JP2018509387A - 細胞に治療および診断剤を送達するための方法、組成物、ならびにシステム - Google Patents

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Abstract

対象における細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための方法を開示する。開示の方法は概して、治療または診断剤を含む有効量の脂質ナノ粒子と有効量の膜不安定化ポリマーとを対象に投与する工程を含む。関連する組成物および送達システムも開示する。

Description

配列表への言及
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出され、その全体において参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2016年1月13日に作成された該ASCII Copyは、「3900_PCTl_Seq_Listing_ST25」と名付けられ、サイズが66,448バイトである。
発明の背景
脂質ナノ粒子(LNP)は、通常は細胞不透過性である治療用核酸、タンパク質、およびペプチドなどの生物活性化合物のための効果的な薬物送達システムである。リポソーム製剤も、概して一定の組織において薬物を富化することならびに毒性を緩和することを目的として、小分子薬剤向けに開発されている。
インビトロで転写されたメッセンジャーRNA(mRNA)などの大きな核酸分子やメッセンジャーRNAまたは遺伝子と相互作用するより小さなポリヌクレオチドを含む核酸に基づく薬剤は、効果的であるためには適切な細胞コンパートメントに送達されなければならない。例えば、二本鎖核酸、例えばsiRNAを含む二本鎖RNA分子(dsRNA)などは、それらを細胞に対して不透過性にするそれらの物理化学的性質の問題がある。適切なコンパートメントに送達された際には、siRNAはRNA干渉(RNAi)として知られる高度に保存された調節機構を通じて遺伝子発現をブロックする。典型的には、siRNAは分子量が12〜17kDaの範囲でありサイズが大きく、負電荷数が最大で50であるそれらのリン酸骨格のために高度にアニオン性である。また、2つの相補的RNA鎖が強固ならせん構造をもたらす。これらの特徴はsiRNAの「薬剤様の」性質の乏しさに寄与している。静脈内に投与されると、siRNAは、典型的な半減期がわずか10分の範囲で身体から急速に排泄される。加えて、siRNAは、血液および他の液体中または組織中に存在するヌクレアーゼによって急速に分解され、インビトロおよびインビボで強い免疫応答を刺激することが示されている。例えば、Robbins et al., Oligonucleotides 19:89-102, 2009（非特許文献1）を参照されたい。mRNA分子は、不透過性、脆弱性、および免疫原性という同様の問題がある。
適切な化学修飾の導入により、ヌクレアーゼに対する安定性を高め得ると同時に免疫刺激を抑制し得る。siRNAへの親油性小分子のコンジュゲーションは二本鎖RNA分子の薬剤動態特性を改善する。これらの小分子siRNAコンジュゲートは、げっ歯類の肝細胞で発現される遺伝子の特異的ダウンレギュレーションに有効であることが実証されている。しかしながら、所望の生物学的効果を誘発するためには、多くの用量が必要であった。Soutschek et al, Nature 432:173-178, 2004（非特許文献2）を参照されたい。
脂質ナノ粒子製剤はインビボでは核酸の送達を改善した。例えば、そのような製剤はインビボでの標的ノックダウンを達成するのに必要なsiRNA用量を有意に減少させた。Zimmermann et al, Nature 441:111-114, 2006（非特許文献3）を参照されたい。典型的には、そのような脂質ナノ粒子薬剤送達システムは、カチオン性脂質と、ヘルパー脂質と、ポリエチレングリコールを含有する脂質とを含む多成分製剤である。正電荷を備えたカチオン性脂質はアニオン性核酸に結合する一方で、他の成分は脂質ナノ粒子の安定した自己組織化をサポートする。
脂質ナノ粒子製剤の送達効率の改善に向けた取り組みが行われている。多くのそのような取り組みはより適切なカチオン性脂質を開発することに向けられている。例えば、Akinc et al., Nature Biotechnology 26:561-569, 2008（非特許文献4）; Love et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:1864-1869, 2010（非特許文献5）; Baigude et al., Journal of Controlled Release 107:276-287, 2005（非特許文献6）; Semple et al., Nature Biotechnology 28:172-176, 2010（非特許文献7）を参照されたい。これらの取り組みにもかかわらず、特に治療用途向けの脂質ナノ粒子に基づく薬剤送達システムには、有効性の向上および/または毒性の低下という点での改善が依然として必要である。
Robbins et al., Oligonucleotides 19:89-102, 2009 Soutschek et al, Nature 432:173-178, 2004 Zimmermann et al, Nature 441:111-114, 2006 Akinc et al., Nature Biotechnology 26:561-569, 2008 Love et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:1864-1869, 2010 Baigude et al., Journal of Controlled Release 107:276-287, 2005 Semple et al., Nature Biotechnology 28:172-176, 2010
一局面では、本発明は、対象内の標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための方法を提供する。該方法は(a)治療または診断剤を含む有効量の脂質ナノ粒子と(b)有効量の膜不安定化ポリマーとを対象に投与し、治療または診断剤が標的細胞の細胞質ゾルに送達される工程を概して含む。脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、別々に(例えば、脂質ナノ粒子の投与後に膜不安定化ポリマーが投与される)または、代替的には、単一組成物内で一緒に投与されてもよい。典型的には、脂質ナノ粒子は大きさが約200nmより小さい。一定のバリエーションでは、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、反復投薬計画(例えば、週に一回または隔週に一回の反復投与プロトコル)で投与される。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子はカチオン性脂質を含む。特に好適なカチオン性脂質は、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）；N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）；1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DOEPC）；1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DLEPC）；1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DMEPC）；1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（14:1）；N1-[2-((1S)-1-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4-[ジ(3-アミノ-プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド）エチル]-3,4-ジ[オレイルオキシ]-ベンズアミド（MVL5）；ジオクタデシルアミド-グリシルスペルミン（DOGS）；3b-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol）；ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）；Saint脂質(例えば、SAINT-2,N-メチル-4-(ジオレイル)メチルピリジニウム)；1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）；1,2-ジオレオイル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）；1,2-ジオレオイルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（DORI）；ジアルキル化アミノ酸（DILA2）(例えば、C18:1-norArg-C16)；ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）；1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（POEPC）；および1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（MOEPC）を含む。いくつかのバリエーションでは、カチオン性脂質は、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2-ジリノレイル-4-(2ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA)、1,2-ジオレオイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DODAP)、1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、モルホリノコレステロール(Mo-CHOL)、(R)-5-(ジメチルアミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩(DODAPen-Cl)、(R)-5-グアニジノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩(DOPen-G)、(R)-N,N,N-トリメチル-4,5-ビス(オレオイルオキシ)ペンタン-1-アミニウムクロリド(DOTAPen)などのイオン化可能なカチオン性脂質である。一定の態様では、脂質ナノ粒子は、組み合わせ即ち2つ以上のカチオン性脂質(例えば、上記の2つ以上のカチオン性脂質)を含む。
上記の方法のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、例えば、コレステリルヘミサクシネート(CHEMS)、ホスファチジルセリン、パルミトイルホモセリン、またはα-トコフェロールヘミサクシネートなどのイオン化可能なアニオン性脂質を含む。一定のバリエーションでは、脂質ナノ粒子は組み合わせ即ち2つ以上のアニオン性脂質(例えば、上記の2つ以上のアニオン性脂質)を含む。
上記の方法のいくつかのバリエーションでは、脂質ナノ粒子はヘルパー脂質を含む。特に好適なヘルパー脂質は、コレステロール(CHOL)；1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)；1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)；1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)；1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)；1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DLPE);1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)；および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPHyPE)を含む。一定の態様では、脂質ナノ粒子は組み合わせ即ち2つ以上のヘルパー脂質(例えば、上記の2つ以上のヘルパー脂質)を含む。
上記の方法の一定の態様では、脂質ナノ粒子は、例えば、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコールn)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE-PEGn、ここでnは350,500,750,1000または2000である)、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコールn)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE-PEGn、ここでnは350,500,750,1000または2000である)、DSPE-ポリグリセリン-シクロヘキシル-カルボン酸、DSPE-ポリグリセリン-2-メチルグルタル-カルボン酸、ポリエチレングリコール-ジミリストールグリセロール(PEG-DMG)、ポリエチレングリコール-ジステアロイルグリセロール(PEG-DSG)、またはN-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]}(C8 PEG2000セラミド)などのポリエチレングリコール-脂質コンジュゲート(PEG-脂質)を含む。nが350,500,750,1000または2000であるDMPE-PEGnのいくつかのバリエーションでは、PEG-脂質はN-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE-PEG2,000)である。nが350,500,750,1000または2000であるDSPE-PEGnのいくつかのバリエーションでは、PEG-脂質はN-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE-PEG2,000)である。一定の態様では、脂質ナノ粒子は組み合わせ即ち2つ以上のPEG-脂質(例えば、上記の2つ以上のPEG-脂質)を含む。
上記の方法のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む。膜不安定化ポリマー、脂質ナノ粒子、または膜不安定化ポリマーおよび脂質ナノ粒子の両方が、第1の標的化リガンドを含んでいてもよい。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの一方が第1の標的化リガンドを含み、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの他方が第1の標的化リガンドとは異なる第2の標的化リガンドを含みかつ(i)第1の標的化リガンドによって認識されるのと同じ細胞表面分子に特異的に結合するかまたは(ii)標的細胞の表面の異なる細胞表面分子に特異的に結合する。特定のバリエーションでは、第1の標的化リガンド、第2の標的化リガンド、または第1のおよび第2の標的化リガンドの両方のいずれかが、トランスフェリン受容体1型、トランスフェリン受容体2型、EGF受容体、HER2/Neu、VEGF受容体、PDGF受容体、インテグリン、NGF受容体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、葉酸受容体、およびシグマ受容体より選択される細胞表面分子に特異的に結合する。
脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方が第1の標的化リガンドを含む(かつ脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの他方が第2の標的化リガンドを任意で含む)上記の方法の一定の態様では、第1のおよび/または第2の標的化リガンドは小分子標的化部分を含む。具体的なバリエーションでは、小分子標的化部分は、糖(例えば、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン(NAG、GalNAcとも呼ばれる)、マンノース、およびマンノース-6-リン酸(M6P))、ビタミン(例えば、葉酸)、ビスホスホネート、またはそのアナログである。他の態様では、第1のおよび/または第2の標的化リガンドは、例えば、抗体、ペプチドアプタマー、または細胞表面分子の天然リガンドに由来するタンパク質などのタンパク質である。さらに別の態様では、第1のおよび/または第2の標的化リガンドは、例えば、インテグリン結合ペプチド、LOX-1結合ペプチド、および上皮成長因子(EGF)ペプチド、ニューロテンシンペプチド、NL4ペプチド、またはYIGSRラミニンペプチドなどのペプチドである。
上記の方法の一定の態様では、標的細胞は、分泌細胞、軟骨細胞、上皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液細胞、内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、および樹状細胞より選択される。別の好適な標的細胞は、癌細胞、免疫細胞、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞、または異常な代謝活性を有する細胞を含む。
標的細胞が分泌細胞である特定のバリエーションでは、標的分泌細胞は肝細胞である。いくつかのそのような態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、肝細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む。一定の態様では、第1の標的化リガンドはアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合し、例えば、特定のバリエーションでは、第1の標的化リガンドはN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む。肝細胞の表面の分子に結合する第1の標的化リガンドを含む上記のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの両方が第1の標的化リガンドを含む。別の態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーのうちの一方が第1の標的化リガンドを含み、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーのうちの他方が第1の標的化リガンドとは異なる第2の標的化リガンドを含みかつ(i)アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合するかまたは(ii)肝細胞の表面の異なる細胞表面分子に特異的に結合し、いくつかのそのような態様では、第2の標的化リガンドはN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む。
上記の方法のいくつかの態様では、膜不安定化ポリマーは、コポリマー、合成ペプチド、膜不安定化毒素またはその誘導体、あるいはウイルス融合ペプチド（viral fusogenic peptide）またはその誘導体である。特定のバリエーションでは、膜不安定化ポリマーは、例えば、pH感受性コポリマーなどのpH感受性ポリマーである。コポリマーは、例えばジブロックコポリマーなどのブロックコポリマーであってもよい。いくつかのバリエーションでは、ブロックコポリマーは、疎水性膜不安定化ブロックおよび親水性ブロックを含む。いくつかのそのような態様では、親水性ブロックにおいては疎水性モノマー残基よりも親水性モノマー残基が多くなるように親水性ブロックが親水性モノマーおよび疎水性モノマーの両方から重合されている。親水性ブロックは、ジスルフィド結合またはpH感受性結合を通じてなどで疎水性ブロックに開裂可能に連結されていてもよい。いくつかの態様では、親水性ブロックは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)部分などのペンダント遮蔽部分に連結したモノマー残基を含む。遮蔽部分は、ジスルフィド結合またはpH感受性結合を通じてなどで親水性ブロックに開裂可能に連結されていてもよい。特に好適なpH感受性結合(親水性および疎水性ブロックの連結または親水性ブロックへの遮蔽成分の連結のための)は、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、イミン、オルトエステル、カーボネートおよびマレアミド酸結合を含む。
pH感受性ポリマーは、カルボン酸官能基を有するモノマー残基、アミン官能基を有するモノマー残基、および/または疎水性官能基を有するモノマー残基を含んでいてもよい。いくつかのバリエーションでは、pH感受性ポリマーは、(C2-C8)アルキルアクリル酸(例えば、プロピルアクリル酸)の重合に由来するモノマー残基；(C2-C8)アルキル-エタクリレート、(C2-C8)アルキル-メタクリレート、または(C2-C8)アルキル-アクリレートの重合に由来するモノマー残基；および/または(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、または(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来するモノマー残基を含む。具体的なバリエーションでは、pH感受性ポリマーは、プロピルアクリル酸、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート、およびブチルメタクリレートの重合に由来するモノマー残基を有するランダムコポリマー鎖を含み、いくつかのそのような態様では、pH感受性ポリマーは、膜破壊ポリマーブロックとしてランダムコポリマー鎖を含み、1つまたは複数の追加のブロックをさらに含むブロックコポリマーである。
一定の態様では、pH感受性膜不安定化ポリマーは、親水性ランダムコポリマーブロックおよび疎水性ランダムコポリマーブロックを有するジブロックコポリマーであり、(i)親水性ブロックは親水性モノマー残基および疎水性モノマー残基の両方を含む両親媒性ブロックであり、親水性ブロック中の親水性モノマー残基の数は疎水性モノマー残基の数よりも大きく、(ii)疎水性ブロックは疎水性モノマー残基および親水性モノマー残基の両方を含み、約7.4のpHで全体的に疎水的特性を有する両親媒性膜不安定化ブロックであり；かつ(iii)親水性および疎水性ブロックの親水性モノマー残基のそれぞれは、独立して、約7.4のpHでイオン性であるモノマー残基、約7.4のpHで中性であるモノマー残基、および約7.4のpHで双性イオン性であるモノマー残基からなる群より選択される。
さらに別のバリエーションでは、pH感受性ポリマーは膜不安定化ペプチドに共有連結している。いくつかのそのような態様では、pH感受性ポリマーは複数のペンダント連結基を含み、複数の膜不安定化ペプチドは複数のペンダント連結基を介してpH感受性ポリマーに連結している。
いくつかの態様では、pH感受性ポリマーは、式Iのランダムブロックコポリマーを含み：
Figure 2018509387
式中、
A0、A1、A2、A3、A4およびA5は、それぞれ独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-、-O(C)b-、および-CR8-CR9からなる群より選択され；R1〜R6およびY0〜Y5では完全には置換されていないA0〜A5の4価の炭素原子は、適切な数の水素原子で満たされており；aおよびbは、それぞれ独立して1〜4であり；R8およびR9は、それぞれ独立して、-C(O)OH、-C(O)Oアルキル、および-C(O)NR10からなる群より選択され、R8およびR9は、互いに共有連結して環構造(例えば、環状無水物または環状イミド)を形成していてもよく；
Y5は、水素であるかまたは、いずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい-(1C-10C)アルキル、-(3C-6C)シクロアルキル、-O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、-C(O)NR11(1C-10C)アルキル、および-(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
Y0、Y3、およびY4は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-、-S(2C-10C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され；
Y1およびY2は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-18C)アルキル-、-(3C-18C)分岐アルキル、-C(O)O(2C-18C)アルキル-、-C(O)O(2C-18C)分岐アルキル、-OC(O)(1C-18C)アルキル-、-OC(O)(1C-18C)分岐アルキル-、-O(2C-18C)アルキル-、-0(2C-18C)分岐アルキル-、-S(2C-18C)アルキル-、-S(2C-18C)分岐アルキル-、-C(O)NR12(2C-18C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-18C)分岐アルキル-からなる群より選択され、Y1またはY2の任意のアルキルまたは分岐アルキル基は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、およびR12は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
Q0は、生理的pHで親水性である残基；O-[(C)2-3-O]x-R7；およびO-[(C)2-3-O]x-C(O)-NR13R14からなる群より選択される残基であり；xは、1〜48であり；R7は、-CH3または-CO2Hであり；R13およびR14は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
Q1およびQ2は、それぞれ独立して、存在しないか、または通常の生理的pHで親水性である残基；コンジュゲート可能なまたは官能化可能な残基；通常の生理的pHで疎水性である残基；1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基；および1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい分枝アルキル基より選択され；
Q3は、通常の生理的pHで正電荷を持つ残基であり；
Q4は、通常の生理的pHで負電荷を持つが、より低いpHではプロトン化を受ける残基であり；
mは、0より大きく1.0までのモル分率であり；
nは、0〜1.0未満のモル分率であり；
pは、0〜1.0未満のモル分率であり；m + n + p = 1であり；
qは、0.1〜0.9のモル分率であり；
rは、0.05〜0.9のモル分率であり；
sは、最大で0.85までのモル分率で存在し；q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；かつ
wは、1〜50kDaである。
上記の式IのpH感受性ポリマーを含むいくつかの態様では、mはn + pより大きい。いくつかのそのようなバリエーションでは、pは0である。
上記の式IのpH感受性ポリマーを含むいくつかの態様では、nは0より大きい。いくつかのそのようなバリエーションでは、Y1およびQ1の少なくとも一方は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されたアルキルまたは分岐アルキル基を含有する。より特定のバリエーションでは、pは0でありかつ/またはmはnより大きい。
式IのpH感受性ポリマーを含む一定の態様では、pH感受性ポリマーは式IIのポリマーである：
T1-L-[PEGMAm-PDSMAn-BPAMp]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w II
式中、
PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり；
PDSMAは、ピリジルジスルフィドメタクリレート残基であり；
BPAMは、2-[2-Bocアミノエトキシ]エチルメタクリレート残基であり；
BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
mは、0.6〜1のモル分率であり；
nは、0〜0.4(例えば0〜0.2)のモル分率であり；
pは、0〜0.4(例えば0〜0.2)のモル分率であり；
m + n + p = 1であり；
qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜25kDaであり；
T1は、存在しないかまたは第1の標的化リガンドであり；かつ
Lは、存在しないかまたは連結部分である。
式IのpH感受性ポリマーを含む別の態様では、pH感受性ポリマーは式Vのポリマーであり：
T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w V
式中、
PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり;
M2は、
(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；
(C4-C18)分枝アルキル-メタクリレート残基；
コレステリルメタクリレート残基；
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；および
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
からなる群より選択されるメタクリレート残基であり；
BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
mおよびnは、それぞれ0より大きいモル分率であり、mは、nより大きく、m + n = 1であり；
qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜25kDaであり；
T1は、存在しないかまたは第1の標的化リガンドであり；かつ
Lは、存在しないかまたは連結部分である。
式Vのポリマーのいくつかの具体的な態様では、M2は、2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基；2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基(2-プロペン酸，2-メチル-，3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルエステル残基とも呼ばれる)；3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基；1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基；2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基；2-エチルヘキシルメタクリレート残基：ブチルメタクリレート残基；ヘキシルメタクリレート残基；オクチルメタクリレート残基；n-デシルメタクリレート残基；ラウリルメタクリレート残基；ミリスチルメタクリレート残基；ステアリルメタクリレート残基；コレステリルメタクリレート残基；エチレングリコールフェニルエーテルメタクリレート残基；2-プロペン酸，2-メチル-，2-フェニルエチルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，2-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]エチルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，シクロヘキシルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，2-[ビス(1-メチルエチル)アミノ]エチルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，3-メチルブチルエステル残基；ネオペンチルメタクリレート残基；tert-ブチルメタクリレート残基；3,3,5-トリメチルシクロヘキシルメタクリレート残基；2-ヒドロキシプロピルメタクリレート残基；5-ノニルメタクリレート残基；2-ブチル-1-オクチルメタクリレート残基；2-ヘキシル-1-デシルメタクリレート残基；および2-(tert-ブチルアミノ)エチルメタクリレート残基より選択される。
式IIまたは式VのpH感受性ポリマーを含む上記の方法の特定のバリエーションでは、PEGMAはエチレングリコール単位を4〜5個またはエチレングリコール単位を7〜8個有し；T1およびLが存在し、T1はN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含み；かつ/または、Lはエチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコール(PEG)部分を含む。
一定の態様では、脂質ナノ粒子は治療剤を含む。治療剤は、抗癌剤、抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗炎症剤、または細胞代謝活性を調節する薬剤であってもよい。好適な治療剤は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、および小分子から選択されてもよい。
いくつかの態様では、治療剤はポリヌクレオチドである。いくつかのそのようなバリエーションでは、脂質ナノ粒子は約1対約30のN:P(窒素対リン酸)比を有する。一定の態様では、ポリヌクレオチドは、例えばタンパク質欠損疾患に関連する機能性タンパク質をコードするmRNAなどのmRNAである。特定のバリエーションでは、標的細胞は肝細胞であり、mRNAはアルファ-1-抗トリプシン(A1AT)、カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)、フマリルアセトアセターゼ(FAH)酵素、アラニン：グリオキシレート-アミノトランスフェラーゼ(AGT)、メチルマロニルCoAムターゼ(MUT)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファサブユニット(PCCA)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼベータサブユニット(PCCB)、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)のサブユニット、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、銅輸送ATPアーゼAtp7B、ビリルビンウリジンジホスフェートグルクロニルトランスフェラーゼ(BGT)酵素、ヘプシジン、グルコース-6-ホスファターゼ(G6Pase)、グルコース6-ホスフェートトランスロカーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼ(GB)、ニーマン・ピックC1タンパク質(NPC1)、ニーマン・ピックC2タンパク質(NPC2)、酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、第IX因子、ガラクトース-1-ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、トランスサイレチン、補体調節タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、ホモゲンチセート1,2-ジオキシゲナーゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、P型ATPアーゼタンパク質FIC-1、アルファ-ガラクトシダーゼA、酸性セラミダーゼ、酸性α-L-フコシダーゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、アルファ-L-イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、N-アセチルガラクトサミン-6-サルフェートスルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼB、ヘパラン-N-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル-CoA:α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-サルフェートスルファターゼ、アルファ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼAからなる群より選択されるタンパク質をコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、例えばタンパク質欠損疾患に関連する機能性タンパク質(例えば、上に列挙したタンパク質より選択されるタンパク質)をコードするDNAなどのDNAである。
一定の態様では、治療剤は分泌タンパク質をコードするmRNAである。好適な分泌タンパク質は、ホルモン、サイトカイン、成長因子、凝固因子、抗プロテアーゼタンパク質、血管新生タンパク質、抗血管新生タンパク質、ケモカイン、および抗体を含む。特定のバリエーションでは、分泌タンパク質は、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、レプチン、血小板由来成長因子(例えば、血小板由来成長因子B(PDGF-B))、ケラチノサイト成長因子(KGF)、骨形成タンパク質2(BMP-2)、骨形成タンパク質7(BMP-7)、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、ヒト成長ホルモン(HGF)、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、リラキシン(例えば、リラキシン-2)、インターフェロン(例えば、インターフェロン-α(IFN-α)、インターフェロン-β(IFN-β)、インターフェロン-γ(IFN-γ))、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-10(IL-10)、インターロイキン-11(IL-11)、インターロイキン-12(IL-12)、インターロイキン-18(IL-18)、インターロイキン21(IL-21)、CCサブファミリーケモカイン、CXCサブファミリーケモカイン、Cサブファミリーケモカイン、およびCX3Cサブファミリーケモカインより選択される。分泌タンパク質が抗体であるいくつかの態様では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体(例えば、一本鎖Fv(scFv))、および二重特異性抗体より選択される遺伝子組換え抗体である。
治療剤がポリヌクレオチドである別の態様では、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである。好適なオリゴヌクレオチド治療剤は、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗miR(antagomiRとしても公知である)、ロックド核酸(LNA)に基づくオリゴヌクレオチド、ダイサー基質、miRNA、aiRNA、shRNA、リボザイム、および核酸アプタマーを含む。
一定の態様では、治療剤は、例えば、抗体またはペプチドアプタマーなどのタンパク質である。抗体治療剤の特定のバリエーションは、一本鎖抗体および二重特異性抗体を含む。
いくつかの態様では、治療剤はペプチドである。例示的なペプチド治療剤は、疾患関連抗原(例えば、腫瘍抗原)からの1つまたは複数の短いかまたは長いアミノ酸配列を含むペプチドワクチンを含む。
別の態様では、治療剤は小分子である。具体的なバリエーションでは、小分子は、抗チューブリン剤、DNA副溝結合剤、およびDNA複製阻害剤より選択される。別のバリエーションでは、小分子は、アントラサイクリン、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシノイド、ビンカアルカロイド、および白金(II)化合物より選択される。
別の態様では、治療剤は、疾患に関連する遺伝子を破壊するかまたは修正する遺伝子編集システムの構成要素である。いくつかの態様では、遺伝子編集システムの構成要素は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)である。特に好適なヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)、および組換えメガヌクレアーゼを含む。ヌクレアーゼがCas9である特定のバリエーションでは、脂質ナノ粒子は、ヌクレアーゼを標的細胞ゲノムにおける特定部位に標的化させるガイドRNAをさらに含む。上記の遺伝子編集に向けられたいくつかのバリエーションでは、脂質ナノ粒子は、相同組換えによって疾患関連遺伝子を修正するためのDNA供与体配列を含有するポリヌクレオチドをさらに含む。別のバリエーションでは、方法は、相同組換えによって疾患関連遺伝子を修正するためのDNA供与体配列を含有するポリヌクレオチドを含む有効量の第2の脂質ナノ粒子を対象に投与する工程をさらに含む。
いくつかの態様では、治療剤は免疫原である。好適な免疫原は、ペプチド、タンパク質、mRNA、短いRNA、DNA、および単体または複合体炭水化物を含む。一定のバリエーションでは、免疫原は、感染因子(例えば、ウイルスまたは細菌)または癌細胞に由来する。いくつかのそのような態様では、膜不安定化ポリマーは、脂質ナノ粒子の免疫原と同一または異なっていてもよい免疫原とも関連している。
治療剤がポリヌクレオチドである上記の方法の一定の態様では、脂質ナノ粒子は脂質成分の混合物を含み、該脂質成分の混合物は、(i)生理的pHで永続的に電荷を有し、該混合物中に約35モル％〜約55モル％存在するカチオン性脂質と；(ii)イオン化可能なアニオン性脂質であって、このアニオン性脂質は存在しなくてもよく、存在する場合は該混合物中に約25モル％〜約40モル％存在する、イオン化可能なアニオン性脂質と；(iii)該イオン化可能なアニオン性脂質が存在しない場合、該混合物中に約40モル％〜約50モル％存在するヘルパー脂質であって、該イオン化可能なアニオン性脂質が存在する場合、該混合物中に約5モル％〜約20モル％存在するヘルパー脂質と；(iv)該混合物中に約2モル％〜約15モル％存在するPEG-脂質とを含む。いくつかのそのような態様では、カチオン性脂質はDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質はCHEMSであり、ヘルパー脂質はCHOLであり、かつ/あるいはPEG-脂質はDSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2kである。上記の脂質ナノ粒子を含む方法のいくつかのバリエーションでは、イオン化可能なアニオン性脂質は存在せず、カチオン性脂質は約35モル％〜約45モル％存在し、PEG-脂質は約5モル％〜約15モル％存在する。別のバリエーションでは、イオン化可能なアニオン性脂質が存在し、カチオン性脂質は約40モル％〜約55モル％存在し、いくつかのそのようなバリエーションでは、PEG-脂質は約5モル％〜約15モル％で存在する。より具体的な態様では、(a)カチオン性脂質はDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質は存在せず、ヘルパー脂質はCHOLであり、PEG-脂質はDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比は約40:50:10であるか；(b)カチオン性脂質がDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、ヘルパー脂質がCHOLであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:16:2であるか；(c)カチオン性脂質がDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、ヘルパー脂質がCHOLであり、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10であるか;または(d)カチオン性脂質がDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、ヘルパー脂質がCHOLであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10である。
別の局面では、本発明は、対象内の標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための組成物を提供する。組成物は、(a)治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子と(b)膜不安定化ポリマーとを概して含む。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む。組成物の脂質ナノ粒子、膜不安定化ポリマー、治療剤、および/または標的化リガンドは、治療または診断剤を細胞に送達するための方法に関して上に記載した様々な態様を含む。
さらに別の局面では、本発明は、対象内の標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための送達システムを提供する。システムは、(a)治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子を含む担体組成物と(b)膜不安定化ポリマーを含むエンハンサー組成物とを概して含む。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む。組成物の脂質ナノ粒子、膜不安定化ポリマー、治療剤、および/または標的化リガンドは、治療または診断剤を細胞に送達するための方法に関して上に記載した様々な態様を含む。
また別の局面では、本発明は、機能性タンパク質の欠損をもたらす遺伝的欠陥を特徴とする疾患を治療するための方法を提供する。方法は、疾患を有する対象に(a)機能性タンパク質または該機能性タンパク質と同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードするmRNAを含む有効量の脂質ナノ粒子と(b)有効量の膜不安定化ポリマーとを投与する工程を概して含み、該mRNAは該疾患に関連する標的組織の標的細胞の細胞質ゾルに送達され、標的組織内にコードされたタンパク質を産生するようにタンパク質合成中に該mRNAが翻訳され、これにより疾患を治療する。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、標的組織の標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む。脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、別々に(例えば、脂質ナノ粒子の投与後に膜不安定化ポリマーが投与される)または、代替的には、単一組成物内で一緒に投与されてもよい。脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、治療または診断剤を細胞に送達するための方法に関して上に記載した様々な態様を含むが、但し治療剤はmRNAであり、脂質ナノ粒子はカチオン性脂質(例えば、イオン化可能なカチオン性脂質)を含み、存在する場合には標的化リガンドは、タンパク質欠損症を示す標的組織の標的細胞に結合するように選択される。一定のバリエーションでは、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、反復投薬計画(例えば、週に一回または隔週に一回の反復投与プロトコル)で投与される。
一定の態様では、疾患は肝臓のタンパク質欠損疾患である。いくつかのそのような態様では、mRNAは、アルファ-1-抗トリプシン(A1AT)、カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)、フマリルアセトアセターゼ(FAH)酵素、アラニン：グリオキシレート-アミノトランスフェラーゼ(AGT)、メチルマロニルCoAムターゼ(MUT)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファサブユニット(PCCA)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼベータサブユニット(PCCB)、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)のサブユニット、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、銅輸送ATPアーゼAtp7B、ビリルビンウリジンジホスフェートグルクロニルトランスフェラーゼ(BGT)酵素、ヘプシジン、グルコース-6-ホスファターゼ(G6Pase)、グルコース6-ホスフェートトランスロカーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼ(GB)、ニーマン・ピックC1タンパク質(NPC1)、ニーマン・ピックC2タンパク質(NPC2)、酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、第IX因子、ガラクトース-1-ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、トランスサイレチン、補体調節タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、ホモゲンチセート1,2-ジオキシゲナーゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、P型ATPアーゼタンパク質FIC-1、アルファ-ガラクトシダーゼA、酸性セラミダーゼ、酸性α-L-フコシダーゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、アルファ-L-イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、N-アセチルガラクトサミン-6-サルフェートスルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼB、ヘパラン-N-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル-CoA:α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-サルフェートスルファターゼ、アルファ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼAより選択される機能性タンパク質をコードする。
疾患が肝臓のタンパク質欠損疾患である別の態様では、疾患は尿素サイクル異常症である。いくつかのそのような態様では、尿素サイクル異常症は、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症、カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)欠損症、アルギニノコハク酸尿症(アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)欠損症)、およびシトルリン血症(アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)欠損症)より選択される。尿素サイクル異常症がオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症である一定のバリエーションでは、mRNAは、SEQ ID NO:1の残基35〜354と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む機能性OTCタンパク質をコードする。尿素サイクル異常症がアルギニノコハク酸尿症(アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)欠損症)である一定のバリエーションでは、mRNAはSEQ ID NO:48と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む機能性ASLタンパク質をコードする。尿素サイクル異常症がシトルリン血症(アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)欠損症)である一定のバリエーションでは、mRNAはSEQ ID NO:50と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む機能性ASS1タンパク質をコードする。
上記の肝臓のタンパク質欠損疾患を治療するための一定の態様では、膜不安定化ポリマーおよび脂質ナノ粒子の少なくとも一方は、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合する標的化リガンドを含む。特に好適なASGPR特異的標的化リガンドは、N-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む。
別の局面では、本発明はpH感受性膜不安定化ポリマーを提供する。いくつかの態様では、pH感受性膜不安定化ポリマーは、式Iaのランダムブロックコポリマーを含み：
Figure 2018509387
式中、
A0、A1、A2、A3、A4およびA5は、それぞれ独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-、-O(C)b-、および-CR8-CR9からなる群より選択され；R1〜R6およびY0〜Y5では完全には置換されていないA0〜A5の4価の炭素原子は、適切な数の水素原子で満たされており；aおよびbは、それぞれ独立して、1〜4であり；R8およびR9は、それぞれ独立して、-C(O)OH、-C(O)Oアルキル、および-C(O)NR10からなる群より選択され、R8およびR9は、互いに共有連結して環構造を形成していてもよく；
Y5は、水素であるかまたは、いずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい-(1C-10C)アルキル、-(3C-6C)シクロアルキル、-O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、-C(O)NR11(1C-10C)アルキル、および-(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
Y0、Y3、およびY4は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-、-S(2C-10C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され；
Y1およびY2は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-18C)アルキル-、-(3C-18C)分岐アルキル、-C(O)O(2C-18C)アルキル-、-C(O)O(2C-18C)分岐アルキル、-OC(O)(1C-18C)アルキル-、-OC(O)(1C-18C)分岐アルキル-、-O(2C-18C)アルキル-、-0(2C-18C)分岐アルキル-、-S(2C-18C)アルキル-、-S(2C-18C)分岐アルキル-、-C(O)NR12(2C-18C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-18C)分岐アルキル-からなる群より選択され、Y1またはY2の任意のアルキルまたは分岐アルキル基は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、およびR12は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
Q0は、生理的pHで親水性である残基；O-[(C)2-3-O]x-R7；およびO-[(C)2-3-O]x-C(O)-NR13R14からなる群より選択される残基であり；xは、1〜48であり；R7は、-CH3または-CO2Hであり；R13およびR14は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
Q1およびQ2は、それぞれ独立して、存在しないか、または通常の生理的pHで親水性である残基；コンジュゲート可能なまたは官能化可能な残基；通常の生理的pHで疎水性である残基；1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基；および1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい分枝アルキル基より選択され；
Q3は、通常の生理的pHで正電荷を持つ残基であり；
Q4は、通常の生理的pHで負電荷を持つが、より低いpHではプロトン化を受ける残基であり；
mは、0.5より大きく1.0より小さいモル分率であり；
nは、0より大きく0.5より小さいモル分率であり；
pは、0〜0.5未満のモル分率であり；m + n + p = 1であり；
qは、0.1〜0.9のモル分率であり;
rは、0.05〜0.9のモル分率であり;
sは、最大で0.85までのモル分率で存在し；q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜50kDaであり；かつ
Y1およびQ1の少なくとも一方は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されたアルキルまたは分枝アルキル基を含有する。
上記の式Iaのコポリマーを含むpH感受性ポリマーのいくつかの態様では、pは0である。
上記の式Iaのコポリマーを含むpH感受性ポリマーのいくつかの態様では、R2-A1-Y1-Q1は一緒になって、2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基；2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基(2-プロペン酸，2-メチル-，3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルエステル残基とも呼ばれる)：3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基；1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基；および2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基より選択されるメタクリレート残基である。
上記の式Iaのコポリマーを含むpH感受性ポリマーのいくつかの態様では、
(a)Y3は-C(O)OCH2CH2であり、Q3はジメチルアミノであり、かつ/またはR4は-CH3であり;
(b)Y4は共有結合であり、Q4はカルボキシル残基であり、かつ/またはR5は-CH2CH2CH3であり；
(c)Y5は-C(O)O(CH2)3CH3であり、かつ/またはR6は-CH3であり；かつ/あるいは
(d)Y0は-C(O)O(2C-10C)アルキル-であり、Q0は、0-[(C)2-3-0]x-R7(ここでxは1〜48であり、R7は-CH3である)であり、かつ/またはR1は-CH3である。
式Iaのコポリマーを含むpH感受性ポリマーの態様では、pH感受性ポリマーは、式Vaのコポリマーであり：
T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w Va
式中、
PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり；
M2は、
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基、および
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
からなる群より選択されるメタクリレート残基であり、
BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
mおよびnは、それぞれ0より大きいモル分率であり、mは、nより大きく、m + n = 1であり；
qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜25kDaであり；
T1は、存在しないかまたは第1の標的化リガンドであり；かつ
Lは、存在しないかまたは連結部分である。
上記の式VaのpH感受性ポリマーの一定のバリエーションでは、M2は、2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基；2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基；および3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基；1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基；および2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基からなる群より選択されるメタクリレート残基である。
別の態様では、pH感受性膜不安定化ポリマーは式Vのポリマーであり：
T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w V
式中、
PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり;
M2は、
(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；
(C4-C18)分枝アルキル-メタクリレート残基；
コレステリルメタクリレート残基；
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；および
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
からなる群より選択されるメタクリレート残基であり；
BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
mおよびnは、それぞれ0より大きいモル分率であり、mはnより大きく、m + n = 1であり；
qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜25kDaであり；
T1は、存在しないかまたは第1の標的化リガンドであり；かつ
Lは、存在しないかまたは連結部分である。
上記の式VのpH感受性ポリマーの一定のバリエーションでは、M2は、2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基；2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基；1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基；2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基；2-エチルヘキシルメタクリレート残基；ブチルメタクリレート残基；ヘキシルメタクリレート残基；オクチルメタクリレート残基；n-デシルメタクリレート残基；ラウリルメタクリレート残基；ミリスチルメタクリレート残基；ステアリルメタクリレート残基；コレステリルメタクリレート残基；エチレングリコールフェニルエーテルメタクリレート残基；2-プロペン酸,2-メチル-,2-フェニルエチルエステル残基；2-プロペン酸,2-メチル-,2-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]エチルエステル残基；2-プロペン酸,2-メチル-,2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチルエステル残基；2-プロペン酸,2-メチル-,シクロヘキシルエステル残基；2-プロペン酸,2-メチル-,2-[ビス(1-メチルエチル)アミノ]エチルエステル残基；2-プロペン酸,2-メチル-,3-メチルブチルエステル残基；ネオペンチルメタクリレート残基；tert-ブチルメタクリレート残基；3,3,5-トリメチルシクロヘキシルメタクリレート残基；2-ヒドロキシプロピルメタクリレート残基；5-ノニルメタクリレート残基；2-ブチル-1-オクチルメタクリレート残基；2-ヘキシル-1-デシルメタクリレート残基；および2-(tert-ブチルアミノ)エチルメタクリレート残基からなる群より選択されるメタクリレート残基である。
さらに別の態様では、本発明は脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、(a)ポリヌクレオチドと(b)脂質成分の混合物とを含み、該脂質成分の混合物は、(i)生理的pHで永続的に電荷を有し、該混合物中に約35モル％〜約55モル％存在するカチオン性脂質と；(ii)イオン化可能なアニオン性脂質であって、このアニオン性脂質は存在しなくてもよく、存在する場合は該混合物中に約25モル％〜約40モル％存在する、イオン化可能なアニオン性脂質と；(iii)該イオン化可能なアニオン性脂質が存在しない場合、該混合物中に約40モル％〜約50モル％存在するヘルパー脂質であって、該イオン化可能なアニオン性脂質が存在する場合、該混合物中に約5モル％〜約20モル％存在するヘルパー脂質と；(iv)該混合物中に約5モル％〜約15モル％存在するPEG-脂質とを含む。いくつかのそのような態様では、カチオン性脂質はDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質はCHEMSであり、ヘルパー脂質はCHOLであり、かつ/あるいはPEG-脂質はDSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2kである。上記の脂質ナノ粒子のいくつかのバリエーションでは、イオン化可能なアニオン性脂質は存在せず、カチオン性脂質は約35モル％〜約45モル％存在する。別のバリエーションでは、イオン化可能なアニオン性脂質が存在し、カチオン性脂質は約40モル％〜約55モル％存在する。より具体的な態様では、(a)カチオン性脂質はDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質は存在せず、ヘルパー脂質はCHOLであり、PEG-脂質はDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比は約40:50:10であるか;(b)カチオン性脂質はDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質はCHEMSであり、ヘルパー脂質はCHOLであり、PEG-脂質はDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比は約50:32:8:10であるか;または(c)カチオン性脂質はDOTAPであり、イオン化可能なアニオン性脂質はCHEMSであり、ヘルパー脂質はCHOLであり、PEG-脂質はDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比は約50:32:8:10である。上記の脂質ナノ粒子の一定の態様では、ポリヌクレオチドはmRNAである。
本発明のこれらおよび他の局面は、次の発明の詳細な説明を参照する際に明確になるであろう。
定義
特に定義した場合を除いて、本明細書において用いた技術および科学用語は全て、記載の方法および組成物が関わる技術分野における通常の技術を有するものによって一般的に解釈されるのと同じ意味を有する。本明細書において用いるように、次の語句は、特に規定した場合を除いてそれらの通常の意味を有する。
「a」「an」、および「the」という語は、文脈上明らかに他意を示す場合を除き複数形の指示対象を含む。
本明細書において用いるように、「脂質ナノ粒子」または「LNP」という語は、少なくとも1つの脂質分子種と共に処方される約1,000nm未満の、典型的には約200nm未満の粒子を指す。脂質ナノ粒子は、それらのラメラ性、形状、または構造にかかわらずリポソームを(非限定的に)含む。本明細書において用いるように、「リポソーム」は、水性の内部をとり囲む脂質含有膜を有する構造体である。リポソームは1つまたは複数の脂質膜を有してもよい。単層リポソームは「単ラメラ」と呼ばれ、多層リポソームは「多重ラメラ」と呼ばれる。脂質ナノ粒子は、脂質膜を安定させるため、脂質酸化を防止するため、またはリポソーム表面にリガンドを付着させるためなどの様々な目的のためにリポソーム組成中に含まれていてもよい、1つまたは複数の追加の脂質および/または他の成分をさらに含んでもよい。両親媒性、中性、カチオン性、およびアニオン性脂質を含む任意の数の脂質が存在してもよい。脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子を含む治療または診断剤と複合体化することができ、インビボ送達ビヒクルとして有用である。
「カチオン性脂質」という語は、生理的pHで正味の正電荷を備えた多数の脂質種のいずれかを指す。そのような脂質は、DODAC、DOTMA、DOTAP、DC-Chol、DMRIE、DOEPC、DLEPC、DMEPC、14:1、MVL5、DOGS、DORIE、DORI、およびDILA2を非限定的に含む。
「中性脂質」という語は、生理的pHで非電荷または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多数の脂質種のいずれかを指す。そのような脂質は、例えば、コレステロール、DOPE、DLPE、DLPC、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドを含む。
「非カチオン性脂質」という語は、上に記載の任意の中性脂質ならびにアニオン性脂質(すなわち、生理的pHで正味の負電荷を備えた脂質種)を指す。アニオン性脂質の例は、カルジオリピン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジン酸を非限定的に含む。
「イオン化可能なアニオン性脂質」は、pHが脂質のpKaに向かって低下するにつれてプロトン化を受けるアニオン性脂質を意味する。イオン化可能なアニオン性脂質のpKaでは、脂質の半分はアニオン形態であり、脂質の半分はプロトン形態である。脂質ナノ粒子の文脈では、イオン化可能なアニオン性脂質のpKaを超えるpH値ではより多くの脂質が負電荷を有し、脂質の負電荷を有する形態は、二重層組織において他の脂質を安定化させることができ、二重層小胞の形成を可能にする。次いで、これらの小胞は、エンドソーム環境中など、イオン化可能なアニオン性脂質のpKaに向かってpHが低下するにつれて融合し、より多くのイオン化可能なアニオン性脂質がプロトン化する。イオン化可能なアニオン性脂質の例は、コレステリルヘミサクシネート(CHEMS)、ホスファチジルセリン、パルミトイルホモセリン、およびα-トコフェロールヘミサクシネートを含む。
「イオン化可能なカチオン性脂質」は、pHが脂質のpKaに向かって低下するにつれてプロトン化を受けるカチオン性脂質を意味する。イオン化可能なカチオン性脂質のpKaでは、脂質の半分はプロトン形態であり、脂質の半分は中性形態である。脂質ナノ粒子の文脈において、イオン化可能なカチオン性脂質のpKaを下回るpH値では、脂質の正電荷を有する形態は、負電荷を有するオリゴヌクレオチドと相互作用でき、小胞およびナノ粒子の内部へのオリゴヌクレオチドの封入が可能になる。pKaを超えるpH値では、より多くのカチオン性脂質は中性であり、この電荷の欠如は脂質ナノ粒子の表面電位に影響を及ぼしかつこれらの脂質からのオリゴヌクレオチドの放出に影響を及ぼし得る。さらに、不飽和の尾部を有する適切に設計されたカチオン性脂質は、ラメラ−逆ヘキサゴナル相転移を受けることによって他の膜との融合事象を仲介し得る。そのような融合事象は、細胞質ゾルへの物質の送達を可能にし得るエンドソーム分解をもたらし得る。イオン化可能なアニオン性脂質の例は、DDAB、DlinDMA、DLin-KC2-DMA、MC3脂質(DLin-MC3-DMA)、DODAP、DODMA、およびMo-CHOLを含む。
「交換可能なPEG-脂質」は、LNP中のPEG-脂質分子が経時的にLNP膜を離れるように生理的温度では脂質ナノ粒子(LNP)膜中で安定ではないPEG-脂質を意味する。LNP膜を離れる交換可能なPEG-脂質は、典型的には、生体膜(例えば、血液細胞膜)へと移動するか、またはそれら自体でミセルを形成することがある。LNPからのPEG-脂質の放出速度は、主に、アルキル鎖の長さおよびアルキル鎖中の不飽和の度合い(すなわち、炭素-炭素二重結合の数)の関数である。典型的には、炭素が14個以下の飽和鎖を有するPEG-脂質が交換可能である。1つまたは複数の二重結合(例えば、18:1、18:2)を有するC18鎖も交換可能である。概して、炭素が18個より多いアルキル鎖を有するPEG-脂質は交換可能ではないか、または炭素が14個以下のアルキル鎖を有するPEG-脂質よりも交換の速度がはるかに遅い。PEG-脂質の放出速度を高め得る別の要因は、アルキル鎖の非対称性(例えば、アルキル鎖長が異なるPEG-セラミド(例えば、cerC8))ならびにPEG部分の大きさを含み、より大きな分子量のPEG部分が脂質の交換可能性に寄与する。
本明細書において用いるように、「両親媒性(amphipathic)」または「両親媒性(amphiphilic)」化合物は、親水性(水溶性)および疎水性(水不溶性)の両方の部位を有する。
本明細書において用いるように、「治療剤」という語は、細胞への送達時に治療効果を有することがある任意の分子種(例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子)を指す。ポリヌクレオチドの場合、この効果は、転写に続き(例えば、アンチセンスRNA、リボザイム、干渉性dsRNA、mRNA)またはタンパク質への発現に続いて核酸自体(例えば、アンチセンスポリヌクレオチド)によって仲介され得る。疾患状態を減弱するかまたは防止する際の発現されたタンパク質の「治療的」効果は、細胞内に留まっているか、膜中の細胞に付着したままであるか、またはタンパク質が全身循環および血液に入り得る細胞から分泌されかつ分離されるかのいずれかのタンパク質によって達成され得る。治療的であり得る分泌タンパク質は、ホルモン、サイトカイン、成長因子、凝固因子、抗プロテアーゼタンパク質(例えば、アルファ1-抗トリプシン)、血管新生タンパク質(例えば、血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子)、抗血管新生タンパク質(例えば、エンドスタチン、アンジオスタチン)、および血液中に存在する他のタンパク質を含む。膜上のタンパク質は、細胞がタンパク質またはリポタンパク質を取り込むための受容体を提供することによる治療効果を有し得る。細胞内に留まる治療タンパク質(細胞内タンパク質)は、フェニルケトン尿症でのように循環する有毒な代謝産物を取り除く酵素になり得る。それらはまた、癌細胞の増殖性または癌性をより低くさせるか(例えば、より低い転移性)またはウイルスの複製を妨害し得る。細胞内タンパク質は細胞骨格(例えば、アクチン、ジストロフィン、ミオシン、サルコグリカン、およびジストログリカン)の一部であり得、したがって心筋症および筋骨格疾患(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、四肢腺疾患)において治療効果を有する。タンパク質薬剤はまた、細胞に直接に送達されてもよい(すなわち、発現すべきコードするポリヌクレオチドとしてよりもむしろタンパク質の形態で)。心疾患を治療するために特に重要な他の治療用タンパク質は、心収縮性(例えば、カルシウムおよびナトリウムチャネル)に影響するポリペプチド、再狭窄の阻害剤(例えば、酸化窒素シンテターゼ)、血管新生因子、および抗血管新生因子を含む。タンパク質薬剤はまた、細胞内標的に向けられた抗体(例えば、小さい一本鎖抗体または二重特異性抗体)を含んでもよい。他の例示的な「治療剤」は、例えば細胞内標的分子の小分子阻害剤またはアゴニスト(例えば、キナーゼ阻害剤、DNA合成経路の阻害剤)または細胞に対する細胞毒性または細胞増殖抑制効果を有する小分子(癌治療のための化学療法剤など)；抗感染剤(例えば、抗ウイルス剤または抗菌剤)；あるいはワクチン(タンパク質、ペプチド、DNA、またはRNAを含む場合がある)などの小分子を含む。いくつかの態様では、「治療剤」は、疾患を引き起こす遺伝子を破壊するかまたは修正する遺伝子編集システムの構成要素(例えば、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド；ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと共に処方されることがあるガイドRNA；または相同組換えによって遺伝子を修正するためのドナーDNA配列)である。
本明細書において用いるように、「診断剤」という語は対象または対象からの試験試料において検出され得る成分を指す。例示的な診断剤は、放射性剤、蛍光剤、造影剤(例えば、MRIまたはX線造影剤)、および他の画像化試薬を含む。診断試薬は、例えば、免疫診断試薬(例えば、細胞内標的に向けられた抗体)ならびに他の特異的結合剤も含む。診断剤は、例えば、脂質ナノ粒子と複合体化した診断的に検出可能な標識からなっていてもよく、または他の分子(例えば、ペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドなどの特異的結合分子)にコンジュゲートした診断的に検出可能な標識を含んでいてもよい。多くの異なる標識が当技術分野に存在し、標識する方法は当業者に周知である。本発明で用いることができる一般的なクラスの標識は、放射性同位体、常磁性同位体、陽電子放射断層撮影法(PET)によって画像化することができる化合物、蛍光または有色化合物、磁気共鳴によって画像化することができる化合物、化学発光化合物、生物発光化合物などを非限定的に含む。特に好適な検出可能な標識は、放射性、蛍光性、蛍光発生性、または発色性標識を非限定的に含む。γカウンター、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーによって簡潔に検出される有用な放射性標識(放射性核種)は、3H、125I、131I、35S、および14Cを非限定的に含む。
本明細書において用いるように、「膜不安定化ポリマー」という語は、生体膜に次の1つまたは複数の効果を誘導することができるポリマーを指す：小分子の透過を可能にする改変または破壊、膜内の細孔形成、膜の融合および/または分裂、大分子の透過を可能にする改変または破壊、膜の溶解、あるいはタイトジャンクションを開きかつ傍細胞輸送を可能にする膜摂動を引き起こすこと。この改変は、次のアッセイの少なくとも1つにおける化合物の活性によって機能的に規定することができる：赤血球溶解(溶血)、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム内容物の放出。典型的には、膜不安定化ポリマーは、膜を通過するように分子量が50原子質量単位を超える分子の輸送を可能にする。この輸送は、膜構造の喪失または膜内の穴または孔の形成のいずれかによって達成されてもよい。特定のバリエーションでは、膜不安定化ポリマーは、コポリマー(例えば、両親媒性コポリマー)、合成両親媒性ペプチド、膜活性毒素(例えば、パルダキシン、メリチン、セクロピン、マガイニン、PGLa、インドリシジン、デルマセプチン、またはこれらの誘導体)、またはウイルス融合ペプチド(例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素サブユニットHA-2ペプチド)である。
本明細書において用いるように、「ブロックコポリマー」は、構成またはモノマー単位の1つまたは複数のサブコンビネーションを含む構造を指す。いくつかの態様では、ブロックコポリマーは、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマーまたはより高次のブロックコポリマーである。例えば、ジブロックコポリマーは、2つのブロックを含み得、そのようなポリマーは模式的に一般化すると次のように表される：[Aa-Bb-Cc- ...]m-[Xx-Yy-Zz- ...]nまたは[Aa-Bb-Cc- ...]m-b-[Xx-Yy-Zz- ...]n、ここで各文字はそれぞれ構成またはモノマー単位を表し、構成単位の各下付き文字は、特定のブロックにおけるその単位のモル分率を表し、3つの点は、各ブロックにおいてより多く(より少ない場合もある)の構成単位が存在する場合があることを示し、mおよびnは、ジブロックコポリマーにおける各ブロックの分子量(または重量分率)を示す。そのような模式図によって示唆されるように、いくつかの場合では各構成単位の数および性質は各ブロック毎に個別に制御される。模式図は、ブロックのそれぞれにおける、構成単位の数の間または異なる種類の構成単位の数の間のいかなる関係を暗示していることを意味するものではなく、かつ暗示していると解釈すべきものではない。また模式図が特定のブロック内の構成単位の任意の特定の数または配列を記載していることを意味するものではない。各ブロックにおいて、構成単位は明示的に特に記載がない限り純粋なランダム、交互ランダム、規則的交互、規則的ブロックまたはランダムブロック構成で配置されていてもよい。例えば、純粋にランダムな構成は、x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z...という形態を有してもよい。例示的な交互ランダム構成は、x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z...という形態を有してもよく、例示的な規則的交互構成はx-y-z-x-y-z-x-y-z...という形態を有してもよい。例示的な規則的ブロック構成は次の全体的な構成...x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x...を有してもよいが、例示的なランダムブロック構成は、...x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-...という全体的な構成を有してもよい。勾配ポリマーでは、1つまたは複数のモノマー単位の含有量は、ポリマーのα末端からω末端まで勾配様式で増加または減少する。上の包括的な例のいずれにおいても、個々の構成単位またはブロックの具体的な並置、あるいはブロック内の構成単位の数またはブロックの数を意味するものではなく、またこれらは本発明のポリマー担体を形成するブロックコポリマーの実際の構造に影響するかまたはそれを制限すると何ら解釈すべきものではない。
本明細書において用いるように、構成単位を囲む括弧は、構成単位自体がブロックを形成することを意味するものではなく、かつ意味すると解釈されるものではない。すなわち、鍵括弧内の構成単位は、ブロック内の他の構成単位と任意の様式、すなわち純粋にランダム、交互ランダム、規則的交互、規則的ブロックまたはランダムブロック構成で組み合わさっていてもよい。本明細書において記載のブロックコポリマーは、交互、勾配またはランダムブロックコポリマーであってもよい。
本明細書において用いるように、ポリマーまたはポリマーブロックのための「分子量」という語は数平均分子量である。当技術分野では、ポリマー分子の集団は異なる分子量の分布を有すると理解される。この分子量の分布は、分散度指数または多分散指数(PIまたはPDI)という語で記載し得、これは重量平均分子量/数平均分子量である。
本明細書において用いるように、「ポリヌクレオチド」という語は、2つ以上のヌクレオチドモノマー単位(「ヌクレオチド」)を含むポリマーを指す。本発明の一定の態様に係る典型的なポリヌクレオチドは、ヌクレオチドモノマー単位を7〜20,000個、ヌクレオチドモノマー単位を7〜15,000個、ヌクレオチドモノマー単位を7〜10,000個、ヌクレオチドモノマー単位を7〜5,000個およびヌクレオチドモノマー単位を7〜1000個含むものを含む。ヌクレオチドが200個より少ないポリヌクレオチドは一般に「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)、またはそれらの誘導体、ならびにDNA、RNAの組み合わせを含む。DNAは、cDNA、インビトロ重合DNA、プラスミドDNA、プラスミドDNAの一部、ウイルス由来の遺伝物質、線状DNA、ベクター(Pl、PAC、BAC、YAC、および人工染色体)、発現ベクター、発現カセット、キメラ配列、組換えDNA、染色体DNA、アンチセンスDNA、またはこれらの群の誘導体の形態であってもよい。RNAは、メッセンジャーRNA(mRNA)、インビトロ重合RNA、組換えRNA、トランスファーRNA(tRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、リボソームRNA(rRNA)、キメラ配列、ダイサー基質およびその前駆体、ロックド核酸、アンチセンスRNA、干渉RNA(RNAi)、非対称干渉RNA(aiRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、外部ガイド配列、低分子非メッセンジャーRNA(snmRNA)、非翻訳RNA(utRNA)、snoRNA(24量体、アンチセンス機構によって作用する修飾されたsnmRNA)、小型(tiny)非コードRNA(tncRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、またはこれらの誘導体の形態であってもよい。また、DNAおよびRNAは、一本、二本、三本、または四本鎖であってもよい。二本鎖RNA(dsRNA)およびsiRNAは、特にRNA干渉の現象に関して重要である。本明細書において用いるオリゴヌクレオチドの例は、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ダイサー基質、miRNA、aiRNAまたはshRNAを非限定的に含む。本明細書において用いるオリゴヌクレオチドのさらなる例は、ヌクレオチド17〜29個またはヌクレオチド19〜25個の長さを有し、治療的に関連するタンパク質または抗原の核酸配列のコードまたは非コード領域に対して(dsRNAのヌクレオチドが)少なくとも90パーセント、または95パーセントまたは100パーセント相補的であるdsRNAを非限定的に含む。90パーセント相補的とは、ヌクレオチド20個の長さのdsRNAに含有されmRNAの対応する部分とは対応する相補性がないヌクレオチドが2個以下であること意味する。本明細書中で用いるようなポリヌクレオチドのさらに別の例は、修飾または未修飾であり得る一本鎖mRNAを非限定的に含む。修飾されたmRNAは、少なくとも1つの修飾と、翻訳可能な領域とを含む。修飾は、骨格、核酸分子のヌクレオシド、および/または5'キャップ構造上に位置していてもよい。例えば、修飾はヌクレオシドに位置していてもよく(例えば、プソイドウリジンによるウリジン残基の置換)、または修飾はヌクレオシドおよび骨格連結の両方に位置していてもよい。典型的には、本発明の一定の組成物および方法に係るmRNAは、ヌクレオチドモノマー単位を300〜20,000個、ヌクレオチドモノマー単位を300〜15,000個、ヌクレオチドモノマー単位を300〜10,000個、ヌクレオチドモノマー単位を300〜5,000個、ヌクレオチドモノマー単位を300〜2000個、ヌクレオチドモノマー単位を300〜1,500個、およびヌクレオチドモノマー単位を300〜1000個含むものを含む。いくつかのバリエーションでは、本開示の組成物および方法に係るmRNAは、ヌクレオチドモノマー単位が少なくとも500個、少なくとも1,000個、少なくとも1,200個、または少なくとも1,500個ある。
ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドと比較して修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。修飾されたヌクレオチドは、糖部分中および/あるいはピリミジンまたはプリン塩基部分中に改変を有し得る。糖修飾は、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による1つまたは複数の水酸基の置換を含むか、または糖はエーテルまたはエステルとして官能化され得る。また、糖部分全体を、アザ-糖および炭素環式糖アナログなどの立体的および電子的に類似の構造体で置換し得る。塩基部分における修飾の例は、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、あるいは他の周知の複素環式置換体を含む。ヌクレオチドモノマー単位は、ホスホジエステル結合またはそのような連結のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル連結のアナログは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデートなどを含む。「ポリヌクレオチド」という語は、ポリアミド骨格に付着した天然に存在するかまたは修飾された核酸塩基を含むいわゆる「ペプチド核酸」も含む。
「ポリペプチド」は、天然にまたは合成的に産生されたかにかかわらずペプチド結合によって繋がったアミノ酸残基のポリマーである。アミノ酸残基が約50個より少ないポリペプチドは一般的に「ペプチド」と呼ばれる。
「タンパク質」は、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質はまた、炭水化物基などの非ペプチド成分を含んでいてもよい。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加されてもよく、細胞のタイプによって異なるであろう。タンパク質は、本明細書においてはそれらのアミノ酸骨格構造の点から規定され、炭水化物基などの置換基は概して特定していないが、存在していてもよい。
本明細書において記載のタンパク質に関して、SEQ ID NOによって特定されるものに対応するアミノ酸残基への言及は、そのような残基の翻訳後修飾物を含む。
本明細書において用いるように、「抗体」という語は、抗原に特異的に結合する任意の免疫グロブリンタンパク質ならびにその抗原結合フラグメントおよびその組換えバリアントを指す。したがって、「抗体」という語は、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2およびF(v)フラグメントなどのインタクトな抗体のパラトープを含有するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合抗体フラグメントを含む。キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖Fvフラグメント、一本鎖抗体、二機能性抗体、低分子抗体、直鎖状抗体、多価または多重特異性ハイブリッド抗体などの遺伝子組換えインタクト抗体およびフラグメントも含まれる。したがって、「抗体」という語は、抗体の抗原結合部位を含みかつその抗原に結合することができる任意のタンパク質を含むように広範に用いられる。いくつかの態様では、抗体は細胞表面分子に対して親和性を有する。
「遺伝子組換え抗体」という語は、アミノ酸配列が未改変の抗体のものから変化した抗体を意味する。抗体の生成における組換えDNA技術の関連性のため、天然の抗体に見出されるアミノ酸の配列に制限される必要はなく、所望の特性を得るために抗体を再設計し得る。可能なバリエーションは多く、アミノ酸を1個だけまたは数個変更することから、例えば可変または定常領域の完全な再設計までにわたる。定常領域における変更は、補体固定、細胞との相互作用および他のエフェクター機能などの特性を改善するかまたは改変するために概ね行われるであろう。典型的には、可変領域における変更は、抗原結合特性を改善するか、可変領域の安定性を改善するか、または免疫原性のリスクを低減するために行われるであろう。
「抗体の抗原結合部位」は、その抗原に結合するのに十分な抗体の部分である。最小限のそのような領域は、典型的には、可変ドメインまたはその遺伝子組換えバリアントである。単一ドメイン結合部位は、単一ドメイン抗体("dAb"; Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; US Patent No. 6,248,516 to Winter et al.を参照されたい)を産生するためのラクダ科動物抗体から(Muyldermans and Lauwereys, J. Mol. Recog. 12:131-140, 1999; Nguyen et al., EMBO J. 19:921-930, 2000を参照されたい)または他の種のVHドメインから作成され得る。一定のバリエーションでは、抗原結合部位は、天然または非天然(例えば、変異誘発された)に存在する重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインあるいはこれらの組み合わせの相補性決定領域(CDR)を2個のみ有するポリペプチド領域である(例えば、Pessi et al., Nature 362:367-369, 1993; Qiu et al., Nature Biotechnol. 25:921-929, 2007を参照されたい)。より一般的には、抗体の抗原結合部位は、共通のエピトープに結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方を含む。抗体の抗原結合部位を含む分子の例は当技術分野で公知であり、例えば、Fvフラグメント、一本鎖Fvフラグメント(scFv)、Fabフラグメント、二機能性抗体、低分子抗体、Fab-scFv融合物、二重特異性(scFv)4-IgG、および二重特異性(scFv)2-Fabを含む。(例えば、Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061, 1996; Atwell et al., Molecular Immunology 33: 1301-1312, 1996; Carter and Merchant, Curr. Opin. Biotechnol. 8:449-454, 1997; Zuo et al., Protein Engineering 13:361-367, 2000; and Lu et al., J. Immunol. Methods 267:213-226, 2002を参照されたい。)
本明細書において用いるように、「一本鎖Fv」および「一本鎖抗体」という語は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を単一のポリペプチド鎖内に含むが定常領域を欠く抗体フラグメントを指す。概ね、一本鎖抗体は、VHおよびVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは抗原結合を可能にする所望の構造を形成させることができる。一本鎖抗体は、例えば、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113 (Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 1994), pp.269-315においてPluckthunにより詳細に検討されている。(WIPO Publication WO 88/01649; U.S. Patent Nos. 4,946,778 および5,260,203; Bird et al., Science 242:423-426, 1988も参照されたい。)一本鎖抗体はまた、二重特異性および/またはヒト化であり得る。
「二重特異性抗体」は、2つの異なる重鎖/軽鎖対および2つの異なる結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、2つの異なる決定基に結合する単一のタンパク質を作製するための標準的技術として当技術分野において十分に確立されている。例えば、Kufer et al., Trends Biotechnol. 22:238-244, 2004を参照されたい。二重特異性抗体は、クアドローマ、 F(ab')2、4価のヘテロ二量体scFv、二重特異性scFv、タンデムscFv、二機能性抗体および低分子抗体フォーマット、あるいは抗体全体に付加したかまたは組換え融合したscFvを非限定的に含む多くの異なるフォーマットで作られてもよい。例えば、Kufer et al., 2004; Holliger and Hudson Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005; Morrison and Coloma, WO 95/09917を参照されたい。
本明細書中で用いられるように、「免疫原」は、免疫応答を誘導する実体(例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、または炭水化物)であり、これは自然または適応免疫応答(例えば、感染症または癌から対象を防護するもの)を含んでもよい。適応免疫応答は、体液性および/または細胞媒介性の免疫応答であり得る。一定の態様では、本開示の文脈における免疫原はワクチンとして用いられる。
本明細書において用いるように、「糖」という語は、例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類などの糖類を指す。典型的には、本明細書において用いる糖は、標的細胞または組織、または具体的な細胞のタイプにコポリマーを標的化させるかまたは送達し、かつ標的細胞との分子の会合を向上させる。例えば、肝臓の肝細胞はアシアロ糖タンパク(ASGP)受容体を含有する。したがって、肝細胞を標的とするためにガラクトース含有標的化基を用いてもよい。ガラクトース含有標的基の例は、ガラクトースまたはその保護アナログなどのガラクトース誘導体、N-アセチルガラクトサミン(NAG、GalNAcとも呼ばれる)またはその保護アナログなどのN-アセチルガラクトサミン誘導体、オリゴ糖、ならびにTyr-Glu-Glu-(アミノヘキシルGalNAc)3、リジンをベースとするガラクトースクラスター、およびコランをベースとするガラクトースクラスターなどのサッカライドクラスターを非限定的に含む。糖の別の例は、マンノースおよびその保護アナログなどのマンノース誘導体を非限定的に含む。いくつかのバリエーションでは、糖は、2つ以上の糖部分(例えば、3つまたは4つの部分)を含む多価構造である。いくつかのそのような多価糖の態様では、各部分は、リンカーを介して共通の分岐点に接続されている。例示的な多価糖は、NAG部分を3個有するトリ-N-アセチルガラクトサミン(tri-NAG)構造である。tri-NAG構造は、当技術分野において一般的に公知であり、例えば、Lee et al., Carbohydrates and Chemistry and Biology (B. Ernst, G.W. Hart, & P. Sinay, Eds., Wiley-WCH: Weinheim, 2000), Vol.4, p459 (およびこの中で引用される文献); Biessen et al., J. Med. Chem. 38:1538, 1995; Sliedregt et al., J. Med. Chem. 42:609, 1999; Rensen et al., J. Med. Chem. 47:5798, 2004; Khorev et al., Bioorg. Med. Chem. 16:5216, 2008に記載されている。別の例示的な多価糖は、マンノース-6-リン酸部分を2個有するビス-マンノース-6-リン酸(bis-M6P)構造である(例えば、ZhuらへのUS8,399,657を参照されたい)。
本明細書において用いるように、「ビタミン」という語は、生体の正常な成長および活動のために微量で必須である様々な脂溶性または水溶性有機物のいずれかを指す。例示的なビタミンは、ビタミンA(レチノール)、ビタミンB1(チアミン)、ビタミンC(アスコルビン酸)、ビタミンD(カルシフェロール)、ビタミンB2(リボフラビン)、ビタミンE(トコフェロール)、ビタミンB12(コバラミン)、ビタミンK1(フィロキノン)、ビタミンB5(パントテン酸)、ビタミンB7(ビオチン)、ビタミンB6(ピリドキシン)、ビタミンB3(ナイアシン)、ビタミンB9(葉酸)およびこれらの誘導体を含む。典型的には、本明細書において用いるビタミンは、標的細胞または組織、または具体的な細胞タイプに脂質ナノ粒子および/または膜不安定化ポリマーを標的化するかまたは送達し、かつ標的細胞との分子の会合を向上させる。本明細書において用いるビタミンの例は、葉酸、葉酸塩およびこれらの誘導体を含むビタミンB9を含む。
本明細書において用いるように、「標的化リガンド」は、対象の標的組織内の細胞などの標的細胞の表面の分子に特異的に結合することができる部分を指す。標的化部分に特異的に結合する分子(例えば、細胞表面分子)は、本明細書においては「結合パートナー」とも呼ばれる。
本明細書において用いるように、「アルキル」とは、炭化水素鎖の一部としてシクロアルキル基を有していてもよい(鎖の末端位置または非末端位置においてのいずれか)直鎖または分枝鎖の完全に飽和した(二重または三重結合がない)炭化水素(炭素および水素のみ)基を指す。本明細書におけるアルキル基は、炭素原子を主鎖に1〜10個および炭素原子を最大で20個まで含み、直鎖状または分枝鎖状であってもよい。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、ターシャリーブチル、ペンチルおよびヘキシルを非限定的に含む。本明細書において用いるように、「アルキル」は、他の基との結合のために解放された原子価が1つではなくむしろ2つ有する直鎖または分岐鎖の完全に飽和した炭化水素基を指す「アルキレン」基を含む。アルキレン基の例は、メチレン(-CH2-)、エチレン(-CH2CH2-)、プロピレン(-CH2CH2CH2-)、n-ブチレン(-CH2CH2CH2CH2-)、sec-ブチレン(-CH2CH2CH(CH3)-)などを含む。本開示のアルキル基は、1つまたは複数のフッ素基と任意で置換されていてもよい。
本明細書において用いるように、mおよびnが整数である「mC〜nC」、「Cm〜Cn」、または「Cm〜Cn」は、表示の基において可能性のある炭素原子の数を指す。すなわち、該基は炭素原子を包括的に「m」〜「n」個含有し得る。本開示のアルキル基は炭素原子を1〜18個含んでもよい、すなわちmが1であり、nが18である。もちろん、特定のアルキル基は、より限定的であってもよい。限定するものではないが一例を挙げると、本開示のアルキル基は、3〜8個の炭素原子からなっていてもよく、この場合には(3C-8C)アルキル基と称されるであろう。数は包括的であり表示された数の炭素原子を有する全ての直鎖または分枝鎖構造を包含する。限定するものではないが例えば、「1C〜4Cアルキル」または「(1C-4C)アルキル」基は、炭素原子を1〜4個有する全てのアルキル基、すなわちCH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、CH3CH(CH3)-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-、(CH3)2CHCH2-および(CH3)3CH-を指す。
本明細書において用いるように、「アリール」または「アリール基」という語は、環員を合計5〜14個有する置換されていてもよい単環式、二環式、および三環式環系を指し、系中の少なくとも1つの環は芳香族であり、系中の各環は環員を3〜7個含有する。単独でまたは別の基の一部として本明細書において用いる「アリール」または「ar」という語は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、置換フェニル、置換ビフェニルまたは置換ナフチルなどの、置換されていてもよい同素環式芳香族基、好ましくは環部分に炭素原子を6〜12個含有する単環式または二環式基を表す。フェニルおよび置換フェニルがより好ましいアリールである。
本明細書において用いるように、「ヘテロアルキル」という語は、骨格炭素原子の少なくとも1つがヘテロ原子で置換されたアルキル基を意味する。
本明細書において用いるように、「ヘテロアリール」という語は、環員の少なくとも1つがヘテロ原子であり、好ましくは各環に原子が5または6個のアリール基を意味する。ヘテロ芳香族基は、好ましくは、環内に酸素原子を1または2個、硫黄原子を1または2個、および/または窒素原子を1〜4個有し、炭素またはヘテロ原子を通じて分子の残りの部分に結合していてもよい。例示的なヘテロ芳香族は、フリル、チエニル、ピリジル、オキサゾリル、ピロリル、インドリル、キノリニル、またはイソキノリニルなどを含む。例示的な置換基は次の基の1つまたは複数を含む：ヒドロカルボニル、置換ヒドロカルボニル、ケト(すなわち=O)、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミド、アミノ、ニトロ、シアノ、チオール、ケタール、アセタール、エステルおよびエーテル。
本明細書において用いるように、「シクロアルキル」は、アルキル鎖の末端炭素原子が互いに共有結合したアルキル基を指す。数「m」および「n」は、形成された環中の炭素原子の数を指す。したがって、一例を挙げると、(3C-8C)シクロアルキル基は、3、4、5、6、7または8員環、すなわちシクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタンおよびシクロオクタンを意味する。本発明のシクロアルキル基は、1つもしくは複数のフッ素基および/または1つもしくは複数のアルキル基で任意で置換されていてもよい。
本明細書において用いるように、「ヘテロシクロアルキル」という語は、骨格炭素原子の少なくとも1つがヘテロ原子で置換されたシクロアルキル基を意味する。
本明細書において用いるように、「アルキニル」という語は、その中に炭素原子を2〜10個有し、少なくとも2個の炭素原子が三重結合によって互いに結合した不飽和直鎖炭化水素基を指す。
本明細書において用いるように、「アルケニル」という語は、その中に炭素原子を2〜10個有し、少なくとも2個の炭素原子が二重結合によって互いに結合した不飽和直鎖炭化水素基を指す。
アミンなどの官能基が「保護された」と記載されている場合、これは、保護された部位での望ましくない副反応を妨げるために該基が修飾形態であることを意味する。本開示のコポリマーのための好適な保護基は、当技術分野での技術水準を考慮したうえで、かつGreene, T. W. et al., Protective Groups in Organic Synthesis Wiley, New York (1991)などの標準的な教科書を参照して本願から認識されるであろう。カルボキシ基は、そのエステル、例えば、メチル、エチル、tert-ブチル、ベンジル、および4-ニトロベンジルエステルとして保護し得る。ヒドロキシ基は、そのエーテルまたはエステル、例えば、メトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、ベンジルエーテル、アセテートまたはベンゾエートとして保護し得る。メルカプト基は、チオエーテルまたはチオエステル、例えば、ピリジルチオエーテル、マレイミドチオエーテル、tert-ブチルチオエーテル、チオアセテートまたはチオベンゾエートとして保護し得る。アミノ基は、tert-ブトキシカルボニル誘導体などのカルバメート、またはアセトアミドおよびベンズアミドなどのアミドとして保護し得る。
当技術分野で周知のように、PEG分子量の表記法は、全体の分子量(PEG末端基を含む)または繰り返し単位の数を用い得る。例えば、PEG12は、PEG0.6kDaまたはPEG0.6kとしても公知である。PEG36は、PEG1.6kDaまたはPEG1.6kとしても公知である。PEG48は、PEG2.2kDaまたはPEG2.2kとしても公知である。PEG48の特定の形態は、PEG24-アミド-PEG24としても公知であるが、概してPEG2.2kDaまたはPEG2.2kとしても記載されている。
PEGMA4-5(ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、平均Mn=300)は、PEGMA0.3kDAまたはPEGMA0.3kまたはPEGMA300としても公知であり、これはPEGMA4とPEGMA5との混合物の平均分子量である。同様に、PEGMA7-9(ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、平均Mn=500)は、PEGMA0.5kDAまたはPEGMA0.5kまたはPEGMA500としても公知であり、これはPEG7とPEG9との混合物の平均分子量である。同様に、PEGMA17-19(ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、平均Mn=1000)は、PEGMA1kDAまたはPEGMA1kまたはPEGMA1000としても公知であり、これはPEGMA17とPEGMA19との混合物の平均分子量である。
本明細書において用いるように、「不安定な結合」は、選択的に切断することができる共有結合である。すなわち、不安定な結合は、他の共有結合の存在下で他の共有結合の切断を伴わずに切断されてもよい。例えば、ジスルフィド結合は、分子中に存在することもある炭素-炭素、炭素-酸素、炭素-硫黄、炭素-窒素結合などの他の結合の開裂を伴わずにチオールの存在下で切断することができる。不安定とはまた「開裂可能である」ことを意味する。
本明細書において用いるように、「不安定な連結」は、不安定な結合を含有し、2つの他の基の間にリンクまたはスペーサーを提供する化合物である。連結される基は、生物学的活性化合物、膜活性化合物、膜活性を阻害する化合物、機能性反応基、モノマー、および細胞標的化シグナルなどの化合物より選ばれてもよい。スペーサー基は、アルカン、アルケン、エステル、エーテル、グリセロール、アミド、糖類、多糖類、ならびに酸素、硫黄、または窒素などのヘテロ原子を含む群より選ばれる化学的部分を含有してもよい。スペーサーは、電子的に中性であってもよく、正または負電荷を備えていてもよく、あるいは全体としての電荷が中性、正または負である正および負電荷の両方を備えていてもよい。
本明細書において用いるように、「pH不安定」または「pH感受性」は、酸性条件下(pH<7)での共有結合の選択的切断、または共有結合が中性条件下よりも酸性条件下(pH<7)でより速く切断されることを指す。すなわち、pH不安定な結合は、切断されていない他の共有結合の存在下で酸性条件下で切断されてもよい。
本明細書において用いるように、「ミセル」はコアと親水性シェルとを含む粒子を含み、コアは少なくとも部分的に、主に、または実質的に、疎水性相互作用を通じて結びついている。一定の事例では、本明細書において用いるように、「ミセル」は、少なくとも2つのドメインという内側ドメインまたはコアと外側ドメインまたはシェルとを含む多成分ナノ粒子である。コアは、少なくとも部分的に、主に、または実質的に、疎水性相互作用によって結びついており、ミセルの中心に存在する。本明細書において用いるように、「ミセルのシェル」は、ミセルの非コア部分として規定される。
本明細書において用いるように、実質的にミセルのように挙動する場合には粒子またはアセンブリは「ミセル様」であり：(1)これは、水混和性溶媒(非限定的にはエタノールなど)から水性溶媒(リン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4)への希釈の際に組織化されたアセンブリ(例えば、ミセル)を形成するブロックコポリマーの自発的な自己会合によって形成され；(2)これは、希釈(例えば、臨界安定性濃度または臨界ミセル濃度(CMC)を構成する100μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、5μg/mlまたは1μg/mlのポリマー濃度までの低下)に対して安定であり；かつ/または(3)ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMS)、およびジオキサンを非限定的に含む有機溶媒の濃度が上昇するにつれて不安定さが増す。
対象に脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーを投与することによって細胞内に治療または診断剤を送達するための本明細書に記載の方法の文脈における「有効量」という語は、脂質ナノ粒子の量および膜不安定化ポリマーの量を合わせて標的細胞または標的組織の細胞質ゾルへの治療または診断剤の検出可能な送達を達成するのに十分な量を指す。本明細書における「細胞質ゾル」への治療または診断剤の送達に対する言及は、細胞質ゾルへのその送達に続いて細胞の核に最終的に標的化させることがあるそのような治療または診断剤の送達を含む。
本明細書に記載の対象に脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーを投与することによる疾患の治療の文脈における「有効量」または「治療有効量」という語は、脂質ナノ粒子(治療剤を含む)および膜不安定化ポリマーの量を合わせて対象における疾患の1つもしくは複数の症状の発生を抑制するかまたは症状を緩和するのに十分な量を指す。有効量の薬剤含有脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは「有効な投与計画」で本方法に従って投与される。「有効な投与計画」という語は、投与されている薬剤含有脂質ナノ粒子と、投与されている膜不安定化ポリマーと、疾患の治療または予防を達成するのに適した投薬頻度との組合せを指す。
本明細書において記載のインビボでの治療または診断剤の送達の文脈における「患者」または「対象」という語は、ヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
パーセント配列同一性は従来の方法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603, 1986, and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1992を参照されたい。例えば、10のギャップオープニングペナルティ、1のギャップエクステンションペナルティ、および前記Henikoff and Henikoffの「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを用いて、アライメントスコアを最適化するように2つのアミノ酸配列を整列し得る。次いでパーセント同一性は次のように計算される：([完全な一致の総数]/[長いほうの配列の長さプラス2つの配列を整列させるために長いほうの配列に導入したギャップの数])(100)。当業者であれば、2つのアミノ酸配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識している。Pearson and Lipman (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444,1988およびPearsonによるMeth. Enzytnol. 183:63、1990)の「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書において開示するアミノ酸配列と第2のアミノ酸配列とによって共有される同一性の度合いを調べるための好適なタンパク質アライメント法である。
そのような値が「約」Xまたは「およそ」Xとして表される場合には、Xの記載値は±10％まで正確であると理解されるであろう。
図1Aおよび1Bは、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)をコードするmRNAで処置した高アンモニア血症OTC-spfashマウスにおけるオロチン酸(OA)および血漿アンモニアレベルの減少を示す。高アンモニア血症は、AAV2/8ベクター/OTC shRNAでの処置によってOTC-spfashマウスに誘導し、AAV投薬の4日後に、N:P 7 + 50mg/kg P67の同時注入にてDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k(50:32:16:2)に処方した1mg/kgのOTC mRNAで週2回処置した。実施例21を参照されたい。6日目および13日目(AAV処置後)に採取した尿の、クレアチンレベルに対してノーマライズしたOAレベルを調べ、13日目に採取した血漿のアンモニアレベルを調べた。オロチン酸レベルを図1Aに示す(黒塗り=6日目；斜線=13日目)。 図1Aおよび1Bは、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)をコードするmRNAで処置した高アンモニア血症OTC-spfashマウスにおけるオロチン酸(OA)および血漿アンモニアレベルの減少を示す。高アンモニア血症は、AAV2/8ベクター/OTC shRNAでの処置によってOTC-spfashマウスに誘導し、AAV投薬の4日後に、N:P 7 + 50mg/kg P67の同時注入にてDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k(50:32:16:2)に処方した1mg/kgのOTC mRNAで週2回処置した。実施例21を参照されたい。6日目および13日目(AAV処置後)に採取した尿の、クレアチンレベルに対してノーマライズしたOAレベルを調べ、13日目に採取した血漿のアンモニアレベルを調べた。血漿アンモニアレベルを図1Bに示す。 図2Aおよび2Bは、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)をコードするmRNAで処置した高アンモニア血症OTC-spfashマウスにおけるオロチン酸(OA)および血漿アンモニアレベルの減少を示す。高アンモニア血症は、AAV2/8ベクター/OTC shRNAでの処置によってOTC-spfashマウスに誘導し、AAV投薬の4日後に、N:P 7 + 35mg/kgのP82の同時注入にて、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k(50:32:8:10)に処方した1mg/kgのOTC mRNAで週2回処置した。実施例21を参照されたい。6日目および13日目(AAV処置後)に採取した尿の、クレアチンレベルに対してノーマライズしたOAレベルを調べ、13日目に採取した血漿のアンモニアレベルを調べた。オロチン酸レベルを図2Aに示す(黒塗り=6日目;斜線=13日目)。 図2Aおよび2Bは、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)をコードするmRNAで処置した高アンモニア血症OTC-spfashマウスにおけるオロチン酸(OA)および血漿アンモニアレベルの減少を示す。高アンモニア血症は、AAV2/8ベクター/OTC shRNAでの処置によってOTC-spfashマウスに誘導し、AAV投薬の4日後に、N:P 7 + 35mg/kgのP82の同時注入にて、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k(50:32:8:10)に処方した1mg/kgのOTC mRNAで週2回処置した。実施例21を参照されたい。6日目および13日目(AAV処置後)に採取した尿の、クレアチンレベルに対してノーマライズしたOAレベルを調べ、13日目に採取した血漿のアンモニアレベルを調べた。血漿アンモニアレベルを図2Bに示す。 図3は、本開示の態様に係る膜不安定化ポリマーおよびLNP担体を用いた標的細胞の細胞質ゾルへのmRNAの送達のための提案する作用機序を模式的に示す。(A)2つの別個のナノ粒子溶液を調製する：膜不安定化ポリマーを含有する一方のナノ粒子およびmRNAを含むLNPである第2のナノ粒子。(B)次いで、2つのナノ粒子溶液をインビボ投与の直前に混合する。(C)理論に拘束されるものではないが、ポリマーおよびmRNA/LNPナノ粒子は、標的細胞の同じ細胞内小胞(例えば、エンドソーム)内に共存すると考えられ、ここで(D)膜不安定化ポリマーは、タンパク質への翻訳のために細胞質ゾルへのmRNAの放出を引き起こす。
発明の説明
本発明は、標的細胞の細胞質ゾルへの治療または診断剤のインビボ送達(例えば、標的組織内の複数の標的細胞への薬剤のインビボ細胞質ゾル送達)のための方法、組成物、および送達システムに向けられる。本方法、組成物、および送達システムは、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、および小分子を含む広範な分子薬剤の細胞内送達のために用いられてもよく、したがって、例えば、癌、感染性疾患、およびタンパク質欠損を特徴とする疾患の治療を含む様々な診断および治療用途を有する。
本発明は、とりわけ、治療または診断剤の送達のために用いられる製剤に関する。概して、治療または診断剤は、脂質ナノ粒子(「LNP」、例えばリポソーム)中に処方され、膜不安定化ポリマーは製剤に添加されるか(LNPおよびポリマーの同時注入のための合剤)、またはLNP「担体」製剤および膜不安定化ポリマーは対象への別個の(例えば逐次的な)注入を介して別々に用いられる。LNPおよび膜不安定化ポリマーの一方または両方は、所望の細胞標的の表面の分子に結合する標的化リガンドを含んでもよい。一定の別の態様では、LNPおよび膜不安定化ポリマーのいずれも標的化リガンドを有さない。脂質ナノ粒子の機能は、治療または診断剤を封入して、体循環の様々な成分とのその相互作用を防止しかつ所望の組織および細胞への送達および取り込みを促進することである。脂質ナノ粒子はエンドソームの溶解に関与することもある。理論に拘束されるものではないが、膜不安定化ポリマーは、おそらくはエンドソームからのLNPのエンドソーム脱出を改善することによって、標的細胞の細胞質ゾルへの治療または診断剤の送達を誘発するかまたは向上する薬剤として機能すると考えられる。例えば、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、標的細胞内の細胞内小胞に共存してもよく、ここで膜不安定化ポリマーは小胞膜を破壊することによって治療または診断剤の放出を促進してもよい。本明細書において実施例に示すように、LNPと膜不安定化ポリマーとの組み合わせは、LNP単独の使用と比較して、送達された薬剤(同時注入または逐次注入のいずれかを用いた)の活性の向上を実証した。下記の実施例1、2、18、および20を参照されたい。再び理論に拘束されるものではないが、この結果はポリマーがLNP担体と組み合わせて用いられた際の標的細胞への薬剤の送達の向上によるものと考えられる。
よって、一局面では、本発明は、標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための方法を提供する。方法は、(a)治療または診断剤を含む有効量の脂質ナノ粒子と(b)有効量の膜不安定化ポリマーとを対象に投与し、治療または診断剤が標的細胞の細胞質ゾルに送達される工程を概して含む。方法のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む。
別の態様では、本発明は、標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための組成物を提供する。組成物は、(a)治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子と(b)膜不安定化ポリマーとを概して含む。組成物のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む。そのような組成物は、本明細書において記載の送達方法の一定の態様、特に、膜不安定化ポリマーと治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子との同時注入を含む態様で用いてもよい。
別の態様では、本発明は、標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための送達システムを提供する。送達システムは、(a)治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子を含む担体組成物と(b)膜不安定化ポリマーを含むエンハンサー組成物とを概して含む。送達システムのいくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む。そのような送達システムは、本明細書において記載の送達方法の一定の態様、特に、膜不安定化ポリマーと治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子との別々の(例えば逐次的な)注入を含む態様で用いてもよい。
別の態様では、本発明は、本明細書において記載の膜不安定化ポリマーを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書において記載の脂質ナノ粒子を提供する。
典型的には、本開示に従って膜不安定化ポリマーが脂質ナノ粒子製剤に添加される場合(例えば(a)治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子と(b)膜不安定化ポリマーとを含む組成物を作るために)、ポリマーは脂質ナノ粒子内には含有されない。本明細書において開示される様々な局面の一定の態様では、膜不安定化ポリマーは、脂質ナノ粒子と組成的に区別されるナノ粒子を形成する。例えば、膜不安定化ポリマーが親水性および疎水性セグメントを含むポリマーである場合は、ポリマーは水溶液中にミセルまたはミセル様粒子を形成してもよい。
広範な治療および診断剤が一般的に公知であり、本方法、組成物、および送達システムに従って用いられてもよい。送達される治療または診断剤は、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子であり得る。好適なクラスの治療剤は、例えば、抗癌剤、抗感染剤(例えば抗ウイルスまたは抗菌剤)、免疫調節剤(例えば免疫抑制または免疫刺激剤)、抗炎症剤、または細胞代謝活性を調節する薬剤を含む。好適な診断剤は、単独で、または診断法において有用な所望の特性(例えば所望の細胞内標的に対する結合特異性)を有する別の分子(例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子)に対するコンジュゲート(標識)として用いられてもよい様々な検出可能な薬剤などを含む。本発明で用いることができる一般的なクラスの標識は、放射性同位体、常磁性同位体、陽電子放射断層撮影法(PET)によって画像化することができる化合物、蛍光または着色化合物、磁気共鳴によって画像化することができる化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、および他の画像化試薬を非限定的に含む。
薬物送達のために脂質ナノ粒子を処方するための方法は、当技術分野で一般的に公知であり、本発明の文脈における使用に向けて適合させてもよい。例えば、小分子RNAの送達のための脂質ナノ粒子製剤は、例えば、Hong and Nam, Theranostics 4:1211-1232, 2014; Asai and Oku, Biol. Pharm. Bull. 37:201-205, 2014; and Tam et al., Pharmaceutics 5:498-507, 2013で検討されている。薬物送達のための脂質粒子製剤および脂質設計も、例えば、Samad et al., Current Drug Delivery 4:297-305, 2007; Martin et al., Current Pharmaceutical Design 11:375-394, 2005; Hafez et al., Biophysical Journal 79:1438-1446, 2000; Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed. 51:8529-8533, 2012; Li and Schick, Biophysical Journal 80:1703-1711, 2001; Adami et al., Molecular Therapy 19:1141-1151, 2011); Dabkowska et al., J. R. Soc. Interface 9:548-561, 2012; Gubernator, Expert Opinion on Drug Delivery 8:565-80, 2011; Whitehead et al., Nat. Commun. 5:4277, 2014; and Dong et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 111:3955-60, 2014に検討されている。
ポリヌクレオチド剤を含むLNP製剤には、脂質ナノ粒子は、とりわけ静電相互作用を介してポリヌクレオチドと複合体化するのに有用な1つまたは複数のカチオン性脂質を含む。脂質ナノ粒子は、製造および保存安定性ならびに生体内分布の調節を助けるなどの様々な目的を果たす場合がある追加の脂質をさらに含んでいてもよい。生体内分布はまた、脂質ナノ粒子の脂質部分にコンジュゲートした標的化リガンドの取り込みによって調節されてもよい。ポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子は、約1〜約30の範囲のN:P比で典型的には処方される。より具体的なバリエーションでは、N:P比は、約1〜約14、約1〜約7、または約3〜約7(例えば、約3、約3.5、または約7のN:P比)である。
一定の態様では、脂質ナノ粒子を形成するためのカチオン性脂質は第4級アミンを含み、それゆえ永続的に正電荷を有する。ポリヌクレオチドLNP製剤で用いてもよい特に好適な永続的に電荷を有するカチオン性脂質は、例えば、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOEPC)、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DLEPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMEPC)、1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1)、N1-[2-((1S)-1-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4-[ジ(3-アミノプロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]-3,4-ジ[オレイルオキシ]-ベンズアミド(MVL5)、ジオクタデシルアミド-グリシルスペルミン(DOGS)、3b-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、SAINT-2,N-メチル-4-(ジオレイル)メチルピリジニウムなどのsaint脂質、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、1,2-ジオレオイルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド(DORI)、ジアルキル化アミノ酸(DILA2)(例えば、C18:1-norArg-C16)、ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(POEPC)、1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(MOEPC)、および(R)-N,N,N-トリメチル-4,5-ビス(オレオイルオキシ)ペンタン-1-アミニウムクロリド(DOTAPen)を含む。第一級アミン(例えばDODAG N',N'-ジオクタデシル-N-4,8-ジアザ-10-アミノデカノイルグリシンアミド）およびグアニジニウム頭部基(例えば、ビス-グアニジニウム-スペルミジン-コレステロール(BGSC)、ビス-グアニジニウムトレン-コレステロール(BGTC)、PONA、および(R)-5-グアニジノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩(DOPen-G))などの生理的pHで電荷を有する頭部基を持つカチオン性脂質も好適である。さらに別の好適なカチオン性脂質は、(R)-5-(ジメチルアミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩(DODAPen-Cl)である。一定の態様では、カチオン性脂質は、具体的なエナンチオマーまたはラセミ形態であり、上記のカチオン性脂質の様々な塩形態(例えば塩化物または硫酸塩)を含む。例えば、いくつかの態様では、カチオン性脂質は、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP-Cl)またはN-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムサルフェート(DOTAP-硫酸塩)である。
一定のバリエーションでは、脂質ナノ粒子を形成するためのカチオン性脂質は、アミノ酸の側鎖を頭部基として利用し、ここでα-アミノおよびα-カルボキシル基は疎水性尾部のための付着部位として働く(「DiLA2」アーキテクチャとも呼ばれる; Adami et al., Molecular Therapy 19:1141-1151, 2011を参照されたい)。DiLA2構造を有するカチオン性脂質の特定のバリアントは、C18:1-norArg-C16である。前記Adami et alを参照されたい。
典型的には、上記のカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子は1つまたは複数の追加の脂質を含む。脂質ナノ粒子に組み込むのに好適な追加の脂質は、アニオン性脂質、中性ヘルパー脂質、およびPEGコンジュゲート脂質(本明細書においては「PEG-脂質」とも呼ばれる)の1つまたは複数を含んでもよい。したがって、一定の態様では、上記のカチオン性脂質と、アニオン性脂質、ヘルパー脂質およびPEG-脂質の群より選択される1つまたは複数の追加の脂質とを含む脂質ナノ粒子が提供される。
カチオン性脂質含有LNP製剤における使用のためのアニオン性脂質は、典型的にはイオン化可能なアニオン性脂質である。アニオン性脂質のpKaを超えるpH値では負電荷を有している一方で、イオン化可能なアニオン性脂質は、LNP中の他の脂質を概して安定化しかつ二重層小胞の形成を可能にするが、細胞の酸性エンドソーム環境においてなどでは、pHがpKaに向かって低下するにつれてこれらの小胞の融合を促進する。好適なイオン化可能なアニオン性脂質は、コレステリルヘミサクシネート(CHEMS)、ホスファチジルセリン、パルミトイルホモセリン、およびα-トコフェロールヘミサクシネートを含む。
ヘルパー脂質は、安定なリポソーム分散液を作るのを助ける中性脂質であり、カチオン性脂質をベースとする送達製剤の有効性を高めることもある。コレステロール(CHOL)は、脂質ナノ粒子製剤における使用に特に好適なヘルパー脂質の1つである。好適なヘルパー脂質はまた、例えば、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、または天然スフィンゴミエリン(SM)および1-オレオイル-2-コレステリル-ヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)などのその合成誘導体などの任意の関連するホスファチジルコリンなどの双性イオン性脂質を含む。他の好適なヘルパー脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DLPE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPHyPE)を含む。
いくつかの態様では、LNPは、例えばポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーで修飾された非荷電脂質(本明細書では「PEG-脂質」とも呼ばれる)を含む。そのようなPEG-脂質は、概して、その製造中のナノ粒子の集合を助け、脂質ナノ粒子を安定化させ、その凝集を回避し、血清タンパク質、オプソニンおよびRBCとのその相互作用を防止する。ポリエチレングリコール(PEG)のサイズは、およそ1からおよそ5kDaまで異なり得る。製剤中のこれらの分子の相対量および炭化水素鎖の長さに依存して、PEG-脂質は製剤の薬剤動態学的特性、生体内分布、および有効性に影響を及ぼし得る。炭素が約14個の比較的短い脂質炭化水素鎖を有するPEG-脂質は、1時間より短い半減期で血漿中においてインビボでLNPから解離する。対照的に、炭素が約18個の比較的長い脂質炭化水素鎖長を有するPEG-脂質は、数日間製剤と完全に会合して循環する。したがって、典型的な態様では、PEG-脂質は、炭素原子が12〜20個、炭素原子が14〜18個、または炭素原子が14個の脂質炭化水素鎖を含む。典型的には、PEG-脂質の濃度は約0.5〜10モル％である。好適なPEG修飾脂質の例は、PEG化セラミドコンジュゲートおよびPEG化ジステアロイルホスファチジル-エタノールアミン(PEG-DSPE)を含む。脂質ナノ粒子を安定化するために用いることができる他の化合物は、ガングリオシド(GMt、GM3など)を含む。好ましいPEG-脂質は、約1〜約5kDaの範囲のPEGサイズを有し、好ましいサイズ範囲は約2〜約5kDaである。具体例は、メトキシ-ポリエチレングリコール-カルバモイル-ジミリスチルオキシ-プロピルアミン(PEG2000-c-DMA)、α-(3'-(1,2-ジミリストイル-3-プロパノキシ)-カルボキサミド-プロピル]-ω-メトキシ-ポリオキシエチレン(PEG2000-c-DOMG)、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE-PEG2,000)、ポリエチレングリコール-ジミリストールグリセロール(PEG-DMG)、およびN-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]}(C8 PEG2000セラミド)を含む。nが350、500、750、1000または2000であるDMPE-PEGnのいくつかのバリエーションでは、PEG-脂質は、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE-PEG2,000)である。nが350、500、750、1000または2000であるDSPE-PEGnのいくつかのバリエーションでは、PEG-脂質は、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE-PEG2,000)である。いくつかの態様では、PEG-脂質は、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する標的リガンド(例えばN-アセチルガラクトサミン(NAG)糖残基)にコンジュゲートし、そのようなPEG-脂質は本明細書においてさらに記載するように標的リガンドを含む脂質ナノ粒子を処方するために特に有用である。NAG部分を含む例示的なPEG-脂質は、DSPE-PEG2k-NAGである(例えば下記の実施例19および22を参照されたい)。
一定の態様では、上記の脂質ナノ粒子は、任意の典型的には永続的に電荷を有するカチオン性脂質の代わりに、イオン化可能なカチオン性脂質を含む。イオン化可能なカチオン性脂質は、典型的には生理的pH(例えばpH7.4)以下のpHで脂質が正電荷を有し、かつ第2のpH、好ましくは生理的pH以上で中性であるように、少なくとも1つのプロトン化可能または脱プロトン化可能な基を有する。pHの関数としてのプロトンの添加または除去は平衡プロセスであること、および電荷を有するかまたは中性の脂質への言及は主たる種の性質を指し、脂質の全てが電荷を有するかまたは中性の形態で存在する必要はないことが理解されるであろう。一定の態様では、イオン化可能なカチオン性脂質は、プロトン化可能な基のpKaが約4〜約11の範囲である。これらの脂質はより低いpHの処方段階ではカチオン性であるが粒子はpH7.4付近の生理的pHでは大部分(完全にではない)が表面中和されているので、約4〜約7のpKaが最も好ましい。このpKaのメリットの1つは、粒子の外表面に会合した少なくとも一部の核酸が生理的pHでその静電相互作用を失い、簡単な透析によって除去されるので、クリアランスに対する粒子の影響の受けやすさを大幅に低減させる。本発明に係る使用のために好適なイオン化可能なカチオン性脂質は、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2-ジリノレイル-4-(2ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA)、1,2-ジオレオイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DODAP)、1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、モルホリノコレステロール(Mo-CHOL)、C12-200などのリピドイド(Love et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:1864-9, 2010を参照されたい)、cKK-E12などのリポペプチド型化合物(Dong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:3955-60, 2014)、およびAIC-0217およびAIC-0218(Acuitas Therapeutics, Vancouver, BC)などの脂質を含む。他の適切なイオン化可能なカチオン性脂質は、例えば、本明細書において先に記載したカチオン性脂質構造に由来する場合がある。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子組成物は、脂質と、任意のポリマー(例えばPEG)成分を含むがポリヌクレオチド(例えばRNA)成分は含まない送達促進成分との総量の約0.5％〜約70％(モル％)である1つまたは複数のカチオン性脂質を含有する。より特定のバリエーションでは、脂質ナノ粒子組成物は、1つもしくは複数のカチオン性脂質を約10％〜約55％、1つもしくは複数のカチオン性脂質を約15％〜約35％、または1つもしくは複数のカチオン性脂質を約35％〜約55％含有する。
一定の態様では、脂質ナノ粒子組成物は1つまたは複数の非カチオン性脂質を含有し、ここで非カチオン性脂質は、脂質と、任意のポリマー(例えばPEG)成分を含むがポリヌクレオチド(例えばRNA)成分は含まない送達促進成分との総量の約2％〜約95％(モル％)である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子組成物は、1つまたは複数の非カチオン性脂質を約20％〜約75％、約45％〜約75％、または約45％〜約55％含有する。他のバリエーションでは、脂質ナノ粒子組成物は、1つまたは複数の非カチオン性脂質を約10％〜約50％含有する。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子組成物は1つまたは複数のポリマー脂質(例えばPEG-脂質)を含有し、ここでポリマー脂質は、脂質と、任意のポリマー(例えばPEG)成分を含むがポリヌクレオチド(例えばRNA)成分は含まない送達促進成分との総量の約0.2％〜約20％(モル％)である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子組成物は、組成物のうち、1つもしくは複数のポリマー脂質を約0.5％〜約10％、または1つもしくは複数のポリマー脂質を約1％〜約5％含有する。
小分子薬剤を含む脂質ナノ粒子製剤も公知である。例えば、Gubernator, Expert Opinion on Drug Delivery 8:565-80, 2011を参照されたい。例えば、小分子は、例えばDSPC:CHOL:DSPE-PEG(50:45:5モル％)リポソームに受動的または能動的充填法を用いて封入し得る。基本的に、受動的充填法には、脂質は有機溶媒に溶解され、次いで溶媒を蒸発させて薄い脂質フィルムを形成し、これを、封入すべき親水性または疎水性の薬物を含有する水溶液で水和する。リポソーム混合物を次いで、典型的には、ボルテックスによって均質化し、粒子サイズを小さくするために(例えば約100nmまで)ポリカーボネート膜を通じて押し出す。封入されなかった薬物は、透析またはカラム濾過を用いて除去し得る。
イオン化可能な小分子は、リポソームに能動的に閉じ込められる(遠隔充填法)。典型的には、この特定の場合では、薬物は、予め形成されたリポソームの内部でプロトン化されるかまたは析出し、リポソームコアに捕捉されたままになる。典型的には、イオン化可能な小分子を封入するために、リポソームの内側区画と外側区画との間に1〜3のpH単位の差があるpH勾配(酢酸塩、クエン酸塩または硫酸アンモニウム)が用いられる。薬物をリポソームに能動的に充填するために金属勾配(Cu2+、Mn2+またはMg2+勾配)を用いることもできる。K+、Mn2+またはMg2+を用いてリポソーム中にpH勾配を作り出すためにA23187などのイオノフォアも用い得る。リポソーム内部に小分子を能動的に捕捉するためにEDTA勾配法も用い得る。遠隔充填法では、単純な脂質膜水和技術(例えば、水和緩衝液が脂質二重層にわたって勾配を作り出すために必要な溶質を含有することを除いて受動的捕捉法について上に記載したような)によって典型的に形成される。封入されていない溶質は、透析またはカラム濾過によって典型的に除去される。リポソームの形成およびリポソーム二重層全体にわたる勾配の確立に続いて、プロトン化されていない薬物はリポソームの外側の充填緩衝液に添加され、脂質二重層を通過し得、リポソーム内部でプロトン化され、次いでリポソームの内部水性区画に存在するアニオンによって安定化される。薬物の充填を速めるために、リポソーム脂質の相転移温度より上で懸濁液を保温する必要がある場合がある。封入されていない遊離薬物は、透析によるかまたはイオン交換クロマトグラフィーによって除去し得る。
タンパク質またはペプチド治療法のための脂質ナノ粒子製剤も一般的に公知である。いくつかの態様では、タンパク質性薬剤は、脂質膜水和法によってリポソームに組み込まれる。例えば、タンパク質は、例えば、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コレステロール、ナトリウムコレステロール-3-サルフェートおよびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-N-PEG2000(DSPE-PEG[2000])からなるPEG化リポソームに組み込まれていてもよい。そのような処方法は、リポソームに組み込まれたtPAに対して実質的に薬剤動態を向上することが示された。Kim et al., Biomaterials 30:5751-5756, 2009を参照されたい。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子組成物は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびPEG-脂質を含む。そのようなLNP脂質成分の混合物は、式[カチオン性脂質]w:[アニオン性脂質]x:[ヘルパー脂質]y:[PEG-脂質]zで表し得、式中、下付き文字w、x、y、およびzは混合物内の各脂質成分のモル％を示す(LNPの治療または診断剤成分(例えばポリヌクレオチド)を含まない)。この式は、代替的には[カチオン性脂質]:[アニオン性脂質]:[ヘルパー脂質]:[PEG-脂質](w:x:y:z)で示し得、式中w、x、y、およびzはそれぞれカチオン性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびPEG-脂質のモル％を示す。様々な態様では、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびPEG-脂質のそれぞれは、本明細書において開示する例示的な脂質より選択される。いくつかの態様では、wは、約10〜約70、約30〜約60、または約35〜約55であり；xは、0〜約60、0〜約50、約10〜約50、または約20〜約45であり；yは、約5〜約40、約5〜約30、または約5〜約20であり；zは、約1〜約20、約2〜約20、または約5〜約15である。例えば、約50モル％で存在するカチオン性脂質DOTAP、約32モル％で存在するアニオン性脂質CHEMS、約8モル％で存在するヘルパー脂質CHOL、および約10モル％で存在するPEG-脂質DMPE-PEG2kを有する脂質混合物は、DOTAP50:CHEMS32:CHOL8:DMPE-PEG2k10としてまたはDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k(50:32:8:10)として表し得る。
具体的な態様では、本発明に係る使用のための脂質ナノ粒子は、(i)約30モル％〜約60モル％のカチオン性脂質と；(ii)0モル％〜約50モル％のアニオン性脂質と；(iii)約1モル％〜約50モル％のヘルパー脂質と；(iv)約1モル％〜約20モル％のPEG-脂質とを含む、脂質成分の混合物を含む。典型的には、カチオン性脂質は、生理的pHで永続的に電荷を有するカチオン性脂質(例えばDOTAP)である。存在する場合には、アニオン性脂質は、典型的には、例えばCHEMSなどのイオン化可能なアニオン性脂質である。そのような態様で使用するための特に好適なヘルパー脂質はコレステロール(CHOL)であり、特に好適なPEG-脂質はDSPE-PEG2kおよびDMPE-PEG2kを含む。存在する場合には、アニオン性脂質に対して過剰のカチオン性脂質が好ましい。いくつかのバリエーションでは、(i)カチオン性脂質(例えばDOTAP)は、脂質混合物中に約35モル％〜約55モル％、約40モル％〜約55モル％、約45モル％〜約55モル％、または約40モル％〜約50モル％存在し；(ii)アニオン性脂質(例えばCHEMS)は、脂質混合物中に0モル％〜約45モル％、約10モル％〜約45モル％、約20モル％〜約45モル％、約30モル％〜約45モル％、または約30モル％〜約40モル％存在し；(iii)ヘルパー脂質(例えばCHOL)は、脂質混合物中に約5モル％〜約50モル％、約5モル％〜約40モル％、約5モル％〜約30モル％、約5モル％〜約20モル％、または約5モル％〜約10モル％存在し；かつ(iv)PEG-脂質(例えばDSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2k)は、脂質混合物中に約1モル％〜約5モル％、約2モル％〜約20モル％、約2モル％〜約15モル％、約2モル％〜約10モル％、約5モル％〜約20モル％、約5モル％〜約15モル％、または約5モル％〜約10モル％存在する。いくつかの好ましい態様では、PEG-脂質は、脂質混合物中に5より大きいモル％(例えば、5より大きいモル％から約20モル％まで、約15モル％まで、または約10モル％まで)で存在し；いくつかのそのような態様では、PEG-脂質は、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、または少なくとも約10モル％で存在する。アニオン性脂質が存在しない上記のLNP組成物のいくつかの態様では、カチオン性脂質(例えばDOTAP)は、脂質混合物中に約35モル％〜約45モル％存在し；ヘルパー脂質(例えばCHOL)は、脂質混合物中に約40モル％〜約50モル％存在し；かつPEG-脂質(例えばDSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2k)は、脂質混合物中に約5モル％〜約15モル％存在し；いくつかのそのような態様では、[カチオン性脂質]:[ヘルパー脂質]:[PEG-脂質]のモル比は約40:50:10である。アニオン性脂質が存在する上記のLNP組成物の別の態様では、カチオン性脂質(例えばDOTAP)は、脂質混合物中に約40モル％〜約55モル％存在し；アニオン性脂質(例えばCHEMS)は、脂質混合物中に約25モル％〜約40モル％存在し；ヘルパー脂質(例えばCHOL)は、脂質混合物中に約5モル％〜約20モル％存在し；かつPEG-脂質(例えばDSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2k)は、脂質混合物中に約2モル％〜約15モル％、約2モル％〜約10モル％、または約5モル％〜約15モル％存在し、いくつかのそのような態様では、[カチオン性脂質]:[アニオン性脂質]:[ヘルパー脂質]:[PEG-脂質]のモル比は約50:32:16:2または約50:32:8:10である。より具体的なバリエーションでは、LNP組成物は、(a)DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k(50:32:16:2)；(b)DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k(50:32:8:10)；(c)DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k(50:32:8:10)；および(d)DOTAP:CHOL:DSPE-PEG2k(40:50:10)より選択される脂質成分の混合物(成分のモル比は括弧内に特定する)を含む。上に記載の脂質成分の混合物は、例えばmRNAなどのポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子組成物に特に好適である。PEG-脂質含有量が多い(例えば5より大きいモル％、例えば約10％など)LNPは、ポリヌクレオチド(例えばmRNA)送達のためのいくつかの好ましい態様を表し、本明細書において記載の実験によって示されるように、より多いPEG-脂質含有量は、インビボでの細胞へのポリヌクレオチドの送達のための方法では特に有効であった。例えば実施例20を参照されたい。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子はサイズが約200nmより小さい。例えば、脂質ナノ粒子はサイズが約30nm〜約150nmであってもよい。一定のバリエーションでは、脂質ナノ粒子のサイズ(例えば約30nm〜約150nmの間)は、向上した浸透および保持効果によって肝臓への送達を促進する。脂質ナノ粒子は、粒子を所望の組織に標的化させる標的化リガンドをさらに含んでいてもよい。脂質ナノ粒子は正又は負のゼータ電位を有してもよく、いくつかのバリエーションでは、脂質ナノ粒子のゼータ電位は実質的に中性である。
本発明によれば、膜不安定化ポリマーは、対象への同時注入のために、治療または診断剤を含有する脂質ナノ粒子と同時に処方されるか、またはLNPと膜不安定化ポリマーとの別々の注入(例えば逐次注入)のために別々に処方される。典型的には、同時注入のバリエーションには、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーはまず別々の組成物として処方され、次いで投与前(典型的には、投与前の1時間以内、より典型的には投与前の30分以内、好ましくは投与前の15分以内または5分以内)に単一の組成物へと混合される。膜不安定化ポリマーは、巨大分子もしくは生体分子、または小分子が細胞に入るかもしくは細胞小胞(例えばエンドソームもしくはリソソーム)を出るように細胞膜構造(例えばエンドソーム膜)における透過性の変化を誘発する。様々な膜不安定化ポリマーが当技術分野で一般的に公知であり、本明細書において記載の本方法に従って用いてもよい。公知のタイプの膜不安定化ポリマーは、例えば、両親媒性コポリマー、ポリカチオン性または両親媒性ペプチド、膜活性毒素、およびウイルス融合ペプチドなどのコポリマーを含む。特定のタイプの特に好適な膜不安定化ポリマーは、例えば、International PCT Application Publication Nos. WO 2009/140427およびWO 2009/140429に記載されており、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーは、膜不安定化ペプチドであるかまたはそれを含む。特定のバリエーションでは、膜不安定化ペプチドは
Figure 2018509387
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より選択される。
膜不安定化ポリマーは、所望のpHで膜不安定化活性を有するpH感受性ポリマーであり得る。いくつかの態様では、本明細書において提供される膜不安定化ポリマー(例えばブロックコポリマーなどのコポリマー)は、エンドソームのpHで膜を不安定化する(例えば水性媒体中で)。いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーは、約6.5以下のpH、好ましくは約5.0〜約6.5の範囲のpH、または約6.2以下のpH、好ましくは約5.0〜約6.2の範囲のpH、または約6.0以下のpH、好ましくは約5.0〜約6.0の範囲のpHで膜を不安定化する(例えば水性媒体中で)。
典型的には、いずれの場合も、膜不安定化ポリマーは、所望の分量(例えば濃度)のポリマーで膜不安定化活性を有し得る。ポリマーの膜不安定化特性は、当技術分野で公知の好適なアッセイによって判定し得る。例えば、ポリマーの膜不安定化活性は、赤血球溶血アッセイまたはリポソーム漏出アッセイなどのインビトロ細胞アッセイで判定し得る。エンドソーム溶解性ポリマー活性は、インビトロ細胞アッセイで判定し得る。
概して、膜不安定化ポリマーは、特定の性質を有するモノマー残基から構成される。例えば、ポリマーは、第一級、第二級、第三級、または第四級であり、ポリマーと膜との相互作用を駆動するアミンを有してもよい。これらのアミンは、永続的に電荷を有するまたは4〜14の範囲のpKaを有してもよい。特に、これらのpKaは、エンドソームにおいて酸-塩基反応を受けることができるように4.5〜7.5の間であってもよい。ポリマーはまた、膜との相互作用をさらに向上するために疎水性基を有してもよい。ポリマーはまた、pKaが4.0〜7.5の範囲のカルボキシル官能基を有してもよい。
一定の態様では、膜不安定化ポリマーは、アニオン性、カチオン性、疎水性、および親水性のモノマー残基より選択される1つまたは複数のモノマー種を含む。アニオン性モノマー残基は、プロトン化可能なアニオン種を含む、アニオンにまで荷電したかまたは荷電可能な種を含む。アニオン性モノマー残基は、およそ中性のpH7.2〜7.4でアニオン性であり得る。カチオン性モノマー残基は、脱プロトン化可能なカチオン種を含む、カチオンにまで荷電したかまたは荷電可能な種を含む。カチオン性モノマー残基は、およそ中性のpH7.2〜7.4でカチオン性であり得る。疎水性モノマー残基は疎水性種を含む。親水性モノマー残基は親水性種を含む。
いくつかのバリエーションでは、膜不安定化ポリマーは、疎水性である少なくとも1つのポリマー鎖であるかまたはそれを含む。いくつかのそのような態様では、ポリマーは、複数のアニオン性モノマー残基を含む少なくとも1つのポリマー鎖であるかまたはそれを含む。この点で、例えば、ポリマーは、(i)疎水性種を有する複数の疎水性モノマー残基と、(ii)およそ中性のpHで好ましくはアニオン性でありエンドソームpHまたは弱酸性のpHで実質的に中性または非荷電の複数のアニオン性モノマー残基とを含む少なくとも1つのポリマー鎖であってもまたはそれを含んでもよい。
そのような上記の態様では、ポリマーは複数のカチオン種をさらに含み得る。よって、例えば、ポリマーは、複数のアニオン性モノマー残基(例えば、ほぼ中性のpHでアニオン性の種を有する)と、複数の疎水性モノマー残基(例えば、疎水性種を有する)と、任意で複数のカチオン性モノマー残基(例えば、ほぼ中性のpHでカチオン性である種を有する)とを含む少なくとも1つのポリマー鎖であり得るかまたはそれを含み得る。そのような態様では、下にさらに検討するように、ポリマーは、電荷調節され、好ましくは荷電平衡されて、実質的に全体的には電荷が中性である少なくとも1つのポリマー鎖であり得るかまたはそれを含み得る。
いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーは、膜不安定化セグメント(例えば、ポリマーのブロックまたは領域として)を含むブロックコポリマーである。膜不安定化セグメントは、複数のアニオン性モノマー残基(例えば、ほぼ中性のpHでアニオン性である種を有する)と、複数の疎水性モノマー残基(例えば、疎水性種を有する)と、任意で複数のカチオン性モノマー残基(例えば、ほぼ中性のpHでカチオン性である種を有する)とを含み得る。そのような態様では、セグメント(例えばブロックまたは領域)は、凝集体で考えると疎水性であり得る。そのような態様では、ブロックコポリマーは親水性セグメントをさらに含んでもよい。
膜不安定化ブロックを含むブロックコポリマーのいくつかの態様では、ブロックコポリマーは、コポリマーの第1のブロックAを規定する第1のポリマー鎖と、コポリマーの第2のブロックBを規定する第2の膜不安定化ポリマー鎖とを含む。例えば、ブロックコポリマーは、親水性であるコポリマーの第1のブロックAを規定する第1のポリマー鎖と、(i)複数の疎水性モノマー残基および(ii)血清生理的pHでアニオン性でありかつエンドソームpHで実質的に中性または非荷電の複数のアニオン性モノマー残基を含むコポリマーの第2のブロックBを規定する第2のポリマー鎖とを含み得る。
いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーは、ポリマー鎖の膜不安定化または膜不安定化活性を向上するように適合させた比で、複数のアニオン性モノマー残基と、複数の疎水性モノマー残基と、任意で複数のカチオン性モノマー残基とを含む少なくとも1つのポリマー鎖であるかまたはそれを含む。例えば、非限定的には、pH7.4ではそのような態様では、疎水性:(アニオン+カチオン)種の比は約1:2〜約3:1の範囲であり、アニオン:カチオン種の比は約1:0〜約1:5である。他のそのような態様では、pH7.4では、疎水性:(アニオン+カチオン)種の比は約1:1〜約2:1の範囲であり、アニオン:カチオン種の比は約4:1〜約1:5である。
いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーは、ポリマー鎖の膜不安定化または膜不安定化活性を向上するように適合させた比で、複数のカチオン性モノマー残基と、複数の疎水性モノマー残基と、任意で複数のアニオン性モノマー残基とを含む少なくとも1つのポリマー鎖であるかまたはそれを含む。例えば、非限定的には、pH7.4ではそのような態様では、疎水性:(カチオン+アニオン)種の比は約1:2〜約3:1の範囲であり、カチオン:アニオン種の比は約1:0〜約1:20である。他のそのような態様では、pH7.4では、疎水性:(カチオン+アニオン)種の比は約1:1〜約2:1の範囲であり、カチオン:アニオン種の比は約1:0〜約1:5である。
いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーは、ポリマー鎖の膜不安定化または膜不安定化活性を向上するように適合させた比で、複数のカチオン性モノマー残基と、任意で複数の疎水性モノマー残基とを含む少なくとも1つのポリマー鎖であるかまたはそれを含む。例えば、非限定的には、pH7.4ではそのような態様では、疎水性:カチオン種の比は約0:1〜約5:1である。他のそのような態様では、pH7.4では、疎水性:カチオン種の比は約0:1〜約2:1である。
概して、膜不安定化ポリマーは、例えば、アニオン性モノマー残基およびカチオン性モノマー残基の両方と共に疎水性モノマー残基を含む、電荷調節された少なくとも1つのポリマー鎖であり得るかまたはそれを含み得る。アニオン性モノマー残基とカチオン性モノマー残基との相対比は、所望の全体的な電荷特性を達成するように制御され得る。典型的な態様では、例えば、そのようなポリマーまたはポリマー鎖は、生理的pH(例えばpH7.2〜7.4)の水性媒体中で実質的に中性の全体的な電荷を有するように、電荷調節され得る。
少なくとも1つのブロックが疎水性膜不安定化ポリマーなどの膜不安定化ポリマーであるかまたはそれを含むブロックコポリマーを含む態様は、ブロックコポリマーの追加のブロックとして1つまたは複数のさらなるポリマー鎖を含み得る。概して、そのようなさらなるポリマーブロックは、厳密には重要ではなく、親水性、疎水性、両親媒性であり、それぞれの場合に全体的な電荷特性において中性、アニオン性またはカチオン性であるポリマー鎖であり得るかまたはそれを含み得る。
いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーは、1つもしくは複数の追加の構成成分および/または機能的特徴を促進するように適合されたポリマー鎖であるかまたはそれを含む。例えば、そのようなポリマー鎖は、標的化リガンド(親和性試薬)または遮蔽剤に直接的または間接的に共有連結するように適合された末端官能基(例えば、ポリマー鎖のアルファ末端またはオメガ末端)を含み得る。付加的にまたは代替的には、そのようなポリマー鎖は、薬剤にコンジュゲートするように適合されたペンダント官能基を有する1つまたは複数のモノマー残基を含み得る。そのようなコンジュゲート可能なモノマー残基は、親和性試薬、遮蔽剤、または他の生体分子剤に直接または間接的に共有連結するために利用され得る。付加的または代替的には、そのようなポリマー鎖は、遮蔽種を有する1つまたは複数のモノマー残基を含み得る。例えば、遮蔽モノマー残基は、遮蔽部分を含む重合可能なモノマーを含む重合反応に直接由来し得る。遮蔽剤は、ポリエチレングリコールモノマーおよび/またはポリマーを含む。付加的または代替的には、そのようなポリマー鎖は、ポリマー鎖間の架橋に好適なペンダント官能基を2つ以上有する1つまたは複数のモノマー残基を含み得る。そのような架橋性モノマー残基は、多官能性(例えば二官能性)架橋性モノマーを含む1つまたは複数の重合可能なモノマーを含む重合反応に直接由来するような架橋されたポリマーまたはポリマー鎖の構成部分であり得る。
概して、ブロックコポリマーの1つまたは複数のブロックは、2つ以上の組成的に区別されるモノマー残基を含むランダムコポリマーブロックであり得る。
概して、単一のモノマー残基は、異なる官能性を有する複数の部分を含み得、例えば、疎水性種ならびにアニオン種を含み得るか、疎水性種ならびにカチオン種を含み得るか、またはアニオン種ならびにカチオン種を含み得る。したがって、任意の態様では、ポリマーは、疎水性種およびアニオン種(例えば、ほぼ中性のpHでアニオン性である種)を含むアニオン性疎水性モノマー残基などのモノマー残基を含むポリマーであり得るかまたはそれを含み得る。
典型的なバリエーションでは、アニオン性モノマー残基は、プロトン化可能なアニオン種を含む。ポリマー鎖中に組み込まれているような凝集物として考えると、そのようなアニオン性モノマー残基は、7.0より高いpHで実質的にアニオン性であり、6.0より低いpHで実質的に中性(非荷電)であり得る。好ましくは、そのようなアニオン性モノマー残基は、約4〜約6.8(例えば、約4〜約6、約4〜約5、約5〜約6、約5〜約6.8、または約5.5〜約6.8)の範囲のpKaを有する。アニオン性モノマー残基は、カルボン酸、スルホンアミド、ボロン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、リン酸、ホスフィン酸、および亜リン酸基、ならびにこれらの組み合わせより選択されるプロトン化可能なアニオン種を有する複数のモノマー残基を独立して含み得る。特に好適なアニオン性モノマー残基は、(C2-C8)アルキルアクリル酸の重合に由来してもよい。
疎水性モノマー残基は、概して、電荷を有するかまたは非荷電であり得る。いくつかの態様は、中性(非荷電)の疎水性モノマー残基を含む。いくつかの態様では、ポリマー鎖は、(C1-C18)アルキル(例えば(C2-C8)アルキル)、(C1-C18)アルケニル(例えば(C2-C8)アルケニル)、(C1-C18)アルキニル(例えば(C2-C8)アルキニル)、アリール、ヘテロアリール、およびコレステロール(これらのそれぞれは任意で置換されていてもよい)より選択される疎水性種を有する複数のモノマーの残基を独立して含み得る。一定の態様では、複数のモノマーの残基は、(C1-C18)アルキル-エタクリレート(例えば(C2-C8)アルキル-エタクリレート)、(C1-C18)アルキル-メタクリレート(例えば(C2-C8)アルキル-メタクリレート)、または(C1-C18)アルキル-アクリレート(例えば(C2-C8)アルキル-アクリレート)(これらはそれぞれ任意で置換されていてもよい)の重合に由来し得る。
カチオン性モノマー残基は、好ましくは脱プロトン化可能なカチオン種を含み得る。ポリマー鎖中に組み込まれているような凝集物として考えると、そのようなカチオン性モノマー残基は、7.0より高いpHで実質的にカチオン性であり得る。好ましくは、そのようなカチオン性モノマー残基は、pKaが約5.5〜約9.0(例えば約6.5〜約9.0)の範囲である。カチオン性モノマー残基は、非環状アミン、非環状イミン、環状アミン、環状イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される脱プロトン化可能なカチオン種を有する複数のモノマー残基を独立して含み得る。好ましいカチオン性モノマー残基は、いずれの場合も置換されていてもよい(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来し得る。
いくつかの態様では、pH感受性膜不安定化ポリマーは、例えば、上に記載の2つ以上のモノマー残基種を含むランダムコポリマー鎖などのランダムコポリマー鎖を含む。例えば、特定のバリエーションでは、ランダムコポリマー鎖は、プロピルアクリル酸、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート、およびブチルメタクリレートの重合に由来するモノマー残基を有する。特定の態様では、pH感受性ポリマーは、膜不安定化ポリマーブロックとしてランダムコポリマー鎖を含み、1つまたは複数の追加のブロック(例えば親水性ブロック)をさらに含むブロックコポリマーである。例えば、いくつかの態様では、ポリマーは、膜不安定化ランダムコポリマーブロックおよび第2のブロックを含むジブロックコポリマーであり、これは模式[A]v-[B]wで表され得、式中[B]は膜不安定化ブロックを表し、[A]は第2のブロック(例えば親水性ブロックまたは両親媒性ブロック)を表し、文字vおよびwはコポリマー中の各ブロックの分子量(数平均)を表す。膜不安定化ポリマーブロックおよび親水性ブロックを含むブロックコポリマーの一定のバリエーションでは、親水性ブロックは、親水性ブロック中に疎水性モノマー残基よりも親水性モノマー残基が多くなるように親水性モノマーおよび疎水性モノマーの両方から重合される。
いくつかのバリエーションでは、pH感受性膜不安定化ポリマーは、親水性ランダムコポリマーブロックおよび疎水性ランダムコポリマーブロックを有するジブロックコポリマーであり、(i)親水性ブロックは、親水性モノマー残基および疎水性モノマー残基の両方を含む両親媒性ブロックであり、親水性ブロック中の親水性モノマー残基の数は、疎水性モノマー残基の数よりも大きく、(ii)疎水性ブロックは、疎水性モノマー残基および親水性モノマー残基の両方を含み、約7.4のpHで全体的に疎水的特性を有する両親媒性膜不安定化ブロックであり、(iii)親水性および疎水性ブロックの親水性モノマー残基のそれぞれは独立して、約7.4のpHでイオン性であるモノマー残基、約7.4のpHで中性であるモノマー残基、および約7.4のpHで双性イオン性であるモノマー残基より選択される。いくつかのそのような態様では、ジブロックコポリマーを調製するために用いるモノマーは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、および/またはメタクリルアミドを含む。特定のバリエーションでは、親水性ブロックは、約7.4のpHで中性である親水性モノマー残基を含み、かつ/または疎水性ブロックは、約7.4のpHでカチオン性である親水性モノマー残基および約7.4のpHでアニオン性である親水性モノマー残基の両方を含む。上記のジブロックコポリマーでの使用に好適な親水性および疎水性モノマー残基は本明細書においてさらに記載されている。いくつかの態様では、上記のジブロックコポリマーは、本明細書において記した式Iのランダムブロックコポリマーである。
いくつかのバリエーションでは、pH感受性膜不安定化ポリマーは、親水性ランダムコポリマーブロックおよび疎水性ランダムコポリマーブロックを有するジブロックコポリマーであり、(i)親水性ブロックは、親水性モノマー残基および疎水性モノマー残基の両方を含みかつ約7.4のpHで全体的に親水性の特性を有する両親媒性ブロックであり、(ii)疎水性ブロックは、疎水性モノマー残基および親水性モノマー残基の両方を含み、約7.4のpHで全体的に疎水的特性を有する両親媒性膜不安定化ブロックであり、(iii)親水性および疎水性ブロックの親水性モノマー残基のそれぞれは独立して、約7.4のpHでイオン性であるモノマー残基、約7.4のpHで中性であるモノマー残基、および約7.4のpHで双性イオン性であるモノマー残基より選択される。いくつかのそのような態様では、ジブロックコポリマーを調製するために用いるモノマーは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、および/またはメタクリルアミドを含む。
一定の態様では、pH感受性ポリマーは、膜不安定化ペプチドに共有連結されている。例えば、pH感受性ポリマーは、複数のペンダント連結基を含んでいてもよく、複数の膜不安定化ペプチドは、複数のペンダント連結基を介してpH感受性ポリマーに連結していてもよい。いくつかのバリエーションでは、アミノまたはカルボキシル末端のいずれかにシステイン残基を含むペプチドは、システインチオールを通じてジスルフィド部分を含有するモノマーにコンジュゲートされてジスルフィド架橋を形成する。ポリマーに連結されてもよい例示的な膜不安定化ペプチドは、例えば
Figure 2018509387
Figure 2018509387
を含む。
いくつかの態様では、pH感受性ポリマーは、式Iのランダムブロックコポリマーを含み：
Figure 2018509387
式中、
A0、A1、A2、A3、A4およびA5は、それぞれ独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-、-O(C)b-、および-CR8-CR9からなる群より選択され；R1〜R6およびY0〜Y5では完全には置換されていないA0〜A5の4価の炭素原子は、適切な数の水素原子で満たされており；aおよびbは、それぞれ独立して1〜4であり；R8およびR9は、それぞれ独立して、-C(O)OH、-C(O)Oアルキル、および-C(O)NR10からなる群より選択され、R8およびR9は、互いに共有連結して環構造(例えば環状無水物または環状イミド)を形成していてもよく；
Y5は、水素であるかまたは、いずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい-(1C-10C)アルキル、-(3C-6C)シクロアルキル、-O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、-C(O)NR11(1C-10C)アルキル、および-(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
Y0、Y3、およびY4は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-、-S(2C-10C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され；
Y1およびY2は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-18C)アルキル-、-(3C-18C)分岐アルキル、-C(O)O(2C-18C)アルキル-、-C(O)O(2C-18C)分岐アルキル、-OC(O)(1C-18C)アルキル-、-OC(O)(1C-18C)分岐アルキル-、-O(2C-18C)アルキル-、-0(2C-18C)分岐アルキル-、-S(2C-18C)アルキル-、-S(2C-18C)分岐アルキル-、-C(O)NR12(2C-18C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-18C)分岐アルキル-からなる群より選択され、Y1またはY2の任意のアルキルまたは分岐アルキル基は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、およびR12は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
Q0は、生理的pHで親水性である残基；O-[(C)2-3-O]x-R7；およびO-[(C)2-3-O]x-C(O)-NR13R14からなる群より選択される残基であり；xは、1〜48であり；R7は、-CH3または-CO2Hであり；R13およびR14は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
Q1およびQ2は、それぞれ独立して、存在しないか、または通常の生理的pHで親水性である残基；コンジュゲート可能なまたは官能化可能な残基；通常の生理的pHで疎水性である残基；1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基；および1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい分枝アルキル基より選択され；
Q3は、通常の生理的pHで正電荷を備えた残基であり；
Q4は、通常の生理的pHで負電荷を備えたが、より低いpHではプロトン化を受ける残基であり；
mは、0より大きく1.0までのモル分率であり；
nは、0〜1.0未満のモル分率であり；
pは、0〜1.0未満のモル分率であり；m + n + p = 1であり；
qは、0.1〜0.9のモル分率であり；
rは、0.05〜0.9のモル分率であり；
sは、最大で0.85までのモル分率で存在し；q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；かつ
wは、1〜50kDaである。
上記の式Iのポリマーの一定の態様では、mはn + pより大きい。いくつかのそのようなバリエーションでは、pは0である。
上記の式Iのポリマーの一定の態様では、nは0より大きい。nが0より大きい式Iの特に好適なポリマーは、R2-A1-Y1-Q1が一緒になって全体的に疎水性の特性を有するモノマー残基であるポリマーを含む。いくつかのそのようなバリエーションでは、疎水性モノマーは、1つもしくは複数のフッ素原子で置換されたアルキルまたは分岐アルキル基を含有する(例えば、Y1およびQ1の少なくとも一方は、Y1およびQ1について式Iで特定されるようなアルキルまたは分岐アルキル基を含有し、アルキルまたは分岐アルキル基は1つまたは複数のフッ素原子で置換されている)。
nが0より大きい式Iのポリマーのいくつかのバリエーションでは、pは0である。いくつかのそのような態様では、mはnより大きい。例えば、mは典型的にはnより大きく、R2-A1-Y1-Q1は一緒になって全体的に疎水性の特性を有するモノマー残基である。
式Iのポリマーのいくつかの具体的な態様では、w:vの比は、約1:1〜約5:1、または約1:1〜約2:1の範囲である。
例示的であるが非限定的な膜不安定化ポリマーは、1つまたは複数の対イオンを有していてもよい、式1で表されるランダムコポリマーであるポリマー鎖であり得るかまたはそれを含み得る。
一定の態様では、式1の第2のブロックの構成単位は、重合可能なモノマーであるN,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)、プロピルアクリル酸(PAA)およびブチルメタクリレート(BMA)に由来する。
式IのpH感受性ポリマーを含む一定の態様では、pH感受性ポリマーは式IIのポリマーであり：
T1-L-[PEGMAm-PDSMAn-BPAMp]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w II
式中、
PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり；
PDSMAは、ピリジルジスルフィドメタクリレート残基であり；
BPAMは、2-[2-Bocアミノエトキシ]エチルメタクリレート残基であり；
BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
mは、0.6〜1のモル分率であり；
nは、0〜0.4(例えば0〜0.2)のモル分率であり；
pは、0〜0.4(例えば0〜0.2)のモル分率であり；
m + n + p = 1であり；
qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜25kDaであり；
T1は、存在しないかまたは第1の標的化リガンドであり；かつ
Lは、存在しないかまたは連結部分である。
式IのpH感受性ポリマーを含む別の態様では、pH感受性ポリマーは式Vのポリマーであり：
T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w V
式中、
PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり;
M2は、
(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；
(C4-C18)分枝アルキル-メタクリレート残基；
コレステリルメタクリレート残基；
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；および
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
からなる群より選択されるメタクリレート残基であり；
BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
mおよびnは、それぞれ0より大きいモル分率であり、mは、nより大きく、m + n = 1であり；
qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜25kDaであり；
T1は、存在しないかまたは第1の標的化リガンドであり；かつ
Lは、存在しないかまたは連結部分である。
式Vのポリマーにおける使用のために特に好適なM2メタクリレート残基は、2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基；2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基(2-プロペン酸，2-メチル-，3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルエステル残基とも呼ばれる)；3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基；1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基；2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基；2-エチルヘキシルメタクリレート残基：ブチルメタクリレート残基；ヘキシルメタクリレート残基；オクチルメタクリレート残基；n-デシルメタクリレート残基；ラウリルメタクリレート残基；ミリスチルメタクリレート残基；ステアリルメタクリレート残基；コレステリルメタクリレート残基；エチレングリコールフェニルエーテルメタクリレート残基；2-プロペン酸，2-メチル-，2-フェニルエチルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，2-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]エチルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，シクロヘキシルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，2-[ビス(1-メチルエチル)アミノ]エチルエステル残基；2-プロペン酸，2-メチル-，3-メチルブチルエステル残基；ネオペンチルメタクリレート残基；tert-ブチルメタクリレート残基；3,3,5-トリメチルシクロヘキシルメタクリレート残基；2-ヒドロキシプロピルメタクリレート残基；5-ノニルメタクリレート残基；2-ブチル-1-オクチルメタクリレート残基；2-ヘキシル-1-デシルメタクリレート残基；および2-(tert-ブチルアミノ)エチルメタクリレート残基を含む。
式IIまたは式VのpH感受性ポリマーの特定のバリエーションでは、PEGMAはエチレングリコール単位を4〜5個またはエチレングリコール単位を7〜8個有する。いくつかの態様では、T1およびLが存在する。T1は、例えば、例を挙げると本明細書においてさらに記載されるtri-NAG部分などのN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含んでもよい。Lは、例えば、1つまたは複数のPEG鎖を含む部分などの親水性部分であってもよい。いくつかの態様では、Lは、エチレングリコール単位(例えば、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコール(PEG)部分)を2〜240個含む親水性部分である。
具体的な態様では、式IIのpH感受性ポリマーは
Figure 2018509387
からなる群より選択され、式中、「D」は式IIについて上に規定したDMAEMAであり、「P」は式IIについて上に規定したPAAであり、「B」は式IIについて上に規定したBMAであり、「NAG」はN-アセチルガラクトサミン残基であり、「PEG12」は、エチレングリコール単位を12個有しNAG残基および連鎖移動剤への付着のために各末端で官能化されたポリエチレングリコールであり、「PEGMA」、「PDSMA」、および「BPAM」は式IIについて上に規定した通りであり、かつm、n、p、q、r、s、v、およびwの値は式IIについて上に規定した通りである。式IIaのポリマーの特定のバリエーションでは、mは0.85〜0.9であり、nは0.1〜0.15であり、qは0.33〜0.37であり、rは0.07〜0.15であり、sは0.52〜0.57であり、vは3kDa〜4.5kDaであり、かつ/またはwは5.5kDa〜7kDaである。式IIbのポリマーの具体的なバリエーションでは、mは0.75〜0.8であり、nは0.1〜0.13であり、pは0.1〜0.12であり、qは0.25〜0.37であり、rは0.07〜0.25であり、sは0.5〜0.57であり、vは3kDa〜4.5kDaであり、wは5.5kDa〜7kDaである。いくつかの具体的な態様では、w:vの比は、約1:1〜約5:1、または約1:1〜約2:1の範囲である。
具体的な態様では、式VのpH感受性ポリマーは
Figure 2018509387
からなる群より選択され、式中、「D」は式Vについて上に規定したDMAEMAであり、「P」は式Vについて上に規定したPAAであり、「B」は式Vについて上に規定したBMAであり、「NAG」はN-アセチルガラクトサミン残基であり、「PEG12」は、エチレングリコール単位を12個有しNAG残基および連鎖移動剤への付着のために各末端で官能化されたポリエチレングリコールであり、「PEGMA」は式Vについて上に規定した通りであり、「Fl-BMA」は2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基であり、「OFl-5TFM-HMA」は3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5（トリフルオロメチル）ヘキシルメタクリレート残基であり、「Fl15-OMA」は2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基であり、「B-Fl-HMA」は3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基であり、「B-Fl-OMA」は3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基であり、「EHMA」は2-エチルヘキシルメタクリレート残基であり、「HMA」はヘキシルメタクリレート残基であり、「C8MA」はオクチルメタクリレート残基であり、「C12MA」はラウリルメタクリレート残基であり、「2-Bu1-OMA」は2-ブチル-1-オクチルメタクリレート残基であり、「5-NMA」は5-ノニルメタクリレート残基であり、かつm、n、q、r、s、v、およびwの値は式Vについて上に規定した通りである。
いくつかの態様では、pH感受性膜不安定化ポリマーは、式Iaのランダムブロックコポリマーを含み：
Figure 2018509387
式中、
A0、A1、A2、A3、A4およびA5は、それぞれ独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-、-O(C)b-、および-CR8-CR9からなる群より選択され；R1〜R6およびY0〜Y5では完全には置換されていないA0〜A5の4価の炭素原子は、適切な数の水素原子で満たされており；aおよびbは、それぞれ独立して、1〜4であり；R8およびR9は、それぞれ独立して、-C(O)OH、-C(O)Oアルキル、および-C(O)NR10からなる群より選択され、R8およびR9は、互いに共有連結して環構造を形成していてもよく；
Y5は、水素であるかまたは、いずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい-(1C-10C)アルキル、-(3C-6C)シクロアルキル、-O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、-C(O)NR11(1C-10C)アルキル、および-(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
Y0、Y3、およびY4は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-、-S(2C-10C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され；
Y1およびY2は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-18C)アルキル-、-(3C-18C)分岐アルキル、-C(O)O(2C-18C)アルキル-、-C(O)O(2C-18C)分岐アルキル、-OC(O)(1C-18C)アルキル-、-OC(O)(1C-18C)分岐アルキル-、-O(2C-18C)アルキル-、-0(2C-18C)分岐アルキル-、-S(2C-18C)アルキル-、-S(2C-18C)分岐アルキル-、-C(O)NR12(2C-18C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-18C)分岐アルキル-からなる群より選択され、Y1またはY2の任意のアルキルまたは分岐アルキル基は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、およびR12は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
Q0は、生理的pHで親水性である残基；O-[(C)2-3-O]x-R7；およびO-[(C)2-3-O]x-C(O)-NR13R14からなる群より選択される残基であり；xは、1〜48であり；R7は、-CH3または-CO2Hであり；R13およびR14は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
Q1およびQ2は、それぞれ独立して、存在しないか、または通常の生理的pHで親水性である残基；コンジュゲート可能なまたは官能化可能な残基；通常の生理的pHで疎水性である残基；1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基；および1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい分枝アルキル基より選択され；
Q3は、通常の生理的pHで正電荷を備えた残基であり；
Q4は、通常の生理的pHで負電荷を備えたが、より低いpHではプロトン化を受ける残基であり；
mは、0.5より大きく1.0より小さいモル分率であり；
nは、0より大きく0.5より小さいモル分率であり；
pは、0〜0.5未満のモル分率であり；m + n + p = 1であり；
qは、0.1〜0.9のモル分率であり;
rは、0.05〜0.9のモル分率であり;
sは、最大で0.85までのモル分率で存在し；q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜50kDaであり；かつ
Y1およびQ1の少なくとも一方は、1つもしくは複数のフッ素原子で置換されたアルキルまたは分枝アルキル基を含有する。
上記の式Iaのコポリマーを含むpH感受性ポリマーのいくつかの態様では、pは0である。
式Iaの好適なコポリマーは、R2-A1-Y1-Q1が一緒になって、2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基；2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基；1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基；および2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基より選択されるメタクリレート残基である。
上記の式Iaのコポリマーを含むpH感受性ポリマーの様々な態様では、(a)Y3は-C(O)OCH2CH2であり、Q3はジメチルアミノであり、かつ/またはR4は-CH3であり;(b)Y4は共有結合であり、Q4はカルボキシル残基であり、かつ/またはR5は-CH2CH2CH3であり；(c)Y5は-C(O)O(CH2)3CH3であり、かつ/またはR6は-CH3であり;かつ/あるいは(d)Y0は-C(O)O(2C-10C)アルキル-であり、Q0は、0-[(C)2-3-0]x-R7(xは1〜48であり、R7は-CH3である)であり、かつ/またはR1は-CH3である。例えば、より具体的なバリエーションでは、R4-A3-Y3-Q3は一緒になってジメチルアミノエチルメタクリレート残基(DMAEMA)であり；R5-A4-Y4-Q4は一緒になってプロピルアクリル酸残基(PAA)であり；R6-A5-Y5はは一緒になってブチルメタクリレート残基(BMA)であり；かつ/またはR1-A0-Y0-Q0は一緒になってエチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基(PEGMA)である。
上記の式Iaのコポリマーを含むポリマーのいくつかの態様では、pH感受性ポリマーは式Vaのポリマーであり：
T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w Va
式中、
PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり；
M2は、
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基、および
1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
からなる群より選択されるメタクリレート残基であり、
BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
mおよびnは、それぞれ0より大きいモル分率であり、mは、nより大きく、m + n = 1であり；
qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
q + r + s = 1であり；
vは、1〜25kDaであり；
wは、1〜25kDaであり；
T1は、存在しないかまたは第1の標的化リガンドであり；かつ
Lは、存在しないかまたは連結部分である。
式Vaのポリマーでの使用のための特に好適なM2メタクリレート残基は、2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基；2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基；3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基；1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基；および2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基を含む。
式V、式Va、または式Vb〜Vmのいずれかのポリマーの特定のバリエーションでは、mは0.55〜0.9(例えば0.65〜0.9または0.7〜0.85)であり、nは0.1〜0.45(例えば0.1〜0.35または0.15〜0.3)であり、qは0.25〜0.4(例えば0.28〜0.37)であり、rは0.07〜0.15(例えば0.9〜0.15)であり、sは0.5〜0.65(例えば0.5〜0.6)であり、vは、2.5kDa〜10kDa(例えば、2.5kDa〜7kDa、2.5kDa〜5kDa、2.5kDa〜4.5kDa、または0.29〜4kDa)であり、かつ/またはwは4kDa〜9kDa(例えば、4kDa〜7kDa、4kDa〜6kDa、または5kDa〜7kDa)である。いくつかの一定の態様では、w：vの比は、約1:0.8〜約5:1、または約1:1〜約2:1の範囲である。
概して、膜不安定化ポリマー(またはブロックコポリマーのブロックなどの構成部分として含まれるポリマー鎖)は遮蔽剤または可溶化剤を含み得る。遮蔽剤はポリマー鎖の可溶性を改善するのに有効であり得る。遮蔽剤はまた、一定の組成物の毒性を低減させるのに有効であり得る。いくつかの態様では、遮蔽剤は複数の中性親水性モノマー残基を含むポリマーであり得る。遮蔽ポリマーは、ポリマーの末端基を介して、またはポリマーの1つもしくは複数のモノマー残基のペンダント官能基を介して直接的または間接的に膜不安定化ポリマーに共有結合的にカップリングされ得る。いくつかの態様では、ポリマー鎖の複数のモノマー残基は遮蔽種を有し得、好ましくはそのような遮蔽種は重合可能なモノマー(遮蔽モノマー残基が由来する)からのペンダント部分である。例えば、ポリマーは、遮蔽オリゴマーを含むペンダント基を有する複数のモノマー残基を含み得る。遮蔽/可溶化種は、例えばpH感受性結合またはリンカーなどの不安定な連結を介してポリマーにコンジュゲートしてもよい。特に好適なpH感受性結合およびリンカーは、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、イミン、オルトエステル、カーボネート、およびマレアミド酸連結を含む。不安定な連結は、例えば、ペンダント連結基を有する複数のモノマー残基を介した連結のため、または他のポリマーブロックへの遮蔽種を含むポリマーブロックの連結(例えば、膜不安定化ブロックへの遮蔽ブロックの連結)のために利用してもよい。
好ましい遮蔽/可溶化ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)オリゴマー(例えば、繰り返し単位が20個以下)またはポリマー(例えば、繰り返し単位が20個より多い)であり得る。PEGは、ポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキシドとして記載され得、-CH2-CH2-O-繰り返し単位(この繰り返し単位は本明細書においては「エチレングリコール単位」または「エチレンオキシド単位」とも呼ばれる)からのオリゴマーまたはポリマーであると理解される。一定の態様では、ブロックコポリマーの1つのブロックは、例えばコポリマーの膜不安定化ブロックのアルファ末端またはオメガ末端に共有結合的にカップリングした、ポリエチレングリコール(PEG)オリゴマーまたはポリマーであり得るかまたはこれを含み得る。別の態様では、ポリエチレングリコール(PEG)オリゴマーまたはポリマーは、ポリエチレングリコールオリゴマーまたはポリマーに直接的または間接的に連結するのに好適な官能基を含む種を有するコンジュゲート化モノマー残基を通じてポリマーに共有結合的にカップリングされ得る。別の態様では、モノマー残基は、モノマーに懸垂したポリエチレングリコールオリゴマーを含む重合性モノマー(例えば上記のPEGMA)に由来し得る。
1つの一般的なアプローチでは、PEG鎖またはブロックは膜不安定化ポリマー鎖に共有結合的にカップリングされる。そのような態様には、例えば、PEG鎖またはブロックはおよそ1,000〜およそ30,000の範囲の分子量を有し得る。いくつかの態様では、PEGはブロックコポリマーの第2のブロックとして有効である(すなわち、組み込まれている)。例えば、PEGは膜不安定化ポリマーを含むブロックに共有結合的にカップリングした第2のブロックであり得る。いくつかの態様では、PEGは、ブロックコポリマー末端基に、またはポリマー化合物に存在するペンダントな修飾可能な基の1つまたは複数にコンジュゲートされている、例えばポリマー(例えばブロックコポリマー)の親水性セグメントまたはブロック(例えば第2のブロック)内の修飾可能な基にコンジュゲートされている。例としては、コポリマーのブロックは、式IIIの繰り返し単位を有する遮蔽ポリマーであり得るか、またはそれにコンジュゲートされ得る。
Figure 2018509387
式中、R1およびR2は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、および置換されていてもよいC1-C3アルキルからなる群より選択され、分子量が約1,500〜約15,000の範囲である。
別の一般的なアプローチでは、モノマー残基は、PEGオリゴマーを含む重合性モノマーに由来し、例えば、そのようなモノマー残基は、重合中にポリマーにまたはブロックコポリマーの1つまたは複数のブロックに組み込まれ得る。好ましい態様では、モノマー残基は、式IVのオリゴマーを含むペンダント基を有する重合性モノマーに由来し得る。
Figure 2018509387
式中、R1およびR2は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、および置換されていてもよいC1-C3アルキルからなる群より選択され、nは2〜20の整数である。
概して、膜不安定化ポリマー(またはブロックコポリマーのブロックなどの構成部分として含まれるポリマー鎖)は、任意の好適な様式で調製され得る。例えば膜不安定化コポリマーを製造するために用いられる好適な合成方法は、例えば、カチオン、アニオンおよびフリーラジカル重合などの周知の「リビング重合」法を非限定的な例として含む。
リビング重合を用いると、多分散性または鎖長差が非常に小さいポリマーが得られ得る。多分散性は、ポリマー鎖の重量平均分子量をそれらの数平均分子量で割ることによって通常は測定される。数平均分子量は、個々の鎖分子量の合計を鎖の数で割ったものである。重量平均分子量は、分子量の二乗をその分子量の分子の数で割った値に比例する。重量平均分子量は常に数平均分子量より大きいので、多分散性は常に1以上である。より同じ数に近づくにつれて、すなわち多分散性が1という値に近づくにつれて、ポリマーは、全ての鎖が厳密に同じ数の構成単位を有する単分散に近くなる。ラジカルリビング重合を用いて1に近い多分散性値を達成可能である。限定するものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析、およびエレクトロスプレー質量分析などの多分散性を判定する方法が当技術分野で周知である。
可逆的付加-開裂連鎖移動すなわちRAFTは、エチレン骨格ポリマーを合成する際に使用するための例示的なリビング重合技術である。RAFTは当業者に周知である。RAFTは、フリーラジカル退行連鎖移動プロセスを含む。ほとんどのRAFT手法は、非限定的にはジチオエステル、ジチオカルバメート、トリチオカーボネートおよびキサンテートなどのチオカルボニルチオ化合物を利用して、可逆的連鎖移動機構による重合を仲介する。上記のいずれかの化合物のC=S基との重合性ラジカルの反応は、安定なラジカル中間体の形成につながる。これらの安定なラジカル中間体は、標準的なラジカル重合に典型的な停止反応を受けず、むしろモノマーと共に再開または伝播することができるラジカルを再導入し、プロセスにおいてC=S結合を再形成する。C=S結合への付加に続くその後のラジカルの開裂というこのサイクルは、全てのモノマーが消費されるかまたは反応がクエンチされるまで継続する。任意の特定の時点で活性ラジカルの濃度が低いと、正常な停止反応が制限される。別の態様では、ポリマーは、キサンテートの可逆的付加-開裂連鎖移動を介した大分子設計(MADIX)によって合成される(Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di- and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX Process", Daniel Taton et al., Macromolecular Rapid Communications, 22:1497-1503, 2001)。
本発明の一定の態様では、脂質ナノ粒子および/または膜不安定化ポリマーは、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する標的化リガンドを少なくとも1個含む。いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーが標的化リガンドを含む。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子が標的化リガンドを含む。いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーおよび脂質ナノ粒子の両方が同一または異なっていてもよい標的リガンド(例えば、同一の標的細胞に結合する異なる標的化リガンド種)を含む。
標的化リガンドは、例えば細胞表面受容体などの、標的細胞の表面の分子を特異的に認識する。特に好適な標的化部分は、抗体、抗体様分子、ポリペプチド、タンパク質(例えばインスリン様成長因子II(IGF-II))、ペプチド(例えば、RGD含有ペプチドなどのインテグリン結合ペプチド)および、例えば糖(例えば、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン(NAG)、マンノース、マンノース-6-リン酸(M6P))またはビタミン(例えば葉酸)などの小分子を含む。いくつかのバリエーションでは、標的化部分は、細胞表面分子の天然リガンドに由来する(例えば、サイトカインに、または細胞表面対抗受容体に結合する細胞表面受容体の細胞外ドメインに、由来する)タンパク質である。本明細書において提供されるコポリマーの標的化部分によって標的とされてもよい細胞表面分子の例は、トランスフェリン受容体1型および2型、EGF受容体、HER2/Neu、VEGF受容体、インテグリン、NGF、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、アシアロ糖タンパク質受容体、マンノース受容体、カチオン非依存性マンノース-6-リン酸/IGF-II受容体、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、葉酸受容体、およびシグマ受容体を非限定的に含む。
特定のバリエーションでは、標的化リガンドは、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合するN-アセチルガラクトサミン(NAG)糖残基を含む。いくつかのそのような態様では、標的化リガンドは次の式を有する。
Figure 2018509387
NAG糖残基を含む別の態様では、標的化リガンドは、1価のNAG部分に対するアシアロ糖タンパク質受容体の結合活性を高める場合がある複数のNAG糖残基(例えば3つのNAG残基、本明細書では「tri-NAG」構造とも呼ぶ)を含む。いくつかのそのような態様では、tri-NAGは次の式を有する。
Figure 2018509387
式中、
Figure 2018509387
は付着点を示す。
様々な態様では、標的化リガンドは、膜不安定化ポリマー(例えばブロックコポリマー)のいずれかの末端に付着するか、モノマー単位の側鎖に付着するか、ポリマーブロックに組み込まれるか、あるいは脂質ナノ粒子の脂質またはポリマー成分に付着する。膜不安定化ポリマーまたはLNPへ標的化リガンドの付着は、任意の好適な様式で、例えば、アミン-カルボキシルリンカー、アミン-スルフヒドリルリンカー、アミン-炭水化物リンカー、アミン-ヒドロキシルリンカー、アミン-アミンリンカー、カルボキシル-スルフヒドリルリンカー、カルボキシル-炭水化物リンカー、カルボキシル-ヒドロキシルリンカー、カルボキシル-カルボキシルリンカー、スルフヒドリル-炭水化物リンカー、スルフヒドリル-ヒドロキシリンカー、スルフヒドリル-スルフヒドリルリンカー、炭水化物-ヒドロキシリンカー、炭水化物-炭水化物リンカー、およびヒドロキシル-ヒドロキシルリンカーを非限定的に含む多数のコンジュゲーション化学アプローチのいずれか1つによって達成される。具体的な態様では、標的化リガンドをポリマーに付着させるために「クリック」化学を用いる(「クリック」反応の例については、Wu and Fokin, "Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications," Aldrichim. Acta 40:7-17, 2007を参照されたい)。種々のコンジュゲーション化学が任意で利用される(例えばBioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998およびその中の章を参照されたい)。いくつかの態様では、標的化リガンドはモノマーに付着され、得られた化合物は次いでポリマー(例えばブロックコポリマー)の重合合成に用いられる。いくつかの態様では、標的化部分は、混合ポリマーミセル集合体における第1のブロックコポリマーのブロックまたは第2のブロックコポリマーのブロックに付着される。
様々な標的化リガンドを用いた脂質粒子の標的化は以前に記載されている。U.S. Patent Nos. 4,957,773 and 4,603,044を参照されたい。標的化機構は、標的化部分が例えば細胞表面受容体である標的との相互作用に利用可能であるような様式で、標的化リガンドが脂質粒子の表面に配置されることを概して必要とする。上記ならびに、例えば、Sapra and Allen, Prog. Lipid Res. 42:439-62, 2003 and Abra et al., J. Liposome Res. 12:1-3, 2002に記載のものを含む様々な異なる標的化リガンドおよび方法が公知であり利用可能である。抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質などの様々な標的化カウンター受容体はリポソームの表面に結合され得る。例えば、肝臓に標的化させるためには、分岐型ガラクトシル脂質誘導体でリポソームを修飾してアシアロ糖タンパク質受容体を標的にし得る。Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287, 1997; Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259, 1997を参照されたい。組織標的化のためのより一般的なアプローチでは、標的細胞は、標的細胞によって発現される分子に特異的なビオチン化抗体で予め標識される。Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998を参照されたい。遊離抗体の血漿消失後、ストレプトアビジンでコンジュゲートされたリポソームを投与する。別のアプローチでは、標的化抗体はリポソームに直接付着される。前記Harasym et al.を参照されたい。
具体的なバリエーションでは、標的化リガンドは、以下より選択される式を有するリンカーを用いてポリマーに付着され：
Figure 2018509387
式中、mは1〜100または10〜250、ならびにw、x、y、およびzのそれぞれは独立して1〜48である。上記のmを含むリンカーの一定のバリエーションでは、mは1〜15、10〜20、20〜30、20〜25、11または12である。上記のmを含むリンカーの他のバリエーションでは、mは20〜60、25〜60、25〜55、25〜50、25〜48、30〜60、30〜55、30〜50、30〜48、34〜60、34〜55、34〜50、34〜48、36〜60、36〜55、36〜50、36〜48、36、または48である。上記のmを含むリンカーのさらに別の態様では、mは60〜250、100〜250、150〜250、または200〜250である。上記のxおよびy、x、yおよびz、またはw、x、yおよびzを含むL1の一定のバリエーションでは、w、x、yおよびzのそれぞれは独立して20〜30、20〜25、または23である。上記のxおよびy、x、yおよびz、またはw、x、yおよびzを含むL1の別のバリエーションでは、w、x、yおよびzのそれぞれは独立して1〜12、1〜24、1〜36、8〜16、10〜14、20〜28、22〜26、32〜40、34〜38、8〜48、10〜48、20〜48、22〜48、32〜48、34〜48、または44〜48である。
本発明の特定の態様は、治療剤のインビボ送達に向けられる。いくつかの態様では、治療剤はポリヌクレオチドである。好適なポリヌクレオチド治療剤は、cDNA、インビトロ重合DNA、プラスミドDNA、ウイルス由来の遺伝物質、直鎖DNA、ベクター、発現ベクター、発現カセット、キメラ配列、組換えDNA、アンチセンスDNA、またはこれらの群の誘導体の形態であってもよいDNA剤を含む。他の好適なポリヌクレオチド治療剤は、メッセンジャーRNA(mRNA)、インビトロ重合RNA、組換えRNA、トランスファーRNA(tRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、リボソームRNA(rRNA)、キメラ配列、ダイサー基質およびその前駆体、ロックド核酸、アンチセンスRNA、干渉RNA(RNAi)、非対称干渉RNA(aiRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、外部ガイド配列、低分子非メッセンジャーRNA(snmRNA)、非翻訳RNA(utRNA)、snoRNA(24量体、アンチセンス機構によって作用する修飾snmRNA)、小型非コードRNA(tncRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、またはこれらの誘導体の形態であってもよいRNAを含む。二本鎖RNA(dsRNA)およびsiRNAは、特にRNA干渉の現象に関連して重要である。本明細書において用いる治療的オリゴヌクレオチドの例は、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ダイサー基質、miRNA、aiRNAまたはshRNAを非限定的に含む。本明細書において用いる大きな治療用ポリヌクレオチドの例は、遺伝子置換療法のための機能性タンパク質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を非限定的に含む。ポリヌクレオチド治療剤は、他の巨大分子に特異的に結合する核酸オリゴマーである核酸アプタマーであってもよく、他の巨大分子に特異的に結合するそのようなアプタマーは、SELEXなどの公知の技術によってそのようなオリゴマーのライブラリから容易に単離され得る。例えばStoltenburg et al., Biomol. Eng., 24:381, 2007を参照されたい。
別の態様では、治療剤はタンパク質またはペプチドである。例えば、一定のバリエーションでは、薬剤は細胞内標的に結合しかつ拮抗するかまたは刺激する抗体である。本発明における使用のための抗体は、マウスへの免疫原の注入およびハイブリドーマを作製するためのそれに続くリンパ球の融合を通じてなどの任意の公知の方法を通じて生成されてもよい。そのようなハイブリドーマは次いで(a)抗体を直接産生するために、または(b)その後の遺伝子操作のために抗体フラグメントをコードするcDNAをクローン化するために用いてもよい。後者のストラテジーを採用する1つの方法を説明すると、mRNAはハイブリドーマ細胞から単離され、アンチセンスオリゴ-dTまたは免疫グロブリン遺伝子特異的プライマーを用いてcDNAに逆転写され、プラスミドベクターにクローン化される。クローンは配列決定されかつ特性決定される。それらは次いで標準的なプロトコルに従って組換えられて、例えば一本鎖scFvを作成するために、抗体の重鎖および軽鎖を組み合わせてバクテリアまたは哺乳類の発現ベクターに入れられてもよい。短いペプチドリンカーによって離間された2つの異なる抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を組み合わせて細菌または哺乳動物の発現ベクターに入れることによって組換え二重特異性抗体を作成するために同様のアプローチを用いてもよい。組換え抗体は次いで細菌または哺乳動物細胞における十分に確立されたプロトコルに従って発現されかつ精製される。例えば、Kufer et al., 2004, supra; Antibody Engineering: A Practical Approach, McCafferty, Hoogenboom and Chiswell Eds, IRL Press 1996を参照されたい。ペプチドなどの抗体または他のタンパク質性治療分子はまた、例えば、バクテリオファージによって発現される免疫グロブリンドメインまたはペプチドの非常に大きなライブラリのスクリーニングを通じて、相互作用する親和性試薬の選択を可能にするディスプレイ技術を通じて作製されてもよい(Antibody Engineering: A Practical Approach, McCafferty, Hoogenboom and Chiswell Eds, IRL Press 1996)。抗体はまた、ヒト免疫グロブリンドメインの移植を通じてヒト化されるか、またはヒト免疫グロブリン遺伝子/cDNAを有するトランスジェニックマウスまたはバクテリオファージライブラリから作られてもよい。本発明のいくつかの態様では、特異的結合タンパク質治療薬は、アビマー(Silverman et al., Nature Biotechnology 23:1556-1561, 2005を参照されたい)、アンキリンリピート(Zahnd et al., J. Mol. Biol. 369:1015-1028, 2007を参照されたい)およびアドネクチン(US Patent 7,115,396を参照されたい)ならびにまとめて「抗体様分子」と呼ばれる抗原に対する特異的親和性を作り出すように発展し得るドメインを有する他のそのようなタンパク質を非限定的に含む、標的に特異的に結合することができる抗体以外の構造体を含んでもよい。合成中の非天然アミノ酸の取り込みを通じたタンパク質治療薬の修飾は、それらの特性を改善するために用いてもよい(Datta et al., J. Am. Chem. Soc. 124:5652-5653, 2002; and Liu et al., Nat. Methods 4:239-244, 2007を参照されたい)。そのような修飾は、その後のコンジュゲーション反応を促進する化学基の付加を含むいくらかの利点を有する場合がある。
いくつかの態様では、治療剤はペプチドである。一定のバリエーションでは、ペプチドは二重特異性ペプチドである。ペプチドは、例えばタンパク質などの巨大分子を認識しこれに結合する親和性試薬を作製するために容易に作られかつスクリーニングされ得る。例えばJohnsson and Ge, Current Topics in Microbiology and Immunology, 243:87-105, 1999を参照されたい。
別の態様では、タンパク質治療薬はペプチドアプタマーである。ペプチドアプタマーは、標的タンパク質に特異的に結合し、その標的タンパク質の機能的能力を妨害するペプチド分子を含む。例えばKolonin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14266, 1998を参照されたい。ペプチドアプタマーは、タンパク質足場の両端に付着した可変ペプチドループからなる。そのようなペプチドアプタマーは、抗体のアプタマーと同等の結合親和性(ナノモル範囲)をしばしば有し得る。ペプチドアプタマーの高度に選択的な性質により、それらは、具体的なタンパク質を標的とするためだけでなく、所与のタンパク質の具体的な機能(例えばシグナル伝達機能)を標的とするためにも用いられ得る。さらに、ペプチドアプタマーは、時間的、空間的または誘導的様式で発現を調節するプロモーターの使用によって制御された用式で発現され得る。ペプチドアプタマーは、優占的に作用するので、機能喪失変異体が利用可能ではないタンパク質を分析するために用いられ得る。ペプチドアプタマーは、ペプチドのランダムプールまたはライブラリからの特異的標的とのその結合親和性に応じてアプタマーを選択することによって通常は調製される。ペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングによってランダムペプチドライブラリから単離され得る。例えばXu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12473, 1997を参照されたい。それらはまた、ファージライブラリから(例えばHoogenboom et al., Immunotechnology 4:1, 1998を参照されたい)または化学的に作成されたペプチド/ライブラリから単離され得る。
さらに別の態様では、治療剤は小分子治療薬である。小分子治療薬は、当該技術分野で一般的に周知であり、本発明に従って用いられてもよい。そのような分子は、いくつかの広いカテゴリーを挙げると、抗感染(例えば抗ウイルス)小分子、免疫調節小分子、および抗癌小分子を含む。いくつかのバリエーションでは、小分子治療薬は疎水性小分子である。小分子抗癌治療薬は、例えば、様々な化学療法薬、例えばチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)、DNAまたはRNAのいずれかに影響を与える小分子、または微小管の重合または解重合を防止することによって細胞の有糸分裂を阻害する小分子などを含む。小分子化学療法剤の具体例は、代謝拮抗剤(アザチオプリン、シタラビン、フルダラビンホスフェート、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、クラドリビン、カペシタビン6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、メトトレキセート、5-フルオロウラシルおよびヒロキシ尿素など)；アルキル化剤(メルファラン、ブスルファン、シス-プラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、イフォスファミド、ダカラバジン、プロカルバジン、クロラムブシル、チオテパ、ロムスチン、テモゾラミドなど)；抗有糸分裂剤(ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドセタキセル、パクリタキセルなど)；トポイソメラーゼ阻害剤(ドキソルビシン、アムサクリン、イリノテカン、ダウノルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、イダルビシン、テニポシド、エトポシド、トポテカンなど)；抗生物質(アクチノマイシンおよびブレオマイシンなど);アスパラギナーゼ；アントラサイクリン；およびタキサンを含む。一定のバリエーションでは、小分子化学療法薬は、抗チューブリン剤、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、およびチロシンキナーゼ阻害剤より選択される。別の具体的なバリエーションでは、小分子化学療法薬は、アントラサイクリン、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシノイド、ビンカアルカロイド、または白金(II)化合物である。
さらに別の態様では、治療剤は、疾患を引き起こす遺伝子を破壊するかまたは修正する遺伝子編集システムの構成要素である。これらは、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(例えば、Smith et al., Nucleic Acids Res. 28:3361-3369, 2000を参照されたい)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)(例えばLi et al., Nucleic Acids Res. 39:359-372, 2011を参照されたい)、CRISPR/Casシステム(例えばRichter et al., Int. J. Mol. Sci. 14:14518-14531, 2013を参照されたい)、および組換えメガヌクレアーゼ(例えばSilva et al., Curr. Gene Ther. 11:11-27, 2011を参照されたい)を含む。そのような態様では、ヌクレアーゼは、脂質ナノ粒子に処方されたmRNAまたはDNAなどの1つまたは複数の核酸によってコードされる。いくつかのバリエーションでは、LNP担体に複数のmRNAを処方して、遺伝子編集を起こすために同一の細胞に2つのヌクレアーゼを送達する(例えば、ゲノム内の特定の標的部位で修飾を引き起こすためにはその部位を認識するために典型的には2つのヌクレアーゼを必要とするZFNまたはTALEN遺伝子編集システムのために)。本開示の文脈では、膜不安定化ポリマーは、翻訳またはその後の核送達が起きる細胞質への核酸の送達を促進する。いくつかのバリエーションでは、遺伝子編集システムの1つまたは複数の追加の構成要素は、ヌクレアーゼをコードする1つまたは複数の核酸と一緒に標的細胞に送達される。例えば、CRISPR/Cas系では、Cas9タンパク質をコードする核酸に加えて、ゲノム中の特定部位に酵素を標的化させるための小分子ガイドRNAがLNP担体内に典型的に処方される。一定の態様では、相同組換えによって遺伝子を修正するために、ドナーDNA配列もヌクレアーゼをコードする核酸と共に同じかまたは異なるいずれかのLNPに処方されてもよい。遺伝子編集システムが疾患に関連する遺伝子を修正する一定の態様では、疾患は、本明細書において開示する機能性タンパク質の欠損を特徴とする(例えば、以下のタンパク質欠損疾患の考察を参照されたい)。
いくつかの態様では、治療剤は免疫原である。本明細書において開示する方法を用いて、免疫原は免疫応答を誘発するために様々な免疫細胞に効果的に送達され得る。いくつかのバリエーションでは、LNPのみが免疫原を含む。別の態様では、膜不安定化ポリマーはまた免疫原と会合(例えば共有結合的に連結)している。好適な免疫原は、ペプチド、タンパク質、mRNA、短鎖RNA、DNA、単純または複合炭水化物、ならびにウイルス、細菌、癌細胞などに由来する物質を含む。いくつかのバリエーションでは、ハプテンまたはアジュバント成分は、膜不安定化ポリマーまたはLNPに付着(コンジュゲート)するかまたは自己会合する。膜不安定化ポリマーおよびLNPの両方が免疫原と会合している一定の態様では、ポリマーに会合した免疫原はLNPのものとは異なるか、代替的には、ポリマーおよびLNPの両方が同じ免疫原性積荷を有する。例えば、いくつかのバリエーションでは、乱交雑T細胞エピトープである免疫原性ペプチドは、よりロバストな免疫応答を可能にするために膜不安定化ポリマーまたはLNPに付着される。このハプテンは、例えばLNPのmRNA成分によってコードされるタンパク質配列に由来し得るか、あるいは別のタンパク質または1つより多いT細胞エピトープの組み合わせであり得る。別の例として、免疫原は、アジュバントとして作用することによって免疫応答を向上するためにポリマーまたはLNPに付着した細菌細胞壁の成分であってもよい。さらに別のバリエーションでは、自然免疫応答を活性化するために免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたは長い核酸がポリマーまたはLNPに付着するかまたは自己会合する。本明細書において記載の送達システムの二面性を利用して(膜不安定化ポリマー成分とLNP成分の両方を用いて)、T細胞応答を開始するために一方の成分を用いてもよい一方で、B細胞応答を開始するために他方の成分を利用する。免疫原性物質の付着または自己会合を通じて先天性免疫応答、T細胞応答、B細胞応答、またはこれらの組み合わせを誘発するために、ハイブリッド送達システムのポリマーおよびLNP成分を用いてもよい。いくつかの態様では、免疫原を付着しかつ保持するために第1のポリマーを用いる一方で、抗原提示細胞への取り込みを可能にするために第2の膜不安定化ポリマーを用いる。本明細書において開示されるように細胞に免疫原を送達するための一定の態様では、ポリマーおよびLNPの少なくとも一方は、ポリマーおよび/またはLNPを目的の免疫細胞に標的化させる標的化リガンドを有する。
標的細胞の細胞質ゾルへの治療または診断剤の送達のために(例えば、標的細胞を含む標的組織への送達のために)、膜不安定化ポリマーと治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子とは、薬剤の細胞内送達を達成するのに有効な量で対象にそれぞれ投与される。脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、対象への同時注入のための単一組成物として同時処方されてもよい。代替的には、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、別々の投与のために別々に処方されてもよい。典型的には、別々の投与のためには、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは逐次的に投与される。例えば、特定の態様では、膜不安定化ポリマーは、脂質ナノ粒子の投与後に投与される。具体的なバリエーションでは、LNPおよびポリマーの投与間のタイミングは、約2時間以内、典型的には約1時間以内、より典型的には約30分以内、約10分以内、約5分以内、または約1分以内である。いくつかの態様では、LNPおよびポリマーの投与間のタイミングは、約30分、約15分、約10分、約5分、または約1分である。典型的には、脂質ナノ粒子と膜不安定化ポリマーとの同時注入を含むバリエーションでは、LNPおよびポリマーは、まず別々の組成物として処方され、次いで投与前に単一の組成物へと混合される。
任意の細胞型または対応する組織は、本方法を用いた薬剤送達のための標的にされてもよい。好適な標的細胞は、例えば、軟骨細胞、上皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液細胞(例えばリンパ球または骨髄白血球)、内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、および樹状細胞を含む。他の好適な標的細胞は、癌細胞、免疫細胞、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞、または異常な代謝活性を有する細胞を含む。標的細胞が分泌細胞である特定のバリエーションでは、標的分泌細胞は肝細胞である。いくつかのそのような態様では、LNPおよび膜不安定化ポリマーのいずれかまたは両方は、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合する標的化リガンドを含み、例えば、特定のバリエーションでは、標的化リガンドは、N-アセチルガラクトサミン(NAG)残基(例えば一価NAG部分またはtri-NAG構造)を含む。標的細胞は、例えば、ヒト、げっ歯類、ネズミ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、およびサル哺乳類を含む哺乳動物中に該細胞があるものをさらに含む。
ポリヌクレオチドの送達を含む具体的な態様では、ポリヌクレオチドは、タンパク質欠損疾患に関連する機能性タンパク質などの機能性タンパク質をコードするmRNA分子であり、方法は標的細胞内の機能性タンパク質の量を増加させる。例えば、具体的なバリエーションでは、mRNAは、エリスロポエチン、トロンボポエチン、第VII因子、第VIII因子、LDL受容体、アルファ-1-抗トリプシン(A1AT)、カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)、フマリルアセトアセターゼ(FAH)酵素、アラニン：グリオキシレート-アミノトランスフェラーゼ(AGT)、メチルマロニルCoAムターゼ(MUT)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファサブユニット(PCCA)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼベータサブユニット(PCCB)、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)のサブユニット、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、銅輸送ATPアーゼAtp7B、ビリルビンウリジンジホスフェートグルクロニルトランスフェラーゼ(BGT)酵素、ヘプシジン、グルコース-6-ホスファターゼ(G6Pase)、グルコース6-ホスフェートトランスロカーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼ(GB)、Niemann-Pick C1タンパク質(NPC1)、Niemann-Pick C2タンパク質(NPC2)、酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、第IX因子、ガラクトース-1-ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、トランスサイレチン、補体制御タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、ホモゲンチセート1,2-ジオキシゲナーゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、P型ATPアーゼタンパク質FIC-1、アルファ-ガラクトシダーゼA、酸性セラミダーゼ、酸性α-L-フコシダーゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、アルファ-L-イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、N-アセチルガラクトサミン-6-サルフェートスルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼB、ヘパラン-N-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル-CoA:α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-サルフェートスルファターゼ、アルファ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびβ-ヘキソサミニダーゼAより選択されるタンパク質をコードする。
機能性タンパク質をコードするmRNA分子の送達を含む一定の態様では、mRNAは分泌タンパク質をコードする。例示的な分泌タンパク質は、エリスロポエチン、トロンボポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、レプチン、血小板由来成長因子(例えば血小板由来成長因子B)、ケラチノサイト成長因子、骨形成タンパク質2、骨形成タンパク質7、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1、ヒト成長ホルモン、凝固因子(例えば、第VII因子、第VIII因子、第IX因子)、リラキシン(例えば、リラキシン-2)、インターフェロン(例えば、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ)、インターロイキン(例えば、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12、インターロイキン-18、インターロイキン21)、およびケモカイン(例えば、CCサブファミリーケモカイン、CXCサブファミリーケモカイン、Cサブファミリーケモカイン、およびCX3Cサブファミリーケモカイン)を含む。分泌タンパク質は、本明細書において記載される様々な抗体態様より選択されてもよい抗体も含む。特に好適な抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体(例えば一本鎖Fv(scFv))および二重特異性抗体などの遺伝子組換え抗体を含む。いくつかのバリエーションでは、mRNAは、血管内皮成長因子A(VEGF-A)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-17A(IL-17A)、インターロイキン-17F(IL-17F)、インターロイキン-21(IL-21)、インターロイキン-23(IL-23)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、およびプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)より選択されるタンパク質に特異的に結合しかつ拮抗する抗体をコードする。
細胞中のタンパク質の量を増加させることを含む一定の態様では、タンパク質はオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)である。そのような態様では、OTCタンパク質をコードするmRNAは脂質ナノ粒子組成物に処方され、本明細書において記載の膜不安定化ポリマーの同時注入または個別注入で対象に投与される。特定のバリエーションでは、mRNA分子は、SEQ ID NO:1の残基35〜354と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性(例えば、SEQ ID NO:1の残基35〜354と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むOTCタンパク質をコードする。コードされたOTCタンパク質を細胞のミトコンドリアに標的化させるために、OTCタンパク質をコードするmRNA分子は、ミトコンドリア標的化シグナルペプチド(本明細書においては「ミトコンドリアリーダー配列」とも呼ばれる)をコードする配列を含む。ミトコンドリアリーダー配列は、未改変のOTCタンパク質(例えば、SEQ ID NO:1(未改変のヒトミトコンドリアリーダー配列)の残基1〜34またはSEQ ID NO:2(未改変のマウスミトコンドリアリーダー配列)の残基1〜34)であってもよく、あるいはミトコンドリア標的化シグナルペプチドを含む別のタンパク質に由来しても、または新規に合成されてもよい。組換え切断部位は、細胞中のタンパク質分解プロセシングを最適化するために、ミトコンドリアリーダー配列とポリペプチドの残りとの間の接合部に含まれてもよい。ミトコンドリアリーダー配列は、成熟OTCタンパク質をコードするmRNA配列に作動可能に連結されている、すなわち、2つの配列は正確なリーディングフレーム中で繋げられ、新たに合成されたポリペプチドを細胞のミトコンドリアに向けるように配置される。ミトコンドリアリーダー配列は一般的にタンパク質のアミノ末端に位置する。具体的なバリエーションでは、ミトコンドリアリーダー配列を有するコードされたOTCタンパク質は、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記すアミノ酸配列を有する。脂質ナノ粒子組成物に処方されてもよい、SEQ ID NO:1のOTCタンパク質をコードする好適なmRNA配列は、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:8に示す配列(それぞれ残基48〜1112に対応するコード配列(CDS))を含んでもよい。脂質ナノ粒子組成物に処方されてもよい、SEQ ID NO:2のOTCタンパク質をコードする好適なmRNA配列は、SEQ ID NO:7に示す配列(残基48〜1112に対応するコード配列(CDS))を含んでもよい。脂質ナノ粒子との処方のためのOTCをコードするmRNAは、その3'末端にポリ(A)(例えば、約50〜約500個のアデニン残基からなるポリAテール)を典型的にはさらに含み、これは周知の遺伝子工学技術を用いて(例えばPCRを介して)構築物に加えてもよい。SEQ ID NO:6〜8のmRNAコンストラクトの産生および調製のための適切なDNAベクターへの挿入のために用いてもよい例示的なDNA配列は、それぞれSEQ ID NO:3〜5に示す。
細胞中のタンパク質の量を増加させることを含む別の態様では、タンパク質は、メチルマロニルCoAムターゼ(MUT)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼサブユニットA(PCCA)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼサブユニットB(PCCB)、または分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)のサブユニットである。そのような態様では、MUT、PCCA、PCCB、またはBCKDHサブユニットタンパク質をコードするmRNAは、脂質ナノ粒子組成物に処方され、本明細書において記載の膜不安定化ポリマーの同時注入または個別注入で対象に投与される。特定のバリエーションでは、mRNA分子は、SEQ ID NO:9の残基33〜750と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性(例えば、SEQ ID NO:9の残基33〜750と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むMUTタンパク質をコードする。別のバリエーションでは、mRNA分子は、SEQ ID NO:11の残基53〜728と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性(例えば、SEQ ID NO:11の残基53〜728と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むPCCAタンパク質をコードする。別のバリエーションでは、mRNA分子は、SEQ ID NO:13の残基29〜539と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性(例えば、SEQ ID NO:13の残基29〜539と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むPCCBタンパク質をコードする。コードされたMUT、PCCA、PCCB、またはBCKDHサブユニットタンパク質を細胞のミトコンドリアに向けるために、タンパク質をコードするmRNA分子は、ミトコンドリアリーダー配列をコードする配列を含む。ミトコンドリアリーダー配列は、未改変のタンパク質(例えば、SEQ ID NO:9(未改変のヒトMUTミトコンドリアリーダー配列)の残基1〜32、SEQ ID NO:11(未改変のヒトPCCAミトコンドリアリーダー配列)の残基1〜52、またはSEQ ID NO:13(未改変のヒトPCCBミトコンドリアリーダー配列)の残基1〜28)であってもよく、あるいはミトコンドリア標的シグナルペプチドを含む別のタンパク質に由来しても、または新規に合成されてもよい。組換え切断部位は、細胞中のタンパク質分解プロセシングを最適化するために、ミトコンドリアリーダー配列とポリペプチドの残りとの間の接合部に含まれてもよい。ミトコンドリアリーダー配列は、成熟MUT、PCCA、PCCB、またはBCKDHサブユニットタンパク質をコードするmRNA配列に作動可能に連結されている、すなわち、2つの配列は正確なリーディングフレーム中で繋げられ、新たに合成されたポリペプチドを細胞のミトコンドリアに向けるように配置される。具体的なバリエーションでは、ミトコンドリアリーダー配列を有するコードされたMUTタンパク質は、SEQ ID NO:9に記すアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアリーダー配列を有するコードされたPCCAタンパク質は、SEQ ID NO:11に記載のアミノ酸配列を有し、またはミトコンドリアリーダー配列を有するコードされたPCCBタンパク質は、SEQ ID NO:13に記載のアミノ酸配列を有する。本開示に係る脂質ナノ粒子を含む組成物に処方されてもよい、SEQ ID NO:9のMUTタンパク質をコードする好適なmRNA配列は、SEQ ID NO:10に示す配列(残基48〜2297に対応するコード配列)を含んでもよい。本開示に係る脂質ナノ粒子を含む組成物に処方されてもよい、SEQ ID NO:11のPCCAタンパク質をコードする好適なmRNA配列は、SEQ ID NO:12に示す配列(残基48〜2231に対応するコード配列)を含んでもよい。本開示に係る脂質ナノ粒子を含む組成物に処方されてもよい、SEQ ID NO:13のPCCBタンパク質をコードする好適なmRNA配列は、SEQ ID NO:14に示す配列(残基48〜1664に対応するコード配列)を含んでもよい。脂質ナノ粒子との処方のためのMUT、PCCA、PCCB、またはBCKDHサブユニットをコードするmRNAは、その3'末端にポリ(A)(例えば、約50〜約500個のアデニン残基からなるポリAテール)を典型的に含む。
細胞中のタンパク質の量を増加させることを含むさらに別の態様では、タンパク質はアルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)またはアルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)である。そのような態様では、ASLまたはASS1タンパク質をコードするmRNAは脂質ナノ粒子組成物に処方され、本明細書において記載の膜不安定化ポリマーの同時注入または個別注入で対象に投与される。特定のバリエーションでは、mRNA分子は、SEQ ID NO:48と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性(例えば、SEQ ID NO:48と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むASLタンパク質をコードする。別のバリエーションでは、mRNA分子は、SEQ ID NO:50と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性(例えば、SEQ ID NO:50と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むASS1タンパク質をコードする。本開示に係る脂質ナノ粒子を含む組成物に処方されてもよい、SEQ ID NO:48のASLタンパク質をコードする好適なmRNA配列は、SEQ ID NO:49に示す配列(残基48〜1439に対応するコード配列)を含んでもよい。本開示に係る脂質ナノ粒子を含む組成物に処方されてもよい、SEQ ID NO:50のASS1タンパク質をコードする好適なmRNA配列は、SEQ ID NO:51に示す配列(残基48〜1283に対応するコード配列)を含んでもよい。脂質ナノ粒子との処方のためのASLまたはASS1をコードするmRNAは、その3'末端にポリ(A)(例えば、約50〜約500個のアデニン残基からなるポリAテール)を典型的に含む。
したがって、本発明の一定の態様では、mRNAは、mRNAキャリアとしての脂質ナノ粒子に処方される。いくつかのバリエーションでは、膜不安定化ポリマーナノ粒子の逐次注入は、標的細胞における細胞質へのmRNAの送達を向上するmRNA/LNPのおよそ約1〜15分後に行われる。本開示のいくつかの態様では、LNPは、カチオン性脂質と、PEG-脂質と、コレステロールと、アニオン性脂質とを含む。脂質は、典型的には、例えば100％エタノール中で、典型的には20mg/mL〜200mg/mLで個別に可溶化され次いで混合されて、例えば次の脂質比範囲を得る：20〜60モル％のカチオン性脂質、0〜50モル％のアニオン性脂質、0〜40モル％のコレステロール、および0〜15モル％のPEG-脂質。エタノール中の脂質混合物は、1mg/mL〜40mg/mLの範囲で典型的に調製される。mRNAは、周知の手順に従う標準的なインビトロ転写反応を用いて調製してもよい。mRNA溶液は、0.01mg/mL〜1mg/mLの濃度で、ほぼ通常の生理的pH(例えばpH7.4)で水性/等張緩衝液中で典型的に希釈される。次いで、脂質混合物のエタノール溶液とmRNAの水溶液とを次いでマイクロ流体装置を用いて脂質:mRNAが1:3の比で混合してもよい。N:P比(カチオン性脂質とmRNAとの間の窒素対リンの比)が0.5〜40の脂質:mRNA製剤を調製するために、脂質濃度、mRNA濃度および混合比を調整し得る。インキュベーション時間の後、mRNA/LNPは、典型的には、水性/等張緩衝液中で一晩透析される。ポリマーは、ほぼ通常の生理的pH(例えばpH7.4)で水性/等張緩衝液中で可溶化されてもよい。可溶化ポリマーの特に好適な濃度は、1mg/mL〜50mg/mLの範囲である。製剤は、mRNAを標的細胞に送達するために用いてもよい(例えば、製剤はインビトロで細胞と接触させるかまたはインビボでマウスなどの対象に投与されてもよい)。
本開示に従ってmRNAが脂質ナノ粒子に処方され送達されるさらなるバリエーションでは、mRNA/LNPは対象における望ましくない免疫応答を低減するかまたは排除するように処方される。例えば、インビトロで転写されたRNAは、不稔開始事象によって産生された短いRNAならびに、自己相補的3'伸長、RNA鋳型からのRNAでプライミングした転写およびRNA依存性RNAポリメラーゼ活性によって作成された二本鎖(ds)RNAを含む複数の混入物を典型的に含有する。Kariko et al., Nucleic Acids Research, 2011, 1-10, doi:10.1093/nar/gkr695を参照されたい。これらのdsRNA混入物は、トール様受容体TLR3、TLR7、TLR8、レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)、およびRNA依存性タンパク質キナーゼ(PKR)を含む多数の自然免疫受容体に結合しかつ活性化することを通じて免疫刺激性であり得る。さらに、表面会合PEGを含有する脂質ナノ粒子に封入された免疫刺激性核酸の存在は、担体に対する免疫応答を刺激し得る。Semple et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 312: 1020-1026, 2005を参照されたい。Semple et alは、この免疫応答が、LNP中の非交換可能なPEG-脂質(DSPE-PEG2000またはPEGセラミドC20)の存在に依存し、その後のリポソーム封入オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の反復投与の急速な血漿排出につながること示したが、対照的に、より短いアシル鎖を有する交換可能なPEG-脂質(PEGセラミドC14)を含有するLNPに封入された核酸は、反復投与に続く循環レベルに変化がないことを示した。前記Semple et alを参照されたい。
LNPに封入されたmRNAに対する潜在的な免疫応答を低減するかまたは排除するため、ならびにmRNA/LNPの反復投与に続く潜在的な急速な血漿クリアランスを低減するかまたは排除するために、mRNAまたはmRNA/LNP製剤の一定のバリエーションを用いてもよい。例えば、免疫刺激性dsRNA混入物を除去するためにmRNAを精製してもよい(例えばHPLC精製を用いて)。HPLC精製mRNAは、I型インターフェロンサイトカイン(IFN-α、IFN-βおよびTNF-α)の刺激を回避することが示されている。前記Kariko et alを参照されたい。いくつかのバリエーションでは、mRNA配列中の1つまたは複数のウリジンは、自然免疫受容体を活性化することを回避することが示されているプソイドウリジンまたはN1-メチル-プソイドウリジンで置換される(同文献を参照されたい)。別の態様では、ウリジンを除去するかまたはその数を減らすためにmRNA配列をコドン最適化してもよく、これは自然免疫応答を活性化し得る。さらに別の態様では、LNP中の交換可能なPEG-脂質(例えばDMPE-PEG2000)は、反復投与後の活性を維持するために用いられる。これらのバリエーションのいずれか1つまたは複数は、本開示に係るmRNAのインビボ送達および関連する治療方法のために用いられてもよい。
mRNAを精製するための方法は当技術分野で一般的に公知であり、本開示に従って脂質ナノ粒子との製剤化のためのmRNAを調製するために用いられてもよい。例えば、転写混合物からのインビトロ転写(IVT)mRNA構築物の単離後、イオン対/逆相HPLCまたはアニオン交換HPLCを用いて材料のさらなる精製を行ってもよい。これらの技術は、変性条件下で実施された場合、長さに基づく配列バリアントおよび他の核酸不純物を除去することがある。イオン対/逆相HPLCは、従来のC8またはC18固定相(代替的には、ポリマーベースの媒体を用いてもよい)およびトリエチルアンモニウムアセテートなどの好適なイオン対形成剤を含有する移動相システムを利用する。物質は、伝統的にはアセトニトリル勾配を用いて溶出される。精製は変性条件下(典型的には＞55℃の温度)で行われる。強または弱アニオン交換HPLCを利用してもよい。例えば、強アニオン交換カラム(固定相中に第4級アンモニウムを利用する)は、核酸骨格とカラム固定相との相互作用を排除するためより強い塩溶液(例えば1M臭化ナトリウム)の勾配添加によって調節した溶出で、中性〜塩基性のpHで緩衝化された移動相システム(例えば、pH8.0にて20mMリン酸ナトリウム)と共に用いてもよい。強イオン環境はmRNAコンフォメーションの安定性を増加させる(したがってイオン対/逆相分離に対するより高いTmを与える)ため、精製は、二次または二重鎖構造を完全に溶解するためにより高い温度および/またはpH環境を必要とすることがある。
本発明の一定の態様では、治療剤は、治療剤による治療に影響を受けやすい疾患の治療のために標的組織の細胞に細胞内送達される。そのような態様では、治療剤は、膜不安定化ポリマーと本明細書に記載の治療剤を含む脂質ナノ粒子との組み合わせ投与を介して標的組織に、典型的には治療が求められる疾患または障害の管理に関連する従来の方法論と一致する様式で、送達される。本明細書における開示によれば、治療有効量の薬剤は、そのような治療を必要とする対象に、疾患を予防するかまたは治療するのに十分な時間および条件下で投与される。
本明細書において記載の治療剤の投与のための対象は、具体的な疾患を発症する危険性の高い患者ならびに既存の疾患を呈する患者を含む。一定の態様では、対象は、治療が求められる疾患を有すると診断されている。さらに、対象は、治療の過程において疾患の任意の変化について(例えば、疾患の臨床症状の悪化または軽減について)モニタリングされ得る。
予防的用途では、医薬組成物は、特定の疾患になりやすいか、さもなければそのリスクがある患者に、疾患のリスクを排除するかまたは低減させるかあるいは発症を遅延させるのに十分な量で投与される。治療的用途では、組成物は、そのような疾患の疑いがあるかまたは既に罹患している患者に、疾患およびその合併症の症状を治癒するかまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適した量とは、治療的または薬学的に有効な用量または量を指す。予防的および治療的な投与計画の両方で、薬剤は、十分な応答が達成されるまでいくつかの用量で通常は投与される。典型的には、応答がモニタリングされ、所望の応答が消失し始めると反復的な投薬が行われる。
本発明の方法による治療の被験患者を同定するために、受け入れられているスクリーニング方法を採用して、具体的な疾患に関連する危険因子を判定するかまたは対象において同定された既存の疾患の状態を判定してもよい。そのような方法は、例えば、特定の疾患があると診断された親戚を個体が有するかどうかを判定することを含み得る。スクリーニング方法は、例えば、肝臓における欠損しているかまたは変異したタンパク質によって引き起こされる代謝産物の蓄積についてアッセイするための血液検査(一定の肝疾患には)、または遺伝性成分(例えば、様々な癌およびタンパク質欠損疾患は一定の遺伝性成分を有することが知られている)を有することが知られている特定の疾患についての家族性状態を判定するための従来の検査も含み得る。癌の遺伝性成分は、例えば、形質転換している複数の遺伝子(例えば、Ras、Raf、EGFR、cMetおよびその他)における変異、一定のHLAおよびキラー細胞抑制受容体(KIR)分子の存在または非存在、あるいは癌細胞がNK細胞およびT細胞などの細胞の免疫抑制を直接的または間接的に調節することができる機構を含み得る(例えば、Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007を参照されたい)。この目的に向け、関心対象である特定の疾患に関連する遺伝マーカーを備えた個体を同定するためにヌクレオチドプローブを慣例的に採用し得る。また、具体的な疾患のためのマーカーを同定するのに有用な広範な免疫学的方法が当技術分野で公知である。例えば、具体的な腫瘍に関連する抗原を検出するためにモノクローナル抗体プローブを採用する様々なELISAイムノアッセイ法が当技術分野で利用可能であり周知である。スクリーニングは、既知の患者の症候、年齢因子、関連するリスク因子などによって示されるように実施してもよい。これらの方法は、臨床医が治療のために本明細書において記載の方法を必要とする患者を慣例的に選択することを可能にする。
投与には、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、単一の医薬組成物として(同時注入の態様には；典型的には投与の直前に混合される)または別個の医薬組成物として(別々の投与態様には)処方される。LNPおよび/または膜不安定化ポリマーを含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って処方され得、これによりLNPおよび/またはポリマー成分が薬学的に許容可能な担体と混合物中で組み合わされる。組成物は、その投与がレシピエントである患者によって許容され得る場合は「薬学的に許容可能な担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容可能な担体の一例である。他の好適な担体は当業者に周知である(例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)を参照されたい)。製剤は、1つまたは複数の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤などをさらに含んでもよい。
疾患治療には、医薬組成物は、治療上有効な量で対象に投与される。本発明の方法によれば、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、様々な投与形式によって、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸腔内、くも膜下腔内、および経口の投与経路によって対象に投与されてもよい。予防および治療目的には、組成物は、単一ボーラス送達で、長期間にわたる連続送達(例えば連続経皮送達)を介して、または反復投与プロトコルで(例えば、一時間に一回、一日に一回、週に一回、または隔週に一回)対象に投与してもよい。
特定の状況に適切な投薬量の決定は当分野における技術範囲内である。この文脈における有効な投薬量の決定は、動物モデル実験とそれに続くヒト臨床試験に典型的には基づき、モデル対象における対象疾患の発生または重症度を有意に低減する有効な投薬量および投与プロトコルを決定することによって導かれる。本発明の組成物の有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、治療が予防的であるか治療的であるか、ならびに組成物自体の比活性および個体における所望の応答を誘発するその能力を含む多くの異なる要因によって変動する。通常、患者はヒトであるが、いくつかの疾患では、患者は非ヒト哺乳動物であり得る。典型的には、投薬レジメンは、最適な治療応答をもたらすように、すなわち安全性および有効性を最適化するように調節される。よって、治療上または予防上有効な量は、望ましくない副次的な効果を有益な効果が上回るものでもある。治療剤の投与には、投薬量は、他のLNP成分を除いて対象の体重1kgあたり典型的には約0.1μg〜約100mg/kgまたは約1μg/kg〜約50mg/kg、より通常は約1μg/kg〜約10mg/kgまたは約10μg〜約5mg/kgである。より具体的な態様では、薬剤の有効量は、他のLNP成分を除いて約1μg/kg〜約20mg/kgの間、約10μg/kg〜約10mg/kgの間、または約0.1mg/kg〜約5mg/kgの間である。膜不安定化ポリマーの分量は、例えば、約10μg〜約200mg/kg、約10μg〜約100mg/kg、約0.1mg/kg〜約100mg/kg、約0.1mg/kg〜約50mg/kg、または約0.5mg/kg〜約50mg/kgで変動するかまたは調節されてもよい。この範囲内の投薬量は単回あるいは、例えば、一日に複数回の投与あるいは一日に一回、週に一回、隔週に一回、または月に一回の投与を含む複数回投与によって達成され得る。例えば、一定のバリエーションでは、レジメンは、最初の投与に続いて週に一回または隔週に一回の間隔での複数回の後続投与からなる。別のレジメンは、最初の投与に続いて月に一回または隔月に一回の間隔での複数回の後続投与からなる。代替的には、投与は、疾患の生理学的相関物および/または疾患の臨床症状のモニタリングによって示されるように不定期に行い得る。
脂質ナノ粒子は、事実上任意のタイプの細胞に吸着し、次いで、封入された薬剤をゆっくりと放出し得る。代替的には、吸収された脂質ナノ粒子は、細胞(例えば食作用性の細胞)によってエンドサイトーシスされてもよい。エンドサイトーシスに続いて、LNP脂質の内部リソソーム分解および封入された薬剤の放出が典型的に起きる(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368, 1985を参照されたい)。静脈内投与後、脂質ナノ粒子(例えば約0.1〜1.0μmのリポソーム)は、肝臓および脾臓に主に位置する細網内皮系の細胞によって典型的に取り込まれる。細網内皮系の細胞によるより小さなリポソームのこの優先的な取り込みは、化学療法剤をマクロファージにおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。本明細書において記載するように、膜不安定化ポリマーの投与との脂質ナノ粒子の併用投与が細胞の細胞質ゾルへのLNP会合治療剤の送達効率を向上すると考えられる。
細網内皮系は、大量の脂質ナノ粒子での飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避し得る(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428, 1984を参照されたい)。また、リポソーム膜への糖脂質-またはポリエチレングリコール-誘導体化リン脂質の組み込みが、細網内皮系による取り込みを有意に低減することが示されている(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133, 1991; Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993を参照されたい)。
脂質ナノ粒子はまた、脂質ナノ粒子のリン脂質組成を変動することによって特定の細胞または組織を標的とするように調製し得る。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤と共に調製したリポソームが、肝臓を標的とするために用いられている。(例えば、Japanese Patent 04-244,018 to Hayakawa et al ; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960, 1993を参照されたい。)これらの製剤は、大豆ホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびポリオキシエチレン硬化(ethoxylated hydrogenated)ヒマシ油(HCO-60)をメタノール中で混合し、混合物を真空下で濃縮し、次いで混合物を水で再構成することによって調製された。大豆由来のステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)を有するジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)のリポソーム製剤も肝臓を標的とすることが示されている。(例えば、Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881, 1997を参照されたい。)
脂質ナノ粒子および/または膜不安定化ポリマーはまた、本明細書において検討するような標的化リガンドを用いることによって特定の細胞または組織を標的にするように調製し得る。
いくつかの態様では、本明細書において記載の脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーは、対象における欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患を治療するための方法に用いられる。そのような治療方法は、欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患を有する対象に(a)遺伝子と相同であり例えば開裂によりサイレンシングし得るかまたはタンパク質のアミノ酸配列を特定しかつタンパク質合成中に翻訳されるポリヌクレオチドを含む有効量の脂質ナノ粒子と(b)有効量の膜不安定化ポリマーとを投与する工程を含み、ポリヌクレオチドは、疾患に関連する標的組織の標的細胞の細胞質ゾルに送達され、これにより疾患が治療される。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は対象内の標的組織の標的細胞の表面の分子に特異的に結合する標的化リガンドを含む。本明細書において開示される方法によって治療可能な対象における欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患の例は、肝臓癌(例えば肝細胞癌)、肝炎、高コレステロール血症、肝線維症、およびヘモクロマトーシスを含む。別のバリエーションでは、本明細書において開示される方法によって治療可能な対象における欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患または状態は、乳房、卵巣、膵臓、子宮内膜、肺、腎臓、結腸、脳(例えばグリア芽細胞腫)、または造血起源の骨髄細胞の癌である。
一定の態様では、欠陥遺伝子の発現に関連する疾患は、機能性ポリペプチドの欠損を特徴とする疾患(本明細書においては「タンパク質欠損に関連する疾患」または「タンパク質欠損疾患」と呼ばれる)である。そのような治療方法は、タンパク質欠損疾患を有する対象に(a)機能性タンパク質または該機能性タンパク質と同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードするmRNAを含む有効量の脂質ナノ粒子と(b)有効量の膜不安定化ポリマーとを投与する工程を含み、mRNAはタンパク質欠損に関連する標的組織の標的細胞の細胞質ゾルに送達され、疾患を治療するのに十分な量で標的組織内にコードされたタンパク質を産生するようにタンパク質合成中にmRNAが翻訳される。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、標的組織の標的細胞の表面の分子に特異的に結合する標的化リガンドを含む。具体的なバリエーションでは、mRNAは、機能性エリスロポエチン、アルファ-ガラクトシダーゼA、LDL受容体、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、ヘパラン-N-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、ガラクトース6-スルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、アルファ-1-抗トリプシン、アリールスルファターゼA、アリールスルファターゼB、酸性セラミダーゼ、酸性α-L-フコシダーゼ、酸性β-グルコシダーゼ（グルコセレブロシダーゼとしても公知である）、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α-マンノシダーゼ、酸性β-マンノシダーゼ、N-アセチルガラクトサミン-6-硫酸スルファターゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼB、アセチル-CoA:α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-サルフェートスルファターゼ、アルファ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β-グルクロニダーゼ、またはβ-ヘキソサミニダーゼAをコードする。別の態様では、mRNAは、機能性網膜芽腫タンパク質(pRb)、p53腫瘍サプレッサータンパク質、ホスファターゼおよびテンシン相同体(PTEN)、フォン・ヒッペル・リンドウ腫瘍サプレッサー(pVHL)、大腸腺腫性ポリポーシス(APC)、FAS受容体(FasR)、腫瘍原性抑制5(ST5)の抑制、YPEL3、腫瘍原性タンパク質7(ST7)のサプレッサー、または腫瘍原性14タンパク質のサプレッサー(ST14)をコードする。さらに別の態様では、mRNAは、機能性ガラクトース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、トランスサイレチン、補体調節タンパク質(例えば、因子H、因子I、または膜補因子タンパク質)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、ホモゲンチセート1,2-ジオキシゲナーゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、またはP型ATPアーゼタンパク質、FIC-1をコードする。
本明細書において開示される方法によって治療可能な対象における欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患または状態のさらなる例は、肝臓における単一遺伝子代謝異常に関連するタンパク質欠損疾患を含む。例示的な肝臓のタンパク質欠損疾患は、尿素サイクル異常症(例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症、カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)欠損症、アルギノコハク酸尿症(アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)欠損症)、およびシトルリン血症(アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)欠損症))；チロシン血症1型(フマリルアセトアセターゼ(FAH)酵素欠損症)；原発性高シュウ酸塩尿症1型(アラニン:グリオキシレート-アミノトランスフェラーゼ(AGT)欠損症)；有機酸血症(例えば、メチルマロン酸血症(MMA；例えばメチルマロニルCoAムターゼの欠損症)、プロピオン酸血症(PA；プロピオニルCoAカルボキシラーゼ(PCC)欠損症)、およびメープルシロップ尿症(MSUD；分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)欠損症))；ウィルソン病(銅輸送ATPアーゼ、Atp7Bの欠損症)；クリグラー・ナジャー症候群1型(ビリルビンウリジンジホスフェートグルクロニルトランスフェラーゼ(BGT)酵素欠損症)；ヘモクロマトーシス(ヘプシジン欠損症)；グリコーゲン蓄積症(GSD)1a型(グルコース-6-ホスファターゼ(G6Pアーゼ)欠損症)；グリコーゲン蓄積症(GSD)1b型(グルコース6-ホスフェートトランスロカーゼ欠損症)；リソソーム蓄積症(LSD；リソソーム酵素の欠損)、例えばゴーシェ病1、2、および3型(リソソームグルコセレブロシダーゼ(GB)欠損症)、ニーマン・ピック病C型(NPC1またはNPC2遺伝子いずれかの変異)、およびニーマン・ピック病AおよびB型(酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)欠損症)など；アルファ-1抗トリプシン(A1AT)欠損症；血友病B(第IX因子欠損症)；ガラクトース血症1、2、および3型(それぞれガラクトース-1-ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、およびUDP-ガラクトース4-エピメラーゼ欠損症)；トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス(TTR-家族性アミロイド多発性ニューロパチー；トランスサイレチン欠損症)；非定型溶血性尿毒症症候群-1(第H因子、第I因子、または膜補因子タンパク質などの補体制御タンパク質の欠損症)；フェニルケトン尿症(フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)欠損症)；アルカプトン尿症(ホモゲンチゼート1,2-ジオキシゲナーゼ欠損症)；急性間欠性ポルフィリン症(ポルホビリノーゲンデアミナーゼ欠損症)；レッシュ・ナイハン症候群(ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)欠損症；および進行性家族性肝内胆汁うっ滞(PFIC)(P型ATPアーゼタンパク質、FIC-1欠損症))を含む。リソソーム蓄積症(LSD)であるタンパク質欠損疾患の追加の例は、ファブリー病(アルファ-ガラクトシダーゼA欠損症)；ファーバー病(酸性セラミダーゼ欠損症)；フコシドーシス(酸性α-L-フコシダーゼ欠損症)；GM1ガングリオシドーシス(酸性β-ガラクトシダーゼ欠損症)；ハンター症候群(ムコ多糖症II型(MPS II)；イズロネート-2-スルファターゼ欠損症)；ハーラー・シャイエ、ハーラー、およびシャイエ症候群(ムコ多糖症I型(MPS I)；アルファ-L-イズロニダーゼ欠損症)；クラッベ病(ガラクトセレブロシダーゼ欠損症)；α-マンノシドーシス(酸性α-マンノシダーゼ欠損症)；β-マンノシドーシス(酸性β-マンノシダーゼ欠損症)；マロトー・ラミー症候群(ムコ多糖症VI型(MPS VI)；アリールスルファターゼB欠損症)；異染性白質ジストロフィー(アリールスルファターゼA欠損症)；モルキオ症候群A型(ムコ多糖症IVA型(MPS IVA)；N-アセチルガラクトサミン-6-サルフェートスルファターゼ欠損症)；モルキオ症候群B型(ムコ多糖症IVB型(MPS IVB)；酸性β-ガラクトシダーゼ欠損症)；ポンペ病(酸性α-グルコシダーゼ欠損症)；サンドホフ病(β-ヘキソサミニダーゼB欠損症)；サンフィリポ症候群A型(ムコ多糖症IIIA型(MPS IIIA)；ヘパラン-N-スルファターゼ欠損症)；サンフィリポ症候群B型(ムコ多糖症IIIB型(MPS IIIB)；アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ欠損症)；サンフィリポ症候群C型(ムコ多糖症IIIC型(MPS IIIC)；アセチル-CoA:α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ欠損症)；サンフィリポ症候群D型(ムコ多糖症IIID型(MPS IIID)；N-アセチルグルコサミン-6-サルフェートスルファターゼ欠損症)；シンドラー/カンザキ病(アルファ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ欠損症)；シアリドーシス(シアリダーゼ欠損症)；スライ症候群(ムコ多糖症VII;型(MPS VII)；β-グルクロニダーゼ欠損症)；およびテイ・サックス病(β-ヘキソサミニダーゼA欠損症)を含む。
特定のバリエーションでは、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)タンパク質をコードするmRNAは、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)を治療するために本方法に従って送達される。OTCDは、脳損傷、昏睡または死にも至る生命を脅かす疾患である高アンモニア血症を引き起こし得る尿素サイクル異常症である。これは、主に肝臓で起こり体内の過剰な窒素の除去を担う尿素サイクルにおける重要な酵素であるOTCの活性の欠損に起因する。アンモニウム性窒素は、タンパク質摂取ならびに体内でのタンパク質の分解から産生される。肝臓では、このアンモニア性窒素は尿素サイクル中の酵素によって尿素に変換される。尿素は非毒性であり、普通は腎臓を通じて尿へ容易に取り除かれる。しかしながら、OTC酵素が欠乏すると、アンモニアレベルが血液中で上昇し重度の脳損傷を引き起こす。重度のOTC欠損症を有する患者は出生後2〜3日に同定されることが最も多く、患者は血中アンモニアレベルが有意に上昇し昏睡状態に陥る。より軽度のOTC欠損症を有する患者は、ストレス時に発作を起こしアンモニアレベルの上昇を引き起こし、これもまた昏睡に至り得る。現行の治療法は、高アンモニア血症を有する患者に用いるためのアンモニア捕捉剤(Buphenyl、Ravicti)を含む。
OTC遺伝子はX-リンクしている。この疾患は、1つの変異対立遺伝子を有する男性において、および変異対立遺伝子とホモ接合またはヘテロ接合した女性において存在する。男性患者は、典型的には、出生直後に見られる最も重度のOTC欠損症を有するものである。血液アンモニア濃度の上昇に加えて、尿中のオロチン酸レベルもまた上昇する。重度のOTC欠損症を有する患者では、OTC酵素活性は正常レベルの<20％である。より軽度のOTC欠損症を有する患者では、OTC酵素活性は正常レベルの最大で30％までである。
OTCをコードするmRNAを含む脂質ナノ粒子と膜不安定化ポリマーとでOTCDを治療するための方法は、有効量の脂質ナノ粒子と有効量の膜不安定化ポリマーとをOTCDを有する対象に投与する工程を概して含み、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方は、対象内の肝細胞の表面の分子に特異的に結合する標的化リガンドを含み、これによりOTCをコードするmRNAが肝細胞に送達され、タンパク質合成中に翻訳されてOTCタンパク質を産生する。OTCをコードするmRNAは、細胞中のOTCタンパク質を増加するための方法に関して上に示したmRNAであってもよい。
疾患を治療するための組成物または方法の有効性は、疾患の動物モデルにおいてインビボで評価し得る。OTCDの治療のための[脂質ナノ粒子]/[膜不安定化ポリマー]組成物(またはLNP組成物とポリマー組成物との組み合わせ)の有効性を評価するために特に好適な動物モデルは、肝臓におけるOTC酵素が欠乏した公知のマウスモデルを含む。そのようなマウスモデルの1つであるOTC-spfash(被毛疎および異常な皮膚および毛髪)マウスは、OTCタンパク質のレベルを低下させるR129H変異を含有し、肝臓における酵素活性が正常レベルのわずか5〜10％である(Hodges et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4142-4146, 1989を参照されたい)。別のモデルであるOTC-spfマウスは、正常レベルの5〜10％という低下した酵素活性レベルをもたらすH117N変異を含有する(Rosenberg et al., Science 222:426-428, 1983を参照されたい)。これらのマウスモデルは両方ともそれらの野生型同腹仔マウスと比較して尿オロチン酸レベルが上昇している。OTC欠損症のための第3のモデルは、OTC-spfまたはOTC-spfashマウスにおいて高アンモニア血症を誘発することである(Cunningham et al., Mol Ther 19:854-859, 2011)。これらのマウスをOTC siRNAまたはAAV2/8ベクター/OTC shRNAで処理して、残存する内因性OTC発現および活性をノックダウンする。血漿アンモニアレベルが上昇し、マウスはおよそ7〜28日以内に死亡する。
付加的なバリエーションでは、有機酸血症を治療するために、有機酸血症において欠乏する酵素をコードするmRNAが本方法に従って送達される。有機酸血症(酸尿症としても公知である)(OA)は、尿への非アミノ有機酸の排出を特徴とする疾患群である。ほとんどの有機酸血症は、通常は酵素活性の欠乏の結果であるアミノ酸異化作用の特定の段階の機能不全から引き起こされる。大部分の有機酸障害は、分岐鎖アミノ酸またはリジンの異常なアミノ酸異化作用を原因とする。それらは、プロピオン酸血症(PA)、メチルマロン酸血症(MMA)、メープルシロップ尿症(MSUD)などを含む。これらの有機酸血症は常染色体劣性様式で遺伝される。OAに罹患した新生児は、通常は出生時および生後数日間は順調である。通常の臨床症状は毒性脳症のものであり、嘔吐、摂食不良、発作および変調などの神経症状、ならびに昏睡状態に進行する嗜眠を含む。生後10日間での診断および治療によって予後を改善し得る。年長の子供または若者では、OAの異形態は、知的機能の喪失、運動失調または他の局所性神経徴候、ライ症候群、再発性ケトアシドーシス、または精神科的症状として存在し得る。
臨床検査所見は、有機酸血症がアシドーシス、ケトーシス、高アンモニア血症、異常な肝機能、低血糖、および好中球減少を含むことを示す。有機酸血症の一次診断は、質量分析(GC/MS)と共にガスクロマトグラフィーを用いた尿中有機酸分析である。尿の有機酸プロファイルは、急性疾患にあってほぼ常に異常である。確証試験は、リンパ球または培養線維芽細胞における欠乏酵素の活性のアッセイおよび/または分子遺伝学的検査を含む。3つの主要な障害の特徴を表1にまとめる。
（表１）異常なアミノ酸異化作用に起因する有機酸血症における代謝所見
Figure 2018509387
具体的な分析物の検出で診断の可能性が絞り込まれたら、確認試験としてリンパ球または培養線維芽細胞において欠損酵素の活性をアッセイする。多数の経路には、単一の酵素アッセイでは診断を確定し得ない。他には、補完試験などの検査を行う必要がある。
治療のゴールは、生化学的および生理学的恒常性を回復することである。新生児は、具体的な生化学的病変、代謝ブロックの位置、および毒性化合物の影響に応じて緊急の診断および治療を必要とする。治療ストラテジーは、(1)前駆体アミノ酸の食事制限および(2)(a)有毒な代謝産物を廃棄するかまたは(b)欠乏した酵素の活性を増加させるための補助化合物の使用を含む。肝移植は少数の罹患者では成功している。現在の臨床管理アプローチでも、有機酸血症の患者は感染のリスクがより高く、致死的であり得る膵炎の発生率がより高い。
肝臓への具体的なmRNA送達を介した酵素補充療法は、有機酸血症の最も有効な治療法を提供する。有機酸血症を治療するための方法の一定の態様では、メチルマロニルCoAムターゼ(MUT)をコードするmRNAが、メチルマロン酸血症MMAを治療するために本方法に従って対象に送達される。別の態様では、PCCサブユニット(PCCAまたはPCCB)をコードするmRNAが、プロピオン酸血症(PA)を治療するために本方法に従って対象に送達される。さらに別の態様では、BCKDHサブユニットをコードするmRNAが、メープルシロップ尿症(MSUD)を治療するために本方法に従って対象に送達される。Mut、Pcca/b、またはBCKDHサブユニットmRNAを含む脂質ナノ粒子と膜不安定化ポリマーとでMMA、PAまたはMSUDを治療するための方法は、有効量の脂質ナノ粒子および有効量の膜不安定化ポリマーを特定のタイプの有機酸血症を有する対象に投与する工程を概して含み、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方が、対象内の肝細胞の表面の分子に特異的に結合する標的化リガンドを含み、これにより、Mut、Pcca/b、またはBCKDHサブユニットmRNAが肝臓細胞に送達され、タンパク質合成中に翻訳されてそれぞれのタンパク質が産生される。MutまたはPcca/b mRNAは、細胞中のそれぞれのタンパク質を増加するための方法に関して上に記したmRNAであってもよい。
有機酸血症を治療するための組成物または方法の有効性は、疾患の動物モデルにおいてインビボで評価し得る。例えば、MMAおよびPAの治療のためのmRNA/LNPおよびポリマー組成物(またはmRNA/LNP組成物とポリマー組成物との組み合わせ)の有効性を評価するための特に好適な動物モデルは次の通りである。普通は生後21日以内に死亡する重症型のMMAを有するMut-/-新生児マウスは、メチルマロニル-CoAムターゼ(Mut)遺伝子の肝細胞指向送達で結果よく治療されている。ネズミMut遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスの肝内注入後、Mut-/-マウスは救われ、1歳を超こえるまで生きた(Carrillo-Carrasco et al., Hum. Gene Ther. 21:1147-1154, 2010)。マウスが成体期まで生存する別のMMA疾患モデルは、隔離された筋肉特異的プロモーター(Mut-/-; TgINS-MCK-Mut)の制御下で発現されるMut cDNAを有するMut-/-マウスである(Manoli et al., 2011, SIMD Abstract)。これらのマウスは、13Cプロピオン酸酸化/呼吸アッセイ(oxidation/breathe assay)によって測定される上昇した血漿メチルマロン酸レベルおよび低下した酸化能力を有する。PA(Pcca-/-マウス)のマウスモデルは、生後24〜36時間で死に至り、致死的ケトアシドーシスと関連している(Miyazaki et al , J. Biol. Chem. 276:35995-35999, 2001)。トランスジェニックマウス系統の肝臓において10〜20％の出生後PCC活性をもたらすPcca遺伝子導入は、新生児マウスにおける致死的ケトアシドーシスを弱める(前記Miyazaki et al., 2001)。最近、ヒトPccaの肝内アデノ随伴ウイルス媒介性遺伝子導入を新生児Pcca-/-マウスで試験した(Chandler et al., Hum. Gene Ther. 22:477-481, 2010)。筆者らは、およそ64％の生存率および疾患関連代謝物の減少で実証される持続的な治療効果を見出した(前記Chandler et al., 2010)。PAの別のマウス疾患モデルは、Pcca-/-マウスがPCCAタンパク質のA138T変異体を備えた導入遺伝子を発現する低次形態モデルである。これらのマウスは、活性が野生型PCCの2％であり、成体期まで生存し、疾患関連代謝物が上昇している(Guenzel et al., Mol. Ther. 21:1316-1323, 2013)。ヒトPCCA cDNAを発現するアデノウイルスまたはAAVベクターでこれらのマウスを処理すると、PCC酵素活性が増加し、疾患マーカーレベルが修正された(前記Guenzel et al., 2013)。まとめると、MMAおよびPAのネズミモデルでは、遺伝子導入アプローチは、新生仔マウスを救うかまたは酵素活性を回復し、成人病モデルにおける疾病代謝産物レベルを修正し、これにより欠陥のある酵素の回復についてのmRNA送達の評価が可能になる。
付加的なバリエーションでは、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)またはアルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)をコードするmRNAは、アルギニノコハク酸尿症(ASA)またはシトルリン血症I型(CTLN I)をそれぞれ治療するために本方法に従って送達される。ASAおよびCTLN Iの治療のためのmRNA/LNPおよびポリマーの有効性を評価するのに好適な動物モデルは次の通りである。ASL低次形態マウスは、ASAに特有のASL酵素の欠損(mRNAおよびタンパク質が野生型レベルの約10％)およびアルギニノコハク酸およびシトルリン血漿レベルの上昇をもたらすイントロン9に挿入されたネオマイシン遺伝子を有する(Erez et al., Nat Med. 17:1619-1626, 2011)。未治療のままにしておくとこれらのマウスは3週齢前後からひとりでに死亡する。これらのマウスを4週齢でマウスASLを発現するヘルパー依存性アデノウイルスベクターで治療すると、生存率の改善、ASLタンパク質発現の正常化、およびアルギニノコハク酸およびシトルリン血漿レベルの低下がもたらされた(Nagamani et al., Am J Hum Genet. 90:836-846, 2012)。ASS1低次形態マウスは、濾胞性ジストロフィー(fold)として知られる自発的劣性変異(T389I置換)から生じる。この変異は、不安定なASS1タンパク質構造および正常な酵素活性の約5〜10％に至る。ホモ接合性のfold/foldマウスは、血漿シトルリンおよびアンモニアレベルが上昇している。これらのマウスも未処置の場合にひとりでに死亡する(Perez et al., Am J Pathol.177:1958-1968, 2010)。ヒトASS1を発現するAAV8ベクターでこれらのマウスを治療すると、生存率が改善され、血漿シトルリンおよびアンモニアレベルが低下した(Chandler et al., Gene Ther. 20:1188-1191, 2013)。したがって、ASAおよびCTLN Iのネズミモデルでは、肝臓遺伝子導入法は酵素活性を回復し、疾患を直し、これにより、欠陥のある酵素の回復についてのmRNA送達の評価が可能になる。
欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患を治療する方法の一定の別の態様では、遺伝子は、成長因子遺伝子、成長因子受容体遺伝子、酵素(例えば、ホスファターゼまたはキナーゼ、例えばタンパク質チロシン、セリンまたはスレオニンキナーゼ)をコードする遺伝子、アダプタータンパク質遺伝子、Gタンパク質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、または転写因子をコードする遺伝子より選択される。
本明細書において記載の欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患を治療する方法において有用な好適な遺伝子標的のさらなる例は、次の遺伝子または次のタンパク質をコードする遺伝子を含む：MEX3、MMP2、ApoB、ERBB2、血管内皮成長因子(VEGF)、血管内皮成長因子受容体(VEGFR)、血小板由来成長因子受容体(PDGF)、ABL、KITT、FMS様チロシンキナーゼ3(FLT3)、Cav-1、上皮成長因子受容体(EGFR)、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Bcl-2、Survivin、FAK、STAT-3、HER-3、ベータカテニン、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルファ-1-抗トリプシン、およびSrc。
本明細書において記載の欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患を治療する方法に有用な好適な遺伝子標的の別の例は腫瘍抑制因子を含み、変異した遺伝子の機能の喪失は癌を治療するための機能性タンパク質をコードするmRNAの送達によって修正され得る。好適な腫瘍サプレッサー標的は、網膜芽腫タンパク質(pRb)、p53腫瘍サプレッサータンパク質、ホスファターゼおよびテンシン相同体(PTEN)、フォン・ヒッペル・リンドウ腫瘍サプレッサー(pVHL)、大腸腺腫性ポリポーシス(APC)、FAS受容体(FasR)、腫瘍原性抑制5(ST5)のサプレッサー、YPEL3、腫瘍原性タンパク質7(ST7)のサプレッサー、および腫瘍原性14タンパク質のサプレッサー(ST14)を含む。
一定の態様では、膜不安定化ポリマーと本明細書において記載の治療剤を含む脂質ナノ粒子とは、治療剤による治療に影響を受けやすい疾患の治療のための医薬品または医薬品の組み合わせの調製に用いられる。いくつかのそのような態様では、疾患は、対象における欠陥遺伝子の発現および/または活性に関連する疾患である。
いくつかの態様では、膜不安定化ポリマーと本明細書において記載の機能性タンパク質をコードするmRNAを含む脂質ナノ粒子とは、機能性タンパク質の欠損と関連する疾患の治療のための医薬品または医薬品の組み合わせの調製に用いられる。
本発明を次の非限定的な実施例によってさらに説明する。
この明細書の全体を通じて、様々な公知の頭字語および略語を用いてモノマーまたはそのようなモノマーの重合から誘導されるモノマー残基を記載する。限定するものではないが、別記しない限り、「BMA」(または等価の簡略表記としての文字「B」)は、ブチルメタクリレートまたはそれから誘導されるモノマー残基を指し；「DMAEMA」(または同等の略記法としての文字「D」)は、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレートまたはそれから誘導されるモノマー残基を表し；「PAA」(または等価の簡略表記としての文字「P」)は、2-プロピルアクリル酸またはそれから誘導されるモノマー残基を指し；「PEGMAn」は、n＝8〜9または4〜5で、ペグ化メタクリルモノマー、CH3O(CH2CH2O)nC(O)C(CH3)CH2またはそれから誘導されるモノマー残基を指し；「PDSMA」は、2-(ピリジン-2-イルジスルファニル)エチルメタクリレートまたはそれから誘導されるモノマー残基を表し；「TFPMA」は、2,3,5,6-テトラフルオロフェニルメタクリレートまたはそれから誘導されるモノマー残基を表し；「PFPMA」は、ペンタフルオロフェニルメタクリレートまたはそれから誘導されるモノマー残基を表す。いずれの場合も、そのような表記はモノマー(その塩またはイオン性アナログを全て含む)またはモノマーの重合に由来するモノマー残基(その塩またはイオン性アナログを全て含む)を示し、具体的な示された形態は当業者には文脈から明らかである。次の実施例におけるポリマーまたはマクロCTAの図は、特定のブロック内の構成単位の特定の配置を記載することを意味していない。本明細書において用いられる「KDa」および「k」は、キロダルトンでの分子量を指す。
次の図は、ポリマーの調製に用いたモノマーの構造の例示である。
Figure 2018509387
モノマーおよびポリマーの1H NMRスペクトルは、25℃で重水素化溶媒中Varian 400MHzで記録した。
マススペクトルは次の設定を用いてBruker Esquire Ion Trap装置で取得した：エレクトロスプレーイオン化、キャピラリー出口電圧100.0V、走査80.00m/z〜2200.00m/z、ドライガス流量6.0L/分。質量分析は、UV検出器を有するAgilent 1290 Infinity UHPLCシステムを備えた6520 Accurate Mass Q-TOF LC/MSでも行った。
Viscotek GPC max VE2001および屈折計VE3580(Viscotek, Houston, TX)を用いてDMF中のコポリマー試料の分子量および多分散性(PDI、Mw/Mn)を判定するためにゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)を用いた。分析は、マッチするガードカラムと共に57℃で直列にした2つのPolarGel-Mカラム(300mm×7.5mm、Agilent Technologies)、またはマッチするガードカラムと共に57℃で直列にした2つのPolarGel-Lカラム(300 mm×7.5 mm、Agilent Technologies)、または57℃で直列にした2つのTSKgel G3000SWカラム(300mm×7.5mm、10μm、Tosoh Biosciences LLC)を用いて行った。1.0 wt％LiBrを含有するHPLCグレードのジメチルホルムアミド(DMF)を移動相として用いた。
NanoDrop UV/Vis分光計(経路長0.1cm)を用いてUV/Vis分光法を実施した。
ポリマーの粒度は、Malvern Zetasizer Nano ZSを用いた動的光散乱法によって測定した。
HPLC分析は、C18分析用逆相カラム(ES Industries Chromega Columns、Sonoma C18カタログ番号155B21-SMA-C18(2)、100Å、25.0cm×4.6mm、カラムを30℃まで加熱、またはC18 Phenomenex 5μ 100Å 250×4.6mm×5ミクロン(品番00G-4252-E0)Lunaカラム、30℃まで加熱したガードカラム付き)を有する可変波長UV検出器を有するShimadzu LD-20ABで実施した。
別に示す場合を除き、全ての試薬は市販のものであり、重合反応に使用する前に痕跡量の安定化剤からモノマーを精製した。シアノ-4-(エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸(ECT)はOmm Scientificから入手した。特に記載する場合を除き、全ての重合反応においてラジカル開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)(Wako chemicals)を用いた。
実施例1：ポリマーを逐次注入した脂質mRNAナノ粒子製剤
DOTAP(Corden Pharma, Boulder, Colorado, USA:カタログ番号LP-R4-117)またはDOTMA(Avanti Polar Lipid Alabaster, Alabama, USA：カタログ番号890898P)を室温で15分間200プルーフのエタノールに200mg/mLで可溶化した。DMPE-PEG2K(Corden Pharma, Boulder, Colorado, USA:カタログ番号LP-R4-123)を室温で15分間200プルーフのエタノールに25mg/mLで可溶化した。コレステリルヘミサクシネート(CHEMS)(Avanti Polar Lipid Alabaster, Alabama, USA:カタログ番号850524P)およびコレステロール(CHOL)(Corden Pharma, Boulder, Colorado, USA：カタログ番号CH-0355)を個別に75℃で5分間200プルーフに25mg/mLで可溶化した。典型的には、N:P比が7のDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2K(50:32:16:2モル％)LNPの調製物2mLには、200プルーフのエタノール中の200mg/mL DOTAPを22μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL CHEMSを79μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL CHOLを31.4μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL DMPE-PEG2Kを27.4μL、および200プルーフのエタノールを506μL含有する脂質エタノール混合物を最終容量が0.666mLおよび最終脂質濃度が11.83mg/mLになるように調製した。脂質ナノ粒子(LNP)製剤は、DOTAPまたはDOTMA濃度に基づいてN:P(窒素対リン酸)比が3.5〜28で調製した。DOTAP:CHEMSまたはDOTMA:CHEMS比は、様々なN:P比でそれぞれ50:32モル％で1.6に固定した。DMPE-PEG2Kは2〜5モル％で変動させた。CHOLのモル％は最終脂質濃度が100モル％になるように調整した。
10mM Tris-HCl(pH7.5)中の1mg/mL Fluc(ホタルルシフェラーゼ)mRNA原液(TriLink Biotechnologies, San Diego, California, USA; カタログ番号L-6107)を20mM HEPES/5％グルコースpH7.4緩衝液(HEPES緩衝液)で0.225mg/mLまで希釈した。Precision NanoSystems Inc(Vancouver BC, Canada)のマイクロ流体デバイスを12mL/分の流速で用いて、エタノール脂質溶液をHEPES緩衝液中の0.225mg/mL mRNAと1:3の比(エタノール中の脂質混合物、mRNAのHEPES緩衝溶液)で混合することによりN:P比が3.5〜28のmRNA/LNPを構築した。33％エタノール中のmRNA/LNPを次いで室温で60分間インキュベートした後、100容量(200mL)のHEPES緩衝液に対して18時間透析した。
逐次注入のために用いたポリマーであるポリマーP1435(NAG-C5N-PEG0.6K-[PEGMA30087.9％-PDSMA12.1％]3.9kDa-b-[DMAEMA34.7％-BMA53.5％-PAA11.8％]6.1kDa)をHEPES緩衝液に400rpmで1時間アジテーションしながら20mg/mLで可溶化し、次いで4℃で一晩保存した。ポリマーは、注入前にHEPES緩衝液で7.5mg/mLまで希釈した。
mRNA/LNPおよびポリマーを同時注入する場合は、それぞれの2X溶液を調製した。投薬直前に溶液を混合し直ちに注入した。
製剤の粒度は、90μLのHEPES緩衝液に加えて10μLの製剤を使い捨てのマイクロキュベットに入れて、Malvern Instrument ZETASIZER NANO-ZSを用いて分析することによって測定した。LNPは52nm(z平均)の粒度を示した。pH7.4での製剤のゼータ電位は、740μLのHEPES緩衝液に加えて10μLの製剤を使い捨ての1mLキュベットに入れることによって測定した。pH4での製剤のゼータ電位は、740μLのスクロースアセテート緩衝液(pH4)に加えて10μLの製剤を使い捨ての1mLキュベットに入れることによって測定した。ゼータディップセルを1mLキュベットに挿入し、ZETASIZER NANO-ZSを用いて製剤を分析した。典型的には、DOTMA LNPは、pH7では+12mV、pH4.0では+16mVのゼータ電位を有していた。mRNAをコンパクトにするLNPの能力は、SYBR Gold色素染色アッセイを用いて96ウェルプレートで測定した。典型的には、0.01mg/mL mRNAでの50μLの脂質製剤を150μLの希釈SYBR Gold原液(3mLのHEPES緩衝液中の1μLのStock SYBR Gold)に加え、アジテーション(100RPM)しながら15分間室温でインキュベートした。蛍光を励起波長495nmおよび発光波長538nmで読み取った。パーセント色素染色性は、処方されたmRNAの蛍光強度を遊離mRNAの蛍光強度で割ったもの×100で算出した。DOTMA LNPは、HEPES緩衝液中で調製すると2％の色素染色性を示した。下記表2は、例示的なLNP製剤の特性を示す。
（表２）
Figure 2018509387
実施例2：脂質-mRNA製剤とポリマーの同時注入または連続注入とによるmRNAのインビボ発現
Fluc mRNA/LNP + ポリマー製剤を評価するために雌CD-1マウス(7〜10週齢)を用いた。1mg/kgのmRNAおよび13〜103mg/kgの脂質で製剤を静脈内に投薬し、1群あたり5匹のマウスに注入した。ポリマーP1435単独を75mg/kg、Fluc mRNA/LNP注入と同時注入または1、5、10、30、60または120分後に逐次的に静脈内に注入した。HEPES緩衝液を注入したマウスを対照として用いた。各注入には、個々の体重に基づいておよそ0.25mLまたは10mL/kgの最終投薬容量をマウスに与えた。
ルシフェラーゼのインビボ発現は、Xenogen IVIS Lumina II Imaging System (Caliper Life Sciences, 現Perkin Elmer)を用いてマウスにおける発光を検出することによって評価した。投薬の6時間後に画像化を実施した。画像化の15分前に、各マウスはのルシフェラーゼ基質である0.25mLのD-ルシフェリン(Perkin Elmer)を腹腔内に15mg/mL(PBSに溶解)注入した。画像化の数分前に、マウスをイソフルランチャンバー内に入れ麻酔(約3％のイソフルラン濃度)を誘導した。続いて、マウスの腹部側を上にして鼻部をイソフルラン充填ノーズコーンに接触させながらマウスをIVISイメージングチャンバーに移した。リビングイメージソフトウェア(Caliper Life Sciences)を用いて、露光時間、ビニングおよびF/Stopを試験の全体を通じて同じままにして発光画像を取得した。画像化が終了するとマウスをすぐにケージに戻し、それらは1〜3分以内に覚醒した。
全てのマウスについて画像の取得が終了した後、発光結果をLiving Imageソフトウェアを用いて分析した。簡単に説明すると、具体的な発光シグナルを表示しかつバックグラウンドシグナルを除去するために各画像のカラースケールをまず調整した。次いで関心領域(ROI)ツールを用いて肝臓のROIの輪郭を規定し、ROI測定ボタンをクリックして光子束データを表示した。発光の強度を示すために各動物のROIの全光束(光子/秒)を用いた。比較のため各製剤群について5匹全てのマウスからの全光束を平均した。
表3は、最初の注入の10分後にポリマーP1435を逐次的に注入したかまたはしなかったDOTMA:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/LNP単独ではほとんど発光が見られなかった(緩衝液よりわずか3倍高い)が、ポリマーP1435の逐次注入を伴うと発光シグナルに100倍の改善が認められた。
（表３）
Figure 2018509387
表4は、最初の注入の10分後にポリマーP1435またはポリマーP1299を逐次的に注入したかまたはしなかったDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。14〜27のN:P比および2〜5モル％のDMPE-PEG2kのバリエーションを評価した。データは投薬の6時間後に取得した。この場合でも、mRNA/LNP単独ではほとんど発光が見られなかったが、ポリマーP1435の逐次注入を伴うと発光シグナルに100倍の改善が認められた。N:P比を27から14まで減少させかつDMPE-PEG2kを5から3.5モル％まで減少させることによって発光シグナルがさらに3倍改善した。ポリマーP1299(NAG-C5N-PEG0.6k-[PEGMA30080％-PDSMA10％-BPAM10％]3.5kDa-b-[DMAEMA34％-BPAM56％-PAA10％]6.3kDa)の逐次注入は、mRNA/LNP単独と比較して発光シグナルにおける5倍の改善を示した。
（表４）
Figure 2018509387
表5は、最初の注入の10分後にポリマーP1435を逐次的に注入したまたは同時注入したかあるいはしなかったDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。3.5〜14のN:P比を評価した。データは投薬の6時間後に取得した。この場合でも、mRNA/LNP単独ではほとんど発光が見られなかったが、ポリマーP1435の逐次注入を伴うと発光シグナルに300倍の改善が認められた。N:P比を14から7まで減少させかつDMPE-PEG2kを2モル％まで減少させることによって、mRNA/LNP単独と比較して発光シグナルがほぼ500倍改善した。N:P比を3.5までさらに減少させると発光がより弱くなった。mRNA/LNPおよびポリマーP1435の逐次注入は、同時注入と比較してわずかに良好な発光シグナルを示した。
（表５）
Figure 2018509387
表6は、最初の注入の1〜120分後にポリマーP1435を逐次的に注入したまたは同時注入したかあるいはしなかったDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。データは投薬の6時間後に取得した。発光シグナルは1〜10分の間は類似しており、30〜120分では低下した。mRNA/LNPおよびポリマーP1435の逐次注入は、同時注入と比較して4倍高い発光シグナルを示した。
（表６）
Figure 2018509387
表7は、最初の注入の1分後にポリマーP1435を逐次的に注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。データは投薬の6時間後に取得した。この実験では、2つの異なるFluc mRNAを試験した。Fluc 2 mRNAは、Fluc 1 mRNAと比較して発光シグナルに15倍の改善を示した。Fluc 2 mRNAは、ARCAキャップ構造とPseudo U/5-メチル-C修飾と120塩基のポリAテール長とを有するFluc 1と比較してPseudo Uのみと酵素キャッピングから得られるCap 1構造とより長いポリAテール(Fluc 1のもののおよそ倍である、約220塩基)とを含有する。
（表７）
Figure 2018509387
実施例3：PEG 0.6k -CTA(化合物6)の合成
Figure 2018509387
HOOC-PEG0.6K-ECT(化合物6)
100mL一口丸底フラスコにECT(473mg、2.0mmol、Omm Scientific)に続いて無水テトラヒドロフラン(20mL)およびトリエチルアミン(0.307mL、2.2mmol)を加えた。この混合物を0℃で5分間攪拌した後、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニルエステル(0.368mL、2.14mmol)を、攪拌した反応物に滴下した。混合物を0℃で5分間攪拌し、次いで室温まで温めた。
20分間室温で反応させた後、反応物をEtOAc(100mL)に希釈し、NaHCO3の飽和水溶液(3×40mL)で抽出した。EtOAc層を分離し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させて粗PFP-エステル4を黄色油状物として得た。
粗エステル4を無水CH2Cl2(20mL)に溶解し、次いで0℃まで冷却した。冷却した攪拌溶液に、トリエチルアミン(0.251mL、1.8mmol)およびアミノ-dPEG12-酸(1.12g、1.8mmol、Quanta Biodesign)を加え、混合物を室温まで温めた。室温で20分間攪拌した後、ロータリーエバポレーターを用いて反応混合物を蒸発させ、黄色油状物を得た。黄色油状物をCH2Cl2(およそ2mL)に溶解し、生成物をフラッシュクロマトグラフィー(SiO2、カラムサイズ5.0cm ID×10.0cm長さ；500mLの100％CH2Cl2；次いで500mLのCH2Cl2/MeOH、20:1 v/v；次いで3.0LのCH2Cl2/MeOH、10:1 v/vでの定組成溶離)によって精製した。TLCで判定した生成物含有画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して、所望の化合物6を橙色油状物として750mg(48％)を得た。
Figure 2018509387
実施例4：Nag(OAc4)C5N-PEG 0.6K -CTA(化合物8)の合成
工程1．化合物3の合成
Figure 2018509387
N-t-Boc-5-アミノ-1-ペンタノール
水(140mL)中の5-アミノ-1-ペンタノール(15.0g、145.4mmol)の溶液および飽和NaHCO3水溶液(1.4mL)を含有する1.0L一口丸底フラスコに、THF(280mL)中のジ-tert-ブチルジカーボネート(33.3g、152.7mmol)の溶液を加えた。次いで、フラスコを大気に開放した状態で、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(90mL)で希釈し、EtOAc(400mL)で抽出した。有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させて、無色透明な油状物として最終生成物を28.9g(98％)得た。1H NMR分析は生成物が不純物を含まないことを示し、さらなる精製は試みなかった。代替的には、N-t-Boc-5-アミノ-1-ペンタノールは、オレゴン州ポートランドのTCI Americaから入手し得る。
化合物2
化合物2は、文献(Westerlind, U. et al. Glycoconj. J. 2004, 21, 227-241)から採用した手順によって調製した。500mL一口丸底フラスコに、2-アセトアミド-1,3,4,6-テトラ-O-アセチル-2-デオキシ-D-ガラクトピラノース1(12.8g、32.8mmol)、続いて無水CH2Cl2(150mL)およびトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(14.3mL、79.2mmol)を加えた。この混合物をアルゴンガス流下で一晩(約18時間)還流しながら攪拌した。反応混合物を0℃まで冷却し、トリエチルアミン(6.4mL、45.9mmol)で30分間処理した後、室温まで温め、次いで飽和NaHCO3水溶液(100mL)で洗浄した。有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて粗オキサゾリン中間体を得た。粗オキサゾリン生成物に、無水CH2Cl2(200mL)、N-t-Boc-5-アミノ-1-ペンタノール(10.0g、49.2mmol)および3Åモレキュラーシーブ(18.0g、150℃で>24時間乾燥)を加えた。この混合物を、アルゴンガスのブランケット下、室温で30分間攪拌した。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(2.97mL、16.4mmol)を反応混合物に加え、溶液を室温で一晩攪拌した。溶液を0℃まで冷却し、トリエチルアミン(3.2mL、23.07mmol)で30分間処理した後、室温まで温めた。反応物が室温に達した後、混合物を濾過し、母液を蒸発させて粗生成物を褐色油状物として得、これを無水ピリジン(100mL)に溶解し、無水酢酸(36mL、38.2mmol)で処理した。この混合物をアルゴン雰囲気下、室温で一晩攪拌し、次いで真空下で蒸発させて褐色液体が生じ、これをCH2Cl2(200mL)に溶解した。溶液を開放したフラスコ中で室温にて飽和NaHCO3水溶液(100mL)および固体NaHCO3と共に激しく攪拌して残存するAc2Oをクエンチし、有機層を分離した。水層をCH2Cl2(1×200mL)で抽出し、全ての有機層を合わせた。有機層を飽和NaHCO3水溶液(1×100mL)で洗浄し、分離し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗生成物を褐色油状物として得、次いでこれをCH2Cl2(15mL)に溶解しカラムクロマトグラフィー(SiO2、カラムサイズ7.5cm ID×16.0cm長さ、500mLのEtOAc:ヘキサン1:3 v/v、500mLのEtOAc:ヘキサン4:1 v/v、1.0Lの100％EtOAc、3.0LのEtOAc中10％MeOH v/v)を用いて精製した。生成物含有画分をプールし、白色固体になるまで真空下で蒸発させ、これをエーテルでトリチュレーションすることによりさらに精製して、所望の生成物が白色固体(5g、29％)として生じた。ESI MS[M+H]+ m/z 533.4
化合物3
100mL丸底フラスコに化合物2(3.14g、5.9mmol)続いてトリフルオロ酢酸(10mL、TFA)を加えた。炭水化物が全て完全に溶解するまで混合物を攪拌し、次いでTFAを真空下で蒸発させて淡黄色油状物が生じた。油状残渣にジエチルエーテル(10mL)を加え、混合物を2〜5分間超音波処理し、上清をデカンテーションした。トリチュレーションプロセスを繰り返し(3×10mL Et2O)、粗生成物を真空下で乾燥させて白色泡状物(3.2g)が生じ、これを下記のように用いた。
工程2．
Figure 2018509387
化合物7
250mL一口丸底フラスコに化合物6(3.37g、3.9mmol、HPLC精製)続いて無水CH2Cl2(40.0mL)およびトリエチルアミン(2.17mL、15.6mmol)を加えた。この溶液を0℃で低流量のアルゴンガス下で5分間攪拌した後、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニルエステル(737μL、4.29mmol)を反応混合物に滴下した。次いで混合物を室温まで温め、室温で30分間攪拌した。
出発物質の消失(Rf=0.30)およびPFP活性化生成物の出現(Rf=0.64)を調べることによって反応の進行をTLC(SiO2、CH2Cl2およびMeOH、9:1 v/v)により追跡した。出発物質がTLCによって消費されたら、粗反応物をCH2Cl2(300mL)で希釈し、混合物をNaHCO3(3×50mL)を用いて抽出した。有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて橙色油状物として最終生成物を3.9g(97％)得た。全ての溶媒および揮発性試薬は一晩高真空を用いて徹底的に除去した後、粗生成物を次の合成工程に移した。
化合物8
100mL一口丸底フラスコに化合物7(3.6g、3.5mmol)次いで無水アセトニトリル(7.5mL)およびトリエチルアミン(1.46mL、10.5mmol)を加えた。この混合物を物質が全て溶解するまでアルゴンガス流下で攪拌し、次いで氷浴で0℃まで冷却した。脱保護したアミン3(1.81g、3.32mmol)を無水アセトニトリル(7.5mL)に溶解し、得られた溶液を0℃で5分間にわたって反応混合物に滴下した。反応物を室温まで温め、室温で一晩攪拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させ、粗生成物を高真空下で乾燥させた。反応混合物(5μL)をCH3CN(695μL)に希釈することによって分析HPLCによって反応の進行を追跡し、50μLの希釈混合物をHPLC(2分間の10％CH3CN、次いで20分間にわたる10％〜60％CH3CNの直線勾配、1.0mL/分の総流量)で分析した。所望の生成物は保持時間が21.0分であった。
粗生成物をMeOH(およそ40mL)に溶解し、分取逆相HPLC(Phenomenex、Luna 5 C18(2)、100Å、25.0cm×21.2mm、SecurityGuard PREP Cartridgeを装備、C18 15×21.2mm ID、CH3CN/H2O、5分間の30％CH3CN、次いで20分間にわたる30％〜53％CH3CNの直線勾配、20.0mL/分の総流量)を用いて2mLアリコートで精製した。所望の生成物は22.0〜23.0分の間に溶出した。所望の生成物を含む全ての画分を合わせ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を完全に除去して、真空下で一晩乾燥させた後に化合物8が2.54g(60％)生じた。
Figure 2018509387
Figure 2018509387
実施例5：Nag(OH)C5N-PEG 0.6K -CTA(化合物8a)の調製
Figure 2018509387
実施例4の化合物3を化合物3aの非保護糖化合物で置き換え、実施例3の化合物6と実施例4の化合物3との間のカップリング反応を化合物6aおよび3aについて以下に示すように修飾した以外は実施例4(化合物8)のNag(OAc4)C5N-PEG0.6K-CTAと同様の様式でNag(OH)C5N-PEG0.6K-CTA(化合物8a)を調製した。
化合物3aは化合物3bから次のように調製した。
Figure 2018509387
250mL一口丸底フラスコに化合物3b(1.86g、3.5mmol)続いて4M HClのジオキサン溶液(30mL)を加えた。この混合物を攪拌し、糖が全て完全に溶解するまで超音波処理した。次いで混合物をロータリーエバポレーターで蒸発させ、油状残渣を得た。全てのHClガスを完全に除去するために化合物をジオキサン(30mL)に溶解し、溶媒を回転蒸発によって除去した。溶媒交換プロセスを合計3回実施し、全てのHClを完全に除去した。次いでフラスコを>30分間高真空下に置き、白色泡状固体を得た。粗化合物を無水MeOH(25mL)に溶解し、MeOH中の0.5Mナトリウムメトキシド溶液(5.80g、7.175mL、3.59mmol、1.025当量、重量基準で測定して添加の正確さを確保)で処理した。NaOMeの第1の当量を用いて、遊離アミンを遊離する第4級アミン塩を脱プロトン化する。アセチル脱保護を促進するためには1当量を超えるわずかに過剰のNaOMe(すなわち、0.025当量、0.09ミリモル)が必要なだけである。NaOMeを加えた後、混合物をアルゴン流下、室温で一晩攪拌する。生成物をMeOHに約1.0μg/mLで溶解することによって反応の進行をAgilent Q-TOF液体クロマトグラフィー質量分析計を用いてLCMSによってモニタリングした。LCはC18 UPLCカラム(Agilent Eclipse Plus C18、カタログ番号959757-902、1.8μm、2.1mm×50mm、室温のカラム、0.1％ギ酸を含有するCH3CN/H2O、1分間5％CH3CNの定組成勾配、次いで4分間にわたる5％〜90％CH3CNの直線勾配、0.4mL/分の総流量)を用いた。所望の生成物は上記のHPLC条件を用いて0.4〜0.5分の間に溶出する一方で、粗中間体生成物(すなわち、依然として存在するアセチルで除去されるBoc)は2.0〜2.2分の間に溶出する。糖が十分に脱保護されたら、わずかに過剰の酢酸(10μL、0.175mmol)を反応混合物に加えて触媒NaOMe(0.09mmol)をクエンチする。次いで全ての溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させることにより除去する。このプロセスにより白色固体として最終生成物が1.1g(100％)生じた。最終生成物は、溶媒としてのCD3ODと共に400MHz 1H NMRを用いて特性決定され、全てのスペクトルは所望の生成物化合物3aと一致した。
Nag(OH)C5N-PEG0.6K-CTA(Nag(OH)C5N-PEG12-CTA；化合物8a)を次のように調製した。化合物6aを実施例3(化合物6)と同様に調製した。
250mL一口丸底フラスコに化合物6a(3.17g、3.68mmol)続いて無水アセトニトリル(10mL)を加えた。別のフラスコで化合物3a(1.07g、3.5mmol)を無水DMF(10mL)に溶解した。化合物3aを乳白色懸濁液として部分的に溶解した後、溶液を100mL添加漏斗に移した。別のフラスコでPyBOP(2.0g、3.85mmol)および無水DMF(10mL)を加えた。PyBOP/DMF溶液を20mLシリンジに取り込んだ。次いで反応溶液を激しく攪拌しながら、3つの溶液全て(化合物6a/CH3CN、化合物3a/DMF、およびPyBOB/DMF)を同時にかつできるだけ速く合わせた。添加が完了したら、反応物をN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.22mL、7.0mmol)で処理し、溶液を室温でアルゴンガス流下で30分間攪拌した。反応の進行は、粗反応物(1.0μL)をMeOH(1.0mL)に溶解し、1.0μLを注入することによってAgilent Q-TOF液体クロマトグラフィー質量分析計を用いて判定した(図1〜2)。LCはC18 UPLCカラム(Agilent Eclipse Plus C18、カタログ番号959757-902、1.8μm、2.1mm×50mm、室温のカラム、0.1％ギ酸を含有するCH3CN/H2O、1分間5％CH3CNの定組成勾配、次いで4分間にわたり5％〜90％CH3CNの直線勾配、0.4mL/分の総流量)を用いた。所望の生成物は、上記のHPLC条件を用いて3.0〜3.1分の間に溶出する。反応物を室温で30分間攪拌した後、糖出発物質(すなわち、化合物3a)は質量分析では検出されなかった。質量分析により化合物8aの存在が確認された[M+Na]+1 = 1173.5207 m/z；[M+H]+1 = 1151.5397 m/z)。
30分間反応させた後、化合物8aの粗反応混合物をH2O(25mL)の添加により希釈し、ShimadzuによるC18分取逆相HPLC(Phenomenex、Luna 5 C18(2)、品番00G-4252-P0-AX、100Å、25.0cm×21.2mm、SecurityGuard PREP Cartridgeを装備、C18 15×21.2mm ID、品番AJ0-7839、0.01％TFAを含むCH3CN/H20、5分間の5％CH3CNの定組成勾配、次いで17分間にわたる5％〜50％CH3CN次いで3分間にわたる50％〜53％CH3CNの直線勾配、20.0mL/分の総流量、室温のカラム)を用いて精製した。DMF/H2O(約75mg/mL)に溶解した2.0mLの粗化合物を各HPLC処理(run)に注入した。上記のHPLC精製条件を用いると、所望の生成物化合物8aは21.5〜22.5分で溶出した。所望の生成物を含有する全ての画分を合わせ、ロータリーエバポレーターに次いで高真空を一晩用いて水/CH3CN溶媒を完全に除去した。HPLC精製および一晩の高真空後の最終生成物の合算収量は、明るい橙色固体として所望の生成物を3.05g(76％)産生した。1H NMR分析は所望の生成物である化合物8aの存在と一致していた。
Figure 2018509387
実施例6：ポリマー合成のための一般手順
第1のブロックの合成の一般手順：第1のブロックポリマーは、つぎのおおよその比を用して調製される：DMF中およそ1.3Mで[モノマー/CTA/開始剤]=[15〜20/1/0.5]。窒素またはアルゴンで酸素をパージした後、所望の分子量に達するまで重合反応物を特定の時間(一般的に1時間15分〜3時間)60〜68℃まで加熱する。重合反応は、反応物を氷浴中に入れ空気に晒すことによってを停止される。所望のポリマーは、2KDa MWCO透析チューブを用いたメタノールに対する透析(3〜7日間)によって精製される。得られたポリマーは、還元雰囲気下で溶媒を除去することによって単離される。
第2のブロックの合成の一般手順：第2のブロックポリマーは、次のおおよその比を用いて調製される：DMF中およそ2〜3Mで[モノマー/CTA/開始剤]=[100〜130/1/0.5]。窒素またはアルゴンで酸素をパージした後、所望の分子量に達するまで、重合反応物を特定の時間(一般的に3〜6時間)60〜68℃まで加熱する。重合反応は、反応物を氷浴中に入れ空気に晒すことによって停止される。所望のポリマーは、ジエチルエーテル/ヘキサンへの析出および/または2KDa MWCO透析チューブを用いたメタノールに対する透析(3〜５日間)よって精製される。得られたポリマーは、還元雰囲気下で溶媒を除去するか、または2KDa MWCO透析チューブを用いた水に対する透析に続く凍結乾燥により単離される。
実施例7：ポリマー合成中のポリマーの個々のブロック内へのモノマー取り込み量の決定
本明細書において例示され特許請求されるポリマーの所与のポリマーブロック、典型的には第1のまたは親水性ポリマーブロック内の所与のモノマーの量は次の手順によって決定した。重合反応前後(すなわち、T0(開始時点)およびTf(終了時点))に取り出した試料を分析HPLCで分析しモノマー消費量および/またはモノマー取り込み量の程度を決定する。
重合反応における初期モノマー量(時間0、T0)は、窒素またはアルゴンパージの前に重合反応溶液をサンプリングすることによって決定される。反応溶液の試料(20μL)を反応溶液から抜き取り、180μLのメタノール(MeOH)に希釈する。得られた溶液の一部(10μL)を590μLのMeOHにさらに希釈し、分析HPLCによる分析のための全体的な希釈率が1:600(重合反応物から)の試験試料を得る。
重合反応の完了の際に、上に記載のT0試料に類似の終了時点(Tf)試料が調製される。
T0およびTf試料の分析HPLC分析は、30℃に加熱したガードカラムを備えたC18 Phenomenex 5μ100Å 250×4.6mm×5ミクロン(品番00G-4252-E0)Lunaカラムを用いて実施する。各時点(すなわち、T0およびTf)毎の3つの独立した希釈物を調製し、各時点について分析する。10μLの試料をカラムに注入し、次の勾配で溶出する。0.1％TFAと共に5％アセトニトリル/水の定組成溶離液を2分間保持する。25分間にわたって5％〜95％アセトニトリルの直線勾配に切り替える。95％アセトニトリルの定組成溶離液を5分間保持する。0.01分間にわたって5％アセトニトリルに戻す。0.1％TFAと共に5％アセトニトリル/水の定組成溶離液を5分間保持する。T0とTfの両方それぞれに少なくとも3つの独立した試料調製物をブロック内のモノマー取り込み量の計算に用いた。
次の方法論を用いて所与のモノマーの％取り込み量を算出する：
a．3つの独立した試料調製物から平均T0およびTfモノマーピーク面積を算出
b．反応における個々のモノマーの消費量を算出(モノマー％消費量)：
=(1-(Tf-avgモノマーピーク面積/T0-avgモノマーピーク面積)×100
c．モノマー投入パーセントに基づいて個々のモノマーの消費されたモル分率を算出
=(モノマー％転化量(上記の工程(b)で算出)×0.01)×モノマー供給量％
d．重合反応における総モノマー消費量および全パーセント転化量：
i．総モノマー消費量=上記工程(c)で算出した個々のモノマー毎に消費されたモル分率の合計
ii．全％転化量=総モノマー消費量(上記の工程(d)(i)で算出)×100
e．ポリマー中の各モノマー毎のパーセントモノマー取り込み量を算出
i．=(消費されたモノマーモル分率(上記工程(c))/総モノマー消費量(上記工程(d)(i))×100
実施例8：ポリマー合成中のポリマーの個々のブロック内へのモノマー取り込み量の決定
本明細書において例示され特許請求されるポリマーの所与のポリマーブロック、典型的には第2のポリマーブロックまたはPAA、BMAおよびDMAEAMAを含有するポリマーブロック内の所与のモノマーの量は次の手順によって決定した。重合反応前後(すなわち、T0(開始時点)およびTf(終了時点))に取り出した試料を分析HPLCで分析しモノマー消費量および/またはモノマー取り込み量の程度を決定する。
重合反応における初期モノマー量(時間0、T0)は、窒素パージの前に重合反応溶液をサンプリングすることによって判定される。反応液の試料(20μL)を抜き取り、0.1％TFAを含有する180μLの1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)/メタノール(MeOH)/ナノピュアウォーター(H2O)(2:1:1、v/v)に希釈する。得られた溶液の一部(10μL)を0.1％TFAを含有する590μLのHFIP/MeOH/H20(2:1:1、v/v)にさらに希釈し、分析HPLCによる分析のための全体的な希釈率が1:600(重合反応物から)の試験試料を得る。
重合反応の完了の際に、上に記載のT0試料に類似の終了時点(Tf)試料が調製される。反応液の試料(20μL)を抜き取り、0.1％TFAを含有する180μLの1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)/メタノール(MeOH)/ナノピュアウォーター(H2O)(2:1:1、v/v)に希釈する。得られた溶液の一部(10μL)を0.1％TFAを含有する590μLのHFIP/MeOH/H20(2:1:1、v/v)にさらに希釈し、分析HPLCによる分析のための全体的な希釈率が1:600(重合反応物から)の試験試料を得る。
T0およびTf試料の分析HPLC分析は、30℃に加熱したガードカラムを備えたC18 Phenomenex 5μ100Å 250×4.6mm×5ミクロン(品番00G-4252-E0)Lunaカラムを用いて実施する。各時点(すなわち、T0およびTf)毎の3つの独立した希釈物を調製し、分析する。10μLの試料をカラムに注入し、次の勾配で溶出する。0.1％TFAと共に5％アセトニトリル/水の定組成溶離液を10分間保持する。10分間にわたって5％〜15％アセトニトリルの直線勾配に切り替える。20分間にわたって15％〜95％アセトニトリルの直線勾配に切り替える。95％溶離液アセトニトリルの定組成溶離液を5分間保持する。0.01分間にわたって5％アセトニトリルに戻す。0.1％TFAと共に5％アセトニトリル/水の定組成溶離液を5分間保持する。T0とTfの両方それぞれに少なくとも3つの独立した試料調製物をブロック内へのモノマー取り込み量の計算に用いた。
次の方法論を用いて所与のモノマーの％取り込み量を算出する：
a．3つの独立した試料調製物から平均T0およびTfモノマーピーク面積を算出
b．反応における個々のモノマーの消費量を算出(モノマー％消費量)：
=(1-(Tf-avgモノマーピーク面積/T0-avgモノマーピーク面積)×100
c．モノマー投入パーセントに基づいて個々のモノマーの消費されたモル分率を算出
=(モノマー％転化量(上記の工程bで算出)×0.01)×モノマー供給量％(例えばDMAEMA=0.25、PAA=0.25、BMA=0.50)
d．重合反応における総モノマー消費量および全パーセント転化量：
i．総モノマー消費量=(c)で算出した個々のモノマー毎の消費されたモル分率の合計
ii．全％転化量=総モノマー消費量(上記の工程(d)(i)で算出)×100
e．ポリマー中の各モノマー毎のパーセントモノマー取り込み量を算出
i．=(消費されたモノマーモル分率(上記(c)で算出)/総モノマー消費量((d)(i)で算出))×100
実施例9：ポリマーNagC5N-PEG 0.6 -[PEGMA4-5 80 -PDSMA 10 -BPAM 10 ] 6.4 -b-[D 25 -B 50 -P 25 ] 6.3 (P1)の合成
実施例9.1：マクロ-CTA C1の合成
Figure 2018509387
PEGMA4-5(0.675g、2.25mmol)、PDSMA(0.072g、0.282mmol)、BPAM(0.077g、0.282mmol)、Nag(OAc4)C5N-PEG0.6K-CTA(化合物8)(0.090g、0.0704mmol；1:40 CTA:モノマー)、AIBN(0.578mg、0.00252mmol；CTA:AIBN 20:1)およびDMF(1.65g)を密閉したバイアルに窒素下で導入した。混合物は窒素を30分間バブリングして脱気し、反応は2時間急速に攪拌しながら68℃で進行させた。反応は、バイアルを氷に入れ混合物を空気に暴露することにより停止させた。ポリマーは、24時間のメタノールに対する透析(Spectrum Labs、Spectra Por Dialysis Membrane MWCO: 2000)続いて真空下での溶媒の除去によって精製した。得られたマクロ-CTAは、真空下で6時間乾燥させた。精製したポリマーの構造および組成は1H NMRによって検証され、これは組み込まれていないモノマーのビニル基に対応するシグナルが存在していないことも確認した。ポリマーの純度はGPC分析によって確認された。Mn,GPC = 7.7 kDa、dn/dc=0.05700、PDI=1.28。
実施例9.2：ポリマーP1の合成
Figure 2018509387
BMA(0.246g、1.73mmol)、PAA(0.099g、0.87mmol)、DMAEMA(0.136g、0.87mmol)、Macro CTA C1(0.113g、0.0147mmol；1:236 CTA:Monomers)、AIBN(0.241mg、0.00147 mmol；CTA:AIBN 10:1)およびDMF(0.615g)を密閉したバイアルに導入した。混合物は、混合物に窒素を30分間バブリングして脱気し、次いで10時間67〜68℃で反応させた。バイアルを氷に入れ、混合物を空気に暴露することにより反応を停止させた。ポリマーを、アセトン/DMF 1:1からヘキサン/エーテル75/25への透析によって精製した(3回)。得られたポリマーは真空下で少なくとも8時間乾燥させた。精製したポリマーの構造および組成は1H NMRによって検証され、これは組み込まれていないモノマーからのビニル基に対応するシグナルが存在していないことも確認した。GPC分析：Mn,=13.996 kDa、dn/dc=0.056505、PDI=1.26。
アセチル基は、アルゴン雰囲気下、室温で1.0時間無水メタノール/クロロホルム中のナトリウムメトキシド(6当量)でのポリマーの処理によって除去した。このポリマーは、室温で1.0時間アルゴンガス流下で2,2'-ジピリジルジスルフィド(ポリマー中のピリジルジスルフィド残基に対して2当量)でキャッピングした。キャッピング後、反応物はMeOHで希釈し、濾過した。濾液は、分子量カットオフが2000g/molの透析膜(Spectrum Labs、Spectra/Por Dialysis Membrane MWCO: 2000)に移し、MeOHに対して24時間かけて透析し、続いて水に対して透析した。溶媒は蒸発させ、ポリマーは真空下で乾燥させた。
実施例10：ポリマーNagC5N-PEG 0.6 -[PEGMA4-5 80 -PDSMA 10 -BPAM 10 ] 7.2 -b-[D 25 -B 50 -P 25 ] 6.1 (P2)の合成
実施例10.1：マクロCTA C2の合成
Figure 2018509387
マクロCTA C2は、PEGMA4-5(8.083g、27.0mmol)、PDSMA(0.860g、3.37mmol)、BPAM(0.921g、3.37mmol)、Nag(OAc4)C5N-PEG0.6K-CTA(化合物8)(1.076g、0.842 mmol；1:40 CTA:モノマー)、AIBN(6.914mg、0.0421mmol；CTA:AIBN 20:1)およびDMF(19.73g)から開始して実施例9.1に記載のように調製した。重合時間は2時間55分であった。GPC: Mn=8.500kDa; PDI〜1.23; dn/dc=0.5780。
実施例10.2：ポリマーP2の調製
Figure 2018509387
マクロCTA C2の伸長は、BMA(0.553g、3.89mmol)、PAA(0.226g、1.98mmol)、DMAEMA(0.311g、1.98mmol)、マクロCTA C2(0.560g、0.0659mmol；1:118 CTA:モノマー), AIBN(1.082mg, 0.00659mmol；CTA:AIBN 10:1)およびDMF(1.37g+0.69g)を用いて実施例10.1に記載のようにRAFT重合による行った。重合は5時間後に停止し、ポリマーはアセトン/DMF 1:1からヘキサン/エーテル75/25への透析によって精製した(3回)。GPC：dn/dc=0.053188；Mn=14.7kDa；PDI=1.31。アセチル基は実施例9.2に記載のようにNaOMeで除去した。
実施例11：ポリマーNagC5N-PEG 0.6 -[PEGMA4-5 80 -PDSMA 10 -BPAM 10 ] 7.2 -b-[D 25 -B 50 -P 25 ] 10.8 (P3)の合成
Figure 2018509387
マクロCTA C2(実施例10)は、BMA(0.197g、1.39mmol)、PAA(0.079g、0.69mmol)、DMAEMA(0.109g、0.69mmol)、Macro-CTA(0.100g、0.0118mmol；1:236 CTA:モノマー)、AIBN(0.193mg、0.00118mmol；CTA:AIBN 10:1)およびDMF(0.492g)を用いて実施例10.2に記載のようにRAFT重合によって4.5時間伸長し、生成物はアセトン/DMF 1:1からヘキサン/エーテル75/25への透析によって精製した(3回)。GPC：dn/dc=0.053160；Mn=19.3kDa；PDI=1.39。アセチル基は実施例10.2に記載のようにNaOMeで除去した。
実施例12：ポリマーPEG 0.6 -[PEGMA4-5 80 -PDSMA 10 -BPAM 10 ] 6.7 -b-[D 25 -B 50 -P 25 ] 6.2 (P4)の合成
実施例12.1：マクロCTA C4の調製
Figure 2018509387
マクロ-CTA C4は、PEGMA4-5(5.128g、17.1mmol)、PDSMA(0.546g、2.14mmol)、BPAM(0.584g、2.14mmol)、PEG0.6K-CTA(化合物6)(0.461g、0.534mmol；1:40 CTA:モノマー)、AIBN(4.385mg、0.0267mmol；CTA:AIBN 20:1)およびDMF(12.52g)から開始して実施例9に記載のように調製し、反応時間は1時間40分であった。GPC：Mn=7.50kDa；PDI〜1.20；dn/dc=0.053910。
実施例12.2：ポリマーP4の調製
Figure 2018509387
ポリマーP4の合成および精製は、BMA(1.656g、11.6mmol)、PAA(0.676g、5.92mmol)、DMAEMA(0.931g、5.92mmol)、マクロCTA C4(1.5g、0.197mmol；1:118 CTA:モノマー)、AIBN(3.241mg、0.0197mmol；CTA:AIBN 10:1)およびDMF(4.16g+2.08g)を用いて実施例8.2に記載のように行った。GPC：dn/dc=0.050；Mn=13.8 kDa；PDI=1.1。
実施例13：ポリマーNagC5N-PEG 0.6 -[PEGMA4-5 80 -PDSMA 10 -BPAM 10 ] 6.6 -b-[D 25 -B 50 -P 25 ] 14.7 (P5)の合成
実施例13.1：マクロCTA C5の調製
Figure 2018509387
マクロCTA C5は、PEGMA4-5(0.5g、1.67mmol)、PDSMA(0.053g、0.208mmol)、BPAM(0.057g、0.208mmol)、Nag(OAc4)C5N-PEG0.6K-CTA(化合物8)(0.0665g、0.0521 mmol；1:40 CTA:モノマー)、AIBN(0.428mg、0.0026mmol；CTA:AIBN 20:1)およびDMF(1.22g)から開始して実施例9.1に記載のように合成した。重合時間は2時間30分であった。GPC:Mn=7.85kDa；PDI=1.18；dn/dc=0.066。
実施例13.2：ポリマーP5の調製
Figure 2018509387
ポリマーP5の合成および精製は、BMA(0.62g、4.36mmol)、PAA(0.249g、2.18 mmol)、DMAEMA(0.342g、2.18mmol)、マクロCTA C5(0.189g、0.0242mmol；1:360 CTA:モノマー)、AIBN(0.398mg、0.00242mmol；CTA:AIBN 10:1)およびDMF(1.55g)を用いて実施例9.2に記載のように行った。重合は10時間進行させた。GPC：dn/dc=0.063851；Mn=22.5kDa；PDI=1.41。脱保護は、実施例9.2に記載のように行った。
実施例14：ポリマーNagC5N-PEG 0.6 -[PEGMA4-5 80 -PDSMA 10 -BPAM 10 ] 3.5 -b-[D 25 -B 50 -P 25 ] 6.3 (P6)の合成
実施例14.1：マクロ-CTA C6の調製
Figure 2018509387
マクロ-CTA C6は、PEGMA4-5(1.503g、5.00mmol)、PDSMA(0.160g、0.626mmol)、BPAM(0.171g、0.626mmol)、Nag(OAc4)C5N-PEG0.6K-CTA(化合物8)(0.500g、0.391mmol；1:40 CTA:モノマー)、AIBN(3.213mg、0.0196mmol；CTA:AIBN 20:1)およびDMF(3.668g)から開始して実施例9.1に記載のように合成し、反応時間は1時間45分であった。GPC：Mn=4.8kDa；PDI=1.19；dn/dc=0.061481。
実施例14.2：ポリマーP6の調製
Figure 2018509387
ポリマーP6の合成および精製は、BMA(0.218g、1.54mmol)、PAA(0.089g、0.781mmol)、DMAEMA(0.123g、0.781mmol)、マクロCTA C6(0.125g、0.0260mmol；1:118 CTA:モノマー)、AIBN(0.428mg、0.00260mmol；CTA:AIBN 10:1)およびDMF(0.830g)を用いて実施例9.2に記載のように行った。重合は4時間50分進行させた。GPC：dn/dc=0.05812；Mn=11.1kDa；PDI=1.38。脱保護は実施例9.2に記載のように行った。
実施例15：ポリマーNagC5N-PEG 0.6 -[PEGMA4-5 86 -PDSMA 14 ] 3.82KDa -[BMA 45 -PAA 15 -DMAEMA 40 ] 5.98KDa (P7)の合成
実施例15.1：マクロCTA C7の調製
Figure 2018509387
AIBN/DMF(DMF中の1.05603mg/g ABINの21.93g)を、40ml反応容器中のNag(OH)C5N-PEG0.6K-CTA(実施例5の化合物8aに記載のように合成)(3.075g；2.6705mmol)に加え、かき混ぜてCTAを溶解した。次いでDMFの総重量が24.9627gになるまでDMFを加えた。得られた溶液にPEGMA(11.18g、37.2621mmol、酸化アルミニウム(活性化、塩基性、Brockmann Iに通して濾過)およびPDSMA(1.1211g、4.1393mmol)を加えた。得られた溶液をかき混ぜ、次いで磁気攪拌棒を備えた密閉した50mL丸底フラスコに移した。得られた溶液に窒素を氷上で50分間バブリングすることによって溶液を脱酸素化した。フラスコを4分間室温に移し、次いで68℃まで予熱した油浴中に1時間42分間入れた(攪拌速度は350rpmに設定した)。バイアルを氷に入れ、混合物を空気に暴露することにより反応を停止させた。反応溶液をMeOHで希釈し、透析膜(Spectrum Labs、Spectrum Spectra/Por 6 Dialysis Membrane Tubing MWCO: 2000)に移し、MeOH(6×4000mL)に対して6日間透析した。LC-MS、GPCおよび1H NMR分析のために試料を取り出した。透析後、溶媒は減圧に続いて高真空下で除去して2.45gのポリマーが生じた。LC-MS分析は、残留CTAのピークを示さなかった。1H NMRは、組み込まれていないモノマーのビニル基に対応するシグナルが存在していないことも確認した。ポリマーの純度は、GPC分析によって確認した。Mn,GPC=4.97KDa、PDI=1.12、dn/dc=0.06469、PDI=1.12。
実施例15.2：ポリマーP7の合成
Figure 2018509387
AIBN/DMF溶液(7.0225g；DMF中の1.10468mg/g AIBN)を40mL反応容器中でマクロ-CTA C7(2.350g)に加え、試料をかき混ぜてマクロ-CTAを溶解した。DMFの総重量が15.05gになるまでDMFを加えた。得られた溶液にBMA(3.967g、酸化アルミニウム(活性化、塩基性、Brockmann I)に通して濾過、PAA(1.6217g)およびDMAEMA(2.237g、酸化アルミニウム[活性化、塩基性、Brockmann I]に通して濾過)を加え、溶液をかき混ぜた。混合物を数分間ボルテックスして均質な原液を得、磁気攪拌棒を備えた密閉した50mL丸底フラスコに移した。混合物は次いで氷浴を用いて0℃まで冷却し、55分間溶液に窒素を激しくバブリングして脱気しながら0℃に維持した。フラスコセプタムを61℃に予熱した油浴(攪拌速度は350であった)に入れ4時間30分間攪拌した。反応は、バイアルを氷に入れ混合物を空気に暴露することにより停止した。反応物は次いでアセトン(反応バイアルに用いたDMFとほぼ同じ体積のアセトン)で希釈し、50mL遠心分離管中のエーテル/ヘキサン(1:3 v/v)の攪拌混合物に1回、次いで600mLエーテル/ヘキサン(1:3 v/v)を有する大きなビーカーに析出させた。ポリマーの析出物はMeOHで単離し溶解して、3つの個別の透析膜(Spectrum Labs、Spectrum Spectra/Por 6 Dialysis Membrane Tubing MWCO: 2,000)に移し、メタノール(5×4000mL)に対して4日間透析した。メタノールに対する透析後、同じ膜(×6、1時間毎に水を交換)を用いてナノピュアウォーターに対して透析した。透析が完了すると、溶液は秤量したバイアルに移し液体窒素で処理した後5日間凍結乾燥して、最終生成物を3.46g得た。最終生成物は、UV/vis、NMR、GPC、およびRI検出器(バッチdn/dc用)を備えたHPLCにより分析した。1H NMRによるポリマーの分析は、残存するビニル基がなくPDSMAが存在するポリマーを示した。NMRは提案した構造と一致している。GPC結果：Mn=10.936KDa、PDI=1.30、dn/dc=0.057867。
実施例16：ポリマーNag-PEG 0.6 -[PEGMA 100 ] 3.5k -[BMA 49 -PAA 10 -DMAEMA 33 -PDSMA 8 ] 7.1k (P8)の合成
実施例16.1：マクロ-CTA C8の調製
Figure 2018509387
20mL反応バイアルにNag(OH)C5N-PEG0.6K-CTA(実施例5に記載のように合成、化合物8a)(794.6mg、0.6922mmol、CTA)に続いて、AIBNの溶液(1.1268mg/gの濃度でDMFに溶解した5.0438gの溶液、5.68mg AIBN、0.03461mmol、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、MeOHから再結晶した化合物)を加え、次いで追加量のDMF(432.2mg)を加えてこの反応で用いられるDMFの総量を5.4760gにした。この溶液をかき混ぜ、CTAの全てが完全に溶解するまで数分間ボルテックスした。CTAが全て完全に溶解されたら、PEGMA(3219.3mg、10.730mmol、平均Mn=300g/molのポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、100ppmのMEHQおよび300ppmのBHT阻害剤で阻害、アルドリッチ品番447935-500mL、未希釈のモノマーをA12O3のプラグに通すことによって阻害剤を除去、を反応バイアルに加えた。この混合物を数分間攪拌した。反応バイアルを部分的に密閉し氷浴を用いて0℃まで冷却しつつ、反応溶液を磁気攪拌しながら30分間窒素を激しくバブリングすることによって混合物を脱気した。次いでバイアルを完全に密閉しヒーターブロックに入れた。攪拌速度は300rpmに設定し、温度計は68℃に設定しプロセス全体にわたってこの温度に維持した。反応物は68℃で1時間47分間攪拌したままにした。反応が完了した後、バイアルを開き次いで反応バイアルを氷に入れて混合物を空気に暴露することによってクエンチした。反応バイアルは、MeOH(10mL)で希釈し、分子量カットオフが2000g/molの透析膜(Spectrum Labs、Spectrum Spectra/Por 6 Dialysis Membrane Tubing MWCO: 2000)に移し、MeOH(3×4000mL)に対して4日間透析した。透析液は毎日、合計3回交換した。透析バッグ中のポリマーは次の手順に従って分析した。透析液の小さなアリコート(約500〜1000μL)を透析チューブから取り出し、風袋計量したバイアルに入れた。溶液は次いでロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。溶媒が除去されたら、バイアルは高真空ラインに移し、高真空下に置いた。化合物は<15分間乾燥させる。バイアル重量が一定になったら、化合物は直ちに1重量％のLiBr溶液を有するDMFに溶解した。ポリマーの最終濃度は、1重量％のLiBrを有するDMF中でおよそ8mg/mLであった(DMFを重量基準で測定し次いで体積に換算)。ほぼ3mg/mLの濃度で1重量％のLiBrを有するDMF(DMFを重量基準で測定し次いで体積に換算)に溶解した20kDaポリスチレン標準物(Fluka、品番81407-1G)は次いでGPCに注入し(100μL)、続いて目的のポリマー試料(60、80、100、および120μL)を注入する。最終的なGPC分析が決定したら、透析液は40mL反応バイアルに移し、次いで溶媒はロータリーエバポレーターを用いて除去した。次いで材料は高真空ライン(圧力<0.5torr)上に>24時間に置いた。このプロセスによって682.9mgの最終生成物が得られた。最終生成物は次いでNMRおよびGPCによって分析される。最終生成物は室温にて高真空下で保存した。NMRは提案した構造と一致している。GPC結果：Mn=4.600、dn/dc=0.053354。
実施例16.2：ポリマーP8の合成
Figure 2018509387
40mL反応バイアルにマクロ-CTA C8(682.1mg、0.148mmol)に続いてAIBNの溶液(1.0927mg/gの濃度でDMFに溶解した2.2338gの溶液、(2.44mgのAIBN、0.0148mmolの2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、MeOHから再結晶化した化合物)を加え、次いで追加量のDMF(2.6163g)を加えてこの反応で用いられるDMFの総量を4.8501gにした。この溶液をかき混ぜ、CTAの全てが完全に溶解するまで数分間ボルテックスした。CTAが全て完全に溶解したら、次いでBMA(1.1849g、8.314mmol、未希釈のモノマーをAl2O3のプラグに通して精製、ブチルメタクリレート、d - 0.894g/mL)、PAA(488.0mg、4.231mmol、未精製2-プロピルアクリル酸、d - 0.951g/mL)、DMAEMA(661.8mg、4.231mmol、未希釈のモノマーをAl2O3のプラグに通すことによって精製、2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート、d - 0.933g/mL)、およびPDSMA(227.0mg、0891mmol)。この混合物を数分間混合した。次いで磁気攪拌棒を含有する真っ新の20mL反応バイアルに反応混合物を移した。反応バイアルを部分的に密閉し氷浴を用いて0℃まで冷却しつつ、反応溶液を磁気攪拌しながら30分間窒素を激しくバブリングすることによって混合物を脱気した。次いでバイアルを完全に密閉しヒーターブロックに入れた。攪拌速度は300に設定し、温度計は62℃に設定した。反応物は62℃で5時間50分間攪拌したままにした。反応が完了した後、バイアルを開き次いで反応バイアルを氷に入れて混合物を空気に暴露することによってクエンチした。反応液は次いでアセトンで希釈し(約5mL、反応バイアルに用いたDMFとほぼ同じ体積のアセトン)、ガラスビーカー中でEt2O/ヘキサン(1000mL、1:4 v/v)の撹拌混合物に析出させた。ポリマーが底に沈殿した後(約15分)、溶媒はデカンテーションして除去した。MeOHに溶解した析出ポリマーは、分子量カットオフが2000g/molの透析膜(Spectrum Labs、Spectrum Spectra/Por 6 Dialysis Membrane Tubing MWCO: 2000)に移し、MeOH(3×4000mL)に対して3日間(72時間)透析した。透析液を毎日、合計3回交換した。MeOHに対する3日間(72時間)の透析後、透析液をナノピュアH20に変更し、H2O(5×4000mL)に対して5時間透析する。透析液をほぼ毎時間、合計5回交換した。透析の完了の際に、溶液を風袋計量したバイアルに移し、バケツ1杯のドライアイスを用いて固体にまで凍結させた。次いでこの物質を凍結乾燥機に>4日間の総乾燥時間入れた。このプロセスによって最終生成物が1.0325g得られた。最終生成物は次いでNMRおよびGPCによって分析された。1H NMRによるポリマーの分析は、残存するビニル基がなくPDSMAが存在するポリマーを示した。NMRは提案した構造と一致している。GPC結果：Mn=11.7kDa、dn/dc=0.058046。最終生成物は、アルゴンでパージしパラフィルムで密封したゴム製セプタムを有するガラスバイアルに保存した。バイアルは-20℃で保存した。
実施例17：ポリマーの合成
同様の方法により、下記表8〜67に示す次の条件に従って次のポリマーを合成した。
（表８）
Figure 2018509387
（表９）
Figure 2018509387
（表１０）
Figure 2018509387
（表１１）
Figure 2018509387
（表１２）
Figure 2018509387
（表１３）
Figure 2018509387
（表１４）
Figure 2018509387
（表１５）
Figure 2018509387
（表１６）
Figure 2018509387
（表１７）
Figure 2018509387
（表１８）
Figure 2018509387
（表１９）
Figure 2018509387
（表２０）
Figure 2018509387
（表２１）
Figure 2018509387
（表２２）
Figure 2018509387
（表２３）
Figure 2018509387
（表２４）
Figure 2018509387
（表２５）
Figure 2018509387
（表２６）
Figure 2018509387
（表２７）
Figure 2018509387
（表２８）
Figure 2018509387
（表２９）
Figure 2018509387
（表３０）
Figure 2018509387
（表３１）
Figure 2018509387
（表３２）
Figure 2018509387
（表３３）
Figure 2018509387
（表３４）
Figure 2018509387
（表３５）
Figure 2018509387
（表３６）
Figure 2018509387
（表３７）
Figure 2018509387
（表３８）
Figure 2018509387
（表３９）
Figure 2018509387
（表４０）
Figure 2018509387
（表４１）
Figure 2018509387
（表４２）
Figure 2018509387
（表４３）
Figure 2018509387
（表４４）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表４５）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表４６）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表４７）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表４８）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表４９）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表５０）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表５１）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表５２）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表５３）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表５４）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
+ブロックの分子量は分子量が公知のポリマーとトレースして重なった部分に基づいて予測される
（表５５）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
+ブロックの分子量は分子量が公知のポリマーとトレースして重なった部分に基づいて予測される
（表５６）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表５７）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表５８）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表５９）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表６０）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
+ブロックの分子量は分子量が公知のポリマーとトレースして重なった部分に基づいて予測される
（表６１）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表６２）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表６３）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表６４）
Figure 2018509387
（表６５）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
（表６６）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
+ブロックの分子量は分子量が公知のポリマーとトレースして重なった部分に基づいて予測される
（表６７）
Figure 2018509387
*ブロック毎のモノマーの取り込み量は過去の取り込み量レベルに基づいて推測される
+ブロックの分子量は分子量が公知のポリマーとトレースして重なった部分に基づいて予測される
実施例18：脂質-mRNA製剤と追加のポリマーの同時注入または逐次注入とによるmRNAのインビボ発現
追加のポリマーを、実施例2に記載したのと同じ方法を用いてmRNA/LNPとの逐次または同時注入で試験した。
表68は、最初の注入の1分後にポリマーP1435、P1299、またはP67を逐次注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。データは投薬の6時間後に取得した。mRNA/LNP + ポリマーP67は、ポリマーP1435またはP1299それぞれと比較して発光シグナルにおいて5倍および8倍の改善を示した。
（表６８）
Figure 2018509387
表69は、最初の注入の1分後にポリマーP67を逐次注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。データは投薬の6時間後に取得した。この実験では、2つの異なるFluc mRNAを試験した。Fluc 2 mRNAは、Fluc 1 mRNAと比較して発光シグナルにおいて21倍の改善を示した。Fluc 1およびFluc 2 mRNAの修飾は実施例2で上に記載している。
（表６９）
Figure 2018509387
表70は、非標的化ポリマーP91と比較したNAG標的化ポリマーP67を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。mRNA/LNP + NAG標的化ポリマーP67は、非標的化ポリマーP91と比較して発光シグナルの130倍の改善を示した。
（表７０）
Figure 2018509387
実施例19：ポリマーを逐次または同時注入したDOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG 2K およびDOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG 2K -NAGmRNAナノ粒子製剤：製剤特性
DOTAP(Corden Pharma, Boulder, Colorado, USA；カタログ番号LP-R4-117)を室温で15分間200プルーフのエタノールに50mg/mL溶解した。DSPE-PEG2K(Corden Pharma, Boulder, Colorado, USA；カタログ番号LP-R4-039)またはDSPE-PEG-NAG (PhaseRx Inc.)を室温で15分間200プルーフのエタノールに50mg/mL溶解した。コレステリルヘミサクシネート(CHEMS)(Avanti Polar Lipid Alabaster, Alabama, USA；カタログ番号850524P)およびコレステロール(CHOL)(Corden Pharma, Boulder, Colorado, USA；カタログ番号CH-0355)を個別に75℃で5分間200プルーフに25mg/mL溶解した。典型的には、N:P比が7のDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2K (50:32:8:10モル％)LNPの調製物2mLには、200プルーフのエタノール中の50mg/mL DOTAPを178μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL CHEMSを158μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL CHOLを31μL、200プルーフのエタノール中の50mg/mL DSPE-PEG2Kを143μL、および200プルーフのエタノールを156μL含有する脂質エタノール混合物を最終容量が0.666mLおよび最終脂質濃度が31mg/mLになるように調製した。N:P比が7のDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2K -NAG (50:32:8:10モル％)LNPの調製物2mLには、200プルーフのエタノール中の50mg/mL DOTAPを178μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL CHEMSを158μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL CHOLを31μL、200プルーフのエタノール中の50mg/mL DSPE-PEG2K-NAGを160μL、および200プルーフのエタノールを161μL含有する脂質エタノール混合物を最終容量が0.666mLおよび総脂質濃度が32.5mg/mLになるように調製した。
脂質ナノ粒子(LNP)製剤は、DOTAP濃度に基づいてN:P(窒素対リン酸)比が1.75〜14で調製した。DOTAP:CHEMS比は、様々なN:P比でそれぞれ50:32モル％で1.6に固定した。DSPE-PEG2KまたはDSPE-PEG2K-NAGは1〜15モル％で変動させた。CHOLのモル％は最終脂質濃度が100モル％となるように調整した。
10mM Tris-HCl(pH7.5)中の1mg/mL Fluc(ホタルルシフェラーゼ)mRNA原液を300mMスクロース20mMリン酸pH7.4緩衝液(SUP緩衝液)中で0.45mg/mLまで希釈した。Precision NanoSystems Inc(Vancouver BC, Canada)のマイクロ流体デバイスを12mL/分の流速で用いて、エタノール脂質溶液をSUP緩衝液中の0.45mg/mL mRNAと1:2(脂質エタノール混合液: mRNAのSUP緩衝溶液)の比で混合することによりN:P比が1.75〜14のmRNA/LNPを構築した。33％エタノール中のmRNA/LNPを次いで室温で60分間インキュベートした後、100容量(200mL)のSUP緩衝液に対して18時間透析した。
逐次注入または同時注入に用いたポリマーは、400rpmで1時間アジテーションしてSUP緩衝剤に20mg/mLで可溶化し、次いで一晩4℃で保存した。ポリマーをSUP緩衝液で5〜10mg/mLまで希釈した後に注入した。
mRNA/LNPおよびポリマーを同時注入する場合は、それぞれの2X溶液を調製した。投薬直前に溶液を混合し直ちに注入した。
製剤の粒度は、90μLのSUP緩衝液に加えて10μLの製剤を使い捨てマイクロキュベットに入れて、Malvern Instrument ZETASIZER NANO-ZSを用いて分析することによって測定した。LNPは85nm(Z平均)の粒度を示した。pH7.4での製剤のゼータ電位は、10μLの製剤を740μLのSUP緩衝液に加えて使い捨ての1mLキュベットに入れて測定した。pH4での製剤のゼータ電位は、10μLの製剤を740μLのスクロースアセテート緩衝液(pH4)に加えて使い捨ての1mLキュベットに入れて測定した。ゼータディップセルを1mLキュベットに挿入し、ZETASIZER NANO-ZSを用いて製剤を分析した。典型的には、DOTAP LNPは、pH7では+1.6mV、pH4.0では+10mVのゼータ電位を有していた。mRNAをコンパクトにするLNPの能力は、SYBR Gold色素染色アッセイを用いて96ウェルプレートで測定した。典型的には、mRNAが0.01mg/mLの50μL脂質製剤を、150μLの希釈SYBR Gold原液(3mLのSUP緩衝溶液中の1μLのStock SYBR Gold)に加え、アジテーション(100RPM)しながら15分間室温でインキュベートした。蛍光を励起波長495nmおよび発光波長538nmで読み取った。パーセント色素染色性は、処方されたmRNAの蛍光強度を遊離mRNAの蛍光強度で割ったものx100で算出した。DOTAP LNPは、SUP緩衝液で調製すると8％の色素染色性を示した。下記表71は、例示的なLNP製剤の特徴を示す。
（表７１）LNP特性
Figure 2018509387
実施例20：DOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG 2k およびDOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG 2k -NAG mRNA製剤とポリマーの同時注入または逐次注入とによるmRNAのインビボ発現
実施例19に記載の追加のLNPを、逐次または同時注入と実施例2に記載したのと同じ方法とを用いて様々なポリマーと共に試験した。
表72は、ポリマーP67を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k、または DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k-NAG + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6、24、および48時間後に取得した。DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k-NAGおよびDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNPは、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k LNPと比較して、曲線下面積（AUC）値においてそれぞれ8.7倍および2.6倍長い発現の期間を示した。
（表７２）
Figure 2018509387
表73は、ポリマーP71またはP81を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2kまたはDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k-NAG + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6、24、48、72、および96時間後に取得した。DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2kおよびDOTAP : CHEMS : CHOL: DSPE-PEG2k-NAG LNP + P81は、LNP + P71いずれかと比較して曲線下面積(AUC)値においてそれぞれ7倍および2.8倍大きい発光シグナルを示した。
（表７３）
Figure 2018509387
表74は、ポリマーP71またはP92を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + Fluc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P71は、P92と比較して4〜13倍大きい発光シグナルを示した。
（表７４）
Figure 2018509387
表75は、ポリマーP71、P93、P79、またはP80を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + Fluc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P80またはP79は、P71と比較してそれぞれ5倍または2倍大きい発光シグナルを示した。P93はP71と同様の活性を示した。
（表７５）
Figure 2018509387
表76は、ポリマーP71、P82、P94、またはP86を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + Fluc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P82、P94、またはP86は、P71と比較して6〜13倍大きい発光シグナルを示した。
（表７６）
Figure 2018509387
表77は、ポリマーP71、P87、P88、またはP89を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + Fluc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P87、P88、またはP89は、P71と比較して3〜18倍大きい発光シグナルを示した。
（表７７）
Figure 2018509387
表78は、ポリマーP95、P90、P96、またはP87を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + Fluc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P90、P96、またはP87は、P95と同様の発光シグナルを示した。
（表７８）
Figure 2018509387
表79は、ポリマーP71、P77、またはP78を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P77またはP78は、P71と比較して3〜8倍大きい発光シグナルを示した。
（表７９）
Figure 2018509387
表80は、ポリマーP96、P98、P99、またはP100を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P98、P99、またはP100は、P96と比較して3〜5倍大きい発光シグナルを示した。
（表８０）
Figure 2018509387
表81は、ポリマーP82、P90、P106、またはP107を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P90、P106、またはP107は、P82と比較して3〜10倍大きい発光シグナルを示した。
（表８１）
Figure 2018509387
表82は、ポリマーP97、P104、P108、またはP109を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P104、P108、またはP109は、P97と比較して最大で2倍大きい発光シグナルを示した。
（表８２）
Figure 2018509387
表83は、ポリマーP103、P90、P106、またはP108を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P90、P106、またはP108は、P103と比較して最大で2倍大きい発光シグナルを示した。
（表８３）
Figure 2018509387
表84は、ポリマーP95、P111、またはP112を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P111またはP112は、P95と比較して最大で4倍大きい発光シグナルを示した。
（表８４）
Figure 2018509387
表85は、ポリマーP103、P106、P114またはP115を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P106、P114、またはP115は、P103と比較して最大で7倍大きい発光シグナルを示した。
（表８５）
Figure 2018509387
表86は、ポリマーP103、P116またはP117を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P116またはP117は、P103と比較して低い発光シグナルを示した。
（表８６）
Figure 2018509387
表87は、ポリマーP105、P98またはP123を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P98またはP123は、P105と同様の発光シグナルを示した。
（表８７）
Figure 2018509387
表88は、ポリマーP105、P106、P124またはP125を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P106、P124またはP125は、P105と比較して最大で2倍大きい発光シグナルを示した。
（表８８）
Figure 2018509387
表89は、ポリマーP105、P118、P119またはP110を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + FLuc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P118、P119またはP110は、P105と比較して低い発光シグナルを示した。
（表８９）
Figure 2018509387
実施例21：オルニチントランスカルバミラーゼ欠損マウスにおける脂質-mRNA製剤とポリマーの同時注入とによるmRNAの治療効果
残存する内因性OTC発現および活性をノックダウンするためにAAV2/8ベクター/OTC shRNAで処理したOTC-spfashマウスに高アンモニア血症を誘導した(Cunningham et al., Mol Ther 19: 854-859, 2011)。これらのマウスでは血漿アンモニアレベルおよびオロチン酸レベルが上昇した。AAVの投薬の4日後、N:Pが7のDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k(50:32:16:2)中に処方した1mg/kgのOTC mRNAを50mg/kgのP67と同時注入してこれらのマウスに週2回投薬した。AAV処理後6日目(単回mRNA投薬後)および13日目(3回の反復mRNA投薬後)に尿を採取し、クレアチニンレベルにノーマライズしたオロチン酸レベルを分析した。OTC mRNA処理後に正常レベルに近いオロチン酸の有意な減少が見られた(図1A参照)。AAV処理後13日目(3回の反復mRNA投薬後)に血漿を採取し、アンモニアレベルを分析した。OTC mRNA処理マウスにおける血漿アンモニアは、高アンモニア血症の緩衝液処理マウスと比較して野生型および未処理のOTC-spfashマウスにおけるものと同様の正常レベルであった(図1B参照)。
上記と同様のOTC-spfashマウスにおける別の高アンモニア血漿実験では、N:Pが7のDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k(50:32:8:10)を処方した1mg/kgのOTC mRNAを35mg/kgのP82と同時注入してこれらのマウスに週2回投薬した。AAV処理後6日目(単回mRNA投薬後)および13日目(3回の反復mRNA投薬後)に尿を採取し、クレアチニンレベルにノーマライズしたオロチン酸レベルを分析した。OTC mRNA処理後に正常レベルへのオロチン酸の有意な減少が見られた(図2Aを参照されたい)。AAV処理後13日目(3回の反復mRNA投薬後)に血漿を採取し、アンモニアレベルを分析した。OTC mRNA処理マウスにおける血漿アンモニアは、高アンモニア血症の緩衝液処理マウスと比較して正常化されていた(図2Bを参照されたい)。
実施例22：DSPE-PEG 2k -NAGの調製
Figure 2018509387
化合物3a(204mg、0.665mmol、2当量)にDMF(1.5mL)を加え、溶液を25分間攪拌した。得られた溶液にトリメチルアミン(TEA、185μL、1.33mmol、4当量)を加えた。5分後、DSPE-020GS(NOF、1.00g、0.332mmol、1当量)に続いてジクロロメタン(DCM、2.0mL)および追加のDMF(0.5mL)を加え、得られた溶液を周囲温度で撹拌した。5時間後、溶媒を減圧雰囲気下で除去し、残渣をDCM(100mL)に取り込んだ。DCM層を飽和NaHCO3(30mL)で洗浄した。得られたNaHCO3層をDCM(50mL)で洗浄した。合わせた有機層を乾燥させ(Na2SO4)、減圧雰囲気下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(2.5×7.5cm、溶離液=10％MeOH/DCM(300mL)、次いで15％MeOH/DCM(400mL)、次いで20％MeOH/DCM(600mL)、画分サイズ=18×150mm試験管、カラムから125mLの溶離液が溶出した後に回収された画分)によって精製した。画分11〜40を減圧雰囲気下で濃縮して、DSPE-PEG2K-NAG(439mg、収率41％)が得られた。
実施例23：DOTAP:CHEMS:コレステロール:DMPE-PEG2kおよびDOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG 2k mRNA製剤の反復投薬とポリマーの同時注入とによるmRNAのインビボ発現
ポリマーと同時注入したLNP製剤を反復投与計画を用いてmRNA発現について試験した。mRNA/LNP + ポリマーの同時注入およびインビボルシフェラーゼ発現の評価は実施例2に記載したものと同じ方法を用いて実施した。
表90は、ポリマーP103を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kまたはDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは各投薬の6時間後に取得した。製剤は、CD-1マウスにおいて週1回10週間IV投与により反復投薬した。交換可能なPEG脂質であるDMPE-PEG2Kを含有するLNPによる反復投与は、各1週間用量で10週まで同様の発光シグナルをもたらした。対照的に、安定なPEG脂質であるDSPE-PEG2Kを含有するLNPによる反復投与は、3週目から始まる20倍の活性の有意な低下をもたらした。この減少は、1週目の活性と比較してその後の8回の反復投薬にわたって4〜30倍の活性の低下の範囲であった。
（表９０）
Figure 2018509387
実施例24：低次形態アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)マウスモデルにおけるmRNA製剤によるアルギニノコハク酸尿症の治療
本明細書において記載のように肝臓の肝細胞を標的とする膜不安定化ポリマーを同時注入するかまたは逐次注入した脂質ナノ粒子に処方したアルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)をコードするmRNAの静注投与によって5〜10匹の低次形態AslNeo/Neoマウスからなる群を処理して、これによりASLの発現および活性を達成する。マウスをビヒクル対照または0.1〜5mg/kgのAsl mRNAで処理する。単回または反復投薬のいずれかを様々な投薬間隔(例えば、一日に一回、二日に一回、隔週に一回など)で実施する。血液を採取して、短期の効果について最終投薬後3時間から72時間までの範囲の異なる時点で、または効果の持続期間に関して投薬後最大で2週間まで血漿アミノ酸(アルギニノコハク酸、シトルリン、アルギニン)、血漿アンモニア、および血清トランスアミナーゼを調べる。これらの時点で、マウスを屠殺し、肝臓を採取しサンプリングして、肝臓組織切片のウエスタン分析および免疫蛍光によってASL酵素活性、ASLタンパク質発現を測定する。AslNeo/Neoマウスが有意な発育制限を有し、トリプル療法(安息香酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、L- アルギニン)による継続治療にもかかわらず生後6〜14週間以内に死亡するので、長期間の実験を行って成長および生存をモニタリングする場合は体重を測定する(Erez et al., Nat Med 2011. 17:1619-1626)。
結果は、ビヒクル処理マウスならびに、正常レベルのASLタンパク質発現、血漿アミノ酸レベル、血漿アンモニア、および血清トランスアミナーゼを有する野生型同腹仔マウスと比較する。有効性は、ビヒクル処理マウスで検出されたレベルより高い、ウエスタンおよび免疫蛍光によって評価された検出可能なレベルのASLタンパク質発現によって示される。野生型同腹仔マウスでは血漿アルギニノコハク酸(ASA)レベルは通常は検出可能ではなく、血漿シトルリンレベルは約70μMであるのに対して、AslNeo/Neoマウスは約100μM ASAおよび約200μMシトルリンレベルを有する。野生型同腹仔マウスの血漿アンモニアレベルは約50μMという正常なものであるのに対し、AslNeo/Neoマウスでは100〜500μMの範囲にレベルが上昇する。血漿アミノ酸および血漿アンモニアレベルによる有効性は、野生型同腹仔マウスに見られるレベルに向けた修正である。より長期の実験では、ビヒクル処理マウスと比較した成長率および生存率の増加によって有効性が示される。
実施例25：シトルリン血症1型(CTLN1)(fold/fold)のアルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)欠損ネズミモデルにおけるのmRNA製剤によるCTLN1の治療
本明細書において記載のように肝臓の肝細胞を標的とする膜不安定化ポリマーを同時注入するかまたは逐次注入した脂質ナノ粒子に処方したアルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)をコードするmRNAの静注投与によって5〜10匹のAss1fold/foldマウスからなる群を処理して、これによりASS1の発現および活性を達成する。マウスをビヒクル対照または0.1〜5mg/kgのAss1 mRNAで処理する。単回または反復投薬のいずれかを様々な投薬間隔(例えば、一日に一回、二日に一回、隔週に一回など)で実施する。血液を採取して、短期の効果について最終投薬後3時間から72時間までの範囲の異なる時点で、または効果の持続期間に関して投薬後最大で2週間まで血漿アミノ酸(シトルリン、アルギニン)および血漿アンモニアレベルを調べる。これらの時点で、マウスを屠殺し、肝臓を採取しサンプリングして、肝臓組織切片のウエスタン分析および免疫蛍光によってASS1酵素活性、ASS1タンパク質発現を測定する。Ass1fold/foldマウスが有意な発育制限を有し、安息香酸ナトリウムおよびL- アルギニンで治療されなければ生後3週間以内に死亡するので、長期間の実験を行って成長および生存をモニタリングする場合は体重を測定する(Perez et al., Am J Pathol. 177:1958-1968, 2010)。
結果は、ビヒクル処理マウスならびに、正常レベルのASS1タンパク酵素活性、血漿アミノ酸および血漿アンモニアレベルを有する野生型同腹仔マウスと比較する。有効性は、ビヒクル処理マウスで検出されたレベルより高くなったASS1酵素活性の修正によって示される。野生型同腹仔マウスでは血漿シトルリンレベルは約70μMであるのに対して、Ass1fold/foldマウスは約2000〜3000μΜという有意に向上したシトルリンレベルを有する。野生型同腹仔マウスの血漿アンモニアレベルは約50μMという正常なものであるのに対し、Ass1fold/foldマウスでは100〜500μMの範囲に上昇している。マウスを安息香酸ナトリウムおよびL-アルギニンで処理しない場合にはレベルは高い。血漿アミノ酸および血漿アンモニアレベルによる有効性は、野生型同腹仔マウスに見られるレベルに向けた修正である。より長期の実験では、マウスが安息香酸ナトリウムおよびL-アルギニンによる処理を受けない場合は、ビヒクル処理マウスと比較して成長率および生存率の増加によって有効性が示される。
実施例26：ポリマーを逐次または同時注入したDOTAPen:CHEMS:コレステロール:DMPE-PEG 2k mRNAナノ粒子製剤：製剤特性
(R)-N,N,N-トリメチル-4,5-ビス(オレオイルオキシ)ペンタン-1-アミニウムクロリド(DOTAPen)を実施例34に記載のように合成し、室温で15分間200プルーフのエタノールに50mg/mLで可溶化した。DMPE-PEG2K(Corden Pharma, Boulder, Colorado, USA；カタログ番号LP-R4-123)を室温で15分間200プルーフのエタノールに50mg/mLで可溶化した。コレステリルヘミサクシネート(CHEMS)(Avanti Polar Lipid Alabaster, Alabama, USA；カタログ番号850524P)およびコレステロール(CHOL)(Corden Pharma, Boulder, Colorado, USA；カタログ番号CH-0355)を個別に75℃で5分間200プルーフに25mg/mLで可溶化した。N:P比が7のDOTAPen:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2K(50:32:16:2モル％)LNPの調製物2mLには、200プルーフのエタノール中の50mg/mL DOTAPenを92μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL CHEMSを79μL、200プルーフのエタノール中の25mg/mL CHOLを32μL、200プルーフのエタノール中の50mg/mL DMPE-PEG2Kを14μL、および200プルーフのエタノールを450μL含有する脂質エタノール混合物を最終容量が0.666mLおよび総脂質濃度が27mg/mLになるように調製した。
脂質ナノ粒子(LNP)製剤は、DOTAPen濃度に基づいてN:P(窒素対リン酸)比が7〜10で調製した。DOTAPen:CHEMS比は、様々なN:P比でそれぞれ50:32モル％で1.6に固定した。
10mM Tris-HCl(pH7.5)中の1mg/mL Fluc(ホタルルシフェラーゼ)mRNA原液を、300mMスクロース20mMリン酸pH7.4緩衝液(SUP緩衝液)中で0.225mg/mLまで希釈した。Precision NanoSystems Inc(Vancouver BC, Canada)のマイクロ流体デバイスを12mL/分の流速で用いて、エタノール脂質溶液をSUP緩衝液中の0.225mg/mL mRNA(脂質エタノール混合物：mRNAのSUP緩衝溶液)と1:2の比で混合することによりN:P比が7または10のmRNA/LNPを構築した。33％エタノール中のmRNA/LNPを次いで室温で60分間インキュベートした後、100容量(200mL)のSUP緩衝液に対して18時間透析した。
同時注入に用いたポリマーは、400rpmで1時間アジテーションしてSUP緩衝剤に20mg/mLで可溶化し、次いで一晩4℃で保存した。ポリマーをSUP緩衝液で6mg/mLまで希釈した後に注入した。
mRNA/LNPおよびポリマーを同時注入したので、それぞれの2X溶液を調製した。投薬直前に溶液を混合し直ちに注入した。
製剤の粒度は、10μLの製剤を90μLのSUP緩衝液に加えて使い捨てマイクロキュベットに入れ、Malvern Instrument ZETASIZER NANO-ZSを用いて分析することによって測定した。LNPは88nm(z平均)の粒度を示した。pH7.4での製剤のゼータ電位は、10μLの製剤を740μLのSUP緩衝液に加えて使い捨ての1mLキュベットに入れて測定した。pH4での製剤のゼータ電位は、10μLの製剤を740μLのスクロースアセテート緩衝液(pH4)に加えて使い捨ての1mLキュベットに入れて測定した。ゼータディップセルを1mLキュベットに挿入し、ZETASIZER NANO-ZSを用いて製剤を分析した。DOTAPen LNPは、pH7では-4mV、pH4では+12mVのゼータ電位を有していた。mRNAをコンパクトにするLNPの能力は、RiboGreen色素染色アッセイを用いて96ウェルプレートで測定した。色素染色mRNA測定のためにSUPで1:64に希釈した100μLのナノ粒子または全mRNA測定のためにSUPで1:200に希釈した100μLのナノ粒子を96ウェルプレートに充填した。これに、色素染色測定のためのSUP緩衝液中のRiboGreen試薬の1:200希釈液100μLまたは全mRNA測定のための0.2％Triton X-100/SUP緩衝液中のRiboGreen試薬の1:200希釈液100μLをそれぞれ各ウェルに加えた。プレートは、室温にて暗所中で5分間インキュベートした。蛍光は、480nmでの励起および520nmでの発光でMolecular Devices SpectraMax M5を用いて読み取った。最後に、全mRNAのμM濃度から色素染色mRNAのμM濃度を引き、その値を全mRNAのμM濃度で割り、次いで100を掛けることによってパーセント色素染色性を算出した。
DOTAPen LNPは、SUP緩衝液中で調製すると28％の色素染色性を示した。下記表91は、例示的なLNP製剤の特徴を示す。
（表９１）LNP特性
Figure 2018509387
実施例27：DOTAPen:CHEMS:コレステロール:DMPE-PEG 2k mRNA製剤とポリマーの同時注入とによるmRNAのインビボ発現
実施例26に記載のDOTAPen含有LNPを、同時注入および実施例2に記載したものと同じ方法を用いてP105と共に試験した。
表92は、ポリマーP105を同時注入したN:P比が7または10のDOTAPen:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。DOTAPen含有LNPの活性は、ポリマーを同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + Fluc mRNAナノ粒子と比較した。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは投薬の6時間後に取得した。Fluc mRNA/DOTAPen:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P105は、Fluc mRNA/DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNP + P105と比較して3〜6倍低い発光シグナルを示した。
（表９２）
Figure 2018509387
実施例28：DOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG 2k mRNA製剤とポリマーの同時注入とによるhEPO mRNAのインビボ発現
P96ポリマーを同時注入したDOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG2k LNPに処方したhEPO mRNAを評価するために雌CD-1マウス(7〜10週齢)を用いた。1mg/kgのmRNA、35mg/kgの脂質、および35mg/kgのポリマーにて製剤を1群当たり5匹のマウスに静脈内投薬した。スクロースリン酸緩衝液を注入したマウスを対照として用いた。各注入には、個々の体重に基づいておよそ0.25mLまたは10mL/kgの最終投薬容量をマウスに与えた。
hEPO mRNAのインビボ発現を、投薬6時間後に採取したマウス血清で評価した。後眼窩サンプリングにより採血し、血清分離管に採取した。血清は遠心分離により単離し、アッセイするまで-20℃で凍結保存した。ELISAアッセイのために、血清はPBSで希釈し、次いで製造業者のプロトコルに従ってHuman Epo Quantikine IVD ELISA (R&D Systems #DEP00)を用いて行った。簡潔に記載すると、100μLの希釈試料をELISAプレート中の100μLのEpoアッセイ希釈剤と混合し、500RPMで1時間振盪した。溶液を除去し、200μLの抗体コンジュゲートと交換し、さらに1時間震盪した。次いでプレートを洗浄し、二成分HRP/TMBシステムを用いて発色させ、450nmで読み取った。
表93は、緩衝液でまたは、ポリマーP96を同時注入したhEPO mRNA/LNPで処理した動物のhEPO血清レベルを示す。1mg/kgのhEPO mRNAで検出された2.98×106 pg/mLのhEPOと比較して、緩衝液処理マウスでは検出可能なレベルのhEPOは見られなかった。
（表９３）
Figure 2018509387
実施例29：DOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG 2k mRNA製剤とポリマーの同時注入とによるHPLC精製および非精製mRNAのインビボサイトカイン分析
P95ポリマーを同時注入したDOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG2k LNPに処方したHPLC精製または非精製Fluc mRNAを評価するために、雌CD-1マウス(7〜10週齢)を用いた。1mg/kgのmRNA、35mg/kgの脂質、および30mg/kgのポリマーにて製剤を1群当たり5匹のマウスに静脈内投薬した。スクロースリン酸緩衝液を注入したマウスを対照として用いた。各注入には、個々の体重に基づいておよそ0.25mLまたは10mL/kgの最終投薬容量をマウスに与えた。
マウスIP-10サイトカインレベルは、R&D systems Mouse CXCL10/IP-10/CRG-2 Quantikine ELISAキット(#SMCX100)を用いて定量した。投薬の3時間後に後眼窩サンプリングにより採血し、血清分離管に採取した。血清は遠心分離により単離し、アッセイするまで-20℃で凍結保存した。ELISAには、血清はPBSで希釈され、次いでメーカーのプロトコルに従って処理(run)した。簡潔に記載すると、50μLの希釈試料をELISAプレート中の50μLのアッセイ希釈剤と混合し、RTで2時間インキュベートした。溶液を除去し、200μLの抗体コンジュゲートと交換し、RTで2時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、二成分HRP/TMBシステムを用いて発色させ、450nmで読み取った。
表94は、緩衝液でまたは、ポリマーP95を同時注入したLNPに処方したHPLC精製または非精製Fluc mRNAで処理した動物のIP-10血清レベルを示す。投薬3時間後のIP-10サイトカインレベルは、非精製Fluc mRNAで誘導した高IP-10サイトカインレベルと比較して、HPLC精製Fluc mRNAでは有意に低減した。
（表９４）
Figure 2018509387
実施例30：DOTAP:CHEMS:コレステロール:DSPE-PEG 2k とポリマーの同時注入とによる、反復投薬後のHPLC精製または非精製Fluc mRNAのインビボ発現
P95を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k LNPに処方されたHPLC精製Fluc 2 mRNAおよび非精製Fluc 2 mRNAは、実施例2に記載したのと同じ方法を用いてCD-1マウスに反復投与した。
表95は、ポリマーP95を同時注入したDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k + HPLC精製または非精製Fluc 2 mRNAナノ粒子で処理した動物の肝臓における発光値を示す。mRNA/LNP + ポリマーを1:1の比で混合し、直ちにマウスに注入した。データは各投薬の6時間後に取得した。製剤は、CD-1マウスにおいて週1回5週間IV投与により反復投薬した。HPLC精製Fluc mRNAの反復投与は、各1週間用量では5週目までは発光シグナルの減少がほとんどなかった（最大で8倍）。対照的に、非精製Fluc mRNAでの反復投与は、各1週間用量では5週目までは発光シグナルの減少が最大で76倍であった。
（表９５）
Figure 2018509387
実施例31：DOTAP:CHEMS:コレステロール:DMPE-PEG 2k mRNA製剤とポリマーの同時注入とによるHPLC精製および非精製mRNAsのインビボサイトカイン分析
P103ポリマーを同時注入したDOTAP:CHEMS:コレステロール:DMPE-PEG2k LNPに処方したHPLC精製または非精製hOTCあるいは翻訳不可能なhOTC対照mRNA(AUG開始コドンはAAGへ変異させた)を評価するために、雄OTC-spfashマウス(8〜12週齢)を用いた。1mg/kgのmRNA、27mg/kgの脂質、および30mg/kgのポリマーにて製剤を1群当たり5匹のマウスに静脈内投薬した。スクロースリン酸緩衝液を注入したマウスを対照として用いた。各注入には、個々の体重に基づいておよそ0.25mLまたは10mL/kgの最終投薬容量をマウスに与えた。
マウスIP-10サイトカインレベルは、R&D systems Mouse CXCL10/IP-10/CRG-2 Quantikine ELISAキット(#SMCX100)を用いて定量した。投薬の3時間後に後眼窩サンプリングにより採血し、血清分離管に採取した。血清は遠心分離により単離し、アッセイするまで-20℃で凍結保存した。ELISAには、血清はPBSで希釈され、次いでメーカーのプロトコルに従って処理(run)した。簡潔に記載すると、50μLの希釈試料をELISAプレート中の50μLのアッセイ希釈剤と混合し、RTで2時間インキュベートした。溶液を除去し、200μLの抗体コンジュゲートと交換し、RTで2時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、二成分HRP/TMBシステムを用いて発色させ、450nmで読み取った。
表96は、緩衝液でまたは、ポリマーP103を同時注入したLNPに処方したHPLC精製または非精製hOTC mRNAあるいは翻訳不可能なhOTC対照mRNAで処理した動物のIP-10血清レベルを示す。非精製mRNAで誘導した高IP-10サイトカインレベルと比較して、HPLC精製mRNAでは、投薬3時間後ではIP-10サイトカインレベルの誘導は観察されなかった。
（表９６）
Figure 2018509387
実施例32：オルニチントランスカルバミラーゼ欠損マウスにおける脂質-mRNA製剤とポリマーの同時注入とによるHPLC精製mRNAの治療効果
高アンモニア血症は実施例21に記載のようにOTC-spfashマウスに誘導した。AAVの投薬の4日後、N:Pが7のDOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2k(50:32:16:2)に処方した1mg/kgのHPLC精製OTC mRNAまたは1mg/kgのHPLC精製翻訳不可能OTC対照mRNAを30mg/kgのポリマーP103と同時注入して、3〜4日毎に全部で3回の反復投薬で投与した。二回目のmRNA投薬の48時間後(AAV処理後9日目)に尿を採取し、クレアチニンレベルにノーマライズしたオロチン酸レベルを分析した。オロチン酸(OA)レベルは、緩衝液処理(999±192μmol OA/mmolクレアチニン)または翻訳不可能な対照mRNA処理(882±192μmol OA/mmolクレアチニン)と比較して、OTC mRNA処理(336±166μmol OA/mmolクレアチニン)後では低減していた。AAV処理後12日目(3回目の反復mRNA投薬後24時間)に血漿を採取し、アンモニアレベルを分析した。血漿アンモニアレベルは、翻訳不可能な対照mRNA（217±119μMアンモニア）または緩衝液処理（110±24μMアンモニア）で処理した高アンモニア血症マウスと比較して、OTC mRNAでの処置後では正常なレベル(43±29μMアンモニア)まで低減していた。HPLC精製OTCまたは翻訳不可能な対照mRNAの投与後に何らかのサイトカイン誘導が観察されるかどうかを調べるため、最初のmRNA投薬の3時間後に血清を採取し、IP-10レベルを調べた。IP-10レベルは、HPLC精製OTCおよび翻訳不可能な対照mRNA処理マウスの両方における定量化レベルより低く（<30pg/mL）、緩衝液処理マウスと同様であった。対照的に、未精製Fluc 2 mRNA対照は、IP-10血清レベルの高い誘導(13,009±4932 pg/mL)を示した。
実施例33：オルニチントランスカルバミラーゼ欠損マウスにおける脂質-mRNA製剤とポリマーの同時注入とによるOTC mRNAの発現
OTC-spfashマウスに、3 mg/kgのOTC mRNA、3 mg/kgの翻訳不可能なOTC対照mRNA、または緩衝液の単回IV用量を投与した。各mRNAは、N:Pが7のDOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2k(50:32:18:10)に処方し、30mg/kgのポリマーP105を同時注入した。マウスは投薬後6、24、または48時間後に屠殺し、肝臓組織試料をOTCウエスタン分析のために採取した。肝臓組織からタンパク質抽出物を調製するために、およそ200mgの肝臓組織を含有する各試料チューブに400〜600μLの新しく調製したPierce T-PER組織溶解緩衝液（10mlの溶解緩衝液毎にPierceプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルタブレットを1個）を加えた。次いでチューブをMP Bio Fastprep-24 Instrument（カタログ番号116004500）に載せ、組織を6m/sの速度で20秒間均質化した。各組織ホモジネートを4℃、13,000rpmで15分間遠心分離し、上清を新しいEppendorfチューブに移した。この全細胞溶解物をBCAアッセイ（Thermo Scientific、カタログ番号23225）により総タンパク質濃度についてさらに分析した。タンパク質抽出物を4X試料緩衝液(Bio-Rad、カタログ番号161-0791)および20X XT還元剤(Bio-Rad、カタログ番号161-0792)と混合して最終タンパク質濃度を5μg/μlとした後、4〜12％SDS-PAGEゲル（Bio-Rad、カタログ番号345-0124）の1レーン当たり25μgの各試料を載せた。試料は次いで95℃で5分間加熱された後ゲル上を泳動(running)させた。電気泳動に続いて、タンパク質をBio-Rad Transfer-Blot Turboシステム（カタログ番号170-4155）下でゲルからPVDF膜（Bio-Rad、カタログ番号170-4157）に移すことによってブロッティングを実施した。その後、ブロットをOdyssey Blocking Buffer（LI-COR、カタログ番号927-40000）中で室温にて1時間ブロックし、続いてOTC（Sigma、カタログ番号HPA000243、1:2000希釈物）またはHSP90（Origene、カタログ番号TA500494、1:8000希釈物）一次抗体と4℃で一晩インキュベーションした。TBST緩衝液中で数回洗浄した後、ブロットをHRPでコンジュゲートされた二次抗体（Cell Signaling、カタログ番号7076S、1:2000）と共に室温で1時間インキュベートした。タンパク質バンドを可視化するために、洗浄したブロットを発光ベースのHRP基質（Millipore、カタログ番号WBLUF0500）と共にインキュベートし、次いでBio-Rad ChemiDoc XRSシステム（カタログ番号170-8265）下で画像化した。ウエスタン解析の定量は、ChemiDocシステムに連結したBio-Rad Image Lab Software（カタログ番号170-9690）を用いて実施した。野生型同腹仔試料と比べた処理したOTC-spfash試料におけるOTC発現レベルを定量するために、OTCタンパク質バンドの強度を同じ試料中のローディングコントロールであるHSP90の強度で割った。次いでこの比を野生型同腹仔試料の同様の比で割った。これを野生型と比べた％OTC発現とみなした。
表97は、3mg/kgのOTC mRNA、3mg/kgの翻訳不可能な対照mRNA、または緩衝液で処理したOTC-spfashマウスの野生型同腹仔マウスと比べた％OTC発現を示す。投薬の24および48時間後では、OTC-spfashマウスにおけるOTC mRNA処理は野生型OTC発現レベルのおよそ40％を示した。翻訳不可能な対照mRNAからは、緩衝液処理で見られたレベルを超えるOTC発現は検出できなかった。
（表９７）
Figure 2018509387
実施例34：カチオン性脂質の合成
パート1：(R)-5-(ジメチルアミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩(DODAPen-Cl)の合成
Figure 2018509387
(R)-5-ブロモペンタン-1,2-ジイルジオレエート(1.66g、2.33mmol)を、磁気攪拌棒を備えた100mL丸底フラスコ中で無水アセトニトリル(50.0mL)に溶解した。塩酸ジメチルアミン(0.951g、11.7mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(2.03mL、11.7mmol)を懸濁液に逐次的に加え、混合物を油浴中で16時間60℃まで加熱した。現状で透明な溶液をRTまで冷却し(その際に濁った)、溶媒を減圧下ロータリーエバポレーター上で除去して褐色油状残渣が得られた。ジクロロメタン:メタノール(0〜10％)の勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗残渣を精製して、明褐色の半固体として清浄な生成物が得られた(1.20g、1.77mmol、収率：76％)。濃塩酸を油状生成物に加え、ロータリーエバポレーター上で、続いて高真空下で混合物を濃縮することによって塩酸塩を得た。最終生成物はろう様のオフホワイトとして得られた。最終生成物はNMR(溶媒としてのCD3ODとの400MHz 1H NMR)によって特性決定され、全てのスペクトルは所望のものと一致した。
パート2：(R)-5-グアニジノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩(DOPen-G)の合成
Figure 2018509387
パート2A：(R)-5-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエートの合成
(R)-tert-ブチル-(4,5-ジヒドロキシペンチル)カルバメート(2.10g、9.58mmol)を、磁気攪拌棒を備えた250mL丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン(50.0mL)に溶解した。混合物にオレイン酸(5.70g、20.2mmol)を加え、攪拌溶液を氷浴中で0℃まで冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド(4.94g、23.9mmol)およびジメチルアミノピリジン(1.17g、9.58mmol)を冷溶液に加え、反応物を16時間かけてRTまで温めた。固体のジシクロヘキシル尿素沈殿物をブフナー漏斗で濾別し、ジクロロメタン(4×25mL)で洗浄した。ジクロロメタン濾液を減圧下ロータリーエバポレーター上で濃縮して油状残渣を得た。得られた残渣をヘキサン:酢酸エチル(0〜10％)の勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。純生成物を無色油状物として得た(6.89g、9.21mmol)。収率：96％。生成物はNMR(溶媒としてのCD3ODとの400MHz 1H NMR)によって特性決定され、全てのスペクトルは(R)-5-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエートと一致した。
パート2B：(R)-5-アミノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩の合成
(R)-5-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート(6.87g、9.18mmol)を磁気攪拌棒を備えた250mL丸底フラスコ中で無水1,4-ジオキサン(50.0mL)に溶解した。1,4-ジオキサン中の4N塩酸を加え(46.0mL、184mmol)、溶液をRTで4時間撹拌した。溶媒を減圧下ロータリーエバポレーター上で除去し、生成物を高真空下で16時間乾燥させた。純生成物を粘性の無色油状物(6.29g、9.18mmol)として定量的収率で得た。生成物はNMR(溶媒としてのCD3ODとの400MHz 1H NMR)によって特性決定し、全てのスペクトルは(R)-5-アミノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩と一致した。
パート2C：(R)-5-(2,3-ビス(tert-ブトキシカルボニル)グアニジノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート
(R)-5-アミノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩(2.46g、3.59mmol)を、磁気攪拌棒を備えた250mL丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン(50.0mL)に溶解した。トリエチルアミン(1.00mL、7.17mmol)および1,3-ジ-Boc-2-(トリフルオロメチルスルホニル)グアニジン(1.55g、3.96mmol)を逐次的に加え、混合物を周囲温度で22時間撹拌した。溶液を減圧下ロータリーエバポレーター上で濃縮して、油状残渣が得られた。得られた残渣をヘキサン:酢酸エチル(0〜10％)の勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。純生成物を無色油状物として得た(3.00g、3.37mmol)。収率：94％。生成物はNMR(溶媒としてのCDCl3との400MHz 1H NMR)によって特性決定され、全てのスペクトルは(R)-5-(2,3-ビス(tert-ブトキシカルボニル)グアニジノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエートと一致した。
パートD：(R)-5-グアニジノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩(DOPen-G)の合成
(R)-5-(2,3-ビス(tert-ブトキシカルボニル)グアニジノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート(1.81g、2.03mmol)を、磁気攪拌棒を備えた250mL丸底フラスコ中の無水1,4-ジオキサン(20.0mL)に溶解した。1,4-ジオキサン中の4N塩酸を加え(30.2mL、121mmol)、溶液をRTで48時間撹拌した。溶媒を減圧下ロータリーエバポレーター上で濃縮して油状残渣が得られた。得られた残渣をジクロロメタン:メタノール(0〜100％)の勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィー上で精製した。純生成物を高真空下で20時間乾燥して、オフホワイトの半固体(1.00g、1.38mmol)が生じた。収率：68％。生成物はNMR(溶媒としてのCD3ODとの400MHz 1H NMR)によって特性決定され、全てのスペクトルはDOPen-Gと一致した。
パート3：(R)-N,N,N-トリメチル-4,5-ビス(オレオイルオキシ)ペンタン-1-アミニウムクロリド(DOTAPen)の合成
Figure 2018509387
(R)-5-(ジメチルアミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート(DODAPen、0.700g、1.04mmol)を、磁気攪拌棒を備えた100mL丸底フラスコ中の無水アセトニトリル(10.0mL)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(1.80mL、10.3mmol)およびヨードメタン(1.93mL、31.0mmol)を逐次的に加え、溶液を85℃で20時間還流させた。溶液をRTまで冷却し、ジエチルエーテル(300mL)で希釈し、その際にジイソプロピルエチルアミニウムヨウ化物塩の析出物が形成された。固体析出物を濾別し、合わせた有機相を減圧下ロータリーエバポレーター上で濃縮した。ジクロロメタンとメタノール(10％)との混合物を用いて粗残渣を短いシリカゲルカラムに通した。純生成物(ヨウ化物塩)は赤褐色の半固体として得られた(780mg)。生成物は次いでAmberlite IRA400塩化物イオン交換樹脂カラムに通し、ジクロロメタン:メタノール(33％)の混合物で溶離した。カラム操作を10回繰り返して所望の生成物を塩化物塩として得た。高真空下で乾燥させた後、純生成物は淡褐色のワックス状固体(430mg、0.592mmol)として得られた。収率：57％。生成物はNMR(溶媒としてのCD3ODとの400MHz 1H NMR)によって特性決定され、全てのスペクトルはDOTAPenと一致した。
本発明の具体的な態様が例示目的のために本明細書において記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な改変を行ってもよいことが上記から理解されるであろう。よって、本発明は添付の特許請求の範囲を除いて限定されない。本明細書において引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的でそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (272)

  1. （a）治療または診断剤を含む有効量の脂質ナノ粒子と、
    （b）有効量の膜不安定化ポリマーと
    を対象に投与する工程であって、該治療または診断剤が標的細胞の細胞質ゾルに送達される、工程
    を含む、対象内の標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための方法。
  2. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方が、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む、請求項1記載の方法。
  3. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーが別々に投与される、請求項1または2記載の方法。
  4. 膜不安定化ポリマーが脂質ナノ粒子の投与後に投与される、請求項3記載の方法。
  5. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーが単一組成物内で一緒に投与される、請求項1または2記載の方法。
  6. 脂質ナノ粒子がカチオン性脂質を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. カチオン性脂質が、
    N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、
    N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、
    1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DOEPC）、
    1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DLEPC）、
    1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DMEPC）、
    1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（14:1）、
    N1-[2-((1S)-1-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4-[ジ(3-アミノプロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド）エチル]-3,4-ジ[オレイルオキシ]-ベンズアミド（MVL5）、
    ジオクタデシルアミド-グリシルスペルミン（DOGS）、
    3b-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール（DC-Chol）、
    ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、
    SAINT-2,N-メチル-4-(ジオレイル)メチルピリジニウム、
    1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、
    1,2-ジオレオイル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）、
    1,2-ジオレオイルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（DORI）、
    ジアルキル化アミノ酸（DILA2）、
    C18:1-norArg-C16、
    ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、
    1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（POEPC）、
    1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（MOEPC）、
    (R)-5-(ジメチルアミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩（DODAPen-Cl）、
    (R)-5-グアニジノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩（DOPen-G）、
    (R)-N,N,N-トリメチル-4,5-ビス(オレオイルオキシ)ペンタン-1-アミニウムクロリド（DOTAPen）、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項6記載の方法。
  8. カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質である、請求項6記載の方法。
  9. イオン化可能なカチオン性脂質が、
    ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、
    1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、
    2,2-ジリノレイル-4-(2ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン（DLin-KC2-DMA）、
    ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート（DLin-MC3-DMA）、
    1,2-ジオレオイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DODAP）、
    1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DODMA）、
    モルホリノコレステロール（Mo-CHOL）、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項8記載の方法。
  10. 脂質ナノ粒子が、イオン化可能なアニオン性脂質を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  11. イオン化可能なアニオン性脂質が、
    コレステリルヘミサクシネート(CHEMS)、
    ホスファチジルセリン、
    パルミトイルホモセリン、
    α-トコフェロールヘミサクシネート、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項10記載の方法。
  12. 脂質ナノ粒子がヘルパー脂質を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
  13. ヘルパー脂質が、
    コレステロール(CHOL)、
    1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、
    1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、
    1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、
    1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、
    1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DLPE)、
    1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、
    1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPHyPE）、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項12記載の方法。
  14. 脂質ナノ粒子が、ポリエチレングリコール-脂質コンジュゲート（PEG-脂質）を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. PEG-脂質が、
    N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DMPE-PEG2,000)、
    N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE-PEG2,000)
    ポリエチレングリコール-ジミリストールグリセロール（PEG-DMG）、
    ポリエチレングリコール-ジステアロイルグリセロール（PEG-DSG）、
    N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]}(C8 PEG2000セラミド)、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項14記載の方法。
  16. 脂質ナノ粒子は、大きさが約200nmより小さい、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
  17. 膜不安定化ポリマーが第1の標的化リガンドを含む、請求項2記載の方法。
  18. 脂質ナノ粒子が第1の標的化リガンドを含む、請求項2記載の方法。
  19. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの両方が第1の標的リガンドを含む、請求項2記載の方法。
  20. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの一方が第1の標的化リガンドを含み、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーのうちの他方が、第1の標的化リガンドとは異なる第2の標的化リガンドを含み、かつ(i)第1の標的化リガンドによって認識されるのと同じ細胞表面分子に特異的に結合するか、または(ii)標的細胞の表面の異なる細胞表面分子に特異的に結合する、請求項2記載の方法。
  21. 標的細胞が、分泌細胞、軟骨細胞、上皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液細胞、内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、または樹状細胞である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
  22. 標的細胞が、癌細胞、免疫細胞、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞、または異常な代謝活性を有する細胞である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
  23. 第1の標的化リガンドが、トランスフェリン受容体1型、トランスフェリン受容体2型、EGF受容体、HER2/Neu、VEGF受容体、PDGF受容体、インテグリン、NGF受容体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、葉酸受容体、およびシグマ受容体からなる群より選択される細胞表面分子に特異的に結合する、請求項2および17〜20のいずれか一項記載の方法。
  24. 第2の標的化リガンドが、トランスフェリン受容体1型、トランスフェリン受容体2型、EGF受容体、HER2/Neu、VEGF受容体、PDGF受容体、インテグリン、NGF受容体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、葉酸受容体、およびシグマ受容体からなる群より選択される細胞表面分子に特異的に結合する、請求項20記載の方法。
  25. 第1の標的化リガンドが小分子標的化部分を含む、請求項2および17〜20のいずれか一項記載の方法。
  26. 第2の標的化リガンドが小分子標的化部分を含む、請求項20記載の方法。
  27. 小分子標的化部分が、糖、ビタミン、ビスホスホネート、またはこれらのアナログである、請求項25または26記載の方法。
  28. 糖が、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン(NAG)、マンノース、およびマンノース-6-リン酸(M6P)より選択される、請求項27記載の方法。
  29. ビタミンが葉酸である、請求項27記載の方法。
  30. 第1の標的化リガンドがタンパク質である、請求項2および17〜20のいずれか一項記載の方法。
  31. 第2の標的化リガンドがタンパク質である、請求項20記載の方法。
  32. タンパク質が、抗体、ペプチドアプタマー、または細胞表面分子の天然リガンドに由来するタンパク質である、請求項30または31記載の方法。
  33. 第1の標的化リガンドがペプチドである、請求項2および17〜20のいずれか一項記載の方法。
  34. 第2の標的化リガンドがペプチドである、請求項20記載の方法。
  35. ペプチドが、インテグリン結合ペプチド、LOX-1結合ペプチド、および上皮成長因子（EGF）ペプチド、ニューロテンシンペプチド、NL4ペプチド、またはYIGSRラミニンペプチドである、請求項33または34記載の方法。
  36. 標的細胞が肝細胞である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
  37. 標的細胞が肝細胞である、請求項2および17〜20のいずれか一項記載の方法。
  38. 第1の標的化リガンドが、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合する、請求項37記載の方法。
  39. 第1の標的化リガンドがN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む、請求項38記載の方法。
  40. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの両方が第1の標的化リガンドを含む、請求項37〜39のいずれか一項記載の方法。
  41. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの一方が第1の標的化リガンドを含み、脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーのうちの他方が、第1の標的化リガンドとは異なる第2の標的化リガンドを含み、かつ(i)アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合するか、または(ii)肝細胞の表面の異なる細胞表面分子に特異的に結合する、
    請求項37〜39のいずれか一項記載の方法。
  42. 第2の標的化リガンドがN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む、請求項41記載の方法。
  43. 膜不安定化ポリマーが、コポリマー、合成ペプチド、膜不安定化毒素もしくはその誘導体、またはウイルス融合ペプチドもしくはその誘導体である、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
  44. 膜不安定化ポリマーがpH感受性ポリマーである、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
  45. pH感受性ポリマーがコポリマーである、請求項44記載の方法。
  46. コポリマーがブロックコポリマーである、請求項45記載の方法。
  47. ブロックコポリマーがジブロックコポリマーである、請求項46記載の方法。
  48. ブロックコポリマーが疎水性膜不安定化ブロックおよび親水性ブロックを含む、請求項46記載の方法。
  49. 親水性ブロックが疎水性ブロックに開裂可能に連結している、請求項48記載の方法。
  50. 親水性ブロックがジスルフィド結合またはpH感受性結合を通して疎水性ブロックに連結している、請求項49記載の方法。
  51. pH感受性結合が、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、イミン、オルトエステル、カーボネート、またはマレアミド酸である、請求項50記載の方法。
  52. 親水性ブロックにおいて疎水性モノマー残基よりも親水性モノマー残基が多くなるように、親水性ブロックが親水性モノマーおよび疎水性モノマーの両方から重合されている、請求項48記載の方法。
  53. 親水性ブロックが、ペンダント遮蔽部分に連結したモノマー残基を含む、請求項48または52記載の方法。
  54. 前記遮蔽部分がポリエチレングリコール(PEG)部分である、請求項53記載の方法。
  55. 前記遮蔽部分が親水性ブロックに開裂可能に連結している、請求項53または54記載の方法。
  56. 前記遮蔽部分が、ジスルフィド結合またはpH感受性結合を通して親水性ブロックに連結している、請求項55記載の方法。
  57. pH感受性結合が、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、イミン、オルトエステル、カーボネート、またはマレアミド酸である、請求項56記載の方法。
  58. pH感受性ポリマーが、カルボン酸官能基を有するモノマー残基を含む、請求項44記載の方法。
  59. pH感受性ポリマーが、アミン官能基を有するモノマー残基を含む、請求項44記載の方法。
  60. pH感受性ポリマーが、疎水性官能基を有するモノマー残基を含む、請求項44記載の方法。
  61. pH感受性ポリマーが、(C2-C8)アルキルアクリル酸の重合に由来するモノマー残基を含む、請求項44記載の方法。
  62. pH感受性ポリマーが、(C2-C8)アルキル-エタクリレート、(C2-C8)アルキル-メタクリレート、または(C2-C8)アルキル-アクリレートの重合に由来するモノマー残基を含む、請求項44記載の方法。
  63. pH感受性ポリマーが、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、または(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来するモノマー残基を含む、請求項44記載の方法。
  64. pH感受性ポリマーが、プロピルアクリル酸、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート、およびブチルメタクリレートの重合に由来するモノマー残基を有するランダムコポリマー鎖を含む、請求項44記載の方法。
  65. pH感受性ポリマーが、膜破壊ポリマーブロックとしてランダムコポリマー鎖を含み、1つまたは複数の追加のブロックをさらに含むブロックコポリマーである、請求項64記載の方法。
  66. pH感受性ポリマーが膜不安定化ペプチドに共有連結している、請求項44〜64のいずれか一項記載の方法。
  67. pH感受性ポリマーが複数のペンダント連結基を含み、複数の膜不安定化ペプチドが該複数のペンダント連結基を介して該pH感受性ポリマーに連結している、請求項44〜64のいずれか一項記載の方法。
  68. pH感受性膜不安定化ポリマーが、親水性ランダムコポリマーブロックおよび疎水性ランダムコポリマーブロックを有するジブロックコポリマーであり、
    該親水性ブロックは、親水性モノマー残基および疎水性モノマー残基の両方を含む両親媒性ブロックであり、親水性ブロック中の親水性モノマー残基の数は、疎水性モノマー残基の数よりも大きく；
    該疎水性ブロックは、疎水性モノマー残基および親水性モノマー残基の両方を含み、約7.4のpHで全体的に疎水的特性を有する両親媒性膜不安定化ブロックであり；かつ
    該親水性および疎水性ブロックの親水性モノマー残基のそれぞれは、独立して、約7.4のpHでイオン性であるモノマー残基、約7.4のpHで中性であるモノマー残基、および約7.4のpHで双性イオン性であるモノマー残基からなる群より選択される、
    請求項44記載の方法。
  69. 式Iのランダムブロックコポリマーであって、
    Figure 2018509387
    式中、
    A0、A1、A2、A3、A4およびA5は、それぞれ独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-、-O(C)b-、および-CR8-CR9からなる群より選択され；R1〜R6およびY0〜Y5では完全には置換されていないA0〜A5の4価の炭素原子は、適切な数の水素原子で満たされており；aおよびbは、それぞれ独立して1〜4であり；R8およびR9は、それぞれ独立して、-C(O)OH、-C(O)Oアルキル、および-C(O)NR10からなる群より選択され、R8およびR9は、互いに共有連結して環構造を形成していてもよく；
    Y5は、水素であるか、または、いずれも1つもしくは複数のフッ素原子で置換されていてもよい-(1C-10C)アルキル、-(3C-6C)シクロアルキル、-O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、-C(O)NR11(1C-10C)アルキル、および-(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
    Y0、Y3、およびY4は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-、-S(2C-10C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され；
    Y1およびY2は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-18C)アルキル-、-(3C-18C)分岐アルキル、-C(O)O(2C-18C)アルキル-、-C(O)O(2C-18C)分岐アルキル、-OC(O)(1C-18C)アルキル-、-OC(O)(1C-18C)分岐アルキル-、-O(2C-18C)アルキル-、-0(2C-18C)分岐アルキル-、-S(2C-18C)アルキル-、-S(2C-18C)分岐アルキル-、-C(O)NR12(2C-18C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-18C)分岐アルキル-からなる群より選択され、Y1またはY2の任意のアルキルまたは分岐アルキル基は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、およびR12は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    Q0は、生理的pHで親水性である残基；O-[(C)2-3-O]x-R7；およびO-[(C)2-3-O]x-C(O)-NR13R14からなる群より選択される残基であり；xは、1〜48であり；R7は、-CH3または-CO2Hであり；R13およびR14は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    Q1およびQ2は、それぞれ独立して、存在しないか、あるいは、通常の生理的pHで親水性である残基；コンジュゲート可能なまたは官能化可能な残基；通常の生理的pHで疎水性である残基；1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基；および1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい分枝アルキル基より選択され；
    Q3は、通常の生理的pHで正電荷を持つ残基であり；
    Q4は、通常の生理的pHで負電荷を持つが、より低いpHではプロトン化を受ける残基であり；
    mは、0より大きく1.0までのモル分率であり；
    nは、0〜1.0未満のモル分率であり；
    pは、0〜1.0未満のモル分率であり；m + n + p = 1であり；
    qは、0.1〜0.9のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.9のモル分率であり；
    sは、最大で0.85までのモル分率で存在し；q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；かつ
    wは、1〜50kDaである、
    前記ランダムブロックコポリマーを、pH感受性ポリマーが含む、請求項44記載の方法。
  70. mがn + pより大きい、請求項69記載の方法。
  71. pが0である、請求項70記載の方法。
  72. nが0より大きい、請求項69〜71のいずれか一項記載の方法。
  73. Y1およびQ1の少なくとも一方が、1つもしくは複数のフッ素原子で置換されたアルキルまたは分枝アルキル基を含有する、請求項72記載の方法。
  74. pH感受性ポリマーが、式IIのポリマーであって、
    T1-L-[PEGMAm-PDSMAn-BPAMp]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w II
    式中、
    PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり；
    PDSMAは、ピリジルジスルフィドメタクリレート残基であり；
    BPAMは、2-[2-Bocアミノエトキシ]エチルメタクリレート残基であり；
    BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
    PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
    DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
    mは、0.6〜1のモル分率であり；
    nは、0〜0.4のモル分率であり；
    pは、0〜0.4のモル分率であり；
    m + n + p = 1であり；
    qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
    sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；
    wは、1〜25kDaであり；
    T1は、存在しないか、または第1の標的化リガンドであり；かつ
    Lは、存在しないか、または連結部分である、
    前記ポリマーである、請求項69記載の方法。
  75. pH感受性ポリマーが、式Vのポリマーであって、
    T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w V
    式中、
    PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり;
    M2は、
    (C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；
    (C4-C18)分枝アルキル-メタクリレート残基；
    コレステリルメタクリレート残基；
    1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；および
    1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
    からなる群より選択されるメタクリレート残基であり；
    BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
    PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
    DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
    mおよびnは、それぞれ0より大きいモル分率であり、mは、nより大きく、m + n = 1であり；
    qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
    sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；
    wは、1〜25kDaであり；
    T1は、存在しないか、または第1の標的化リガンドであり；かつ
    Lは、存在しないか、または連結部分である、
    前記ポリマーである、請求項69記載の方法。
  76. M2が、
    2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基、
    2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基、
    1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基、
    2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基、
    2-エチルヘキシルメタクリレート残基、
    ブチルメタクリレート残基、
    ヘキシルメタクリレート残基、
    オクチルメタクリレート残基、
    n-デシルメタクリレート残基、
    ラウリルメタクリレート残基、
    ミリスチルメタクリレート残基、
    ステアリルメタクリレート残基、
    コレステリルメタクリレート残基、
    エチレングリコールフェニルエーテルメタクリレート残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，2-フェニルエチルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，2-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]エチルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，シクロヘキシルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，2-[ビス(1-メチルエチル)アミノ]エチルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，3-メチルブチルエステル残基、
    ネオペンチルメタクリレート残基、
    tert-ブチルメタクリレート残基、
    3,3,5-トリメチルシクロヘキシルメタクリレート残基、
    2-ヒドロキシプロピルメタクリレート残基、
    5-ノニルメタクリレート残基、
    2-ブチル-1-オクチルメタクリレート残基、
    2-ヘキシル-1-デシルメタクリレート残基、および
    2-(tert-ブチルアミノ)エチルメタクリレート残基
    からなる群より選択される、請求項75記載の方法。
  77. PEGMAが、エチレングリコール単位を4〜5個またはエチレングリコール単位を7〜8個有する、請求項74〜76のいずれか一項記載の方法。
  78. T1およびLが存在しており、T1がN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む、請求項74〜77のいずれか一項記載の方法。
  79. Lが、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコール(PEG)部分を含む、請求項77記載の方法。
  80. 脂質ナノ粒子が治療剤を含む、請求項1〜79のいずれか一項記載の方法。
  81. 治療剤が、抗癌剤、抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗炎症剤、または細胞代謝活性を調節する薬剤である、請求項80記載の方法。
  82. 治療剤が、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子である、請求項80記載の方法。
  83. 治療剤がポリヌクレオチドである、請求項82記載の方法。
  84. 脂質ナノ粒子が脂質成分の混合物を含み、該脂質成分の混合物が、
    生理的pHで永続的に電荷を有し、該混合物中に約35モル％〜約55モル％存在するカチオン性脂質と；
    イオン化可能なアニオン性脂質であって、該アニオン性脂質は存在しなくてもよく、存在する場合は該混合物中に約25モル％〜約40モル％存在する、イオン化可能なアニオン性脂質と；
    該イオン化可能なアニオン性脂質が存在しない場合は、該混合物中に約40モル％〜約50モル％存在するヘルパー脂質であって、該イオン化可能なアニオン性脂質が存在する場合は、該混合物中に約5モル％〜約20モル％存在する、ヘルパー脂質と；
    該混合物中に約2モル％〜約15モル％存在するPEG-脂質と
    を含む、請求項83記載の方法。
  85. カチオン性脂質がDOTAPであり；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり；
    ヘルパー脂質がCHOLであり；かつ/あるいは、
    PEG-脂質がDSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2kである、
    請求項84記載の方法。
  86. イオン化可能なアニオン性脂質が存在せず、カチオン性脂質が約35モル％〜約45モル％存在し、PEG-脂質が約5モル％〜約15モル％存在する、請求項84または85記載の方法。
  87. イオン化可能なアニオン性脂質が存在し、カチオン性脂質が約40モル％〜約55モル％存在する、請求項84または85記載の方法。
  88. PEG-脂質が約5モル％〜約15モル％存在する、請求項87記載の方法。
  89. カチオン性脂質がDOTAPであり、ヘルパー脂質がCHOLであり、かつ
    イオン化可能なアニオン性脂質が存在せず、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約40:50:10であるか；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:16:2であるか；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10であるか；または
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10である、
    請求項84記載の方法。
  90. 脂質ナノ粒子は、N:P比が約1〜約30である、請求項83記載の方法。
  91. ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項83〜90のいずれか一項記載の方法。
  92. mRNAが、タンパク質欠損症と関連する機能性タンパク質をコードする、請求項91記載の方法。
  93. 標的細胞が肝細胞であり、mRNAが、アルファ-1-抗トリプシン(A1AT)、カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)、フマリルアセトアセターゼ(FAH)酵素、アラニン：グリオキシレート-アミノトランスフェラーゼ(AGT)、メチルマロニルCoAムターゼ(MUT)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファサブユニット(PCCA)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼベータサブユニット(PCCB)、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)のサブユニット、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、銅輸送ATPアーゼAtp7B、ビリルビンウリジンジホスフェートグルクロニルトランスフェラーゼ(BGT)酵素、ヘプシジン、グルコース-6-ホスファターゼ(G6Pase)、グルコース6-ホスフェートトランスロカーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼ(GB)、ニーマン・ピックC1タンパク質(NPC1)、ニーマン・ピックC2タンパク質(NPC2)、酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、第IX因子、ガラクトース-1-ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、トランスサイレチン、補体調節タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、ホモゲンチセート1,2-ジオキシゲナーゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、P型ATPアーゼタンパク質FIC-1、アルファ-ガラクトシダーゼA、酸性セラミダーゼ、酸性α-L-フコシダーゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、アルファ-L-イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、N-アセチルガラクトサミン-6-サルフェートスルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼB、ヘパラン-N-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル-CoA:α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-サルフェートスルファターゼ、アルファ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびβ-ヘキソサミニダーゼAからなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項92記載の方法。
  94. mRNAが分泌タンパク質をコードする、請求項91記載の方法。
  95. 分泌タンパク質が、ホルモン、サイトカイン、成長因子、凝固因子、抗プロテアーゼタンパク質、血管新生タンパク質、抗血管新生タンパク質、ケモカイン、および抗体からなる群より選択される、請求項94記載の方法。
  96. 分泌タンパク質が、エリスロポエチン、トロンボポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、レプチン、血小板由来成長因子B、ケラチノサイト成長因子、骨形成タンパク質2、骨形成タンパク質7、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1、ヒト成長ホルモン、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、リラキシン-2、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12、インターロイキン-18、インターロイキン-21、CCサブファミリーケモカイン、CXCサブファミリーケモカイン、Cサブファミリーケモカイン、およびCX3Cサブファミリーケモカインからなる群より選択される、請求項94記載の方法。
  97. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーが反復投薬計画で投与される、請求項91〜93のいずれか一項記載の方法。
  98. ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項83記載の方法。
  99. オリゴヌクレオチドが、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗miR、ロックド核酸（LNA）をベースとするオリゴヌクレオチド、ダイサー基質、miRNA、aiRNA、shRNA、リボザイム、または核酸アプタマーである、請求項98記載の方法。
  100. 治療剤がタンパク質である、請求項82記載の方法。
  101. タンパク質が抗体またはペプチドアプタマーである、請求項100記載の方法。
  102. 抗体が一本鎖抗体である、請求項101記載の方法。
  103. 抗体が二重特異性抗体である、請求項101記載の方法。
  104. 治療剤がペプチドである、請求項102記載の方法。
  105. 治療剤が小分子である、請求項102記載の方法。
  106. 小分子が、抗チューブリン剤、DNA副溝結合剤、およびDNA複製阻害剤からなる群より選択される、請求項105記載の方法。
  107. 小分子が、アントラサイクリン、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシノイド、ビンカアルカロイド、および白金(II)化合物からなる群より選択される、請求項105記載の方法。
  108. 治療剤が、疾患に関連する遺伝子を破壊するかまたは修正する遺伝子編集システムの構成要素である、請求項80記載の方法。
  109. 遺伝子編集システムの構成要素が、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドである、請求項108記載の方法。
  110. ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)、および組換えメガヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項109記載の方法。
  111. ヌクレアーゼがCas9であり、脂質ナノ粒子が、標的細胞ゲノムにおける特定部位にヌクレアーゼを標的化させるガイドRNAをさらに含む、請求項110記載の方法。
  112. 脂質ナノ粒子が、相同組換えによって疾患関連遺伝子を修正するためのDNA供与体配列を含有するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項109〜111のいずれか一項記載の方法。
  113. 相同組換えによって疾患関連遺伝子を修正するためのDNA供与体配列を含有するポリヌクレオチドを含む有効量の第2の脂質ナノ粒子を対象に投与する工程をさらに含む、請求項109〜111のいずれか一項記載の方法。
  114. 治療剤が免疫原である、請求項80記載の方法。
  115. 治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子と、
    膜不安定化ポリマーと
    を含む、対象内の標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための組成物。
  116. (a)治療または診断剤を含む脂質ナノ粒子を含むキャリア組成物と、
    (b)膜不安定化ポリマーを含むエンハンサー組成物と
    を含む、対象内の標的細胞の細胞質ゾルに治療または診断剤を送達するための送達システム。
  117. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方が、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む、請求項115記載の組成物または請求項116記載の送達システム。
  118. 脂質ナノ粒子がカチオン性脂質を含む、請求項115〜117のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  119. カチオン性脂質が、
    N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、
    N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、
    1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DOEPC）、
    1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DLEPC）、
    1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（DMEPC）、
    1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（14:1）、
    N1-[2-((1S)-1-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4-[ジ(3-アミノプロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド）エチル]-3,4-ジ[オレイルオキシ]-ベンズアミド（MVL5）、
    ジオクタデシルアミド-グリシルスペルミン（DOGS）、
    3b-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール（DC-Chol）、
    ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、
    SAINT-2,N-メチル-4-(ジオレイル)メチルピリジニウム、
    1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、
    1,2-ジオレオイル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）、
    1,2-ジオレオイルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（DORI）、
    ジアルキル化アミノ酸（DILA2）、
    C18:1-norArg-C16、
    ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、
    1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（POEPC）、
    1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（MOEPC）、
    (R)-5-(ジメチルアミノ)ペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩（DODAPen-Cl）、
    (R)-5-グアニジノペンタン-1,2-ジイルジオレエート塩酸塩（DOPen-G）、
    (R)-N,N,N-トリメチル-4,5-ビス(オレオイルオキシ)ペンタン-1-アミニウムクロリド（DOTAPen）、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項118記載の組成物または送達システム。
  120. カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質である、請求項118記載の組成物または送達システム。
  121. イオン化可能なカチオン性脂質が、
    ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、
    1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、
    2,2-ジリノレイル-4-(2ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン（DLin-KC2-DMA）、
    ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート（DLin-MC3-DMA）、
    1,2-ジオレオイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DODAP）、
    1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DODMA）、
    モルホリノコレステロール（Mo-CHOL）、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項120記載の組成物または送達システム。
  122. 脂質ナノ粒子が、イオン化可能なアニオン性脂質を含む、請求項115〜119のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  123. イオン化可能なアニオン性脂質が、
    コレステリルヘミサクシネート(CHEMS)、
    ホスファチジルセリン、
    パルミトイルホモセリン、
    α-トコフェロールヘミサクシネート、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項122記載の組成物または送達システム。
  124. 脂質ナノ粒子がヘルパー脂質を含む、請求項115〜123のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  125. ヘルパー脂質が、
    コレステロール(CHOL)、
    1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、
    1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、
    1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、
    1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、
    1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DLPE)、
    1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、
    1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPHyPE）、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項124記載の組成物または送達システム。
  126. 脂質ナノ粒子がポリエチレングリコール-脂質コンジュゲート(PEG-脂質)を含む、請求項115〜125のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  127. PEG-脂質が、
    N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DMPE-PEG2,000)、
    N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE-PEG2,000)
    ポリエチレングリコール-ジミリストールグリセロール（PEG-DMG）、
    ポリエチレングリコール-ジステアロイルグリセロール（PEG-DSG）、
    またはN-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]}(C8 PEG2000セラミド)、または
    これらの2つ以上の組み合わせ
    である、請求項126記載の組成物または送達システム。
  128. 脂質ナノ粒子は、大きさが約200nmより小さい、請求項115〜127のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  129. 膜不安定化ポリマーが第1の標的化リガンドを含む、請求項117記載の組成物または送達システム。
  130. 脂質ナノ粒子が第1の標的化リガンドを含む、請求項117記載の組成物または送達システム。
  131. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの両方が第1の標的リガンドを含む、請求項117記載の組成物または送達システム。
  132. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの一方が第1の標的化リガンドを含み、かつ
    脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーのうちの他方が、第1の標的化リガンドとは異なる第2の標的化リガンドを含み、かつ(i)第1の標的化リガンドによって認識されるのと同じ細胞表面分子に特異的に結合するか、または(ii)標的細胞の表面の異なる細胞表面分子に特異的に結合する、
    請求項117記載の組成物または送達システム。
  133. 標的細胞が、分泌細胞、軟骨細胞、上皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液細胞、内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、または樹状細胞である、請求項115〜132のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  134. 標的細胞が、癌細胞、免疫細胞、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞、または異常な代謝活性を有する細胞である、請求項115〜132のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  135. 第1の標的化リガンドが、トランスフェリン受容体1型、トランスフェリン受容体2型、EGF受容体、HER2/Neu、VEGF受容体、PDGF受容体、インテグリン、NGF受容体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、葉酸受容体、およびシグマ受容体からなる群より選択される細胞表面分子に特異的に結合する、請求項117および129〜132のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  136. 第2の標的化リガンドが、トランスフェリン受容体1型、トランスフェリン受容体2型、EGF受容体、HER2/Neu、VEGF受容体、PDGF受容体、インテグリン、NGF受容体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、葉酸受容体、およびシグマ受容体からなる群より選択される細胞表面分子に特異的に結合する、請求項132記載の組成物または送達システム。
  137. 第1の標的化リガンドが小分子標的化部分を含む、請求項117および129〜132のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  138. 第2の標的化リガンドが小分子標的化部分を含む、請求項132記載の組成物または送達システム。
  139. 小分子標的化部分が、糖、ビタミン、ビスホスホネート、またはこれらのアナログである、請求項137または138記載の組成物または送達システム。
  140. 糖が、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン(NAG)、マンノース、およびマンノース-6-リン酸(M6P)より選択される、請求項139記載の組成物または送達システム。
  141. ビタミンが葉酸である、請求項139記載の組成物または送達システム。
  142. 第1の標的化リガンドがタンパク質である、請求項117および129〜132のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  143. 第2の標的化リガンドがタンパク質である、請求項132記載の組成物または送達システム。
  144. タンパク質が、抗体、ペプチドアプタマー、または細胞表面分子の天然リガンドに由来するタンパク質である、請求項142または143記載の組成物または送達システム。
  145. 第1の標的化リガンドがペプチドである、請求項117および129〜132のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  146. 第2の標的化リガンドがペプチドである、請求項132記載の組成物または送達システム。
  147. ペプチドが、インテグリン結合ペプチド、LOX-1結合ペプチド、および上皮成長因子(EGF)ペプチド、ニューロテンシンペプチド、NL4ペプチド、またはYIGSRラミニンペプチドである、請求項145または146記載の組成物または送達システム。
  148. 標的細胞が肝細胞である、請求項115〜132のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  149. 標的細胞が肝細胞である、請求項117および129〜132のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  150. 第1の標的化リガンドが、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合する、請求項149記載の組成物または送達システム。
  151. 第1の標的化リガンドがN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む、請求項150記載の組成物または送達システム。
  152. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの両方が第1の標的化リガンドを含む、請求項149〜151のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  153. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの一方が第1の標的化リガンドを含み、
    脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーのうちの他方が、第1の標的化リガンドとは異なる第2の標的化リガンドを含み、かつ(i)アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合するか、または(ii)肝細胞の表面の異なる細胞表面分子に特異的に結合する、
    請求項149〜151のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  154. 第2の標的化リガンドがN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む、請求項153記載の組成物または送達システム。
  155. 膜不安定化ポリマーが、コポリマー、合成ペプチド、膜不安定化毒素もしくはその誘導体、またはウイルス融合ペプチドもしくはその誘導体である、請求項115〜154のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  156. 膜不安定化ポリマーがpH感受性ポリマーである、請求項115〜154のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  157. pH感受性ポリマーがコポリマーである、請求項156記載の組成物または送達システム。
  158. コポリマーがブロックコポリマーである、請求項157記載の組成物または送達システム。
  159. ブロックコポリマーがジブロックコポリマーである、請求項158記載の組成物または送達システム。
  160. ブロックコポリマーが疎水性膜不安定化ブロックおよび親水性ブロックを含む、請求項159記載の組成物または送達システム。
  161. 親水性ブロックが疎水性ブロックに開裂可能に連結している、請求項160記載の組成物または送達システム。
  162. 親水性ブロックがジスルフィド結合またはpH感受性結合を通して疎水性ブロックに連結している、請求項161記載の組成物または送達システム。
  163. pH感受性結合が、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、イミン、オルトエステル、カーボネート、またはマレアミド酸である、請求項162記載の組成物または送達システム。
  164. 親水性ブロックにおいて疎水性モノマー残基よりも親水性モノマー残基が多くなるように、親水性ブロックが親水性モノマーおよび疎水性モノマーの両方から重合されている、請求項160記載の組成物または送達システム。
  165. 親水性ブロックが、ペンダント遮蔽部分に連結したモノマー残基を含む、請求項160または164記載の組成物または送達システム。
  166. 前記遮蔽部分がポリエチレングリコール(PEG)部分である、請求項165記載の組成物または送達システム。
  167. 前記遮蔽部分が親水性ブロックに開裂可能に連結している、請求項165または166記載の組成物または送達システム。
  168. 前記遮蔽部分がジスルフィド結合またはpH感受性結合を通して親水性ブロックに連結している、請求項167記載の組成物または送達システム。
  169. pH感受性結合が、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、イミン、オルトエステル、カーボネート、またはマレアミド酸である、請求項168記載の組成物または送達システム。
  170. pH感受性ポリマーが、カルボン酸官能基を有するモノマー残基を含む、請求項156記載の組成物または送達システム。
  171. pH感受性ポリマーが、アミン官能基を有するモノマー残基を含む、請求項156記載の組成物または送達システム。
  172. pH感受性ポリマーが、疎水性官能基を有するモノマー残基を含む、請求項156記載の組成物または送達システム。
  173. pH感受性ポリマーが、(C2-C8)アルキルアクリル酸の重合に由来するモノマー残基を含む、請求項156記載の組成物または送達システム。
  174. pH感受性ポリマーが、(C2-C8)アルキル-エタクリレート、(C2-C8)アルキル-メタクリレート、または(C2-C8)アルキル-アクリレートの重合に由来するモノマー残基を含む、請求項156記載の組成物または送達システム。
  175. pH感受性ポリマーが、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、または(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来するモノマー残基を含む、請求項156記載の組成物または送達システム。
  176. pH感受性ポリマーが、プロピルアクリル酸、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート、およびブチルメタクリレートの重合に由来するモノマー残基を有するランダムコポリマー鎖を含む、請求項156記載の組成物または送達システム。
  177. pH感受性ポリマーが、膜破壊ポリマーブロックとして前記ランダムコポリマー鎖を含み、1つまたは複数の追加のブロックをさらに含むブロックコポリマーである、請求項176記載の組成物または送達システム。
  178. pH感受性ポリマーが膜不安定化ペプチドに共有連結している、請求項156〜176のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  179. pH感受性ポリマーが複数のペンダント連結基を含み、複数の膜不安定化ペプチドが該複数のペンダント連結基を介して該pH感受性ポリマーに連結している、請求項156〜176のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  180. pH感受性膜不安定化ポリマーが、親水性ランダムコポリマーブロックおよび疎水性ランダムコポリマーブロックを有するジブロックコポリマーであり、
    該親水性ブロックは、親水性モノマー残基および疎水性モノマー残基の両方を含む両親媒性ブロックであり、親水性ブロック中の親水性モノマー残基の数は、疎水性モノマー残基の数よりも大きく；
    該疎水性ブロックは、疎水性モノマー残基および親水性モノマー残基の両方を含み、約7.4のpHで全体的に疎水的特性を有する両親媒性膜不安定化ブロックであり；かつ
    該親水性および疎水性ブロックの親水性モノマー残基のそれぞれは、独立して、約7.4のpHでイオン性であるモノマー残基、約7.4のpHで中性であるモノマー残基、および約7.4のpHで双性イオン性であるモノマー残基からなる群より選択される、
    請求項156記載の組成物または送達システム。
  181. 式Iのランダムブロックコポリマーであって：
    Figure 2018509387
    式中、
    A0、A1、A2、A3、A4およびA5は、それぞれ独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-、-O(C)b-、および-CR8-CR9からなる群より選択され；R1〜R6およびY0〜Y5では完全には置換されていないA0〜A5の4価の炭素原子は、適切な数の水素原子で満たされており；aおよびbは、それぞれ独立して、1〜4であり；R8およびR9は、それぞれ独立して、-C(O)OH、-C(O)Oアルキル、および-C(O)NR10からなる群より選択され、R8およびR9は、互いに共有連結して環構造を形成していてもよく；
    Y5は、水素であるかまたは、いずれも1つもしくは複数のフッ素原子で置換されていてもよい-(1C-10C)アルキル、-(3C-6C)シクロアルキル、-O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、-C(O)NR11(1C-10C)アルキル、および-(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
    Y0、Y3、およびY4は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-、-S(2C-10C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され；
    Y1およびY2は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-18C)アルキル-、-(3C-18C)分岐アルキル、-C(O)O(2C-18C)アルキル-、-C(O)O(2C-18C)分岐アルキル、-OC(O)(1C-18C)アルキル-、-OC(O)(1C-18C)分岐アルキル-、-O(2C-18C)アルキル-、-0(2C-18C)分岐アルキル-、-S(2C-18C)アルキル-、-S(2C-18C)分岐アルキル-、-C(O)NR12(2C-18C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-18C)分岐アルキル-からなる群より選択され、Y1またはY2の任意のアルキルまたは分岐アルキル基は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、およびR12は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    Q0は、生理的pHで親水性である残基；O-[(C)2-3-O]x-R7；およびO-[(C)2-3-O]x-C(O)-NR13R14からなる群より選択される残基であり；xは、1〜48であり；R7は、-CH3または-CO2Hであり；R13およびR14は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    Q1およびQ2は、それぞれ独立して、存在しないか、または通常の生理的pHで親水性である残基；コンジュゲート可能なまたは官能化可能な残基；通常の生理的pHで疎水性である残基；1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基；および1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい分枝アルキル基より選択され；
    Q3は、通常の生理的pHで正電荷を持つ残基であり；
    Q4は、通常の生理的pHで負電荷を持つが、より低いpHではプロトン化を受ける残基であり；
    mは、0より大きく1.0までのモル分率であり；
    nは、0〜1.0未満のモル分率であり；
    pは、0〜1.0未満のモル分率であり；m + n + p = 1であり；
    qは、0.1〜0.9のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.9のモル分率であり；
    sは、最大で0.85までのモル分率で存在し；q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；かつ
    wは、1〜50kDaである、
    前記ランダムブロックコポリマーを、pH感受性ポリマーが含む、請求項156記載の組成物または送達システム。
  182. mがn + pより大きい、請求項181記載の組成物または送達システム。
  183. pが0である、請求項182記載の組成物または送達システム。
  184. nが0より大きい、請求項181〜183のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  185. Y1およびQ1の少なくとも一方が、1つまたは複数のフッ素原子で置換されたアルキルまたは分枝アルキル基を含有する、請求項184記載の組成物または送達システム。
  186. pH感受性ポリマーが、式IIのポリマーであって：
    T1-L-[PEGMAm-PDSMAn-BPAMp]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w II
    式中、
    PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり；
    PDSMAは、ピリジルジスルフィドメタクリレート残基であり；
    BPAMは、2-[2-Bocアミノエトキシ]エチルメタクリレート残基であり；
    BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
    PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
    DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
    mは、0.6〜1のモル分率であり；
    nは、0〜0.4のモル分率であり；
    pは、0〜0.4のモル分率であり；
    m + n + p = 1であり；
    qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
    sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；
    wは、1〜25kDaであり；
    T1は、存在しないか、または第1の標的化リガンドであり；かつ
    Lは、存在しないか、または連結部分である、
    前記ポリマーである、請求項181記載の組成物または送達システム。
  187. pH感受性ポリマーが、式Vのポリマーであって：
    T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w V
    式中、
    PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり;
    M2は、
    (C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；
    (C4-C18)分枝アルキル-メタクリレート残基；
    コレステリルメタクリレート残基；
    1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；および
    1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
    からなる群より選択されるメタクリレート残基であり；
    BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
    PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
    DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
    mおよびnはそれぞれ0より大きいモル分率であり、mはnより大きく、m + n = 1であり；
    qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
    sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；
    wは、1〜25kDaであり；
    T1は、存在しないか、または第1の標的化リガンドであり；かつ
    Lは、存在しないか、または連結部分である、
    前記ポリマーである、請求項181記載の組成物または送達システム。
  188. M2が、
    2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基、
    2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基、
    1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基、
    2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基、
    2-エチルヘキシルメタクリレート残基、
    ブチルメタクリレート残基、
    ヘキシルメタクリレート残基、
    n-デシルメタクリレート残基、
    オクチルメタクリレート残基、
    ラウリルメタクリレート残基、
    ミリスチルメタクリレート残基、
    ステアリルメタクリレート残基、
    コレステリルメタクリレート残基、
    エチレングリコールフェニルエーテルメタクリレート残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，2-フェニルエチルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，2-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]エチルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，シクロヘキシルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，2-[ビス(1-メチルエチル)アミノ]エチルエステル残基、
    2-プロペン酸，2-メチル-，3-メチルブチルエステル残基、
    ネオペンチルメタクリレート残基、
    tert-ブチルメタクリレート残基、
    3,3,5-トリメチルシクロヘキシルメタクリレート残基、
    2-ヒドロキシプロピルメタクリレート残基、
    5-ノニルメタクリレート残基、
    2-ブチル-1-オクチルメタクリレート残基、
    2-ヘキシル-1-デシルメタクリレート残基、および
    2-(tert-ブチルアミノ)エチルメタクリレート残基
    からなる群より選択される、請求項187記載の組成物または送達システム。
  189. PEGMAが、エチレングリコール単位を4〜5個またはエチレングリコール単位を7〜8個有する、請求項186〜188のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  190. T1およびLが存在しており、T1がN-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む、請求項186〜189のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  191. Lが、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコール(PEG)部分を含む、請求項190記載の組成物または送達システム。
  192. 脂質ナノ粒子が治療剤を含む、請求項115〜191のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  193. 治療剤が、抗癌剤、抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗炎症剤、または細胞代謝活性を調節する薬剤である、請求項192記載の組成物または送達システム。
  194. 治療剤が、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子である、請求項192記載の組成物または送達システム。
  195. 治療剤がポリヌクレオチドである、請求項194記載の組成物または送達システム。
  196. 脂質ナノ粒子が脂質成分の混合物を含み、該脂質成分の混合物が、
    生理的pHで永続的に電荷を有し、該混合物中に約35モル％〜約55モル％存在する、カチオン性脂質と；
    イオン化可能なアニオン性脂質であって、該アニオン性脂質は存在しなくてもよく、存在する場合は該混合物中に約25モル％〜約40モル％存在する、イオン化可能なアニオン性脂質と；
    該イオン化可能なアニオン性脂質が存在しない場合、該混合物中に約40モル％〜約50モル％存在するヘルパー脂質であって、該イオン化可能なアニオン性脂質が存在する場合、該混合物中に約5モル％〜約20モル％存在する、ヘルパー脂質と；
    該混合物中に約2モル％〜約15モル％存在するPEG-脂質と
    を含む、請求項195記載の組成物または送達システム。
  197. カチオン性脂質がDOTAPであり；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり；
    ヘルパー脂質がCHOLであり；かつ/あるいは、
    PEG-脂質が、DSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2kである、
    請求項196記載の組成物または送達システム。
  198. イオン化可能なアニオン性脂質が存在せず、カチオン性脂質が約35モル％〜約45モル％存在し、PEG-脂質が約5モル％〜約15モル％存在する、請求項196または197記載の組成物または送達システム。
  199. イオン化可能なアニオン性脂質が存在し、カチオン性脂質が約40モル％〜約55モル％存在する、請求項196または197記載の組成物または送達システム。
  200. PEG-脂質が約5モル％〜約15モル％存在する、請求項199記載の組成物または送達システム。
  201. カチオン性脂質がDOTAPであり、ヘルパー脂質がCHOLであり、かつ
    イオン化可能なアニオン性脂質が存在せず、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約40:50:10であるか；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:16:2であるか；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10であるか；または
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10である
    請求項196記載の組成物または送達システム。
  202. 脂質ナノ粒子は、N:P比が約1〜約30である、請求項195記載の組成物または送達システム。
  203. ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項195〜202のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  204. mRNAが、タンパク質欠損症と関連する機能性タンパク質をコードする、請求項203記載の組成物または送達システム。
  205. mRNAが、アルファ-1-抗トリプシン(A1AT)、カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)、フマリルアセトアセターゼ(FAH)酵素、アラニン：グリオキシレート-アミノトランスフェラーゼ(AGT)、メチルマロニルCoAムターゼ(MUT)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファサブユニット(PCCA)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼベータサブユニット(PCCB)、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)のサブユニット、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、銅輸送ATPアーゼAtp7B、ビリルビンウリジンジホスフェートグルクロニルトランスフェラーゼ(BGT)酵素、ヘプシジン、グルコース-6-ホスファターゼ(G6Pase)、グルコース6-ホスフェートトランスロカーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼ(GB)、ニーマン・ピックC1タンパク質(NPC1)、ニーマン・ピックC2タンパク質(NPC2)、酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、第IX因子、ガラクトース-1-ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、トランスサイレチン、補体調節タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、ホモゲンチセート1,2-ジオキシゲナーゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、P型ATPアーゼタンパク質FIC-1、アルファ-ガラクトシダーゼA、酸性セラミダーゼ、酸性α-L-フコシダーゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、アルファ-L-イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、N-アセチルガラクトサミン-6-サルフェートスルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼB、ヘパラン-N-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル-CoA:α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-サルフェートスルファターゼ、アルファ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびβ-ヘキソサミニダーゼAからなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項204記載の組成物または送達システム。
  206. mRNAが分泌タンパク質をコードする、請求項203記載の組成物または送達システム。
  207. 分泌タンパク質が、ホルモン、サイトカイン、成長因子、凝固因子、抗プロテアーゼタンパク質、血管新生タンパク質、抗血管新生タンパク質、ケモカイン、および抗体からなる群より選択される、請求項206記載の組成物または送達システム。
  208. 分泌タンパク質が、エリスロポエチン、トロンボポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、レプチン、血小板由来成長因子B、ケラチノサイト成長因子、骨形成タンパク質2、骨形成タンパク質7、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1、ヒト成長ホルモン、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、リラキシン-2、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12、インターロイキン-18、インターロイキン21、CCサブファミリーケモカイン、CXCサブファミリーケモカイン、Cサブファミリーケモカイン、およびCX3Cサブファミリーケモカインからなる群より選択される、請求項206記載の組成物または送達システム。
  209. ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項195記載の組成物または送達システム。
  210. オリゴヌクレオチドが、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗miR、ロックド核酸(LNA)をベースとするオリゴヌクレオチド、ダイサー基質、miRNA、aiRNA、shRNA、リボザイム、または核酸アプタマーである、請求項209記載の組成物または送達システム。
  211. 治療剤がタンパク質である、請求項194記載の組成物または送達システム。
  212. タンパク質が抗体またはペプチドアプタマーである、請求項211記載の組成物または送達システム。
  213. 抗体が一本鎖抗体である、請求項212記載の組成物または送達システム。
  214. 抗体が二重特異性抗体である、請求項212記載の組成物または送達システム。
  215. 治療剤がペプチドである、請求項194記載の組成物または送達システム。
  216. 治療剤が小分子である、請求項194記載の組成物または送達システム。
  217. 小分子が、抗チューブリン剤、DNA副溝結合剤、およびDNA複製阻害剤からなる群より選択される、請求項216記載の組成物または送達システム。
  218. 小分子が、アントラサイクリン、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシノイド、ビンカアルカロイド、および白金(II)化合物からなる群より選択される、請求項216記載の組成物または送達システム。
  219. 治療剤が、疾患に関連する遺伝子を破壊するかまたは修正する遺伝子編集システムの構成要素である、請求項192記載の組成物または送達システム。
  220. 遺伝子編集システムの構成要素が、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドである、請求項219記載の組成物または送達システム。
  221. ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)、および組換えメガヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項220記載の組成物または送達システム。
  222. ヌクレアーゼがCas9であり、脂質ナノ粒子が、標的細胞ゲノムにおける特定部位にヌクレアーゼを標的化させるガイドRNAをさらに含む、請求項221記載の組成物または送達システム。
  223. 脂質ナノ粒子が、相同組換えによって疾患関連遺伝子を修正するためのDNA供与体配列を含有するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項220〜222のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  224. 相同組換えによって疾患関連遺伝子を修正するためのDNA供与体配列を含有するポリヌクレオチドを含む第2の脂質ナノ粒子をさらに含む、請求項220〜222のいずれか一項記載の組成物または送達システム。
  225. 治療剤が免疫原である、請求項192記載の組成物または送達システム。
  226. 式Iaのランダムブロックコポリマーであって：
    Figure 2018509387
    式中、
    A0、A1、A2、A3、A4およびA5は、それぞれ独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-、-O(C)b-、および-CR8-CR9からなる群より選択され；R1〜R6およびY0〜Y5では完全には置換されていないA0〜A5の4価の炭素原子は、適切な数の水素原子で満たされており；aおよびbは、それぞれ独立して、1〜4であり；R8およびR9は、それぞれ独立して、-C(O)OH、-C(O)Oアルキル、および-C(O)NR10からなる群より選択され、R8およびR9は、互いに共有連結して環構造を形成していてもよく；
    Y5は、水素であるかまたは、いずれも1つもしくは複数のフッ素原子で置換されていてもよい-(1C-10C)アルキル、-(3C-6C)シクロアルキル、-O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、-C(O)NR11(1C-10C)アルキル、および-(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
    Y0、Y3、およびY4は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-、-S(2C-10C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され；
    Y1およびY2は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-18C)アルキル、-(3C-18C)分岐アルキル、-C(O)O(2C-18C)アルキル-、-C(O)O(2C-18C)分岐アルキル、-OC(O)(1C-18C)アルキル-、-OC(O)(1C-18C)分岐アルキル-、-O(2C-18C)アルキル-、-0(2C-18C)分岐アルキル-、-S(2C-18C)アルキル-、-S(2C-18C)分岐アルキル-、-C(O)NR12(2C-18C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-18C)分岐アルキル-からなる群より選択され、Y1またはY2の任意のアルキルまたは分岐アルキル基は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、およびR12は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    Q0は、生理的pHで親水性である残基；O-[(C)2-3-O]x-R7；およびO-[(C)2-3-O]x-C(O)-NR13R14からなる群より選択される残基であり；xは、1〜48であり；R7は、-CH3または-CO2Hであり；R13およびR14は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    Q1およびQ2は、それぞれ独立して、存在しないか、または通常の生理的pHで親水性である残基；コンジュゲート可能なまたは官能化可能な残基；通常の生理的pHで疎水性である残基；1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基；および1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい分枝アルキル基より選択され；
    Q3は、通常の生理的pHで正電荷を持つ残基であり；
    Q4は、通常の生理的pHで負電荷を持つが、より低いpHではプロトン化を受ける残基であり；
    mは、0.5より大きく1.0より小さいモル分率であり；
    nは、0より大きく0.5より小さいモル分率であり；
    pは、0〜0.5未満のモル分率であり；m + n + p = 1であり；
    qは、0.1〜0.9のモル分率であり;
    rは、0.05〜0.9のモル分率であり;
    sは、最大で0.85までのモル分率で存在し；q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；
    wは、1〜50kDaであり；かつ
    Y1およびQ1の少なくとも一方は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されたアルキルまたは分枝アルキル基を含有する、
    前記ランダムブロックコポリマーを含む、pH感受性膜不安定化ポリマー。
  227. pが0である、請求項226記載のpH感受性ポリマー。
  228. R2-A1-Y1-Q1が一緒になって、
    2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基、
    2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基、
    1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基、および
    2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基
    からなる群より選択されるメタクリレート残基である、請求項226または227記載のpH感受性ポリマー。
  229. Y3が-C(O)OCH2CH2であり、Q3がジメチルアミノである、請求項226〜228のいずれか一項記載のpH感受性ポリマー。
  230. R4が-CH3である、請求項229記載のpH感受性ポリマー。
  231. Y4が共有結合であり、Q4がカルボキシル残基である、請求項226〜230のいずれか一項記載のpH感受性ポリマー。
  232. R5が-CH2CH2CH3である、請求項231記載のpH感受性ポリマー。
  233. Y5が-C(O)O(CH2)3CH3である、請求項226〜232のいずれか一項記載のpH感受性ポリマー。
  234. R6が-CH3である、請求項233記載のpH感受性ポリマー。
  235. Y0が-C(O)O(2C-10C)アルキル-であり、Q0がO-[(C)2-3-O]x-R7であり、xが1〜48であり、R7が-CH3である、請求項226〜234いずれか一項記載のpH感受性ポリマー。
  236. R1が-CH3である、請求項235記載のpH感受性ポリマー。
  237. 式Vaのポリマーであって：
    T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w Va
    式中、
    PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり；
    M2は、
    1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基、および
    1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
    からなる群より選択されるメタクリレート残基であり、
    BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
    PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
    DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
    mおよびnはそれぞれ0より大きいモル分率であり、mはnより大きく、m + n = 1であり；
    qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
    sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；
    wは、1〜25kDaであり；
    T1は、存在しないか、または第1の標的化リガンドであり；かつ
    Lは、存在しないか、または連結部分である、
    前記ポリマーである、請求項226記載のpH感受性ポリマー。
  238. M2が、
    2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基、
    2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基、
    1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基、および
    2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基
    からなる群より選択される、請求項237記載のpH感受性ポリマー。
  239. 式VのpH感受性膜不安定化ポリマーであって：
    T1-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w V
    式中、
    PEGMAは、エチレングリコール単位を2〜20個有するポリエチレングリコールメタクリレート残基であり；
    M2は、
    (C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；
    (C4-C18)分枝アルキル-メタクリレート残基；
    コレステリルメタクリレート残基；
    1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)アルキル-メタクリレート残基；および
    1つまたは複数のフッ素原子で置換された(C4-C18)分岐アルキル-メタクリレート残基
    からなる群より選択されるメタクリレート残基であり；
    BMAは、ブチルメタクリレート残基であり；
    PAAは、プロピルアクリル酸残基であり；
    DMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；
    mおよびnはそれぞれ0より大きいモル分率であり、mはnより大きく、m + n = 1であり；
    qは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.6のモル分率であり；
    sは、0.2〜0.75のモル分率であり；
    q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；
    wは、1〜25kDaであり；
    T1は、存在しないか、または第1の標的化リガンドであり；かつ
    Lは、存在しないか、または連結部分である、
    前記pH感受性膜不安定化ポリマー。
  240. M2が、
    2,2,3,3,4,4,4-ヘプタフルオロブチルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,6,6,6-オクタフルオロ-5(トリフルオロメチル)ヘキシルメタクリレート残基、
    2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-ペンタデカフルオロオクチル2-メチルアクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,6-ノナフルオロヘキシルメタクリレート残基、
    3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルメタクリレート残基、
    1,1,1-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシ-4-メチル-5-ペンチルメタクリレート残基、
    2-[(1',1',1'-トリフルオロ-2'-(トリフルオロメチル)-2'-ヒドロキシ)プロピル]-3-ノルボルニルメタクリレート残基、
    2-エチルヘキシルメタクリレート残基、
    ブチルメタクリレート残基、
    ヘキシルメタクリレート残基、
    オクチルメタクリレート残基、
    n-デシルメタクリレート残基、
    ラウリルメタクリレート残基、
    ミリスチルメタクリレート残基、
    ステアリルメタクリレート残基、
    コレステリルメタクリレート残基、
    エチレングリコールフェニルエーテルメタクリレート残基、
    2-プロペン酸,2-メチル-,2-フェニルエチルエステル残基、
    2-プロペン酸,2-メチル-,2-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]エチルエステル残基、
    2-プロペン酸,2-メチル-,2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチルエステル残基、
    2-プロペン酸,2-メチル-,シクロヘキシルエステル残基、
    2-プロペン酸,2-メチル-,2-[ビス(1-メチルエチル)アミノ]エチルエステル残基、
    2-プロペン酸,2-メチル-,3-メチルブチルエステル残基、
    ネオペンチルメタクリレート残基、
    tert-ブチルメタクリレート残基、
    3,3,5-トリメチルシクロヘキシルメタクリレート残基、
    2-ヒドロキシプロピルメタクリレート残基、
    5-ノニルメタクリレート残基、
    2-ブチル-1-オクチルメタクリレート残基、
    2-ヘキシル-1-デシルメタクリレート残基、および
    2-(tert-ブチルアミノ)エチルメタクリレート残基
    からなる群より選択される、請求項239記載のpH感受性ポリマー。
  241. (a)ポリヌクレオチドと、
    (b)脂質成分の混合物と
    を含む、脂質ナノ粒子であって、
    該脂質成分の混合物が、
    生理的pHで永続的に電荷を有し、該混合物中に約35モル％〜約55モル％存在する、カチオン性脂質と；
    イオン化可能なアニオン性脂質であって、該アニオン性脂質は存在しなくてもよく、存在する場合は該混合物中に約25モル％〜約40モル％存在する、イオン化可能なアニオン性脂質と；
    該イオン化可能なアニオン性脂質が存在しない場合、該混合物中に約40モル％〜約50モル％存在するヘルパー脂質であって、該イオン化可能なアニオン性脂質が存在する場合、該混合物中に約5モル％〜約20モル％存在するヘルパー脂質と；
    該混合物中に約5モル％〜約15モル％存在するPEG-脂質と
    を含む、前記脂質ナノ粒子。
  242. カチオン性脂質がDOTAPであり；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり；
    ヘルパー脂質がCHOLであり；かつ/あるいは、
    PEG-脂質がDSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2kである、
    請求項241記載の脂質ナノ粒子。
  243. イオン化可能なアニオン性脂質が存在せず、カチオン性脂質が約35モル％〜約45モル％存在する、請求項241または242記載の脂質ナノ粒子。
  244. イオン化可能なアニオン性脂質が存在し、カチオン性脂質が約40モル％〜約55モル％存在する、請求項241または242記載の脂質ナノ粒子。
  245. カチオン性脂質がDOTAPであり、ヘルパー脂質がCHOLであり、かつ
    イオン化可能なアニオン性脂質が存在せず、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約40:50:10であるか；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10であるか；または
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10である、
    請求項241記載の脂質ナノ粒子。
  246. ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項241〜245のいずれか一項記載の脂質ナノ粒子。
  247. 機能性タンパク質の欠損をもたらす遺伝的欠陥を特徴とする疾患を治療するための方法であって、
    該疾患を有する対象に、（a）該機能性タンパク質をコードするmRNAまたは該機能性タンパク質と同じ生物学的活性を有するタンパク質を含む有効量の脂質ナノ粒子と、（b）有効量の膜不安定化ポリマーとを投与する工程を含み、
    該mRNAが該疾患に関連する標的組織の標的細胞の細胞質ゾルに送達され、コードされたタンパク質が該標的組織内に産生されるようにタンパク質合成中に該mRNAが翻訳され、これにより該疾患を治療する、
    前記方法。
  248. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーの少なくとも一方が、標的組織の標的細胞の表面の分子に特異的に結合する第1の標的化リガンドを含む、請求項247記載の方法。
  249. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーが別々に投与される、請求項247または248記載の方法。
  250. 膜不安定化ポリマーが脂質ナノ粒子の投与後に投与される、請求項249記載の方法。
  251. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーが、単一組成物内で一緒に投与される、請求項247または248記載の方法。
  252. 脂質ナノ粒子が脂質成分の混合物を含み、該脂質成分の混合物が、
    生理的pHで永続的に電荷を有し、該混合物中に約35モル％〜約55モル％存在するカチオン性脂質と；
    イオン化可能なアニオン性脂質であって、該アニオン性脂質は存在しなくてもよく、存在する場合は該混合物中に約25モル％〜約40モル％存在する、イオン化可能なアニオン性脂質と；
    該イオン化可能なアニオン性脂質が存在しない場合、該混合物中に約40モル％〜約50モル％存在するヘルパー脂質であって、該イオン化可能なアニオン性脂質が存在する場合、該混合物中に約5モル％〜約20モル％存在するヘルパー脂質と；
    該混合物中に約2モル％〜約15モル％存在するPEG-脂質と
    を含む、
    請求項247〜251のいずれか一項記載の方法。
  253. カチオン性脂質がDOTAPであり；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり；
    ヘルパー脂質がCHOLであり；かつ/あるいは、
    PEG-脂質がDSPE-PEG2kまたはDMPE-PEG2kである、
    請求項252記載の方法。
  254. イオン化可能なアニオン性脂質が存在せず、カチオン性脂質が約35モル％〜約45モル％存在し、PEG-脂質が約5モル％〜約15モル％存在する、請求項252または253記載の方法。
  255. イオン化可能なアニオン性脂質が存在し、カチオン性脂質が約40モル％〜約55モル％存在する、請求項252または253記載の方法。
  256. PEG-脂質が約5モル％〜約15モル％存在する、請求項255記載の方法。
  257. カチオン性脂質がDOTAPであり、ヘルパー脂質がCHOLであり、かつ
    イオン化可能なアニオン性脂質が存在せず、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約40:50:10であるか；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:16:2であるか；
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDSPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DSPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10であるか；または
    イオン化可能なアニオン性脂質がCHEMSであり、PEG-脂質がDMPE-PEG2kであり、DOTAP:CHEMS:CHOL:DMPE-PEG2kのモル比が約50:32:8:10である、
    請求項252記載の方法。
  258. 膜不安定化ポリマーが、疎水性膜不安定化ブロックおよび親水性ブロックを含むpH感受性ブロックコポリマーである、請求項247〜257のいずれか一項記載の方法。
  259. 親水性ブロックにおいて疎水性モノマー残基よりも親水性モノマー残基が多くなるように、親水性ブロックが、親水性モノマーおよび疎水性モノマーの両方から重合されている、請求項258記載の方法。
  260. 膜不安定化ポリマーが、プロピルアクリル酸、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート、およびブチルメタクリレートの重合に由来するモノマー残基を有するランダムコポリマー鎖を含むpH感受性ポリマーである、請求項247〜257のいずれか一項記載の方法。
  261. pH感受性膜不安定化ポリマーが、親水性ランダムコポリマーブロックおよび疎水性ランダムコポリマーブロックを有するジブロックコポリマーであり、
    該親水性ブロックは、親水性モノマー残基および疎水性モノマー残基の両方を含む両親媒性ブロックであり、親水性ブロック中の親水性モノマー残基の数は、疎水性モノマー残基の数よりも大きく；
    該疎水性ブロックは、疎水性モノマー残基および親水性モノマー残基の両方を含み、約7.4のpHで全体的に疎水的特性を有する両親媒性膜不安定化ブロックであり；かつ
    該親水性および疎水性ブロックの親水性モノマー残基のそれぞれは、独立して、約7.4のpHでイオン性であるモノマー残基、約7.4のpHで中性であるモノマー残基、および約7.4のpHで双性イオン性であるモノマー残基からなる群より選択される、
    請求項247〜257のいずれか一項記載の方法。
  262. 式Iのランダムブロックコポリマーであって：
    Figure 2018509387
    式中、
    A0、A1、A2、A3、A4およびA5は、それぞれ独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-、-O(C)b-、および-CR8-CR9からなる群より選択され；R1〜R6およびY0〜Y5では完全には置換されていないA0〜A5の4価の炭素原子は、適切な数の水素原子で満たされており；aおよびbは、それぞれ独立して、1〜4であり；R8およびR9は、それぞれ独立して、-C(O)OH、-C(O)Oアルキル、および-C(O)NR10からなる群より選択され、R8およびR9は、互いに共有連結して環構造を形成していてもよく；
    Y5は、水素であるかまたは、いずれも1つもしくは複数のフッ素原子で置換されていてもよい-(1C-10C)アルキル、-(3C-6C)シクロアルキル、-O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、-C(O)NR11(1C-10C)アルキル、および-(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
    Y0、Y3、およびY4は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-、-S(2C-10C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され；
    Y1およびY2は、それぞれ独立して、共有結合、-(1C-18C)アルキル-、-(3C-18C)分岐アルキル、-C(O)O(2C-18C)アルキル-、-C(O)O(2C-18C)分岐アルキル、-OC(O)(1C-18C)アルキル-、-OC(O)(1C-18C)分岐アルキル-、-O(2C-18C)アルキル-、-0(2C-18C)分岐アルキル-、-S(2C-18C)アルキル-、-S(2C-18C)分岐アルキル-、-C(O)NR12(2C-18C)アルキル-、および-C(O)NR12(2C-18C)分岐アルキル-からなる群より選択され、Y1またはY2の任意のアルキルまたは分岐アルキル基は、1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、およびR12は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    Q0は、生理的pHで親水性である残基；O-[(C)2-3-O]x-R7；およびO-[(C)2-3-O]x-C(O)-NR13R14からなる群より選択される残基であり；xは、1〜48であり；R7は、-CH3または-CO2Hであり；R13およびR14は、それぞれ独立して、水素、-CNであるか、またはアルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれも1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよく；
    Q1およびQ2は、それぞれ独立して、存在しないか、または通常の生理的pHで親水性である残基；コンジュゲート可能なまたは官能化可能な残基；通常の生理的pHで疎水性である残基；1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基；および1つまたは複数のフッ素原子で置換されていてもよい分枝アルキル基より選択され；
    Q3は、通常の生理的pHで正電荷を持つ残基であり；
    Q4は、通常の生理的pHで負電荷を持つが、より低いpHではプロトン化を受ける残基であり；
    mは、0より大きく1.0までのモル分率であり；
    nは、0〜1.0未満のモル分率であり；
    pは、0〜1.0未満のモル分率であり；m + n + p = 1であり；
    qは、0.1〜0.9のモル分率であり；
    rは、0.05〜0.9のモル分率であり；
    sは、最大で0.85までのモル分率で存在し；q + r + s = 1であり；
    vは、1〜25kDaであり；かつ
    wは、1〜50kDaである、
    前記ランダムブロックコポリマーを、pH感受性ポリマーが含む、請求項261記載の方法。
  263. 前記疾患が、肝臓のタンパク質欠損症である、請求項247〜262のいずれか一項記載の方法。
  264. mRNAが、アルファ-1-抗トリプシン(A1AT)、カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)、フマリルアセトアセターゼ(FAH)酵素、アラニン:グリオキシル酸-アミノトランスフェラーゼ(AGT)、メチルマロニルCoAムターゼ(MUT)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファサブユニット(PCCA)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼベータサブユニット(PCCB)、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)のサブユニット、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、銅輸送ATPアーゼAtp7B、ビリルビンウリジンジホスフェートグルクロニルトランスフェラーゼ(BGT)酵素、ヘプシジン、グルコース-6-ホスファターゼ(G6Pase)、グルコース6-ホスフェートトランスロカーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼ(GB)、ニーマン・ピックC1タンパク質(NPC1)、ニーマン・ピックC2タンパク質(NPC2)、酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、第IX因子、ガラクトース-1-ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、トランスサイレチン、補体調節タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、ホモゲンチセート1,2-ジオキシゲナーゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、P型ATPアーゼタンパク質FIC-1、アルファ-ガラクトシダーゼA、酸性セラミダーゼ、酸性α-L-フコシダーゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、アルファ-L-イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、N-アセチルガラクトサミン-6-サルフェートスルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼB、ヘパラン-N-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル-CoA:α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-サルフェートスルファターゼ、アルファ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびβ-ヘキソサミニダーゼAから選択される機能性タンパク質をコードする、請求項263記載の方法。
  265. 肝臓のタンパク質欠乏性疾患が、尿素サイクル異常症である、請求項263記載の方法。
  266. 尿素サイクル異常症が、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症；カルバモイルホスフェートシンテターゼI(CPS1)欠損症；アルギニノコハク酸尿症(アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)欠損症)；およびシトルリン血症(アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)欠損症)からなる群より選択される、請求項265記載の方法。
  267. 尿素サイクル異常症が、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症であり、mRNAが、SEQ ID NO:1の残基35〜354と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む機能性OTCタンパク質をコードする、請求項265記載の方法。
  268. 尿素サイクル異常症が、アルギニノコハク酸尿症(アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)欠損症)であり、mRNAが、SEQ ID NO:48と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む機能性ASLタンパク質をコードする、請求項265記載の方法。
  269. 尿素サイクル異常症が、シトルリン血症（アルギニノコハク酸シンテターゼ（ASS1）欠損症）であり、mRNAが、SEQ ID NO:50と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む機能性ASS1タンパク質をコードする、請求項265記載の方法。
  270. 膜不安定化ポリマーおよび脂質ナノ粒子の少なくとも一方が、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に特異的に結合する標的化リガンドを含む、請求項263から266のいずれか一項記載の方法。
  271. ASGPR特異的標的化リガンドが、N-アセチルガラクトサミン(NAG)残基を含む、請求項270記載の方法。
  272. 脂質ナノ粒子および膜不安定化ポリマーが、反復投薬計画で投与される、請求項247〜271のいずれか一項記載の方法。
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