C1-C24 알킬), 1 내지 12개의 탄소 원자 (C1-C12 알킬), 1 내지 8개의 탄소 원자 (C1-C8 알킬) 또는 1 내지 6개의 탄소 원자 (C1-C6 알킬)를 가지며, 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착되고, 그 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸 (이소프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸 (t 부틸), 3-메틸헥실, 2-메틸헥실, 에테닐, 프로프-1-에닐, 부트-1-에닐, 펜트-1-에닐, 펜타-1,4-디에닐, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 등이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬 기는 선택적으로 치환된다.
"알킬렌" 또는 "알킬렌 사슬"은 탄소 및 수소 원자만으로 구성된 분자의 나머지 부분을 라디칼 기에 연결하는 직쇄 또는 분지형 2가 탄화수소 사슬을 지칭하며, 이 사슬은 포화 또는 불포화되고 (즉, 하나 이상의 이중 (알케닐렌) 및/또는 삼중 결합 (알키닐렌)을 함유하고), 예를 들어, 1 내지 24개의 탄소 원자 (C1-C24 알킬렌), 1 내지 15개의 탄소 원자 (C1-C15 알킬렌), 1 내지 12개의 탄소 원자 (C1-C12 알킬렌), 1 내지 8개의 탄소 원자 (C1-C8 알킬렌), 1 내지 6개의 탄소 원자 (C1-C6 알킬렌), 2 내지 4개의 탄소 원자 (C2-C4 알킬렌), 1 내지 2개의 탄소 원자 (C1-C2 알킬렌)를 가지며, 그 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, n-부틸렌, 에테닐렌, 프로페닐렌, n-부테닐렌, 프로피닐렌, n-부티닐렌, 등이다. 알킬렌 사슬은 단일 또는 이중 결합을 통해 분자의 나머지 부분에 부착되고 단일 또는 이중 결합을 통해 라디칼 기에 부착된다. 분자의 나머지와 라디칼 기에 대한 알킬렌 사슬의 부착점은 사슬 내의 1개의 탄소 또는 임의의 2개의 탄소를 통해 이루어질 수 있다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬렌 사슬은 선택적으로 치환될 수 있다.
"사이클로알킬" 또는 "카보사이클릭 고리"는 탄소 및 수소 원자로만 구성된 안정한 비-방향족 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소 라디칼을 지칭하고, 이 라디칼은 3 내지 15개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 융합되거나 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있고, 포화되거나 불포화되고 단일 결합에 의해 분자의 나머지 부분에 부착된다. 모노사이클릭 라디칼은 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸을 포함한다. 폴리사이클릭 라디칼은 예를 들어, 아다만틸, 노르보르닐, 데칼리닐, 7,7 디메틸 바이사이클로[2.2.1]헵타닐, 등을 포함한다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 사이클로알킬 기는 선택적으로 치환된다.
"사이클로알킬렌"은 2가 사이클로알킬 기이다. 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 사이클로알킬렌 기는 선택적으로 치환될 수 있다.
"헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클릭 고리"는 2개 내지 12개의 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 6개의 헤테로원자로 이루어진 안정한 3-원 내지 18-원 비-방향족 고리 라디칼을 지칭한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로사이클릴 라디칼은 융합 또는 가교 고리 시스템을 포함할 수 있는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템일 수 있고; 헤테로사이클릴 라디칼의 질소, 탄소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있으며; 질소 원자는 선택적으로 사차화될 수 있고; 헤테로사이클릴 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다. 이러한 헤테로사이클릴 라디칼의 예는 디옥소라닐, 티에닐[1,3]디티아닐, 데카하이드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모폴리닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로이소인돌릴, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴누클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로푸릴, 트리티아닐, 테트라하이드로피라닐, 티오모폴리닐, 티아모폴리닐, 1-옥소-티오모폴리닐, 및 1,1-디옥소 티오모폴리닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로사이클릴 기는 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치환된"은 하기로 제한되지 않는 것과 같은, 적어도 하나의 수소 원자가 비-수소 원자에 대한 결합으로 대체된 임의의 상기 기(예를 들어, 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴)를 의미한다: 할로겐 원자 예컨대 F, Cl, Br, 및 I; 옥소 기 (=O); 하이드록실 기 (-OH); 알콕시 기 (-ORa, 여기서 Ra는 C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬임); 카복실 기 (-OC(=O)Ra 또는 -C(=O)ORa, 여기서 Ra는 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬임); 아민 기 (-NRaRb, 여기서 Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬임); C1-C12 알킬 기; 및 사이클로알킬 기. 일부 구현예에서 치환기는 C1-C12 알킬 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 사이클로알킬 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 플루오로와 같은 할로 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 옥소 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 하이드록실 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 알콕시 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 카복실 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 아민 기이다.
"선택적" 또는 "선택적으로"(예를 들어, 선택적으로 치환된)는 후속적으로 기재된 상황의 사건이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있고, 상기 기재가 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우, 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 알킬"은 알킬 라디칼이 치환되거나 치환되지 않을 수 있고 설명이 치환된 알킬 라디칼 및 치환을 갖지 않는 알킬 라디칼 모두를 포함함을 의미한다.
범위: 본 개시내 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태가 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서 범위의 설명은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치를 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1에서 6과 같은 범위의 설명은 구체적으로 개시된 하위범위 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
설명
본 발명은 부분적으로 전달 비히클의 표적화된 전달을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 표적화 도메인에 접합된 전달 비히클을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 전달 비히클은 적어도 하나의 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 전달 비히클은 mRNA, 뉴클레오시드 변형 RNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 안티센스 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 RNA 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 전달 비히클은 치료제를 포함한다. 한 구현예에서, 치료제는 뉴클레오시드 변형 RNA이다.
다양한 구현예에서, 표적화 도메인은 T 세포 항원의 세포 표면 분자에 결합한다. 한 구현예에서, T 세포 항원은 CD4+ T 세포의 표면 항원이다. 한 구현예에서, T 세포 표면 항원은 CD4이다.
한 구현예에서, 조성물은 CD4 또는 CD4+ T 세포의 표면 항원에 결합하여 조성물을 CD4+ T 세포로 향하게 하는 표적화 도메인에 접합된 전달 비히클을 포함한다.
한 구현예에서, 전달 비히클은 CD4+ T 세포 조절을 위한 제제를 포함하거나 캡슐화한다. 일부 구현예에서 제제는 핵산 분자이다. 일부 구현예에서 핵산 분자는 뉴클레오시드 변형 mRNA이다.
한 구현예에서, 전달 비히클은 CD4+ T 세포 조절을 위한 치료제를 포함하거나 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 치료제는 뉴클레오시드 변형 mRNA이다. 일부 구현예에서 치료제는 mRNA 기반 면역치료제이다.
본 발명은 또한 부분적으로 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 CD4 또는 CD4+ T 세포의 표면 항원에 결합하는 표적화 도메인에 접합된 제제를 포함하는 전달 비히클을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다.
본 발명의 CD4 T 세포 표적화 치료 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 예시적인 질환 및 장애는 암, 감염성 질환 및 면역학적 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비제한적인 예로서, 한 구현예에서, 본 발명의 CD4+ T 세포 표적화 전달 비히클은 HIV 감염 또는 이와 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 분기군 C 전달/창시자 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-1 외피 (Env) 1086C을 인코딩하는 뉴클레오시드 변형 1086C Env mRNA를 포함하거나 캡슐화한다.
전달 비히클 카고(cargo)
다양한 구현예에서, 전달 비히클은 면역 세포를 유전적으로 변형시키는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, mRNA, 발현 벡터 또는 게놈 편집 벡터)의 카고를 포함한다. (예를 들어, 세포내이입에 의해) 표적 면역 세포에 의한 전달 비히클의 세포 흡수 후에, 카고 핵산은 엔도좀으로부터 방출된다. 일단 방출되면, 카고 핵산은 대상체의 표적 면역 세포를 변형시켜 하나 이상의 표면 모이어티 (예를 들어, 세포 수용체)을 발현시킨다.
한 구현예에서, 전달 비히클은 적어도 하나의 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 치료제, 영상화제, 진단제, 조영제, 표지화제, 검출제 또는 소독제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제제는 또한 전형적으로 활성 성분으로 간주되지 않는 생물학적 활성을 갖는 물질, 예컨대 방향제, 감미제, 향미 및 풍미 증강 제제, pH 조정제, 발포 제제, 연화제, 증량제, 가용성 유기 염, 침투 제제, 항산화제, 착색제 또는 착색 제제, 등을 포함한다.
한 구현예에서, 전달 비히클은 적어도 하나의 치료제를 포함한다. 본 발명은 임의의 특정 치료제에 제한되지 않고, 오히려 전달 비히클 내에 포함될 수 있는 임의의 적합한 치료제를 포괄한다. 예시적인 치료제는 항-바이러스제, 항박테리아제, 항산화제 제제, 혈전용해제, 화학요법제, 항-염증제, 면역원성 제제, 방부제, 마취제, 진통제, 약제, 소분자, 펩티드, 핵산 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 제제는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 mRNA 분자(예를 들어, 뉴클레오시드 변형 mRNA 분자)이다.
핵산 제제
한 양태에서, 본 개시내용은 활성화 섬유아세포를 억제, 불활성화 및/또는 파괴하는 데 사용하기 위한 mRNA, 발현 벡터, 게놈 편집 벡터, siRNA, shRNA, miRNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 핵산 카고(예를 들어, DNA 또는 RNA)를 포함하는 전달 비히클을 제공한다. 다양한 구현예에서, 핵산 카고는 뉴클레오시드 변형 핵산 분자(예를 들어, 뉴클레오시드 변형 mRNA 분자)일 수 있다. 다양한 구현예에서, 제제는 단리된 핵산이다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 cDNA, mRNA, siRNA, shRNA 또는 miRNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 뉴클레오시드 변형 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 RNA 분자는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 안티센스 분자이다.
다양한 구현예에서, 전달 비히클은 면역 세포를 유전적으로 변형시키는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, mRNA, 발현 벡터, 또는 게놈 편집 벡터, DNA, 또는 RNA)의 카고를 포함한다. (예를 들어, 세포내이입에 의해) 표적 면역 세포에 의한 전달 비히클의 세포 흡수 후에, 카고 핵산은 엔도좀으로부터 방출된다. 일단 방출되면 카고 핵산은 대상체의 표적 면역 세포를 변형시킨다.
한 구현예에서, 핵산은 핵산이 핵산의 발현을 지시할 수 있도록 하는 프로모터/조절 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 문헌[Sambrook 등 (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), and in Ausubel 등 (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)]에 기재되고 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 세포에서 외인성 핵산의 동반 발현과 함께 외인성 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 발현 벡터 및 방법을 포함한다.
뉴클레오시드 변형 RNA 제제
한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 뉴클레오시드 변형 핵산(예를 들어, 뉴클레오시드 변형 mRNA 분자)을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 치료용 단백질과 같은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오시드 변형 RNA를 포함한다.
예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 뉴클레오시드 변형 RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 뉴클레오시드 변형 mRNA를 포함한다. 뉴클레오시드 변형 mRNA는 예를 들어 증가된 안정성, 낮거나 없는 선천적 면역원성 및 강화된 번역을 포함하여 비-변형 mRNA에 비해 특별한 이점을 가지고 있다. 본 발명에 유용한 뉴클레오시드 변형 mRNA는 미국 특허 제8,278,036호, 제8,691,966호 및 제8,835,108호에 추가로 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다.
특정 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 mRNA는 임의의 병태생리학적 경로를 활성화하지 않고, 전달 직후 매우 효율적으로 번역되며, 며칠 동안 지속되는 생체 내 연속 단백질 생산을 위한 주형으로 작용한다(Kariko 등, 2008, Mol Ther 16: 1833-1840; Kariko 등, 2012, Mol Ther 20:948-953). 생리학적 효과를 발휘하는 데 필요한 mRNA의 양이 적기 때문에 인간 요법에 적용할 수 있다.
특정 사례에서, 인코딩 mRNA를 전달하여 단백질을 발현하는 것이 단백질, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터를 사용하는 방법에 비해 많은 이점이 있다. mRNA 형질감염 동안, 원하는 단백질의 코딩 서열은 세포에 전달되는 유일한 물질이므로 플라스미드 백본, 바이러스 유전자 및 바이러스 단백질과 연관된 모든 부작용을 피할 수 있다. 더 중요하게는, DNA 및 바이러스 기반 벡터와 달리, mRNA가 게놈에 통합될 위험이 없으며 mRNA 전달 직후 단백질 생산이 시작된다는 것이다. 예를 들어, 높은 수준의 순환 단백질은 인코딩 mRNA의 생체 내 주입 후 15 내지 30분 이내에 측정되었다. 특정 구현예에서, 단백질보다는 mRNA를 사용하는 것이 또한 많은 이점을 갖는다. 순환에서 단백질의 반감기는 종종 짧기 때문에, 단백질 치료는 빈번한 투약이 필요한 반면, mRNA는 며칠 동안 지속적인 단백질 생산을 위한 주형을 제공한다. 단백질의 정제는 문제가 있으며 역효과를 일으키는 응집체 및 기타 불순물을 함유할 수 있다(Kromminga and Schellekens, 2005, Ann NY Acad Sci 1050:257-265).
특정 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 RNA는 자연 발생 변형된 뉴클레오시드 슈도우리딘을 포함한다. 특정 구현예에서, 슈도우리딘의 내포는 mRNA를 더욱 안정하고, 비면역원성이고, 고도로 번역가능하게 만든다(Kariko 등, 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Anderson 등, 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892; Anderson 등, 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338; Kariko 등, 2011, Nucleic Acids Research 39:e142; Kariko 등, 2012, Mol Ther 20:948-953; Kariko 등, 2005, Immunity 23:165-175).
RNA에서 슈도우리딘을 포함하는 변형된 뉴클레오시드의 존재는 그들의 선천적 면역원성을 억제한다는 것이 입증되었다(Kariko 등, 2005, Immunity 23:165-175). 또한, 슈도우리딘을 함유하는 단백질-코딩, 시험관 내-전사된 RNA는 다른 변형된 뉴클레오시드를 함유하지 않거나 함유하는 RNA보다 더 효율적으로 번역될 수 있다(Kariko 등, 2008, Mol Ther 16:1833-1840). 이후에, 슈도우리딘의 존재는 RNA의 안정성을 개선하고(Anderson 등, 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338), PKR의 활성화 및 번역 억제를 둘 다 감소시키는 것으로 나타났다(Anderson 등, 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892).
슈도우리딘에 대해 기재된 것과 유사한 효과가 1-메틸-슈도우리딘을 함유하는 RNA에 대해서도 관찰되었다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 핵산 분자는 정제된 뉴클레오시드 변형 핵산 분자이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이중 가닥 오염물을 제거하기 위해 조성물을 정제한다. 일부 경우에, 분취용 HPLC 정제 절차를 사용하여 우수한 번역 잠재력을 갖고 선천적 면역원성이 없는 슈도우리딘 함유 RNA를 얻는다(Kariko 등, 2011, Nucleic Acids Research 39:e142). 에리트로포이에틴을 인코딩하는 HPLC-정제된 슈도우리딘 함유 RNA를 마우스 및 마카크에 투여하면 혈청 EPO 수준이 상당히 증가했으며(Kariko 등, 2012, Mol Ther 20:948-953), 따라서 슈도우리딘 함유 mRNA가 생체 내 단백질 요법에 적합하다는 것을 확인한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 핵산 분자는 비-HPLC 방법을 사용하여 정제된다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 변형 핵산 분자는 HPLC 및 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 포함하나 이에 제한되지 않는 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제된다. 예시적인 FPLC 기반 정제 절차는 문헌[Weissman 등, 2013, Methods Mol Biol, 969: 43-54]에 기재되어 있다. 예시적인 정제 절차는 미국 특허 출원 공개 제US2016/0032316호에 기재되어 있고, 이는 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 RNA, 올리고리보뉴클레오티드 및 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 단리된 핵산을 포함하고, 핵산은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하고, 여기서 핵산은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오시드 변형 RNA는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 IVT RNA이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 RNA는 T7 파아지 RNA 중합효소에 의해 합성된다. 다른 구현예에서, 뉴클레오시드 변형된 mRNA는 SP6 파아지 RNA 중합효소에 의해 합성된다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 RNA는 T3 파아지 RNA 중합효소에 의해 합성된다.
한 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 m1acp3ψ (1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필) 슈도우리딘이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 m1ψ(1-메틸슈도우리딘)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 ψm(2'-O-메틸슈도우리딘이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 m5D(5-메틸디하이드로우리딘)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 m3ψ(3-메틸슈도우리딘)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 추가로 비변형 슈도우리딘 모이어티이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 임의의 상기 슈도우리딘의 모노포스페이트, 디포스페이트, 또는 트리포스페이트이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 당업계에 공지된 임의의 다른 슈도우리딘 유사 뉴클레오시드이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오시드 변형 RNA에서 변형된 뉴클레오시드는 우리딘(U)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 시티딘(C)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 아데노신(A)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 구아노신(G)이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 뉴클레오시드는 m5C(5-메틸시티딘)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 m5U(5-메틸우리딘)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 m6A(N6-메틸아데노신)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 s2U(2-티오우리딘)이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 ψ(슈도우리딘)이다. 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 Um(2'-O-메틸우리딘)이다.
다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 m1A (1-메틸아데노신); m2A (2-메틸아데노신); Am (2'-O-메틸아데노신); ms2m6A (2-메틸티오-N6-메틸아데노신); i6A (N6-이소펜테닐아데노신); ms2i6A (2-메틸티오-N6이소펜테닐아데노신); io6A (N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신); ms2io6A (2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐) 아데노신); g6A (N6-글라이시닐카바모일아데노신); t6A (N6-트레오닐카바모일아데노신); ms2t6A (2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신); m6t6A (N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신); hn6A(N6-하이드록시노르발릴카바모일아데노신); ms2hn6A (2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴 카바모일아데노신); Ar(p) (2'-O-리보실아데노신 (포스페이트)); I (이노신); m1I (1-메틸이노신); m1Im (1,2'-O-디메틸이노신); m3C (3-메틸시티딘); Cm (2'-O-메틸시티딘); s2C (2-티오시티딘); ac4C (N4-아세틸시티딘); f5C (5-포르밀시티딘); m5Cm (5,2'-O-디메틸시티딘); ac4Cm (N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘); k2C (라이시딘); m1G (1-메틸구아노신); m2G (N2-메틸구아노신); m7G (7-메틸구아노신); Gm (2'-O-메틸구아노신); m2 2G (N2,N2-디메틸구아노신); m2Gm (N2,2'-O-디메틸구아노신); m2 2Gm (N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신); Gr(p) (2'-O-리보실구아노신 (포스페이트)); yW (와이부토신); o2yW (퍼옥시와이부토신); OHyW (하이드록시와이부토신); OHyW* (미변형 하이드록시와이부토신); imG (와이오신); mimG (메틸와이오신); Q (퀘우오신); oQ (에폭시퀘우오신); galQ (갈락토실-퀘우오신); manQ (만노실-퀘우오신); preQ0 (7-시아노-7-데아자구아노신); preQ1 (7-아미노메틸-7-데아자구아노신); G+ (아케오신); D (디하이드로우리딘); m5Um (5,2'-O-디메틸우리딘); s4U (4-티오우리딘); m5s2U (5-메틸-2-티오우리딘); s2Um (2-티오-2'-O-메틸우리딘); acp3U (3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘); ho5U (5-하이드록시우리딘); mo5U (5-메톡시우리딘); cmo5U (우리딘 5-옥시아세트산); mcmo5U (우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르); chm5U (5-(카복시하이드록시메틸)우리딘)); mchm5U (5-(카복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르); mcm5U (5-메톡시카보닐메틸우리딘); mcm5Um (5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸우리딘); mcm5s2U (5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘); nm5s2U (5-아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5U (5-메틸아미노메틸우리딘); mnm5s2U (5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5se2U (5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘); ncm5U (5-카바모일메틸우리딘); ncm5Um (5-카바모일메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5U (5-카복시메틸아미노메틸우리딘); cmnm5Um (5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5s2U (5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘); m6 2A (N6,N6-디메틸아데노신); Im (2'-O-메틸이노신); m4C (N4-메틸시티딘); m4Cm (N4,2'-O-디메틸시티딘); hm5C (5-하이드록시메틸시티딘); m3U (3-메틸우리딘); cm5U (5-카복시메틸우리딘); m6Am (N6,2'-O-디메틸아데노신); m6 2Am (N6,N6,O-2'-트리메틸아데노신); m2,7G (N2,7-디메틸구아노신); m2,2,7G (N2,N2,7-트리메틸구아노신); m3Um (3,2'-O-디메틸우리딘); m5D (5-메틸디하이드로우리딘); f5Cm (5-포르밀-2'-O-메틸시티딘); m1Gm (1,2'-O-디메틸구아노신); m1Am (1,2'-O-디메틸아데노신); τm5U (5-타우리노메틸우리딘); τm5s2U (5-타우리노메틸-2-티오우리딘)); imG-14 (4-탈메틸와이오신); imG2 (이소와이오신); 또는 ac6A (N6-아세틸아데노신)이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오시드 변형 RNA는 상기 변형 중 2개 이상의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 RNA는 상기 변형 중 3개 이상의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 RNA는 상기 변형 중 3개 초과의 조합을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오시드 변형된 잔기의 0.1% 내지 100%가 변형된다(예를 들어 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오시드 염기의 존재에 의해). 또 다른 구현예에서, 잔기의 0.1%가 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 잔기의 분율은 0.2%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.3%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.4%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.5%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.6%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.8%이다. 다른 구현예에서, 분율은 1%이다. 다른 구현예에서, 분율은 1.5%이다. 다른 구현예에서, 분율은 2%이다. 다른 구현예에서, 분율은 2.5%이다. 다른 구현예에서, 분율은 3%이다. 다른 구현예에서, 분율은 4%이다. 다른 구현예에서, 분율은 5%이다. 다른 구현예에서, 분율은 6%이다. 다른 구현예에서, 분율은 8%이다. 다른 구현예에서, 분율은 10%이다. 다른 구현예에서, 분율은 12%이다. 다른 구현예에서, 분율은 14%이다. 다른 구현예에서, 분율은 16%이다. 다른 구현예에서, 분율은 18%이다. 다른 구현예에서, 분율은 20%이다. 다른 구현예에서, 분율은 25%이다. 다른 구현예에서, 분율은 30%이다. 다른 구현예에서, 분율은 35%이다. 다른 구현예에서, 분율은 40%이다. 다른 구현예에서, 분율은 45%이다. 다른 구현예에서, 분율은 50%이다. 다른 구현예에서, 분율은 60%이다. 다른 구현예에서, 분율은 70%이다. 다른 구현예에서, 분율은 80%이다. 다른 구현예에서, 분율은 90%이다. 다른 구현예에서, 분율은 100%이다.
다른 구현예에서, 분율은 5% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 3% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 1% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 2% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 4% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 6% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 8% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 10% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 12% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 15% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 20% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 30% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 40% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 50% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 60% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 70% 미만이다.
또 다른 구현예에서, 주어진 뉴클레오시드(즉, 우리딘, 시티딘, 구아노신 또는 아데노신)의 잔기의 0.1%가 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 주어진 뉴클레오티드의 분율은 0.2%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.3%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.4%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.5%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.6%이다. 다른 구현예에서, 분율은 0.8%이다. 다른 구현예에서, 분율은 1%이다. 다른 구현예에서, 분율은 1.5%이다. 다른 구현예에서, 분율은 2%이다. 다른 구현예에서, 분율은 2.5%이다. 다른 구현예에서, 분율은 3%이다. 다른 구현예에서, 분율은 4%이다. 다른 구현예에서, 분율은 5%이다. 다른 구현예에서, 분율은 6%이다. 다른 구현예에서, 분율은 8%이다. 다른 구현예에서, 분율은 10%이다. 다른 구현예에서, 분율은 12%이다. 다른 구현예에서, 분율은 14%이다. 다른 구현예에서, 분율은 16%이다. 다른 구현예에서, 분율은 18%이다. 다른 구현예에서, 분율은 20%이다. 다른 구현예에서, 분율은 25%이다. 다른 구현예에서, 분율은 30%이다. 다른 구현예에서, 분율은 35%이다. 다른 구현예에서, 분율은 40%이다. 다른 구현예에서, 분율은 45%이다. 다른 구현예에서, 분율은 50%이다. 다른 구현예에서, 분율은 60%이다. 다른 구현예에서, 분율은 70%이다. 다른 구현예에서, 분율은 80%이다. 다른 구현예에서, 분율은 90%이다. 다른 구현예에서, 분율은 100%이다.
또 다른 구현예에서, 변형된 주어진 뉴클레오티드의 분율은 8% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 10% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 5% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 3% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 1% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 2% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 4% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 6% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 12% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 15% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 20% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 30% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 40% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 50% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 60% 미만이다. 다른 구현예에서, 분율은 70% 미만이다.
일부 구현예에서, 조성물은 단일 가닥 뉴클레오시드 변형 RNA의 정제된 제제를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 가닥 뉴클레오시드 변형 RNA의 정제된 제제는 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 정제된 제제는 모든 다른 핵산 분자 (DNA, dsRNA, 등)에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93 % 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.9% 단일 가닥 뉴클레오시드 변형 RNA이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오시드 변형 RNA는 동일한 서열을 갖는 비변형 RNA 분자보다 더 효율적으로 세포에서 번역된다. 다른 구현예에서, 뉴클레오시드 변형 RNA는 표적 세포에 의해 번역되는 강화된 능력을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 비변형 대응물에 비해 번역이 2배로 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 3배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 5배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 7배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 10배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 15배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 20배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 50배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 100배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 200배 비율까지 강화된다. 다른 구현예에서, 번역은 500배 비율까지 강화된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 1000배 비율까지 강화된다. 다른 구현예에서, 번역은 2000배 비율까지 강화된다. 다른 구현예에서, 비율은 10 내지 1000배이다. 다른 구현예에서, 비율은 10 내지 100배이다. 다른 구현예에서, 비율은 10 내지 200배이다. 다른 구현예에서, 비율은 10 내지 300배이다. 다른 구현예에서, 비율은 10 내지 500배이다. 다른 구현예에서, 비율은 20 내지 1000배이다. 다른 구현예에서, 비율은 30 내지 1000배이다. 다른 구현예에서, 비율은 50 내지 1000배이다. 다른 구현예에서, 비율은 100 내지 1000배이다. 다른 구현예에서, 비율은 200 내지 1000배이다. 또 다른 구현예에서, 번역은 임의의 다른 상당한 양 또는 양의 범위에 의해 강화된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오시드 변형 RNA는 동일한 서열의 비변형 시험관 내 합성된 RNA 분자보다 훨씬 더 적은 선천적 면역원성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 변형 RNA 분자는 비변형 대응물보다 2배 적은 선천적 면역 반응을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 3배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 4배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 5배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 6배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 7배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 8배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 9배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 10배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 15배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 20배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 50배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 100배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 200배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 500배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 1000배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 2000배 비율까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천적 면역원성은 또 다른 배수 차이에 의해 감소된다.
또 다른 구현예에서, "선천적 면역원성이 현저하게 덜 나타난다"는 선천적 면역원성의 검출가능한 감소를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 선천적 면역원성의 배수 감소(예를 들어, 상기 열거된 배수 감소의 1배)를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 뉴클레오시드 변형 RNA의 유효량이 검출가능한 선천적 면역 반응을 촉발하지 않고 투여될 수 있도록 하는 감소를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 뉴클레오시드 변형 RNA가 변형 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 생성을 검출 가능하게 감소시키기에 충분한 선천적 면역 반응을 유발하지 않고 반복적으로 투여될 수 있도록 하는 감소를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 감소는 변형 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 검출가능한 생산을 제거하기에 충분한 선천적 면역 반응을 유발하지 않고 뉴클레오시드 변형 RNA가 반복적으로 투여될 수 있도록 한다.
RNA 간섭 제제
한 구현예에서, siRNA는 표적 단백질의 수준을 감소시키는 데 사용된다. RNA 간섭(RNAi)은 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 다양한 유기체 및 세포 유형에 도입되어 상보적인 mRNA가 분해되는 현상이다. 세포에서, 긴 dsRNA는 다이서(Dicer)로 알려진 리보뉴클레아제에 의해 짧은 21-25개 뉴클레오티드의 작은 간섭 RNA 또는 siRNA로 절단된다. 이후 siRNA는 단백질 성분과 함께 RNA 유도 사일런싱 복합체(RISC)로 조립되어 그 과정에서 풀린다. 그 다음, 활성화된 RISC는 siRNA 안티센스 가닥과 mRNA 사이의 염기쌍 상호작용에 의해 상보적인 전사체에 결합한다. 결합된 mRNA는 절단되고 mRNA의 서열 특이적 분해는 유전자 사일런싱을 초래한다. 예를 들어 문헌[미국 특허 제6,506,559호; Fire 등, 1998, Nature 391(19):306-311; Timmons 등, 1998, Nature 395:854; Montgomery 등, 1998, TIG 14 (7):255-258; David R. Engelke, Ed., RNA Interference (RNAi) Nuts & Bolts of RNAi Technology, DNA Press, Eagleville, PA (2003); 및 Gregory J. Hannon, Ed., RNAi A Guide to Gene Silencing, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2003)]을 참조한다. 문헌[Soutschek 등 (2004, Nature 432:173-178)]은 정맥내 전신 전달을 돕는 siRNA에 대한 화학적 변형을 기재한다. siRNA를 최적화하려면 전체 G/C 함량, 말단의 C/T 함량, Tm 및 3' 오버행의 뉴클레오티드 함량을 고려해야 한다. 예를 들어, 문헌[Schwartz 등, 2003, Cell, 115:199-208 및 Khvorova 등, 2003, Cell 115:209-216]을 참조한다. 따라서, 본 발명은 또한 RNAi 기술을 사용하여 PTPN22의 수준을 감소시키는 방법을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 siRNA 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 바람직하게는, siRNA 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리펩티드의 발현을 억제할 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 혼입시키고 벡터를 선택하는 것은 예를 들어 문헌[Sambrook 등 (2012) 및 Ausubel 등 (1997)] 및 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 벡터는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 제제를 코딩한다. shRNA 분자는 당업계에 잘 알려져 있고 표적의 mRNA에 대해 지시되어 표적의 발현을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 인코딩된 shRNA는 세포에 의해 발현되고, 이어서 siRNA로 가공된다. 예를 들어, 특정 사례에서, 세포는 shRNA를 절단하여 siRNA를 형성하는 천연 효소(예를 들어, 다이서)를 보유한다.
siRNA, shRNA 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 발현을 평가하기 위해, 세포에 도입될 발현 벡터는 또한 본 발명의 전달 비히클을 사용하여 형질감염 또는 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별을 용이하게 하기 위해 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 선택 가능한 마커는 별도의 DNA 조각 상에 운반될 수 있고 또한 전달 비히클 내에 함유될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열과 측접될 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 예컨대 네오마이신 내성 등을 포함한다.
따라서, 한 양태에서, 전달 비히클은 전달될 뉴클레오티드 서열 또는 작제물을 함유하는 벡터를 함유할 수 있다. 벡터의 선택은 이후 도입될 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 발현 벡터이다. 적합한 숙주 세포는 다양한 원핵 및 진핵 숙주 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터 및 포유류 세포 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 원핵생물 및/또는 진핵생물 벡터 기반 시스템을 사용하여 본 발명과 함께 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 이의 동족 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 많은 그러한 시스템이 상업적으로 널리 이용 가능한다.
예로서, 핵산 서열이 도입되는 벡터는 세포에 도입될 때 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 통합되지 않는 플라스미드일 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명의 유전자 작제물이 삽입될 수 있는 벡터의 예시적이고 비-제한적인 예는 진핵생물 세포에서 발현을 위한 tet-on 유도성 벡터를 포함한다.
벡터는 당업자에게 공지된 통상적인 방법으로 얻을 수 있다(Sambrook 등, 2012). 특정 구현예에서, 벡터는 동물 세포를 형질전환하는데 유용한 벡터이다.
한 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 또한 펩티드 또는 펩티드모방체를 인코딩하는 핵산 분자를 함유할 수 있다.
프로모터는 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 그 서열의 하류 또는 상류에 위치한 폴리뉴클레오티드 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 자연 환경에서 폴리뉴클레오티드 서열과 정상적으로 연관되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 코딩 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 위치시킴으로써 특정 이점을 얻을 수 있다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 자연 환경에서 폴리뉴클레오티드 서열과 정상적으로 연관되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 즉 다른 전사 조절 영역의 다른 요소 및/또는 발현을 변경하는 돌연변이를 함유하는 "자연 발생"이 아닌 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 외에도, 서열은 본원에 개시된 조성물과 관련하여 PCRTM을 비롯한 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 대조 서열이 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 소기관 및 유기체에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위해 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합을 사용하는 방법을 알고 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook 등 (2012)]을 참조한다). 사용된 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대규모 생산에 유리한 것과 같이 도입된 DNA 단편의 고수준 발현을 지시하기 위한 적절한 조건 하에서 구성적, 조직 특이적, 유도성 및/또는 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포의 선택을 용이하게 하는 선택 가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 적합한 선택 가능한 마커 유전자는 특정 약물, β-갈락토시다제, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 반딧불이 루시퍼라제, 또는 면역글로불린 또는 그의 일부 예컨대 면역글로불린의 Fc 부분 바람직하게는 IgG에 대한 내성을 부여하는 G418 및 하이그로마이신과 같은 단백질을 인코딩하는 유전자이다. 선택 가능한 마커는 관심 핵산과는 별도인 벡터에 도입될 수 있다.
siRNA 폴리뉴클레오티드의 생성 후, 당업자는 siRNA 폴리뉴클레오티드가 치료 화합물로서 siRNA를 개선하기 위해 변형될 수 있는 특정 특성을 가질 것임을 이해할 것이다. 따라서, siRNA 폴리뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 또는 다른 연결, 메틸포스포네이트, 설폰, 설페이트, 케틸, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스페이트 에스테르, 등을 포함하도록 변형함으로써 분해에 저항하도록 추가로 설계될 수 있다(예를 들어, 문헌[Agrawal 등, 1987, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542; Stec 등, 1985 Tetrahedron Lett. 26:2191-2194; Moody 등, 1989 Nucleic Acids Res. 12:4769-4782; Eckstein, 1989 Trends Biol. Sci. 14:97-100; Stein, In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed., Macmillan Press, London, pp. 97-117 (1989)] 참조).
임의의 폴리뉴클레오티드는 생체 내 안정성을 증가시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 가능한 변형에는 5' 및/또는 3' 단부에 측접 서열의 추가; 백본에서 포스포디에스테르 연결보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및/또는 비전통적인 염기 예컨대 이노신, 퀘우오신, 및 와이부토신 등, 뿐만 아니라 아세틸- 메틸-, 티오- 및 다른 변형된 형태의 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민, 및 우리딘의 내포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 플라스미드 벡터에 의해 발현되는 안티센스 핵산 서열은 표적 단백질의 발현을 억제하는 제제로 사용된다. 안티센스 발현 벡터는 포유류 세포 또는 포유류 자체를 형질감염시켜 표적 단백질의 내인성 발현을 감소시키는 데 사용된다.
유전자 발현을 억제하기 위한 안티센스 분자 및 그의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Cohen, 1989, In: Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press] 참조). 안티센스 핵산은 특정 mRNA 분자의 적어도 일부에 대해 본 명세서의 다른 곳에서 정의된 바와 같이 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다(Weintraub, 1990, Scientific American 262:40). 세포에서, 안티센스 핵산은 해당 mRNA에 혼성화하여 이중 가닥 분자를 형성하여 유전자 번역을 억제한다.
유전자 번역을 억제하기 위한 안티센스 방법의 사용은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Marcus-Sakura (1988, Anal. Biochem. 172:289)]에 기재되어 있다. 이러한 안티센스 분자는 문헌[Inoue, 1993, U.S. Patent No. 5,190,931]에 교시된 바와 같이 안티센스 분자를 인코딩하는 DNA를 사용하여 유전자 발현을 통해 세포에 제공될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 안티센스 분자는 합성으로 만들어진 다음, 세포에 제공될 수 있다. 약 10개 내지 약 30개, 보다 바람직하게는 약 15개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 바람직한데, 그 이유는 쉽게 합성되어 표적 세포에 도입되기 때문이다. 본 발명에 의해 고려되는 합성 안티센스 분자는 비변형 올리고뉴클레오티드와 비교하여 개선된 생물학적 활성을 갖는 당업계에 공지된 올리고뉴클레오티드 유도체를 포함한다(미국 특허 제5,023,243호 참조).
본 발명의 일 구현예에서, 리보자임은 표적 단백질의 발현을 억제하는 제제로 사용된다. 표적 분자의 발현을 억제하는데 유용한 리보자임은 예를 들어 표적 분자를 인코딩하는 mRNA 서열에 상보적인 기본 리보자임 구조에 표적 서열을 통합함으로써 설계될 수 있다. 표적 분자를 표적으로 하는 리보자임은 상업적으로 입수 가능한 시약(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하여 합성하거나 이를 인코딩하는 DNA로부터 유전적으로 발현될 수 있다.
한 구현예에서, 제제는 CRISPR-Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있으며, 표적 분자를 인코딩하는 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA) 및 CRISPR 연관(Cas) 펩티드는 복합체를 형성하여 표적화 유전자 내에서 돌연변이를 유도한다. 한 구현예에서, 제제는 gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 Cas 펩티드 또는 Cas 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
microRNA 제제
한 구현예에서, 제제는 miRNA 또는 miRNA의 모방체를 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 miRNA 또는 miRNA의 모방체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
MiRNA는 번역을 억제하거나 표적화 mRNA를 분해함으로써 세포에서 특정 유전자의 전사 후 사일런싱을 유발할 수 있는 작은 비-인코딩 RNA 분자이다. miRNA는 완전히 상보적일 수 있거나 표적 핵산과 상보적이지 않은 영역을 가질 수 있어 결과적으로 상보적이지 않은 영역에서 "팽출(bulge)"이 발생한다. miRNA는 miRNA가 표적 핵산에 완전히 상보적이지 않은 경우와 같이 번역을 억제하거나 miRNA가 표적에 완벽한 상보성으로 결합할 때만 발생하는 것으로 여겨지는 표적 RNA 분해를 유발하여 유전자 발현을 억제할 수 있다. 본 개시내용은 또한 miRNA의 이중 가닥 전구체를 포함할 수 있다. miRNA 또는 pri-miRNA는 길이가 18 내지 100개인 뉴클레오티드이거나 길이가 18 내지 80개인 뉴클레오티드일 수 있다. 성숙한 miRNA는 19 내지 30개 뉴클레오티드 또는 21 내지 25개 뉴클레오티드, 특히 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. MiRNA 전구체는 전형적으로 약 70 내지 100개의 뉴클레오티드 길이를 가지며 헤어핀 형태를 갖는다. miRNA는 특히 긴 프리-miRNA를 기능성 miRNA로 처리하는 Dicer 및 Drosha 효소에 의해 프리-miRNA로부터 생체 내에서 생성된다. 본 개시내용에서 특징으로 하는 헤어핀 또는 성숙한 microRNA, 또는 pri-microRNA 제제는 세포 기반 시스템에 의해 생체 내에서 또는 화학적 합성에 의해 시험관 내에서 합성될 수 있다.
다양한 구현예에서, 제제는 질환 연관 miRNA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 프리-microRNA, 성숙형 또는 헤어핀 형태의 질환 연관 miRNA의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 질환 연관 miRNA, 임의의 프리-miRNA, 임의의 단편 또는 이들의 임의의 조합의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 조합이 구상된다.
MiRNA는 원하는 특성을 부여하는 변형을 포함하도록 합성될 수 있다. 예를 들어, 변형은 안정성, 표적 핵산과의 혼성화 열역학, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 표적화, 또는 예를 들어, 세포내이입 의존적 또는 비-독립적 메커니즘에 의한 세포 투과성을 개선할 수 있다.
변형은 또한 서열 특이성을 증가시킬 수 있고, 결과적으로 부위외 표적화를 감소시킬 수 있다. 합성 및 화학적 변형 방법은 아래에 자세히 기재되어 있다. 원하는 경우, miRNA 분자를 변형하여 분해에 대해 miRNA를 안정화하거나, 반감기를 강화시키거나, 달리 효능을 개선할 수 있다. 바람직한 변형은 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20070213292, 20060287260, 20060035254, 20060008822, 및 2005028824에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다. 증가된 뉴클레아제 내성 및/또는 표적에 대한 결합 친화성을 위해, 본 개시내용에서 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 제제는 2'-O-메틸, 2'-불소, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-아미노프로필, 2'-아미노, 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 잠금 핵산 (LNA), 에틸렌 핵산 (ENA), 예를 들어, 2'-4'-에틸렌 가교된 핵산, 및 특정 뉴클레오티드 변형의 내포는 또한 표적에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드 백본에 파이라노스 당을 포함시키는 것도 핵산내 분해 절단을 감소시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 3' 양이온성 기를 포함하거나 3'-3' 연결로 3'-말단에서 뉴클레오시드를 반전시킴으로써 추가로 변형될 수 있다. 또 다른 대안에서, 3'-말단은 아미노알킬 기로 차단될 수 있다. 다른 3' 접합체는 3'-5' 핵산외 분해 절단을 억제할 수 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, 3'은 엑소뉴클레아제가 올리고뉴클레오티드의 3' 단부에 결합하는 것을 입체적으로 차단함으로써 핵산외 분해 절단을 억제할 수 있다. 작은 알킬 사슬, 아릴 기 또는 헤테로사이클릭 접합체 또는 변형된 당(D-리보스, 데옥시리보스, 글루코스 등)도 3'-5'-엑소뉴클레아제를 차단할 수 있다.
한 구현예에서, miRNA는 뉴클레아제 내성을 위해 포스포로티오에이트로 변형된 일부 또는 모든 뉴클레오티드간 연결을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드 갭을 함유하는 2' 변형 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 메틸포스포네이트 변형의 존재는 표적 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키고 따라서 IC5Q를 감소시킨다. 이 변형은 또한 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 본 개시내용의 방법 및 시약은 억제성 핵산 분자의 안정성 또는 효능을 강화시키기 위해 개발될 수 있는 임의의 기술과 함께 사용될 수 있음이 이해된다.
miRNA 분자는 변형된 백본 또는 비-천연 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 뉴클레오티드 올리고머를 포함한다. 변형된 백본을 갖는 올리고머는 백본에 인 원자를 보유하는 것과 백본에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 뉴클레오시드간 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 올리고머로 간주된다. 변형된 올리고 뉴클레오티드 백본을 갖는 뉴클레오티드 올리고머는 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보라노포스페이트를 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태도 포함된다.
성숙한 형태 또는 헤어핀 형태일 수 있는 본 명세서에 기재된 miRNA는 네이키드 올리고뉴클레오티드로 제공될 수 있다. 일부 경우에, miRNA 또는 다른 뉴클레오티드 올리고머를 세포로 전달하는 것을 돕는 제형을 이용하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,656,611, 5,753,613, 5,785,992, 6,120,798, 6,221,959, 6,346,613, 및 6,353,055, 이들 각각은 본 명세서에 참조로 포함됨).
일부 예에서, miRNA 조성물은 적어도 부분적 결정성, 균일한 결정성 및/또는 무수물(예를 들어, 80, 50, 30, 20, 또는 10% 미만의 물)이다. 또 다른 예에서, miRNA 조성물은 수성상, 예를 들어 물을 포함하는 용액에 있다. 수성상 또는 결정성 조성물은 전달 비히클, 예를 들어 리포솜(특히 수성상에 대해) 또는 입자(예를 들어, 결정성 조성물에 적합할 수 있는 미세입자)에 통합될 수 있다. 일반적으로 miRNA 조성물은 의도된 투여 방법과 호환되는 방식으로 제형화된다. miRNA 조성물은 다른 제제, 예를 들어 또 다른 치료제 또는 올리고뉴클레오티드 제제를 안정화시키는 제제, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 제제와 복합체를 형성하는 단백질과 조합하여 제형화될 수 있다. 또 다른 제제는 킬레이트제, 예를 들어 EDTA(예를 들어 Mg와 같은 2가 양이온을 제거하기 위한 것), 염 및 RNAse 억제제(예를 들어 광범위한 특이성 RNAse 억제제)를 포함한다. 한 구현예에서, miRNA 조성물은 또 다른 miRNA, 예를 들어, 제2 miRNA 조성물(예를 들어, 제1의 것과 별개인 microRNA)을 포함한다. 또 다른 제제는 적어도 3개, 5개, 10개, 20개, 50개 또는 100개 초과의 다른 올리고뉴클레오티드 종을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 miRNA의 활성을 모방하는 올리고뉴클레오티드 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 miRNA의 핵염기 서열에 대해 핵염기 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 따라서 miRNA의 활성을 모방하도록 설계된다. 특정 구현예에서, miRNA 활성을 모방하는 올리고뉴클레오티드 조성물은 성숙한 miRNA 헤어핀 또는 가공된 miRNA 듀플렉스를 모방하는 이중 가닥 RNA 분자를 포함한다.
한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 내인성 miRNA 또는 miRNA 전구체 핵염기 서열과 동일성을 공유한다. 본 발명의 조성물에 포함시키기 위해 선택된 올리고뉴클레오티드는 다수의 길이 중 하나일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 길이가 7개 내지 100개인 연결된 뉴클레오시드일 수 있다. 예를 들어, miRNA와 핵염기 동일성을 공유하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 7개 내지 30개인 연결된 뉴클레오시드일 수 있다. miRNA 전구체와 동일성을 공유하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 최대 100개인 연결된 뉴클레오시드일 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 7개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 또는 30개의 연결된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 19개 내지 23개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 40개 내지 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개인 연결된 뉴클레오시드이다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 또는 그의 전구체에 대해 특정 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 성숙한 miRNA의 핵염기 서열 및 본 명세서에 기재된 상응하는 스템-루프 서열은 miRNA 서열 및 주석의 온라인 검색 가능 데이터베이스인 miRBase에서 발견되는 서열이다. miRBase Sequence 데이터베이스의 항목은 성숙한 miRNA 서열의 위치 및 서열에 대한 정보와 함께 miRNA 전사체(스템-루프)의 예측된 헤어핀 부분을 나타낸다. 데이터베이스의 miRNA 스템-루프 서열은 엄밀히 말하면 전구체 miRNA(프리-miRNA)가 아니며, 일부 경우에 프리-miRNA와 추정된 일차 전사체의 일부 측접 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 miRNA 핵염기 서열은 miRBase 서열 데이터베이스의 Release 10.0에 기재된 서열 및 miRBase 서열 데이터베이스의 이전 Release에 기재된 서열을 포함하여 miRNA의 임의의 버전을 포함한다. 서열 데이터베이스 릴리스로 인해 특정 miRNA의 이름이 변경될 수 있다. 서열 데이터베이스 릴리스는 성숙한 miRNA 서열의 변형을 초래할 수 있다. 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기재된 miRNA의 임의의 핵염기 서열 버전에 대해 특정 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고머 화합물을 포괄한다.
특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 핵염기의 영역에 비해 miRNA와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵염기 서열을 갖는다. 따라서, 특정 구현예에서 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 miRNA에 대해 하나 이상의 동일하지 않은 핵염기를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 miRNA, 전구체, 모방체 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 원하는 포유류 세포 또는 조직에서 miRNA, 전구체, 모방체 또는 그의 단편을 발현하기에 적합한 다른 발현 벡터를 포함할 수 있다.
시험관 내 전사된 RNA 제제
한 구현예에서, 본 발명의 제제는 시험관 내 전사된 (IVT) RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 제제는 치료 단백질을 인코딩하는 시험관 내 전사 (IVT) RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 제제는 복수의 치료 단백질을 인코딩하는 IVT RNA를 포함한다.
한 구현예에서, IVT RNA는 일시적 형질감염의 형태로서 세포에 도입될 수 있다. RNA는 합성적으로 생성된 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 시험관 내 전사에 의해 생산된다. 임의의 공급원의 관심 DNA는 적절한 프라이머와 RNA 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 시험관 내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 변환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적절한 공급원일 수 있다. 한 구현예에서, 시험관 내 전사를 위한 원하는 주형은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 치료 단백질이다.
한 구현예에서, PCR에 사용되는 DNA는 열린 해독틀을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈에서 자연 발생 DNA 서열에서 유래할 수 있다. 한 구현예에서, DNA는 유전자 일부의 전장 관심 유전자이다. 유전자는 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 유전자는 엑손과 인트론을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, PCR에 사용되는 DNA는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 박테리아, 바이러스, 기생충 및 진균을 포함하는 병원성 또는 공생 유기체로부터의 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR에 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 박테리아, 바이러스, 기생충 및 진균을 포함하는 병원성 또는 공생 유기체로부터 유래한다. DNA는 대안적으로 자연 발생 유기체에서 정상적으로 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 인코딩하는 열린 해독틀을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자 부분을 함유하는 것이다. 함께 결찰된 DNA 부분은 단일 유기체 또는 둘 이상의 유기체에서 유래할 수 있다.
PCR을 위한 DNA의 공급원으로 사용될 수 있는 유전자에는 유기체에서 적응 면역 반응을 유도하거나 강화시키는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자가 포함된다. 바람직한 유전자는 단기 치료에 유용하거나 복용량 또는 발현된 유전자에 대한 안전성 문제가 있는 유전자이다.
다양한 구현예에서, 형질감염에 사용되는 RNA의 시험관 내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 플라스미드가 사용된다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력이 있는 화학 구조도 사용할 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 한 구현예에서, 5' UTR은 길이가 0 내지 3000개인 뉴클레오티드이다. 코딩 영역에 추가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 다른 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머 설계를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 수정할 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 유전자에 대한 자연 발생 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 있는 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머에 통합하거나 주형의 임의의 다른 변형에 의해 추가할 수 있다. 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 수정하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열의 AU가 풍부한 요소는 RNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 잘 알려진 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
한 구현예에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 전술된 바와 같이 PCR에 의해 추가되는 경우, 공통 코작 서열은 5' UTR 서열을 추가함으로써 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율성을 높일 수 있지만 모든 RNA가 효율적인 번역을 가능하게 하는 데 필요한 것으로 보이지는 않는다. 많은 RNA에 대한 코작 서열에 대한 요건은 당업계에 공지되어 있다. 다른 구현예에서 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, RNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 다양한 뉴클레오티드 유사체가 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝 없이 DNA 주형으로부터 RNA 합성을 가능하게 하려면, 전사 프로모터가 전사될 서열의 상류 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 중합효소의 프로모터 역할을 하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 단부에 추가되면 RNA 중합효소 프로모터는 전사될 열린 해독틀의 상향 PCR 산물에 통합된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 프로모터는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 T7 RNA 중합효소 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 중합효소 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다.
바람직한 구현예에서, RNA는 리보솜 결합, 번역 개시 및 세포에서의 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 테일 둘 다에 캡을 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA에서, RNA 중합효소는 진핵 세포에서 발현하기에 적합하지 않은 긴 콘카타머 산물을 생성한다. 3' UTR의 끝에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후 폴리아데닐화될 때 진핵 세포 형질감염에 효과적인 정상 크기의 RNA를 생성한다.
선형 DNA 주형에서, 파아지 T7 RNA 중합효소는 주형의 마지막 염기를 넘어 전사체의 3' 단부를 확장할 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).
polyA/T 스트레치를 DNA 주형으로 통합하는 종래의 방법은 분자 복제이다. 그러나 플라스미드 DNA에 통합된 polyA/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있으며, 이는 플라스미드 증식을 위한 재조합 비적격 박테리아 세포의 사용을 통해 개선될 수 있다.
RNA의 폴리(A) 테일는 폴리(A) 중합효소, 예컨대 E. 콜라이 polyA 중합효소 (E-PAP) 또는 효모 polyA 중합효소를 사용하여 시험관 내 전사 후에 추가로 확장될 수 있다. 한 구현예에서, 폴리(A) 테일의 길이를 100개 뉴클레오티드에서 300 내지 400개 뉴클레오티드로 증가시키면 RNA의 번역 효율이 약 2배 증가한다. 또한, 3' 말단에 다른 화학 기를 부착하면 RNA 안정성을 높일 수 있다. 그러한 부착은 변형된/인공적인 뉴클레오티드, 압타머 및 기타 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 폴리(A) 테일에 통합될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 더욱 증가시킬 수 있다.
5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 방법에 의해 생산된 RNA는 5' cap1 구조를 포함한다. 이러한 cap1 구조는 백시니아 캡핑 효소 및 2'-O-메틸트랜스퍼라제 효소를 사용하여 생성할 수 있다 (CellScript, Madison, WI). 대안적으로, 5' 캡은 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 제공된다(Cougot, 등, Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, 등, RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, 등, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
폴리펩티드 제제
다른 관련 양태에서, 제제는 표적을 조절하는 단리된 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 본 발명의 펩티드는 표적에 결합함으로써 표적을 직접 억제하거나 활성화시켜 표적의 정상적인 기능적 활성을 조절한다. 한 구현예에서, 본 발명의 펩티드는 내인성 단백질과 경쟁함으로써 표적을 조절한다. 한 구현예에서, 본 발명의 펩티드는 트랜스우성 음성 돌연변이체로서 작용함으로써 표적의 활성을 조절한다.
폴리펩티드 제제의 변이체는 (i) 아미노산 잔기 중 하나 이상이 보존되거나 비-보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩된 것일 수도 있고 아닐 수도 있는 것, (ii) 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기, 예를 들어 치환기 기의 부착에 의해 변형된 잔기가 있는 것, (iii) 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드의 대안적인 스플라이스 변이체인 것, (iv) 폴리펩티드의 단편 및/또는 (v) 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드, 예컨대 리더 또는 분비 서열 또는 정제(예: His-tag) 또는 검출(예: Sv5 에피토프 태그)에 사용되는 서열과 융합된 것일 수 있다. 단편은 원래 서열의 단백분해 절단(다중 부위 단백질분해 포함)을 통해 생성된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 번역 후 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변이체는 본 명세서의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
항체 제제
본 발명은 또한 표적에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 포함하는 전달 비히클을 고려한다. 즉, 항체는 표적을 억제하여 유익한 효과를 제공할 수 있다.
항체는 온전한 단클론성 또는 다클론성 항체, 및 면역학적으로 활성 단편 (예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 항체 경쇄, 인간화된 항체, 유전적으로 조작된 단일 사슬 FV 분자(Ladner 등, 미국 특허 제4,946,778호), 또는 키메라 항체, 예를 들어 뮤린 항체의 결합 특이성을 포함하지만 나머지 부분이 인간 기원인 항체일 수 있다. 단클론성 및 다클론 항체, 단편 및 키메라를 포함하는 항체는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
항체는 온전한 폴리펩티드 또는 관심 있는 면역화 항원을 함유하는 단편을 사용하여 제조될 수 있다. 동물을 면역화하기 위해 사용되는 폴리펩티드 또는 올리고펩티드는 RNA의 번역으로부터 얻어지거나 화학적으로 합성될 수 있으며, 원한다면 담체 단백질에 접합될 수 있다. 펩티드에 화학적으로 커플링될 수 있는 적합한 담체는 소 혈청 알부민 및 티로글로불린, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌을 포함한다. 그 다음, 커플링된 폴리펩티드는 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 또는 토끼)을 면역화하기 위해 사용될 수 있다.
CAR 제제
한 구현예에서, 제제는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 CAR을 인코딩하는 mRNA 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 CAR을 인코딩하는 뉴클레오시드 변형 mRNA 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 이펙터 세포에서 발현되고 항원에 특이적으로 결합하도록 조작된 인공 T 세포 수용체를 지칭한다. CAR은 입양 세포 전달을 통한 요법으로 사용될 수 있다. T 세포는 환자에게서 제거되어 특정 형태의 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형된다. 일부 구현예에서, CAR은 선택된 표적에 대해 특이성을 갖는다. CAR은 또한 선택된 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, CAR은 CD3-제타 막관통 및 세포내 도메인에 융합된 항-B 세포 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 제제를 포함하는 전달 비히클에 관한 것이며, 여기서 제제는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 재조합 핵산 서열(예를 들어, mRNA)을 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 mRNA 분자(예를 들어, 변형된 뉴클레오시드 mRNA 분자)를 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 CAR을 인코딩하는 mRNA 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 CAR을 인코딩하는 뉴클레오시드 변형 mRNA 분자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 달리 항원 결합 도메인으로 지칭되는 표적 특이적 결합 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 또한 힌지 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포내 도메인 또는 달리 세포질 도메인은 공동자극 신호전달 영역 및 제타 사슬 부분을 포함한다. 공동자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다.
CAR의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이, 또는 CAR의 세포질 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 도메인이 통합될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 세포외 도메인 또는 폴리펩티드 사슬의 세포질 도메인에 막관통 도메인을 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 스페이서 도메인은 최대 5개의 아미노산, 또는 10개의 아미노산, 또는 20개의 아미노산, 또는 30개의 아미노산, 또는 40개의 아미노산, 또는 50개의 아미노산, 또는 60개의 아미노산, 또는 70개의 아미노산, 또는 80개의 아미노산, 또는 90개의 아미노산, 또는 100개의 아미노산, 또는 110개의 아미노산, 또는 120개의 아미노산, 또는 130개의 아미노산, 또는 140개의 아미노산, 또는 150개의 아미노산, 또는 160개의 아미노산, 또는 170개의 아미노산, 또는 180개의 아미노산, 또는 190개의 아미노산, 또는 200개의 아미노산, 또는 210개의 아미노산, 또는 220개의 아미노산, 또는 230개의 아미노산, 또는 240개의 아미노산, 또는 250개의 아미노산, 또는 260개의 아미노산, 또는 270개의 아미노산, 또는 280개의 아미노산, 또는 290개의 아미노산, 또는 300개의 아미노산을 포함할 수 있다.
세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인은 이러한 도메인의 임의의 원하는 공급원으로부터 유래될 수 있다.
CAR 항원 결합 도메인
항원 결합 도메인은 리간드 결합 및/또는 신호 전달과 연관된 임의의 다양한 세포외 도메인 또는 분비 단백질로부터 수득될 수 있다. 한 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CHI 및 힌지 영역의 존재로 인해 Ig 경쇄와 공유 결합될 수 있거나 힌지, CH2 및 CH3 도메인의 존재로 인해 다른 Ig 중쇄/경쇄 복합체와 공유 결합될 수 있는 Ig 중쇄로 구성될 수 있다. 후자의 경우, 키메라 작제물에 결합되는 중쇄/경쇄 복합체는 키메라 작제물의 항체 특이성과는 다른 특이성을 갖는 항체를 구성할 수 있다. 항체의 기능, 원하는 구조 및 신호 전달에 따라, 전체 사슬을 사용할 수도 있고 말단절단 사슬을 사용할 수도 있으며 여기서 CHI, CH2 또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 제거하거나 힌지 영역의 전부 또는 일부가 제거될 수 있다.
다양한 구현예에서, CAR 항원 결합 도메인은 인간화되거나 완전 인간 서열을 포함할 수 있다.
CAR 막관통 도메인
막관통 도메인과 관련하여, 본 개시내용의 CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 한 구현예에서, CAR의 도메인 중 하나와 자연적으로 연관된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 다른 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막 결합 단백질 또는 막관통 단백질에서 유래될 수 있다. 본 발명에서 특정 용도의 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD 154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래될 수 있다 (즉 적어도 이의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다). 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 한 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항은 합성 막관통 도메인의 각 단부에서 발견될 수 있다. 선택적으로 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 길이로 제한되지 않지만 막관통 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, 링커는 글리신-세린 이중체를 포함한다.
CAR 세포내 도메인
다양한 구현예에서, CAR의 세포질 도메인 또는 달리 세포내 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당할 수 있다. "이펙터 기능"이라는 용어는 세포의 특화된 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. "세포내 신호전달 도메인"이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 변환하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 도메인을 이용할 수 있지만, 많은 경우에 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 세포내 도메인의 말단절단된 부분이 사용되는 한, 그러한 말단절단된 부분은 이펙터 기능 신호를 변환하는 한 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 따라서 용어 세포내 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 도메인의 임의의 말절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기 위한 세포내 도메인의 바람직한 예는 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 공동 수용체 및 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열뿐만 아니라 이들 서열의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 합성 서열을 포함한다.
TCR만으로 생성되는 신호는 T 세포의 전체 활성화에 불충분하며 이차 또는 공동 자극 신호도 필요하다고 알려져 있다. 따라서 T 세포 활성화는 두 부류의 세포내 신호 전달 서열에 의해 매개된다고 말할 수 있다: TCR(일차 세포질 신호 서열)을 통해 항원 의존적 일차 활성화를 개시하는 것 및 항원 독립적인 방식으로 작용하여 이차 또는 공동자극 신호(이차 세포질 신호전달 서열)를 제공하는 것.
일차 세포내 신호전달 서열은 자극 방식 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포내 신호 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특정 용도인 일차 세포내 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 CAR 내의 세포내 신호전달 분자는 CD3 제타로부터 유래된 세포내 신호전달 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인을 단독으로 포함하거나 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 도메인은 CD3 제타 사슬 부분 및 공동자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD2, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), Ox40, CD30, CD40, PD-1, ICO, 림프구 기능 연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 등을 포함한다.
본 발명의 CAR의 세포내 도메인 내의 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 선택적으로 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어 길이가 2 내지 10개 아미노산이 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 일부 구현예에서 적합한 링커를 제공한다.
한 구현예에서, 세포내 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 또 다른 구현예에서, 세포내 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-IBB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다.
항원 결합 도메인은 단클론성 항체, 다클론성 항체, 합성 항체, scFvs, 인간 항체, 인간화된 항체, 및 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 하나의 비제한적 구현예에서, 항원 결합 영역은 선택된 표적, 예를 들어 활성화 섬유아세포 세포 표면 수용체(예를 들어 CD90, FAP, FSP-1, CD140a, CD140b, CD49b, CD87, CD95, α 평활근 액틴(αSMA) 또는 혈소판 유래 성장 인자 β(PDGFR β)에 특이적으로 결합한다.
다양한 구현예에서, CAR은 "1세대", "2세대", "3세대", "4세대" 또는 "5세대" CAR일 수 있다(예를 들어, 문헌[Sadelain 등, Cancer Discov. 3(4):388-398 (2013); Jensen 등, Immunol. Rev. 257:127-133 (2014); Sharpe 등, Dis. Model Mech. 8(4):337-350 (2015); Brentjens 등, Clin. Cancer Res. 13:5426-5435 (2007); Gade 등, Cancer Res. 65:9080-9088 (2005); Maher 등, Nat. Biotechnol. 20:70-75 (2002); Kershaw 등, J. Immunol. 173:2143-2150 (2004); Sadelain 등, Curr. Opin. Immunol. (2009); Hollyman 등, J. Immunother. 32:169-180 (2009))] 참조, 이들 각각은 전체 내용이 참조로 포함됨).
본 발명에서 사용하기 위한 "1세대" CAR은 항원 결합 도메인, 예를 들어 T 세포 수용체 사슬의 세포질/세포내 도메인에 융합된 막관통 도메인에 융합된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한다. "1세대" CAR은 전형적으로 내인성 T 세포 수용체(TCR)의 신호의 일차 전달자인 CD3ζ-사슬의 세포내 도메인을 가지고 있다. "1세대" CAR은 새로운 항원 인식을 제공할 수 있으며 HLA 매개 항원 제시와 독립적으로 단일 융합 분자에서 CD3ζ 사슬 신호전달 도메인을 통해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 활성화를 유발할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 "2세대" CAR은 항원 결합 도메인, 예를 들어 T 세포를 활성화할 수 있는 세포내 신호전달 도메인 및 T 세포 효능 및 지속성을 증강시키도록 설계된 공동자극 도메인에 융합된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한다(Sadelain 등, Cancer Discov. 3:388-398 (2013)). 따라서 CAR 설계는 TCR 이종이량체와 CD3 복합체라는 2개의 개별 복합체에 의해 생리학적으로 발생하는 두 가지 기능인 신호 전달과 항원 인식을 조합할 수 있다. "2세대" CAR은 세포에 추가적인 신호를 제공하기 위해 CAR의 세포질 테일에 다양한 공동자극 분자, 예를 들어 CD28, 4-1BB, ICOS, OX40 등의 세포내 도메인을 포함한다.
"2세대" CAR은 예를 들어 CD28 또는 4-1BB 도메인에 의한 공동 자극 및 예를 들어 CD3ζ 신호 도메인에 의한 활성화를 모두 제공한다. 전임상 연구는 "2세대" CAR이 T 세포의 항종양 활성을 개선할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, "2세대" CAR 변형 T 세포의 강력한 효능은 만성 림프모구성 백혈병 (CLL) 및 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 환자의 CD19 분자를 표적으로 하는 임상 시험에서 입증되었다(Davila 등, Oncoimmunol. 1(9):1577-1583 (2012)).
"3세대" CAR은 예를 들어 CD28 및 4-1BB 도메인 모두를 포함함으로써 다중 공동-자극 및 예를 들어 CD3ζ 활성화 도메인을 포함함으로써 활성화를 제공한다.
"4세대" CAR은 예를 들어 CD28 또는 4-1BB 도메인에 의한 공동 자극 및 예를 들어 구성적 또는 유도성 케모카인 성분에 더하여 CD3ζ 신호전달 도메인에 의한 활성화를 제공한다.
"5세대" CAR은 예를 들어 CD28 또는 4-1BB 도메인에 의한 공동 자극, 및 예를 들어 CD3ζ 신호전달 도메인, 구성적 또는 유도성 케모카인 성분 및 사이토카인 수용체, 예를 들어, IL-2Rβ의 세포내 도메인에 의한 활성화를 제공한다.
다양한 구현예에서, CAR은 다가 CAR 시스템, 예를 들어 DualCAR 또는 "TandemCAR" 시스템에 포함될 수 있다. 다가 CAR 시스템은 다중 CAR을 포함하는 시스템 또는 세포 및 하나 초과의 항원을 표적으로 하는 2가/이중특이적 CAR을 포함하는 시스템 또는 세포를 포함한다.
본 명세서에 개시된 구현예에서, CAR은 일반적으로 전술된 바와 같이 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 특정 비제한적 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다.
한 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표적화 도메인이고, 여기서 표적화 도메인은 CAR을 발현하는 T 세포를 특정 세포 또는 관심 조직으로 향하게 한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 표적화 도메인은 항원(예를 들어, 자가 항원 또는 외래 항원)에 특이적으로 결합하여 CAR을 발현하는 T 세포를 항원을 발현하는 세포 또는 조직에 지시하는 항체, 항체 단편 또는 펩티드를 포함한다.
본 발명의 CAR 분자의 항원 결합 도메인은 종양 항원, 외래 항원 (예를 들어, 박테리아 항원, 또는 바이러스 항원) 또는 자가 항원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 바람직한 관심 항원, 또는 그의 단편에 반응하도록 생성될 수 있다.
종양 항원은 면역 반응을 유도하는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 본 발명의 VM-도메인 함유 융합 분자의 항원 결합 도메인의 선택은 치료할 특정 유형의 암에 따라 달라질 것이다. 종양 항원은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 신경교종 연관 항원, 암종배아 항원 (CEA), β-인간 융모성 고나도트로핀, 알파태아단백 (AFP), 렉틴 반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선 특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다. 또 다른 예시적인 종양 항원는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4) (흑색종 연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 고-분자-중량 흑색종 연관 항원 (HMW-MAA), 또는 뉴런-신경교 항원 2 (NG2)라고도 함)이다.
한 구현예에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격에 대한 표적 항원 역할을 할 수 있는 많은 단백질을 발현한다. 이들 분자는 조직 특이적 항원 예컨대 흑색종에서 MART-1, 티로시나제 및 GP 100 및 전립선압에서 전립선 산 포스파타제 (PAP) 및 전립선 특이적 항원 (PSA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 표적 분자는 종양 유전자 HER-2/Neu/ErbB-2와 같은 형질전환 관련 분자 그룹에 속한다. 표적 항원의 또 다른 군은 암종배아 항원(CEA)과 같은 종양 태아 항원이다. B-세포 림프종에서, 종양 특이적 개체특이형 면역글로불린은 개별 종양에 고유한 진정한 종양 특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. CD19, CD20 및 CD37과 같은 B-세포 분화 항원은 B-세포 림프종의 표적 항원에 대한 다른 후보이다. 이러한 항원 중 일부(CEA, HER-2, CD19, CD20, 개체특이형)는 제한된 성공을 거둔 단클론성 항체를 사용한 수동 면역요법의 표적으로 사용되었다.
본 발명에서 언급되는 종양 항원의 유형은 또한 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 연관 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 고유하며 신체의 다른 세포에서는 발생하지 않는다. TAA 연관 항체는 종양 세포에 고유하지 않으며 대신 항원에 대한 면역학적 관용 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포에서도 발현된다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건에서 발생할 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙하여 반응할 수 없을 때 태아 발달 동안 정상 세포에서 발현되는 항원일 수 있거나 정상 세포에서는 매우 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만 종양 세포에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비-제한적 예는 하기를 포함한다: 분화 항원 예컨대 MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양 특이적 다계통 항원 예컨대 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; 과발현된 배아 항원 예컨대 CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제인자 유전자 예컨대 p53, Ra, HER-2/neu; 염색체 전위로 인한 생성된 고유한 종양 항원; 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대 엡슈타인 바르 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 대형 단백질 기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ra, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C 관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS를 포함한다.
외래 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생 항원 또는 그의 단편, 또는 그의 변이체일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 표적화될 수 있는 예시적인 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다.
이중특이적 T-세포 연관체(예를 들어, BiTE) 제제
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 카고 분자(예를 들어, mRNA, 발현 벡터, CRISPR 게놈 편집 시스템, 또는 뉴클레오시드 변형 mRNA 분자)는 면역 세포 (예를 들어, CD4+ T 세포)에 대한 항원 및 관심 세포, 예를 들어, 병원체에 대한 항원 둘 다에 특이적으로 결합하는 이중특이적 T-세포 연관체를 인코딩할 수 있다.
이중특이적 T-세포 연관체는 두 항체의 표적 영역(즉, 항원 결합 도메인)을 단일 분자로 연결하여 생성되는 이중특이적 분자이다. 분자의 하나의 아암(arm)은 CD4+ T 세포 표면에서 발견되는 단백질과 결합하도록 조작되고, 다른 아암은 표적 세포에서 주로 발견되는 특정 단백질에 결합하도록 설계된다. 두 표적이 결합되면 이중특이적 T 세포 연관체(즉, BiTE 분자)가 CD4+ T 세포와 표적 세포 사이에 브릿지를 형성한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 표적 세포는 활성화 섬유아세포이고 BiTE 분자는 섬유아세포 특이적 마커에 결합하는 데 특이적인 결합 아암을 포함한다. 섬유아세포 특이적 마커는 CD90, FAP, FSP-1, CD140a, CD140b, CD49b, CD87, CD95, α 평활근 액틴 (αSMA), 및 혈소판 유래된 성장 인자 β (PDGFR β) 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 문헌[Diego Ellerman, "Bispecific T-cell engagers: Towards understanding variable influencing the in vitro potency and tumor selectivity and their modulation to enhance their efficacy and safety," Methods, Vol.154, Feb. 2019, pp.102-117]를 추가로 참조하고, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다.
용어 "이중특이적"은 이중특이적 분자(예를 들어, 이중특이적 T-세포 연관체)가 적어도 2개의 별개의 항원 결정인자(예를 들어, CD4+ T 세포로부터의 하나 및 표적 세포, 예컨대 병원체로부터의 다른 것)에 특이적으로 결합할 수 있다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들 각각은 다른 항원 결정인자에 특이적이다. 특정 구현예에서 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 별개의 세포 상에서 발현되는 2개의 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
본 발명은 BiTE 포맷에 한정되지 않지만, 디아바디(Holliger 등, Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 및 이의 유도체, 예컨대 탠덤 디아바디(Kipriyanov 등, J Mol Biol 293, 41-66 (1999)), 디아바디 포맷을 기반으로 하지만 추가적인 안정화를 위한 C-말단 디설파이드 브리지를 특징으로 하는 DART(이중 친화성 재표적화) 분자(Moore 등, Blood 117, 4542-51 (2011)), 및 전체 하이브리드 마우스/랫트 IgG 분자이고 또한 현재 임상 시험에서 평가되고 있는 트리오맙은 더 큰 크기의 포맷을 나타내는 트리오맙(Seimetz 등, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)에서 검토됨)을 포함하여 T 세포 재지향에 적합한 임의의 적합한 이중특이성 포맷의 사용을 고려한다. 전술한 참조문헌 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다.
이중특이적 항체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Millstein 등, Nature, 305:537-539 (1983); Traunecker 등, EMBOJ., 10:3655-3659 (1991); Suresh 등, Methods in Enzymology, 121:210 (1986); Kostelny 등, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992); Hollinger 등, PNAS USA, 90:6444-6448 (1993); Gruber 등, J. Immunol. 152:5368 (1994); 미국 특허 번호 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 95,731,168; 4,676,980; 및 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; 및 EP 03089] 참조). BiTE를 포함하는 이중특이적 항체를 만드는 것과 관련된 상기 언급된 각각의 참고문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법을 실시하는데 유용한 예시적인 이중특이적 항체 분자는 (i) 2개의 항체, 즉 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 제1 항체 및 면역 세포(예를 들어, CD4+ T 세포)의 표면 상에 발현된 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 제2 항체, (ii) 표적 세포의 표면에 발현된 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 하나의 사슬 또는 아암 및 면역 세포(예를 들어, CD4+ T 세포)에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 사슬 또는 아암을 갖는 단일 항체, (iii) 예를 들어 여분의 펩티드 링커에 의해 나란히 연결된 2개의 scFv를 통해 표적 세포의 표면에 발현된 항원에 대한 결합 특이성 및 면역 세포(예를 들어, CD4+ T 세포)에 대한 결합 특이성을 갖는 단일 사슬 항체; (iv) 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig)로서, 각각의 경쇄 및 중쇄는 짧은 펩티드 결합을 통해 나란히 2개의 가변 도메인을 함유하는 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig); (v) 화학적으로 연결된 이중특이적 (Fab')2 단편; (vi) 각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일 사슬 디아바디의 융합인 Tandab; (vii) 플렉시바디(다가 분자를 생성하는 디아바디와 scFv의 조합); (viii) 소위 "도킹 및 잠금(dock and lock)" 분자(다른 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편을 함유하는 3가 이중특이적 결합 단백질을 생성하기 위해 Fab에 적용될 수 있는 단백질 키나아제 A의 "이량체화 및 도킹 도메인"의 적응); (ix) 예를 들어 인간 Fc-영역의 양쪽 말단에 융합된 2개의 scFv를 함유하는 소위 "스콜피온" 분자; (x) 디아바디; 및 (xi) 소위 "ImmTAC" 분자를 함유한다 (Immune mobilising mTCR Against Cancer; 예를 들어 [Liddy 등, Nat. Med. 18:980-987 (2012)] 참고).
영상화제
한 구현예에서, 전달 비히클은 영상화제를 포함한다. 영상화제는 세포 또는 조직에 노출된 후 전달 비히클을 시각화할 수 있는 물질이다. 시각화에는 육안을 위한 영상화뿐만 아니라 기기로 감지하거나 일반적으로 눈에 보이지 않는 정보를 감지해야 하는 영상화가 포함되며 광자, 소리 또는 기타 에너지 양자를 감지해야 하는 영상화가 포함된다. 예에는 스테인(stain), 중요한 염료, 형광 마커, 방사성 마커, 효소 또는 마커 또는 효소를 인코딩하는 플라스미드 작제물이 포함된다. 전달 비히클에 사용될 수 있는 영상화 및 표적화를 위한 많은 물질 및 방법은 문헌[Handbook of Targeted delivery of Imaging Agents, Torchilin, ed. (1995) CRC Press, Boca Raton, Fla]에 제공된다.
분자 영상화에 기반 시각화는 전형적으로 조직, 세포 또는 분자 수준에서 생물학적 과정 또는 생물학적 분자를 감지하는 것을 수반한다.
분자 영상화는 유전자 요법, 세포 기반 요법의 특정 표적을 평가하고 진단 또는 연구 도구로서 병리 상태를 시각화하는 데 사용할 수 있다. 세포내로 전달될 수 있는 영상화제는 이러한 제제가 세포내 활동 또는 상태를 평가하는 데 사용될 수 있기 때문에 특히 유용하다. 영상화제가 효과적이려면 목표에 도달해야 하고; 따라서 일부 구현예에서 세포에 의한 효율적인 흡수가 바람직하다. 또한 RES를 피하기 위해 신속한 흡수가 바람직할 수 있다(문헌[Allport and Weissleder, Experimental Hematology 1237-1246 (2001)]의 리뷰 참조).
또한, 영상화제는 직접적으로 또는 특정 표적과 연관된 신호를 증가시키는 효과적인 증폭 기술에 의해 소량으로 검출될 수 있도록 높은 신호 대 잡음비를 제공해야 한다. 증폭 전략은 문헌[Allport 및 Weissleder, Experimental Hematology 1237-1246 (2001)]에서 검토되었으며, 예를 들어 아비딘-비오틴 결합 시스템, 전환된 리간드의 트랩핑, 표적에 의해 결합된 후 물리적 거동을 변화시키는 프로브 및 이완 속도의 이점을 이용하는 것을 포함한다. 영상화 기술의 예는 자기 공명 영상, 방사선핵종 영상화, 컴퓨터 단층촬영, 초음파, 및 광학 영상을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 전달 비히클은 예를 들어 영상화제를 전달 비히클에 통합함으로써 다양한 영상화 기술 또는 전략에서 유리하게 사용될 수 있다. 많은 영상화 기술 및 전략이 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Allport and Weissleder, Experimental Hematology 1237-1246 (2001)]의 리뷰를 참조하고; 이러한 전략은 전달 비히클과 함께 사용하도록 조정될 수 있다. 적합한 영상화제는 예를 들어, 형광 분자, 표지된 항체, 표지된 아비딘:바이오틴 결합제, 콜로이드성 금속 (예를 들어, 금, 은), 리포터 효소 (예를 들어, 서양고추냉이 과산화효소), 초상자성 트랜스페린, 제2 리포터 시스템 (예를 들어, 티로시나제), 및 상자성 킬레이트을 포함한다.
일부 구현예에서, 영상화제는 자기 공명 영상화 조영제이다. 자기 공명 영상 조영제의 예는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라세트산 (DOTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"-테트라에틸인 (DOTEP), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N"-트리아세트산 (DOTA) 및 이의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (미국 특허 번호 5,188,816, 5,219,553 및 5,358,704 참조). 일부 구현예에서, 영상화제는 X선 조영제이다. 당업계에 이미 공지된 X선 조영제는 5-아미노-이소프탈산의 다수의 할로겐화 유도체, 특히 요오드화 유도체를 포함한다.
소분자 제제
다양한 구현예에서, 제제는 소분자이다. 제제가 소분자일 때, 소분자는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 이러한 방법에는 화학적 유기 합성 또는 생물학적 수단이 포함된다. 생물학적 수단은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하는 생물학적 공급원으로부터의 정제, 재조합 합성 및 시험관 내 번역 시스템을 포함한다. 한 구현예에서, 소분자 제제는 유기 분자, 무기 분자, 생체분자, 합성 분자 등을 포함한다.
다양한 질환 및 병태를 치료하는데 잠재적으로 유용한 분자적으로 다양한 화학적 화합물의 조합 라이브러리는 라이브러리를 만드는 방법과 마찬가지로 당업계에 잘 알려져 있다. 이 방법은 고상 합성, 용액 방법, 단일 화합물의 병렬 합성, 화학적 혼합물의 합성, 강성 코어 구조, 유연한 선형 서열, 디컨볼루션 전략, 태깅 기술 및 주도적 발견을 위한 편향되지 않은 분자 환경 생성 대 주도적 개발을 위한 편향된 구조 생성을 포함하는 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 제제는 조합 기술을 사용하여 합성 및/또는 확인된다.
작은 라이브러리 합성을 위한 일반적인 방법에서, 활성화된 코어 분자는 여러 빌딩 블록과 함께 응축되어, 공유 결합된 코어 빌딩 블록 앙상블의 조합 라이브러리를 생성한다. 코어의 형상과 강성은 형상 공간에서 빌딩 블록의 배향을 결정한다. 특성화된 생물학적 구조("집중된 라이브러리")를 표적으로 하는 코어, 연결 또는 빌딩 블록을 변경하여 라이브러리를 편향시키거나 유연한 코어를 사용하여 구조적 편향을 줄이면서 합성할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 제제는 작은 라이브러리 합성을 통해 합성된다.
본 명세서에 기재된 소분자 및 소분자 화합물은 염이 도시되지 않더라도 염으로 존재할 수 있으며, 본 발명은 본 명세서에 도시된 제제의 모든 염 및 용매화물뿐만 아니라 당업자에 의해 잘 이해되는 바와 같이 제제의 비-염 및 비-용매화물 형태를 포괄하는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 제제의 염은 약제학적으로 허용되는 염이다.
호변이성질체 형태가 본 명세서에 기재된 임의의 제제에 대해 존재할 수 있는 경우, 각각의 및 모든 호변이성질체 형태가 본 발명에 포함되는 것으로 의도되지만, 호변이성질체 형태 중 단지 하나 또는 일부만이 명시적으로 도시될 수 있다. 예를 들어, 2-하이드록시피리딜 모이어티가 도시되는 경우, 상응하는 2-피리돈 호변이성체도 의도된다.
본 발명은 또한 기재된 제제의 임의의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 형태를 포함하는 임의의 또는 모든 입체화학적 형태를 포함한다. 본 명세서에서 구조 또는 명칭의 인용은 도시된 제제의 모든 가능한 입체이성질체를 포함하도록 의도된다. 제제의 결정성 또는 비-결정성 형태와 같은 모든 형태의 제제도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 제제를 포함하는 조성물, 예컨대 특정 입체화학적 형태를 포함하는 실질적으로 순수한 제제의 조성물, 또는 라세미 또는 비-라세미 혼합물과 같은 2개 이상의 입체화학적 형태를 포함하는 임의의 비율로 본 발명의 제제의 혼합물을 포함하는 조성물이 또한 의도된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 제제의 임의의 또는 모든 활성 유사체 또는 유도체, 예컨대 전구약물을 포함한다. 한 구현예에서, 제제는 전구약물이다. 한 구현예에서, 본 명세서에 기재된 소분자는 유도체화를 위한 후보이다. 이와 같이, 특정 사례에서, 조절된 효능, 선택성 및 용해도를 갖는 본 명세서에 기재된 소분자의 유사체가 본 명세서에 포함되며 약물 발견 및 약물 개발을 위한 유용한 선도를 제공한다. 따라서 특정 사례에서, 최적화 동안에 약물 전달, 대사, 신규성 및 안전성 문제를 고려하여 새로운 유사체가 설계된다.
일부 경우에, 본 명세서에 기재된 소분자 제제는 조합 및 의약 화학 분야에 잘 알려진 바와 같이 공지된 제제의 유도체 또는 유사체이다. 유사체 또는 유도체는 다양한 위치에서 작용기를 추가 및/또는 치환함으로써 제조될 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에 기재된 소분자는 잘 알려진 화학적 합성 절차를 사용하여 유도체/유사체로 전환될 수 있다. 예를 들어, 모든 수소 원자 또는 치환기는 선택적으로 변형되어 새로운 유사체를 생성할 수 있다. 또한, 연결 원자 또는 기는 탄소 백본 또는 헤테로 원자를 갖는 더 길거나 더 짧은 링커로 변형될 수 있다. 또한, 고리 기는 고리에 다른 수의 원자를 갖도록 및/또는 헤테로 원자를 포함하도록 변경될 수 있다. 더욱이, 방향족화합물은 사이클릭 고리로 전환될 수 있으며 그 반대도 가능하다. 예를 들어, 고리는 5-7개의 원자일 수 있고 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유사체(analog)", "유도체(analogue)" 또는 "유도체"는 하나 이상의 화학 반응에 의해 모 화합물 또는 분자로부터 만들어진 화학적 화합물 또는 분자를 지칭하는 것을 의미한다. 이와 같이, 유사체는 본 명세서에 기재된 소분자 제제의 구조와 유사한 구조를 갖는 구조일 수 있거나 본 명세서에 기재된 소분자 제제의 스캐폴드에 기초할 수 있지만, 대사적으로 유사하거나 반대 작용을 할 수 있는 특정 구성 요소 또는 구조적 구성과 관련하여 다르다. 본 발명에 따른 임의의 소분자 억제제의 유사체 또는 유도체는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 본 명세서에 기재된 소분자 제제는 수소 기를 서로 독립적으로 다른 치환기로 변형시킴으로써 독립적으로 유도체화되거나 그로부터 제조된 유사체일 수 있다. 즉, 각 분자의 각 원자는 동일한 분자의 다른 원자에 대해 독립적으로 변형될 수 있다. 유래물/유사체를 생성하기 위한 임의의 기존의 변형을 사용할 수 있다. 예를 들어, 원자 및 치환기는 독립적으로 수소, 알킬, 지방족, 직쇄 지방족, 사슬 헤테로 원자를 갖는 지방족, 분지형 지방족, 치환된 지방족, 사이클릭 지방족, 하나 이상의 헤테로 원자를 갖는 헤테로사이클릭 지방족, 방향족, 헤테로방향족, 다환방향족, 폴리아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 이들의 조합, 할로겐, 할로 치환된 지방족화합물, 등으로 구성될 수 있다. 또한, 화합물의 모든 고리 기는 유도체화되어 고리 크기를 증가 및/또는 감소시킬 뿐만 아니라 백본 원자를 탄소 원자 또는 헤테로 원자로 변경할 수 있다.
전달 비히클
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 제제의 전달을 위한 전달 비히클을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제제는 본 발명의 mRNA 분자(예를 들어, 뉴클레오시드 변형 mRNA 분자)를 포함한다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀, 혼합된 마이셀, 및 리포솜을 포함하는 지질 기반 시스템이다. 시험관 내 및 생체 내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
지질 제형의 사용은 적어도 하나의 제제를 숙주 세포로 도입하기 위해 고려된다(시험관 내, 생체 외 또는 생체 내). 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 제제는 지질과 연관될 수 있다. 지질과 연관된 적어도 하나의 제제는 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되어 있으며, 리포솜과 올리고뉴클레오티드 둘 다와 연관된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되고, 리포솜에 포획되고, 리포솜과 복합체를 이루고, 지질을 함유하는 용액에 분산되고, 지질과 혼합되고, 지질과 조합되고, 지질에 현탁액으로 함유되어 있으며, 마이셀을 함유하거나 복합화되거나, 달리 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/핵산 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이중층 구조, 마이셀 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 그들은 또한 단순히 용액에 산재되어 크기나 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 함유하는 화합물의 부류뿐만 아니라 세포질에서 자연 발생 지방 액적을 포함한다.
지질 및 그 유도체
다양한 구현예에서, 전달 비히클은 지질 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다.
지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 알데하이드, 및 중합체 (예를 들어 페길화 지질)를 함유하는 화합물의 부류뿐만 아니라 세포질에서 자연 발생 지방 액적을 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma(St. Louis, MO)로부터 입수할 수 있으며; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(Plainview, NY)로부터 입수할 수 있고; 콜레스테롤("Chol")은 Calbiochem-Behring에서 얻을 수 있으며; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발하기 때문에 유일한 용매로 사용된다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질이 바람직하다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 생리학적 pH와 같은 선택적 pH에서 순 양전하를 갖는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 포함한다. 그러한 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸염화암모늄 (DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸염화암모늄 (DOTMA); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸염화암모늄 (DOTAP); 3-(N―(N′,N′-디메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤 (DC-Chol), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N-2-(스페르민카복사미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오르아세테이트 (DOSPA), 디옥타데실아미도글라이실 카복시스페르민 (DOGS), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판 (DODAP), N,N-디메틸-2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DODMA), 및 N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 본 발명에서 사용될 수 있는 양이온성 지질의 다수의 시판 제제가 이용가능하다. 이들은 예를 들어 LIPOFECTIN® (GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.의 DOTMa 및 1,2-디올레오일-sn-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 상업적으로 입수 가능한 양이온성 리포솜); LIPOFECTAMINE® (GIBCO/BRL의 N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페르민카복사미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA) 및 (DOPE)을 포함하는 상업적으로 입수 가능한 양이온성 리포솜); 및 TRANSFECTAM® (Promega Corp., Madison, Wis.의 에탄올 중 디옥타데실아미도글라이실 카복시스페르민 (DOGS)을 포함하는 상업적으로 입수 가능한 양이온성 지질)을 포함한다. 다음 지질은 양이온성이며 생리학적 pH 이하에서 양전하를 띤다: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA).
한 구현예에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다. 본 발명에 유용한 적합한 아미노 지질은 WO 2012/016184에 기재된 것을 포함하며, 이는 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 대표적인 아미노 지질은 1,2-디리놀레일록시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리놀레일록시-3-모폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판 (DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디올 (DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), 및 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적합한 아미노 지질은 하기 화학식을 갖는 것을 포함한다:
Figure pct00001
여기서 R1 및 R2는 동일하거나 상이하고 독립적으로 선택적으로 치환된 C10-C24 알킬, 선택적으로 치환된 C10-C24 알케닐, 선택적으로 치환된 C10-C24 알키닐, 또는 선택적으로 치환된 C10-C24 아실이고;
R3 및 R4는 동일하거나 상이하고 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐이거나, R3 및 R4는 함께 연결되어 4 내지 6개의 탄소 원자 및 질소 및 산소로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자의 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R5는 존재하지 않거나 존재하며 존재하는 경우 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
m, n 및 p는 동일하거나 상이하고 독립적으로 0 또는 1이며, 단 m, n 및 p는 동시에 0이 아니며;
q은 0, 1, 2, 3 또는 4이고; 그리고
Y 및 Z는 동일하거나 상이하며 독립적으로 O, S 또는 NH이다.
한 구현예에서, R1 및 R2는 각각 리놀레일이고, 아미노 지질은 디리놀레일 아미노 지질이다. 한 구현예에서, 아미노 지질은 디리놀레일 아미노 지질이다.
대표적인 유용한 디리놀레일 아미노 지질은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00002
여기서 n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
한 구현예에서, 양이온성 지질은 DLin-K-DMA이다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 DLin-KC2-DMA(상기 DLin-K-DMA, 여기서 n은 2임)이다.
한 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 성분은 하기 화학식 (I)의 구조:
Figure pct00003
또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 가지며,
L1 및 L2는 각각 독립적으로-O(C=O)-, -(C=O)O-또는 탄소-탄소 이중 결합이고;
R1a 및 R1b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R2a 및 R2b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R3a 및 R3b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R4a 및 R4b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, 또는 (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 메틸 또는 사이클로알킬이고;
R7은 각 경우에 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 하나의 질소 원자를 포함하는 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 24의 정수이고;
b 및 c는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고; 그리고
e는 1 또는 2이다.
화학식 (I)의 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이다. 다른 구현예에서, R1a 및 R1b는 a가 6인 경우 이소프로필이 아니거나 a가 8인 경우 n-부틸이 아니다.
화학식 (I)의 또 다른 구현예에서, R1a, R2a, R3a 또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이고; 그리고
R1a 및 R1b는 a가 6인 경우 이소프로필이 아니거나 a가 8인 경우 n-부틸이 아니다.
화학식 (I)의 다른 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 하나의 질소 원자를 포함하는 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
화학식 (I)의 특정 구현예에서, L1 또는 L2 중 임의의 하나는 -O(C=O)- 또는 탄소-탄소 이중 결합일 수 있다. L1 및 L2는 각각 -O(C=O)-이거나 탄소-탄소 이중 결합일 수 있다.
화학식 (I)의 일부 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2는 모두 -O(C=O)-이다.
화학식 (I)의 일부 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2 둘 다는 -(C=O)O-이다.
화학식 (I)의 일부 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다. 다른 구현예에서, L1 및 L2는 모두 탄소-탄소 이중 결합이다.
화학식 (I)의 또 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이고 L1 또는 L2 중 다른 하나는 -(C=O)O-이다. 더 많은 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이고 L1 또는 L2 중 다른 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다. 더 많은 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이고 L1 또는 L2 중 다른 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다.
명세서 전반에 걸쳐 사용되는 "탄소-탄소" 이중 결합은 다음 구조 중 하나를 지칭하는 것으로 이해된다:
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
여기서 Ra 및 Rb는 각 경우에 독립적으로 H 또는 치환기이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Ra 및 Rb는 각 경우에 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬, 예를 들어 H 또는 C1-C12 알킬이다.
다른 구현예에서, 화학식(I)의 지질 화합물은 하기 구조(Ia)를 갖는다:
Figure pct00006
다른 구현예에서, 화학식(I)의 지질 화합물은 하기 구조(Ib)를 갖는다:
Figure pct00007
또 다른 구현예에서, 화학식 (I)의 지질 화합물은 하기 구조 (Ic)를 갖는다:
Figure pct00008
화학식 (I)의 지질 화합물의 특정 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 특정 구현예에서, a는 0이다. 일부 구현예에서, a는 1이다. 다른 구현예에서, a는 2이다. 더 많은 구현예에서, a는 3이다. 또 다른 구현예에서, a는 4이다. 일부 구현예에서, a는 5이다. 다른 구현예에서, a는 6이다. 더 많은 구현예에서, a는 7이다. 또 다른 구현예에서, a는 8이다. 일부 구현예에서, a는 9이다. 다른 구현예에서, a는 10이다. 더 많은 구현예에서, a는 11이다. 또 다른 구현예에서, a는 12이다. 일부 구현예에서, a는 13이다. 다른 구현예에서, a는 14이다. 더 많은 구현예에서, a는 15이다. 또 다른 구현예에서, a는 16이다.
화학식 (I)의 일부 다른 구현예에서, b는 1이다. 다른 구현예에서, b는 2이다. 더 많은 구현예에서, b는 3이다. 또 다른 구현예에서, b는 4이다. 일부 구현예에서, b는 5이다. 다른 구현예에서, b는 6이다. 더 많은 구현예에서, b는 7이다. 또 다른 구현예에서, b는 8이다. 일부 구현예에서, b는 9이다. 다른 구현예에서, b는 10이다. 더 많은 구현예에서, b는 11이다. 또 다른 구현예에서, b는 12이다. 일부 구현예에서, b는 13이다. 다른 구현예에서, b는 14이다. 더 많은 구현예에서, b는 15이다. 또 다른 구현예에서, b는 16이다.
화학식 (I)의 일부 추가 구현예에서, c는 1이다. 다른 구현예에서, c는 2이다. 더 많은 구현예에서, c는 3이다. 또 다른 구현예에서, c는 4이다. 일부 구현예에서, c는 5이다. 다른 구현예에서, c는 6이다. 더 많은 구현예에서, c는 7이다. 또 다른 구현예에서, c는 8이다. 일부 구현예에서, c는 9이다. 다른 구현예에서, c는 10이다. 더 많은 구현예에서, c는 11이다. 또 다른 구현예에서, c는 12이다. 일부 구현예에서, c는 13이다. 다른 구현예에서, c는 14이다. 더 많은 구현예에서, c는 15이다. 또 다른 구현예에서, c는 16이다.
화학식 (I)의 일부 특정 다른 구현예에서, d는 0이다. 일부 구현예에서, d는 1이다. 다른 구현예에서, d는 2이다. 더 많은 구현예에서, d는 3이다. 또 다른 구현예에서, d는 4이다. 일부 구현예에서, d는 5이다. 다른 구현예에서, d는 6이다. 더 많은 구현예에서, d는 7이다. 또 다른 구현예에서, d는 8이다. 일부 구현예에서, d는 9이다. 다른 구현예에서, d는 10이다. 더 많은 구현예에서, d는 11이다. 또 다른 구현예에서, d는 12이다. 일부 구현예에서, d는 13이다. 다른 구현예에서, d는 14이다. 더 많은 구현예에서, d는 15이다. 또 다른 구현예에서, d는 16이다.
화학식 (I)의 일부 다른 다양한 구현예에서, a와 d는 동일하다. 일부 다른 구현예에서, b와 c는 동일하다. 일부 다른 특정 구현예에서, a와 d는 동일하고 b와 c는 동일하다.
화학식 (I)에서 a와 b의 합 및 c와 d의 합은 원하는 특성을 갖는 화학식 (I)의 지질을 얻기 위해 변화될 수 있는 인자이다. 일 구현예에서, a 및 b는 합이 14 내지 24 범위의 정수가 되도록 선택된다. 다른 구현예에서, c 및 d는 합이 14 내지 24 범위의 정수가 되도록 선택된다. 추가 구현예에서, a와 b의 합 및 c와 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a와 b의 합 및 c와 d의 합은 모두 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다. 또 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 a와 b의 합 및 c와 d의 합이 12 이상이 되도록 선택된다.
화학식 (I)의 일부 구현예에서, e는 1이다. 다른 구현예에서, e는 2이다.
화학식 (I)의 R1a, R2a, R3a 및 R4a에서의 치환기는 특별히 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각 경우에 H이다. 다른 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 다른 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 다른 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 전술한 구현예 중 일부에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
화학식 (I)의 특정 구현예에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각 경우에 C1-C12 알킬이다.
화학식 (I)의 추가 구현예에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각 경우에 H이다.
화학식 (I)의 특정 구현예에서, R1b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 전술한 것의 다른 구현예에서, R4b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (I)의 R5 및 R6에서의 치환기는 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, R5 또는 R6 중 하나 또는 둘 다는 메틸이다. 다른 특정 구현예에서, R5 또는 R6 중 하나 또는 둘 다는 사이클로알킬, 예를 들어 사이클로헥실이다. 이들 구현예에서 사이클로알킬은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 특정 다른 구현예에서 사이클로알킬은 C1-C12 알킬, 예를 들어 tert-부틸로 치환된다.
R7에서의 치환기는 화학식 (I)의 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 구현예에서 적어도 하나의 R7은 H이다. 일부 다른 구현예에서, R7은 각 경우에 H이다. 다른 특정 구현예에서, R7은 C1-C12 알킬이다.
화학식 (I)의 전술한 다른 특정 구현예에서, R8 또는 R9 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서, R8 및 R9는 모두 메틸이다.
화학식 (I)의 일부 다른 구현예에서, R8 및 R9는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 전술한 것의 일부 구현예에서, R8 및 R9는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-원 헤테로사이클릭 고리, 예를 들어 피롤리디닐 고리를 형성한다.
다양한 다른 구현예에서, 화학식 (I)의 예시적인 지질은 하기를 포함할 수 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
일부 구현예에서, LNP는 화학식 (I)의 지질, 적어도 하나의 제제, 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화 지질로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (I)의 지질은 화합물 I-5이다. 일부 구현예에서, 화학식 (I)의 지질은 화합물 I-6이다.
일부 다른 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 성분은 화학식 (II)의 구조:
Figure pct00016
또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 가지며,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa, -OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O-, 또는 직접적인 결합이고;
G1은 C1-C2 알킬렌, -(C=O)-, -O(C=O)-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)- 또는 직접적인 결합이고;
G2는 -C(=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)S-, -C(=O)NRa 또는 직접적인 결합이고;
G3은 C1-C6 알킬렌이고;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1a 및 R1b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R2a 및 R2b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R3a 및 R3b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R4a 및 R4b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; 또는 (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고;
R7은 C4-C20 알킬이고;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬이거나; 또는 R8 및 R9는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고; 그리고
x는 0, 1 또는 2이다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접적인 결합이다.
다른 구현예에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O) 또는 직접적인 결합이다. 일부 다른 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접적인 결합이고; G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접적인 결합이다.
화학식 (II)의 일부 다른 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRa-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa, -OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O-, -NRaS(O)xNRa-, -NRaS(O)x- 또는 -S(O)xNRa-이다.
화학식 (II)의 전술한 다른 구현예에서, 지질 화합물은 하기 구조 (IIA) 또는 (IIB) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00017
또는
Figure pct00018
화학식 (II)의 일부 구현예에서, 지질 화합물은 구조 (IIA)를 갖는다. 다른 구현예에서, 지질 화합물은 구조(IIB)를 갖는다.
화학식 (II)의 상기 임의의 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2 각각은 -O(C=O)-이다.
화학식 (II)의 일부 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2 각각은 -(C=O)O-이다.
화학식 (II)의 다른 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 직접적인 결합이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "직접적인 결합"은 기(예를 들어, L1 또는 L2)가 부재함을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2 각각은 직접적인 결합이다.
화학식 (II)의 다른 다른 구현예에서, R1a 및 R1b의 적어도 하나의 경우에 대해, R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 또 다른 다른 구현예에서, R4a 및 R4b의 적어도 하나의 경우에 대해, R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 더 많은 구현예에서, R2a 및 R2b의 적어도 하나의 경우에 대해, R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 다른 다른 구현예에서, R3a 및 R3b의 적어도 하나의 경우에 대해, R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 다양한 다른 구현예에서, 지질 화합물은 하기 구조 (IIC) 또는 (IID) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00019
또는
Figure pct00020
여기서 e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 1 내지 12의 정수이다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, 지질 화합물은 구조(IIC)를 갖는다. 다른 구현예에서, 지질 화합물은 구조(IID)를 갖는다.
구조 (IIC) 또는 (IID)의 다양한 구현예에서, e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 4 내지 10의 정수이다.
화학식 (II)의 특정 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 특정 구현예에서, a는 0이다. 일부 구현예에서, a는 1이다. 다른 구현예에서, a는 2이다. 더 많은 구현예에서, a는 3이다. 또 다른 구현예에서, a는 4이다. 일부 구현예에서, a는 5이다. 다른 구현예에서, a는 6이다. 더 많은 구현예에서, a는 7이다. 또 다른 구현예에서, a는 8이다. 일부 구현예에서, a는 9이다. 다른 구현예에서, a는 10이다. 더 많은 구현예에서, a는 11이다. 또 다른 구현예에서, a는 12이다. 일부 구현예에서, a는 13이다. 다른 구현예에서, a는 14이다. 더 많은 구현예에서, a는 15이다. 또 다른 구현예에서, a는 16이다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, b는 1이다. 다른 구현예에서, b는 2이다. 더 많은 구현예에서, b는 3이다. 또 다른 구현예에서, b는 4이다. 일부 구현예에서, b는 5이다. 다른 구현예에서, b는 6이다. 더 많은 구현예에서, b는 7이다. 또 다른 구현예에서, b는 8이다. 일부 구현예에서, b는 9이다. 다른 구현예에서, b는 10이다. 더 많은 구현예에서, b는 11이다. 또 다른 구현예에서, b는 12이다. 일부 구현예에서, b는 13이다. 다른 구현예에서, b는 14이다. 더 많은 구현예에서, b는 15이다. 또 다른 구현예에서, b는 16이다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, c는 1이다. 다른 구현예에서, c는 2이다. 더 많은 구현예에서, c는 3이다. 또 다른 구현예에서, c는 4이다. 일부 구현예에서, c는 5이다. 다른 구현예에서, c는 6이다. 더 많은 구현예에서, c는 7이다. 또 다른 구현예에서, c는 8이다. 일부 구현예에서, c는 9이다. 다른 구현예에서, c는 10이다. 더 많은 구현예에서, c는 11이다. 또 다른 구현예에서, c는 12이다. 일부 구현예에서, c는 13이다. 다른 구현예에서, c는 14이다. 더 많은 구현예에서, c는 15이다. 또 다른 구현예에서, c는 16이다.
화학식 (II)의 일부 특정 구현예에서, d는 0이다. 일부 구현예에서, d는 1이다. 다른 구현예에서, d는 2이다. 더 많은 구현예에서, d는 3이다. 또 다른 구현예에서, d는 4이다. 일부 구현예에서, d는 5이다. 다른 구현예에서, d는 6이다. 더 많은 구현예에서, d는 7이다. 또 다른 구현예에서, d는 8이다. 일부 구현예에서, d는 9이다. 다른 구현예에서, d는 10이다. 더 많은 구현예에서, d는 11이다. 또 다른 구현예에서, d는 12이다. 일부 구현예에서, d는 13이다. 다른 구현예에서, d는 14이다. 더 많은 구현예에서, d는 15이다. 또 다른 구현예에서, d는 16이다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, e는 1이다. 다른 구현예에서, e는 2이다. 더 많은 구현예에서, e는 3이다. 또 다른 구현예에서, e는 4이다. 일부 구현예에서, e는 5이다. 다른 구체예에서, e는 6이다. 더 많은 구현예에서, e는 7이다. 또 다른 구현예에서, e는 8이다. 일부 구현예에서, e는 9이다. 다른 구현예에서, e는 10이다. 더 많은 구현예에서, e는 11이다. 또 다른 구현예에서, e는 12이다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, f는 1이다. 다른 구현예에서, f는 2이다. 더 많은 구현예에서, f는 3이다. 또 다른 구현예에서, f는 4이다. 일부 구현예에서, f는 5이다. 다른 구현예에서, f는 6이다. 더 많은 구현예에서, f는 7이다. 또 다른 구현예에서, f는 8이다. 일부 구현예에서, f는 9이다. 다른 구현예에서, f는 10이다. 더 많은 구현예에서, f는 11이다. 또 다른 구현예에서, f는 12이다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, g는 1이다. 다른 구현예에서, g는 2이다. 더 많은 구현예에서, g는 3이다. 또 다른 구현예에서, g는 4이다. 일부 구현예에서, g는 5이다. 다른 구현예에서, g는 6이다. 더 많은 구현예에서, g는 7이다. 또 다른 구현예에서, g는 8이다. 일부 구현예에서, g는 9이다. 다른 구체예에서, g는 10이다. 더 많은 구현예에서, g는 11이다. 또 다른 구현예에서, g는 12이다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, h는 1이다. 다른 구체예에서, e는 2이다. 더 많은 구현예에서, h는 3이다. 또 다른 구현예에서, h는 4이다. 일부 구현예에서, e는 5이다. 다른 구현예에서, h는 6이다. 더 많은 구현예에서, h는 7이다. 또 다른 구현예에서, h는 8이다. 일부 구현예에서, h는 9이다. 다른 구현예에서, h는 10이다. 더 많은 구현예에서, h는 11이다. 또 다른 구현예에서, h는 12이다.
화학식 (II)의 일부 다른 다양한 구현예에서, a와 d는 동일하다. 일부 다른 구현예에서, b와 c는 동일하다. 일부 다른 특정 구현예에서, a와 d는 동일하고 b와 c는 동일하다.
화학식 (II)의 a와 b의 합 및 c와 d의 합은 원하는 특성을 갖는 지질을 얻기 위해 변화될 수 있는 인자이다. 일 구현예에서, a 및 b는 합이 14 내지 24 범위의 정수가 되도록 선택된다. 다른 구현예에서, c 및 d는 합이 14 내지 24 범위의 정수가 되도록 선택된다. 추가 구현예에서, a와 b의 합 및 c와 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a와 b의 합 및 c와 d의 합은 모두 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다. 또 다른 구현예에서, a, b, c 및 d는 a와 b의 합 및 c와 d의 합이 12 이상이 되도록 선택된다.
화학식 (II)의 R1a, R2a, R3a 및 R4a에서의 치환기는 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 H이다. 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각 경우에 H이다. 다른 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 다른 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 다른 특정 구현예에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 전술한 구현예 중 일부에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
화학식 (II)의 특정 구현예에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각 경우에 C1-C12 알킬이다.
화학식 (II)의 추가 구현예에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각 경우에 H이다.
화학식 (II)의 특정 구현예에서, R1b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 전술한 것의 다른 구현예에서, R4b는 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 R5 및 R6에서의 치환기는 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, R5 또는 R6 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서, R5 또는 R6은 각각 메틸이다.
화학식 (II)의 R7에서의 치환기는 전술한 구현예에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, R7은 C6-C16 알킬이다. 일부 다른 구현예에서, R7은 C6-C9 알킬이다. 이들 구현예 중 일부에서, R7은 -(C=O)ORb, -O(C=O)Rb, -C(=O)Rb, -ORb, -S(O)xRb, -S-SRb, -C(=O)SRb, -SC(=O)Rb, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -C(=O)NRaRb, -NRaC(=O)NRaRb, -OC(=O)NRaRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaS(O)xNRaRb, -NRaS(O)xRb 또는 -S(O)xNRaRb로 치환되고, 여기서 Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고; Rb는 C1-C15 알킬이고; x는 0, 1 또는 2이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, R7은 -(C=O)ORb 또는 -O(C=O)Rb로 치환된다.
화학식 (II)의 상기 다양한 구현예에서, Rb는 분지형 C1-C15 알킬이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Rb는 다음 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00021
또는
Figure pct00022
화학식 (II)의 전술한 다른 특정 구현예에서, R8 또는 R9 중 하나는 메틸이다. 다른 구현예에서, R8 및 R9는 모두 메틸이다.
화학식 (II)의 일부 다른 구현예에서, R8 및 R9는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 전술한 것의 일부 구현예에서, R8 및 R9는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-원 헤테로사이클릭 고리, 예를 들어 피롤리디닐 고리를 형성한다. 일부 다른 구현예에서, R8 및 R9는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 6-원 헤테로사이클릭 고리, 예를 들어 피페라지닐 고리를 형성한다.
전술한 화학식 (II)의 지질의 또 다른 구현예에서, G3은 C2-C4 알킬렌, 예를 들어 C3 알킬렌이다.
다양한 다른 구현예에서, 지질 화합물은 다음 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
일부 구현예에서, LNP는 화학식 (II)의 지질, 적어도 하나의 제제, 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화 지질로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-9이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-10이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-11이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-12이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-32이다.
일부 다른 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 성분은 화학식 (III)의 구조:
Figure pct00029
또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 가지며,
L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2 중 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접적인 결합이고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고;
G3은 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, C3-C8 사이클로알케닐렌이고;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1 및 R2 각각은 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고;
R3은 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5C(=O)R4이고;
R4는 C1-C12 알킬이고;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고; 그리고
x는 0, 1 또는 2이다.
화학식 (III)의 일부 전술한 구현예에서, 지질은 하기 구조 (IIIA) 또는 (IIIB) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00030
또는
Figure pct00031
여기서:
A는 3 내지 8-원 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌 고리이고;
R6은 각 경우에 독립적으로 H, OH 또는 C1-C24 알킬이고;
n은 1 내지 15의 정수이다.
화학식 (III)의 전술한 구현예 중 일부에서, 지질은 구조 (IIIA)를 갖고, 다른 구현예에서, 지질은 구조 (IIIB)를 갖는다.
화학식 (III)의 다른 구현예에서, 지질은 하기 구조 (IIIC) 또는 (IIID) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
여기서 y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 12 범위의 정수이다.
화학식 (III)의 상기 임의의 구현예에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2 각각은 -O(C=O)-이다. 전술한 것의 일부 다른 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2 각각은 -(C=O)O-이다.
화학식 (III)의 일부 다른 구현예에서, 지질은 하기 구조 (IIIE) 또는 (IIIF) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00034
또는
Figure pct00035
화학식 (III)의 일부 전술한 구현예에서, 지질은 하기 구조 (IIIG), (IIIH), (IIII), 또는 (IIIJ) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00036
Figure pct00037
또는
Figure pct00038
전술한 화학식 (III)의 일부 구현예에서, n은 2 내지 12, 예를 들어 2 내지 8 또는 2 내지 4 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 n은 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, n은 5이다. 일부 구현예에서, n은 6이다.
화학식 (III)의 전술한 일부 다른 구현예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 4 내지 9 또는 4 내지 6 범위의 정수이다.
화학식 (III)의 전술한 구현예 중 일부에서, R6은 H이다. 상기 다른 구현예에서, R6은 C1-C24 알킬이다. 다른 구현예에서, R6은 OH이다.
화학식 (III)의 일부 구현예에서, G3은 비치환된다. 다른 구현예에서, G3은 치환된다. 다양한 다른 구현예에서, G3은 선형 C1-C24 알킬렌 또는 선형 C1-C24 알케닐렌이다.
화학식 (III)의 일부 다른 전술한 구현예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 C6-C24 알케닐이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00039
여기서:
R7a 및 R7b는 각각의 경우 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고; 그리고
a는 2 내지 12의 정수이고,
여기서 R7a, R7b 및 a는 각각 R1 및 R2가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다.
화학식 (III)의 전술한 구현예 중 일부에서, R7a의 적어도 하나의 경우는 H이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R7a는 각각의 경우에 H이다. 전술한 다른 다른 구현예에서, R7b의 적어도 하나의 경우는 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
화학식 (III)의 다른 구현예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 다음 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00040
화학식 (III)의 전술한 구현예 중 일부에서, R3은 OH, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R4이다. 일부 구현예에서, R4는 메틸 또는 에틸이다.
다양한 다른 구현예에서, 화학식 (III)의 양이온성 지질은 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
일부 구현예에서, LNP는 화학식 (III)의 지질, 적어도 하나의 제제, 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화 지질로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (III)의 지질은 화합물 III-3이다. 일부 구현예에서, 화학식 (III)의 지질은 화합물 III-7이다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 약 30 내지 약 95몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 30 내지 약 70몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 40 내지 약 60몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 50몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, LNP는 양이온성 지질만을 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 입자의 형성 동안 입자의 형성을 안정화시키는 하나 이상의 추가 지질을 포함한다.
적합한 안정화 지질은 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함한다.
"중성 지질"이라는 용어는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않거나 중성 쯔비터이온성 형태로 존재하는 많은 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다. 대표적인 중성 지질은 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 디하이드로 스핑고미엘린, 세팔린, 및 세레브로시드를 포함한다.
예시적인 중성 지질은 예를 들어, 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 및 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티딜에탄올 아민 (SOPE), 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (transDOPE)을 포함한다. 한 구현예에서, 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
일부 구현예에서, LNP는 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택되는 중성 지질을 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질(예를 들어, 화학식 (I)의 지질) 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.
다양한 구현예에서, LNP는 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 추가로 포함한다. "스테로이드"는 다음 탄소 골격을 포함하는 화합물이다:
Figure pct00046
특정 구현예에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 이들 구현예 중 일부에서, 양이온성 지질(예를 들어, 화학식 (I)의 지질) 대 콜레스테롤의 몰비는 약 2:1 내지 1:1 범위이다.
용어 "음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 음전하를 띠는 임의의 지질을 지칭한다. 이러한 지질은 포스파티딜글리세롤, 카디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-석시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 라이실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤 (POPG), 중성 지질에 결합된 기타 음이온 변형 기를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 당지질(예를 들어, 모노시알로강글리오시드 GM1)을 포함한다. 특정 구현예에서, LNP는 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 중합체 접합 지질을 포함한다. 용어 "중합체 접합 지질"은 지질 부분과 중합체 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 중합체 접합 지질의 예는 페길화 지질이다. 용어 "페길화 지질"은 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 페길화 지질은 당업계에 공지되어 있고 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-s-DMG) 등을 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜-지질(페길화 지질)인 추가의 안정화 지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG 변형 포스파티딜에탄올아민, PEG 변형 포스파티드산, PEG 변형 세라미드 (예를 들어, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG 변형 디알킬아민, PEG 변형 디아실글리세롤, PEG 변형 디알킬글리세롤을 포함한다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMa 및 PEG-s-DMG를 포함한다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바밀]-1,2-디미리스틸옥실프로필-3-아민(PEG-c-DMA)이다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG)이다. 다른 구현예에서, LNP는 페길화된 디아실글리세롤 (PEG-DAG) 예컨대 1-(모노메톡시 폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤 (PEG-DMG), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민 (PEG-PE), PEG 석시네이트 디아실글리세롤 (PEG-S-DAG) 예컨대 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트 (PEG-S-DMG), 페길화된 세라미드 (PEG-cer), 또는 PEG 디알콕시프로필카바메이트 예컨대 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-디(테트라데카녹시)프로필)카바메이트 또는 2,3-디(테트라데카녹시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트를 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질 대 페길화 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1 범위이다.
일부 구현예에서, LNP는 하기 구조 (IV)를 갖는 페길화 지질:
Figure pct00047
또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 또는 입체이성질체을 포함하며,
R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고, 여기서 알킬 사슬은 선택적으로 하나 이상의 에스테르 결합에 의해 중단되고; 그리고
z는 30 내지 60 범위의 평균값을 갖는다.
페길화 지질(IV)의 전술한 구현예 중 일부에서, R10 및 R11은 z가 42일 때 둘 다 n-옥타데실이 아니다. 일부 다른 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 12 내지 16개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 14개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 다른 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 16개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 더 많은 구현예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 18개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 또 다른 구현예에서, R10은 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고 R11은 14개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다.
다양한 구현예에서, z는 (II)의 PEG 부분이 약 400 내지 약 6000 g/mol의 평균 분자량을 갖도록 선택되는 범위에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 평균 z는 약 45이다.
다른 구현예에서, 페길화 지질은 다음 구조 중 하나를 갖는다:
여기서 n은 페길화 지질의 평균 분자량이 약 2500 g/mol이 되도록 선택된 정수이다.
특정 구현예에서, 추가 지질은 약 1 내지 약 10몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 약 1 내지 약 5몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 약 1몰% 또는 약 1.5몰%로 LNP에 존재한다.
일부 구현예에서, LNP는 화학식 (I)의 지질, 뉴클레오시드 변형 RNA, 중성 지질, 스테로이드 및 페길화 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (I)의 지질은 화합물 I-6이다. 다른 구현예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 다른 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 또 다른 구현예에서, 페길화 지질은 화합물 IVa이다.
특정 구현예에서, LNP는 LNP를 세포 또는 세포 집단으로 표적화하는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 표적화 도메인은 LNP를 세포 표면에서 발견되는 수용체로 안내하는 리간드이다.
특정 구현예에서, LNP는 하나 이상의 내재화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 세포에 결합하여 LNP의 내재화를 유도하는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 하나 이상의 내재화 도메인은 세포 표면에서 발견되는 수용체에 결합하여 LNP의 수용체 매개 흡수를 유도한다. 특정 구현예에서, LNP는 생체 내에서 생체분자와 결합할 수 있으며, 여기서 LNP 결합 생체분자는 세포-표면 수용체에 의해 인식되어 내재화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 전신 ApoE에 결합하여 LNP 및 관련 카고(cargo)의 흡수를 유도한다.
다른 예시적인 LNP 및 이의 제조는 당해 기술, 예를 들어 문헌[미국 특허 출원 공개 제US20120276209호, Semple 등, 2010, Nat Biotechnol., 28(2):172-176; Akinc 등, 2010, Mol Ther., 18(7): 1357-1364; Basha 등, 2011, Mol Ther, 19(12): 2186-2200; Leung 등, 2012, J Phys Chem C Nanomater Interfaces, 116(34): 18440-18450; Lee 등, 2012, Int J Cancer., 131(5): E781-90; Belliveau 등, 2012, Mol Ther nucleic Acids, 1: e37; Jayaraman 등, 2012, Angew Chem Int Ed Engl., 51(34): 8529-8533; Mui 등, 2013, Mol Ther Nucleic Acids. 2, e139; Maier 등, 2013, Mol Ther., 21(8): 1570-1578; 및 Tam 등, 2013, Nanomedicine, 9(5): 665-74]에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 참조로 포함된다.
하기 반응식은 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 지질을 제조하는 방법을 예시한다.
일반 반응식 1
Figure pct00049
화학식 (I)의 지질(예를 들어, 화합물 A-5)의 구현예는 일반 반응식 1("방법 A")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이고 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응식 1을 참조하면, 구조 A-1의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구입하거나 당업자에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. A-1, A-2 및 DMAP의 혼합물을 DCC로 처리하여 브로마이드 A-3을 얻는다. 브로마이드 A-3, 염기(예를 들어, N,N-디이소프로필에틸아민) 및 N,N-디메틸디아민 A-4의 혼합물을 임의의 필연적 워크업 및/또는 정제 단계 후에 A-5를 생성하기에 충분한 온도 및 시간에서 가열한다.
일반 반응식 2
Figure pct00050
화학식 (I)의 화합물(예를 들어, 화합물 B-5)의 다른 구현예는 일반 반응식 2("방법 B")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이고 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 구조 B-1의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구입하거나 당업자에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. B-1(1 당량)의 용액을 산 염화물 B-2(1 당량) 및 염기(예를 들어, 트리에틸아민)로 처리한다. 미정제 생성물을 산화제(예를 들어, 피리디늄 클로로크로메이트)로 처리하고 중간 생성물 B-3을 회수한다. 미정제 B-3, 산(예를 들어, 아세트산) 및 N,N-디메틸아미노아민 B-4의 용액을 환원제(예를 들어, 나트륨 트리아세톡시붕소수화물)로 처리하여 임의의 필요한 워크업 및/또는 정제 후 B-5를 얻는다.
시작 물질 A-1 및 B-1이 포화된 메틸렌 탄소만을 포함하는 것으로 상기에 기술되어 있지만, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 시작 물질이 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 화합물의 제조에 사용될 수도 있음을 주목해야 한다.
일반 반응식 3
Figure pct00051
화학식 (I)의 지질(예를 들어, 화합물 C-7 또는 C9)의 다른 구현예는 일반 반응식 3("방법 C")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R은 포화 또는 불포화 C1-C24 알킬 또는 포화 또는 불포화 사이클로알킬이고, m은 0 또는 1이고 n은 1 내지 24의 정수이다. 일반 반응식 3을 참조하면, 구조 C-1의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구입하거나 당업자에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다.
일반 반응식 4
Figure pct00052
Figure pct00053
화학식 (II)의 화합물(예를 들어, 화합물 D-5 및 D-7)의 구현예는 일반 반응식 4("방법 D")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R1a, R1b, R2a, R2b, R3a, R3b, R4a, R4b, R5, R6, R8, R9, L1, L2, G1, G2, G3, a, b, c 및 d는 본 명세서에서 정의된 바와 같고, R7'은 R7 또는 C3-C19 알킬을 나타낸다. 일반 반응식 1을 참조하면, 구조 D-1 및 D-2의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구입하거나 당업자에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. D-1과 D-2의 용액을 환원제(예를 들어, 나트륨 트리아세톡시붕소수화물)로 처리하여 임의의 필요한 워크업 후 D-3을 얻는다. D-3 및 염기(예를 들어, 트리메틸아민, DMAP)의 용액을 아실 클로라이드 D-4(또는 카복실산 및 DCC)로 처리하여 임의의 필요한 워크업 및/또는 정제 후 D-5를 얻는다. D-5는 임의의 필요한 워크업 및/또는 정제 후 LiAlH4 D-6으로 환원되어 D-7을 제공할 수 있다.
일반 반응식 5
Figure pct00054
화학식 (II)의 지질(예를 들어, 화합물 E-5)의 구현예는 일반 반응식 5("방법 E")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R1a, R1b, R2a, R2b, R3a, R3b, R4a, R4b, R5, R6, R7, R8, R9, L1, L2, G3, a, b, c 및 d는 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 일반 반응식 2을 참조하면, 구조 E-1 및 E-2의 화합물은 상업적 공급원으로부터 구입하거나 당업자에게 친숙한 방법에 따라 제조될 수 있다. E-1(과량), E-2 및 염기(예를 들어, 탄산칼륨)의 혼합물을 임의의 필요한 워크업 후 가열하여 E-3을 얻는다. E-3 및 염기(예를 들어, 트리메틸아민, DMAP)의 용액을 아실 클로라이드 E-4(또는 카복실산 및 DCC)로 처리하여 임의의 필요한 워크업 및/또는 정제 후 E-5를 얻는다.
일반 반응식 6
Figure pct00055
일반 반응식 6은 화학식 (III)의 지질을 제조하기 위한 예시적인 방법(방법 F)을 제공한다. 일반 반응식 6에서 G1, G3, R1 및 R3은 본 명세서에서 화학식 (III)에 대해 정의된 바와 같고, G1'은 G1의 탄소 1개 더 짧은 동족체를 나타낸다. 구조 F-1의 화합물은 구입하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조한다. 적절한 축합 조건(예를 들어, DCC) 하에서 F-1과 디올 F-2와의 반응은 에스테르/알코올 F-3을 생성하며, 이는 이어서 알데히드 F-4로 산화될 수 있다(예를 들어, PCC). 환원성 아미노화 조건 하에서 F-4와 아민 F-5와의 반응은 화학식 (III)의 지질을 생성한다.
화학식 (III)의 지질을 제조하기 위한 다양한 대안적인 전략이 당업자에게 이용가능하다는 점에 주목해야 한다. 예를 들어, L1 및 L2가 에스테르가 아닌 화학식 (III)의 다른 지질은 적절한 시작 물질을 사용하여 유사한 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 일반 반응식 6은 G1 및 G2가 동일한 화학식 (III)의 지질의 제조를 도시하고; 그러나 이는 본 발명의 요구되는 양태가 아니며 상기 반응식에 대한 변형은 G1 및 G2가 다른 화합물을 생성하는 것이 가능하다.
본 명세서에 기재된 공정에서 중간체 화합물의 작용기는 적합한 보호기에 의해 보호될 필요가 있을 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 그러한 작용기는 하이드록시, 아미노, 머캅토 및 카복실산을 포함한다. 하이드록시를 위한 적합한 보호기는 트리알킬실릴 또는 디아릴알킬실릴 (예를 들어, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 또는 트리메틸실릴), 테트라하이드로피라닐, 벤질, 등을 포함한다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노를 위한 적합한 보호기는 t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 등을 포함한다. 머캅토를 위한 적합한 보호기는 -C(O)-R"(여기서 R"은 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등을 포함한다. 카복실산을 위한 적합한 보호기는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스테르를 포함한다. 보호기는 당업자에게 공지되고 본 명세서에 기재된 바와 같은 표준 기술에 따라 추가 또는 제거될 수 있다. 보호기의 사용은 문헌[Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 제3판, Wiley]에 상술되어 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 보호기는 또한 Wang 수지, Rink 수지 또는 2-클로로트리틸-클로라이드 수지와 같은 중합체 수지일 수 있다.
전달 비히클 구현예
임의의 적합한 전달 비히클 포맷이 고려된다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀, 혼합된 마이셀, 리포솜, 및 지질 나노입자를 포함하는 지질 기반 시스템이다. 시험관 내 및 생체 내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포) 및 지질 나노입자를 포함한다.
전술된 바와 같은 지질 제형의 사용은 적어도 하나의 제제를 숙주 세포로 도입하기 위해 고려된다(시험관 내, 생체외 또는 생체 내). 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 제제는 지질과 연관될 수 있다. 지질과 연관된 적어도 하나의 제제는 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되어 있으며, 리포솜과 올리고뉴클레오티드 둘 다와 연관된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되고, 리포솜에 포획되고, 리포솜과 복합체를 이루고, 지질을 함유하는 용액에 분산되고, 지질과 혼합되고, 지질과 조합되고, 지질에 현탁액으로 함유되어 있으며, 지질과 복합화되고, 마이셀을 함유하거나 복합화되거나, 달리 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/핵산 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이중층 구조, 마이셀 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 그들은 또한 단순히 용액에 산재되어 크기나 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 제제의 전달은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 예시적인 전달 방법을 포함하는 임의의 적합한 전달 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 제제를 대상체에게 전달하는 것은 접촉 단계 전에 적어도 하나의 제제를 형질감염 시약과 혼합하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 제제를 형질감염 시약과 함께 투여하는 것을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 양이온성 지질 시약이다.
다른 구현예에서, 형질감염 시약은 지질 기반 형질감염 시약이다. 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 단백질 기반 형질감염 시약이다. 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 폴리에틸렌이민 기반 형질감염 시약이다. 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 인산칼슘이다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 Lipofectin®, Lipofectamine®, 또는 TransIT®이다. 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 당업계에 공지된 임의의 다른 형질감염 시약이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 제제의 전달은 리포솜을 포함한다. "리포솜"은 둘러싸인 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중라멜라 지질 비히클을 포괄하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 특징지어질 수 있다. 다중라멜라 리포솜은 수성 매질로 분리된 여러 지질 층을 가지고 있다. 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 닫힌 구조가 형성되기 전에 자가 재배열을 거치고 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(Ghosh 등, 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나 용액에서 정상적인 소포 구조와 다른 구조를 갖는 조성물도 포괄된다. 예를 들어, 지질은 마이셀 구조를 추정하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 집합체로 존재할 수 있다.
지질과 연관된 적어도 하나의 제제는 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되어 있으며, 리포솜과 올리고뉴클레오티드 둘 다와 연관된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되고, 리포솜에 포획되고, 리포솜과 복합체를 이루고, 지질을 함유하는 용액에 분산되고, 지질과 혼합되고, 지질과 조합되고, 지질에 현탁액으로 함유되어 있으며, 마이셀을 함유하거나 복합화되거나, 달리 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/핵산 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이중층 구조, 마이셀 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 그들은 또한 단순히 용액에 산재되어 크기나 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 형질감염 시약은 리포솜을 형성한다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 세포내 안정성을 증가시키고 흡수 효율을 증가시키며 생물학적 활성을 개선한다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 세포막을 구성하는 지질과 유사한 방식으로 배열된 지질로 구성된 중공 구형 소포이다. 일부 구현예에서, 리포솜은 수용성 화합물을 포획하기 위한 내부 수성 공간을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 적어도 하나의 제제를 활성 형태로 세포에 전달할 수 있다.
한 구현예에서, 조성물은 지질 나노입자(LNP) 및 적어도 하나의 제제를 포함한다.
용어 "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질을 포함하는 나노미터 정도(예를 들어, 1-1000nm)의 적어도 하나의 차원을 갖는 입자를 지칭한다. 일부 구현예에서, LNP는 역 지질 마이셀 내에 조직화되고 지질 단일층 외피 내에 둘러싸이거나 인접한 지질 이중층(예를 들어, 지질 이중층-제제-지질 이중층) 사이에 삽입되는 적어도 하나의 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP의 형태는 전자 치밀 코어를 소유하기 때문에 수성 코어를 둘러싸는 지질 이중층을 특징으로 하는 기존의 리포솜과 같지 않으며, 양이온성/이온화 가능한 지질은 캡슐화된 제제(예를 들어, mRNA 분자) 주변의 역 마이셀로 조직화된다 (Cullis and Hope, 2017; Guevara 등, 2019b). 다양한 구현예에서, 입자는 화학식(I), (II) 또는 (III)의 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 제제를 포함하는 제형에 포함된다. 일부 구현예에서, 이러한 지질 나노입자는 양이온성 지질 (예를 들어, 화학식 (I), (II) 또는 (III))의 지질 및 중성 지질, 하전된 지질, 스테로이드 및 지질 고정 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, 페길화된 지질 예컨대 구조 (IV), 예컨대 화합물 IVa)의 페길화된 지질)로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제제는 지질 나노입자의 지질 부분 또는 지질 나노입자의 지질 부분의 일부 또는 전부에 의해 둘러싸인 수성 공간에 캡슐화되어, 숙주 유기체 또는 세포의 메커니즘에 의해 유도된 효소 분해 또는 기타 바람직하지 않은 효과, 예를 들어 불리한 면역 반응으로부터 보호한다.
다양한 구현예에서, 지질 나노입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm의 평균 직경을 갖는다. 한 구현예에서, 지질 나노입자는 약 83 nm의 평균 직경을 갖는다. 일 구현예에서, 지질 나노입자는 약 102 nm의 평균 직경을 갖는다. 한 구현예에서, 지질 나노입자는 약 103 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 실질적으로 무독성이다. 특정 구현예에서, 지질 나노입자에 존재할 때 적어도 하나의 제제는 수용액에서 세포내 또는 세포간 효소에 의한 분해에 대해 내성이다.
LNP는 적어도 하나의 제제가 부착되거나 적어도 하나의 제제가 캡슐화되거나 복합화되는 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다. 용어 "지질"은 지방산(예를 들어, 에스테르)의 유도체이고 일반적으로 물에는 녹지 않지만 많은 유기 용매에는 녹는 것을 특징으로 하는 유기 화합물 기를 지칭한다. 예시적인 지질은 본 명세서의 다른 곳에 제시되어 있다.
한 구현예에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질은 중성 지질, 음이온성 지질 및 페길화 지질을 포함한다.
한 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "양이온성 또는 이온화 지질"은 pH가 지질의 이온화 기의 pKa 미만으로 낮아짐에 따라 양이온성이거나 양이온성(양성자화)이 되지만 더 높은 pH 값에서 점진적으로 더 중성인 지질을 지칭한다. pKa 미만의 pH 값에서, 지질은 음전하를 띤 핵산과 회합할 수 있다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 pH 감소 시 양전하를 띠는 쯔비터이온성 지질을 포함한다.
다양한 구현예에서, LNP는 양이온성 또는 이온화가능한 지질, 안정화 지질, 스테롤 및 지질 고정 폴리에틸렌 글리콜(즉, 페길화 지질)을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 화학식 (I)의 이온성 지질, 적어도 하나의 제제, 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (I)의 지질은 화합물 I-5이다. 일부 구현예에서, 화학식 (I)의 지질은 화합물 I-6이다.
일부 구현예에서, LNP는 화학식 (II)의 이온성 지질, 적어도 하나의 제제, 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-9이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-10이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-11이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-12이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 지질은 화합물 II-32이다.
일부 구현예에서, LNP는 화학식 (III)의 이온성 지질, 적어도 하나의 제제, 및 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (III)의 지질은 화합물 III-3이다. 일부 구현예에서, 화학식 (III)의 지질은 화합물 III-7이다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 약 30 내지 약 95몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 30 내지 약 70몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 40 내지 약 60몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 약 50몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, LNP는 양이온성 지질만을 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 카고를 캡슐화하고 입자 형성 동안 입자 형성을 안정화하는 것을 돕는 하나 이상의 안정화 지질(예를 들어, 중성 또는 음이온성 지질)을 포함한다. 예시적인 중성 지질은 예를 들어, 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 및 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티딜에탄올 아민 (SOPE), 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (transDOPE)을 포함한다. 한 구현예에서, 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질(예를 들어, 화학식 (I)의 지질) 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.
다양한 구현예에서, LNP는 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 이들 구현예 중 일부에서, 양이온성 지질(예를 들어, 화학식 (I)의 지질) 대 콜레스테롤의 몰비는 약 2:1 내지 1:1 범위이다.
특정 구현예에서, LNP는 당지질(예를 들어, 모노시알로강글리오시드 GM1)을 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 면역계 인식을 감소시키고 생체분포를 개선하기 위한 폴리에틸렌 글리콜-지질 (페길화 지질)인 추가적인 지질을 포함한다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG이다. 다른 구현예에서, LNP는 페길화된 디아실글리세롤 (PEG-DAG) 예컨대 1-(모노메톡시 폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤 (PEG-DMG), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민 (PEG-PE), PEG 석시네이트 디아실글리세롤 (PEG-S-DAG) 예컨대 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트 (PEG-S-DMG), 페길화된 세라미드 (PEG-cer), 또는 PEG 디알콕시프로필카바메이트 예컨대 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-디(테트라데카녹시)프로필)카바메이트 또는 2,3-디(테트라데카녹시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트를 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질 대 페길화 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1 범위이다.
특정 구현예에서, 페길화 지질은 약 1 내지 약 10몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 페길화 지질은 약 1 내지 약 5몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 한 구현예에서, 페길화 지질은 약 1몰% 또는 약 1.5몰%로 LNP에 존재한다.
일부 구현예에서, LNP는 화학식 (I)의 지질, 뉴클레오시드 변형 RNA, 중성 지질, 스테로이드 및 페길화 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (I)의 지질은 화합물 I-6이다. 다른 구현예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 다른 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 또 다른 구현예에서, 페길화 지질은 화합물 IVa이다.
특정 구현예에서, LNP는 LNP를 세포 또는 세포 집단으로 표적화하는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 표적화 도메인은 LNP를 세포 표면에서 발견되는 수용체로 안내하는 리간드이다. 예시적인 표적화 도메인은 CD4를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 하나 이상의 내재화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 세포에 결합하여 LNP의 내재화를 유도하는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 하나 이상의 내재화 도메인은 세포 표면에서 발견되는 수용체에 결합하여 LNP의 수용체 매개 흡수를 유도한다. 특정 구현예에서, LNP는 생체 내에서 생체분자와 결합할 수 있으며, 여기서 LNP 결합 생체분자는 세포-표면 수용체에 의해 인식되어 내재화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 전신 ApoE에 결합하여 LNP 및 관련 카고(cargo)의 흡수를 유도한다.
다른 예시적인 LNP 및 이의 제조는 당해 기술, 예를 들어 문헌[미국 특허 출원 공개 제US20120276209호, Semple 등, 2010, Nat Biotechnol., 28(2):172-176; Akinc 등, 2010, Mol Ther., 18(7): 1357-1364; Basha 등, 2011, Mol Ther, 19(12): 2186-2200; Leung 등, 2012, J Phys Chem C Nanomater Interfaces, 116(34): 18440-18450; Lee 등, 2012, Int J Cancer., 131(5): E781-90; Belliveau 등, 2012, Mol Ther nucleic Acids, 1: e37; Jayaraman 등, 2012, Angew Chem Int Ed Engl., 51(34): 8529-8533; Mui 등, 2013, Mol Ther Nucleic Acids. 2, e139; Maier 등, 2013, Mol Ther., 21(8): 1570-1578; 및 Tam 등, 2013, Nanomedicine, 9(5): 665-74]에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 참조로 포함된다.
표적화 모이어티
위에서 교시한 바와 같이, 본 명세서에서 고려되는 전달 비히클(이는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀, 혼합된 마이셀, 리포솜, 및 지질 나노입자 (LNP)을 포함하는 지질 기반 시스템으로 제한되지 않는 것과 같은 다양한 방식 포함할 수 있음)은 전달 비히클(예를 들어, LNP)을 세포 또는 세포 집단에 표적화하는 기능을 하는 하나 이상의 표적화 모이어티(또는 동등하게 "표적화 도메인" 또는 "표적화 리간드")를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 표적 세포 또는 조직의 표면 상의 표적 세포 리간드와 특이적으로 상호작용하고 결합할 수 있는 임의의 적합한 결합제를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 자연 발생적이거나 조작된 것일 수 있다. 표적화 모이어티는 단백질, 펩티드, 항체 또는 항체 단편, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편, 소분자, 압타머, 비타민, 핵산 분자, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의의 특정 표적화 모이어티가 (a) 전달 비히클(공유 또는 비공유)에 커플링되고 (b) 전달 비히클 상의 표적화 모이어티와 표적 세포 또는 조직 상의 표적 세포 리간드 사이의 결합 또는 상호작용에 의해 표적 세포 또는 조직으로의 전달 비히클의 국소화 또는 표적화를 야기하거나 용이하게 할 수 있는 한, 본 명세서에서 고려되는 표적화 모이어티에 제한을 두는 것을 의미하지 않는다.
표적 세포 리간드는 세포 표면 또는 세포 외부의 세포외 공간에서 발생하는 내인성 리간드, 예컨대 탄수화물, 지질, 다당류, 단백질, 당단백질, 당지질, 펩티드, 세포막 성분 (예를 들어, 콜레스테롤) 등을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 세포 상의 내인성 리간드는 표적 세포에 대해 특이적이며, 즉, 표적 세포에서만 발현되고/되거나 함유되거나, 적어도 표적 세포가 아닌 세포에 최소한으로 존재한다. 예를 들어, 표적 세포 상의 내인성 리간드는 질환 연관 단백질, 예를 들어 건강한 세포에서는 전형적으로 발현되지 않는 암 세포 단백질 세포 표면 단백질일 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 세포 상의 표적화 리간드는 조작된 또는 달리 비-자연 발생 리간드, 예를 들어, 비-자연 발생 표면 세포 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 표적 세포일 수 있다. 적합한 표적화 리간드는 표적 세포의 고유한 특성이 이용되도록 선택될 수 있으며, 따라서 조성물이 표적 세포와 비-표적 세포를 구별할 수 있게 한다.
이러한 양태는 관심 표적 세포(예를 들어, T-세포와 같은 림프구)로의 전달 비히클의 "선택적 전달"로 지칭될 수 있다. 용어 "선택적 전달"은 전달 비히클의 표적화 모이어티과 관심 표적 세포(예를 들어, 특정 T-세포 하위집단) 상의 표적 세포 리간드 사이의 결합 상호작용을 통해 전달 비히클이 표적 세포(예를 들어, 특정 T-세포 하위집단)에 공유 또는 비공유 결합함으로써 국소화됨을 하지만, 전달 비히클은 표적 세포 리간드를 발현하지 않는 세포(즉, 이러한 세포는 "비-표적 세포"로 지칭될 수 있음)에 결합하지 않거나 최소한으로 결합한다. "최소한으로 결합한다"란, 비-표적 세포에 대한 전달 비히클의 결합이 음성 대조군(전달 비히클에 결합하지 않는 것으로 알려진 세포 유형일 수 있음)에 비해 검출되지 않은 범위 내지 1% 미만, 또는 2% 미만, 또는 3% 미만, 또는 4% 미만, 또는 5% 미만, 또는 6% 미만, 또는 7% 미만, 또는 8% 미만, 또는 9% 미만, 또는 10% 미만의 증가된 결합의 범위임을 의미한다.
따라서, 본 개시내용의 전달 비히클은 전달 비히클에 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 부착된 표적화 모이어티를 이용함으로써 특정 유형의 세포(예를 들어, 특정 유형의 T 세포)에 국소화되거나 표적화될 수 있다. 바람직하게는, 전달 비히클의 외부 표면에 표적화 모이어티이 제시되거나 달리 노출되도록 표적화 부분이 부착되고, 이로써 모이어티가 표적 세포 또는 조직의 표면 상의 동족 결합 도메인 또는 리간드(예를 들어, 특정 CD4 항원)와 상호작용할 수 있어, 표적 세포 또는 조직(예를 들어, CD4+ T 세포)에 대한 전달 비히클의 결합을 촉진하거나 용이하게 하고, 그 다음 전달 비히클에 의해 일단 세포 내부로 운반되는 제제(예를 들어, mRNA)의 부수적인 방출과 함께 (예를 들어, 세포내이입과 같은 능동적 내재화를 통해) 내재화된다.
표적화 모이어티가 제조 동안 또는 제조 후에 전달 비히클의 표면에 연결될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 비히클이 제조된 후에 전달 비히클의 표면에 부착된다. 다른 구현예에서, 표적화 모이어티는 비히클이 제조되기 전에 조립되지 않은 전달 비히클의 성분(예를 들어, 지질)에 부착된다. 이러한 부착 수단은 당업계에 이미 잘 알려져 있고 본 명세서에서 논의된 임의의 적합한 접합 화학을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 전달 비히클 또는 전달 비히클을 포함하는 조성물은 표적 세포에 대한 전달 비히클의 국소화를 강화시키는 하나 이상의 추가 제제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 추가 제제는 다른 펩티드, 압타머, 올리고뉴클레오티드, 비타민 또는 전달 비히클의 표적 세포로의 국소화를 촉진하지만 반드시 전달 비히클에 직접적인 커플링되지는 않는 다른 분자를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 본 개시내용의 전달 비히클은 일반적으로 면역계 세포의 골수 및 림프양 부류를 포함하는 백혈구로 전달 비히클을 표적화할 수 있는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 골수 세포는 예를 들어 호중구, 호산구, 비만 세포, 호염기구 및 단핵구를 포함할 수 있다. 단핵구는 수지상 세포와 대식세포로 추가 분류된다. 림프양 세포 (또는 림프구)에는 T 세포(헬퍼 T 세포, 기억 T 세포 및 세포독성 T 세포로 세분됨), B 세포(형질 세포 및 기억 B 세포로 세분됨) 및 자연 살해 세포가 포함된다.
전달 비히클이 특이적이고 바람직하게는 표적화 모이어티와 세포 표적 리간드 사이의 선택적인 상호작용으로 인해 표적 세포에 국소화되도록 전달 비히클, 예를 들어 항체, 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 소분자, 비타민 또는 압타머(전달 비히클에 공유 또는 비-공유) 상의 적절하게 일치하는 표적화 모이어티를 설치함으로써, 당업자는 본 명세서에 기재된 전달 비히클을 국소화하기 위한 수단으로서 이용될 수 있는 각각의 이러한 유형의 백혈구 상의 적절한 세포 표적 리간드를 확인할 수 있을 것이다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 백혈구, 및 특히, 특정 림프구, 예컨대 CD4+ T 세포를 표적화 및/또는 국소화하는 전달 비히클을 고려한다. 특정 구현예에서, 전달 비히클은 전달 비히클을 헬퍼 T 세포를 포함하는 T 세포로 표적화할 수 있는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다.
백혈구가 다른 유형의 백혈구의 특징이고 백혈구의 다양한 하위집단을 정의하는 것을 돕는 CD 항원으로 알려진 세포 표면 항원을 포함한다는 것을 당업자는 인식할 것이다.
분화 클러스터(CD)는 백혈구의 세포 표면에서 발견되는 항원을 식별하고 분류하기 위해 고안된 명명법 시스템이다. 처음에 표면 항원은 이에 결합하는 단클론성 항체의 이름을 따서 명명되었다. 종종 서로 다른 실험실에서 각 항원에 대해 생성된 여러 개의 단클론성 항체가 있었기 때문에, 일관된 명명법을 채택할 필요성이 생겼다. 현재의 시스템은 1982년 제1회 International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA)를 통해 채택되었다. Human Cell Differentiation Molecules 조직은 알려진 CD 마커 목록을 유지하고 개발하기 위해 HLDA 회의를 계속 개최한다.
이 명명 시스템 하에, 특성이 잘 알려진 항원에는 임의의 번호(예를 들어, CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8 등)가 지정되는 반면, 단 하나의 단클론성 항체에 의해 인식되는 분자에는 임시의 지정 "CDw" 예를 들어, CDw50가 지정된다. CD1a 또는 CD1d와 같이 공통 사슬을 공유하는 더 큰 분자를 나타내기 위해 할당된 번호 뒤에 하위 등급 문자도 추가된다. 생리학적으로, CD 분자는 임의의 특정 부류에 속하지 않으며 세포 표면 수용체에서 접착 분자에 이르기까지 다양한 기능을 한다. 처음에는 인간 백혈구에만 사용되었지만 CD 분자 명명 규칙은 이제 다른 종(예를 들어, 마우스)과 다른 세포 유형을 포함하도록 확장되었다. 2016년 4월 현재 인간 CD 항원은 CD371까지 넘버링되어 있다.
특정 세포 집단의 표면에서 특정 항원의 존재 또는 부재는 각각 "+" 또는 "-"로 표시된다. 다양한 세포 발현 수준은 또한 높음 또는 낮음으로 표시되고, 예를 들어 중심 기억 T-세포는 CD62Lhi인 반면, 이펙터 기억 T-세포는 CD62Llow이다. 다른 CD 항원의 발현 프로파일을 모니터링하면 다양한 면역 과정에서 기능에 따라 세포 유형을 식별, 단리 및 표현형 분석할 수 있다.
본 개시내용의 전달 비히클은 CD4 항원에 결합하거나 달리 회합하는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 전달 비히클을 표적 세포(예를 들어, 백혈구)로 표적화하기 위한 표적화 모이어티는 항체 또는 항체 결합 단편이다. 이러한 항체 또는 항체 결합 단편은 항-CD4 항체 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체"는 상응하는 항원(예를 들어, CD4 항원)에 비-공유적으로, 가역적으로 및 특정 방식으로 결합할 수 있는 면역글로불린 계열의 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 자연 발생 IgG 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H) 사슬 및 2개의 경(L) 사슬을 포함하는 사량체이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전통적 보체계의 제1 성분(C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 개시내용의 항체는 단클론성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타과 항체, 키메라 항체, 및 항-개체특이형 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 개시내용의 항체에 대한 항-Id 항체 포함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체는 임의의 아이소타입/부류 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, Iga 및 IgY), 또는 하위 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "상보성 결정 도메인" 또는 "상보성 결정 영역"("CDR")은 VL 및 VH의 초가변 영역을 상호교환적으로 지칭한다. CDR은 이러한 표적 단백질에 대한 특이성을 갖는 항체 사슬의 표적 단백질 결합 부위이다. 가변 도메인의 약 15-20%를 구성하는 각각의 인간 VL 또는 VH에는 3개의 CDR(CDR1-3, N-말단으로부터 순차적으로 넘버링됨)이 있다. CDR은 해당 영역 및 순서로 지칭될 수 있다. 예를 들어, "VHCDR1" 또는 "HCDR1"은 모두 중쇄 가변 영역의 제1 CDR을 지칭한다. CDR은 표적 단백질의 에피토프에 구조적으로 상보적이어서 결합 특이성을 직접적으로 담당한다. 소위 프레임워크 영역이라고 하는 VL 또는 VH의 나머지 스트레치는 아미노산 서열에서 덜 변이를 나타낸다(Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000).
CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계에 잘 알려진 다양한 정의, 예를 들어 Kabat, Chothia 및 AbM을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어 문헌[Johnson 등, Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia 등, Nature, 342:877-883 (1989); Chothia 등, J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani 등, J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)] 참조). 항원 결합 부위의 정의는 또한 하기에 기재되어 있다: 문헌[Ruiz 등, Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); 및 Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum 등, J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); 및 Martin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin 등, Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); 및 Rees 등, In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996).) 참조]. 조합된 카밧(Kabat) 및 초티아(Chothia) 넘버링 체계에서, 일부 구현예에서, CDR은 카밧 CDR, 초티아 CDR 또는 둘 다의 일부인 아미노산 잔기에 해당한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CDR은 VH, 예를 들어, 포유류 VH, 예를 들어, 인간 VH에서 아미노산 잔기 26-35 (HC CDR1), 50-65 (HC CDR2), 및 95-102 (HC CDR3); 및 VL, 예를 들어, 포유류 VL, 예를 들어, 인간 VL에서 아미노산 잔기 24-34 (LC CDR1), 50-56 (LC CDR2), 및 89-97 (LC CDR3)에 해당한다.
경쇄와 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 나누어진다. "불변" 및 "가변"라는 용어는 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것이 이해될 것이다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 통상적으로, 불변 영역 도메인의 넘버링은 항원 결합 부위 또는 항체의 아미노-말단으로부터 더 멀어질수록 증가한다. N-말단은 가변 영역이고 C-말단은 불변 영역이고; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시 말단 도메인을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "항원 결합 단편"은 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) 백혈구의 CD4 항원의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 의미한다. 결합 단편의 예는 단쇄 Fvs(scFv), 디설파이드 연결 Fvs(sdFv), Fab 단편, F(ab') 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward 등, Nature 341:544-546, 1989); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 항체의 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 Fv ("scFv")로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird 등, Science 242:423-426, 1988; 및 Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988]를 참조한다)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 "항원 결합 단편"이라는 용어 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항원 결합 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv에 통합될 수 있다(예를 들어, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). 항원 결합 단편은 피브로넥틴 유형 III(Fn3)(피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재하는 미국 특허 제6,703,199호 참조)과 같은 폴리펩티드에 기반 스캐폴드에 그라프팅될 수 있다. 따라서, 본 명세서의 항체 및 항원 결합 단편(예를 들어, 항-CD4 항원 결합 단편)은 각각 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 융합 (때때로 로 지칭함 "항체 콘주게이트"), 및 각각의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 구조일 수 있다. 특정 항체 단편 (또는 항원 결합 단편)은 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) 단일 가변 영역으로 구성된 dAb 단편, (v) 단리된 CDR 영역, (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (vii) 단일 사슬 Fv 분자(scFv)로서, VH 도메인 및 VL 도메인은 항원 결합 부위를 형성하기 위해 2개의 도메인이 회합하는 것을 허용하는 펩티드 링커에 의해 연결되는 단일 사슬 Fv 분자 (scFv), (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 작제된 "디아바디" 또는 "트리아바디", 다가 또는 다중특이적 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 변형될 수 있다. 예를 들어, 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 가교의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. 항체 형식 및 아키텍쳐의 예는 문헌[Carter, 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357] 및 이에 인용된 참고문헌에 기재되어 있으며, 모두 참고로 명시적으로 포함되어 있다.
항원 결합 단편은 상보적인 경쇄 폴리펩타이드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)를 포함하는 단일 사슬 분자에 통합될 수 있다(Zapata 등, Protein Eng 8:1057-1062, 1995; 및 미국 특허 제5,641,870호).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단클론성 항체"는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 동일한 유전적 공급원으로부터 유래된 항체 및 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 또한 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 포함한다. 단클론성 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 문헌[Knappik 등, J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같이 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식계열 서열, 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이된 버전 또는 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 공통 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 키메라 항체는 다른 유전적 공급원으로부터의 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 일부 구현예에서, 키메라 항체는 마우스로부터의 아미노산 서열 및 인간으로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 키메라 항체는 마우스로부터 유래된 가변 도메인 및 인간으로부터 유래된 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 본 명세서에 사용된 "인간화" 항체란 비-인간(일반적으로 마우스 또는 랫트) 항체로부터의 인간 프레임워크 영역(FR) 및 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체를 의미한다. CDR을 제공하는 비-인간 항체를 "공여체"라고 하고 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린을 "수용체"라고 한다. 인간화는 주로 수용체 (인간) VL 및 VH 프레임워크 상에 공여체 CDR의 그라프팅에 의존한다(Winter 미국 특허 제5,225,539호, 전체가 참조로 포함됨). 이 전략을 "CDR 그라프팅"이라고 한다. 선택된 수용체 프레임워크 잔기의 상응하는 공여체 잔기로의 "역돌연변이"는 종종 초기 그래프팅된 작제물에서 손실된 친화도를 회복하는 데 필요하다(미국 특허 제5,693,762호, 이는 전체가 참조로 포함됨). 인간화 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이고, 따라서 전형적으로 인간 Fc 영역을 포함할 것이다. 비-인간 항체를 인간화하고 재형성하기 위한 다양한 기술 및 방법이 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Tsurusita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), 및 본 명세서에 인용된 참고문헌] 참조, 모두는 참조로 포함됨). 인간화 또는 비-인간 항체 가변 영역의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은 예를 들어 전체가 참조로 포함된 문헌[Roguska 등, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973]에 기재된 바와 같이 재표면화 방법을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 성숙한 항체 가변 영역을 인간화 및/또는 친화화하기 위해, 즉 그의 표적 항원에 대한 가변 영역의 친화성을 증가시키기 위해 선택 기반 방법을 이용할 수 있다. 다른 인간화 방법은 전체가 참조로 포함된 문헌[미국 시리즈 제09/810,502호; Tan 등, 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis 등, 2002, J. Immunol. 169:3076-3084]에 기재된 바와 같은 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 CDR의 일부만 이식하는 것을 포함할 수 있다. 구조 기반 방법은 예를 들어 전체가 참조로 포함된 미국 시리즈 제10/153,159호 및 관련 출원에 기재된 바와 같이 인간화 및 친화성 성숙을 위해 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 인간 조작 항체이다. 인간 조작 항체는 마우스와 같은 비-인간 공급원에서 유래한 항체를 지칭하고, 항체가 대상체에게 투여될 때 안정성을 증가시키거나 면역원성을 감소시키는 것과 같이 항체의 원하는 특성을 개선하기 위해 하나 이상의 치환이 이루어졌다. 일부 구현예에서, 치환은 저위험 위치(예를 들어, 용매에 노출되지만 항원 결합 또는 항체 구조에 기여하지 않음)에서 이루어진다. 이러한 치환은 원하는 에피토프 또는 항원에 결합하는 항체의 능력에 영향을 미치지 않으면서 대상체가 항체 투여 후 항체에 대한 면역 반응을 생성할 위험을 완화시킨다(예를 들어, 문헌[Studnicka 등 Protein Eng. 1994. 7(6):805-814] 참조).
일부 구현예에서, 항체는 단일 사슬 항체 또는 항원 결합 단편이다. 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 가변 단편(scFV)은 단일 단백질 또는 폴리펩티드를 형성하기 위해, 예를 들어 합성 링커에 의해 함께 결된된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드이다(예를 들어, 문헌[Bird 등, Science. 242:423-426, 1988; 및 Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988] 참조)
일부 구현예에서, 항체는 항체 단편 또는 항원 결합 단편이다. 항체 단편은 항체로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드이다. 항원 결합 단편은 그것이 유래된 항체와 동일한 에피토프 또는 항원에 결합할 수 있는 항체로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 항체는 감소된된 글리코실화를 갖거나, 글리코실화가 없거나, 저푸코실화된다. 글리코실화는 당, 단당류, 이당류, 올리고당류, 다당류 또는 글리칸 모이어티가 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 분자에 공유적으로 부착되는 것을 지칭한다. 이러한 당 또는 글리칸 모이어티는 일반적으로 B 세포에 의해 분비되기 전에 번역 후 문제에서 항체에 부착된다. 글리코실화가 감소된 항체는 항체가 마우스 또는 인간에서 시험관 내 또는 생체 내에서 B 세포에 의해 생산되는 경우와 같이 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체에 전형적으로 부착되는 수보다 이러한 부착된 당 또는 글리칸 모이어티가 더 적다. 글리코실화가 없는 항체에는 부착된 당이나 글리칸 모이어티가 없다. 저푸코실화된 항체는 항체가 시험관 내 또는 마우스 또는 인간에서 생체 내에서 B 세포에 의해 생산되는 경우와 같이 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체에 전형적으로 부착되는 수보다 더 적은 푸코실 잔기를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 논의된 항체 및 항원 결합 단편은 면역원성을 감소시키는 방식으로 변형될 수 있다. 면역원성을 감소시키기 위한 변형은 MHC 단백질에 대한 모 서열로부터 유래된 처리된 펩티드의 결합을 감소시키는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 변형은 임의의 우세한 MHC 대립유전자에 높은 친화도로 결합할 것으로 예측되는 면역 에피토프가 없거나 최소 수로 있도록 조작될 것이다. 단백질 서열에서 MHC 결합 에피토프를 확인하는 여러 방법이 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 항체에서 에피토프를 스코어링하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 시리즈 제09/903,378호, 미국 시리즈 제10/754,296호, 미국 시리즈 제11/249,692호 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌은 모두 명시적으로 참조로 포함된다.
CD4는 4개의 면역글로불린 수퍼패밀리 도메인(N 말단에서 세포막 쪽으로 D1에서 D4까지 순서대로 지정됨)이 세포 외부에 존재하고, 총 2개의 N 연결 당 사슬이 도메인 D3 내지 D4에 결합되는 유형 I 막관통 단백질이다. CD4는 D1 및 D2 도메인을 통해 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 II 분자에 결합한 다음, T 세포를 활성화한다. 또한, CD4는 D3 및 D4 도메인을 통해 중합된다는 것도 알려져 있다. CD4의 D1 도메인은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 수용체 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Anderson 등, Clinical Immunology and Immunopathology, 84(1):73-84), 1997).
CD4는 등록 번호 P01730-1(UniParc)에 따른 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00056
본 발명의 항-CD4 항체는 CD4에 결합하는 임의의 항체일 수 있으며, 예를 들어 임의의 공지되거나 발견되지 않은 항-CD4 항체의 가변 영역(예를 들어, CDR)을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 CD4에 대한 선택성을 나타낼 수 있다. 그 예는 전장 대 스플라이스 변이체, 세포 표면 대 가용성 형태, 다양한 다형성 변이체에 대한 선택성 또는 표적의 특정 공간배열 형태에 대한 선택성을 포함한다. 본 발명의 항체는 CD4 상의 임의의 에피토프 또는 영역에 결합할 수 있고 상기 항원의 단편, 돌연변이 형태, 스플라이스 형태 또는 비정상적인 형태에 대해 특이적일 수 있다. CD4-양성 세포의 예는 CD4-양성 T 세포 예컨대 Thl 세포, Th2 세포, Thl7 세포, 조절 T 세포 (Treg), 및 γδΤ 세포를 포함한다. 또한, CD4 양성 세포는 암 및 염증성 질환(예를 들어, 자가면역 질환 또는 알러지성 질환)을 비롯한 질환과 연관이 있다.
수많은 항-CD4 항체 및 항원 결합 단편은 당업계에 공지되어 있고/있거나 상업적으로 입수가능하며, 이들 모두는 본 발명에서 사용될 수 있다.
표 1은 본 개시내용에 사용될 수 있는 다양한 상업적으로 공급되는 항-CD4 항체의 목록을 제공한다.
Figure pct00057
상업적 공급원 외에도, CD4에 대한 다수의 단클론성 항체가 문헌에 보고되었다. 다양한 항-CD4 mAb가 암, 면역 질환 및 감염을 치료할 목적으로 임상 개발 중에 있다. 예를 들어, CD4와 HIV의 결합이 HIV 감염에 필수적이라는 사실에 기초하여, CD4의 D1 도메인을 인식하는 항체는 HIV 치료제로서 개발 하에서 HIV 감염을 억제할 수 있다. 암 또는 면역 질환 치료제로 개발된 항-CD4 mAb의 예로는 자놀리무맙(6G5), 이발리주맙, 트레갈리주맙 및 켈릭시맙(CE9.1)이 있다. 이들 항체는 표적 세포인 CD4 발현 세포를 특이적으로 공격하여 약효를 발휘하는 항체이고, 약효의 기전은 주로 ADCC 활성에 기인하는 것으로 생각된다(Kim 등, Blood, 109(11):4655-4662, 2007).
또한, 본 개시내용은 하기 참고문헌에 개시된 임의의 항-CD4 항체 또는 그의 항체 단편의 사용을 고려한다: 문헌[US7338658B2; US5741488A; US5871732A; US9758581B2; Delmonico 등, "Anti-CD4 monoclonal antibody therapy," Clin Transplant, 1996, Oct 10(5): pp. 397-403; Konig 등, "Tregalizumab - A Monoclonal Antibody to Target Regulatory T Cells," Front Immunol. 2016, Vol.7:11; 및 JF Bach, "Therapeutic monoclonal antibodies," Ann Pharm Fr., 2006, 64(5): 308-11], 이들 각각은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
문헌에 공지된 상기 언급된 모든 상업적으로 이용가능한 항-CD4 항체는 본 개시내용에서 사용될 수 있다.
특정 다른 구현예에서, 전달 비히클을 표적 세포(예를 들어, 백혈구)로 표적화하기 위한 표적화 모이어티는 항-CD8 항체 또는 항원 결합 단편이다.
CD8은 MHC 클래스 I 분자(pMHCI)와 복합된 펩티드 항원의 TCR 인식을 위한 공동 수용체로 기능하는 표면 당단백질이다. 이것은 αα 동종이량체 또는 αβ 이종이량체로서 표현되고(Zamoyska, Immunity, 1:243-6, 1994), 두 사슬은 단일 세포외 Ig 수퍼패밀리(IgSF) V 도메인, 막 근위 힌지 영역, 막관통 도메인, 및 세포질 테일를 발현한다. CD8은 β 가닥과 세포외 IgSF V 도메인 내의 상보적 결정 영역(CDR)을 사용하여 im 및 MHC 클래스 I 분자의 a2 및 a3 도메인과 상호작용한다. 이러한 연관성은 클래스 I 표적과 함께 T 세포 수용체의 접착력/결합력을 증가시킨다.
또한, CD8a 사슬 관련 티로신 단백질 키나아제 p561ck4'5에 의해 매개되는 내부 신호 캐스케이드가 T 세포 활성화를 유도한다. Lck는 나이브 CD8+ T 세포의 활성화 및 확장에 필요하지만; 그 발현은 생체 내 또는 시험관 내에서 이차 항원 자극에 대한 기억 CD8+ T 세포의 반응에 필수적이지 않다(Bachman 등, J Exp Med, 189: 1521-30, 1999). CD8a 또는 CD8B 유전자 표적 마우스에 의해 나타난 바와 같이, CD8은 MHC 클래스 I 제한 T 림프구의 성숙 및 기능에 중요한 역할을 한다(Nakayama 등, Science, 263: 1131-3, 1984). 반복적인 박테리아 감염으로 고통받는 한 환자는 CD8a 유전자의 단일 돌연변이로 인해 CD8 결핍을 나타내는 것으로 밝혀졌다. CD8의 결여는 CD8+ T 세포 계통 투입 또는 말초 세포용해 기능에 필수적인 것으로 보이지 않았다(de la Calle-Martin 등, J Clin Invest, 108: 117- 23, 2001).
인간 CD8 분자는 세포독성 T-세포(CTL) 상에서 발현되는 당단백질 및 세포 표면 마커이다. 이들은 T-림프구의 하위 집합이며 척추동물의 적응 면역 체계에서 중요한 역할을 한다. 그들은 바이러스에 감염된 세포 또는 다른 비정상 세포 예컨대 일부 종양 세포의 제거를 담당한다. 이 세포는 표적 세포에서 MHC (주요 조직적합성 복합체) 클래스 I을 통해 제시된 특정 항원과 상호 작용하는 T-세포 수용체(TCR)를 통해 특이적으로 인식된다.
예시적인 CD8 아미노산 서열은 정규 서열로 알려져 있는 P01732-1(UniParc)로 제시된다:
Figure pct00058
수많은 항-CD8 항체 및 항원 결합 단편은 당업계에 공지되어 있고/있거나 상업적으로 입수가능하며, 이들 모두는 본 발명에서 사용될 수 있다.
표 2는 본 개시내용에 사용될 수 있는 다양한 상업적으로 공급되는 항-CD8 항체의 목록을 제공한다.
Figure pct00059
당업계에 공지된 단클론성 항체를 포함하는 다수의 항-CD8 항체가 있으며, 이는 하기를 포함한다: 2D2; 4D12.1; 7B12 IG1 1; 8E-1.7; 8G5; 14; 21Thy; 51.1; 66.2; 109-2D4; 138- 17; 143-44; 278F24; 302F27; AICD8.1; anti-T8; B9.1.1; B9.2.4; B9.3.1; B9.4.1; B9.7.6; B9.8.6; B9.1 1; B9.1 1.10; BE48; BL15; BL-TS8; BMAC8; BU88; BW135/80; C1-11G3; CIO; C12/D3; CD8-4C9; CLB-T8/1; CTAG-CD8, 3B5; F80-1D4D11; F101-87 (S-T8a); GIO-I; GlO-1.1; HI208; HI209; HI212; HIT8a; HIT8b; HIT8d; ICO-31; ICO-122; IP48; ITI-5C2; ITM8-1; JML-H7; JML-H8; L2; L533; Leu-2a; LT8; LY17.2E7; LY19.3B2; M236; M-T122; M-T415; M-T805; M-T806; M- T807; M-T808; M-T809; M-T1014; MCD8; MEM-31; MEM- 146; NU-Ts/c; OKT8; OKT8f; P218; RPA-T8; SM4; T8; T8 /2T8-19; T8 /2T8-2A1; T8 /2T8- 1B5; T8 /2T8-1C1; T8 /7Pt3F9; T8 /21thy2D3; T8 /21 thy; T8 /TPE3FP; T8b; T41D8; T811; TU68; TU102; UCHT4; VIT8; VIT8b; WuT8-l; X107; YTC141.1; 및/또는 YTC 182.20.
상업적 공급원 외에도, CD8에 대한 다수의 단클론성 항체가 문헌에 보고되었다. 예를 들어, 다음 공보에 기재된 항-CD8 항체 또는 그의 단편이 본 명세서에서 고려된다: AU2014249243B2; 10,746,726; 9,790,279; 9,758,581; 9,587,022; 8,877,913; 8,685,651; 8,673,304; 8,586,715; 8,440,806; 8,399,621; 7,541,443; 7,482,000; 7,452,981; 7,452,534; 7,338,658; 6,136,310; 6,056,956; 5,871,732; 및 5,741,488, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
문헌에 공지된 상기 언급된 모든 상업적으로 이용가능한 항-CD8 항체는 본 개시내용에서 사용될 수 있다.
특정 다른 구현예에서, 전달 비히클을 표적 세포(예를 들어, 백혈구)로 표적화하기 위한 표적화 모이어티는 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이다.
CD3 항원은 T-세포 상의 T-세포 수용체 복합체와 연관이 있다. CD3 및 표적 세포의 항원에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 항원 결합 단백질은 표적 세포 상의 T-세포의 세포독성 활성을 촉발할 수 있다. 즉, CD3 및 표적 세포, 예를 들어 종양 세포에 대한 항원 결합 단백질의 다중특이적 결합에 의해, 표적 세포의 세포 용해가 유도될 수 있다. CD3 결합 부위를 갖는 항원 결합 단백질 및 그의 생성은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어 문헌[Kipriyanov 등, 1999, Journal of Molecular Biology 293:41-56, Le Gall 등, 2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17/4:357-366]에 기재되어 있다).
CD3 항원은 분자량이 각각 25-28, 21, 20, 16 및 22 kDa인 γ, δ, ε, ζ 및 η의 5개의 불변 폴리펩티드 사슬의 복합체이다. CD3 사슬은 ζ 동종이량체, 또는 ζ /η, 또는 ζ/γ FcR 이종이량체 (γ FcR은 Fc 수용체의 γ 사슬임), 또는 γFcR 동종이량체로 구성된 구성된 가변 이량체와 연관된 2개의 불변 이량체, γ/ε 및 δ/ε의 군에서 클러스터링된다. CD3는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 더 큰 복합체의 일부이다. TCR과 연관된 CD3 복합체는 면역 반응 동안 주요 조직적합성 복합체 클래스 I 및 II에 결합된 펩티드의 인식에 관여한다. T 세포 활성화는 외래 항원이 MHC 복합체를 통해 TCR에 제시될 때 유도될 수 있다. CD3 항원은 성숙한 T 림프구와 흉선 세포의 서브세트에 의해 발현된다.
수많은 항-CD3 항체 및 항원 결합 단편은 당업계에 공지되어 있고/있거나 상업적으로 입수가능하며, 이들 모두는 본 발명에서 사용될 수 있다.
표 3은 본 개시내용에 사용될 수 있는 다양한 상업적으로 공급되는 항-CD8 항체의 목록을 제공한다.
Figure pct00060
단클론성 항체를 포함하는 항-CD3 항체는 US2018/0057593, US11007267B2, US10865251B2, US10759858B2, US10906978B2, US20210253701A1, US20200123255A1, US20210095027A1, US20210147561A1, US10544220B2, US20190284278A1, US20190263904A1, 및 US20200048348A1에 개시된 것을 포함하여 당해 기술에 공지되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
문헌에 공지된 상기 언급된 모든 상업적으로 이용가능한 항-CD3 항체는 본 개시내용에서 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 전달 비히클 상의 표적화 모이어티로서 사용될 수 있는 본 개시내용의 항체는 또한 임의의 적합한 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다. 한 가지 접근법에서, 관심 항원(예를 들어, CD4)으로 면역화한 후, 항체를 생산할 가능성이 있는 체세포, 특히 B 림프구(B 세포)를 MAb 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택한다. 이러한 세포는 생검된 비장이나 림프절 또는 순환 혈액에서 얻을 수 있다. 면역화된 동물로부터의 항체 생성 B 림프구는 면역화된 동물 또는 인간 또는 인간/마우스 키메라 세포와 일반적으로 동일한 종 중 하나인 불멸의 골수종 세포의 세포와 융합된다. 하이브리도마 생산 융합 절차에 사용하기에 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 비-항체 생산이고, 융합 효율이 높고, 효소 결핍으로 인해 원하는 융합 세포(하이브리도마)의 성장만 지원하는 특정 선택 배지에서 성장할 수 없다. 당업자에게 공지된 바와 같이 다수의 골수종 세포 중 임의의 하나를 사용할 수 있다(Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984).
항체를 생성하는 방법
항체 생산 비장 또는 림프절 세포와 골수종 세포의 하이브리드를 생성하는 방법은 일반적으로 세포막의 융합을 촉진하는 제제 또는 제제들(화학적 또는 전기적)의 존재 하에 체세포를 골수종 세포와 혼합하는 것을 포함한다. 센다이 바이러스를 사용한 융합 방법은 Kohler와 Milstein(1975; 1976)에 의해 기재되었으며, 37%(v/v) PEG와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용한 방법은 Gefter 등 (1977)에 의해 기재되었다. 전기적으로 유도된 융합 방법을 사용하는 것도 적절한다(Goding, pp. 71-74, 1986).
배양은 특정 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마 집단을 제공한다. 전형적으로, 하이브리도마의 선택은 미세역가 플레이트에서 단일-클론 희석에 의해 세포를 배양한 다음, 원하는 반응성에 대해 (약 2 내지 3주 후) 개별 클론 상청액을 테스트함으로써 수행된다. 검정은 방사선면역검정, 효소 면역검정, 세포독성 검정, 플라크 검정 다트(dot) 면역결합 검정, 등과 같이 민감하고 간단하며 신속해야 한다. 그 다음, 선택된 하이브리도마는 연속 희석되거나 유동 세포측정 분류에 의해 단일 세포 분류되고 개별 항체 생산 세포주로 클로닝되며, 이 클론은 mAb를 제공하기 위해 무기한 증식될 수 있다.
세포주는 두 가지 기본 방식으로 MAb 생산을 위해 이용될 수 있다. 하이브리도마의 샘플은 동물(예를 들어, 마우스)에 주입(종종 복강 내로)될 수 있다. 선택적으로, 동물은 주입 전에 탄화수소, 특히 오일 예컨대 프리스탄 (테트라메틸펜타데칸)로 프라이밍된다. 인간 하이브리도마를 이런 식으로 사용하는 경우, SCID 마우스와 같은 면역 저하 마우스에 종양 거부 반응을 방지하기 위해 주입하는 것이 최적이다. 주입된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생산된 특정 단클론성 항체를 분비하는 종양을 발생시킨다. 그 다음, 혈청 또는 복수액과 같은 동물의 체액을 탭핑하여 고농도의 MAb를 제공할 수 있다. 개별 세포주는, 또한 MAb가 고농도로 쉽게 얻을 수 있는 배양 배지로 자연적으로 분비되는 시험관 내에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 인간 하이브리도마 세포주는 세포 상청액에서 면역글로불린을 생산하기 위해 시험관 내에서 사용될 수 있다. 세포주는 고순도의 인간 단클론성 면역글로불린을 회수하는 능력을 최적화하기 위해 무혈청 배지에서의 성장에 적합할 수 있다.
어느 방법으로든 생산된 MAb는 원하는 경우 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래피 방법 예컨대 FPLC 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 본 개시내용의 단클론성 항체의 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 효소로의 소화를 포함하는 방법 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 정제된 단클론성 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용에 포괄되는 단클론성 항체 단편은 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
또한 단클론성을 생성하기 위해 분자 클로닝 접근법이 사용될 수 있음이 고려된다. 이를 위해, 하이브리도마 계통과 RT-PCR로 얻은 항체 유전자로부터 RNA를 단리하고 면역글로불린 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 대안적으로, 조합 면역글로불린 파아지미드 라이브러리는 세포주로부터 단리된 RNA로부터 제조되고 적절한 항체를 발현하는 파아지미드는 바이러스 항원을 사용하여 패닝함으로써 선택된다. 종래의 하이브리도마 기술에 비해 이 접근법의 장점은 단일 라운드에서 더 많은 항체를 생산하고 스크리닝할 수 있으며 H 및 L 사슬 조합에 의해 새로운 특이성이 생산되어 적절한 항체를 찾을 가능성이 더욱 높아진다는 것이다.
본 개시내용에 유용한 항체의 생성을 교시하는 미국 특허(각각 본 명세서에 참조로 포함됨)는 조합 접근법을 사용한 키메라 항체의 생성을 기재하는 미국 특허 5,565,332; 재조합 면역글로불린 제제를 기재하는 미국 특허 4,816,567; 및 항체-치료제 접합체를 기재하는 미국 특허 4,867,973을 포함한다.
조합
한 구현예에서, 본 발명은 2개 이상의 T 세포 항원을 표적화하는 T 세포 표적화 전달 비히클의 조합을 제공한다. 한 구현예에서, 2개 이상의 T 세포 항원은 CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD40L, CD44, CD45, CD62L, CD69, CD73, CD80, CD83, CD86, CD95, CD103, CD119, CD126, CD150, CD153, CD154, CD161, CD183, CD223, CD254, CD275, CD45RA, CXCR3, CXCR5, FasL, IL18R1, CTLA-4, OX40, GITR, LAG3, ICOS, PD-1, leu-12, TCR, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, NKG2D, CCR, CCR1, CCR2, CCR4, CCR6, 또는 CCR7로부터 선택된다. 한 구현예에서, 조합은 CD4+ T 세포의 표면 항원 및 CD8+ T 세포의 표면 항원을 표적화하는 1개 이상의 T 세포 표적화 전달 비히클을 포함한다. 한 구현예에서, 조합은 CD4 및 CD8을 표적으로 하는 2개 이상의 T 세포 표적화 전달 비히클을 포함한다.
한 구현예에서, T 세포 표적화 전달 비히클의 조합은 다른 표면 항원을 발현하는 T 세포에 동일한 제제를 전달한다. 한 구현예에서, T 세포 표적화 전달 비히클의 조합은 제1 표면 항원을 발현하는 T 세포의 하나의 서브세트에 제1 제제를 전달하고, 제2 표면 항원을 발현하는 T 세포의 제2 서브세트에 제2의 다른 제제를 전달한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 본 발명의 조합은 T 세포에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10개 초과의 다른 제제를 전달하는 데 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기재된 제제의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제의 조합을 포함하는 조성물은 부가적 효과를 가지며, 여기서 조합의 전체 효과는 각각의 개별 제제의 효과의 합과 거의 동일하다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제의 조합을 포함하는 조성물은 시너지 효과를 가지며, 여기서 조합의 전체 효과는 각각의 개별 제제의 효과의 합보다 크다.
제제의 조합을 포함하는 조성물은 개별 제제를 임의의 적합한 비율로 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 2개의 개별 제제를 1:1 비율로 포함한다. 그러나 조합은 특정 비율로 제한되지 않는다. 오히려 효과적인 것으로 나타난 모든 비율이 포괄된다.
접합
본 발명의 다양한 구현예에서, 전달 비히클은 표적화 도메인에 접합된다. 예시적인 접합 방법은 공유 결합, 정전기적 상호작용 및 소수성("반 데르 발스") 상호작용을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 접합은 전달 비히클이 특정 조건 또는 화학 제제에 노출시 표적화 도메인으로부터 분리될 수 있도록 하는 가역적 접합이다. 다른 구현예에서, 접합은 정상 조건 하에서 전달 비히클이 표적화 도메인으로부터 분리되지 않도록 하는 비가역적 접합이다.
일부 구현예에서, 접합은 활성화 중합체 접합된 지질과 표적화 도메인 사이의 공유 결합을 포함한다. "활성화 중합체 접합 지질"이라는 용어는 제1 커플링 기를 갖는 중합체 접합 지질의 작용화를 통해 활성화된 지질 부분 및 중합체 부분을 포함하는 분자를 지칭한다. 한 구현예에서, 활성화 중합체 접합 지질은 제2 커플링 기와 반응할 수 있는 제1 커플링 기를 포함한다. 한 구현예에서, 활성화 중합체 접합 지질은 활성화 페길화 지질이다. 한 구현예에서, 제1 커플링 기는 페길화 지질의 지질 부분에 결합된다. 다른 구현예에서, 제1 커플링 기는 페길화 지질의 폴리에틸렌 글리콜 부분에 결합된다. 한 구현예에서, 제2 작용기는 표적화 도메인에 공유 결합된다.
제1 커플링 기 및 제2 커플링 기는 예를 들어 온화한 반응 조건 또는 생리학적 조건 하에서 함께 공유 결합을 형성하는 당업자에게 공지된 임의의 작용기일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 커플링 기 또는 제2 커플링 기는 말레이미드, N-하이드록시석신이미드 (NHS) 에스테르, 카보디이미드, 하이드라자이드, 펜타플루오로페닐 (PFP) 에스테르, 포스핀, 하이드록시메틸 포스핀, 소랄렌, 이미도에스테르, 피리딜 디설파이드, 이소시아네이트, 비닐 설폰, 알파-할로아세틸, 아릴 아지드, 아실 아지드, 알킬 아지드, 디아지린, 벤조페논, 에폭사이드, 카보네이트, 무수물, 설포닐 클로라이드, 사이클로옥틴, 알데하이드, 및 설프하이드릴 기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 커플링 기 또는 제2 커플링 기는 유리 아민 (-NH2), 유리 설프하이드릴 기 (-SH), 유리 수산화물 기 (-OH), 카복실레이트, 하이드라자이드, 및 알콕시아민으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 커플링 기는 말레이미드, 피리딜 디설파이드 또는 할로아세틸과 같은 설프히드릴 기에 대해 반응성인 작용기이다. 일 구현예에서, 제1 커플링 기는 말레이미드이다.
한 구현예에서, 제2 커플링 기는 설프하이드릴 기이다. 설프하이드릴 기는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 표적화 도메인 상에 설치될 수 있다. 한 구현예에서, 설프하이드릴 기는 유리 시스테인 잔기에 존재한다. 한 구현예에서, 설프하이드릴 기는 2-머캅토에틸아민과의 반응을 통해와 같이 표적화 도메인 상의 디설파이드의 환원을 통해 드러난다. 한 구현예에서, 설프하이드릴 기는 유리 아민과 2-이미노틸란 또는 N-석신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA) 사이의 반응과 같은 화학 반응을 통해 설치된다.
일부 구현예에서, 중합체 접합 지질 및 표적화 도메인은 "클릭" 화학에 사용되는 기로 작용화된다. 생물학적 직교 "클릭" 화학은 아지드, 니트릴 옥사이드, 니트론, 이소시아나이드 및 링크와 같은 1,3-쌍극자가 있는 작용기와 알켄 또는 알킨 쌍극성체 사이의 반응을 포함한다. 예시적인 쌍극성체는 사이클로옥틴, 디벤조사이클로옥틴, 모노플루오르화 사이클로옥틴, 디플루오르화 사이클로옥틴 및 바이아릴아자사이클로옥티논을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 변형된 사이클로알켄 및 사이클로알킨을 포함한다.
펩티드 표적화 모이어티
한 구현예에서, 본 발명의 표적화 도메인은 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 펩티드 표적화 도메인은 관심 표적에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 펩티드는 화학적 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 고상 기술(Roberge J Y 등 (1995) Science 269: 202-204)에 의해 합성되고, 수지로부터 절단되고, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 자동 합성은 예를 들어 ABI 431 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)를 사용하여 제조업체에서 제공한 지침에 따라 달성할 수 있다.
펩티드는 대안적으로 재조합 수단에 의해 또는 더 긴 폴리펩티드로부터의 절단에 의해 만들어질 수 있다. 펩티드의 조성은 아미노산 분석이나 시퀀싱으로 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드의 변이체는 (i) 아미노산 잔기 중 하나 이상이 보존되거나 비-보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩된 것일 수도 있고 아닐 수도 있는 것, (ii) 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기, 예를 들어 치환기 기의 부착에 의해 변형된 잔기가 있는 것, (iii) 펩티드가 본 발명의 펩티드의 대안적인 스플라이스 변이체인 것, (iv) 펩티드의 단편 및/또는 (v) 펩티드가 다른 펩티드, 예컨대 리더 또는 분비 서열 또는 정제(예를 들어, His-tag) 또는 검출(예를 들어, Sv5 에피토프 태그)에 사용되는 서열과 융합된 것일 수 있다. 단편은 원래 서열의 단백분해 절단(다중 부위 단백질분해 포함)을 통해 생성된 펩티드를 포함한다. 변이체는 번역 후 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변이체는 본 명세서의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
당업계에 공지된 바와 같이, 2개의 펩티드 사이의 "유사성"은 1개의 펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환기를 제2 펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 변이체는 원래 서열과 다르고, 바람직하게는 관심 세그먼트당 잔기의 40% 미만에서 원래 서열과 다르고, 보다 바람직하게는 관심 세그먼트당 25% 미만의 잔기에서 원래 서열과 다르고, 더 바람직하게는 관심 세그먼트당 잔기의 10% 미만으로 다르고, 가장 바람직하게는 관심 세그먼트당 단지 몇 개의 잔기에서 원래 단백질 서열과 다르고, 동시에 원래 서열의 기능성을 보존하기 위해 원래 서열과 충분히 상동성인 펩타이드 서열을 포함하는 것으로 정의된다. 본 발명은 원래의 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% 또는 95% 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 2개의 펩티드 사이의 동일성 정도는 당업자에게 널리 알려진 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 사용하여 결정된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 결정된다[BLAST Manual, Altschul, S., 등, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., 등, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
본 발명의 펩티드는 번역 후 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 범위에 속하는 번역후 변형은 신호 펩티드 절단, 글리코실화, 아세틸화, 이소프레닐화, 단백질분해, 미리스토일화, 단백질 폴딩 및 단백분해 프로세싱 등을 포함한다. 변형 또는 프로세싱 이벤트에는 추가 생물학적 기구의 도입이 필요하다. 예를 들어, 신호 펩타이드 절단 및 코어 글리코실화와 같은 프로세싱 이벤트는 표준 번역 반응에 개(canine)의 마이크로솜 막 또는 제노푸스 알 추출물(미국 특허 제6,103,489호)을 첨가하여 검사된다.
본 발명의 펩티드는 번역 후 변형에 의해 또는 번역 중에 비-천연 아미노산을 도입함으로써 형성된 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다.
핵산 표적화 모이어티
한 구현예에서, 본 발명의 표적화 도메인은 예를 들어 DNA 올리고뉴클레오티드 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 비롯한 단리된 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 표적화 도메인은 관심 표적에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 핵산은 관심 표적에 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
핵산 표적화 도메인의 뉴클레오티드 서열은 대안적으로 생성된 핵산이 원래대로 기능하고 관심 대상체에 특이적으로 결합한다는 조건 하에 원래 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 변이, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
본 설명에서 사용된 의미에서, 뉴클레오티드 서열은 그의 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 60%, 유리하게는 적어도 70, 바람직하게는 적어도 85%, 및 더 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 정도를 가질 때 본 명세서에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열과 "실질적으로 상동성"이다. 가능한 변형의 다른 예에는 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 삽입, 서열의 임의의 단부에 하나 이상의 뉴클레오티드 부가, 또는 임의의 단부 또는 서열 내부에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실이 포함된다. 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성 정도는 당업자에게 널리 알려진 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 사용하여 결정된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 바람직하게는 BLASTN 알고리즘을 사용하여 결정된다[BLAST Manual, Altschul, S., 등, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., 등, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
항체 표적화 모이어티
한 구현예에서, 본 발명의 표적화 도메인은 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 표적화 도메인은 관심 표적에 특이적으로 결합한다. 이러한 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, Fab 및 그의 단일 사슬 Fv (scFv) 단편, 이중특이적 항체, 헤테로콘주게이트, 인간 및 인간화 항체를 포함한다.
항체는 온전한 단클론성 또는 다클론성 항체, 및 면역학적으로 활성 단편 (예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 항체 경쇄, 인간화된 항체, 유전적으로 조작된 단일 사슬 Fv 분자(Ladner 등, 미국 특허 제4,946,778호), 또는 키메라 항체, 예를 들어 뮤린 항체의 결합 특이성을 포함하지만 나머지 부분이 인간 기원인 항체일 수 있다. 단클론성 및 다클론 항체, 단편 및 키메라를 포함하는 항체는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
이러한 항체는 하이브리도마 배양, 박테리아 또는 포유류 세포 배양에서의 재조합 발현 및 형질전환 동물에서의 재조합 발현을 포함하는 다양한 방식으로 생산될 수 있다. 제조 방법의 선택은 원하는 항체 구조, 항체에 대한 탄수화물 부분의 중요성, 배양 및 정제 용이성, 및 비용을 포함한 여러 요인에 따라 달라진다. 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab 및 Fv 단편, 및 다른 종으로부터의 성분을 포함하는 키메라 항체를 비롯한 많은 다른 항체 구조가 표준 발현 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이펙터 기능이 없고 제한된 약동학적 활성을 갖는 작은 크기의 항체 단편, 예컨대 Fab 및 Fv 단편이 박테리아 발현 시스템에서 생성될 수 있다. 단일 사슬 Fv 단편은 낮은 면역원성을 나타낸다.
한 구현예에서, 본 발명의 표적화 도메인은 CD4+ T 세포의 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. 한 구현예에서, 본 발명의 표적화 도메인은 CD4에 특이적으로 결합하는 항체이다.
T 세포
다양한 구현예에서, 전달 비히클의 표적은 신체 내 임의의 유형의 세포(즉, "표적 세포")일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 표적 세포는 임의의 부류의 골수 세포 (예를 들어, 호중구, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 단핵구) 또는 임의의 부류의 림프구 (예를 들어, T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 기억 T 세포), B 세포 (예를 들어, 형질 세포 및 기억 B 세포), 및 자연 살해 세포)로 제한되지 않는 것과 같은 면역 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 표적화될 수 있는 T 세포는 면역자극 세포, 즉 면역 반응을 매개하는 세포이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 표적화될 수 있는 T 세포는 T 헬퍼 세포 (CD4+) 및 CD4+ 세포독성 T 세포 (세포독성 T 림프구, CD4+ CTL이 라고도 함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 표적화될 수 있는 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있고 T 헬퍼 세포 (CD4+), 세포독성 T 세포 (세포독성 T 림프구, CTL; CD8- T 세포라고도 함), 및 중심 기억 T 세포 (TCM), 줄기 기억 T 세포 (TSCM), 줄기세포 유사 기억 T 세포 (또는 줄기 유사 기억 T 세포), 및 이펙터 기억 T 세포, 예를 들어, TEM 세포 및 TEMRA (CD45RA+) 세포, 이펙터 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, Th22 세포, Tfh (여포성 헬퍼) 세포, T 조절 세포, 자연 살해 T 세포, 점막 관련 불변 T 세포 (MAIT), 및 γδ T 세포를 포함하는 기억 T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 주요 T-세포 하위유형에는 TN (나이브), TSCM (줄기 세포 기억), TCM (중심 기억), TTM (과도기적 기억), TEM (이펙터 기억), 및 TTE (말단 이펙터), TCR-형질전환 T-세포, 범용 사이토카인 매개 사멸 (TRUCK)을 재지정된 T-세포, 종양 침윤 T-세포 (TIL), CAR-T-세포 또는 질환이나 장애를 치료하는 데 사용할 수 있는 임의의 T-세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다.
치료 방법
본 발명은 질환, 또는 질환 또는 장애의 진단, 치료 또는 예방을 위한 적어도 하나의 제제를 CD4+ T 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, CD4+ T 세포 표적화 전달 비히클은 대상체에게 투여될 제제를 포함하거나 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 제제는 뉴클레오시드 변형 mRNA이다. 따라서 본 발명은 적어도 하나의 제제를 CD4+ T 세포에 전달하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, CD4+ T 세포 표적화 전달 비히클은 질환 또는 장애의 치료를 위한 치료제를 포함하거나 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 치료제는 뉴클레오시드 변형 mRNA이다. 따라서 본 발명은 적어도 하나의 치료제를 CD4+ T 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 방법은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 예시적인 질환 또는 장애는 암, 감염성 질환 및 면역학적 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다음은 개시된 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 암의 비제한적 예이다: 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 맹장암, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 유암종, 중추신경계 비전형 기형/횡문근양 종양, 중추신경계 배아 종양, 중추신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 대뇌 별아교세포종/악성 신경교종, 자궁경부암, 소아기 시각적 경로 종양, 척색종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수형성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막 암, 상의모세포종, 뇌실막세포종, 식도암, 유잉 계열의 종양, 두개외 암, 고환외 생식 세포 종양, 간외 담도암, 간외 암, 안암, 진균모양, 담낭암, 위 (위) 암, 위장암, 위장 유암종, 위장 간질성 종양 (요지), 생식 세포 종양, 임신성 암, 임신성 융모성 종양, 교모세포종, 신경교종, 모발 세포 백혈병, 두경부암, 간세포 (간) 암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두 암, 시상하부 및 시각적 경로 신경교종, 시상하부 종양, 안구내 (눈) 암, 안구내 흑색종, 소도 세포 종양, 카포시 육종, 신장 (신장 세포) 암, 랑게르한스 세포 암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두 암, 백혈병, 입술 및 구강 암, 간암, 폐암, 림프종, 거대글로불린혈증, 뼈의 악성 섬유질 조직구증 및 골육종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 머켈 세포 암종, 중피종, 잠복 원발성을 갖는 전이성 편평상피 목암, 구강암, 다중 내분비 신조직형성 증후군, 다발성 골수종, 진균증, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수형성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수종, 골수증식성 장애, 비강 및 부비동 암, 비인두 암, 신경교세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구강암, 구강 암, 구강인두 암, 골육종 및 악성 섬유질 조직구종, 골육종 및 뼈, 난소의 악성 섬유질 조직구종, 난소암, 난소 상피 암, 난소 생식 세포 종양, 난소 낮은 악성 잠재적 종양, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부갑상선암, 음경암, 인두 암, 크롬친화세포종, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 송과체모세포종 및 천막상 원시적인 신경외배엽 종양, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 아세포종, 원발성 중추신경계 암, 원발성 중추신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신장 세포 (신장) 암, 신우 및 요관 암, 염색체 15에 대한 nut 유전자를 수반하는 기도 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선 암, 육종, 세자리 증후군, 피부암 (흑색종), 피부암 (비흑색종), 피부 암종, 소세포 폐암, 소장 암, 연조직 암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평상피 목암, 위 (위) 암, 천막상 원시적인 신경외배엽 종양, 천막상 원시적인 신경외배엽 종양 및 송과체모세포종, T-세포 림프종, 고환암, 인후두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 이행 세포 암, 신우 및 요관의 잉행 세포 암, 융모성 종양, 요도 암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각적 경로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 윌름스 종양.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 자가면역 질환: 류마티스관절염/혈청검사 음성 관절병증, 골관절염, 염증성 장 질환, 전신 홍반성 낭창, 홍채안염/포도막 시신경염, 특발성 폐 섬유증, 전신 혈관염/베게너 축농증, 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유육종증: 류마티스관절염/혈청검사 음성 관절병증, 골관절염, 염증성 장 질환, 전신 홍반성 낭창, 홍채안염/포도막 시신경염, 특발성 폐 섬유증, 전신 혈관염/베게너 축농증, 유육종증, 심근염, 심근경색후 증후군, 심막절개후 증후군, 아급성 박테리아 심내막염 (SBE), 항-사구체 기저막 신장염, 간질 방광염, 루푸스 신장염, 자가면역 간염, 일차 담즙성 담관염(PBC), 원발성 경화성 담관염, 항합성효소 증후군, 원형 탈모증, 자가면역 맥관부종, 자가면역 프로게스테론 피부염, 자가면역 두드러기, 수포성 유천포창, 반흔성 유천포창, 포진성 피부염, 원판성 홍반성 낭창, 후천성 수포성 표피박리증, 결절 홍반, 임신성 유천포창, 화농성 한선염, 편평 태선, 경화성 태선, 선형 IgA 질환 (LAD), 반상경피증, 심상성 천포창, 급성 두창양 태선양 잔비늘증, 무카-하베르만 질환, 건선, 전신 경피증, 백반증, 애디슨병, 자가면역 다선 증후군 (APS) 유형 1, 자가면역 다선 증후군 (APS) 유형 2, 자가면역 다선 증후군 (APS) 유형 3, 자가면역 췌장염 (AIP), 진성 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 오드 갑상선염, 그레이브스병, 자가면역 난소염, 자궁내막증, 자가면역 고환염, 쇼그렌 증후군, 자가면역 장 병증, 만성적 소화장애증, 크론병, 현미경적 결장염, 궤양성 대장염, 항인지질 증후군(APS, APLS), 재생불량빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 혈소판감소성 자반병, 한랭 응집소 질환, 필수적인 혼합된 한성글로불린혈증, 에반스 증후군, 악성 빈혈, 순수한 적혈구 무형성증, 혈소판감소증, 통증지방증, 성인형 스틸병, 강직 척추염, 크레스트 증후군, 약물 유도 루푸스, 골부착염 연관 관절염, 호산구 근막염 펠티 증후군, IgG4 연관 질환, 소아 관절염, 라임병 (만성), 혼합된 결합 조직 질환 (MCTD), 회문성 류마티스, 패리 롬버그 증후군, 파르소니지-터너 증후군, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 재발 다연골염, 후복막 섬유증, 류마티스열, 쉬니츨러 증후군, 미분화 결합 조직 질환 (UCTD), 피부근염, 섬유근육통, 봉입체 근염, 근염, 중증 근무력증, 신경근긴장증, 방종양성 소뇌 퇴행, 다발성근염, 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM), 급성 운동 축삭 신경병증, 항-N-메틸-D-아스파르테이트 (항-NMDA) 수용체 뇌염, 발로 동심 경화증, 비커스탭(Bickerstaff) 뇌염, 만성 염증성 탈수초 다발성신경병증, 길랑-바레 증후군, 하시모토 뇌병증, 특발성 염증성 탈수초 질환, 람베르트-이튼 근무력증 증후군, 다발성 경화증, 패턴 II, 오쉬토란(Oshtoran) 증후군, 스트렙토코쿠스 (PANDAS)와 연관된 소아 자가면역 신경정신 장애, 진행성 염증성 신경병증, 하지 불안 증후군, 강직 인간 증후군, 시든햄 무도병, 횡단성 척수염, 자가면역 망막병증, 자가면역 포도막염, 코간 증후군, 그레이브스 눈병증, 중간 포도막염, 목질 결막염, 무렌(Mooren) 궤양, 시신경척수염, 안구간대 근경련 증후군, 시신경염, 공막염, 수삭(Susac) 증후군, 교감성 안염, 톨로사-헌트 증후군, 자가면역 내이 질환(AIED), 메니에르병, 베체트병, 다발성맥관염 (EGPA)이 있는 호산구 육아종증, 거대세포 동맥염, 다발성맥관염 (GPA)이 있는 육아종증, IgA 혈관염 (IgAV), 가와사키병, 백혈구파괴성 혈관염, 루푸스 혈관염, 류마티스성 혈관염, 현미경적 다발성맥관염 (MPA), 결절성 다발동맥염 (PAN), 다발근육통 류마티스성, 두드러기 혈관염, 혈관염, 및 일차 면역 결핍을 치료하거나 예방하는 방법을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 치료제는 감염 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 제제이다. 한 구현예에서, 치료제는 박테리아 감염 또는 이와 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 제제이다. 박테리아는 다음 문(phyla) 중 하나에 속할 수 있다. 악시도박테리아, 악티노박테리아, 아퀴피카에, 박테로이데테스, 칼디세리카, 클라마이디애, 클로로비, 클로로플렉시, 크리시오게네테스, 시아노박테리아, 데페리박테레스, 데이노코쿠스-테르무스, 딕티오글로미, 엘루시미크로비아, 파이브로박테레스, 피르미쿠테스, 푸소박테리아, 겜마티모나데테스, 렌티스파에라에, 니트로스피라, 플랑크토마이세테스, 프로테오박테리아, 스피로차에테스, 시네르기스테테스, 테네리쿠테스, 서모데설포박테리아, 써모토가에, 및 베루코마이크로비아.
박테리아는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 박테리아는 호기성 박테리아 또는 혐기성 박테리아일 수 있다. 박테리아는 자가영양 박테리아 또는 종속영양 박테리아일 수 있다. 박테리아는 중온균, 호중구, 극한균, 호산균, 알칼리균, 호열균, 호냉균, 호염균, 또는 삼투압균일 수 있다.
박테리아는 탄저병 박테리아, 항생제 내성 박테리아, 질환 유발 박테리아, 식중독 박테리아움, 감염성 박테리아, 살모넬라 박테리움, 스타필로코쿠스 박테리움, 스트렙토코쿠스 박테리움, 또는 파상풍 박테리아일 수 있다. 박테리아는 마이코박테리아, 클로스트리듐 테타니, 예르시니아 페스티스, 바실러스 안트라시스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA), 또는 클로스트리듐 디피실레일 수 있다.
한 구현예에서, 치료제는 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 제제이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 다음 과(family) 중 하나로부터 유래한다: 아데노비리다에, 아레나비리다에, 분야비리다에, 칼리시비리다에, 코로나비리다에 (SARS 및 SARS-CoV-2 포함), 필로비리다에, 헤파드나비리다에, 헤르페스비리다에, 오토믹소비리다에, 파포바비리다에, 파라믹소비리다에, 파보비리다에, 피코르나비리다에, 폭스비리다에, 레오비리다에, 레트로비리다에, 라브도비리다에, 또는 토가비리다에. 바이러스 항원은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 치쿤군야 바이러스 (CHIKV), 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 예를 들어, 인간 파필로모아 바이러스 (HPV), 폴리오 바이러스, 간염 바이러스, 예를 들어, 간염 A 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), 간염 C 바이러스 (HCV), 간염 D 바이러스 (HDV), 및 간염 E 바이러스 (HEV), 천연두 바이러스 (대두창 및 소두창), 백시니아 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노바이러스, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스, 황열병 바이러스, 노워크 바이러스, 간염 A 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 (HTLV-I), 모발 세포 백혈병 바이러스 (HTLV-II), 캘리포니아 뇌염 바이러스, 한타 바이러스 (출혈열), 광견병 바이러스, 에볼라 열병 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 단순 포진 1 (구순 포진), 단순 포진 2 (성기 포진), 대상포진 (수두-대상포진, 수두라고도 알려짐), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 예를 들어 인간 CMV, 엡슈타인-바르 바이러스 (EBV), 플라비바이러스, 구제역 바이러스, 라사 바이러스, 아레나바이러스, 또는 암 유발하는 바이러스.
한 구현예에서, 치료제는 기생충 감염 또는 이와 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 제제이다. 일부 구현예에서, 기생충은 원생동물, 연충 또는 체외기생충이다. 연충(즉, 벌레)은 편형동물(예를 들어, 흡충 및 촌충), 가시머리 벌레 또는 둥근 벌레(예를 들어, 요충)일 수 있다. 체외기생충은 이, 벼룩, 진드기 및 응애일 수 있다.
기생충은 다음 질환 중 하나를 유발하는 기생충일 수 있다. 가시아메바 각막염, 아메바증, 회충증, 바베스열원충증, 대장섬모충증, 너구리회충증, 샤가스 질환, 간흡충증, 코클리오마이아, 작은와포자충, 열두조충증, 드라쿤쿨루스증, 포충증, 코끼리피부병, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 사상충증, 람블편모충증, 악구충증, 막양조충증, 이소스포라증, 카타야마열, 라이쉬마니증, 라임병, 말라리아, 흡충증, 구더기증, 사상충증, 이감염증, 옴, 주혈협충병, 수면병, 간충증, 조충증, 톡소카라증, 톡소플라스마증, 선모충증, 및 편충증.
기생충은 가시아메바, 아니사키스, 아스카리스 룸브리코이데스, 쇠파리, 발란티듐 콜라이, 빈대, 조충 (촌충), 양충, 코클리오마이아 호미니보락스, 이질아메바, 파스시올라 헤파티카, 람플편모충, 구충, 라이쉬마니아, 린구아툴라 세라타, 간 흡충, 로아사상충, 파라고니무스 - 폐 흡충, 요충, 플라스모디엄 팔시파럼, 쉬스토소마, 분선충속 스테르코랄리스, 진드기, 촌충, 톡소플라스마 곤디이, 트라이파노소마, 편충, 또는 반크롭트 사상충일 수 있다.
한 구현예에서, 치료제는 진균 감염 또는 이와 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 제제이다. 일부 구현예에서, 진균은 아스페르길루스 종, 블라스토마이세스 더마티티디스, 칸디다 효모 (예를 들어, 칸디다 알비칸스), 콕시디오이데스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 크립토코쿠스 가티이, 피부사상균, 푸사리움 종, 히스토플라즈마 캅술라툼, 뮤코로마이코티나, 뉴모사이스티스 지로베시, 스포로트릭스 쉔크키, 엑세로힐룸, 또는 클라도스포리움이다
비-제한적 예로서, 한 구현예에서, 본 발명은 HIV 감염 또는 이와 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 분기군 C 전달/창시자 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-1 외피 (Env) 1086C을 인코딩하는 뉴클레오시드 변형 1086C Env mRNA를 포함하거나 캡슐화하는 CD4+ T 세포 표적화 전달 비히클을 제공한다.
당업자는 본 발명이 이미 확립된 질환 또는 장애의 치료에 제한되지 않는다는 것을 본 명세서에 상술된 방법을 포함하는 본 개시내용으로 무장할 때 인식할 것이다. 특히, 질환 또는 장애가 대상체에게 해를 끼칠 정도로 나타날 필요는 없고; 실제로 질환 또는 장애는 치료가 투여되기 전에 대상체에서 검출될 필요가 없다. 즉, 본 발명이 이익을 제공하기 전에 질환 또는 장애의 유의미한 징후 또는 증상이 발생할 필요는 없다. 따라서, 본 발명은 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 포함하며, 본 명세서의 다른 곳에서 이전에 논의된 바와 같은 조성물은 질환 또는 장애의 발병 전에 대상체에게 투여되어 질환 또는 장애를 예방할 수 있다.
당업자는 본 명세서의 개시내용으로 무장할 때 질환 또는 장애의 예방이 질환 또는 장애의 발생 또는 진행에 대한 예방 조치로서 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포괄함을 이해할 것이다. 본 명세서의 다른 곳에서 더 충분히 논의된 바와 같이, 유전자 또는 유전자 산물의 수준 또는 활성을 조절하는 방법은 전사, 번역 또는 둘 다를 비롯하여 폴리펩티드 유전자 산물의 수준 및 활성을 조절할 뿐만 아니라 핵산의 발현을 조절하기 위한 광범위한 기술을 포괄한다.
본 발명은 표적화 도메인에 접합된 적어도 하나의 제제를 포함하는 전달 비히클의 전달을 포함한다. 본 발명의 방법을 실시하기 위해; 당업자는 본 명세서에 제공된 개시내용에 기초하여 대상체에게 적절한 조성물을 제형화하고 투여하는 방법을 이해할 것이다. 본 발명은 임의의 특정 투여 방법 또는 치료 레지멘에 제한되지 않는다.
당업자는 본 발명의 조성물이 단독으로 또는 임의의 조합으로 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 조성물은 동시에, 또는 서로 전 및/또는 후에 투여될 수 있다는 점에서 시간적 의미로 단독으로 또는 임의의 조합으로 투여될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 제공된 개시내용에 기초하여, 본 발명의 조성물이 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있고, 치료 결과에 영향을 미치기 위해 조성물이 단독으로 또는 다른 조성물과 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 임의의 조성물은 단독으로 또는 질환 또는 장애와 연관된 다른 분자의 다른 조절제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물(예를 들어, 전달 비히클)을 인간 환자에게 투여하는 것은 정맥내, 결절내, 진피내, 경피, 피하, 근육내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 국소(즉, 기도 표면을 포함하는 피부 및 점막 표면 모두), 척수강내, 관절내, 복수내, 대뇌내, 동맥내, 복강내, 경구, 림프내, 비강내, 직장 또는 질 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 경로에 의해, 국소 카테터를 통한 관류에 의해 또는 직접 병소내 주사에 의한 것일 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물(예를 들어 전달 비히클)은 정의된 기간(예를 들어, 0.5 내지 2시간)에 걸쳐 정맥내 푸시 또는 정맥내 주입에 의해 투여된다. 본 발명의 조성물은 연동 수단에 의해 또는 데포의 형태로 전달될 수 있지만, 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 대상체의 종, 연령, 성별 및 전반적인 상태, 치료되는 병태의 성질 및 중증도 및/또는 투여되는 특정 조성물의 성질(즉, 복용량, 제형)과 같은 인자에 따라 의존할 것이다. 특정 구현예에서, 투여 경로는 주 1회 또는 2회 일정 기간에 걸쳐 볼러스 또는 연속 주입을 통한 것이다. 다른 특정 구현예에서, 투여 경로는 선택적으로 매주 1회 또는 2회, 하나 이상의 부위(예를 들어, 허벅지, 허리, 둔부, 팔)에 피하 주사에 의한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 외래환자 기반으로 투여된다.
한 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물의 조합을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 부가적 효과를 가지며, 여기서 조성물 조합을 투여하는 전체 효과는 각각의 개별 억제제를 투여하는 효과의 합과 거의 동일하다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 시너지 효과를 가지며, 여기서 조성물의 조합을 투여하는 전체 효과는 각각의 개별 조성물을 투여하는 효과의 합보다 크다.
방법은 조성물의 조합을 임의의 적합한 비율로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 방법은 1:1 비율로 2개의 개별 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 그러나 방법은 임의의 특정 비율로 제한되지 않는다. 오히려 효과적인 것으로 나타난 모든 비율이 포괄된다.
약제학적 조성물
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되거나 이후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 준비 방법에는 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시킨 다음, 필요하거나 원하는 경우 생성물을 원하는 단일 또는 다중 용량 단위로 성형하거나 포장하는 단계가 포함된다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물의 설명은 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에 투여하기에 적합하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 다양한 동물에 대한 투여에 적합한 조성물을 만들기 위해 인간에 대한 투여에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되고, 보통의 숙련된 수의과 약리학자는 그러한 변형을 만약 있다면 단지 일상적인 실험으로 설계하고 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체에는 인간 및 기타 영장류, 상업적으로 관련된 포유류, 예컨대 비인간 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개를 비롯한 포유류가 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 안과용, 경구, 직장, 질, 비경구, 국부, 폐, 비강내, 협측, 정맥내, 뇌실내, 진피내, 근육내, 또는 또 다른 투여 경로에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 다른 고려되는 제형은 투영된 나노입자, 리포솜 제제, 활성 성분을 함유하는 재밀봉된 적혈구, 및 면역원성 기반 제형을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단일 단위 용량으로, 또는 복수의 단일 단위 용량으로 대량으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단위 용량"은 활성 성분의 미리 결정된 양을 포함하는 약제학적 조성물의 개별적인 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 및 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 동일성, 크기 및 상태에 따라 그리고 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
활성 성분 외에, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제어 또는 지속 방출 제형은 종래의 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 약제학적 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직의 물리적 파괴 및 조직의 파괴를 통한 약제학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 따라서 비경구 투여는 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 침투 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약제학적 조성물의 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 안구내, 유리체내, 피하, 복강내, 근육내, 진피내, 흉골내 주사, 종양내, 정맥내, 뇌실내 및 신장 투석 주사 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 멸균수 또는 멸균 등장 식염수와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형은 볼러스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 앰플 또는 보존제를 함유하는 다중 용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식가능한 지속 방출 또는 생분해성 제형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 일 구현예예서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예를 들어, 무발열원 멸균수)로 재구성하기 위한 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
약제학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 이외에 추가 성분, 예컨대 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사 가능한 제형은 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 기타 허용 가능한 희석제 및 용매에는 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드와 같은 고정 오일이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 유용한 다른 비경구 투여 가능한 제형은 활성 성분을 미세결정성 형태로, 리포솜 제제로, 또는 생분해성 중합체 시스템의 성분으로 포함하는 것을 포함한다. 서방성 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체 또는 난용성 염과 같은 약제학적으로 허용 가능한 중합체성 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은 활성 성분을 포함하고 약 0.5 내지 약 7 나노미터, 바람직하게는 약 1 내지 약 6 나노미터 범위의 직경을 갖는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 편리하게는 추진제의 스트림이 분말을 분산시키도록 유도될 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하는 장치를 사용하거나, 또는 자가-추진 용매/분말-분배 용기, 예컨대 밀봉된 용기에서 저비점 추진제 중에 용해 또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치를 사용하여 투여하기 위한 건조 분말의 형태이다. 바람직하게는, 이러한 분말은 중량 기준으로 입자의 적어도 98%가 0.5 나노미터 초과의 직경을 갖고 개수 기준으로 입자의 적어도 95%가 7 나노미터 미만의 직경을 갖는 입자를 포함한다. 더 바람직하게는, 중량 기준으로 입자의 적어도 95%는 1 나노미터 초과의 직경을 갖고 개수 기준으로 입자의 적어도 90%는 6 나노미터 미만의 직경을 갖는다. 건조 분말 조성물은 바람직하게는 당과 같은 고체 미세 분말 희석제를 포함하고 편리하게 단위 용량 형태로 제공된다.
저비점 추진제는 일반적으로 대기압에서 비등점이 65℉ 미만인 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50 내지 99.9%(w/w)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20%(w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비이온성 또는 고체 음이온성 계면활성제 또는 고체 희석제(바람직하게는 활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 차수의 입자 크기를 가짐)와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 멸균수 또는 멸균 등장 식염수와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형은 볼러스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 앰플 또는 보존제를 함유하는 다중 용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식가능한 지속 방출 또는 생분해성 제형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 일 구현예예서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예를 들어, 무발열원 멸균수)로 재구성하기 위한 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
약제학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 이외에 추가 성분, 예컨대 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사 가능한 제형은 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 기타 허용 가능한 희석제 및 용매에는 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드와 같은 고정 오일이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 유용한 다른 비경구 투여 가능한 제형은 활성 성분을 미세결정성 형태로, 리포솜 제제로, 또는 생분해성 중합체 시스템의 성분으로 포함하는 것을 포함한다. 서방성 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체 또는 난용성 염과 같은 약제학적으로 허용 가능한 중합체성 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "추가 성분"은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 풍미제; 착색제; 보존제; 생리적으로 분해성 조성물 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 진통제; 완충액; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 약제학적으로 허용 가능한 중합체성 또는 소수성 물질. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 Remington's Pharmaceutical Sciences(1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)에 기재되어 있다.
실험예
본 발명은 하기 실험예를 참조하여 더욱 상세하게 기재된다. 이러한 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 의도가 아니다. 따라서, 본 발명은 하기 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 설명 없이, 당업자는 선행 기술 및 하기 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 활용하고 청구된 방법을 실시할 수 있다고 여겨진다. 따라서 다음 작업 예는 본 개시내용의 나머지 부분을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 조작된 CD4+ T 세포 귀소 mRNA-LNP를 사용한 고효율 CD4+ T 세포 표적화 및 유전자 재조합
mRNA 기반 치료제는 현재 단백질 기반 또는 바이러스 기반 면역요법 접근법의 문제, 예컨대 제조의 어려움, 불안정성, 발현량과 기간에 대한 통제 부족, 높은 독성, 일부 경우에 게놈 통합 또는 부위외 효과를 해결하는 수많은 이점을 제공한다 (Goswami 등, 2019, Front. Oncol, 9:297; Das 등, 2015, J. Cell. Physiol, 230:259-271; Chames 등, 2009, Br. J. Pharmacol, 157:220-233). mRNA 기반 면역치료제 개발의 핵심 장애물은 효율적인 생체 내 전달이다. 현재까지, 임상 적용을 위한 T 세포 변형은 자가 T 세포 추출, 확장 및 생체외 게놈 편집을 필요로 했으며, 이는 비용과 시간이 많이 소요되며 HIV 또는 겸상 적혈구 빈혈과 같은 보다 일반적인 질환에 대한 광범위한 사용을 배제한다. T 세포는 형질감염시키기 어려운 세포로 알려져 있다(Peer 등, 2010, Journal of Controlled Release, 148:63-68; Gust 등, 2008, Cell Commun Signal, 6:3; Goffinet 등, 2006, The FASEB Journal, 20:500-502). 여기서, LNP를 함유하는 항-CD4 항체 접합 Luc mRNA로 인간 T 세포를 표적화하지만 대조군 IgG-접합 LNP로는 그렇지 않음이 용량 의존적 방식으로 인간 CD4+ T 세포에서 강한 결합 및 루시퍼라제 발현을 초래한다는 것이 증명되었다 (도 1a 내지 도 1c). 유사하게, C57BL/6 마우스에 전신 주사했을 때, 항-마우스 CD4/mRNA-LNP가 특이적으로 축적되었고 mRNA는 비장 및 림프절과 같은 T 세포가 풍부한 조직에서 번역되었다(도 3 및 도 4a 내지 도 4c). 또한, Cre/loxP 리포터 시스템을 사용하여 게놈 편집을 매개하는 T 세포 표적화 mRNA-LNP 시스템의 가능성을 기능적으로 평가하였다. Cre 매개 유전자 재조합은 생체 내 CD4+ T 세포에서 유도되었다. 흥미롭게도, 고용량(마우스당 30 μg)의 비장 및 림프 조직 모두 에서 비표적화된 mRNA-LNP로부터의 신호는 처리되지 않은 마우스(CD3+CD8- 세포 중 28% ZsGreen1+ 세포)에서 관찰된 바와 같이 0이 아니었다. 이러한 관찰은 LNP가 ApoE에 결합하고 일반적으로 간 31을 표적으로 하기 때문에 일부 T 세포(Sundqvist, 2018, Front. Immunol, 9:974; Panezai 등, 2017, Immunology 152:308-327)에 의한 ApoE 수용체의 발현으로 인한 것 같다. 유전자 편집 세포의 백분율은 항-CD4/mRNA-LNP의 다중 주사에 의해 추가로 증가되었다. 이러한 높은 수준의 생체 내 T 세포 표적화 유전자 재조합은 다른 곳에서는 보고되지 않았다. 잠재적인 유전자 편집 요법에 대한 중요한 발견은 유사한 수준의 유전자 재조합이 휴식 및 활성화된 CD4+ T 세포에서 관찰되었다는 것이다. 시간이 지남에 따라 성공적으로 표적화된 T 세포의 존재에 대한 평가는 항-CD4/mRNA-LNP로 처리 후 1주 동안 비장에서 ZsGreen1 신호의 점진적인 감소를 보여주었다. 이러한 경향은 비장에서 T 세포의 우세한 집단인 순환 T 세포의 수명을 고려하여 예상되었다(Langeveld 등, 2006, Journal of Clinical Investigation, 36:250-256; Bronte 등, 2013, Immunity, 39:806-818). 그러나, 림프절에서의 ZsGreen1 발현은 항-CD4/mRNA-LNP로 처리한 후 7일의 실험 시간 동안 최소한의 변화를 유지하였다. 랫트의 주요 림프양 및 비-림프양 조직에서 51Cr 표지 흉관 림프구(TDL)의 이동을 분석한 보고서에서 림프구가 비장보다 림프절에서 더 긴 상주 시간을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 유사한 상주 시간이 또한 마우스에 대해서도 보고되었다(Mandl 등, 2012, Proc Natl Acad Sci U S A, 109:18036-18041). 마지막으로, 다양한 T 세포 하위유형이 표적이 되는지 여부를 평가하였다. 항-CD4/Cre mRNA-LNP로 처리했을 때 나이브, 기억 및 이펙터 기억 하위유형 간에 흡수 및 재조합에 유의한 차이가 없었다. 항-CD4 mRNA-LNP 시스템은 T 세포 요법에 중요한 비장 및 림프절과 같은 조직에서 CD4+ T 세포 표적화를 허용한다. 현재의 T 세포 표적 플랫폼은 T 세포 표적화 치료 mRNA 전달을 가능하게 함으로써 많은 생체 내 T 세포 조작 기반 적용에 큰 잠재력을 가지고 있다. 특정 세포 유형(예를 들어, 그 중에서도 T 림프구 등)에 대한 생체 내 전달은 많은 최근 연구에서 입증된 것처럼 매우 발전하는 분야이다(Veiga 등, 2020, Adv Drug Deliv Rev, 159:364-376; Mizrahy 등, 2017, Mol Ther, 25:1491-1500, Fenton 등, 2017, Adv Mater, 29, Ramishetti 등, 2016, J Drug Target, 24:780-786, Veiga 등, 2018, Nat Commun, 9:4493). 항체로 변형된 LNP는 유전자 사일런싱 목적을 위해 siRNA를 림프구로 전달하는 데 사용되었다(Ramishetti 등, 2015, ACS Nano, 9:6706-6716). 문헌[Ramishetti등] CD4+ T 림프구를 표적화하기 위한 항-CD4 단클론성 항체를 갖는 표면 변형된 siRNA 로딩된 LNP을 개시한다. 그들은 비장에서 단리한 CD4+ T 세포의 약 30%에서 유전자 사일런싱을 관찰했는데, 이는 CD4 표적화 Cre mRNA-LNP(비장 내 CD4+ T 세포의 ~60%)에서 관찰된 표적화 기능 활성의 절반에 불과하다. siRNA-LNP를 사용하고 실험의 비-이진 판독값으로 인해 두 플랫폼의 표적화 효율성을 직접 비교하는 것은 간단하지 않다. 다른 지질 및 중합체 기반 운반체를 사용하여 림프구 표적화를 위한 다른 시도가 있었다. 문헌[McKinlay 등 (McKinlay 등, 2018, Proceedings of the National Academy of Sciences 115, E5859-E5866)]는 마우스의 대략 1.5% T 림프구 형질감염 효율를 달성하는 하이브리드 지질 기반 양친매성 전하 변경 방출 수송체(CART)를 사용하여 mRNA 전달의 조합 화학적 접근법에 대해 보고하였다. 마찬가지로 문헌[Fenton 등 (Fenton 등, 2017, Advanced Materials, 29:1606944)]는 능동 표적화 리간드를 사용하지 않고 B 림프구에 mRNA를 전달하기 위한 특정 LNP 디자인을 기재하였다. 그들은 LNP 제형 라이브러리의 다른 비-선택적 제형과 비교하여 비장에서 B 세포 표적화 Luc mRNA-LNP 제형으로부터 향상된 발광 신호를 보여주었다. 문헌[Veiga 등 (Veiga 등, 2018, Nature communications, 9:4493-4493)]는 ASSET 플랫폼을 사용하여 표면 변형된 LNP의 mRNA를 염증성 Ly6C+ 백혈구에 전달했으며, 이 플랫폼 또한 단클론성 항체 표적화를 이용한다. IL-10을 인코딩하는 mRNA의 전달 및 발현은 결장염 모델에서 상당한 치료 효과를 보여 주었다. 단핵구, 대식세포 및 호중구와 마찬가지로 일부 T 세포도 Ly6c를 발현하지만, 백혈구 집단이 Ly6c 표적화 LNP를 흡수하고 발현하는지, 그리고 어느 정도까지 결정되지 않았다. 표적화된 mRNA-LNP 플랫폼은 선택적이고 기능적인 CD4+ 표적화를 위한 LNP 기반 mRNA 전달 시스템의 첫 번째 보고서이다. 전반적으로 본 명세서에 제시된 T 세포 표적화 mRNA-LNP 플랫폼은 광범위한 생체 내 T 세포 조작을 위한 엄청난 기회를 제공한다. 림프절과 같은 접근하기 어려운 조직의 모든 T 세포 하위유형에 도달할 수 있는 이 시스템의 큰 잠재력은 생체 내에서 많은 유형의 T 세포 조작에 이용할 수 있는 표적 플랫폼을 만들 것이다. 점용 잠재성은 잠재적인 HIV 치유를 위해 T 세포에 mRNA 치료제를 전달하는 것을 포함한다. 특히, 조작된 게놈 편집 효소의 표적화 전달은 감염된 세포의 게놈에서 HIV 통합 프로바이러스를 절제함으로써 HIV를 치유할 가능성이 있다(Karpinski 등, 2016, Nat Biotechnol, 34:401-409). 추가로, 림프구의 표적화 변형은 다양한 암, 감염성 질환, 및 면역학적 장애에 대한 신속하고 비용 효율적인 면역치료제 개발을 위한 수많은 적용을 가지고 있다.
실험에 사용된 물질 및 방법이 이제 기재된다.
마우스
C57BL/6J 마우스. 동일한 수의 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스를 Jackson 실험실에서 구입하였다. Ai6(RCL-ZsGreen) 마우스. C57BL/6J 배경의 Ai6(RCL-ZsGreen) 마우스는 Jackson Laboratory(재고 번호: 007906) 에서 구입 및 사내에서 동형접합체를 사육하였다. Ai6은 CAG 프로모터 유도 강화된 녹색 형광 단백질 변이체(ZsGreen1)의 전사를 방지하는 loxP 측접 STOP 카세트가 있는 Cre 리포터 대립유전자이다 - 모두 Gt(ROSA)26Sor 유전자좌에 삽입된다. Cre 매개 재조합 시, Ai6 마우스는 강력한 ZsGreen1 형광을 나타낸다.
mRNA 생산 및 LNP 제조
Cre 재조합효소 또는 반듯불이 루시퍼라제의 코딩 서열은 코돈 최적화, 합성 및 mRNA 생산 플라스미드(각각 pUC-ccTEV-Cre-A101 및 pUC-ccTEV-Luc2-A101)로 클로닝되었다. mRNA는 선형화된 플라스미드에서 T7 RNA 폴리머라제(Megascript, Ambion)를 사용하여 생산되었다. mRNA는 101개 뉴클레오티드 길이의 폴리(A) 테일을 포함하도록 전사되었다. UTP 대신 m1ψ-5'-트리포스페이트(TriLink)을 사용하여 변형된 뉴클레오시드 함유 mRNA를 생성하였다. 시험관 내 전사된 mRNA의 캡핑은 트리뉴클레오티드 cap1 유사체, CleanCap(TriLink)을 사용하여 공동 전사적으로 수행하였다. mRNA는 기재한 대로 셀룰로스 정제로 정제하였다(Baiersdorfer 등, 2019, Mol Ther Nucleic Acids, 15:26-35). 모든 mRNA는 천연 아가로스 겔 전기영동으로 분석되었고 -20℃에서 냉동 보관되었다.
m1ψ 함유 mRNA는 pH = 4.0의 mRNA 수용액이 에탄올에 용해된 지질 용액과 빠르게 혼합되는 자가 조립 공정을 사용하여 LNP에 캡슐화되었다(Maier 등, 2013, Mol Ther, 21:1570). -1578). 본 연구에 사용된 LNP는 이전에 기술된 것과 조성이 유사하였다(Maier 등, 2013, Mol Ther, 21:1570-1578; Jayaraman 등, 2012, Angew Chem Int Ed Engl, 51:8529-8533), 이는 이온화 가능 양이온성 지질 (Acuitas)/ 포스파티딜콜린/콜레스테롤/PEG-지질 (50:10:38.5:1.5 mol/mol)을 함유하고 ~0.04(wt/wt)의 RNA 대 총 지질 비율로 캡슐화되었다. 나노입자의 직경은 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) 기기를 사용하여 동적 광 산란으로 측정했을 때 ~80 nm였다. mRNA-LNP 제형은 ~1 μg/μL의 mRNA 농도로 -80℃에서 보관되었다.
단클론성 항체 접합 지질 나노입자
LNP는 CD4에 특이적인 mAb와 접합되었다. 정제된 NA/LE 랫트 항-마우스 CD4 (BD PharmingenTM), 정제된 랫트 항-인간 CD4 항체, 클론 A161A1 (BioLegend), 및 대조군 아이소타입 매칭된 IgG는 이전에 기재한 바와 같이 SATA-말레이미드 컨쥬게이션 화학을 통해 LNP에 결합되었다 18. 간략하게, LNP는 삽입 후 기술에 의해 DSPE-PEG-말레이미드로 변형되었다. 항체를 SATA (N-석신이미딜 S-아세틸티오아세테이트)(Sigma-Aldrich)로 변형시켜 말레이미드에 대한 접합을 허용하는 설프하이드릴 기를 도입하였다. SATA는 0.5 M 하이드록실아민을 사용하여 탈보호한 후 G-25 Sephadex Quick Spin Protein 컬럼(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)으로 미반응 성분을 제거하였다. 그 다음 항체 상의 반응성 설프하이드릴 기를 티오에테르 접합 화학을 사용하여 말레이미드 모이어티에 접합시켰다. Sepharose CL-4B 겔 여과 컬럼(Sigma-Aldrich)을 사용하여 정제를 수행하였다. 변형된 Quant-iT RiboGreen RNA 검정(Invitrogen)을 수행하여 mRNA 함량을 계산하였다. 표적화 지질 나노입자의 크기 및 표면 전하는 각각 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)에서 동적 광 산란(DLS) 및 레이저 도플러 유속계(LDV)를 사용하여 결정되었다. 크기 및 제타 전위 측정은 관련 일회용 모세관 세포에서 PBS pH 7.4, 25℃에서 수행되었다. 산란각이 173°인 비침습적 후방 산란 시스템(NIBS)을 크기 측정에 사용하였다. 비접합 및 항체 변형 mRNA-LNP의 직경은 정규화된 강도 크기 분포 및 입자 제제에 대한 z-평균 값으로 해석되었다.
시험관 내 세포 결합 연구
방사능 측정을 사용한 세포 결합 연구를 위해, LNP는 앞서 기술된 바와 같이 요오드화 비드 (Pierce)를 사용하여 먼저 Na125I로 방사성 표지되었다 (Khoshnejad 등, 2016, Bioconjug Chem, 27:628-637). 그 다음 인간 CD4+ T 세포를 증가하는 양의 항-CD4/ 또는 대조군 IgG/mRNA-LNP와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 인큐베이션 배지를 제거하고 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하여 세포 표면에서 비결합 나노입자를 제거하였다. 세포를 1 N NaOH 중 1% Triton X100으로 용해시키고 세포 관련 방사능을 Wallac 1470 Wizard 감마 계수기(Gaithersburg, MD)로 측정하고 추가된 총 활성과 비교하였다.
유동 세포측정을 사용한 세포 결합 연구를 위해, 인간 CD4+ T 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 150,000개 세포로 시딩(seeding)하였다. 폴리(C) RNA를 운반하는 LNP를 웰당 증가하는 양의 mRNA로 배지에 첨가하고, 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 인큐베이션 배지를 제거하고 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하여 세포 표면에서 비결합 나노입자를 제거하였다. FITC 태깅된 항-랫트 IgG(Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 BD LSR II 유동 세포측정기에서 항체 접합된 LNP의 결합을 모니터링하였다.
시험관 내 세포 형질감염 연구
반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase) mRNA를 사용한 세포 형질감염 연구를 위해, 인간 CD4+ T 세포를 48-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 18시간 후, 리포터 루시퍼라제 mRNA를 운반하는 LNP를 증가하는 농도로 세포에 첨가하고, 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 플레이트를 PBS로 3회 세척하고 완전 배지를 세포에 첨가하였다. 완전 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 세척하고, 루시퍼라제 세포 배양 용해 시약(Promega, Madison, WI)에 용해시키고 발광으로서 루시퍼라제 효소 활성(Luciferase assay system, Promega)을 측정하였다 18. 형질감염은 삼중으로 수행하였다. Cre 재조합효소 mRNA를 사용하는 세포 형질감염 연구를 위해, 2마리의 Ai6 마우스로부터 비장을 채취하고 풀링된 단일 세포 현탁액을 생산하였다. 200만 개의 비장세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 세포를 1, 3, 6 또는 9 μg의 CD4-표적 또는 비-표적(비접합된 또는 대조군 IgG 접합된) Cre mRNA-LNP와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 수집하고 Live/Dead Aqua(Thermo Fisher Sci, L34966) 및 CD3 및 CD8 (및 이후 실험에서 생략된 CD4)에 대한 항체로 염색하고 ZsGreen1 발현 CD3+CD8- 세포의 백분율을 유동 세포측정을 사용하여 결정하였다.
C57BL/6J 마우스에서 항-CD4/mRNA-LNP의 생체분포; 조직 흡수
125I 방사선 표지된 mRNA-LNP를 C57BL/6 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에 IV(후안와) 주사로 투여하였다. 하대 정맥에서 주사 후 0.5, 1, 24시간에 채혈하였다. 특정 장기(간, 비장, 폐, 신장 및 심장)도 같은 시점에 채취하여 식염수로 헹구고 블롯 건조된 후 칭량하였다. 감마 계수기(Wallac 1470 Wizard 감마 계수기, Gaithersburg, MD)에서 각 장기 및 100 μL의 혈액 샘플의 방사능 양을 측정하였다. 그램 조직당 주사된 용량의 퍼센트로서의 조직 흡수(%ID/g) 및 장기 대 혈액 비율로서의 국소화 비율(LR)은 샘플의 방사능 값 및 중량을 사용하여 계산되었다. 면역특이성 지수(ISI)는 CD4 표적화 mRNA-LNP의 LR 대 대조군 IgG-변형된 것의 LR의 비율로도 계산되었다.
C57BL/6J 마우스에서 항-CD4/mRNA-LNP의 생체분포; 조직 및 세포 수준에서 루시퍼라제 mRNA 번역
C57BL/6J 마우스에 항-CD4/mRNA-LNP 또는 대조군 IgG/mRNA-LNP 제형을 IV(후안와) 주사하였다. 주사 5시간 후에, 동물을 안락사시키고 선택된 장기(간, 비장, 폐, 신장 및 심장)를 채취하고 PBS로 헹구고 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 해동되면, 조직 샘플을 프로테아제 억제제 칵테일(1X)를 함유하는 적절한 부피의 세포 용해 완충액(1X)(Promega Corp, Madison, WI)에서 균질화하고 4℃에서 1시간 동안 부드럽게 혼합하였다. 그 다음 균질물을 드라이아이스/37℃에서 냉동/해동 주기에 적용하고 4℃에서 16,000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 루시퍼라제 활성은 Victor 3 1420 Multilabel Plate Counter (Perkin Elmer, Wellesley, MA)를 사용하여 상청액에서 측정되었다. 또한, CD3+ 세포 집단에서 mRNA 발현을 평가하였다. 제조업체의 지침에 따라 MagniSortTM 마우스 CD3+ 선택 키트(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 주사된 마우스의 비장 또는 림프절에서 CD3+ 세포를 단리하였다. 간략하게, 바이오틴화 항-마우스 CD3 항체 및 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드를 CD3+ 세포 단리를 위해 이용하였다. CD3+ 세포를 항체에 결합시킨 다음, 자성 비드에 결합시켰다. 자기장에 놓였을 때, 바람직하지 않은 세포는 경사분리에 의해 CD3+ 세포로부터 분리되었다. CD3+ 풍부 세포 집단의 세포 용해물에 대해 루시퍼라제 활성 측정을 수행하였다.
생물발광 이미징
C57BL/6J 마우스에 항-CD4/mRNA-LNP 또는 대조군 IgG/mRNA-LNP 제형을 IV(후안와) 주사하였다. 주사 후 5시간에, IVIS Spectrum 이미징 시스템(Caliper Life Sciences, Waltham, MA)을 사용하여 이전 18에 기재된 바와 같이 생물발광 이미징을 수행하였다. D-루시페린을 마우스에게 150 mg/kg의 용량으로 복강내 투여하였다. 5분 후, 마우스를 안락사시키고; 원하는 조직을 채취하고 이미징 플랫폼에 즉시 배치하였다. IVIS 이미징 시스템에서 5초 이상의 노출 시간을 사용하여 조직 발광을 측정하여 얻은 신호가 수술 감지 범위 내에 있는지 확인하였다. Caliper에서 제공하는 LivingImage 소프트웨어를 사용하여 관심 영역에서 광자 플럭스(광자/초)를 측정하여 생물발광 값도 정량화하였다.
Cre/loxP 리포터 시스템을 사용하는 항-CD4/mRNA-LNP의 표적화 효율의 결정
비장 및 림프절 내의 표적 세포화 집단에 대한 전달 효율을 분석하기 위해, 단일 세포 분해능으로 mRNA 번역을 추적하였다. Cre 재조합효소 mRNA를 함유하는 표적화 및 비-표적화 LNP는 녹색 형광 단백질 변이체(ZsGreen1)의 전사를 방지하는 loxP 측접 STOP 카세트와 함께 Cre 리포터 대립유전자를 운반하는 Ai6 마우스에 IV (안와후) 주사되었다. Cre 재조합효소는 loxP 측접 STOP 카세트를 절제하여 ZsGreen1의 전사를 허용한다. 주사 후, 원하는 시점에 동물을 안락사시키고 비장 및 림프절을 채취하였다. 장기 단일 세포 현탁액에서 녹색 형광 신호를 방출하는 CD3+CD8- 세포의 수를 유동 세포측정을 사용하여 평가하였다.
단일 세포 현탁액 제조 및 유동 세포측정
비장 및 림프절로부터 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 간략하게, 유리 현미경 슬라이드의 젖빛 단부를 사용하여 조직을 분쇄한 다음, 70-μm 필터를 통과시켰다. 원심분리 및 상청액 제거 후, 세포를 RPMI + 10% FBS 배지에 재현탁시키고, Live/Dead Aqua 세포 염색(Thermo Fisher Sci., Cat# L34957)으로 먼저 염색한 다음, 항-마우스 항체의 혼합물로 염색하였다(도 11). 염색된 단일 세포 집단은 BD LSR II 유동 세포측정기(BD Biosciences)에서 특성화되었다. 샘플당 500,000개의 이벤트가 수집되었다. Live/Dead Aqua에 대한 ArCTM Amine Reactive 비드(Thermo Fisher Sci.), 모든 항체에 대한 Compbead 항 랫트 및 항-햄스터 Ig κ음성 대조군 보상 입자 세트(BD Biosciences), 및 ZsGreen1에 대한 GFP BrightComp eBeads(Thermo Fisher Sci., Cat# A10514)를 사용하여 다색 흐름의 보상을 수행하였다. FlowJo 소프트웨어(Ashland, OR)로 데이터를 분석하였다. 실험에 사용된 물질 및 방법이 이제 기재된다.
이제 실험 결과를 기재한다.
시험관 내 CD4+ T 세포를 표적으로 하는 mRNA-LNP
T 세포가 자연적으로 나노입자를 세포내이입하지 않는다는 점을 고려하여, 초기에 mAb 결합 후 세포내이입하는 CD4+ T 세포 표면 항원을 찾았다. CD4+ T 세포 표적화 전달을 달성하기 위해 CD4 표적화 수용체 매개 세포내이입이 선택되었다 19. CD4 수용체 표적화는 또한 나노입자 결합 시 흡수 및 내재화할 수 있는 것으로 밝혀졌다 20, 21. 건강한 공여자로부터 얻은 인간 CD4+ T 세포에서 표적화 mRNA-LNP의 결합능을 먼저 평가하였다. 항-CD4 IgG 항체(항-CD4/mRNA-LNP) 또는 비-특이적 아이소타입 대조군 IgG(대조군 IgG/mRNA-LNP)를 mRNA-LNP에 접합시켰다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 방사성 표지된 항-CD4/mRNA-LNP는 인간 CD4+ T 세포에 선택적으로 결합한 반면, 대조군 IgG 대응물은 그렇지 않았다. CD4+ T 세포에 대한 선택적 표적화는 유동 세포측정을 사용하여 확인되었다(도 1b 및 도 1c). 인간 CD4+ T 세포를 항-CD4/폴리(C) RNA-LNP 또는 대조군 IgG/폴리(C) RNA-LNP와 함께 인큐베이션하고, FITC 태깅된 항-랫트 IgG를 사용하여 항체 접합된 LNP의 세포에의 결합을 모니터링하였다. 항-CD4/폴리(C) RNA-LNP의 용량-반응성 결합이 관찰되었다. 표적화된 mRNA-LNP의 내재화 및 기능적 활성(mRNA 번역)을 결정하기 위해, 반딧불이 루시퍼라제(firefly Luciferase) 인코딩 mRNA를 운반하는 항-CD4 항체- 또는 대조군 IgG 접합된 LNP를 인간 CD4+ T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 항-CD4/mRNA-LNP에서 mRNA의 효율적인 번역은 대조군 IgG/mRNA-LNP와 비교하여 입증되었다. CD4+ T 세포와 고용량의 Luc mRNA-LNP과의 인큐베이션은 더 높은 Luc 활성을 산출하여 용량-반응 상관관계를 입증하였다(도 1c).
단일 세포 수준에서 표적화 효율을 직접 평가하고 유전자 편집 목적을 위한 표적화 플랫폼을 테스트하기 위해, 비장 세포는 Ai6(Cre 매개 재조합 시, 강력한 ZsGreen1 형광을 발현하는 LoxP 측접 STOP 카세트가 있는 Cre 리포터 대립유전자)을 보유하는 마우스로부터 채취되었고, 상이한 양의 표적화 또는 비표적화 (비-접합 또는 대조군 IgG 접합된) Cre mRNA-LNP로 처리되었다. 그 다음 세포를 수집하고 CD3 및 CD8에 대한 항체로 염색하고(항체는 도 11에 나열됨) 유동 세포측정으로 분석하였다. CD3+CD8- 집단 중에서 ZsGreen1 양성 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략은 도 2b에 제시되어 있으며, 해당 ZsGreen1 양성 세포는 도 2a에 나와 있다. CD3+CD8-염색은 항-CD4 항체 접합된 나노입자의 투여 시 CD4의 일시적인 소멸 때문에 CD4+ T 세포를 식별하기 위해 직접 CD4 염색 대신에 사용되었다(도 3). 매우 낮은 백분율의 CD3+CD8- 세포는 비표적화 LNP가 사용될 때 양성 ZsGreen1 신호를 나타낸 반면, 이 세포 집단의 약 80%는 투여된 최저량의 mRNA-LNP에서도 항-CD4 항체 접합된 LNP로 전달된 Cre mRNA를 채택하고 번역하였다. Cre 매개 재조합 후 강력한 tdTomato 형광을 발현하는 Ai9 마우스에서 채취한 비장세포에서 동일한 실험을 수행했으며 유사한 결과를 얻었다. 이는 시험관 내에서 CD4+ T 세포를 효율적으로 형질감염시키는 표적화 항-CD4/mRNA-LNP의 잠재력을 보여준다.
생체 내 항-CD4/mRNA-LNP 표적 CD4+ T 세포
다음으로, 마우스의 항-CD4/mRNA-LNP의 생체분포를 안와후 정맥내 (IV) 투여 후에 분석하였다. LNP는 항-마우스 CD4 또는 대조군 IgG와 접합하기 전에 125I로 직접 표지되었으므로, 측정된 방사능은 결과에 영향을 미치는 분리된 표적화 항체 없이 입자의 분포만 나타내었다. 조직 흡수를 측정하기 위해, 다양한 조직의 방사능 양(조직 그램당 주사된 용량의 백분율-%ID/g)을 계산하였다. 예상대로, 상당한 양의 대조군 IgG/mRNA-LNP 입자가 주사 후 0.5시간(h)에 여전히 혈액에서 순환하고 있었으며(19.35±2.2 %ID/g), 이는 대조군 IgG LNP의 간 표적화의 감소와 함께 생체분포의 상당한 변화를 나타낸다 (도 4a). 항-CD4/mRNA-LNP의 경우, 더 적은 양의 입자가 순환하였다(10.84±0.42 %ID/g). 대부분의 항-CD4/mRNA-LNP 흡수는 비장에서 발생했으며(131.59±9.71% ID/g), 대조군 IgG/mRNA-LNP(37.6±8.67 %ID/g)에 비해 비장 흡수가 3.5배 증가했음을 나타낸다. 혈액에서의 %ID/g의 비율에 대한 주어진 장기의 %ID/g의 비율로 정의되는 국소화 비율(LR)도 CD4 표적화 및 대조군 IgG/mRNA-LNP 모두에 대해 계산되었다. 세망내피계의 일부인 비장은 표적화되지 않은 mRNA-LNP로 관찰되는 비-특이적 비장 흡수에 기여한다. 항-CD4/mRNA-LNP는 대조군 IgG 대응물보다 6배 더 높은 수준으로 비장에 국한되었다(도 4b, 도 5a). 항-CD4/mRNA-LNP의 생체내 조직 흡수의 동역학을 추가로 탐구하고 정량화하기 위해, 표적 및 비-표적 125I 표지된 폴리(C) RNA-LNP를 마우스에 IV 주사하였다. 주사 후 0.5, 1 및 24시간에 동물 그룹을 희생시키고 선택된 조직(혈액, 비장, 간, 폐 및 신장)을 채취하였다. 표적화된 mRNA-LNP의 가장 높은 순환량은 테스트된 초기 시점에서 혈액에서 10.84±0.42 %ID/g였다(도 4c). 나중에, 혈액 내 표적화 입자의 농도는 1시간 및 24시간에 각각 6.86±1.34 및 0.51±0.07의 %ID/g로 빠르게 떨어졌다. 표적화 입자의 특정 비장 흡수는 주사 후 0.5시간(131.59±9.71% ID/g)에서 정점에 이르렀고(도 4c), 국소화 비율은 시간이 지남에 따라 증가하여 마지막 테스트 시점인 24시간에서 61.15에 도달하였다(도 4d).
표적 LNP의 mRNA는 생체 내 CD4+ T 세포에 효율적으로 전달된다
Luc mRNA-LNP의 IV 투여 후 mRNA 번역을 분석하였다. 대조군 IgG/Luc mRNA-LNP 및 항-CD4/Luc mRNA-LNP는 먼저 8 μg(0.32 mg/kg) mRNA의 용량으로 투여되었다. 주사 5시간 후, 다양한 장기를 채취하고 조직 용해물에서 루시퍼라제 활성을 측정하거나 전체 장기의 직접 발광 이미징으로 검출하였다(도 6a 내지 도 6c). Luc 발현 패턴은 항-CD4와 대조군 IgG/Luc mRNA-LNP 처리된 마우스 사이에 현저한 차이를 나타냈는데, 발광 신호가 CD4 표적화로 간에서 상당히 감소했기 때문이다. 가장 중요한 것은 항-CD4/Luc-mRNA-LNP에 대한 Luc 활성이 비장에서 대조군 IgG 변형 mRNA-LNP에 비해 ~7배 더 높았다는 것이다(도 6a 및 도 6b). 비장, 신장, 폐, 심장 및 간을 제거한 후, 비접합 및 항체 접합된 LNP 모두의 높은 흡수를 나타내고 - 림프절 루시퍼라제 발현이 항-CD4/Luc mRNA-LNP 처리된 마우스에서 관찰되었다(도 6c). 이는 표적화 LNP가 내피 막을 통과하고 림프절과 같은 조직의 세포에 기능적으로 접근하는 능력을 보여준다. mRNA가 T 세포 집단에 특이적으로 전달되었음을 입증하기 위해, CD3+ T 세포를 (CD4 선별이 수행될 수 없었기 때문에) 상기와 같이 처리된 마우스의 비장으로부터 단리하였다. 항-CD4/Luc mRNA-LNP 투여 후 CD3+ 집단의 Luc 활성은 대조군 IgG/Luc mRNA-LNP 처리된 샘플에서보다 33배 더 높았다. Luc 활성이 T 세포에 집중되어 있는 경우(도 6d), CD4+ T 세포는 표적화 나노입자의 IV 전달 후 특이적이고 효율적으로 표적화된다는 결론을 내렸다.
ALC-0307 LNP 이외의 LNP 제형으로 CD4 표적화 mRNA-LNP 플랫폼의 표적화 효율을 확인하기 위해, 이온화 가능 지질 0315(ALC-0315 LNP)를 함유한 Acuitas LNP 제형에 동일한 항체 접합 전략이 적용되었으며, 이는 최근 미국 식품의약국(FDA) 승인을 받은 Pfizer/BioNTech COVID 백신의 LNP 제형이다 (Thran 등, 2017, EMBO Mol. Med. 9, 1434-1447; WO2017075531A1). 이 LNP 제형의 성분 목록은 (4-하이드록시부틸)아잔디일)비스(헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트)(4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate) 또는 ALC-0315 이온화 가능 지질, 2[(폴리에틸렌 글리콜-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(2[(polyethylene glycol-2000]-N,N-ditetradecylacetamide], 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 콜레스테롤을 포함한다. 항-CD4 표적화 Luc mRNA-ALC-0315 LNP의 주사 5시간 후, CD4 표적화 ALC-0307 LNP와 매우 유사한 Luc 발현 패턴(즉, 비장에서 더 높은 발광 신호 및 간에서 더 낮은 신호)은 대조군 IgG 대응물과 비교할 때 관찰되었다. 이러한 데이터는 ALC-0315 LNP와 같은 다른 LNP 제형의 CD4 표적화로 유사한 표적화 효율이 달성됨을 입증한다.
생체 내 CD4+ T 세포에서 CD4 표적화 Cre-mRNA-LNP 효과 유전적 재조합
표적화 mRNA 요법의 한 가지 용도는 유전자 편집 및 삽입이다. 생체 내 유전자 변형을 위해 세포 수준에서 CD4 표적화 LNP를 사용하여 mRNA 전달의 효율성을 평가하기 위해, Cre mRNA-LNP를 Ai6 마우스에 투여하였다(도 7a). 이러한 마우스에서, 형광 단백질 ZsGreen1을 인코딩하는 리포터 유전자의 Cre/loxP 매개 발현은 유동 세포측정을 사용하여 성공적으로 형질감염되고 LoxP 재조합 표적 세포를 쉽게 판독할 수 있게 한다(도 7b 및 도 7c). 다양한 용량(3, 10, 30 및 90μg)을 테스트하였다. 마우스에 IV 주사한 다음, 다음날 비장 및 림프절을 채취하고, 각 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 제조하였다. CD4+ T 세포를 식별하기 위해 CD3 및 CD8에 대한 항체를 사용하여 유동 세포측정을 위해 세포를 염색하였다(도 11). 처리되지 않은 동물에서는 어떠한 신호도 관찰되지 않았으며, 이는 리포터 작제물의 누출이 없음을 나타낸다. 대조군 IgG/Cre mRNA-LNP의 투여는 테스트된 두 조직, 즉 비장(도 7b) 및 림프절(도 7c)에서 사용된 mRNA 용량 범위에 걸친 수준에서 유사한 형질감염의 낮은 효율을 초래하였다. 예상대로, 대조군 IgG- 및 비접합 mRNA-LNP 대응물과 비교했을 때 모든 시험된 mRNA 용량에서 항-CD4/Cre mRNA-LNP 처리로 ZsGreen1 발현 세포 수의 상당한 증가가 관찰되었다(도 7b 및 도 7c). 비접합된 mRNA-LNP로 처리된 마우스에서, 용량이 30 μg으로 증가했을 때 mRNA 전달 및 후속 Cre/loxP 재조합의 상당한 증가가 관찰되었다(CD3+CD8- 세포 집단에서 ZsGreen1+ 세포의 최대 약 20%). 이는 여전히 모든 테스트된 용량에서 표적화된 mRNA-LNP로 관찰된 강한 반응보다 훨씬 낮고 일부 T 세포에 의한 ApoE 수용체의 발현으로 인한 것 같다(Sundqvist, 2018, Front. Immunol, 9:974; Panezai 등, 2017, Immunology 152, 308-327). 90μg의 항-CD4/Cre mRNA-LNP를 투여하면 ZsGreen1+ CD4+ T 세포의 백분율이 훨씬 더 높아지는 반면, 이 양의 LNP는 모든 그룹(비접합된 그룹 및 대조군 IgG 접합된 처리 및 CD4 표적화 LNP 처리 모두)에서 독성이 있는 것으로 입증되었고, 따라서 해당 용량은 추가 실험에서 제외되었다. 선택적 CD4 표적화 대 비표적화 LNP의 대조군은 대식세포 및 수지상 세포에서 나노입자의 흡수를 증가시키지 않았으며(도 8), 나노입자의 광범위한 자연 식세포 흡수로 인해 가능성이 있는 반면, CD4+ T 세포에서는, 비표적화 대조군 mRNA-LNP와 비교하여 표적화 mRNA-LNP 흡수가 유의하게 증가한다. 수지상 세포 및 대식세포와 같은 비-T 세포 비장세포에서 ZsGreen1 발현 세포의 수는 이 연구에서 용량 범위 간에 차이가 없었다(도 8).
CD4 표적화 ALC-0315 LNP를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. Ai6 마우스에게 Cre mRNA를 운반하는 이러한 표적화 LNP를 i.v. 주사하는 경우, CD4 표적화된 ALC-0307 LNP-Cre mRNA에 필적하는 표적화 효율이 관찰되었다(대조군 IgG 대응물에 비해 항-CD4/ALC-0315 LNP-Cre mRNA 처리로 처리된 마우스에서 ZsGreen1 발현 세포의 수가 증가함).
항-CD4/mRNA-LNP를 사용한 CD4+ T 세포 표적화는 T 세포 하위유형 특이적이지 않다.
다음으로, 표적화된 LNP의 흡수가 특정 T 세포 하위유형에 의해 선호되는지 여부를 조사하였다. 용량 10μg의 Cre mRNA-LNP를 투여한 지 1일 후, 비장을 채취하고 단일 세포 현탁액을 CD3, CD8, CD44 및 CD62L에 대한 항체로 염색하여 나이브, 기억 및 이펙터 기억 T 세포 하위집단을 식별하였다. 검사된 임의의 특정 CD4+ T 세포 하위집단에 의해 흡수되고 발현되는 CD4 표적화 mRNA-LNP에 대한 유의미한 선호도는 발견되지 않았다: CD4+ 나이브 T 세포 (CD44-CD62L-), 중심 기억 T 세포 (CD44+CD62L+), 및 이펙터 기억 T 세포 (CD44+CD62L-) (도 9a). 생체 내 T 세포의 대부분은 활성화되지 않는다. Cre mRNA-LNP를 받은 CD4+ T 세포에 대해 T 세포 활성화 마커(CD25)의 발현을 분석하였다. 특히, CD4 표적화 mRNA-LNP는 활성화된(CD25+) CD4+ T 세포의 ~40%와 비교하여 휴지기(CD25-)의 ~57%에서 Cre 재조합을 유도하여(도 9b), 휴지기 CD4+ T 세포에서 효율적인 표적화, 형질감염 및 유전자 재조합을 입증한다.
재조합 세포는 비장에서 CD4 표적화 전달 후 시간이 지남에 따라 감소한다.
ZsGreen1 발현은 10 μg의 Cre mRNA-LNP의 단일 IV 투여 후 7일 동안 추적되었다. 비장 및 림프절을 주사 후 1일, 4일 또는 7일에 채취하고, 단일 세포 제제를 상기와 같이 유동 세포측정을 위해 염색하였다. 10 μg의 항-CD4/Cre mRNA-LNP의 투여 4일 후, ZsGreen1 발현 비장 CD4+ T 세포의 수가 크게 감소하였다(1일차 ~50%에서 4일차 ~32%). 그러나 마지막으로 테스트한 시점(7일차)에서 약 26%의 유사한 수준을 유지했으며, 여전히 IgG 및 비접합된 대응물에서 관찰된 값보다 훨씬 높다(도 7d). 혈액 및 비장은 일시적 재순환 T 세포의 부위이며, 이 데이터는 이를 반영한다(Ganusov 등, 2014, PLoS Comput Biol, 10:e1003586; Mandl 등 2012, Proc Natl Acad Sci U S A, 109:18036-18041). 모든 처리에 대한 ZsGreen1 발현은 림프절에서 추출한 T 세포에서 7일 동안 크게 변하지 않았다(도 7e). 이는 림프절에서 T 세포의 더 긴 상주 시간을 반영한다(Ganusov 등, 2014, PLoS Comput Biol, 10:e1003586; Mandl 등 2012, Proc Natl Acad Sci U S A, 109:18036-18041).
생체 내 표적화 mRNA-LNP 유도 특정 유전자 재조합은 부가적인 효과를 보여준다
표적화 mRNA 전달의 잠재적 부가적인 효과는 mRNA-LNP의 연속 투여에 의해 테스트되었다(도 10a 및 도 10b). 24시간마다 1회 주사로 10μg 용량의 Cre mRNA-LNP를 마우스에 3 내지 5회 IV 주사하였다. 비장 및 림프절은 마지막 주사 다음 날 채취하였다. 5회 주사는 3회 주사와 비교할 때 ZsGreen1+ 세포의 수가 상당히 더 많았다. 흥미롭게도, 대조군 IgG/ 및 비접합된 mRNA-LNP 모두에 대해 ZsGreen1 발현 CD4+ T 세포 수의 꾸준한 증가가 관찰되었다. 그러나, 발현은 비접합된 그룹에서 28%로 증가했으며, 테스트된 임의의 주사 횟수에서 여전히 항-CD4/mRNA-LNP보다 상대적으로 낮다. 전반적으로, 표적화 mRNA-LNP의 순차적 투여는 비장 및 림프절 모두에서 증가된 주사 횟수와 함께 Cre 유도 유전자 재조합을 증가시키는 결과를 초래하였다.
본 명세서에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 발명이 특정 구현예를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 구현예 및 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 구현예 및 등가 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA Parhiz, Hamideh Weissman, Drew Tombacz, Istvan Pardi, Norbert Muzykantov, Vladimir <120> In vivo targeting of CD4+-T cells for mRNA therapeutics <130> 046483-6215-00WO <150> US 63/091,010 <151> 2020-10-13 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 35 40 45 Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95 Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105 110 Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160 Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu 165 170 175 Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys 180 185 190 Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser 195 200 205 Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu 275 280 285 Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile 385 390 395 400 Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile 405 410 415 Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met 420 425 430 Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro 435 440 445 His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile 450 455 <210> 2 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr 20 25 30 Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser 35 40 45 Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala 50 55 60 Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala 65 70 75 80 Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp 85 90 95 Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe 115 120 125 Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 130 135 140 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 145 150 155 160 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 165 170 175 Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 180 185 190 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His 195 200 205 Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser 210 215 220 Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val 225 230 235

Claims (15)

  1. 표적화 도메인에 접합된 전달 비히클을 포함하는 조성물로서, 전달 비히클은 적어도 하나의 제제를 포함하고, 표적화 도메인은 CD4+ T 세포의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 전달 비히클은 리포솜, 지질 나노입자 및 마이셀로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 전달 비히클은 지질 나노입자인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 지질 나노입자는 표적화 도메인에 접합된 PEG-지질을 포함하는, 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 적어도 하나의 제제는 지질 나노입자에 캡슐화되는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 제제는 치료제, 영상화제, 진단제, 조영제, 표지화제, 검출제 및 소독제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 제제는 치료제인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 치료제는 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 치료제는 뉴클레오시드 변형 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 핵산 분자는 mRNA 분자를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 표적화 도메인은 핵산 분자, 펩티드, 항체 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 표적화 도메인은 항체인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 표적화 도메인은 항-CD4 항체인, 조성물.
  14. 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제7항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 질환 또는 장애는 암, 감염성 질환, 및 면역학적 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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