KR20170054262A - Socs가 억제된 면역억제능이 향상된 줄기세포 및 그의 이용 - Google Patents

Socs가 억제된 면역억제능이 향상된 줄기세포 및 그의 이용 Download PDF

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KR20170054262A
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이명우
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Abstract

본 발명은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성이 억제된, 면역 억제능을 갖는 줄기세포 및 상기 줄기세포를 포함하는 면역 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 줄기세포의 면역억제 활성 유도용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제는 줄기세포의 면역억제능을 향상시킬 수 있으며, 상기 면역 억제능이 향상된 줄기세포는 자가면역 질환, 장기이식 거부반응, 또는 알러지 질환 등에서 효과적인 세포치료제로서 활용될 수 있다.

Description

SOCS가 억제된 면역억제능이 향상된 줄기세포 및 그의 이용 {SOCS suppressed stem cell with increased immunosuppression and use thereof}
본 발명은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성이 억제된, 면역 억제능을 갖는 줄기세포 및 상기 줄기세포를 포함하는 면역 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 줄기세포의 면역억제 활성 유도용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제를 통하여 줄기세포의 면역억제능 활성을 유도하는 방법에 관한 것이다.
장기, 조직 또는 세포 이식은 다양한 종류의 질병을 앓고 있는 환자의 생명을 구하는 데 이용될 수 있다. 인간의 신장, 간, 심장, 신장, 폐 및 췌장 등의 장기와 피부 등의 조직, 골수 등 세포 동종이식 (allotransplantation)은 말기 장기 부전 등 난치성 질환을 치료하는 방법으로 병원에서 이미 일반적으로 시행되고 있다. 또한, 인간 이외의 포유동물을 공여자로 하는 이종이식 (xenotransplantation)도 동종이식 공여자 부족을 대체하는 방법으로 활발히 연구되고 있는 실정이다. 특히, 최근에는 자기 자신을 영구히 재생할 수 있고, 적절한 조건에서 신체를 구성하는 다양한 종류의 세포로 분화 가능한 줄기세포의 이식이 다양한 난치성 질환의 세포 대체 치료법의 하나로 대두되고 있다.
일반적으로 정상기능을 하는 수혜자의 면역체계는 이식된 장기, 조직이나 세포를 "비자기(non-self)"로 인식하여 이식편(graft)에 대해 면역거부반응을 유발한다. 이러한 면역거부반응은 공여자 조직의 동종항원(alloantigens) 또는 이종항원(xenoantigens)을 인식하는 수혜자의 면역시스템에 존재하는 동종반응성(alloreactive) 또는 이종반응성(xenoreactive) T 세포에 의해 일반적으로 매개된다. 따라서, 동종 또는 이종이식편이 장기간 생존하기 위해서는 외부 항원을 인지하는 수혜자의 면역체계를 피하거나 면역 반응을 억제할 수 있어야 한다. 이식편에 대한 수혜자의 면역 반응을 피하기 위해서 일반적으로 수혜자에게 면역억제제를 투여하게 된다. 싸이클로스포린(cyclosporin) 및 타크롤리무스(tacrolimus, FK-506) 등과 같은 칼시네우린(calcineurin) 억제제나 아자티오프린(azathioprine), 라파마이신(rapamycin), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 및 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide) 등과 같은 항증식성 약제(antiproliferative drug) 등이 대표적인 면역억제제들로 현재 동종 신장, 간, 췌장, 심장 이식 등에 빈번하게 사용되고 있다.
이들 면역억제제는 하루 기준으로 투여하여야 하며, 만일 투여를 중단할 경우 통상적으로 면역거부반응이 초래된다. 따라서, 장기간에 걸쳐 투여해야 하는데, 이로 인해 신장이나 간독성, 고혈압 등을 유발할 수 있다. 뿐만 아니라, 이들 약물은 이식편의 동종항원에만 반응하는 면역세포에만 선택적으로 작용하는 특이적 면역억제제가 아니므로 비특이적 면역억제에 따른 기회감염이나 림포마와 같은 종양형성 등의 부작용을 유발할 수있다. 또 다른 면역억제 방법으로 OKT3, 다클리주맵(Daclizumab) 또는 바실릭시맵(Basiliximab) 등의 단클론 항체를 투여하는 방법이 있는데 이들 역시 비특이적인 면역억제제로 기회감염이나 종양 형성의 문제점을 지니고 있다. 따라서, 약물독성이나 기회감염 등의 문제점이 없는 새로운 면역억제법의 개발이 요구된다.
한편, 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 다양한 조직에서 유래될 수 있으며, 세포 기반 이식 또는 재생 의약 치료에 있어서 강력한 후보자이다.
손상된 조직으로의 이동, 면역억제기능, 자가-재생, 및 다분화능과 같은 MSCs의 특징은 이의 치료적 적용의 가능성을 연다. 현재, MSCs의 주입, 또는 이식을 포함하는 500 여개의 임상이 clinicaltrials.gov에 등록되어 있다. 또한, 이중 약 20%가 MSC의 면역억제능과 관련된다. MSCs의 면역억제 특성이 밝혀졌으며, 대부분의 임상 1상은 생물학적 안정성 문제를 나타내지 않음에도 불구하고, 그 이상의 임상단계에서는 미비한 결과가 도출되고 있다.
더욱이, MSC의 표준화를 위한 배양 방법 또는 프로토콜이 부재하여, 동일한 수여자의 동일한 조직에서 분리한 MSCs의 경우에도 표현형적, 및 기능적 다양성이 관찰되고 있다. 따라서 특정 조건을 부여하여 MSC의 기능을 촉진 또는 억제하는 방법이 필요하다.
이에 본 발명자들은 줄기세포의 면역억제능을 향상시킬 수 있는 방안을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 줄기세포에서 SOCS의 발현을 억제하는 것이 줄기세포의 면역억제능을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 일 양상은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성이 억제된, 면역 억제능을 갖는 줄기세포 및 상기 줄기세포를 포함하는 면역 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 줄기세포의 면역억제 활성 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제를 통하여 줄기세포의 면역억제능 활성을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양상은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성이 억제된, 면역 억제능을 갖는 줄기세포를 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, SOCS (suppressor of cytokine signaling) 단백질은 사이토카인(cytokine) 신호전달의 음성적 피드백 조절인자(negative feedback regulator) 그룹에 속하며, 자누스 키나아제/신호 전달인자(Janus kinase/signal transducer) 및 전사 (JAK/STAT) 경로의 활성인자(activator)들을 포함하고 있는 것으로 알려져있다. 또한, 최근 보고된 자료에 의하면, SOCS 단백질들은 인슐린 수용체(insulin receptor, IR), EGFR 및 KIT를 포함하는 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase, RTK) 신호전달의 음성 조절인자로 작용할 수 있다는 내용이 보고되었다.
상기 SOCS는 그 종류에 제한이 없으며, 예를 들어, CISH(Cytokine-inducible SH2-containing protein), SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6 및 SOCS7일 수 있다. 또한, 가장 바람직하게는 SOCS1 또는 SOCS3일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "줄기세포"는, 다양한 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서, 이는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류될 수 있다.
본 발명에서 줄기세포는 그 유래 또는 유형에 따라, 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 종양줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)이다. 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막, 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아, 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 중간엽 줄기세포의 면역억제능을 증가시키기 위하여, SOCS의 발현을 억제하기 위한 siRNA 및 shRNA를 이용하여 SOCS1 또는 SOCS3가 하향조절된 MSC를 제조하였다. 이후 SOCS가 하향조절된 MSC가 in vitro에서 T-세포의 증식을 억제할 뿐만 아니라, in vivo 이식편대숙주병 동물모델에서도 면역을 억제하여 생존율을 증가시킴을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명은 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 줄기세포의 면역억제 활성 유도용 조성물을 제공한다.
상기 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 억제제는 SOCS (suppressor of cytokine signaling)를 코딩하는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), PNA(peptide nucleic acids), DNAzyme 또는 리보자임(ribozyme)일 수 있다.
또한, 상기 SOCS의 활성 억제제는 SOCS에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머, 항체, 또는 SOCS의 길항제 기타 SOCS 억제활성을 나타내는 추출물, 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성이 억제된 면역 억제능을 갖는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 억제용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 체액성 거부반응, 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.
상기 자가면역질환은 그 종류에 제한은 없으나, 크론병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염일 수 있다.
또한, 상기 알러지성 질환은 과민성(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 소양증, 곤충 알러지, 식품 알러지 또는 약품 알러지일 수 있다.
상기 유효성분은 상기 줄기세포를 포함하는 줄기세포 배양액, 상기 배양물의 농축물 등을 포함하는 개념이다.
상기 조성물이 면역 억제용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 면역 억제용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 면역 억제용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 100-100,000,000 (102-108) cell/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단회 또는 필요시 추가 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 줄기세포에 SOCS (suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 면역억제능 활성을 유도하는 방법을 제공한다.
상기 SOCS (suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성을 억제하는 것은, SOCS의 발현 또는 활성 억제제에 의할 수 있으며, 그의 정의는 상기와 같다.
또한, 상기 줄기세포에는 인터페론 감마(IFN-γ)를 추가로 처리할 수 있다.
상기와 같이, 세포 배양시 인터페론 감마를 처리하는 경우, 상기 줄기세포는 HLA-DRA (major histocompatibility complex, class Ⅱ, DR alpha chain), CD274(B7H1, B7 homolog 1), IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), ICAM2 (intercellular adhesion molecule 2), CCL8 (chemokine (C-C motif) ligand 8), CXCL9 (chemokine (C-X-C motif) ligand 9) 또는 CXCL10 (chemokine (C-X-C motif) ligand 10)의 발현이 증가될 수 있다.
또한, 상기 줄기세포는 고밀도 배양될 수 있으며, 이때 고밀도 배양은 5,000 내지 20,000 cells/cm2의 밀도로 배양하는 것일 수 있다.
상기와 같이, 줄기세포를 고밀도 배양하는 경우, 상기 줄기세포는 PTGDS (Prostaglandin D2 synthase), PTGES (Prostaglandin E synthase), VCAM1 (vascular cell adhesion protein 1), CXCR7 (chemokine (C-X-C motif) receptor type 7), 또는 ULBP1 (UL16 Binding Protein 1)의 발현이 증가될 수 있다.
상기 IFN-γ 처리 및 고밀도 배양은 SOCS 발현 또는 활성 억제제 처리 전 또는 후일 수 있다. 또한, 상기 IFN-γ 처리 역시 고밀도 배양 전 또는 후, 또는 고밀도 배양 중일 수 있다.
또한, 상기 IFN-γ의 처리는 체내 이식 직전 또는 하루, 이틀 전에 처리될 수 있다.
본 발명에 따른 SOCS(suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제는 줄기세포의 면역억제능을 향상시킬 수 있다. 따라서, 상기 면역 억제능이 향상된 줄기세포는 자가면역 질환, 장기이식 거부반응, 또는 알러지 질환에서 효과적인 세포치료제로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 SOCS가 하향 조절된 MSC(중간엽줄기세포)의 면역억제능 특성을 in vitro에서 확인한 결과이다.
도 2는, SOCS를 타겟으로 하는 shRNA를 MSC에 처리하여 SOCS 단백질 발현이 억제된 것을 확인한 적색형광염색(A) 및 웨스턴 블랏팅(B) 결과이다.
도 3은, SOCS가 하향 조절된 MSC의 면역억제능 특성을 in vivo 이식편대숙주병 동물모델에서 확인한 결과이다.
도 4는 IFN-γ 처리한 MSC에서의 SOCS 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 SOCS 하향 조절된 MSC와, 여기에 IFN-γ를 더욱 처리한 MSC간의 면역억제능을 in vivo 이식편대숙주병(GVHD) 동물모델에서 비교평가한 결과이다.
도 6은 MSC를 고밀도 배양한 경우 면역억제 마커 유전자 PTGES의 발현증가를 확인한 결과이다.
도 7은 MSC를 고밀도 배양한 경우 면역억제 마커 유전자 CXCR7의 발현증가를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 방법
1-1. 인간 조직유래 중간엽줄기세포의 분리 및 배양
본 실험은 삼성의료원의 연구 심사위원회(Institutional Review Board; IRB)의 승인(IRB No. 2011-10-134)을 받았으며, 모든 샘플은 사전 동의를 얻어 수집하였다. 중간엽 줄기세포의 분리는 종래 알려진 방법으로 분리하였다. 분리된 세포들은, 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen-Gibco) 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen-Gibco)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Invitrogen-Gibco, Rockville, MD) 배지를 이용해 2 × 103 cells/cm2의 밀도로 분주하여, 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
1-2. siRNA 형질감염
siRNA 형질감염 24시간 전 MSCs를 플레이팅하여, 형질감염일에 50%의 컨플루언스가 되게 하였다. 세포를 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 시약 (Gibco- Invitrogen, Rockville, MD)으로 형질감염시켰다.
간략하게, 세포를 siRNA-Lipofectamine 2000 복합체로 처리하고, 18시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션 하였다. 뒤이어 배지를 신선한 배양 배지 (10% FBS (Invitrogen- Gibco) 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen-Gibco)을 포함하는 저글루코스-DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)로 교환하였으며, 뒤이어 표적 유전자가 효과적으로 하향조절될 때까지 형질감염된 세포를 0~24시간까지 더 인큐베이션하였다. SOCS1 (sc-40996), SOCS3 (sc-41000)를 표적하는 siRNA 및 스크램블 siRNA (sc-37007)는 모두 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구매하였다.
1-3. shRNA 형질감염
SOCS1 발현을 저해하기 위해, 지방조직 유래 중간엽줄기세포(AT-MSC)에 SOCS1 shRNA(short hairpin RNA) 및 적색형광단백질(RFP)을 발현하는 아데노바이러스를 처리하였다. 구체적으로, SOCS1을 타겟으로 하는 shRNA 서열은 인간 U6 프로모터와 TagRFP 마커 유전자 함유 셔틀 벡터(pO6A5-U6-mPGK-TagRFP)에 클로닝되어 pO6A5-U6-shSOCS1-mPGK-TagRFP 발현벡터로 준비하였으며, 셔틀 벡터의 U6-shRNA-SV40-pA 영역은 BAC 벡터에 재조합하여 트랜스퍼하였다. 회수한 재조합 아데노바이러스(Ad5-U6-shSOCS1-mPGK-TagRFP)는 HEK-293세포에서 증식시켰으며, PTD(protein transduction domain)인 HP4는 펩트론사에서 구입하였다. 중간엽줄기세포에 아데노바이러스 파티클을 트랜스펙션하기 위해, HP4 (100 nM)와 함께 아데노바이러스 파티클을 MOI(multiplicity of infection) 100으로 처리하고 실온에서 30분동안 무혈청 배지에 배양시켰다. 이후, 배양된 세포를 PBS로 헹구고 Ad-RFP-shSOCS1 및 HP4 preparation으로 배양하고, 2시간 후에 세포를 PBS로 헹구어 혈청함유 배지에서 배양시켰다. 선별된 중간엽줄기세포는 RFP(red fluorescent protein)를 통한 형광 관찰 및 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다.
1-4. 면역 블롯팅 ( 웨스턴 블롯팅 )
세포를 차가운 PBS (Gibco- Invitrogen)로 세척하고, 300 μl의 차가운 RIPA 버퍼 [1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate), 및 1% 소듐 디옥시콜레이트를 포함하는 50 mM Tris-HCl, pH 7.5]에서 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)로 용출하였다.
세포 용출액를 4 ℃에서 10분간 3000g로 원심분리하였다. 상층액을 수집하고, 단백질 농도를 BCA 단백질 어세이 키트(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 결정하였다. 전기영동을 위하여, 30 μg의 단백질을 샘플 버퍼 (14.4 mM beta-메르캅토에탄올, 25% 글리세롤, 2% SDS, 및 0.1% 브로모페놀 블루를 포함하는 60 mM Tris-HCl, pH 6.8) 내로 용해시키고, 5분간 끓인 뒤, 10% SDS 리듀싱 젤 상에서 분리하였다. 분리된 단백질을 a trans-blot system (Gibco-Invitrogen)을 이용하여 PVDF (polyvinylidene difluoride) 막 (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)상으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 1시간 동안 실온에서 5% 탈지분유(BD Sciences, CA, USA)를 포함하는 TBS(150 mM NaCl 를 포함하는 10 mM Tris-HCl, pH 7.5)로 블로킹한 뒤, TBS로 3회 세척하고, 3% 탈지분유를 포함하는 TBST (150 mM NaCl, 및 0.02% Tween-20를 포함하는 10 mM Tris, pH 7.5) 내의 1차 항체 (모든 항체를 1:1000으로 희석)와 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 다음날, 블롯을 TBST로 3회 세척하고, 1시간 동안 3% 탈지분유를 포함하는 TBST 내의 HRP-융합된 2차 항체(1:2000 또는 1:5000 희석)와 실온에서 인큐베이션 하였다. 이를 TBST로 3회 세척 후, 단백질을 ECL 검출 시스템 (Amersham Biosciences)으로 시각화 하였다.
1-5. 면역세포화학염색법
중간엽줄기세포에 고정용액인 4% 포름알데히드를 처리하고 빛을 차단시킨 상태의 실온에서 30분간 반응시킨후 PBS로 3회 씻어내었다. 세포 내부에 발현되는 단백질(PTGES, CXCR7)을 검출하기 위하여, 세포에 0.25% Triton X-100을 처리하고 빛을 차단시킨 상태의 실온에서 5분 동안 반응시켜 세포 투과성을 높였다. 이후 다시 세포를 3회 씻어내고, 5% FBS 블로킹 용액을 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 다시 세포를 씻어내고 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입한 1차 항체를 처리(1:100)한 후 역시 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 세포를 다시 3회 씻어내고, Alexa Fluor?488이 부착되어 있는 goat anti-mouse IgG(Invitrogen-Gibco) 2차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 이후 Carl Zeiss LSM 700 confocal microscope system(Jena, Germany)을 이용해 세포 이미지를 얻었다.
1-6. T-세포 증식 어세이 ( BrdU Incorporation Assay)
96-웰 플레이트에 10% FBS가 보충된 고 글루코스 DMEM 내로 MSCs를 1.25 × 104 cells/mL로 시딩하였다. 24시간 후, 세포 증식 억제를 위하여 10 μg/mL 미토마이신-C (Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 처리된 세포를 추가적인 2시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 뒤, 배양 배지로 5회 세척하였다. 뒤이어, 1 × 105 hPBMCs (human peripheral blood mononuclear cells)를 구배 원심 (gradient centrifugation)으로 분리하고, 각 웰에 첨가하였으며, 1 μg/mL PHA (phytohemagglutinin; Sigma-Aldrich)로 T-세포 증식을 촉진하였다. 뒤이어, BrdU (5-bromo-2-deoxyuridine)를 첨가하기 전 3-4일 간 PHA-활성화된 hPBMCs를 서로 상이한 조건의 MSCs 상에서 배양하였다. 증식 수준은 Roche Applied Science (Mannheim, Germany)의 어세이 키트를 이용하여 18시간 후 측정하였다.
1-7. 이식편대숙주병 ( GVHD ) 동물모델
8-9주령의 NOD/SCID 면역결핍 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)에 300 cGy의 전신조사법을 실시하고 24시간 후 인간 말초혈액단구세포를 정맥 투여하였다. 구체적으로, 각 마우스에 2 × 107개의 인간 말초혈액단구세포를 1 × 106개의 중간엽줄기세포와 함께 투여하였다. 이후 동일한 개수의 중간엽줄기세포를 투여 7일 째에 반복투여 하였다.
실시예 1: SOCS 하향 조절된 MSC의 in vitro 면역억제능 평가
MSC에서 SOCS를 억제하기 위하여 siRNA를 이용하여 SOCS1 또는 SOCS3 발현을 억제하였다. 그 결과, 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, SOCS1 또는 SOCS3는 각각의 MSC에서 유의적으로 발현 억제됨을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 SOCS가 억제된 MSC를 PHA-유도된 hPBMCs와 배양하고, 그 증식 활성을 BrdU+ 세포의 퍼센트를 통하여 확인하였다. 그 결과, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, SOCS1 또는 SOCS3의 siRNA가 처리된 MSC는 hPBMCs의 세포 증식을 유의적으로 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 2: SOCS 하향 조절된 MSC의 in vivo 면역억제능 평가
SOCS1를 타겟으로 하는 shRNA 발현 아데노바이러스를 지방조직 유래 중간엽줄기세포(AT-MSC)에 형질감염(transduction)시킴으로써, MSC에서 SOCS의 발현 억제를 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 적색형광단백질(RFP) 표지(A) 및 웨스턴 블랏팅(B) 결과에서 MSC내 SOCS1 단백질 발현이 유의적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 획득된 SOCS 하향 조절된 MSC가 실제 이식편대숙주병(GVHD) 동물모델에서 면역억제능을 발휘하는지 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, shRNA에 의해 SOCS가 하향 조절된 MSC(적색 라인) 처리군은 대조군에 비하여 생존률(면역억제능)을 현저히 증가시킴을 알 수 있었다.
실시예 3: IFN -γ를 처리한 MSC에서의 SOCS의 발현 수준
면역억제능을 증진시키기 위하여 IFN-γ를 MSC에 처리한 후, SOCS (Suppressors of cytokine signaling)의 발현을 면역블로팅을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, IFN-γ와 같은 cytokine signal을 조절하는 것으로 알려져 있는 SOCS(SOCS1 및 3)의 발현이 시간별로 변하는 것을 확인하였다. 이는 IFN-γ에 의한 신호를 조절하기 위해 SOCS의 발현이 달라지는 것을 의미한다.
실시예 4: SOCS 하향조절된 MSC에 IFN -γ 처리시의 면역억제능 평가
상기 실시예 2에서 획득된 SOCS 하향 조절된 MSC와, 여기에 IFN-γ를 더욱 처리한 MSC간의 면역억제능을 in vivo 이식편대숙주병(GVHD) 동물모델에서 비교평가하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, shRNA에 의해 SOCS가 하향 조절된 MSC 처리군(청색 라인)에 비하여, SOCS의 하향 조절에 더하여 IFN-γ를 더욱 처리한 MSC 처리군(적색 라인)이, 생존률(면역억제능)을 현저히 증가시킴을 알 수 있었다.
실시예 5: 고밀도 배양한 MSC에서의 면역억제 유전자 발현증가 확인
MSC를 고밀도 배양(5,000 cells/cm2)할 경우, PTGES(Prostaglandin E synthase)와 CXCR7(chemokine (C-X-C motif) receptor type 7) 유전자 발현이 증가하는지 확인함으로써, 고밀도 배양에 의해 면역억제능이 더욱 증진되는지를 평가하였다.
5-1. PTGES 발현증가 확인
PTGES에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅(A) 및 면역세포화학염색(B)한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 저밀도 배양(200 cells/cm2)에 비하여 고밀도 배양(5,000 cells/cm2)시 PTGES의 단백질 발현이 현저히 증가함을 확인하였다.
5-2. CXCR7 발현증가 확인
CXCR7에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅(A) 및 면역세포화학염색(B)한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 저밀도 배양(200 cells/cm2)에 비하여 고밀도 배양(5,000 cells/cm2)시 CXCR7의 단백질 발현이 현저히 증가함을 확인하였다.

Claims (14)

  1. SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성이 억제된, 면역 억제능을 갖는 줄기세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 SOCS는 CISH (Cytokine-inducible SH2-containing protein), SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6 및 SOCS7로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 줄기세포.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 종양 줄기세포, 및 유도만능줄기세포로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 줄기세포.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막 및 태반으로 구성된 군에서 선택된 것으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는, 줄기세포.
  5. SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 줄기세포의 면역억제 활성 유도용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 발현 또는 활성 억제제는 SOCS (suppressor of cytokine signaling) 또는 이를 코딩하는 유전자에 특이적인 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 길항제, 추출물 및 화합물로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 면역 억제용 약학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 체액성 거부반응, 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 크론병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 줄기세포에 SOCS (suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 면역억제능 활성을 유도하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 인터페론 감마를 줄기세포에 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 줄기세포를 고밀도 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 고밀도 배양은 5,000 내지 20,000 cells/cm2의 밀도로 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 줄기세포는 자가, 타가 또는 동종이계 유래인 것을 특징으로 하는, 방법.
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