WO2021230678A1 - 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물 - Google Patents

효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물 Download PDF

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WO2021230678A1
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stem cells
engraftment ability
cell engraftment
cell
enhancing cell
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김대성
이명우
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(주)세렌라이프
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Definitions

  • the present invention relates to a composition for enhancing cell engraftment ability comprising stem cells with enhanced efficacy.
  • Stem cells are cells that have the ability to differentiate into all types of cells that make up the body, such as nerves, blood, and cartilage, if necessary, while remaining undifferentiated into specific cells. There are two main ways to obtain these stem cells. First, they are obtained from a fetus generated from a fertilized egg (embryonic stem cells), and secondly, stem cells (adult stem cells) stored in each part of our body as adults. is to recover Although there are differences in function, both embryonic and adult stem cells have the characteristic of being able to differentiate into various types of cells.
  • human mesenchymal stem cells can be derived from a variety of tissues and are strong candidates for cell-based transplantation or regenerative drug therapy. Characteristics of MSCs such as migration to damaged tissues, immunosuppressive function, self-renewal, and pluripotency open up the possibility of their therapeutic application.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the present inventors have completed the present invention by developing a composition for enhancing cell engraftment ability comprising stem cells with enhanced cell engraftment ability.
  • Another object of the present invention is to provide a cell transplantation adjuvant composition comprising stem cells for enhancing cell engraftment ability.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases, including stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating immune diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a method for enhancing cell engraftment ability.
  • the present invention provides (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting a stem cell expressing it; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant to prepare stem cells for enhancing cell engraftment ability; A method for preparing the composition is provided.
  • the present invention also provides a composition for enhancing cell engraftment ability, comprising the stem cells for enhancing cell engraftment ability prepared by the above method.
  • the present invention also provides (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; and (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant;
  • the present invention also provides (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant; provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases, including stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability produced through .
  • the present invention provides two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; or a gene encoding the same; provides a composition for enhancing cell engraftment ability, comprising stem cells for enhancing cell engraftment ability.
  • the present invention provides two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding it; provides a cell transplantation adjuvant composition comprising stem cells for enhancing cell engraftment ability with enhanced expression.
  • the present invention provides stem cells for enhancing cell engraftment ability, including two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding it; provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases, including stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability with enhanced expression.
  • the present invention includes the step of administering a composition for preventing or treating an immune disease comprising stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof; ) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant; it provides a method for preventing or treating immune diseases, which is produced through.
  • the present invention comprises the step of administering a composition for preventing or treating immune diseases comprising stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof, wherein the stem cells for enhancing cell engraftment ability are PD- two or more proteins selected from the group consisting of L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding it; the expression of which is enhanced, it provides a method for preventing or treating immune diseases.
  • a composition for preventing or treating immune diseases comprising stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof, wherein the stem cells for enhancing cell engraftment ability are PD- two or more proteins selected from the group consisting of L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding it; the expression of which is enhanced, it provides a method for preventing or treating immune diseases.
  • the present invention also includes the step of administering the stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof, wherein the stem cells for enhancing cell engraftment ability include (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; and (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant;
  • the present invention includes the step of administering the stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof, wherein the stem cells for enhancing cell engraftment ability are selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS 2 more than one protein; Or it provides a method for enhancing cell engraftment ability; or a gene encoding it; expression of which is enhanced.
  • composition for enhancing cell engraftment ability comprising stem cells for enhancing cell engraftment ability according to the present invention has an effect of remarkably increasing engraftment of cells cultured together. and in the field of prevention and treatment of various diseases using cell therapeutics;
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of confirming the factors with increased expression compared to the control group, naive MSC, in mesenchymal stem cells for enhancing cell engraftment ability prepared by the culture method of the present invention through a microarray.
  • FIG. 2 is a view showing the results of confirming the effect of promoting cell engraftment in peripheral blood by the stem cells for promoting cell engraftment ability prepared by the culture method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing the results of confirming the effect of promoting cell engraftment in the bone marrow by the stem cells for enhancing cell engraftment ability prepared by the culture method of the present invention.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for enhancing cell engraftment ability comprising stem cells for enhancing cell engraftment ability and a composition for enhancing cell engraftment ability prepared by the method.
  • the present invention also includes the step of administering the stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof, wherein the stem cells for enhancing cell engraftment ability include (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; and (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant;
  • the method for preparing the composition for enhancing cell engraftment ability includes (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; and (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant to prepare stem cells for enhancing cell engraftment ability.
  • a stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into two or more cells while having the ability to self-renew, and the stem cell is an adult stem cell, a pluripotent stem cell, an induced pluripotent stem cell, or an embryonic stem cell. contains stem cells.
  • the adult stem cells are preferably derived from bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta or Wharton's jelly.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord.
  • the mesenchymal stem cells are undifferentiated stem cells isolated from human or mammalian tissues.
  • Mesenchymal stem cells can be derived from various tissues, and in particular, from one or more selected from the group consisting of bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta, or Wharton's jelly. can come from Techniques for isolating stem cells from each tissue are already known in the art.
  • the mesenchymal stem cells are autologous, allogeneic or allogeneic bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta or Wharton's jelly.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from humans, fetuses, or mammals other than humans.
  • the mammals other than humans may be more preferably canines, felines, monkeys, cattle, sheep, pigs, horses, rats, mice or guinea pigs, and the origin is not limited thereto.
  • selection means selecting cells according to whether a certain protein or a gene encoding it is expressed or not and the amount of expression.
  • PD-L1 Programmed death-ligand 1 refers to a transmembrane protein encoded by the CD274 gene in humans, and inhibits the immune system in the treatment of pregnancy, tissue allograft, autoimmune disease and hepatitis. plays an important role.
  • the PD-L1 transmits a signal that reduces the proliferation of antigen-specific T cells in the lymph node, and at the same time increases apoptosis.
  • CXCR7 C-X-C chemokine receptor type 7 refers to a chemokine receptor also known as ACKR3 (G-protein coupled receptor 159) and GPR159 (Atypical chemokine receptor 3).
  • PGES prostaglandin E2 synthase
  • PGE prostaglandin E2 synthase
  • PGDS Prostaglandin-D synthase refers to an enzyme belonging to the sigma class glutathione-S-transferase family.
  • the PGDS catalyzes the conversion of PGH2 to PGD2 (Prostaglandin-D), and is involved in prostanoid production in the immune system and mast cells.
  • the presence of PGDS is also used to identify the differentiation stage of human megakaryocytes.
  • IDO indoleamine 2,3-dioxygenase
  • IDO refers to a heme-containing enzyme encoded by the IDO 1 gene in humans. IDO limits T cell function and is involved in immune regulation through its ability to control mechanisms of immune tolerance.
  • CXCL9 (Chemokine (C-X-C motif) ligand 9), also known as gamma-interferon-induced monochitin, is a small cytokine belonging to the CXC chemokine.
  • the CXCL9 is a T-cell chemoattractant induced by gamma-interferon.
  • CXCL10 (Chemokine (CXC motif) ligand 10) is known as IP-10 (Interferon gamma-induced protein 10) or small-inducible cytokine B10, a protein of 8.7 kDa encoded by the CXCL10 gene in humans. it means.
  • CXCL10 is a small cytokine belonging to the C-X-C chemokine family.
  • the selected stem cells of step (a) are BD2 (Beta-defensin 2) or LL-37 (Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) protein; Or it is preferred that the expression of the gene encoding it is further enhanced.
  • BD2 Beta-defensin 2
  • LL-37 Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37
  • culturing to enable the cell-to-cell interaction of step (b) maintains a state of 90% or more confluent when expressed in terms of culture density, but maintains the shape of the cells, It is preferable to be cultured at a level that does not overlap, and more preferably, after seeding at a density of 3,000 to 20,000 cells/cm 2 , and then culturing for 3 to 5 days, but is not limited thereto.
  • the stimulatory agent is preferably at least one selected from the group consisting of IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and poly IC.
  • the stem cells of step (b) include one or more proteins selected from the group consisting of CXCR7, PGES (prostaglandin E2 synthase) and PGDS (Prostaglandin-D synthase); or a gene encoding it; it is preferable that the expression of the gene is enhanced.
  • the stem cells for enhancing cell engraftment ability include (i) two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; or a gene encoding it; (ii) IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9 (Chemokine (CXC motif) ligand 9), CXCL10 (Chemokine (CXC motif) ligand 10), HLA-G (human leukocyte antigen G), ICAM1 (Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1 (vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP (Interleukin-18-binding protein), RARRES3 (Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8 (CC motif ligand 8) ), CCL13 (CC motif ligand 13), TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL (A proliferation-inducing ligand), IDO (in
  • the steps (a) to (c) refer to selection, interaction, and stimulation steps, respectively, and each step is preferably performed sequentially.
  • composition for enhancing the cell engraftment ability prepared by the above method enhances the cell engraftment ability of stem cells, and when the composition and cells such as hematopoietic stem cells are cultured together, there is an effect of enhancing cell engraftment.
  • the composition for enhancing cell engraftment ability may include a medium for suspending water and cell components.
  • a medium for suspending water and cell components For example, RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), ⁇ -MEM (alpha-Minimum Essential Medium), McCoy's 5A medium, Eagle's basal medium, CMRL 1066 (Connaugh Medical Research Laboratories 1066) , Glasgow's minimum essential medium, Ham's nutrient mixtures medium, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), Liebovitz' L-15 medium, etc. are all available for cell culture.
  • RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • ⁇ -MEM alpha-Minimum Essential Medium
  • McCoy's 5A medium Eagle's basal medium
  • CMRL 1066 Connaugh Medical
  • auxiliary components may be added to the composition for enhancing cell engraftment ability according to the present invention, as needed.
  • Injections such as dextran 40, physiological saline, etc., antibiotics such as penicillin G, streptomycin sulfate, and gentamycin to prevent contamination of microorganisms, and amphotericin B B), one or more selected from antifungal agents such as nystatin may be used.
  • the present invention provides (a) a PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; and (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant;
  • cell transfer means transferring cells to another individual.
  • the cell is preferably a hematopoietic stem cell, but is not limited thereto.
  • the stem cells for enhancing cell engraftment ability of the present invention can be transplanted together with cells, preferably hematopoietic stem cells, to aid in engraftment of cells and to enhance the effects of cells.
  • the cell transplantation adjuvant composition may further include at least one known active ingredient having an effect of enhancing cell engraftment ability in addition to stem cells for enhancing cell engraftment ability.
  • the present invention provides (a) a PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant; provides a composition for preventing or treating immune diseases, including stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability produced through.
  • the present invention includes the step of administering a composition for preventing or treating an immune disease comprising stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof; ) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant; it provides a method for preventing or treating immune diseases, which is produced through.
  • the stem cell for enhancing cell engraftment ability of the present invention can enhance the in vivo engraftment of hematopoietic stem cells, thereby improving the effect of preventing or treating immune diseases of hematopoietic stem cells. may be administered sequentially or sequentially.
  • the immune disease is acute leukemia, chronic myelogenous leukemia, myelodysplastic syndrome, lymphoma, multiple myeloma, germ cell tumor, breast cancer, ovarian cancer, small cell lung cancer, solid tumor including neuroblastoma, aplastic tumor Anemia, erythropathies, Gaucher's disease, Hunter's syndrome, ADA enzyme deficiency, immune diseases including Wiskot-Aldrich syndrome, metabolic diseases, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and multiple sclerosis, preferably at least one disease selected from the group consisting of And, any disease or disease requiring transplantation of hematopoietic stem cells can be used without limitation.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases may be formulated and used in various forms according to a conventional method.
  • it may be formulated in oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, and syrups, and may be formulated in the form of external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
  • composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having a preventive or therapeutic effect on immune diseases together with stem cells for enhancing cell engraftment ability.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive includes starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, and lactose.
  • the pharmaceutically acceptable additive includes starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, and lactose.
  • mannitol, syrup, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, carnauba wax, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, Sucrose and the like may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered in various oral or parenteral formulations during actual clinical administration.
  • commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc. are used. and can be prepared, and it is preferable to use a suitable formulation known in the art.
  • the solid preparation for oral administration includes tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, or It is prepared by mixing lactose and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate talc are also used.
  • the liquid formulations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. may be included.
  • the formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the formulation method, administration method, administration time and/or route of administration of the pharmaceutical composition, and the type and extent of a response to be achieved by administration of the pharmaceutical composition. , various factors including the type of subject to be administered, age, weight, general health, symptoms or severity of disease, sex, diet, excretion, components of drugs or other compositions used simultaneously or at the same time in the subject; It may vary depending on similar factors well known in the medical field, and a person skilled in the art can easily determine and prescribe an effective dosage for a desired treatment.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, preferably administered at a concentration of 0.05 to 5 mg/kg, more preferably 0.1 to 0.4 mg/kg, more preferably 0.2 to 0.35 mg/kg , more preferably 0.25 mg/kg, but the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the administration route and administration method of the pharmaceutical composition of the present invention may be each independent, and the method is not particularly limited, and any administration route and administration method as long as the pharmaceutical composition can reach the desired site. can follow
  • the pharmaceutical composition may be administered by oral administration or parenteral administration.
  • the parenteral administration method includes, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, transdermal administration, or subcutaneous administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers for the prevention or treatment of immune diseases.
  • the subject is an individual expected to develop an immune disease; affected individuals; or an individual who has been determined to be cured; however, it is not limited thereto.
  • the present invention provides two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding the same; provides a composition for enhancing cell engraftment ability, comprising stem cells for enhancing the expression of cell engraftment ability.
  • the present invention also provides a cell transplantation adjuvant composition and a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases, including the stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing the cell engraftment ability.
  • the present invention includes the step of administering the stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof, wherein the stem cells for enhancing cell engraftment ability are selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS 2 more than one protein; Or it provides a method for enhancing cell engraftment ability; or a gene encoding it; expression of which is enhanced.
  • the present invention comprises the step of administering a composition for preventing or treating immune diseases comprising stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof, wherein the stem cells for enhancing cell engraftment ability are PD- two or more proteins selected from the group consisting of L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding it; the expression of which is enhanced, it provides a method for preventing or treating immune diseases.
  • a composition for preventing or treating immune diseases comprising stem cells and hematopoietic stem cells for enhancing cell engraftment ability to an individual in need thereof, wherein the stem cells for enhancing cell engraftment ability are PD- two or more proteins selected from the group consisting of L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding it; the expression of which is enhanced, it provides a method for preventing or treating immune diseases.
  • the stem cells for enhancing cell engraftment ability include BD-2 or LL-37 protein, which is an additional selection factor; Or the gene encoding it; expression may be further enhanced.
  • the stem cells for enhancing cell engraftment ability are IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, at least one protein selected from the group consisting of GBP1, GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 and IFN-beta; Or it is preferred that the expression of the gene encoding it is further enhanced.
  • composition according to the present embodiment has significantly improved cell engraftment ability, more specifically, cell engraftment promotion effect of hematopoietic stem cells, compared to naive stem cells, and is widely used in the field of cell transplantation and treatment of immune-related diseases. can be utilized.
  • the subject may be a subject scheduled for cell transplantation, but is not limited thereto.
  • transfer medium 50 IU/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin (purchased from Invitrogen)
  • the umbilical cord tissue was incised to separate Wharton's jelly (the matrix of the umbilical cord) from the blood vessels and other internal elements of the umbilical cord, the blood vessels were removed to separate the Wharton's jelly.
  • the isolated Wharton's jelly was cut into small pieces (0.5 cm ⁇ 0.5 cm). The culture of the isolated tissue was performed according to the cell culture conditions suitable for the extraction of mesenchymal stem cells.
  • the explanted tissue was impregnated with 5 ml of MEM- ⁇ (Minimum essential medium-alpha, Gibco) with 10% FBS, 10% FBS and 1% antibiotics-antimycotic. Incubated in a carbon dioxide cell incubator at a temperature of 37 °C. At this time, the medium was replaced every 3 or 4 days, and the outgrowth of cells was monitored with an optical microscope. Growing cells were trypsinized (0.125% trypsin/0.05% EDTA) for further expansion and cryopreservation (MEM- ⁇ , 10% FBS), and the medium was changed every 3 or 4 days. The outgrowth of cells from the explanted tissue was monitored by light microscopy.
  • MEM- ⁇ Minimum essential medium-alpha, Gibco
  • the cell pellet was resuspended in medium (MEM- ⁇ (Gibco), 10% FBS, 1% Antibiotics-antimycotic) and counted, and inoculated into T75 tissue culture flasks. The medium was changed every 3 or 4 days. Cell growth and clonogenesis were monitored by light microscopy. At about 90% confluence, cells were sub-cultured as described above.
  • Example 2 S-I-S (Selection-Interaction-Stimulation) culture method for producing mesenchymal stem cells with enhanced efficacy
  • mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord tissue of Example 1 cells with enhanced expression of PD-L1 and CXCR7 proteins were selected. Specifically, the mesenchymal stem cells of Example 1 were cultured confluently to enable cell-to-cell interaction. An experiment was performed to confirm the expression of PD-L1 and CXCR7 proteins in cultured mesenchymal stem cells. In addition, the expression of BD-2 and LL-37 proteins was confirmed as additional selection factors.
  • Example 1-2 Among the mesenchymal stem cells isolated and cultured in Example 1-2, cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 proteins were identified and selected, and these were used in the next experiment.
  • the selected PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 protein expression-enhanced mesenchymal stem cells were subcultured. Specifically, the mesenchymal stem cells were put into the mesenchymal stem cell culture medium and tissue culture flask of Example 1-2, and cultured at 37° C., 5% CO 2 incubator. At this time, bFGF was added to the culture medium. During subculture, mesenchymal stem cells of each generation were frozen. In addition, experiments were performed to confirm the morphology and cell proliferation rate of mesenchymal stem cells during subculture and freezing.
  • mesenchymal stem cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2, and LL-37 proteins maintained the characteristics of mesenchymal stem cells even during subculture, and maintained or increased the cell proliferation rate.
  • mesenchymal stem cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 proteins maintained the characteristics of mesenchymal stem cells even when frozen and thawed, and maintained or increased the cell proliferation rate.
  • mesenchymal stem cells selected in the selection step of Example 2-1 cells with enhanced expression of CXCR7, PGES and PGDS proteins were selected in the additional selection step.
  • 'culture to enable interaction between cells' refers to maintaining a state of 90% or more confluent when expressed in terms of culture density, but maintaining the shape of the cells and culturing at a level where cells do not overlap. do.
  • the mesenchymal stem cells selected in the selection step of Example 2-1 were seeded at a density of 3,000 to 20,000 cells/cm 2 to enable cell-to-cell interaction, and then harvested after culturing for 3 to 5 days. An experiment was performed to confirm the expression of CXCR7, PGES and PGDS proteins in the harvested mesenchymal stem cells.
  • IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , or polyIC Polyinosinic:polycytidylic acid, Poly I:C
  • Poly I:C Polyinosinic:polycytidylic acid, Poly I:C
  • FIG. 1 Gene expression of mesenchymal stem cells (ie, mesenchymal stem cells cultured by the S-I-S culture method) were analyzed through a microarray. The results of analysis of genes with increased expression in mesenchymal stem cells treated with immune stimulants are shown in FIG. 1 .
  • the genes encoding the PD-L1, TRAIL, APRIL and BAFF proteins are denoted as CD274, TNFSF10, TNFSF13 and TNFSF13B, respectively.
  • Example 3 Evaluation of cell engraftment enhancement effect of stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2
  • mice per cage were irradiated with sublethal irradiation level of 300 cGy to induce autologous hematopoietic stem cells of NOD/SCID mice. did damage After 4 hours of irradiation, the test animals were treated with hematopoietic stem cells (negative control group, HSC), hematopoietic stem cells and normally cultured mesenchymal stem cells (positive control group, HSC+naive MSC), hematopoietic stem cells and intermediate with enhanced efficacy.
  • HSC hypothal irradiation level of 300 cGy
  • mesenchymal stem cells positive control group, HSC+naive MSC
  • the mesenchymal stem cells were divided into a group (test group, HSC+MSC SIS CP(I) ), and the test substance was administered through the tail vein.
  • the group administered with the hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells with enhanced efficacy was cultured by the culture method of Example 2, and treated with IFN- ⁇ as an immune stimulant.
  • the results of transplantation of hematopoietic stem cells were observed up to 10 weeks after administration of the test substance. During the observation period, general symptoms such as changes in general status, motility, appearance, and autonomic nerves were observed more than 5 times a week, and the presence or absence of dead animals was determined. did.
  • the engraftment rate (%) was confirmed by analyzing human-derived blood cell antigens expressed in the entire cell group through FACS analysis. ) analysis was performed.
  • FACS analysis was performed as follows. Bone marrow from the tibia and femur and peripheral blood from the inferior vena cava were collected from mice maintained aseptically in a specific pathogen free (SPF) facility for 10 weeks.
  • SPF pathogen free
  • the collected bone marrow was washed once with PBS (2% FBS-PBS) containing 2% fetal bovine serum, red blood cell lysis buffer was added to destroy red blood cells for 15 minutes at room temperature, and washed once with 2% FBS-PBS. .
  • PBS 2% FBS-PBS
  • red blood cell lysis buffer was added to destroy red blood cells for 15 minutes at room temperature, and washed once with 2% FBS-PBS.
  • FACS fluorescence phosphate
  • Cells were isolated from the peripheral blood of each mouse, and i) the ratio of hCD45 + cells and mCD45 + cells, and ii) the ratio of hCD45 + intracellular CD13 + cells (Myeloid cells) and CD19 + cells (B cells) were measured using FACS. analyzed. The results of analyzing the engraftment rate of hematopoietic stem cells in mouse peripheral blood are shown in FIG. 2 .
  • the engraftment rate of hematopoietic stem cells in mouse peripheral blood was higher than in the hematopoietic stem cell transplantation group (HSC). It was increased about 60 times, and it was confirmed that it increased about 3 times compared to the hematopoietic stem cell and mesenchymal stem cell transplant group (HSC + naive MSC).
  • Cells were isolated from the bone marrow of each mouse, and i) the ratio of hCD45+ cells and mCD45+ cells, and ii) the ratio of CD13+ cells (Myeloid cells) and CD19+ cells (B cells) in hCD45+ cells were analyzed using FACS. The results of analyzing the engraftment rate of hematopoietic stem cells in the mouse bone marrow are shown in FIG. 3 .
  • the engraftment rate of hematopoietic stem cells in the mouse bone marrow was approximately lower than in the hematopoietic stem cell transplantation group (HSC). It was increased by 14 times, and it was confirmed that it increased about 2 times compared to the hematopoietic stem cell and mesenchymal stem cell transplant group (HSC + naive MSC).
  • the present inventors prepared mesenchymal stem cells with enhanced efficacy through the culture method of the present invention, and confirmed the effect of enhancing hematopoietic stem cell engraftment. This means that side effects caused by delayed or failure of hematopoietic stem cell engraftment during hematopoietic stem cell transplantation can be reduced, and can be used in various ways in the field of hematopoietic stem cell transplantation and the prevention and treatment of immune-related diseases.

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Abstract

본 발명은 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물은 함께 배양되는 세포의 생착을 현저히 증가시키는 효과를 가지고 있는바, 세포 이식 분야; 및 세포 치료제를 이용한 각종 질환의 예방 및 치료 분야;에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물
본 발명은 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물에 관한 것이다.
줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두가지가 있는데, 첫째는 수정란으로부터 발생한 태아로부터 얻는 것(배아줄기세포)이고 둘째는 성인이 된 우리 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다.
특히, 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 다양한 조직에서 유래될 수 있으며, 세포 기반 이식 또는 재생 의약 치료에 있어서 강력한 후보자이다. 손상된 조직으로의 이동, 면역 억제기능, 자가-재생, 및 다분화능과 같은 MSCs의 특징은 이의 치료적 적용의 가능성을 연다. 현재, MSCs의 주입, 또는 이식을 포함하는 500 여개의 임상이 clinicaltrials.gov에 등록되어 있다. 그러나 대부분의 임상 1 상은 생물학적 안정성 문제를 나타내지 않음에도 불구하고, 그 이상의 임상단계에서는 미비한 결과가 도출되고 있다.
이에 본 발명자들은 세포 생착능이 증진된 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물을 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 세포 생착능 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 이식 보조제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 세포 생착능 증진방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;를 발현하는 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하여 세포 생착능 증진용 줄기세포를 제조하는 단계;를 포함하는, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 이식 보조제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 이식 보조제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인, 면역질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 면역질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포를 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인, 세포 생착능 증진방법을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포를 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 세포 생착능 증진방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물은 함께 배양되는 세포의 생착을 현저히 증가시키는 효과를 가지고 있는바, 세포 이식 분야; 및 세포 치료제를 이용한 각종 질환의 예방 및 치료 분야;에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 마이크로 어레이를 통해 본 발명의 배양방법으로 제조된 세포 생착능 증진용 중간엽 줄기세포에서 대조군인 naive MSC에 비해 발현이 증가된 인자를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 배양방법으로 제조된 세포 생착능 증진용 줄기세포에 의한 말초 혈액 내 세포 생착 증진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 배양방법으로 제조된 세포 생착능 증진용 줄기세포에 의한 골수 내 세포 생착 증진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 세포 생착능 증진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포를 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인, 세포 생착능 증진방법을 제공한다.
상기 세포 생착능 증진용 조성물 제조방법은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및(c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하여 세포 생착능 증진용 줄기세포를 제조하는 단계;를 포함한다.
본 발명에 있어서, 줄기세포(stem cell)는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 성체줄기세포는 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로부터 유래된 것이 바람직하다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 줄기세포는 인간 제대 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 있어서, 중간엽 줄기세포는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 다양한 조직에서 유래할 수 있으며, 특히 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로부터 유래할 수 있다. 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 자가, 타가 또는 동종이형의 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아, 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서, 선별은 어떤 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 여부 및 발현량에 따라 세포를 골라내는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, PD-L1(Programmed death-ligand 1)은 인간에서 CD274 유전자에 의해 암호화되는 막 관통 단백질을 의미하며, 임신, 조직 동종 이식, 자가 면역 질환 및 간염의 치료에 있어서 면역계를 억제하는데 중요한 역할을 한다. 상기 PD-L1은 림프절에서 항원 특이적 T 세포의 증식을 감소시키는 신호를 전달하는 동시에, 세포자살(apoptosis)를 증가시킨다.
본 발명에 있어서, CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7)은 ACKR3(G-protein coupled receptor 159) 및 GPR159(Atypical chemokine receptor 3)로도 알려진 케모카인 수용체를 의미한다.
본 발명에 있어서, PGES(prostaglandin E2 synthase)는 MAPEG(Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism) 계통인 에이코사노이드(eicosanoid) 및 글루타치온(glutathione)의 대사에 관여하는 효소를 의미한다. 보다 상세하게는 상기 PGES는 PGH2(Prostaglandin H2)로부터 PGE(prostaglandin E)를 생성한다.
본 발명에 있어서, PGDS(Prostaglandin-D synthase)는 시그마 클래스 글루타치온-S-트랜스퍼레이즈 패밀리에 속하는 효소를 의미한다. 상기 PGDS는 PGH2가 PGD2(Prostaglandin-D)로 전환되는 것을 촉매하고, 면역계와 비만 세포에서 프로스타노이드 생성에 관여한다. 또한 PGDS의 존재는 인간 거핵세포(megakaryocyte)의 분화 단계를 확인하는 데에 이용된다.
본 발명에 있어서, IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 인간에서 IDO 1 유전자에 의해 암호화되는 헴-함유 효소(heme-containing enzyme)를 의미한다. IDO는 T 세포의 기능을 제한하고, 면역 내성의 메커니즘은 제어하는 능력을 통해 면역 조절에 관여한다.
본 발명에 있어서, CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9)는 감마-인터페론에 의해 유도된 모노키틴으로도 알려져 있으며, CXC 케모카인에 속하는 작은 사이토카인이다. 상기 CXCL9는 감마-인터페론에 의해 유도되는 T 세포 화학유인물질(T-cell chemoattractant)이다.
본 발명에 있어서, CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10)은 IP-10(Interferon gamma-induced protein 10) 또는 small-inducible cytokine B10으로 알려져 있는, 인간에서 CXCL10 유전자에 의해 코딩되는 8.7 kDa의 단백질을 의미한다. CXCL10은 C-X-C 케모카인 계통에 속하는 작은 사이토카인이다
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)의 선별된 줄기세포는 BD2(Beta-defensin 2) 또는 LL-37(Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (b)의 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 3,000 내지 20,000 cells/cm 2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 자극제는 IFN-γ, TNF-α 및 폴리IC(Poly IC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (b)의 줄기세포는 CXCR7, PGES(prostaglandin E2 synthase) 및 PGDS(Prostaglandin-D synthase)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 (i) PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진되고, (ii) IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9), CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10), HLA-G(human leukocyte antigen G), ICAM1(Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP(Interleukin-18-binding protein), RARRES3(Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8(C-C motif ligand 8), CCL13(C-C motif ligand 13), TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL(A proliferation-inducing ligand), BAFF(B-cell activating factor), HLA-DRA(HLA class II histocompatibility antigen-DR alpha chain), CD74(Cluster of Differentiation 74), GBP1(Guanylate-binding protein 1), GBP2(Guanylate-binding protein 2), GBP4(Guanylate-binding protein 4), GBP5(Guanylate-binding protein 5), PGE2(Prostaglandin E2) 및 IFN-beta(Interferon-beta)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (c)는 각각 선별(selection), 상호작용(interaction) 및 자극(stimulation) 단계를 의미하며, 각 단계는 순차적으로 수행되는 것이 바람직하다.
전술한 방법으로 제조된 세포 생착능 증진용 조성물은 줄기세포의 세포 생착능을 증진시키는바, 상기 조성물과 조혈모세포 등의 세포를 함께 배양하였을 때 세포 생착을 증진시키는 효과가 있다.
본 발명에 따른 세포 생착능 증진용 조성물은 물 및 세포성분을 현탁하기 위한 배지를 포함할 수 있다. 예를 들어, RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), α-MEM(alpha-Minimum Essential Medium), McCoy's 5A 배지, Eagle's basal 배지, CMRL 1066(Connaugh Medical Research Laboratories 1066), Glasgow 최소필수 배지, Ham's nutrient mixtures 배지, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), Liebovitz' L-15 배지 등 일반적으로 사용되는 세포배양용 배지는 모두 가능하다.
또한 본 발명에 따른 세포 생착능 증진용 조성물에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 알부민(albumin) 등의 혈청 혹은 혈장 내 성분, 덱스트란 40(dextran 40), 생리식염수 등의 주사액, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G(penicillin G), 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 젠타마이신(gentamycin) 등의 항생제 및 암포테리신 B(amphotericin B), 니스타틴(nystatin) 등의 항진균제 중 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 이식 보조제 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 세포 이식(cell transfer)은 세포를 다른 개체에 이식하는 것을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포는 조혈모세포인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 세포 생착능 증진용 줄기세포는 세포, 바람직하게는 조혈모세포와 함께 이식되어, 세포의 생착을 돕고 세포가 가지고 있는 효과를 증진시킬 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포 이식 보조제 조성물은 세포 생착능 증진용 줄기세포 외에 세포 생착능을 증진시키는 효과를 갖는 공지의 유효성분 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인, 면역질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 세포 생착능 증진용 줄기세포는 조혈모세포의 생체 내 생착을 증진시켜 조혈모 세포의 면역질환 예방 또는 치료 효과를 향상시킬 수 있으며, 세포 생착능 증진용 줄기세포와 조혈모세포는 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 면역질환은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 생식세포 종양, 유방암, 난소암, 소세포폐암, 신경아세포종양을 포함하는 고형종양, 재생불량성빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증, Wiskot-Aldrich 증후군을 포함하는 면역질환, 대사질환, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 질환인 것이 바람직하며, 조혈모세포의 이식이 필요한 어떠한 질환 또는 질병이라면 제한없이 활용할 수 있다.
전술한 방법으로 제조된 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 세포 생착능 증진용 줄기세포와 함께 면역질환에 대하여 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 또한, 상기 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 0.05 내지 5 mg/kg의 농도로 투여되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 0.1 내지 0.4 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 0.35 mg/kg, 더더욱 바람직하게는 0.25 mg/kg일 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 개체는 면역질환이 발병할 것으로 예상되는 개체; 발병한 개체; 또는 완치판정을 받은 개체;일 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는, 세포 이식 보조제 조성물 및 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포를 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 세포 생착능 증진방법을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 면역질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 추가 선별 인자인 BD-2 또는 LL-37 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 및 IFN-beta로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것이 바람직하다.
본 양태에 따른 조성물은 세포 생착능 증진 효과, 보다 상세하게는 조혈모 세포의 세포 생착을 증진하는 효과가 naive 줄기세포에 비해 현저히 증진된 것으로, 세포 이식 분야 및 면역관련 질환의 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 개체는 세포 이식 예정인 개체일 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실험 재료 준비
1-1. 인간 제대 채취
출산 직후에 바로 수집된 제대 조직을 실험실로 옮기기 전 세척하고, 이송용 배지(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Invitrogen으로부터 구매))가 첨가된 F-12 배지를 포함하는 500㎖의 멸균 유리병으로 옮긴 후, 멸균상태의 플로우 후드에서 줄기세포의 추출을 진행하였다. 먼저, 시료는 멸균 스테인리스 스틸의 용기로 옮겨진 후, PBS로 수차례 세정한 후 2 cm 길이로 잘라 10 cm 지름의 세포배양 접시로 옮겨지며, 추가적인 세정 및 70%(v/v) 에탄올에 의해 항감염 처리를 진행하고, 항생제 혼합물(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Invitrogen으로부터 구매))이 첨가된 PBS로 상기 용액이 깨끗해질 때까지 수차례 세정하여 사용하였다.
1-2. 인간 제대 조직으로부터 줄기세포 분리 및 배양
제대의 혈관 및 기타 내부요소들로부터 와튼젤리(제대의 기질)를 분리하기 위해 제대조직을 절개한 후, 혈관을 제거하여 와튼젤리를 분리하였다. 세포 추출을 위해 상기 분리된 와튼젤리를 작은 조각(0.5 cm×0.5 cm)으로 잘랐다. 분리된 조직의 배양은 중간엽 줄기세포의 추출에 적합한 세포 배양 조건에 맞추어 수행하였다.
중간엽 줄기세포의 분리 및 배양을 위해 상기 외식된 조직을 10% FBS가 첨가된 5 ml의 MEM-α(Minimum essential medium-alpha, Gibco), 10% FBS 및 1% antibiotics-antimycotic에 함침시킨 후 이산화탄소 세포배양기에서 37℃ 온도로 배양하였다. 이때, 배지는 매 3일 또는 4일 마다 교체하였으며 세포의 성장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링하였다. 신장하는 세포들은 추가적인 확장 및 냉동보관(MEM-α, 10% FBS)을 위해 트립신처리(0.125% 트립신/0.05% EDTA)하였으며, 상기 배지는 매 3일 또는 4일마다 교체되었다. 외식된 조직으로부터의 세포의 신장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링하였다.
중간엽 줄기세포의 추출을 위해, 세포의 펠렛은 배지(MEM-α(Gibco), 10% FBS, 1% Antibiotics-antimycotic)에 재현탁 및 카운트되었으며, T75 조직배양 플라스크에 접종되었다. 상기 배지는 매 3일 또는 4일마다 교환되었다. 세포의 성장(growth) 및 클론형성은 광학현미경으로 모니터링되었다. 약 90%의 세포수(confluence)에서, 세포들은 상기에 설명된 바와 같이 서브-배양(sub-culture)되었다.
이러한 세포들은 in vitro에서 지방세포, 연골세포, 골세포 등으로의 분화능 및 중간엽 줄기세포를 특정하는 표면 항원(CD44/CD105, >95% positive; CD31/CD45, >95% negative) 존재 유무를 확인하였다.
실시예 2. 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 제조를 위한 S-I-S(Selection-Interaction-Stimulation) 배양방법
2-1. PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포 선별 단계(Selection stage)
2-1-1. 중간엽 줄기세포에서 PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현 분석
실시예 1의 인간 제대 조직으로부터 분리된 중간엽 줄기세포 중 PD-L1 및 CXCR7 단백질의 발현이 증진된 세포를 선별하였다. 구체적으로, 실시예 1의 중간엽 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 컨플루언트하게 배양하였다. 배양된 중간엽 줄기세포에서 PD-L1 및 CXCR7 단백질의 발현을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 또한 추가 선별 인자로서 BD-2 및 LL-37 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 1-2에 의해 분리 및 배양된 중간엽 줄기세포 중 PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질의 발현이 증진된 세포를 확인 및 선별하였으며, 이를 다음 실험에 사용하였다.
2-1-2. PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포의 계대 배양 및 동결
선별된 PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포를 계대 배양하였다. 구체적으로 상기 중간엽 줄기세포를 실시예 1-2의 중간엽 줄기세포 배양배지와 조직배양 플라스크에 넣어 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하였다. 이 때, 배양배지에 bFGF를 첨가하였다. 계대 배양 중 각 세대의 중간엽 줄기세포를 동결시켰다. 또한 계대 배양 및 동결 시 중간엽 줄기세포의 형태 및 세포증식율을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포는 계대 배양 중에도 중간엽 줄기세포의 특성이 유지되며, 세포 증식율이 유지 또는 증가하는 것을 확인하였다.
PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포는 동결 및 해동 시에도 중간엽 줄기세포의 특성이 유지되며, 세포 증식율이 유지 또는 증가하는 것을 확인하였다.
2-2. 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포에서 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포의 상호작용 단계(Interaction stage)
실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포 중 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현이 증진된 세포를 추가 선별 단계에서 선별하였다. 구체적으로, ‘세포 간 상호작용이 가능하도록 배양’은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양되는 것을 의미한다. 상기 실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 3,000 내지 20,000 cells/cm 2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양한 후 수확하였다. 수확된 중간엽 줄기세포에서 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포를 상호작용이 가능하도록 배양한 후 이들 중 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현이 증진된 세포를 확인 및 선별하였으며, 선별된 세포를 다음 실험에 사용하였다.
2-3. 선별된 중간엽 줄기세포에 면역 자극제를 처리하는 프라이밍 단계 (Stimulation stage)
실시예 2-2의 추가 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포에 면역 자극제인 IFN-γ, TNF-α 또는 폴리IC(Polyinosinic:polycytidylic acid, Poly I:C)를 처리하거나 상기 자극제를 혼합하여 자극하였다. 마이크로 어레이를 통해 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포(즉, S-I-S 배양방법으로 배양된 중간엽 줄기세포)의 유전자 발현을 분석하였다. 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포에서 발현이 증가된 유전자의 분석 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포는 IDO, PD-L1, CXCL9, CXCL10, CXCR7, PGES, PGDS, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5 및 IFN-beta 단백질을 코딩하는 유전자; 및 PGE2 단백질;의 발현이 증가된 것을 확인하였다. 상기 PD-L1, TRAIL, APRIL 및 BAFF 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 CD274, TNFSF10, TNFSF13 및 TNFSF13B로 표시된다.
이하, 실험에서는 면역 자극제 처리로 부스팅된 줄기세포를 이용하였다.
실시예 3. 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 세포 생착 증진 효과 평가
3-1. 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포 이식
조혈모세포를 NOD/SCID 마우스에 이식하기 4~6 시간 전 우리당 마우스를 3마리씩 넣고, 준치사 방사선조사(sublethal irradiation) 수준인 300 cGy로 방사선 조사를 수행하여, NOD/SCID 마우스의 자가 조혈모세포에 손상을 주었다. 방사선 조사 4시간 후 시험동물들을 조혈모세포를 투여한 군(음성 대조군, HSC), 조혈모세포 및 일반적으로 배양된 중간엽 줄기세포(양성 대조군, HSC+naive MSC), 조혈모세포 및 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 함께 투여한 군(시험군, HSC+MSC S-I-S CP(I))으로 나누었고, 꼬리정맥을 통해 시험물질을 투여하였다. 상기 조혈모세포 및 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 함께 투여한 군(시험군, HSC+MSC S-I-S CP(I))는 실시예 2의 배양방법으로 배양하였고, 면역 자극제로 IFN-γ를 처리한 중간엽 줄기세포를 의미한다.
3-2. 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포의 이식 결과 관찰
시험물질 투여 후 10 주까지 조혈모세포의 이식 결과를 관찰하였다. 관찰기간 중 주 5회 이상 일반상태의 변화, 운동성, 외관, 자율신경 등의 일반증상을 관찰하고 사망동물의 유무를 파악하였으며, 시험동물의 체중은 각각 군 분리 시 및 관찰기간 중 주 2회 측정하였다. 조혈모세포 이식의 성과를 판단하기 위해, FACS 분석을 통해 전체 세포군에서 발현되는 사람유래 혈액세포항원을 분석하여 생착률(%)을 확인하였으며, 각 군별로 세포이식 후 골수를 채취하여 CFU(colony forming unit) 분석을 수행하였다.
FACS 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 10 주간 SPF(specific pathogen free) 시설에서 무균상태로 유지된 마우스로부터 경골 및 대퇴골에서 골수를, 하대정맥에서 말초혈액을 채취하였다.
채취된 골수는 2% 우태아혈청이 함유된 PBS(2% FBS-PBS)로 1회 세척 후, 적혈구 용해 완충액을 첨가하여 상온에서 15분간 적혈구를 파괴하고 2% FBS-PBS로 1회 세척하였다. FACS를 이용한 면역염색을 위해 튜브 당 5×10 5 세포를 100 ㎕에 현탁한 후, 분석하고자 하는 항체를 지시된 양만큼 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다.
채취된 말초혈액의 분석을 위해서는 혈액 75 ㎕에 골수 샘플에 첨가된 동일한 양의 항체를 반응시킨 후, 2 ㎖의 적혈구 용해 완충액으로 상온에서 15 분간 적혈구를 파괴하였고, 이후의 과정은 골수샘플 취급과정과 동일하였다. 2% FBS-PBS 2 ㎖을 넣고 세척한 후, 원심분리(1500 rpm, 5분)하여 상층액을 제거하였다. 4% PFA(paraformaldehyde) 250 ㎕를 넣고 가볍게 섞어준 후, FACS를 이용하여 분석하였다.
마우스 말초 혈액 내에서 조혈모세포의 생착률
각 마우스의 말초 혈액으로부터 세포를 분리하여 i) hCD45 + 세포 및 mCD45 + 세포의 비율과, ii) hCD45 + 세포 내 CD13 + 세포(Myeloid cell), CD19 + 세포(B cell) 비율을 FACS를 이용하여 분석하였다. 마우스 말초 혈액 내에서 조혈모세포의 생착률을 분석한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포 이식군(HSC+MSC S-I-S CP(I))은, 마우스 말초 혈액에서 조혈모세포의 생착률이 조혈모세포 이식군(HSC)에 비해 약 60배 증가하였고, 조혈모세포 및 중간엽 줄기세포 이식군(HSC+naive MSC)에 비해 약 3배 증가한 것을 확인하였다.
마우스 골수에서 조혈모세포의 생착률
각 마우스의 골수로부터 세포를 분리하여 i) hCD45+ 세포 및 mCD45+ 세포의 비율과, ii) hCD45+ 세포 내 CD13+ 세포(Myeloid cell), CD19+ 세포(B cell) 비율을 FACS를 이용하여 분석하였다. 마우스 골수에서 조혈모세포의 생착률을 분석한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포 이식군(HSC+MSC S-I-S CP(I))은, 마우스 골수에서 조혈모세포의 생착률이 조혈모세포 이식군(HSC)에 비해 약 14배 증가하였고, 조혈모세포 및 중간엽 줄기세포 이식군(HSC+naive MSC)에 비해 약 2배 증가한 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 본 발명의 배양방법을 통해 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 제조하고, 이의 조혈모세포 생착 증진 효과를 확인하였다. 이는 조혈모세포 이식 시 조혈모세포의 생착이 지연되거나 실패함으로써 발생하는 부작용을 감소시킬 수 있음을 의미하는 바, 조혈모세포 이식 분야와 면역관련 질환 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. (a) PD-L1(Programmed death-ligand 1) 또는 CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하여 세포 생착능 증진용 줄기세포를 제조하는 단계;
    를 포함하는, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로부터 유래된 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 선별된 줄기세포는 BD2(Beta-defensin 2) 또는 LL-37(Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양되는 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 3,000 내지 20,000 cells/cm 2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양하는 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자극제는 IFN-γ, TNF-α 및 폴리IC(Poly IC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 줄기세포는 CXCR7, PGES(prostaglandin E2 synthase) 및 PGDS(Prostaglandin-D synthase)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는
    (i) PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진되고,
    (ii) IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9), CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10), HLA-G(human leukocyte antigen G), ICAM1(Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP(Interleukin-18-binding protein), RARRES3(Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8(C-C motif ligand 8), CCL13(C-C motif ligand 13), TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL(A proliferation-inducing ligand), BAFF(B-cell activating factor), HLA-DRA(HLA class II histocompatibility antigen-DR alpha chain), CD74(Cluster of Differentiation 74), GBP1(Guanylate-binding protein 1), GBP2(Guanylate-binding protein 2), GBP4(Guanylate-binding protein 4), GBP5(Guanylate-binding protein 5), PGE2(Prostaglandin E2) 및 IFN-beta(Interferon-beta)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물.
  11. 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 이식 보조제 조성물로,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는
    (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인, 세포 이식 보조제 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 조혈모세포인, 세포 이식 보조제 조성물.
  13. 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는
    (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인, 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 면역질환은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종, 생식세포 종양, 유방암, 난소암, 소세포폐암, 신경아세포종양을 포함하는 고형종양, 재생불량성빈혈, 적혈구병증, 고셔씨병, 헌터 증후군, ADA 효소결핍증, Wiskot-Aldrich 증후군을 포함하는 면역질환, 대사질환, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 질환인, 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 BD-2 또는 LL-37 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 및 IFN-beta로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 생착능 증진용 조성물.
  18. PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 세포 생착능 증진용 줄기세포를 포함하는 세포 이식 보조제 조성물.
  19. 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는
    (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인,
    면역질환 예방 또는 치료방법.
  21. 세포 생착능 증진용 줄기세포 및 조혈모세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인,
    면역질환 예방 또는 치료방법.
  22. 세포 생착능 증진용 줄기세포를 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는
    (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인,
    세포 생착능 증진방법.
  23. 세포 생착능 증진용 줄기세포를 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고,
    상기 세포 생착능 증진용 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인,
    세포 생착능 증진방법.
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