KR101591927B1 - 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 외부에서 환자의 암에 대한 정보(암 항원 정보)를 제공하지 않아도 다양한 암에 대한 항암효과를 극대화할 수 있는 항암면역치료 효과가 우수한 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 수지상세포의 톨유사 수용체를 자극하여 다양한 사이토카인을 분비하고 성숙을 유도하는 면역보조제 또는 아쥬번트로서 이미퀴모드(R837)와 같은 면역활성물질과 수지상세포 내에서 면역반응을 억제하는 STAT3, SOCS1 유전자의 발현을 저해시키는 짧은 간섭 RNA를 동시에 수지상세포에 전달함으로써, 기존의 항암면역치료제보다 암 치료 효과를 8배 이상 높이고 다양한 암과 질병 치료에 두루 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물{COMPOSITIONS OF POLYMER NANOPARTICLES CANCER VACCINE}
본 발명은 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 외부에서 환자의 암에 대한 정보(암 항원 정보)를 제공하지 않아도 다양한 암에 대한 항암효과를 극대화할 수 있는 항암면역치료 효과가 우수한 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물에 관한 것이다.
지난 수십 년간 의학과 생명공학의 눈부신 발전에도 불구하고 암은 여전히 정복하기 어려운 질환 중의 하나로 남아있다. 특히, 암은 우리나라 사망원인의 1위를 차지하고 있고 고령화 사회로 접어들면서 암환자 수는 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 최근에는 암환자 면역세포의 면역력을 증강시켜 암세포를 치료하는 항암면역치료제가 차세대 항암치료제로 각광받고 있다.
항암면역치료는 환자 자신의 면역세포를 이용하기 때문에 화학적 약물 및 방사선 치료로 인한 부작용과 항암치료에 대한 거부반응이 적어, 환자의 신체적 부담을 최소화하는 새로운 암 치료법이다. 그러나, 암세포는 면역세포의 면역력을 억제하거나 차단하여 스스로를 지키려는 특성이 있어 기존의 항암면역치료제는 암환자 면역세포의 면역력을 극대화하는데 한계가 있었다.
대표적인 항원제시세포 중 하나인 수지상세포는 암세포 속에서 암 항원을 인식한 후 2차 면역기관으로 이동해 암세포를 공격하는 T세포에 암 항원 정보를 전달하고, 신호를 받은 T세포는 암세포 조직으로 이동하여 암세포의 증식을 억제한다. 따라서, 항암면역치료에 있어 항암면역세포의 효능을 높이기 위해서는 수지상세포의 면역반응을 활성화하는 것이 무엇보다 중요하다. 면역세포 기반 암 백신의 주요 목표는 골수에서 유도된 APC에 항원 또는 면역유도물질을 전달하는 것이다.
수지상세포에 의한 면역력을 증가시키기 위해 우수한 면역반응을 유발하는 물질과의 조합이 필요하며, 이러한 물질이 아쥬번트(adjuvant)이다. 현재까지 알루미늄 기반 광물염이 아쥬번트 소재로 가장 많이 이용되고 있으나, 알루미늄 기반 광물염은 안정성이 높은 반면 면역유도와 세포매개 면역에 대해 아쥬번트 기능이 약하다는 단점이 있다. 또한, 알루미늄은 알레르기와 관련되는 면역글로블린 E를 유도할 수 있다고 알려져 있다. 따라서, 면역세포 즉, 수지상세포에 안정적으로 작용하고 뛰어난 면역유도 기능을 수행하기 위한 아쥬번트 소재로 패턴인식 수용체를 인식할 수 있는 물질에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다.
패턴인식 수용체 중에서도 가장 보편적으로 잘 알려진 것은 톨유사 수용체(toll-like receptor)이다. 톨유사 수용체는 인간에게서 13개, 쥐에게서 12개가 밝혀져 있으며, 종류에 따라 세포막 표면과 세포내 격실에 존재하고 인식하는 항원이 각각 다른 것으로 알려져 있다. 그 중 톨유사 수용체7의 리간드로 작용하는 이미퀴모드(imiquimod, R837)는 우수한 면역활성물질로서 항바이러스 또는 항암 효과를 갖고 실제 임상에서 피부암과 생식기 사마귀 치료제로서 널리 사용되고 있다.
또한, 암세포 속의 수지상세포는 활성화를 억제하는 분자(signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1)) 등에 의해 활성화가 억제되어 면역반응의 활성화를 높이기 위해서는 면역억제 유전자의 발현을 저해하는 것이 필요하다. 스탯쓰리와 에스오씨에스원은 수지상세포가 활성화됨에 따라 그 발현량이 함께 증가되므로 이러한 면역억제 유전자의 발현을 저해하기 위한 방법으로 RNA 간섭(RNA interference) 방법이 이용되고 있다. 그 중 짧은 간섭 RNA는 특정 단백질의 생산을 효과적으로 억제함으로써 유전자의 발현을 저해하기 때문에 면역억제 유전자의 발현을 감소시켜 수지상세포의 면역반응을 활성화할 수 있다.
스탯쓰리의 경우 면역세포의 활성과정 중 반드시 필요한 단백질인 엔에프카파비(NF-ｋB)의 발현을 억제하여 그 기능을 못하게 함으로써 최종적으로 전체적인 면역활성 능력을 감소시키고, 에스오씨에스원의 경우 사이토카인 신호를 받아들이는 수용체를 조절하는 잭(JAK) 단백질의 인산화를 억제함으로써 면역활성 능력을 감소시킨다.
관련 선행기술로 대한민국 등록특허 0585456호 (동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 암 치료용 백신 조성물), 대한민국 등록특허 0783585호 (스탯의 활성을 저해하는 옥사다이아졸 우레아 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료제), PCT 공개특허 WO2009-048958호 (키토산 나노입자를 함유하는 조성물) 등이 있지만, 고분자 나노입자를 기반으로 면역활성물질과 siRNA를 동시에 수지상세포에 전달하여 항암면역치료제로 이용하는 기술적 특징에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명의 목적은 항암면역세포의 효능을 높이기 위해 수지상세포의 면역반응을 활성화하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물을 제공함으로써, 외부에서 환자의 암에 대한 정보(암 항원 정보)를 수지상세포에 전달해 주는 과정이 필요하여 암 항원이 알려진 몇몇 암 치료에 국한되었던 기존 항암면역세포치료법을 개선함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톨유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)와 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 고분자 물질로 캡슐화(encapsulation)한 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물을 제공한다.
상기 톨유사 수용체 리간드의 톨유사 수용체(TLR)는 티엘알1, 티엘알2, 티엘알3, 티엘알4, 티엘알5, 티엘알6, 티엘알7, 티엘알8, 티엘알9, 티엘알10 또는 티엘알11인 것을 특징으로 한다.
상기 짧은 간섭 RNA(siRNA)는 스탯쓰리(STAT3, signal transducer and activator of transcription 3) 또는 에스오씨에스원(SOCS1, suppressor of cytokine signaling 1) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
상기 고분자 물질은 키토산(chitosan), 폴리-에틸렌이민(poly-ethylenimine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리-디알릴디메틸염화암모늄(poly-diallyldimethyl ammonium chloride), 폴리-알릴아민(poly-allylamine), 염산염(hydrochloride), 폴리-오르니틴(poly-ornithine), 폴리-비닐아민염산염(poly-vinylamine hydrochloride), 폴리-2-디메틸아미노에틸메탈크릴레이트(poly-2-dimethylamino ethyl methacrylate), 폴리-아미도아마인(poly-amido amine), 덴드리머(dendrimer), 폴리-알기닌(poly-arginine) 및 젤라틴(gelatin)을 포함하는 군에서 선택되는 1종의 고분자 물질과 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycol acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-카프로락톤(poly-caprolactone), 폴리-발레로락톤(poly-valerolacton), 폴리-하이드록시 부티레이트(poly-hydroxy butyrate), 폴리-하이드록시 발러레이트(poly-hydroxy valerate), 덱스트란(dextran), 폴리-포스파젠(poly-phosphazen) 및 폴리-아미노에스터(poly-amino ester)를 포함하는 군에서 선택되는 1종의 고분자 물질로 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물은 나노입자의 직경이 50 내지 5000 nm인 것을 특징으로 한다.
상기 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물을 사용하는 방법은 먼저 생체 밖에서 암 백신 조성물을 수지상세포에 처리한 다음, 성숙된 수지상세포를 생체 내에 주입하는 방법으로 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (1) 인산기(-)를 갖는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA)와 양이온성(+) 특성을 갖는 고분자 물질을 혼합하여 복합체를 형성하고; (2) 상기 복합체를 증류수에 용해시켜 혼합수용액을 제조하고; (3) 고분자 물질과 톨유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)를 유기용매에 용해시켜 유기용액을 제조하고; (4) 상기 (3)단계에서 제조한 유기용액에 상기 (2)단계에서 제조한 혼합수용액을 섞어 초음파를 이용하여 분산시키고; (5) PVA(polyvinyl alcohol)용액에 적하시키면서 초음파를 이용하여 분산시킨 후, 6 내지 24 시간 동안 교반하여 유기용매를 제거하고; 및 (6) 원심분리한 후, 상층액은 버리고 증류수를 첨가하여 초음파로 재분산시키는 과정을 2회 이상 반복하는; 단계를 포함하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 (1)단계에서 짧은 간섭 RNA와 고분자 물질은 전하비 1 : 2 내지 1 : 500을 갖도록 혼합하는 것을 특징으로 한다.
상기 (1)단계에서 고분자 물질은 키토산(chitosan), 폴리-에틸렌이민(poly-ethylenimine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리-디알릴디메틸염화암모늄(poly-diallyldimethyl ammonium chloride), 폴리-알릴아민(poly-allylamine), 염산염(hydrochloride), 폴리-오르니틴(poly-ornithine), 폴리-비닐아민염산염(poly-vinylamine hydrochloride), 폴리-2-디메틸아미노에틸메탈크릴레이트(poly-2-dimethylamino ethyl methacrylate), 폴리-아미도아마인(poly-amido amine), 덴드리머(dendrimer), 폴리-알기닌(poly-arginine) 또는 젤라틴(gelatin)인 것을 특징으로 한다.
상기 (3)단계에서 고분자 물질과 톨유사 수용체 리간드는 1 : 1 내지 1000 : 1의 중량비로 유기용매에 용해시키는 것을 특징으로 한다.
상기 (3)단계에서 고분자 물질은 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycol acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-카프로락톤(poly-caprolactone), 폴리-발레로락톤(poly-valerolacton), 폴리-하이드록시 부티레이트(poly-hydroxy butyrate), 폴리-하이드록시 발러레이트(poly-hydroxy valerate), 덱스트란(dextran), 폴리-포스파젠(poly-phosphazen) 또는 폴리-아미노에스터(poly-amino ester)인 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 수지상세포의 톨유사 수용체를 자극하여 다양한 사이토카인을 분비하고 성숙을 유도하는 면역보조제 또는 아쥬번트로서 이미퀴모드(R837)와 같은 면역활성물질과 수지상세포 내에서 면역반응을 억제하는 STAT3, SOCS1 유전자의 발현을 저해시키는 짧은 간섭 RNA를 동시에 수지상세포에 전달함으로써, 기존의 항암면역치료제보다 암 치료 효과를 8배 이상 높이고 항원이 알려진 암이나 질병에만 쓰이던 기존의 항암면역세포치료법의 한계를 극복하여 다양한 암과 질병 치료에 두루 활용할 수 있는 효과가 있다.
또한, 외부를 생체친화성 고분자 물질로 포장하여 면역활성물질과 짧은 간섭 RNA를 봉입함으로써, 면역세포 활성화 분자를 암 세포 주위의 면역세포에 효과적으로 전달하여 항암면역치료 효능이 향상되는 효과가 있다.
도 1은 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 개요도.
도 2는 PLGA 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 구상도.
도 3은 4종류의 PLGA 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 전자주사현미경 이미지 및 ICG가 봉입된 나노입자의 근적외선 형광 이미지.
도 4는 수지상세포에서 24시간(A)과 48시간(B) 동안 PLGA 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 siRNA 효율성을 나타낸 그래프.
도 5는 R837이 봉입된 PLGA 나노입자 기반의 암 백신 조성물에 의한 수지상세포의 활성(A:24시간, B:48시간) 및 성숙(C) 유도를 관찰한 그래프.
도 6은 성숙된 수지상세포의 림프절로의 이동을 근적외선 형광을 통해 추적한 결과.
도 7은 마우스에 수지상세포를 주입하고 7일 후에 비장에서 세포독성 T 세포를 분리하여 암세포의 살해능을 측정한 결과.
도 8은 치료용 수지상세포에 의한 종양 형성 억제를 확인한 결과.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 톨유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)와 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 고분자 물질로 캡슐화(encapsulation)한 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물을 제공한다.
상기 톨유사 수용체 리간드의 톨유사 수용체(TLR)는 티엘알1, 티엘알2, 티엘알3, 티엘알4, 티엘알5, 티엘알6, 티엘알7, 티엘알8, 티엘알9, 티엘알10 또는 티엘알11인 것이 바람직하며, 톨유사 수용체7의 리간드로 작용하는 이미퀴모드(imiquimod, R837)가 톨유사 수용체 리간드로 사용될 수 있다.
상기 짧은 간섭 RNA(siRNA)는 스탯쓰리(STAT3, signal transducer and activator of transcription 3) 또는 에스오씨에스원(SOCS1, suppressor of cytokine signaling 1) 유전자의 발현을 억제하는 것이 바람직하다.
상기 고분자 물질은 짧은 간섭 RNA와 복합체를 이루는 양이온성(+) 특성을 갖는 키토산(chitosan), 폴리-에틸렌이민(poly-ethylenimine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리-디알릴디메틸염화암모늄(poly-diallyldimethyl ammonium chloride), 폴리-알릴아민(poly-allylamine), 염산염(hydrochloride), 폴리-오르니틴(poly-ornithine), 폴리-비닐아민염산염(poly-vinylamine hydrochloride), 폴리-2-디메틸아미노에틸메탈크릴레이트(poly-2-dimethylamino ethyl methacrylate), 폴리-아미도아마인(poly-amido amine), 덴드리머(dendrimer), 폴리-알기닌(poly-arginine) 및 젤라틴(gelatin)을 포함하는 군에서 선택되는 1종의 고분자 물질과 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycol acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-카프로락톤(poly-caprolactone), 폴리-발레로락톤(poly-valerolacton), 폴리-하이드록시 부티레이트(poly-hydroxy butyrate), 폴리-하이드록시 발러레이트(poly-hydroxy valerate), 덱스트란(dextran), 폴리-포스파젠(poly-phosphazen) 및 폴리-아미노에스터(poly-amino ester)를 포함하는 군에서 선택되는 1종의 고분자 물질로 이루어진 것이 바람직하다.
상기 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물은 나노입자의 직경이 50 내지 5000 nm이다.
상기 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물을 사용하는 방법은 먼저 생체 밖에서 암 백신 조성물을 수지상세포에 처리한 다음, 성숙된 수지상세포를 생체 내에 주입하는 수지상세포 치료법을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 암 백신 조성물을 직접 종양세포 내로 주입하여 종양 주변의 면역세포를 활성시키는 방법으로도 사용이 가능하다. 생체 밖에서 수지상세포의 활성을 증가시키고 성숙된 수지상세포를 생체 내에 주입하는 방법은 암 백신 조성물을 직접 생체 내에 주입하는 방법에 비하여 독성시험 및 안전성 면에서 우수하며, 가장 큰 장점은 자가면역세포를 활용하기 때문에 부작용이 없고 전이암이나 치료 후 남은 잔류암의 치료에도 효과적이라는 것이다.
또한, 본 발명은 (1) 인산기(-)를 갖는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA)와 양이온성(+) 특성을 갖는 고분자 물질을 혼합하여 복합체를 형성하고; (2) 상기 복합체를 증류수에 용해시켜 혼합수용액을 제조하고; (3) 고분자 물질과 톨유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)를 유기용매에 용해시켜 유기용액을 제조하고; (4) 상기 (3)단계에서 제조한 유기용액에 상기 (2)단계에서 제조한 혼합수용액을 섞어 초음파를 이용하여 30 내지 90초간 분산시키고; (5) PVA(polyvinyl alcohol)용액에 적하시키면서 초음파를 이용하여 1 내지 3 분간 분산시킨 후, 6 내지 24 시간, 바람직하게는 6 내지 12 시간 동안 교반하여 유기용매를 제거하고; 및 (6) 15 내지 25 분간 원심분리한 후, 상층액은 버리고 증류수를 첨가하여 초음파로 재분산시키는 과정을 2회 이상, 바람직하게는 2 내지 10회 반복하는; 단계를 포함하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 (1)단계에서 짧은 간섭 RNA와 고분자 물질은 전하비 1 : 2 내지 1 : 500, 바람직하게는 1 : 2 내지 1 : 100을 갖도록 혼합하는 것이 바람직하다. 짧은 간섭 RNA는 음이온성 친수성 성질을 가진 저분자량 물질이기 때문에 (3)단계 공정에서 사용되는 친유성 고분자 물질의 입자 내로 로딩(loading)되는 양을 극대화하기 위해서는 혼합하는 양이온성 고분자의 양이 전하비로 적어도 1 : 2 이상이 되어야 하며, 활용 분야에 따라 적은 양의 짧은 간섭 RNA만으로도 충분한 경우 1 : 100까지 희석하여 사용하는 것이 최적의 효과를 나타낸다.
상기 (1)단계에서 고분자 물질은 키토산(chitosan), 폴리-에틸렌이민(poly-ethylenimine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리-디알릴디메틸염화암모늄(poly-diallyldimethyl ammonium chloride), 폴리-알릴아민(poly-allylamine), 염산염(hydrochloride), 폴리-오르니틴(poly-ornithine), 폴리-비닐아민염산염(poly-vinylamine hydrochloride), 폴리-2-디메틸아미노에틸메탈크릴레이트(poly-2-dimethylamino ethyl methacrylate), 폴리-아미도아마인(poly-amido amine), 덴드리머(dendrimer), 폴리-알기닌(poly-arginine) 또는 젤라틴(gelatin)인 것이 바람직하다.
상기 (3)단계에서 고분자 물질과 톨유사 수용체 리간드는 1 : 1 내지 1000 : 1, 바람직하게는 400 : 1 내지 700 : 1의 중량비로 유기용매에 용해시키는 것이 바람직하다. 톨유사 수용체 리간드는 대부분이 강한 면역유도 효과를 나타내며, (3)단계에서 사용되는 고분자 물질은 이러한 톨유사 수용체 리간드와 (1)단계에서 제조한 짧은 간섭 RNA를 포함하는 고분자 물질을 동시에 캡슐화해야 하기 때문에, 고분자 물질과 톨유사 수용체 리간드는 중량비로 약 400 : 1에서 700 : 1의 중량비로 혼합하는 것이 최적의 효과를 나타낸다.
상기 (3)단계에서 고분자 물질은 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycol acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-카프로락톤(poly-caprolactone), 폴리-발레로락톤(poly-valerolacton), 폴리-하이드록시 부티레이트(poly-hydroxy butyrate), 폴리-하이드록시 발러레이트(poly-hydroxy valerate), 덱스트란(dextran), 폴리-포스파젠(poly-phosphazen) 또는 폴리-아미노에스터(poly-amino ester)인 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. PLGA/OVA/ICG 나노입자의 제조.
PLGA(poly lactide-co-glycolide) 60mg을 클로로폼(chloroform) 2ml에 용해시켜 PLGA 유기용액을 제조하고, 난백알부민(Ovalbumin, OVA) 2mg 및 인도시아닌그린(Indocyanine green, ICG) 0.5mg을 3차 증류수 300μl에 순차적으로 용해시켜 혼합수용액을 제조하였다. 상기 PLGA 유기용액에 상기 혼합수용액을 섞어 초음파(750W, 20kHz)를 이용하여 1분 동안 분산시킨 다음, 상기 혼합수용액이 분산된 PLGA 유기용액을 2.5%-폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA) 용액 10ml에 천천히 적하시켜 주면서 초음파(750W, 20kHz)를 이용하여 2분 동안 분산시킨 후, 밤새 교반하여 클로로폼 용매를 제거하였다.
그 후, 13000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 PLGA/OVA/ICG 나노입자를 수득하였다. 상층액은 버리고 증류수를 첨가시켜 초음파로 재분산시킨 뒤 다시 원심분리하는 과정을 3번 반복한 다음, 상기 PLGA/OVA/ICG 나노입자를 동결건조하여 4℃에서 보관하였다.
실시예 2. PLGA/STAT3 siRNA 나노입자의 제조.
인산기(-)를 갖는 STAT3 siRNA와 아민기(+)를 갖는 PLL(poly-L-lysine)을 전하비 1:2 비율로 섞어 STAT3 siRNA와 PLL 복합체를 형성하였다. PLGA 60mg을 클로로폼 2ml에 용해시켜 PLGA 유기용액을 제조하고, STAT3 siRNA와 PLL을 3차 증류수 300μl에 용해시켜 혼합수용액을 제조하였다. 상기 PLGA 유기용액에 상기 혼합수용액을 섞어 초음파(750W, 20kHz)를 이용하여 1분 동안 분산시킨 다음, 상기 혼합수용액이 분산된 PLGA 유기용액을 2.5%-PVA용액 10ml에 천천히 적하시켜 주면서 초음파(750W, 20kHz)를 이용하여 2분 동안 분산시키고 밤새 교반하여 클로로폼 용매를 제거하였다.
그 후, 13000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 PLGA/STAT3 siRNA 나노입자를 수득하였다. 상층액은 버리고 증류수를 첨가시켜 초음파로 재분산시킨 뒤 다시 원심분리하는 과정을 3번 반복한 다음, 상기 PLGA/STAT3 siRNA 나노입자를 동결건조하여 4℃에서 보관하였다.
실시예 3. PLGA/R837 나노입자의 제조.
PLGA 60mg과 R837 0.1mg을 클로로폼 2ml에 용해시켜 PLGA/R837 유기용액을 제조하고, 2.5%-PVA용액 10ml에 천천히 적하시켜 주면서 초음파(750W, 20kHz)를 이용하여 2분 동안 분산시킨 후, 밤새 교반하여 클로로폼 용매를 제거하였다.
그 후, 13000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 PLGA/R837 나노입자를 수득하였다. 상층액은 버리고 증류수를 첨가시켜 초음파로 재분산시킨 뒤 다시 원심분리하는 과정을 3번 반복한 다음, 상기 PLGA/R837 나노입자를 동결건조하여 4℃에서 보관하였다.
실시예 4. PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자의 제조.
인산기(-)를 갖는 STAT3 siRNA와 아민기(+)를 갖는 PLL을 전하비 1:2 비율로 섞어 STAT3 siRNA와 PLL 복합체를 형성하였다. PLGA 60mg과 R837 0.1mg을 클로로폼 2ml에 용해시켜 PLGA/R837 유기용액을 제조하고, STAT3 siRNA와 PLL 복합체를 3차 증류수 300μl에 용해시켜 혼합수용액을 제조하였다. 상기 PLGA/R837 유기용액에 상기 혼합수용액을 섞어 초음파(750W, 20kHz)를 이용하여 1분 동안 분산시킨 다음, 상기 혼합수용액이 분산된 PLGA 유기용액을 2.5%-PVA 용액 10ml에 천천히 적하시켜 주면서 초음파(750W, 20kHz)를 이용하여 2분 동안 분산시킨 후, 밤새 교반하여 클로로폼 용매를 제거하였다.
그 후, 13000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자를 수득하였다. 상층액은 버리고 증류수를 첨가시켜 초음파로 재분산시킨 뒤 다시 원심분리하는 과정을 3번 반복한 다음, 상기 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자를 동결건조하여 4℃에서 보관하였다.
실험예 1. 겔 상에서의 siRNA 방출 실험.
실시예 2에서 제조된 PLGA/STAT3 siRNA 나노입자와 실시예 4에서 제조된 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자를 제조하기 위해 인산기(-)를 갖는 STAT3 siRNA와 아민기(+)를 갖는 PLL을 다양한 전하비율로 섞어 STAT3 siRNA와 PLL 복합체를 형성한 뒤, 겔 상에서 siRNA가 방출되지 않고 완전한 복합체를 형성하는 비율을 확인하였다.
실험 결과, STAT3 siRNA와 PLL을 전하비 1:2 비율로 섞었을 경우 siRNA가 방출되지 않았다.
실험예 2. 나노입자의 광학특성 비교.
나노크기를 갖는 PLGA/OVA/ICG 나노입자의 광학 특성을 비교하기 위하여 실시예 4에서 제조된 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자와 피비에스(Phosphate buffered saline, PBS)에서 광학 특성을 측정하였다.
실시예 1에서 제조된 PLGA/OVA/ICG 나노입자 1mg과 실시예 4에서 제조된 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자 1mg을 각각 PBS에 분산시킨 뒤, 자체 제작된 근적외선 영상 측정장치를 이용하여 근적외선 영상을 확인하였다.
실험예 3. 나노입자의 세포 내로 흡수.
PLGA/OVA/ICG 나노입자와 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자를 각각 OVA 50μg, STAT3 siRNA 500nM 농도로 처리하여 수지상세포에서의 나노입자 흡수 실험을 진행하였다. 세포의 핵을 염색하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 용액을 사용하였고 파란색 형광을 방출하였다.
STAT3 siRNA의 5'가닥에 플루오레세인이소티오시안산염(Fluorescein isothiocyanate, FITC)을 붙여 세포 내에서의 녹색 형광을 확인하였고 ICG를 통해 세포 내에서의 붉은 형광을 확인하였다. 이것으로 PLGA/OVA/ICG 나노입자와 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자가 수지상세포 내로 흡수된 것을 확인하였다.
실험예 4. 전자현미경을 통한 나노입자의 확인.
최종 수득된 PLGA/OVA/ICG, PLGA/STAT3 siRNA, PLGA/R837, PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관찰한 결과, 모든 입자직경이 100nm ~ 200nm인 것을 확인하였다.
실험예 5. siRNA의 효율성 확인.
PLGA/STAT3 siRNA와 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자의 siRNA 효율을 알아보고자 수지상세포에 24시간 또는 48시간 동안 처리한 후 세포를 수확하여 세포 내에서의 STAT3 유전자 발현양을 중합효소 연쇄 반응을 통해 확인하였다.
48시간에서 두 종류의 나노입자 모두 아무것도 처리하지 않은 실험군에 비해 50% 가량 유전자의 발현율이 감소함을 알 수 있었다.
실험예 6. 수지상세포의 활성 확인.
24시간 또는 48시간 동안 나노입자를 수지상세포에 처리한 후 배양 배지 내에 분비된 여러 종류의 사이토카인을 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 측정하였다.
R837이 봉입된 나노입자를 0.5μg/ml부터 4μg/ml까지 다양한 농도로 처리하였을 때, 그 농도에 비례하여 사이토카인(TNF-α, IL-12p70)의 양이 점차 증가되는 것을 확인하였으며, PLGA/STAT siRNA 나노입자의 경우 아무것도 처리하지 않는 실험군과 마찬가지로 사이토카인이 생성되지 않았다.
실험예 7. 수지상세포의 성숙 확인.
24시간 동안 세 종류의 나노입자를 수지상세포에 처리한 후 세포를 수확하여 세포 표면에 발현되어 있는 다양한 표지(CD40, CD80, CD86, CD54)를 특정 항체를 통해 확인하였다.
R837이 봉입된 나노입자를 2μg/ml의 농도로 처리하였을 때, R837에 의한 수지상세포의 성숙이 관찰되었으며, PLGA/R837 나노입자와 PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자 간의 비교를 통해 STAT3 siRNA에 의한 효과는 없는 것으로 확인되었다.
실험예 8. 성숙된 수지상세포의 림프절로의 이동.
PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자가 처리된 실험군과 처리되지 않은 실험군의 성숙 여부에 따른 림프절로의 이동을 근적외선 영상을 통해 확인하였다. 나노입자가 처리된 수지상 세포(2 × 106cells/50μl)를 C57BL/6 마우스의 발바닥에 주입한 뒤, 24시간과 48시간에서 그 형광 세기를 관찰하였다.
PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자가 처리된 수지상세포의 경우, R837에 의한 성숙이 이루어져 림프절로의 이동이 크게 증가된 반면, 미성숙 수지상세포의 경우, 림프절로의 이동이 거의 일어나지 않았다. 48시간 후에 오금에 위치한 림프절을 떼어내어 근적외선 형광을 관찰한 결과 성숙된 수지상세포를 주입한 실험군에서만 형광 세기가 관찰되었다.
실험예 9. 살해 면역세포 기능 측정.
다양한 실험군의 나노입자가 48시간 동안 처리된 수지상세포(2 × 106cells/50μl)를 C57BL/6 마우스에 복강 주사한 뒤, 일주일 후 수지상세포 치료에 의해 유도된 종양 특이 살해세포의 활성을 관찰하였다.
효과기세포(Effecter cell)인 T 세포가 종양 특이 표적인 EG7-OVA 세포(Target cell)를 죽이는 정도를 측정하기 위해 카세인으로 표지된 표적세포(5 × 103cells/100μl)와 효과기세포를 다양한 농도로 섞어 4시간 동안 같이 기른 후, 원심분리를 통해 상등액을 취하였다. 사멸된 표적세포에서 새어 나온 상등액 중의 카세인을 형광을 통해 측정하여 세포 살해능을 확인하였다. PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자가 처리된 실험군에서 가장 강력한 살해능이 관찰되었으며 E : T = 40 : 1에서 50% 이상의 효과가 확인되었다.
실험예 10. 치료용 수지상세포 주입 및 종양 세포 이식.
치료용 수지상세포(1 × 106cells/100μl)는 5주령 C57BL/6 마우스에 복강을 통해 주입하여 예방 접종을 진행하였다. 1 주일 후, 종양 특이 표적인 EG7-OVA 세포를 복강에 주입하여 3일 간격으로 종양의 크기를 관찰하였다.
그 결과, PLGA/R837/STAT3 siRNA 나노입자가 처리된 실험군에서 다른 대조군에 비해 가장 뛰어난 종양 억제 효과가 관찰되었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 톨유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)와 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 하나의 고분자 물질로 모두 포함시켜 캡슐화(encapsulation)하였으며,
    상기 톨유사 수용체 리간드는 티엘알7(TLR7)에 대한 리간드인 이미퀴모드(imiquimod)이고,
    상기 짧은 간섭 RNA(siRNA)는 스탯쓰리(STAT3, signal transducer and activator of transcription 3) 또는 에스오씨에스원(SOCS1, suppressor of cytokine signaling 1) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 하나의 고분자 물질은 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycol acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic acid-co-glycol acid) 및 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic acid-co-glycol acid)을 포함하는 군에서 선택되는 1종의 고분자 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물은 나노입자의 직경이 50 내지 5000 nm인 것을 특징으로 하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물을 사용하는 방법은 먼저 생체 밖에서 암 백신 조성물을 수지상세포에 처리한 다음, 성숙된 수지상세포를 생체 내에 주입하는 방법으로 사용하는 것을 특징으로 하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물.
  7. (1) 인산기(-)를 갖는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA)와 양이온성(+) 특성을 갖는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)을 혼합하여 복합체를 형성하되,
    상기 짧은 간섭 RNA(siRNA)는 스탯쓰리(STAT3, signal transducer and activator of transcription 3) 또는 에스오씨에스원(SOCS1, suppressor of cytokine signaling 1) 유전자의 발현을 억제하는 것이고;
    (2) 상기 복합체를 증류수에 용해시켜 혼합수용액을 제조하고;
    (3) 고분자 물질과 톨유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)를 유기용매에 용해시켜 유기용액을 제조하되,
    상기 톨유사 수용체 리간드는 티엘알7(TLR7)에 대한 리간드인 이미퀴모드(imiquimod)이고;
    (4) 상기 (3)단계에서 제조한 유기용액에 상기 (2)단계에서 제조한 혼합수용액을 섞어 초음파를 이용하여 분산시키고;
    (5) PVA(polyvinyl alcohol)용액에 적하시키면서 초음파를 이용하여 분산시킨 후, 6 내지 24 시간 동안 교반하여 유기용매를 제거하고;
    (6) 원심분리한 후, 상층액은 버리고 증류수를 첨가하여 초음파로 재분산시키는 과정을 2회 이상 반복하는; 단계를 포함하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 (1)단계에서 짧은 간섭 RNA와 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)은 전하비 1 : 2 내지 1 : 500을 갖도록 혼합하는 것을 특징으로 하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 (3)단계에서 고분자 물질과 톨유사 수용체 리간드는 1 : 1 내지 1000 : 1의 중량비로 유기용매에 용해시키는 것을 특징으로 하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 제조방법.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 (3)단계에서 고분자 물질은 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycol acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic acid-co-glycol acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic acid-co-glycol acid) 및 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic acid-co-glycol acid)을 포함하는 군에서 선택되는 1종의 고분자 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물의 제조방법.
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