WO2020106097A1 - 중간엽 줄기세포를 포함하는 지방 생성을 억제하기 위한 조성물 - Google Patents

중간엽 줄기세포를 포함하는 지방 생성을 억제하기 위한 조성물

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WO2020106097A1
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김재연
유혜린
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차의과학대학교 산학협력단
의료법인 성광의료재단
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Definitions

  • fat accumulation is caused by metabolic syndrome or autoimmune reactions, and causes excessive fat metabolism, resulting in increased fat tissue. Diet or drug treatment is being used as a treatment for alleviating the symptoms of fat accumulation in various diseases. However, until now, a method for fundamentally treating fat accumulation has not been developed.
  • One aspect is to provide mesenchymal stem cells that secrete phosphatase of regenerating liver-1 (PRL-1) or overexpress PRL-1 compared to parental cells.
  • Another aspect is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of abnormal fat production and metabolic abnormalities, including mesenchymal stem cells that secrete PRL-1 (phosphatase of regenerating liver -1) or overexpress PRL-1 compared to parental cells. Is to provide.
  • PRL-1 phosphatase of regenerating liver -1
  • PRL-1 phosphatase of regenerating liver -1
  • overexpress PRL-1 compared to parental cells.
  • Another aspect is a health functional food for improving or preventing abnormal fat production and metabolic abnormalities, including mesenchymal stem cells that secrete PRL-1 (phosphatase of regenerating liver -1) or overexpress PRL-1 compared to parental cells. Is to provide.
  • PRL-1 phosphatase of regenerating liver -1
  • PRL-1 phosphatase of regenerating liver -1
  • overexpress PRL-1 compared to parental cells.
  • mesenchymal stem cells that secrete phosphatase of regenerating liver-1 (PRL-1) or overexpress PRL-1 compared to parent cells are administered to the experimental animal in vivo, or in vitro. It provides a method for inhibiting fat accumulation comprising the step of contacting the cells on the.
  • One aspect provides mesenchymal stem cells that secrete phosphatase of regenerating liver-1 (PRL-1) or overexpress PRL-1 compared to parental cells.
  • mesenchymal stem cell in this specification refers to a cell that can maintain self-renewal and stem cell maintenance and differentiate into various mesenchymal tissues. And may include mesenchymal stem cells of mammals, eg animals, including humans, and the mesenchymal stem cells may be derived from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow derived, placenta derived, or fat.
  • the placenta-derived mesenchymal stem cells may be derived from various tissues constituting the placenta, such as amniotic epithelial cells, amniotic membranes, trophoblasts, chorionic membranes, and the like.
  • the placenta-derived mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from the placental chorionic plate, and more preferably may be mesenchymal stem cells derived from the chorionic plate membrane. Isolation of stem cells can be carried out in a manner obvious to those skilled in the art, for example, Pittenger et al. (Science 284: 143, 1997) and van et al. (J. Clin. Invest., 58: 699, 1976).
  • the mesenchymal stem cells may be engineered to secrete phosphatase of regenerating liver-1 (PRL-1) or an active fragment thereof, or to express PRL-1 or an active fragment thereof.
  • the mesenchymal stem cells may have the following characteristics a) or b):
  • PRL-1 phosphatase of regenerating liver -1) expressing properties
  • One or more surface antigen properties selected from the group consisting of CD34, CD105, HLA-ABC, and HLA-G.
  • the mesenchymal stem cells may be to express CD34, CD105, HLA-ABC, or HLA-G.
  • the mesenchymal stem cells provided herein are provided with at least about 20%, 25%, 30% of CD34, CD105, HLA-ABC, or HLA-G positive surface markers for cell markers expressed on the cell surface, It may be 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or about 99% expression.
  • the term "positive" in the context of stem cell labeling may mean that the label is present in a higher amount, or higher concentration, compared to other non-stem cells as a reference.
  • a cell is positive for a label if the label can be distinguished from one or more other cell types using the label because a label exists on or inside the cell. It may also mean that the cell has its label in an amount greater than the background value, such that it can signal the cell measuring device.
  • a cell can be detectably labeled with an antibody specific for CD90, and if the signal from this antibody is detectably greater than the control (eg background value), the cell is “CD90 +”.
  • the term “negative” means that even when an antibody specific for a specific cell surface label is used, the label cannot be detected compared to a background value.
  • a cell is "CD45-" if it cannot detectably label a cell with an antibody specific for CD45.
  • the mesenchymal stem cells may alternatively be a culture, lysate, or extract thereof.
  • the culture, lysate, or extract may be a useful alternative when it is difficult to use the cells as they are, and may contain biological components similar to or equivalent to the original cells because they contain components of cells including proteins.
  • the lysate or extract may be obtained using a commercially available cell lysis kit or an extraction kit.
  • PRL-1 phosphatase of regenerating liver -1)
  • PRL-1 may include PRL-1 from vertebrates, including humans, such as mammals, fish, amphibians, birds, or reptiles.
  • the PRL-1 may also mean to include a precursor of PRL-1.
  • mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells cultured environmentally or genetically engineered to secrete phosphatase of regenerating liver-1 (PRL-1) or to overexpress PRL-1 as compared to parent cells.
  • PRL-1 regenerating liver-1
  • the term “culture environment” may mean equivalent to “culture conditions,” and the term “culture environmental manipulation” or “culture environmentally engineered” cell used herein refers to a cell that is treated with a specific substance against a cell in culture. Represents an action or a cell made by it. “Genetic engineering” or “genetically engineered” refers to the act of introducing one or more genetic modifications to a cell or a cell made thereby.
  • the mesenchymal stem cell or host cell is genetically engineered to increase the expression or activity of PRL-1 or an active fragment thereof, for example, an exogenous gene encoding PRL-1 or an active fragment thereof. It may be included.
  • the increase in activity may mean that the activity of a protein or enzyme of the same type has a higher activity compared to the activity of an intrinsic protein or enzyme that does or does not have a given genetically engineered parental cell (eg, wild type).
  • the exogenous gene may be expressed in an amount sufficient to increase the activity of the protein mentioned in the mesenchymal stem cell or host cell compared to the parent cell.
  • the exogenous gene may be introduced into the parent cell through an expression vector.
  • the exogenous gene may be introduced into the parent cell in the form of a linear polynucleotide.
  • the exogenous gene may be expressed from an expression vector (eg, plasmid) in cells.
  • the exogenous gene may be expressed by being inserted into a genetic material (eg, chromosome) in a cell for stable expression.
  • the genetic manipulation may be performed by a transformation technique, a transfection technique, a transfection method, a viral infection, a gene gun or a Ti-mediated gene transfer technique, and more specifically, microinjection, electricity Electroporation, DEAE-dextran-treated transfection, lipofection, nanoparticle-mediated transfection, protein transfer domain mediated introduction, calcium phosphate (CaPO 4 ) transfection, virus-mediated gene transfer And it may be carried out by a method selected from the group consisting of PEG-mediated transfection method.
  • the genetic manipulation may be performed by electroporation, but is not limited thereto.
  • the PRL-1 or an active fragment thereof can be prepared as a fusion protein.
  • a polynucleotide encoding PRL-1 or an active fragment thereof can be linked to a frame with a polynucleotide encoding another protein or peptide, which is a host.
  • GST glutathione-S-transferase
  • H influenza hemagglutinin
  • HA immunoglobulin constant regions
  • beta-galactosidase beta-galactosidase It is possible to link -galactosidase, maltose-binding protein (MBP), or the like.
  • a polynucleotide encoding the PRL-1 or an active fragment thereof, a recombinant vector comprising the polynucleotide, and a recombinant cell comprising the recombinant vector may be provided.
  • vector means a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors and adeno-associated virus vectors.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14) , pGEX series, pET series, and pUC19), phages or viruses (eg, SV40, etc.).
  • plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14) , pGEX series, pET series, and pUC19), phages or viruses (eg,
  • the polynucleotide encoding the protein complex in the recombinant vector can be operably linked to a promoter.
  • operatively linked refers to a functional binding between a nucleotide expression control sequence (eg, promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • the regulatory sequence can be “operatively linked” to control transcription and / or translation of other nucleotide sequences.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or for expression.
  • the expression vector can be used in the art, conventional ones used to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a prokaryotic cell is a host
  • a strong promoter capable of progressing transcription eg, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • It includes a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription / detox termination sequence.
  • replication origins that operate in eukaryotic cells included in vectors include f1 replication origin, SV40 replication origin, pMB1 replication origin, adeno replication origin, AAV replication origin, and BBV replication origin, etc. It is not limited.
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, a metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, Cytomegalovirus promoter and HSV's tk promoter
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, a metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, Cytomegalovirus promoter and HSV's tk promoter
  • the recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into an appropriate host cell.
  • the host cell is a cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector while being stable, and any host cell known in the art can be used.
  • a prokaryotic cell for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • coli W3110 Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis and Bacillus genus strains, and Salmonella typhimurium, Serra Enterococcus and strains such as Tiamarsensons and various Pseudomonas species, and when transformed into eukaryotic cells, as host cells, yeast (Saccharomyce cerevisiae), insect cells, plant cells and animal cells, such as Sp2 / 0 , CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK cell line, etc. can be used.
  • the mesenchymal stem cell, PRL-1 or an active fragment thereof may be to reduce fat accumulation and / or increase in adipose tissue. This can be done by reducing the expression of factors related to fat production.
  • Another aspect is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of abnormal fat production and metabolic abnormalities, including mesenchymal stem cells that secrete PRL-1 (phosphatase of regenerating liver -1) or overexpress PRL-1 compared to parental cells.
  • Another aspect is a health functional food for improving or preventing abnormal fat production and metabolic abnormalities, including mesenchymal stem cells that secrete PRL-1 (phosphatase of regenerating liver -1) or overexpress PRL-1 compared to parental cells.
  • abnormal fat production and metabolic abnormal disease may mean a disease caused by an abnormality in fat metabolism.
  • abnormal fat production and metabolic abnormal disease may include obesity, diabetes, dyslipidemia, metabolic disease, hypertension, thyroid eye disease or abnormal fat production and metabolic disease degenerative disease.
  • thyroid associated ophthalmopathy refers to an orbital inflammatory disease caused by hyperthyroidism due to excessive secretion of thyroid hormone. Symptoms such as retraction of the eyelids, bulging of the eyes, limited morale, poor vision, diplopia, and reduced vision may be indicated.
  • treatment refers to or includes the reduction, progression or prevention of a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof
  • active ingredient or “pharmaceutical effective amount” refers to a disease, disorder or condition, or Any amount of a composition used in the course of practicing the invention provided herein sufficient to alleviate, inhibit or prevent progression of one or more symptoms.
  • administering are used interchangeably and in one embodiment into a subject by a method or route that results in at least partial localization of the composition to a desired site according to one embodiment. It may mean the arrangement of the composition according to. It can be administered by any suitable route to deliver at least a portion of the cells or cellular components of the composition according to one embodiment to a desired location in a living individual.
  • the survival period of cells after individual administration may be several hours if short, for example 24 hours to several days to several years.
  • the composition may include 0.001% to 80% by weight of PRL-1 or an active fragment thereof based on the total weight of the composition.
  • the dosage of PRL-1 or an active fragment thereof may be 0.01 mg to 10,000 mg, 0.1 mg to 1000 mg, 1 mg to 100 mg, 0.01 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.01 mg to 10 mg, or 0.01 mg to 1 mg have.
  • the dose of mesenchymal stem cells may be 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 8 cells / kg (weight).
  • the dosage may be variously prescribed by factors such as the formulation method, the administration method, the patient's age, weight, sex, morbidity, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity, and those skilled in the art Taking these factors into consideration, the dosage can be appropriately adjusted.
  • the number of times of administration may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and the administration site may be administered in one place or two or more places.
  • the dose is the same as human per kg, or the above dose is converted, for example, by the volume ratio (for example, the average value) of the target animal and human organs (heart, etc.).
  • One amount may be administered.
  • Possible routes of administration include oral, sublingual, parenteral (e.g.
  • humans and other target mammals can be exemplified, and specifically, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cows, dogs, horses, pigs, etc. Is included.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment may include a pharmaceutically acceptable carrier and / or additives.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include sterile water, physiological saline, conventional buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (ascorbic acid, etc.), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives. can do.
  • it may also include organic substances such as biopolymers, inorganic substances such as hydroxyapatite, specifically collagen matrices, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers, and chemical derivatives thereof.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment is prepared in a formulation suitable for injection, the mesenchymal stem cells or PRL-1 may be dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier or frozen in a dissolved solution. .
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment if necessary depending on the method of administration or formulation, suspending agent, solubilizer, stabilizer, isotonic agent, preservative, adsorption inhibitor, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, painless agent, Buffers, reducing agents, antioxidants, and the like.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995.
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment is a unit dose form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method that can be easily carried out by those skilled in the art to which the present invention pertains. Or by incorporating it into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or in powder, granule, tablet or capsule form.
  • the health functional food may be used in combination with other foods or food ingredients other than the PRL-1 or an active fragment thereof, and the health food composition may be suitably used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less with respect to the raw material at the time of manufacturing the health functional food. There are no particular restrictions on the type of the health functional food.
  • mesenchymal stem cells cultured or genetically engineered to secrete phosphatase of regenerating liver-1 (PRL-1) or to overexpress PRL-1 compared to the parental cells are tested in vivo on experimental animals.
  • a method for inhibiting fat accumulation comprising administering or contacting a cell in vitro.
  • the contact may mean a step of treating or contacting an individual with mesenchymal stem cells, PRL-1 or an active fragment thereof.
  • the treatment or contact may be performed by co-culturing mesenchymal stem cells with cells, or by transplanting mesenchymal stem cells, PRL-1, or active fragments thereof into the periphery of a specific organ or orbital tissue of an experimental animal, for example, an animal (Direct local). injection), intravenous injection (intravenous injection, iv injection), and the like.
  • the treatment or contact is in contact with, for example, co-culture with, a host cell comprising a nucleotide sequence encoding PRL-1 or an active fragment thereof, or the host cell is an experimental animal, for example It may include administration to a specific organ or orbital tissue of an animal, such as direct local injection or intravenous injection (iv injection).
  • An ideal method of administration for the treatment of ophthalmic diseases may be effective in local injection or the like around the orbital tissue.
  • the co-cultivation and administration can be carried out during a method and a period of time for a person skilled in the art to achieve the desired effect, for example, mesenchymal stem cells or PRL-1 or active fragments thereof.
  • Mesenchymal stem cells may be useful for preventing, treating, or improving diseases related to fat metabolism abnormalities by inhibiting fat accumulation or increase in adipose tissue.
  • 1 is a schematic diagram of the PRL-1 gene introduced into mesenchymal stem cells.
  • Figure 2 is a micrograph confirmed using GFP whether the PRL-1 gene is introduced into the placenta-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the result of confirming the number of placental-derived mesenchymal stem cells (GFP + cells) into which the PRL-1 gene has been introduced.
  • 5 is a result of confirming the expression level of the surface antigen (Oct4, Nanog, Sox2, HLA-G, TERT) in mesenchymal stem cells according to one aspect by RT-PCR.
  • the surface antigen Oct4, Nanog, Sox2, HLA-G, TERT
  • FIG. 7 is a graph confirming the doubling time of mesenchymal stem cells according to an aspect.
  • 11 is a result of confirming the effect of mesenchymal stem cells on fat production of orbital fibroblasts according to one aspect through co-culture; OF: normal person; TAO: an individual with thyroid eye disease; CP (-): not cocultured; CP Naive (+): co-culture with placenta-derived mesenchymal stem cells; CP-PRL-1 (+): CP-PRL-1 overexpressing placenta-derived mesenchymal stem cells and co-culture.
  • TAO An individual with thyroid eye disease.
  • Orbital fibroblasts (4 normal, 4 patients) were collected from humans and cultured in DMEMF12 (Gibco) (10% FBS, and 1% penicillin-streptomycin). Two days after the growth of fibroblasts in the medium, 5 ⁇ g / ml insulin, 1 mM dexamethasone, and 0.5 mM IBMX were added in DMEM (10% FBS) to start differentiation into adipocytes (day 0). After 72 hours (day 3), the medium was replaced with DMEM medium supplemented with 10% FBS and 5 ⁇ g / ml insulin, after which every other day, DMEM medium supplemented with 10% FBS was supplied.
  • RNA fusion 65 ° C, 1 min
  • annealing 25 ° C, 5 min
  • amplification 42 ° C, 60 min
  • enzyme inactivation 85 ° C, 1 min
  • mRNA expression of each gene was amplified and normalized according to the following PCR conditions: initial fusion (95 ° C, 2 minutes), amplification (95 ° C, 10 seconds; 55 ° C, 20 seconds; and 72 ° C, 20 seconds) ) 40 cycles.
  • initial fusion 95 ° C, 2 minutes
  • amplification 95 ° C, 10 seconds; 55 ° C, 20 seconds; and 72 ° C, 20 seconds
  • PPAR ⁇ , ADIPONECTIN and C / EBPa, primer sets are shown in Table 1 below.
  • MRNA expression of each gene was normalized to 18s rRNA. Data were expressed as a fold (mean ⁇ SEM) of factors related to fat differentiation compared to the normal population.
  • Lysates were prepared using RIPA buffer. The same amount of total protein was separated by SDS-PAGE and transferred to the membrane. The membrane was immunoblotted at 1: 1000 dilution with anti-HAS1 and HAS2 (SantaCruz Biotechnology, SA, USA), and the same membrane was incubated with GAPDH (SantaCruz). After washing, horseradish peroxidase-conjugated anti-goat IgG (horseradish peroxidase-conjugated anti-goat IgG) secondary antibody was incubated for 3 hours at room temperature in a 1: 10000 dilution.
  • Immune response bands were imaged with an enhanced chemiluminescence solution (Animal Genetics, Suwon, Korea) and detected with ChemiDocTM XRS + System Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). The protein expression level was normalized to GAPDH. Data were expressed as a fold (mean ⁇ SEM) of HAS2 compared to the normal population.
  • Human fibroblasts (3 x 10 5 ) were dissociated with cell dissociation buffer (Life Technologies) and washed with PBS (2% (v / v) FBS). This was incubated with isotype control IgG or antigen-specific antibody (BD Biosciences, CA, USA) for 20 minutes and used to identify cells. FACS sorting was performed using a FACS vantage Flow Cytometer (BD Biosciences, CA, USA).
  • FIG. 1 a gene having the structure of FIG. 1 was introduced into the mesenchymal stem cell using electroporation.
  • Placental chorionic valve-derived mesenchymal stem cells 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 25 ng / ml fibroblast growth factor 4 (Fibroblast Growth Factor-4) , FGF-4), and cultured in a CO2 incubator at 37 ° C in MEM-alpha medium to which 1 ug / ml Heparin was added. After washing the cells with phosphate buffered saline (Phosphatase buffered saline, PBS), the cells were separated by treatment with trypsin at 37 ° C for 2 minutes, and the cells separated with PBS were collected and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the culture solution was suspended in the obtained pellet, it was counted using a hemocytometer.
  • the recovered cells were centrifuged at 200 g for 10 minutes, and then Nucleofector was added to suspend the cells (5x10 5 / 100ul) and 2 ug of DNA plasmid containing PRL-1 was added.
  • the cells were transferred to a cuvette and placed in a Nucelofection machine to operate the 'U-23' program. Upon completion of the program, the culture dish containing fresh medium was quickly stabilized in a 37 ° C, CO2 incubator.
  • Neomycin 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin.
  • Figure 2 is a micrograph confirmed using GFP whether the PRL-1 gene is introduced into the placenta-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the result of confirming the number of placental-derived mesenchymal stem cells (GFP + cells) into which the PRL-1 gene has been introduced.
  • placenta-derived mesenchymal stem cells with enhanced expression of the PRL-1 gene were successfully prepared by the method of 1.1.
  • FIG. 4 shows the mRNA expression level of RPL-1 expressed by cells.
  • RT-PCR analysis confirmed that the placenta-derived mesenchymal stem cells (p1, p6) prepared in 1.1. Had significantly higher mRNA levels of PRL-1 than naive cells.
  • RT-PCR and ELISA analysis results show that placental mesenchymal stem cells (PRL1 +) prepared in 1.1. Express the stem cell markers Oct4, Nanog, Sox2, HLA-G, and TERT. Confirmed.
  • the surface antigen (CD34, CD13, CD90, CD105, HLA-DR, HLA-ABC, and HLA-G) characteristics of the placenta-derived mesenchymal stem cells were analyzed through FACS analysis, and the results are shown in FIGS. 8 and 9 It is shown in. 8 and 9, mesenchymal cell markers CD34, CD105, HLA-ABC, and HLA-G were identified as positive.
  • placenta-derived mesenchymal stem cells with enhanced expression of PRL-1 prepared above were evaluated to have an inhibitory effect on orbital fibroblast fat production. Specifically, after placing adipose-inducing differentiation medium in orbital fibroblasts isolated from normal humans and individuals with thyroid associated ophthalmopathy (TAO), placenta with enhanced expression of PRL-1 prepared above Mesenchymal stem cells (CP-PRL-1) and co-culture were divided and cultured for 10 days (DMEM supplemented with 10% FBS, 33 uMbiotin, 17 uM pantothenic acid, 0.2 nM T3, 10 ⁇ g / mL transferrin for the first 4 days) , 0.2 uM prostaglandin I2, 0.1 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 uM dexamethasone, 5 ug / ml insulin / w / o IBMX for 5-10 days, Dexamethaxone, Insulin).
  • the placenta-derived mesenchymal stem cells with enhanced expression of PRL-1 prepared above were not co-cultured with CP-PRL-1 (CP-) or naive to evaluate whether or not the ability to regulate the genes related to fat production of orbital fibroblasts was regulated (CP-) or naive.
  • Co-culture with mesenchymal stem cells of the state (CP Naive (+)), or co-culture with CP-PRL-1 (CP-PRL-1 (+)), a fat-generating gene expressed in these fibroblasts (Adipsin, MRNA levels of Adiponectin, PPAR ⁇ , Leptin, LPL, FABP4) were analyzed by qRT-PCR. The results are shown in FIG. 12. OF: normal person; TAO: An individual with thyroid eye disease.
  • the expression levels of both fat-related genes were decreased in orbital fibroblasts co-cultured with mesenchymal stem cells.
  • the expression level of adipose-generating genes was significantly reduced when co-cultured with CP-PRL-1 than when co-cultured with naive mesenchymal stem cells.
  • TAO An individual with thyroid eye disease.
  • placental-derived mesenchymal stem cells with enhanced expression of PRL-1 have an excellent effect of inhibiting fat production, and thus can be usefully used as a therapeutic agent for diseases related to fat production and / or fat accumulation.

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Abstract

지방 생성을 억제, 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포, 또는 이를 포함하는 조성물은 지방 축적 또는 지방 조직의 증가를 억제시켜 지방대사 이상과 관련된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포를 포함하는 지방 생성을 억제하기 위한 조성물
지방 생성을 억제, 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 출원은 2018년 11월 23일 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2018-0146782호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
지방 생성(adipogenesis), 지방 축적은 대사증후군 또는 자가면역반응으로 인해 유발되며, 과도한 지방대사를 일으켜 지방조직이 증가하는 현상을 초래한다. 여러 질환에서의 지방이 축적되는 증상을 완화시키기 위한 치료법으로는 식이요법 또는 약물치료가 시행되고 있다. 그러나, 현재까지 지방축적을 근본적으로 치료할 수 있는 방법이 개발되지 않은 실정이다.
따라서, 지방 생성 및 지방 축적을 근본적으로 치료하기 위한 안전하고도 효과적인 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 PRL-1(phosphatase of regenerating liver-1) 을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환의 개선 또는 예방을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.
다른 양상은 PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 인 비보(in vivo) 상에서 실험동물에 투여하거나, 또는 인 비트로(in vitro) 상에서 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 지방 축적을 억제시키는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포(줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC)"는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 제대 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반(placenta) 유래, 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다. 상기 태반 유래 중간엽 줄기세포는 태반을 구성하는 다양한 조직, 예를 들어 양막 상피 세포, 양막, 영양막, 융모막등의 조직으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는 상기 태반 유래 중간엽 줄기세포는 태반의 융모막판(chorionic plate)으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 융모막판막(chorionic plate membrane)으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 중간엽 줄기세포의 분리는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1) 또는 그의 활성 단편을 분비하거나, PRL-1 또는 그의 활성 단편을 발현하는 조작된 것일 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 하기 a) 또는 b)의 특성을 가질 수 있다:
a) PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1)을 발현하는 특성;
b) CD34, CD105, HLA-ABC, 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.
상기 중간엽 줄기세포는 CD34, CD105, HLA-ABC, 또는 HLA-G를 발현하는 것일 수 있다. 상세하게는, 본 명세서에서 제공되는 중간엽 줄기세포는 세포 표면에 발현되는 세포 표지자에 대하여 CD34, CD105, HLA-ABC, 또는 HLA-G 양성 표면 마커를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 발현하는 것일 수 있다. 본 발명에서 용어, "양성"은 줄기세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 비줄기 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 CD90에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "CD90+"이다. 본 명세서에서 용어, "음성"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD45에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 "CD45-"이다.
상기 중간엽 줄기세포는 대안적으로 그의 배양물, 용해물 또는 그의 추출물이 이용될 수 있다. 상기 배양물, 용해물 또는 추출물은 세포 그대로를 이용하기 어려운 경우 유용한 대안이 될 수 있으며, 단백질 등을 포함한 세포의 구성 성분을 포함하고 있으므로 본래 세포와 유사하거나 동등한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 상기 용해물 또는 추출물은 상업적으로 이용가능한 세포 용해 키트, 또는 추출 키트 등을 이용하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서 용어 "PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1)"은 인간을 포함한 척추동물, 예를 들면, 포유류, 어류, 양서류, 조류, 또는 파충류 유래의 PRL-1을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PRL-1은 PRL-1의 전구체도 포함하는 의미일 수 있다.
또한, 상기 중간엽 줄기세포는 PRL-1(phosphatase of regenerating liver-1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하도록 배양 환경적 또는 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양 환경"은 "배양 조건"이랑 동등한 의미일 수 있고, 본 명세서에서 용어 "배양 환경적 조작" 또는 "배양 환경적 조작된" 세포는 배양 중인 세포에 대하여 특정 물질을 처리하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 예를 들면, 상기 중간엽 줄기세포 또는 숙주 세포는 PRL-1 또는 그의 활성 단편의 발현 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 것, 예를 들면, PRL-1 또는 그의 활성 단편을 코딩하는외인성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 활성 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 단백질 또는 효소의 활성에 비해, 동일한 타입의 단백질 또는 효소의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 상기 외인성 유전자는, 상기 중간엽 줄기세포 또는 숙주 세포에서 그 모세포에 비하여 언급된 단백질의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터 (예, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질 (예, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 유전적 조작은 형질전환 기술, 형질 감염 기술, 형질 도입법, 바이러스 감염, 유전자 총 또는Ti-매개 유전자 운반 기술에 의해 수행되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란처리 형질감염법, 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입법, 단백질 전달 도메인 매개 도입법, 인산칼슘(CaPO4) 형질 감염법, 바이러스-매개유전자 전달법 및 PEG-매개 형질주입법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 유전적 조작은 전기천공법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PRL-1 또는 그의 활성 단편은 융합 단백질로써 제조될 수 있다. 융합 단백질을 제조하기 위한 방법에서, PRL-1 또는 그의 활성 단편을 암호화하고 있는 폴리뉴클레오티드는 다른 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 프레임(frame)에 연결(ligate)될 수 있으며, 이것은 숙주(host)에서의 발현(expression)을 위해 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 당업계에 알려진 기술들은 이런 목적을 위해 이용될 수 있다. PRL-1과 융합된 펩타이드들을 위해, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6개의 히스티딘(His)으로 이루어진 6x His 잔기들(residues), 10x His, influenza hemagglutinin(HA), 인간 c-myc 단편, VSV-GP 단편, p18HIV 단편(fragments), T7-태그(tag), HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck태크, 알파-튜블린(alpha-tubulin) 단편, B-태그, 및 Protein C 단편과 같이 알려진 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, 융합 단백질을 만들기 위해 PRL-1 또는 그의 활성 단편을 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase, GST), influenza hemagglutinin(HA), immunoglobulin constant regions, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 말토즈-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 또는 등등을 연결하는 것이 가능하다.
따라서, 다른 구체예에 있어서, 상기 PRL-1 또는 그의 활성 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공될 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스서브틸리스, 바실러스츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라티피무리움, 세라티아마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
또한, 상기 중간엽 줄기세포, PRL-1 또는 그의 활성 단편은 지방 축적 및/또는 지방 조직 증가를 감소시키는 것일 수 있다. 이는 지방 생성 관련 인자의 발현을 감소시킴으로써 이루어질 수 있다.
또 다른 양상은 PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1) 을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1) 을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환의 개선 또는 예방을 위한 건강기능식품을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환"은 지방의 대사에 이상이 생겨 발생하는 질병을 의미할 수 있다. 상기 비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환의 예로는 비만, 당뇨, 이상지질혈증, 대사질환, 고혈압, 갑상선 안질환 또는 비정상적인 지방생성 및 대사질환성 퇴행성 질환을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "갑상선 안질환(Thyroid associated ophthalmopathy: TAO)"은 갑상선 호르몬의 과다 분비로 인한 갑상선 기능 항진증으로 인해 발생하는 안와염증질환을 의미한다. 눈꺼풀 후퇴, 안구 돌출, 제한성 사기, 시력 저하, 복시, 시야 감소 등의 병증을 나타낼 수 있다.
용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%의 PRL-1 또는 그의 활성 단편을 포함할 수 있다. 또한, PRL-1 또는 그의 활성 단편의 투여 용량은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다. 또한, 중간엽줄기세포의 투여 용량은 1.0Х 105 내지 1.0Х 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 흡입, 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 중간엽줄기세포 또는 PRL-1가 약학적으로 허용가능한담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 상기 건강식품 조성물은 PRL-1 또는 그의 활성 단편 이외에 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.
또 다른 양상은 PRL-1(phosphatase of regenerating liver-1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하도록 배양 환경적 또는 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 인 비보(in vivo) 상에서 실험동물에 투여하거나, 또는 인 비트로(in vitro) 상에서 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 지방 축적을 억제시키는 방법을 제공한다.
상기 지방 축적을 억제시키는 방법에 있어서, 상기 접촉은 중간엽 줄기세포, PRL-1 또는 그의 활성 단편을 개체에 처리, 또는 접촉시키는 단계를 의미할 수 있다. 상기 처리 또는 접촉은 중간엽 줄기세포를 세포와 공배양하거나, 또는 중간엽 줄기세포, PRL-1 또는 그의 활성 단편을 실험 동물, 예를 들면 동물의 특정 장기 또는 안와조직 주변으로 국소이식 (Direct local injection), 정맥혈관을 통한 이식 (intravenous injection, i.v. injection) 등에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 처리 또는 접촉은 PRL-1 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포와 세포와 접촉시키거나, 예를 들면, 공배양하거나, 또는 상기 숙주 세포를 실험 동물, 예를 들면, 동물의 특정 장기 또는 안와조직 주변으로 국소이식 (Direct local injection), 정맥혈관을 통한 이식 (intravenous injection, i.v. injection) 등에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 안과질환 치료용으로 이상적인 투여 방법은 안와조직 주변으로의 국소이식 (local injection) 등이 효율적일 수 있다. 상기 공배양 및 투여는 통상의 당업자가 목적하는 효과, 예를 들면, 중간엽 줄기세포 또는 PRL-1 또는 그의 활성 단편이 개체에 영향을 미칠 수 있도록 하는 방법 및 기간 동안 수행될 수 있다.
일 양상에 따른 중간엽 줄기세포, 또는 이를 포함하는 조성물은 지방 축적 또는 지방 조직의 증가를 억제시켜 지방대사 이상과 관련된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 중간엽 줄기세포에 도입된 PRL-1 유전자의 모식도이다.
도 2는 태반 유래 중간엽 줄기세포에 PRL-1 유전자가 도입되었는지 GFP를 이용해서 확인한 현미경 사진이다.
도 3은 PRL-1 유전자가 도입된 태반 유래 중간엽 줄기세포의 수(GFP+ cells)를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포가 발현하는 RPL-1의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 5는 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포에서 표면 항원(Oct4, Nanog, Sox2, HLA-G, TERT)의 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 6은 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포에서 표면 항원(Oct4, HLA-G)의 발현 수준을 ELISA로 확인한 결과이다.
도 7은 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포의 배가 시간을 확인한 그래프이다.
도 8 및 9는 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포의 표면 항원(CD34, CD13, CD90, CD105, HLA-DR, HLA-ABC, 및 HLA-G) 특성을 FACS 분석한 결과이다.
도 10은 PRL-1의 별현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포를 골 분화 및 지방세포로의 분화를 유도했을 때, 표면 항원 마커 및 골세포, 지방세포 마커의 발현을 확인한 결과이다.
도 11은 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포가 안와섬유아세포의 지방 생성에 미치는 영향을 공배양을 통해 확인한 결과이다; OF: 정상인; TAO: 갑상선 안질환을 갖는 개체; CP(-): 공배양 하지 않음; CP Naive (+): 태반 유래 중간엽 줄기세포와 공배양; CP-PRL-1 (+): CP-PRL-1 과발현 태반유래 중간엽줄기세포와공배양.
도 12는 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포가 안와섬유아세포의 지방 생성 관련 유전자를 조절하는 능력을 공배양을 통해 확인한 결과이다; OF: 정상인; TAO: 갑상선 안질환을 갖는 개체.
도 13은 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포가 안와섬유아세포의 지방 생선 관련 인자 및 염증 관련 인자에 미치는 영향을 공배양을 통해 확인한 결과이다; TAO: 갑상선 안질환을 갖는 개체.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예
참고예 1. 안와섬유아세포(Orbital fibroblast) 배양 및 처리
사람으로부터 안와섬유아세포(정상 4명, 환자 4명)를 채취하여 DMEMF12(Gibco)(10% FBS, 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 배양하였다. 섬유아세포가 배지에 분포되어 자라고 2일 후, DMEM(10% FBS)에서 5 μg/ml 인슐린, 1 mM 덱사메타손, 및 0.5 mM IBMX을 첨가하여 지방 세포로의 분화가 시작되게 하였다(day 0). 72시간 후(day 3), 배지를 10% FBS 및 5 μg/ml 인슐린이 보충된 DMEM 배지로 교체하고, 그 후 격일마다 10% FBS가 보충된 DMEM 배지를 공급하였다.
참고예 2. Real-time PCR
배양 8 일차(day 8)에, RPL-1이 과발현된 태반 유래 중간엽줄기세포(2 x 105)를 안와섬유아세포와 함께 48 시간 동안 공배양하였다. 세포 용해물은TRIzol(Invitrogen, Carlbad, CA, USA)에서 균질화하여, RNA를 추출하였다. 각각의 시료로부터의 1 μg의 총 RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. cDNA합성 조건은 아래와 같다: RNA 융해(65℃, 1분), 풀림 (25℃, 5분), 증폭(42℃, 60분) 및 효소 불활성 (85℃, 1분).
아래의 PCR 조건에 따라 각 유전자의 mRNA 발현을 증폭하여 표준화(normalization)하였다: 초기 융해(95℃, 2분), 증폭(95℃, 10초; 55℃, 20초; 및 72℃, 20초) 40 사이클. PPARγ, ADIPONECTIN 및 C/EBPα, 프라이머 세트는 하기 표 1과 같다.
마커 유전자 프라이머 서열(5'-3') 접합온도(℃) 서열번호
줄기세포성 04-Oct F: AGT GAG AGG CAA CCT GGA GA 52 1
R: GTG AAG TGA GGG CTC CCA TA 2
Nanog F: TTC TTG ACT GGG ACC TTG TC 52 3
R: GCT TGC CTT GCT TTG AAG CA 4
Sox-2 F: AGA ACC CCA AGA TGC ACA AC 52 5
R: GGG CAG CGT GTA CTT ATC CT 6
HLA-G F: GCG GCT ACT ACA ACC AGA GC 58 7
R: GCA CAT GGC ACG TGT ATC TC 8
TERT F: GAG CTG ACG TGG AAG ATG AG 55 9
R: CTT CAA GTG CTG TCT GAT TCC AAT G 10
골세포성 OC F: CAC TCC TCG CCC TAT TGG C 58 11
R: CCC TCC TGC TTG GAC ACA AAG 12
Col 1 F: AGA CAT CCC ACC AAT CAC CT 60 13
R: CGT CAT CGC ACA ACA CCT 14
지질세포성 Adipsin F: CAC GTA CCA TGA TGG GGC AA 55 15
R: TCG AGA TCC CCA CGT AAC CA 16
PPARg F: GAC AGA CCT CAG GCA GAT TG 55 17
R: GTC AGC GAC TGG GAC TTT TC 18
Adiponectin F: GAC TGC CAC TAA TTC AGA GC 55 19
R: CTC ATG GGG ATA ACA CTC AG 20
LPL F: ACA GGT GCA ATT CCA AGG AG 55 21
R: CTT TCA GCC ACT GTG CCA TA 22
Leptin F: ATC TAT GTG CAC CTG AGG GTA G 55 23
R: TCC TTT TCA CAA AGC CAC ACT AT 24
FABP4 F: ACA TGA AAG AAG TGG GAG TTG GC 55 25
R: AAG TAC TCT CTG ACC GGA TGA CG 26
C/EBPα F: TGT ATA CCC CTG GTG GGA GA 55 27
R: TCA TAA CTC CGG TCC CTC TG 28
- PRL-1 F: TAC TGC TCC ACC AAG AAG CC 60 29
R: AGG TTT ACC CCA TCC AGG TC 30
내부 대조군 human GAPDH F: GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC 55 31
R: GTG GTG AAG ACG CCA GTG GA 32
rat GAPDH F: TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA 55 33
R: AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT 34
각 유전자의 mRNA의 발현은 18s rRNA로 표준화하였다. 데이터는 정상 집단과 비교하여 지방분화 관련 인자의 배수(fold)(평균±SEM)로 표현하였다.
참고예 3. 웨스턴 블롯
RIPA 완충액을 이용하여 용해물을 준비하였다. 동량의 총 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 막에 옮겼다. 상기 막은 항-HAS1 및 HAS2(SantaCruz Biotechnology, SA, USA)로 1:1000 희석에서 면역블롯팅하였고, 같은 막을 GAPDH(SantaCruz)와 함께 배양하였다. 세척 후, 홀스래디쉬 과산화 효소-접합 항-염소 IgG(horseradish peroxidase-conjugated anti-goat IgG) 2차 항체와 함께 1:10000 희석에서 상온에서 3시간 배양하였다. 면역 반응 밴드는 향상된 화학 발광 솔루션(enhanced chemiluminescence solution)(Animal Genetics, Suwon, Korea)으로 이미지화하였고, ChemiDocTM XRS+ System Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 검출하였다. 단백질 발현량은 GAPDH로 표준화(normalization)하였다. 데이터는 정상 집단과 비교하여 HAS2의 배수(fold)(평균±SEM)로 표현하였다.
참고예 4. FACS 분석
인간 섬유아세포(3 x 105)를 세포 해리 버퍼(Life Technologies)로 해리시키고 PBS(2%(v/v) FBS)로 세척하였다. 이를 아이소타입 대조군 IgG(isotype control IgG) 또는 항원-특이적 항체(BD Biosciences, CA, USA)와 함께 20분간 배양하고, 세포를 확인하는데 이용하였다. FACS 분류(sorting)는 FACS vantage Flow Cytometer (BD Biosciences, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.
실시예 1. 기능 강화된 중간엽 줄기세포의 제작
1.1. 태반 유래 중간엽 줄기세포의 분리
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만 시에 수집된 태반조직으로부터 분리하였다. 분리한 조직 (chorioamniotic membranes) 을 50 ml tube에 넣고 DPBS를 첨가해 여분의 혈액을 제거 후 20 ml 효소 용액 I (1mg/ml collagenase type I, 2 mg/ml Trypsin, 20 mg/ml DNase I, 1.2 U/ml Dispase, x1 PS in HBSS) 에서 멸균된 슬라이드 글라스로 융모양막(chorioamniotic membranes)의 안쪽 부분을 긁어 회수되는 부유물들을 한쪽으로 모아주었다. 효소 용액 I 10ml을 넣고 고르게 섞어준 후 37℃ 효소반응을 15분간씩 2회 반복하면서, 조직으로부터 줄기세포를 분리하였다. 분리된 세포 현탁액을 원심분리하고, 분리된 세포는 10 %의 소 태아 혈청, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신, 1 ug/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4)가 첨가된 DMEM/F12를 이용하여 배양하였으며, 이후 4일내지 5일 간격으로 배양배지를 교환하였으며, 첫 계대에서 Invitrogen사의 TrypLE를 37℃인큐베이터에서 단기간 (3분) 처리하여 계대 배양하였다.
1.2. PRL-1 유전자의 발현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포 제작
상기 1.1.에서 분리한 태반 유래 중간엽 줄기세포에서 PRL-1 유전자의 발현을 강화시키기 위해서, 전기천공법을 이용하였다.
구체적으로, 중간엽 줄기세포에 도 1의 구조를 갖는 유전자를 전기천공법을 이용해 도입하였다.
태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기세포(CP-MSCs)를 10 % 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1 % 페니실린-스트렙토마이신, 25 ng/ml 섬유아세포성장인자4 (Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4), 1 ug/ml Heparin이 첨가된 MEM-alpha 배지 중에서 37℃, CO2 인큐베이터 중에서 배양하였다. 세포를 인산완충식염수(Phosphatase buffered saline, PBS)로 세척한 후, 37℃에서 2분간 트립신을 처리하여 세포를 떼어낸 후, PBS를 이용하여 떼어낸 세포를 모아 1200 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 얻어진 펠렛에 배양액 1ml을 넣어 현탁시킨 후 혈색소계(hemocytometer)를 이용하여 계수하였다. 회수한 세포를 200 g에서 10 분간 원심분리하여 Nucleofector를 넣어 세포(5x105/100ul)를 현탁시킨 후 PRL-1을 포함하고 있는 DNA 플라스미드 2 ug을 넣었다. 세포를 큐벳에 옮겨 Nucelofection 기계에 넣어 'U-23' 프로그램을 작동시켰다. 프로그램이 종료되면 신속히 새로운 배지를 포함하고 있는 배양접시를 37℃, CO2 인큐베이터 중에서 안정화시켰다. 4시간 후, 배양 접시의 배지를 흡입기를 이용하여 제거한 후, 부착된 세포는 1.5 mg/ml 네오마이신(Neomycin)을 포함하는 배지(10 % 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS), 1 % 페니실린-스트렙토마이신, 25 ng/ml 섬유아세포성장인자 4 (Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4), 1 ug/ml Heparin이 첨가된 MEM-alpha 배지에서 배양하여 PRL-1 유전자가 형질도입된 태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기세포를 얻었다.
도 2는 태반 유래 중간엽 줄기세포에 PRL-1 유전자가 도입되었는지 GFP를 이용해서 확인한 현미경 사진이다.
도 3은 PRL-1 유전자가 도입된 태반 유래 중간엽 줄기세포의 수(GFP+ cells)를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, PRL-1 유전자를 도입하지 않은 대조군인 naive 태반 유래 중간엽 줄기세포에 비해서, 1.1.에서 제조된 강화 태반 유래 중간엽 줄기세포에서 인위적으로 도입된 PRL-1 유전자의 발현이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.
따라서, 상기 1.1.의 방법에 의해 PRL-1 유전자의 발현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포가 성공적으로 제조되었음을 확인하였다.
1.3. PRL-1 유전자의 발현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포의 특성 분석
1.1. 및 1.2.에서 확인한 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위해, 사이토카인 분비 특성 및 표면 항원 특성을 분석하였다. 구체적으로, RT-PCR 분석을 통해 상기 태반 유래 중간엽 줄기세포에서 PRL-1의 발현 수준을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 세포가 발현하는 RPL-1의 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, RT-PCR 분석 결과 1.1.에서 제조한 태반 유래 중간엽 줄기세포(p1, p6)가 naive 세포에 비해서 PRL-1의 mRNA 발현 수준이 유의적으로 높음을 확인하였다.
또한, RT-PCR 분석을 통해 태반 유래 중간엽 줄기세포에서 표면 항원(Oct4, Nanog, Sox2, HLA-G, TERT)의 발현 수준을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
또한, ELISA 분석을 통해 태반 유래 중간엽 줄기세포에서 표면 항원(Oct4, HLA-G)의 발현 수준을 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, RT-PCR 및 ELISA 분석 결과 1.1.에서 제조한 태반 유래 중간엽 줄기세포(PRL1+)가 줄기세포 마커인 Oct4, Nanog, Sox2, HLA-G, TERT를 발현하는 것을 확인하였다.
또한, 세포배양과정 동안 세포수의 증가를 계수하여 세포의 수가 배가되는 시간(doubling time)을 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, PRL-1 이 과발현된 세포의 계대배양과정 동안 배가 시간은 PRL-1의 발현을 유도하지 않은 대조군과 큰 차이가 없음을 확인 하였다.
또한, FACS 분석을 통해 상기 태반 유래 중간엽 줄기세포의 표면 항원(CD34, CD13, CD90, CD105, HLA-DR, HLA-ABC, 및 HLA-G) 특성을 분석하였고, 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다. 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 중간엽 세포 마커인 CD34, CD105, HLA-ABC, 및 HLA-G가 양성으로 확인되었다.
따라서, PRL-1의 발현이 강화되어 PRL-1을 발현, 포함하는 태반 유래 중간엽 줄기세포가 줄기세포의 특성을 유지하는 것을 확인하였다.
또한, PRL-1의 별현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포를 골 분화 및 지방세포로의 분화를 유도했을 때, 표면 항원 마커 및 골세포, 지방세포 마커의 발현을 확인한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 골 분화 또는 지방세포로 분화를 유도하였을 때, 미분화 마커인 Oct4의 발현이 감소되면서, 골세포 및 지방세포의 마커인 osteocalsin (OC), type I collagen (Col 1), Adipsin, PPAR-r 등의 유전자의 발현이 증가됨을 확인함으로써, 골세포 및 지방세포로의 분화가 잘 이루어진다는 것을 확인하였다.
실시예 3. 지방 생성 억제의 확인
상기 제조한 PRL-1의 발현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포가 안와섬유아세포의 지방 생성 억제 효과가 있는지 평가하였다. 구체적으로, 정상인과 갑상선 안질환(Thyroid associated ophthalmopathy: TAO)을 갖는 개체로부터 분리한 안와섬유아세포(Orbital fibroblast)에 지방생성유도 분화 배지를 넣은 후 상기 제조한 PRL-1의 발현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포(CP-PRL-1)와 공배양 유무를 나눠 10일간 배양하였다 (초기 4 일동안 DMEM supplemented with 10% FBS, 33 uMbiotin, 17 uM pantothenic acid, 0.2 nM T3, 10 μg/mL transferrin, 0.2 uM prostaglandin I2, 0.1mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 uM dexamethasone, 5 ug/ml insulin / 5-10일 동안 w/o IBMX, Dexamethaxone, Insulin). 10일 뒤 Oil-Red-O 염색을 통해 섬유아세포의 지질축적 변화를 관찰하였다. 관찰 결과를 도 11에 나타내었다. OF: 정상인; TAO: 갑상선 안질환을 갖는 개체; CP(-): 공배양 하지 않음; CP Naive (+): 태반 유래 중간엽 줄기세포와 공배양; CP-PRL-1 (+): CP-PRL-1과 공배양.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 분화 배지에 유도된 TAO 환자의 섬유아세포의 지질 축적이 CP-PRL-1과의 공배양을 통해 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
실시예 4. 지방 생성 관련 유전자의 조절 능력 확인
상기 제조한 PRL-1의 발현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포가 안와섬유아세포의 지방 생성 관련 유전자의 조절 능력이 있는지 평가하기 위해 CP-PRL-1와 공배양 하지 않거나(CP-), naive 상태의 중간엽 줄기세포와 공배양 하거나(CP Naive (+)), CP-PRL-1와 공배양 하고(CP-PRL-1(+)) 이들 섬유아세포에서 발현되는 지방 생성 관련 유전자(Adipsin, Adiponectin, PPARγ, Leptin, LPL, FABP4)의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 분석하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. OF: 정상인; TAO: 갑상선 안질환을 갖는 개체.
도 12에 나타낸 바와 같이, 중간엽 줄기세포와 공배양 한 안와섬유아세포에서 지방 생성 관련 유전자 모두의 발현 수준이 감소하였다. 특히, CP-PRL-1와 공배양 한 경우 naive 중간엽 줄기세포와 공배양한 경우에 비해서 지방 생성 관련 유전자의 발현 수준이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
추가적으로, 상기 실험군에서 지방 생성 관련 인자(Leptin, PPARγ) 및 염증 관련 인자 TNF-α의 유전자 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하였고, 이들의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. TAO: 갑상선 안질환을 갖는 개체.
도 13에 나타낸 바와 같이, CP-PRL-1와 공배양 한 경우 naive 중간엽줄기세포와 공배양 한 경우에 비해서 지방 생성 관련 인자 및 염증 관련 인자의 유전자 및 단백질 발현 수준이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
따라서, PRL-1의 발현이 강화된 태반 유래 중간엽 줄기세포는 지방 생성을 억제하는 우수한 효과가 있으므로, 지방 생성 및/또는 지방 축적 관련 질환의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. PRL-1(phosphatase of regenerating liver-1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 PRL-1은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란처리 형질감염법, 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입법, 단백질 전달 도메인 매개 도입법, 인산칼슘(CaPO4) 형질 감염법, 바이러스-매개유전자전달법및 PEG-매개 형질주입법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 전달되어 발현되는 것인 중간엽 줄기세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포인 것인 중간엽 줄기세포.
  4. PRL-1(phosphatase of regenerating liver -1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환은 비만, 당뇨, 이상지질혈증, 대사질환, 고혈압, 갑상선 안질환 및 비정상적인 지방생성 및 대사질환성 퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방 축적 또는 지방 조직 증가를 억제시키는 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포인 것인 약학적 조성물.
  8. PRL-1(phosphatase of regenerating liver-1을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 비정상적인 지방 생성 및 대사 이상질환의 개선 또는 예방을 위한 건강기능식품.
  9. PRL-1(phosphatase of regenerating liver-1)을 분비하거나 모세포에 비하여 PRL-1을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 인 비보(in vivo) 상에서 실험동물에 투여하거나, 또는 인 비트로(in vitro) 상에서 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 지방 축적을 억제시키는 방법.
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