CN110448695B - 一种mRNA疫苗递送载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种mRNA疫苗递送载体，所述mRNA疫苗递送载体为类脂聚合物，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2‑环氧十二烷反应制得。本发明还提供了该mRNA疫苗递送载体的制备方法。本发明提供的mRNA疫苗递送载体特异性好、稳定性好、效率高、毒性低、安全有效。

Description

一种mRNA疫苗递送载体及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种mRNA疫苗递送载体及其制备方法。
背景技术
近年来，包括肿瘤疫苗在内的肿瘤免疫疗法在改变肿瘤治疗和肿瘤生物学的方面取得了突破。治疗性疫苗在治疗多种类型的肿瘤和传染病方面显示出巨大的潜力。在肿瘤疫苗的发展中，抗原通常以蛋白质多肽和DNA质粒的形式作为疫苗的主要组成部分被用作传统疫苗的开发；而今，基于mRNA(messenger RNA，信使RNA)形式的抗原的疫苗治疗方法也逐步得到应用，并成为常规疫苗策略的有力替代品。多肽抗原合成成本较高，耗时较长；而DNA 抗原表达效率不高，而且有造成基因突变的风险。而mRNA形式的抗原不仅可以在非分裂以及难以转染的细胞如树突状细胞中实现快速的蛋白质表达，并且其免疫原性可以通过化学修饰调节。由于以mRNA为基础的疫苗具有作用高效快速、安全性高以及制备成本较低等特点，因此与基于蛋白短肽和质粒DNA的疫苗相比具有更大的发展潜力与优势。目前，在许多基础研究和临床试验中，mRNA疫苗的细胞内递送已显示出可诱导编码抗原蛋白质合成和加工递呈并激活T细胞，从而发挥高效率的抗肿瘤免疫反应的作用。
在过去几年中，体外转录mRNA已成为用于递送遗传信息的潜在新型药物。无修饰及递送载体的裸露mRNA注射具有快速且成本低的特点，但由于mRNA自身带高负电荷、易降解、稳定性差等特点，mRNA的体内递送仍面临若干潜在挑战。目前主要的mRNA体内递送手段是利用鱼精蛋白或者纳米脂质体来提高mRNA的稳定性和刺激抗原的提呈。然而鱼精蛋白包裹mRNA还没有用于肿瘤疫苗，其用于治疗自身免疫疾病的产品目前正在临床试验；而纳米脂质体用于mRNA肿瘤疫苗体内递送需要淋巴结注射，对临床操作难度较高，其治疗效果也还有待临床试验的验证。因此，mRNA肿瘤疫苗的临床应用前景虽然光明，但是如何稳定安全的实现mRNA疫苗在体内的表达和激活免疫反应仍然是一个技术难题。
有效的mRNA肿瘤疫苗需要克服稳定性差、效率有限、毒性高和成本高等问题，实现mRNA的有效递送及编码抗原的高效表达，从而引起特异性的抗肿瘤免疫反应。作为一种全新的治疗方法，肿瘤纳米疫苗的一个优势是可以实现同时递送肿瘤抗原及免疫佐剂。随着纳米医学的发展，许多纳米工程制剂，包括基于聚合物的纳米材料和基于脂质体的纳米材料，已经设计用于在体内递送siRNA(small interfering RNA，小干扰RNA)或其他小寡核苷酸，但用于mRNA疫苗递送的材料还非常有限。由于mRNA的结构及自身物理化学特征，现有的纳米材料对于mRNA递送仍不够有效，以mRNA为基础的肿瘤疫苗的发展与临床应用仍面临许多问题。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够稳定性好、效率高、毒性低、安全有效的mRNA疫苗递送载体。
本发明的另一个目的是提供所述mRNA疫苗递送载体的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种mRNA疫苗。
本发明的另一个目的是提供所述mRNA疫苗的制备方法。
为此，本发明提供了一种mRNA疫苗递送载体，该mRNA疫苗递送载体为类脂聚合物，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物(poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers)与1,2- 环氧十二烷反应制得。
优选地，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。
本发明还提供了所述mRNA疫苗递送载体的制备方法，包括以下步骤：
将PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷分别以1：5的摩尔比混合，加入甲醇，油浴加热，反应温度为90℃，反应48h；反应结束后，旋蒸后得油状混合物，即为所述类脂聚合物。
本发明还提供了类脂聚合物作为mRNA疫苗递送载体的用途，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得。
优选地，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。
一种mRNA疫苗，该mRNA疫苗包括类脂聚合物、编码特定抗原的mRNA和稳定剂，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物(poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers)与1,2- 环氧十二烷反应制得。
优选地，所述类脂聚合物与mRNA的质量比为160：1，且所述类脂聚合物与稳定剂的质量比为5：1。
优选地，所述mRNA编码肿瘤抗原。
优选地，所述稳定剂包括但不限于二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)。
优选地，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得。
更优选地，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。
本发明还提供了所述mRNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将所述类脂聚合物溶于DMSO(二甲基亚砜)中，浓度为10mg/ml，加热至70℃待其完全溶解至透明澄清状态；
步骤2：依次加入所述类脂聚合物、所述mRNA和所述稳定剂，溶剂为DMSO，涡旋混匀；
步骤3：混匀后，将所述步骤2的混合物按DMSO与水为1:9的比例滴加相应体积的无菌水中，滴加完毕后涡旋混匀；
步骤4：静置10分钟，超滤去除DMSO，超滤时用无菌水进行洗涤，超滤后剩余液体即为所述mRNA疫苗。
优选地，所述超滤使用孔径为100kDa的超滤管进行。
优选地，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物(poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers)与1,2-环氧十二烷反应制得。
更优选地，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。
本发明针对mRNA肿瘤疫苗中mRNA递送效率低、蛋白表达低等问题，以激活免疫细胞的强度为指标，从15种以PAMAM枝状物为骨架并且在支链上做了特别修饰的类脂聚合物中筛选出一种类脂聚合物(代号为C1)作为mRNA疫苗递送载体；并且以这种类脂聚合物C1和表达肿瘤抗原的mRNA分子结合形成mRNA纳米肿瘤疫苗；这种疫苗在细胞和动物体内高效地表达抗原，并且可以激活免疫细胞表面受体来刺激抗肿瘤免疫反应，针对肿瘤特异性抗原诱导机体产生特异性免疫应答，从而达到杀伤肿瘤的作用。本发明通过研究证实 C1-mRNA纳米疫苗在体外实验中显示出高效的mRNA递送能力、mRNA编码抗原表达及激活T细胞的作用，并且可以通过TLR4介导的分子通路激活抗原提呈细胞，通过诱导特异性免疫应答有效抑制体内多种类型肿瘤的生长。
附图说明
图1是类脂聚合物C1的合成反应原理示意图。
图2是C1-mRNA纳米疫苗的理化表征示意图。
图3是基于T细胞激活实验的mRNA疫苗载体的体外筛选。
图4是C1-mRNA纳米疫苗在DC2.4细胞及原代细胞BMDCs中的递送效果验证结果。
图5是C1-mRNA纳米疫苗在体内的免疫刺激作用。
图6是C1-mRNA纳米疫苗在MC38-OVA肿瘤模型中的预防效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。
如未特别指出，以下所涉及的试剂均可通过商业途径购得。为简便起见，部分操作未详述操作的参数、步骤及所使用的仪器，应当理解，这些都是本领域技术人员所熟知并可重复再现的。
本发明使用的类脂聚合物C1是一种阳离子类脂聚合物，其在组合中为具有阳离子特性的类脂聚合物，与mRNA及稳定剂混合进行纳米沉淀时可以自组装形成纳米球将mRNA包裹在中间。类脂聚合物C1的合成的原料为聚乙二胺树枝状聚合物(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer，PAMAM树枝状聚合物；一种由乙二胺所合成高分子树枝状之聚合物)和1,2-环氧十二烷。类脂聚合物C1的制备步骤如下：将PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷分别以1：5的摩尔比称好(单次制备使用PAMAM树枝状聚合物1g，1,2-环氧十二烷6.928g)后置于圆底烧瓶中；将圆底烧瓶置于油浴中，量筒取10ml甲醇注入圆底烧瓶中；设置反应温度为90℃，反应48h(此过程为开环反应)；反应结束后，旋蒸后得油状混合物，即为类脂聚合物C1。所得到的C1为具有阳离子脂类物质的特征，为具有树枝状的聚合物分子。经鉴定，所得到的类脂聚合物C1为具有阳离子脂类物质的特征，为具有树枝状的聚合物分子。图1示出了类脂聚合物C1的合成反应原理。
本发明中的抗原编码mRNA是通过使用试剂盒体外转录所合成的。首先，建立一个可以方便快速的负载并稳定表达抗原表位的质粒载体。在mRNA抗原合成中，选择使用免疫实验中常用的抗原如卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)以及TRP2蛋白(小鼠黑色素瘤细胞B16中表达)作为编码抗原来进行实验。而在体外转录mRNA合成时，如果目的是合成编码蛋白的全长序列，则对转录的效率和稳定性要求比较高，而且不能用于表达多个不同蛋白来源的抗原表位。因此更好的策略是选择设计mRNA编码抗原短肽的部分序列进行表达，如OVA257-264(OVA蛋白257-264位的短肽含有可以被识别的抗原表位，是研究中常使用的抗原肽)和TRP2180-188，这两种抗原肽表位是已被证实的可以被MHC递呈，体外转录合成的mRNA分别命名为OVA mRNA和TRP2 mRNA。对mRNA的不同位点进行修饰，包括5’端修饰和3’端加上100多个多聚A以及使用接头序列和信号肽连接抗原表位，从而以增强体外转录的 mRNA的稳定性。所设计的抗原表位序列可以根据需要进行更换并且也可以同时放置多个来自不同肿瘤抗原的表位，因此适用于靶向单个或多个抗原的疫苗制作。
mRNA肿瘤疫苗的制备过程为：首先根据实验计算所用的纳米材料及mRNA的用量；将类脂聚合物C1(浓度为10mg/ml，溶剂为DMSO)，使用前加热至70℃待其完全溶解至透明澄清状态；按照质量比例(类脂聚合物C1：mRNA为160：1)，分别按顺序加入类脂聚合物 C1、mRNA和稳定剂DSPE-PEG2000(溶剂DMSO，类脂聚合物C1：DSPE-PEG2000为5： 1)；试剂添加结束后，使用振荡仪Vortex混匀；混匀后，将其按比例(DMSO:水＝1：9)加入相应体积无菌水中，注意要将无菌水一边使用Vortex涡旋一边将混合好的材料滴加到水中，待全部液体滴加完毕后使用Vortex将其完全混匀；彻底混匀后静置10min，使用孔径为100kDa 的超滤管进行超滤以去除有机试剂DMSO，超滤时使用无菌水进行洗涤纳米疫苗颗粒，超滤后剩余液体即为以C1为递送载体的mRNA肿瘤疫苗(C1-mRNA纳米疫苗)。
经鉴定，所制备的C1-mRNA纳米疫苗是一种阳离子类脂聚合物将mRNA包裹在中心形成纳米颗粒的形式。这种纳米颗粒的粒径约为150nm，并且在一定时间内(7天)对其进行监测发现其具有较好的稳定性。纳米颗粒形成后mRNA被阳离子类脂聚合物包裹在中央，从而保护mRNA不被核酸酶降解。而所使用的稳定剂DAPE-PEG2000可以使纳米粒更稳定，不易受生理环境的影响，从而延长循环时间，降低细胞对材料的吞噬，使其具备更好的生物兼容性。图2示出了C1-mRNA纳米疫苗的理化表征。所制备的纳米疫苗为粒径约150nm的颗粒 (图2A)。而纳米颗粒稳定性检测显示，在短时间内(7天)纳米颗粒PDI(聚合物分散性指数，Polydispersity index)维持在0.2左右，粒径也基本维持在150nm(图2B)；这说明我们的mRNA纳米疫苗具有较好的稳定性。我们为了了解所制备疫苗的携带电荷情况对C1-mRNA 纳米疫苗颗粒进行电荷检测，发现我们所制备的纳米疫苗颗粒是携带正电荷的分子(图2C)。图2 D示透射电子显微镜镜示C1-mRNA纳米疫苗颗粒的形态及大小。
将体外转录合成的OVA mRNA(编码OVA257-264的mRNA)使用15种不同生物材料作为递送载体制备得到OVA mRNA纳米疫苗。将这15种纳米疫苗和小鼠树突状细胞DC2.4共孵育，然后以此刺激B3Z细胞(OVA特异的T细胞，可以识别MHC递呈的OVA抗原表位并被激活) 分泌细胞因子IL-2。通过ELISA检测细胞因子IL-2的分泌量，图3结果显示，C1作为mRNA的递送载体显示出最高的T细胞激活程度，比其他14种不同比例和侧链的材料(A1-A3、B1-B3、 C2-C3、D1-D3、E1-E3)作为载体刺激了更高水平的细胞因子IL-2的分泌。该实验中使用OVA257-264蛋白短肽刺激DC2.4作为阳性对照。作为递送载体的15种不同生物材料的合成原料及其配比如以下表1所示：
表1.作为递送载体的15种不同生物材料的合成原料及其配比
材料代号 合成原料 摩尔比
A1 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧己烷 1:5
A2 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧己烷 1:7
A3 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧己烷 1:9
B1 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧辛烷 1:5
B2 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧辛烷 1:7
B3 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧辛烷 1:9
C1 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷 1:5
C2 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷 1:7
C3 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷 1:9
D1 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十四烷 1:5
D2 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十四烷 1:7
D3 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十四烷 1:9
E1 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十六烷 1:5
E2 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十六烷 1:7
E3 PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十六烷 1:9
图3中，A是体外抗原提呈实验示意图。编码抗原的mRNA被树突细胞摄取，翻译表达编码抗原并加工并提呈给T细胞，激活的T细胞分泌细胞因子IL-2。B则表示，ELISA结果显示，在体外抗原提呈实验中，分别使用15种配比和侧链的生物材料作为mRNA疫苗载体，其中类脂聚合物C1负载OVA mRNA时诱导T细胞激活分泌IL-2的水平最高。C则表示， ELISA结果显示，疫苗制备时C1与OVA mRNA的最佳质量比为160：1，细胞实验中OVA mRNA用量为40ng即可有效激活T细胞。
将体外转录合成的OVA mRNA(编码OVA257-264的mRNA)使用类脂聚合物C1作为递送载体制备得到OVA mRNA纳米疫苗。将以类脂聚合物C1为递送载体的疫苗与Lip2000(Lip2000即Lipfectamine 2000，生物实验常用的一种脂质体试剂用于核酸转染)负载OVAmRNA转染树突状细胞DC2.4，然后以此刺激B3Z细胞(T细胞，可以识别MHC递呈的OVA 抗原表位并被激活)分泌细胞因子IL-2。通过ELISA检测细胞因子IL-2的分泌量，如图4 所示，图4A结果显示C1作为mRNA的递送载体较脂质体lipofeactamine 2000显示出更高的 T细胞激活程度，具有更高水平的细胞因子IL-2的分泌，该实验中使用OVA257-264蛋白短肽刺激DC2.4作为阳性对照。
同样验证了类脂聚合物C1在原代细胞中的递送效率及mRNA编码蛋白合成效率。我们使用小鼠骨髓来源的树突状细胞进行实验验证。将分离诱导培养所得的骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)进行C1-OVA mRNA疫苗刺激后，再加入小鼠来源的OT-1细胞(来源于OT-1 转基因小鼠，可以特异性的识别OVA抗原)共培养，通过检测T细胞IL-2与IFN-γ的分泌情况来确定疫苗的效率。如图4所示，图4B结果显示，使用C1-OVA mRNA纳米疫苗刺激 BMDCs后，BMDCs可以合成编码抗原并将其进行处理并提呈抗原表位，激活OT-1细胞分泌IL-2和IFN-γ，类脂聚合物C1递送mRNA的效果明显优于Lipfectamine2000。
为了验证C1-OVA mRNA(编码OVA257-264)纳米疫苗在小鼠体内刺激抗原提呈并激活特异性T细胞的效果，通过动物实验对其作用进行验证。首先分为三组进行实验(对照组，OVA+Alum对照组，C1-OVA mRNA纳米疫苗组)，其中OVA+Alum组中Alum为目前临床中已经批准使用的免疫佐剂氢氧化铝，可以有效的提高机体对OVA蛋白的免疫效应。通过对小鼠腹股沟部进行皮下注射间隔7天共免疫2次，7天后分离小鼠的脾脏与引流部位淋巴结，并通过流式检测分析抗原特异性T细胞的比例(CD8+OVA-Tetramer+)，步骤如图5A所示。如图5所示，可以看到C1-OVA mRNA纳米疫苗免疫组小鼠引流部位淋巴结与小鼠脾脏的明显肿大(图5B)并且小鼠脾脏(图5C)与淋巴结(图5D)内抗原特异性T细胞的比例的明显升高。由此可见，本发明的C1-mRNA纳米疫苗可以激活抗原的提呈并促进抗原特异性T 细胞的激活。
随后，为了验证C1-mRNA纳米疫苗可以针对肿瘤特异性抗原发挥预防性抗肿瘤的效果，并且比传统的方法(Alum氢氧化铝佐剂在欧洲被批准作为疫苗佐剂在临床使用，Protamine 鱼精蛋白作为mRNA载体在进行临床试验)具有更好的效果，通过实验来验证其作为预防性肿瘤疫苗的作用。首先，使用构建的肠癌细胞MC38-OVA作为小鼠肿瘤模型来进行实验，疫苗接种及肿瘤细胞接种的流程如图6所示(图6A)。实验分组为：对照组，OVA+Alum组， Protamine-OVA mRNA组，C1-OVA mRNA组；Protamine已被证实的可以作为递送mRNA的载体，因此将其设置为对照组；OVA+Alum为实验中常用的免疫刺激。对小鼠腹股沟部进行皮下注射疫苗，间隔7天共免疫2次，疫苗免疫结束7天后进行肿瘤细胞接种(背部皮下接种MC38-OVA细胞，每只小鼠接种1×106个细胞)，观察肿瘤的生长。实验结果显示C1-OVA mRNA纳米疫苗作为预防性的肿瘤疫苗能够有效抑制肿瘤的生长(图6B和图6C)，而 OVA+Alum组和Protamine-OVA mRNA组并没有显示很好的肿瘤抑制效果。图6所示为各组中每只小鼠的肿瘤生长曲线。因此，在MC38-OVA小鼠肿瘤模型中，C1-OVA mRNA作为预防性的肿瘤疫苗可以有效的抑制肿瘤的生长。

Claims (7)

1.类脂聚合物用于制备mRNA疫苗递送载体的用途，其特征在于，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得；所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。
2.一种mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括mRNA疫苗递送载体、编码特定抗原的mRNA和稳定剂，所述mRNA疫苗递送载体为类脂聚合物，所述类脂聚合物由PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷反应制得，所述PAMAM树枝状聚合物与1,2-环氧十二烷的摩尔比为1:5。
3.根据权利要求2所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述类脂聚合物与mRNA的质量比为160：1，且所述类脂聚合物与稳定剂的质量比为5：1。
4.根据权利要求2所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述稳定剂是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
5.根据权利要求2所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA编码肿瘤抗原。
6.根据权利要求2至5任一项所述的mRNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将所述类脂聚合物溶于DMSO中，浓度为10 mg/ml，加热至70℃待其完全溶解至透明澄清状态；
步骤2：依次加入所述类脂聚合物、所述mRNA和所述稳定剂，溶剂为DMSO，涡旋混匀；
步骤3：混匀后，将所述步骤2的混合物按DMSO与水为1:9的体积比滴加到相应体积的无菌水中，滴加完毕后涡旋混匀；
步骤4：静置10分钟，超滤去除DMSO，超滤时用无菌水进行洗涤，超滤后剩余液体即为所述mRNA疫苗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述超滤使用孔径为100kDa的超滤管进行。
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